KR101982760B1 - 초임계 유체-유기용매 시스템을 이용한 탈세포화 조직 기반의 하이드로겔의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 초임계 유체-유기용매 시스템을 이용한 탈세포화 조직 기반의 하이드로겔의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 (a) 생체 조직을 초임계 유체 및 유기용매와 동시에 접촉시켜 탈세포화하는 단계; (b) 상기 탈세포화된 조직을 세척하는 단계; (c) 상기 세척된 탈세포화 조직을 펩신 및 산성 용액과 혼합하여 탈세포화 조직 용액을 제조하는 단계; (d) 상기 탈세포화 조직 용액에 염기성 용액을 처리하여 pH 5.5 내지 7.8로 적정하는 단계; 및 (e) 상기 적정된 탈세포화 조직 용액을 30 내지 40 ℃에서 방치하는 단계;를 통하여 다양한 조직 유래 단백질, 성장인자 및 사이토카인의 보존성을 극대화한 탈세포화 하이드로겔을 제조하고, 이를 포함하여 혈관생성능 및 조직재생능이 향상된 조직공학용 소재로 응용하는 기술에 관한 것이다.

Description

초임계 유체-유기용매 시스템을 이용한 탈세포화 조직 기반의 하이드로겔의 제조방법{Preparation method of hydrogel based on decellularized tissue using supercritical fluid-organic solvent system}
본 발명은 초임계 유체-유기용매 시스템을 이용한 탈세포화 조직 기반의 하이드로겔의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 초임계 유체-유기용매 시스템을 이용하여 다양한 조직 유래 단백질, 성장인자 및 사이토카인의 보존성을 극대화한 탈세포화 하이드로겔을 제조하고, 이를 포함하여 혈관생성능 및 조직재생능이 향상된 조직공학용 소재로 응용하는 기술에 관한 것이다.
조직공학(tissue engineering)은 생명과학, 의학, 공학 등의 기존 과학 영역의 기본 개념과 기술을 바탕으로 생체 조직의 대용품을 만들어 이식함으로써 생체 기능을 유지, 향상, 복원하여 손상된 조직이나 장기를 정상적인 조직으로 대체, 재생시키기 위한 새로운 학문이다. 최근 조직공학 분야에서는 탈세포화 기술을 이용하여, 조직유래 탈세포화 세포 외 기질(Decellularized extracellular matrix, dECM)을 2차원 및 3차원 구조의 ECM 기반 지지체뿐만 아니라, 3D 프린팅을 위한 바이오 잉크 소재 등 다양한 분야로 적용하고 있다.
일반적으로 조직 및 기관을 탈세포화 할 때는 주로 간단하면서도 강력한 효과를 지니는 계면활성제나 효소를 처리하여 세포의 핵을 제거하게 된다. 하지만, 계면활성제 중 하나인 SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)의 경우에는, 세포 잔해들을 제거하는 동시에 ECM을 구성하는 단백질을 변성시키고 조직의 미세구조를 파괴시킬 뿐 만 아니라, 조직 유래 다양한 사이토카인(cytokine)과 성장인자(growth factor)들 또한 함께 제거하게 된다[비특허문헌 1].
이러한 한계를 극복하기 위해, 또 다른 탈세포화 방법으로 정수압 시스템(Hydrostatic pressure system) 혹은 초임계 유체 시스템(Supercritical fluid system)과 같은 고기압 시스템(High pressure technology)이 대두되고 있다. 이러한 탈세포화 방법은 높은 압력을 이용하여 세포를 터뜨림으로써, 계면활성제 없이도 세포막을 깰 수 있으며 뿐만 아니라, 화학 물질이 자체를 사용하지 않았기 때문에, 탈세포화 세포 외기질에 어떠한 세포독성 물질도 남아있지 않게 된다.
고압력 시스템 중 하나인 정수압 시스템은 혈관과 각막을 탈세포화 하긴 하지만, 980 MPa에 달하는 높은 압력을 가해주어야 하고, 물을 사용하기 때문에 탈세포과정이 끝난 조직내에서 얼음 결정이 형성되어 세포외기질의 구조를 변형시키기도 한다[비특허문헌 2].
따라서 본 발명자는 기존의 계면활성제를 이용한 탈세포화 조직 유래 세포외 기질 제조방법의 단점을 개선하기 위하여, 초임계 유체-유기용매 시스템을 이용하여 다양한 조직 유래 단백질, 성장인자 및 사이토카인의 보존성을 극대화한 탈세포화 하이드로겔을 제조하고, 이를 포함하여 혈관생성능 및 조직재생능이 향상된 조직공학용 소재로 응용고자 한다.
비특허문헌 1. Harald C ott et al, Nature medicine 14, 213 - 221 (2008) 비특허문헌 2. Yoshihide Hashimoto et al, Biomaterials 31, 3941-3948 (2010)
본 발명은 상기와 같은 문제점을 고려하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 초임계 유체-유기용매 시스템을 이용하여 다양한 조직 유래 단백질, 성장인자 및 사이토카인의 보존성을 극대화한 탈세포화 하이드로겔을 제조하고, 이를 포함하여 혈관생성능 및 조직재생능이 향상된 조직공학용 소재로 응용하고자 하는 것이다.
상기한 바와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 측면은 (a) 생체 조직을 초임계 유체 및 유기용매와 동시에 접촉시켜 탈세포화하는 단계; (b) 상기 탈세포화된 조직을 세척하는 단계; (c) 상기 세척된 탈세포화 조직을 펩신 및 산성 용액과 혼합하여 탈세포화 조직 용액을 제조하는 단계; (d) 상기 탈세포화 조직 용액에 염기성 용액을 처리하여 pH 5.5 내지 7.8로 적정하는 단계; 및 (e) 상기 적정된 탈세포화 조직 용액을 30 내지 40 ℃에서 방치하는 단계;를 포함하는 탈세포화 조직 기반의 하이드로겔의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 생체 조직은 포유류 동물체의 심장, 비장, 간, 폐, 위, 뇌, 지방 조직, 뼈, 췌장, 난소, 소장, 대장, 결장, 혈관 및 식도 중에서 선택되는 1종일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 (a) 단계 이전에 생체 조직을 동결건조한 후 유기용매에 5 내지 20 시간 동안 담지하는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 초임계 유체는 이산화탄소이고, 상기 유기용매는 에탄올일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 탈세포화는 유기용매가 포함된 반응기 내부에 생체 조직을 투입하고, 반응기 내의 압력이 300 내지 400 bar가 되도록 초임계 유체를 주입한 후 23 내지 42 ℃에서 2 내지 24 시간 동안 접촉시켜 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 (b) 단계는 탈세포화된 조직을 DNase 함유 PBS 완충액으로 세척할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 산성 용액은 0.1 내지 1 M의 아세트산이고, 상기 염기성 용액은 수산화나트륨일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 (c) 단계의 탈세포화 조직 용액은 세척된 탈세포화 조직 및 산성 용액이 10 내지 50 : 1의 중량비로 혼합될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 (c) 단계는 상기 탈세포화 조직 용액에 콜라겐, 피브린, 알지네이트, 폴리에틸렌글리콜 겔, 폴록세이머, 키토산, 아가로스, 젤라틴 및 히알루론산 중에서 선택되는 1종 이상의 겔을 혼합하는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 겔은 콜라겐이고; 상기 콜라겐은 상기 콜라겐 및 탈이온수가 1 내지 5 : 1의 중량비로 혼합된 콜라겐 용액을 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 콜라겐 용액 및 탈세포화 조직 용액의 부피비는 1 내지 9 : 9 내지 1일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 (e) 단계의 방치는 20 분 내지 60 분 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 조직은 심장조직이고; 상기 (a) 단계 이전에 생체 조직을 동결건조한 후 유기용매에 10 내지 16 시간 동안 담지하는 단계를 더욱 포함하며; 상기 초임계 유체는 이산화탄소, 상기 유기용매는 에탄올이며; 상기 탈세포화는 유기용매가 포함된 반응기 내부에 생체 조직을 투입하고, 반응기 내의 압력이 300 내지 400 bar가 되도록 초임계 유체를 주입한 후 35 내지 40 ℃에서 3 내지 9 시간 동안 접촉하여 수행되며; 상기 (b) 단계는 탈세포화된 조직을 DNase 함유 인산염 완충 염수(PBS)로 세척하여 수행되며; 상기 산성 용액은 0.3 내지 0.7 M의 아세트산이고, 상기 염기성 용액은 수산화나트륨이며; 상기 (c) 단계의 탈세포화 조직 용액은 세척된 탈세포화 조직 및 산성 용액이 20 내지 40 : 1의 중량비로 혼합된 것이며; 상기 (c) 단계는 상기 탈세포화 조직 용액에, 콜라겐 및 탈이온수가 2 내지 4 : 1의 중량비로 혼합된 콜라겐 용액을 혼합하는 단계를 더욱 포함하며; 상기 콜라겐 용액 및 탈세포화 조직 용액의 부피비는 3 내지 5 : 5 내지 7이며; 상기 (e) 단계의 방치는 30 내지 50 분 동안 수행될 수 있다.
본 발명에 따르면, 초임계 유체-유기용매 시스템을 이용하여 다양한 조직 유래 단백질, 성장인자 및 사이토카인의 보존성을 극대화한 탈세포화 하이드로겔을 제조하고, 이를 포함하여 혈관생성능 및 조직재생능이 향상된 조직공학용 소재로 응용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에서 사용되는 초임계 유체-유기용매 반응 시스템의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 탈세포화 심장조직, 비교예 1로부터 제조된 탈세포화 심장조직 및 대조군의 (a) DNA를 정량화한 그래프 및 (b) 세포핵 염색 이미지이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 탈세포화 심장조직, 비교예 1로부터 제조된 탈세포화 심장조직 및 대조군의 (a) 콜라겐을 정량화한 그래프 및 (b) 글라이코사미노글라이칸(GAG)을 정량화한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 탈세포화 심장조직, 비교예 1로부터 제조된 탈세포화 심장조직 및 대조군의 혈관생성인자배열이다.
도 5는 본 발명의 실시예 2-1 내지 2-2로부터 제조된, 콜라겐 용액 및 탈세포화 조직 용액의 혼합비에 따른 탈세포화 심작조직 기반의 하이드로겔 및 비교예 2의 콜라겐 용액을 나타낸 이미지이다.
이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 설명한다.
본 발명의 일 측면은 (a) 생체 조직을 초임계 유체 및 유기용매와 동시에 접촉시켜 탈세포화하는 단계; (b) 상기 탈세포화된 조직을 세척하는 단계; (c) 상기 세척된 탈세포화 조직을 펩신 및 산성 용액과 혼합하여 탈세포화 조직 용액을 제조하는 단계; (d) 상기 탈세포화 조직 용액에 염기성 용액을 처리하여 pH 5.5 내지 7.8로 적정하는 단계; 및 (e) 상기 적정된 탈세포화 조직 용액을 30 내지 40 ℃에서 방치하는 단계;를 포함하는 탈세포화 조직 기반의 하이드로겔의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 초임계 유체-유기용매 시스템을 이용한 탈세포화 조직 기반의 하이드로겔의 제조방법은, 종래 계면활성제를 이용한 생체 조직의 탈세포화 방법에 비하여, 단백질 변성 정도가 낮고, 잔존하는 성장인자, 사이토카인 및 조직 유래 단백질의 보존도가 우수하며, 탈세포화 후에도 초임계 유체 및 유기용매가 잔존하지 않으므로 조직 유래 요소를 다량 함유하는 탈세포화 조직 기반의 하이드로겔을 제조할 수 있는 이점이 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 생체 조직은 포유류 동물체의 심장, 비장, 간, 폐, 위, 뇌, 지방 조직, 뼈, 췌장, 난소, 소장, 대장, 결장, 혈관 및 식도 중에서 선택되는 1종일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 (a) 단계 이전에 생체 조직을 동결건조한 후 유기용매에 5 내지 20 시간, 바람직하게는 10 내지 16 시간 동안 담지하는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
상기 단계를 통하여 조직 및 초임계 유체-유기용매와의 용해도를 높일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 초임계 유체는 이산화탄소이고, 상기 유기용매는 에탄올일 수 있다.
이산화탄소는 무독성, 불연성인 특성을 가지며, 가격이 저렴한 시약으로 고순도로 사용이 가능하고, 임계점 이상의 온도와 압력(Tc = 31.1 ℃, Pc = 73.8 bar)에서 기체와 액체의 특성을 동시에 가지고 있는 초임계 유체로 작용한다.
이산화탄소의 액체와 같은 밀도는 용해력을 증가시키는 반면, 기체와 같은 점성은 높은 확산 속도를 가지게 하므로, 초임계 이산화탄소-유기용매가 조직 안의 세포막과 핵막을 구성하는 인지질을 용해시킴으로써, 세포의 구조가 깨지게 된다.
상기 유기용매로는 알코올 계열의 용매로서, 에탄올, 메탄올 및 프로판올 중에서 선택되는 1종 이상을 사용할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 에탄올을 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 탈세포화는 유기용매가 포함된 반응기 내부에 생체 조직을 투입하고, 반응기 내의 압력이 300 내지 400 bar, 바람직하게는 330 내지 370 bar가 되도록 초임계 유체를 주입한 후 23 내지 42 ℃, 바람직하게는 35 내지 40 ℃에서 2 내지 24 시간, 바람직하게는 3 내지 9 시간 동안 접촉시켜 수행될 수 있다.
상기 접촉 반응이 끝난 후에는 반응기 내의 초임계 유체-유기용매를 배출하여 조직으로부터 초임계 유체-유기용매를 제거할 수 있다.
또한, 상기 온도 범위는 생체온도 범위로서, 생체 조직 내의 단백질 및 사이토카인과 성장인자들의 보존도가 향상될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 (b) 단계는 탈세포화된 조직을 DNase 함유 PBS 완충액으로 세척할 수 있다.
상기 DNase(deoxyribonuclease)는 DNA에 특이적으로 작용하고 포스포디에스테르결합을 가수분해함으로써 DNA를 분해하는 효소로서, 탈세포화된 조직을 DNase를 함유하는 PBS 완충액으로 세척함으로써, 이미 고압으로 깨어진 세포막으로부터 빠져나온 DNA를 분해 및 조직을 세척하는 효과가 있다.
또한, 상기 세척은 1 내지 10 일, 바람직하게는 3 내지 8 일, 더욱 바람직하게는 4 내지 6 일 동안 수행할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 산성 용액은 0.1 내지 1 M의 아세트산이고, 상기 염기성 용액은 수산화나트륨일 수 있다.
상기 산성 용액은 아세트산, 염산, 파라톨루엔설포닌산, 및 말레인산 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 이에 제한되지 않고 pH 2.5 내지 4.5로 조절할 수 있는 용액이면 사용 가능하다. 바람직하게는 아세트산 또는 염산을 사용할 수 있고, 가장 바람직하게는 아세트산을 사용할 수 있다.
또한, 상기 선택되는 1종 이상의 산(acid)을 0.1 내지 1 M 농도로 함유하는 수용액을 사용하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 0.3 내지 0.7 M의 아세트산을 사용할 수 있다.
상기 염기성 용액은 수산화나트륨, 탄산나트륨, 탄산수소나트륨, 인산수소이나트륨, 탄산수소칼슘, 수산화칼슘, 수산화질산칼슘, 수산화염화칼슘, 수산화시안칼슘, 수산화칼륨, 수산화암모늄 및 아세트산나트륨 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 이에 제한되지 않고 pH 5.5 내지 7.8로 조절할 수 있는 용액이면 사용 가능하다. 바람직하게는 수산화나트륨을 사용할 수 있다.
상기 염기성 용액은 산성을 적정시켜주고, 피하주사 또는 조직공학용 지지체로써 사용될 때 주변의 세포들의 염증반응을 줄이기 위하여, pH 5.5 내지 7.8, 바람직하게는 pH 6.5 내지 7.5의 생체 내 pH와 유사하게 조절하는 역할을 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 (c) 단계의 탈세포화 조직 용액은 세척된 탈세포화 조직 및 산성 용액이 10 내지 50 : 1의 중량비로 혼합될 수 있다.
구체적인 예로, 상기 세척된 탈세포화 조직을 액체질소와 혼합한 후 곱게 파우더로 분쇄한 다음 1 내지 50 mg/ml 바람직하게는, 5 내지 40 mg/ml의 농도가 되도록 산성 용액에 30 내지 60 시간, 바람직하게는 40 내지 55 시간 동안 혼합하여 탈세포화 조직 용액을 제조할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 (c) 단계는 상기 탈세포화 조직 용액에 콜라겐, 피브린, 알지네이트, 폴리에틸렌글리콜 겔, 폴록세이머, 키토산, 아가로스, 젤라틴 및 히알루론산 중에서 선택되는 1종 이상의 겔을 혼합하는 단계를 더욱 포함할 수 있으며, 겔은 상기 종류에만 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 콜라겐을 사용할 수 있다.
초임계 유체-유기용매 시스템을 이용한 탈세포화 조직은 기존의 계면활성제 탈세포화 처리 방법에 비해, 조직 유래 단백질 및 성장인자들의 보존율이 높고, 계면활성제에 의해 조직의 성분이 녹지 않기 때문에 탈세포화 처리 전과 후의 조직의 무게 감소량이 적다. 따라서, 초임계 유체-유기용매 시스템을 이용한 탈세포화 조직은 조직 단위무게 당 조직 내의 콜라겐이 차지하는 비율이 적다. 조직 기반 하이드로겔을 제조과정에서 젤레이션에 가장 큰 역할을 하는 단백질이 콜라겐인데, 조직의 단위무게 당 콜라겐의 비율이 적기 때문에, 초임계 유체-유기용매 시스템을 이용한 탈세포화 조직액만으로는 젤레이션에 어려움이 있다. 이러한 어려움을 극복하기 위해, 탈세포화 조직 및 상기 종류의 겔을 혼합함으로써, 제조되는 탈세포화 조직 기반의 하이드로겔의 물성을 더욱 보완할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 겔은 콜라겐이고; 상기 콜라겐은 상기 콜라겐, 및 탈이온수, 수산화나트륨용액 및 인산염 완충 염수(PBS) 중에서 선택되는 1종이 1 내지 10 : 1의 중량비로 혼합된 콜라겐 용액을 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 콜라겐 용액 및 탈세포화 조직 용액의 부피비는 1 내지 9 : 9 내지 1일 수 있다.
특히, 상기 탈세포화 조직 용액 및 콜라겐 용액이 각각 상기한 중량비로 혼합된 것임과 동시에, 콜라겐 용액 및 탈세포화 조직 용액의 부피비가 상기 범위일 경우에는 우수한 신생혈관형성능을 갖는 것을 확인하였으며, 반면 상기 탈세포화 조직 용액 및 콜라겐 용액 중 어느 하나라도 상기한 중량비를 벗어나거나, 콜라겐 용액 및 탈세포화 조직 용액의 부피비가 상기 범위를 벗어나는 경우에는 신생혈관형성능이 현저히 저하됨을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 (e) 단계의 방치는 20 분 내지 60 분 동안 수행될 수 있으며, 바람직하게는 30 분 이상 방치하여 하이드로겔을 수득할 수 있다.
특히, 하기 실시예 또는 비교예 등에는 명시적으로 기재하지는 않았지만, 상기 초임계 유체-유기용매 시스템을 이용하여 탈세포화 조직 기반의 하이드로겔을 제조하는 과정에 있어서, 다양한 종류의 생체 조직에 대하여, 조직의 탈세포화 이전에 동결건조와 유기용매에 담지 여부 및 담지 시간, 초임계 유체와 유기용매의 종류, 탈세포화 과정 중 반응기 내의 압력과 온도 및 접촉 시간, 탈세포화된 조직 세척 용액의 종류, 산성 용액과 염기성 용액의 종류, 탈세포화 조직 용액에서 탈세포화 조직 및 산성 용액의 혼합비, 탈세포화 조직 용액에 콜라겐 용액의 혼합 여부 및 콜라겐 및 탈이온수의 혼합비, 콜라겐 용액 및 탈세포화 조직 용액의 부피비, 적정된 탈세포화 조직 용액의 방치 시간을 달리하여 제조된 탈세포화 조직 기반의 하이드로겔을 이용하여 쥐의 피하에 주입 시 체액에 의한 분해 정도를 확인하였다.
그 결과, 다른 종류의 생체 조직과 다른 수치 범위에서와는 달리, 아래 조건이 모두 만족하였을 때 생체 내 주입 시 체액에 의한 분해는 일어나지 않고 90 일 후에도 하이드로겔이 온전히 형성되어 있음을 확인하였다: (ⅰ) 생체 조직은 심장조직, (ⅱ) (a) 단계 이전에 생체 조직을 동결건조한 후 유기용매에 10 내지 16 시간 동안 담지하는 단계를 더욱 포함, (ⅲ) 초임계 유체는 이산화탄소, (ⅳ) 유기용매는 에탄올, (ⅴ) 탈세포화는 유기용매가 포함된 반응기 내부에 생체 조직을 투입하고, 반응기 내의 압력이 300 내지 400 bar가 되도록 초임계 유체를 주입한 후 35 내지 40 ℃에서 3 내지 9 시간 동안 접촉하여 수행, (ⅵ) (b) 단계는 탈세포화된 조직을 DNase 함유 인산염 완충 염수(PBS)로 세척하여 수행, (ⅶ) 산성 용액은 0.3 내지 0.7 M의 아세트산, (ⅷ) 염기성 용액은 수산화나트륨, (ⅸ) (c) 단계의 탈세포화 조직 용액은 세척된 탈세포화 조직 및 산성 용액이 20 내지 40 : 1의 중량비로 혼합된 것, (ⅹ) (c) 단계는 상기 탈세포화 조직 용액에, 콜라겐 및 탈이온수가 2 내지 4 : 1의 중량비로 혼합된 콜라겐 용액을 혼합하는 단계를 더욱 포함, (ⅹⅰ) 콜라겐 용액 및 탈세포화 조직 용액의 부피비는 3 내지 5 : 5 내지 7 , (ⅹⅰⅰ) (e) 단계의 방치는 30 내지 50 분 동안 수행.
다만, 상기 조건 중 어느 하나라도 충족되지 않는 경우에는 하이드로겔의 체액에 의한 분해가 7 일 내로 진행되는 것을 관측되었다.
이하에서는 본 발명에 따른 제조예 및 실시예를 첨부된 도면과 함께 구체적으로 설명한다.
실시예 1: 탈세포화 심장조직의 제조
먼저 조직과 초임계 이산화탄소 및 에탄올 간의 반응성을 높이기 위하여, 동결건조를 시킨 렛 심장조직 100 mg을 에탄올에 12 시간 이상 담궈 두었다.
그 다음에 초임계 유체-유기용매 공정을 위한 고압반응기에 심장조직을 넣고 에탄올을 첨가하여 초임계 이산화탄소와 반응시켜 주었다. 이때 반응기의 온도를 35 ℃까지 올려준 후, 고압 펌프를 이용하여 반응기 내의 압력이 350 bar가 될 때까지 이산화탄소를 주입하였고, 반응기 내의 압력이 다 찬 다음에 반응기 내의 온도를 37 ℃로 설정해 주었다. 압력을 유지한 상태로 6 시간 동안 이산화탄소-에탄올이 심장조직 내로 침투해 들어갈 수 있도록 두었다.
반응시간이 끝나고, 밸브를 열어주어 이산화탄소 및 에탄올을 배출하는 방법으로 조직으로부터 이산화탄소 및 에탄올을 제거하였으며, 반응기에서 꺼낸 탈세포화 심장조직은 DNase 함유 PBS 완충액으로 5 일 동안 세척해 주었다.
실시예 2-1 내지 2-2: 탈세포화 심장조직 기반의 하이드로겔 제조
탈세포화 심장기반의 하이드로겔의 낮은 물성을 보완해주기 위하여, 콜라겐과 혼합하여 하이드로겔을 제조하였다. 상기 실시예 1로부터 제조된 탈세포화 심장조직은 액체질소를 넣어 프리즈밀 장비로 조직을 곱게 파우더로 분쇄한 다음 30 mg/ml의 농도로 0.5 M 아세트산에 녹여 제조한 탈세포화 조직용액으로 사용하였다. 다음으로, 콜라겐 겔은 탈이온수에 3 mg/ml의 농도로 희석한 콜라겐 용액을 사용하였다.
상기 두 개의 겔 모두 온도에 민감하기 때문에 아이스 박스 안에서 상기 콜라겐 용액 및 탈세포화 조직 용액을 혼합했으며, 수산화나트륨으로 중성화 과정을 거친 후에 37 ℃에서 30 분 이상 방치하여 반응시킴으로써 하이드로겔로 제조하였다.
상기 콜라겐 용액 및 탈세포화 조직 용액의 비율을 각각 7:3 및 5:5로 하여 실시예 2-1 내지 2-2으로 하였다.
비교예 1: 계면활성제를 이용한 탈세포화 심장조직의 제조
종래 공지된 문헌에 개시된 내용을 참고하여, 계면활성제를 이용한 탈세포화 심장조직을 제조하였다(Nature medicine 14, 213 - 221 (2008)).
비교예 2: 콜라겐 용액
콜라겐 겔을 탈이온수에 3 mg/ml의 농도로 희석한 콜라겐 용액을 제조하였다.
도 2는 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 탈세포화 심장조직, 비교예 1로부터 제조된 탈세포화 심장조직 및 대조군의 (a) DNA를 정량화한 그래프 및 (b) 세포핵 염색 이미지이다.
도 2를 참조하면, 실시예 1 및 비교예 1의 탈세포화 심장조직은 대조군에 비하여 DNA 및 세포핵이 거의 남아 있지 않는 것을 확인할 수 있다.
도 3은 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 탈세포화 심장조직, 비교예 1로부터 제조된 탈세포화 심장조직 및 대조군의 (a) 콜라겐을 정량화한 그래프 및 (b) 글라이코사미노글라이칸(GAG)을 정량화한 그래프이다.
도 3을 참조하면, 비교예 1에 비하여 실시예 1의 탈세포화 심장조직에 콜라겐 및 글라이코사미노글리칸의 보존도가 현저히 높은 것을 확인할 수 있다.
도 4는 본 발명의 실시예 1로부터 제조된 탈세포화 심장조직, 비교예 1로부터 제조된 탈세포화 심장조직 및 대조군의 혈관생성인자배열이다.
도 4를 참조하면, 다양한 혈관신생인자는 비교예 1에 비하여 실시예 1의 탈세포화 심장조직에서 보존도가 현저히 높은 것을 확인할 수 있다.
도 5는 본 발명의 실시예 2-1 내지 2-2로부터 제조된, 콜라겐 용액 및 탈세포화 조직 용액의 혼합비에 따른 탈세포화 심작조직 기반의 하이드로겔 및 비교예 2의 콜라겐 용액을 나타낸 이미지이다.
도 5를 참조하면, 콜라겐 용액 및 탈세포화 조직 용액의 부피비가 7:3일 때는 물성이 약해 하이드로겔이 형성되지 않는 것을 확인하였고, 5:5일 때는 탈세포화 조직을 가장 많은 양을 함유하는 동시에 하이드로겔 구조가 가장 잘 형성되는 것을 확인하였다.
그러므로 본 발명에 따르면, 초임계 유체-유기용매 시스템을 이용하여 다양한 조직 유래 단백질, 성장인자 및 사이토카인의 보존성을 극대화한 탈세포화 하이드로겔을 제공할 수 있으며, 이를 이용하여 혈관생성능 및 조직재생능이 향상된 조직공학용 소재로 응용할 수 있다.

Claims (13)

  1. (a) 생체 조직을 초임계 유체 및 유기용매와 동시에 접촉시켜 탈세포화하는 단계;
    (b) 상기 탈세포화된 조직을 세척하는 단계;
    (c) 상기 세척된 탈세포화 조직을 펩신 및 산성 용액과 혼합하여 탈세포화 조직 용액을 제조하는 단계;
    (d) 상기 탈세포화 조직 용액에 염기성 용액을 처리하여 pH 5.5 내지 7.8로 적정하는 단계; 및
    (e) 상기 적정된 탈세포화 조직 용액을 30 내지 40 ℃에서 방치하는 단계;를 포함하는 탈세포화 조직 기반의 하이드로겔의 제조방법으로서,
    상기 조직은 심장조직이고;
    상기 (a) 단계 이전에 생체 조직을 동결건조한 후 유기용매에 10 내지 16 시간 동안 담지하는 단계를 더욱 포함하며;
    상기 초임계 유체는 이산화탄소, 상기 유기용매는 에탄올이며;
    상기 탈세포화는 유기용매가 포함된 반응기 내부에 생체 조직을 투입하고, 반응기 내의 압력이 300 내지 400 bar가 되도록 초임계 유체를 주입한 후 35 내지 40 ℃에서 3 내지 9 시간 동안 접촉하여 수행되며;
    상기 (b) 단계는 탈세포화된 조직을 DNase 함유 인산염 완충 염수(PBS)로 세척하여 수행되며;
    상기 산성 용액은 0.3 내지 0.7 M의 아세트산이고, 상기 염기성 용액은 수산화나트륨이며;
    상기 (c) 단계의 탈세포화 조직 용액은 세척된 탈세포화 조직 및 산성 용액이 20 내지 40 : 1의 중량비로 혼합된 것이며;
    상기 (c) 단계는 상기 탈세포화 조직 용액에, 콜라겐 및 탈이온수가 2 내지 4 : 1의 중량비로 혼합된 콜라겐 용액을 혼합하는 단계를 더욱 포함하며;
    상기 콜라겐 용액 및 탈세포화 조직 용액의 부피비는 3 내지 5 : 5 내지 7이며;
    상기 (e) 단계의 방치는 30 내지 50 분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 탈세포화 조직 기반의 하이드로겔의 제조방법.
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