JP7133870B2 - 無細胞臓器及びそれを生成する方法 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年９月１１日に出願された米国仮出願第６２／７２９，９８３号に関するとともにその利益を主張し、同出願の内容がその全体において参照によりここに取り込まれる。

本開示は、概して無細胞臓器の生成の分野に関する。より具体的には、本開示は、様々な疾患、例えば心臓病の治療のための異種移植片に適した無細胞臓器を生成する改善された方法に関する。

心臓病は、心臓機能に影響を与える種々のタイプの状態のことをいう。一般的な心臓病は、冠状動脈性心疾患（ＣＨＤ）、心臓弁膜症、心筋症、不整脈及び炎症性心疾患を含む。世界保健機関（ＷＨＯ）の報告によれば、毎年１７００万人以上が心血管疾患で死亡する。心臓病に関連する典型的な兆候及び症状は、胸痛、息切れ、発汗、吐き気、不整脈、脱力感及びめまいを含む。心臓病の発症に対する危険因子は、喫煙、高血圧、高コレステロール、糖尿病、肥満、アルコール、粗末な食生活及び身体的不活動を含む。

心臓移植は、末期心不全又は重度の心臓病の患者に、他の医学的又は外科的治療が失敗した場合に行われる外科的移植手順である。世界では毎年およそ３５００件の心臓移植が行われ、その半分以上は米国で行われる。感染症及び敗血症に加え、臓器拒絶反応は心臓移植の最も深刻な合併症の１つである。具体的には、他の生物に由来する移植された心臓は、一般に、被移植者に拒絶反応を誘発する。そのような拒絶反応を抑制又は軽減する目的のために、患者は、残りの人生にわたって免疫抑制薬を投与されなければならない。しかし、免疫抑制薬の投与は、感染の増加及び／又は癌の発症の可能性などの望ましくない副作用を引き起こし得る。

前述に鑑み、関連技術において、心臓を生成するための改善された方法の必要があり、その方法においては、結果として生成された心臓が望ましくない拒絶反応を誘発することなく移植後に宿主細胞がその上で成長する３次元スキャフォールドとして作用し得るレベルにまで、免疫原性物質（例えば細胞及び／又は酵素）が低減される一方で、生来の心臓の本来の構造及び立体配座は保存される。

以下に、基本的な理解を読者に与えるために開示の簡略化した概要を提示する。この概要は、開示の網羅的な概観ではなく、本発明の鍵となる／重要な要素を特定するものでも本発明の範囲を記述するものでもない。その専らの目的は、ここに開示される幾つかの概念を、後述のさらに詳細な説明の序章としての簡略な形態で提示することである。

この開示の第１の態様は、免疫原性残基（例えば、細胞物質）を排除しながら、その生来の構造及び立体配座を保存することによって特徴付けられる無細胞臓器（例えば、無細胞心臓）を生成する方法に向けられる。結果として生成された無細胞臓器は、組織移植での使用に適している。無細胞臓器を生成する方法は、
（ａ）臓器を、１０～１００分の第１の期間、３０～５０℃の第１の温度で、２００～５００バールの第１の圧力下で、第１の共溶媒の存在下で、第１の超臨界流体（ＳＣＦ）に供するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の第１のＳＣＦ処置臓器を、１０～１００分の第２の期間、３０～５０℃の第２の温度で、２００～５００バールの第２の圧力下で、第２の共溶媒の存在下で、第２のＳＣＦの連続流に供するステップであって、第２のＳＣＦの流速が１０～３０リットル／分である、ステップと、
を備える。

本開示の実施形態によれば、本方法は、酵素、イオンキレート剤、洗浄剤、グリセロール及びそれらの組合せからなる群から選択される薬剤で臓器を処置するステップを備えない。

本開示のある実施形態によれば、第１及び第２のＳＣＦは、超臨界二酸化炭素（ＳｃＣＯ_２）、超臨界亜酸化窒素（ＳｃＮ_２Ｏ）、超臨界アルカン、超臨界アルケン、超臨界アルコール、超臨界アセトン及びそれらの組合せからなる群から独立して選択される。ある効果的な実施例において、第１及び第２のＳＣＦは、それぞれＳｃＣＯ_２である。

ある実施形態によれば、ステップ（ａ）で、臓器は１０～８０分の第１の期間、４０℃で３５０バールの圧力下でＳｃＣＯ_２に供され、そして、ステップ（ｂ）で、ステップ（ａ）の生成物は１０～８０分の第２の期間、４０℃で３５０バールの圧力下で２０リットル／分の流速のＳｃＣＯ_２の連続流に供される。一実施形態では、第１の期間は３０分であり、第２の期間は６０分である。他の実施形態では、第１の期間は１０分であり、第２の期間は８０分である。さらに他の実施形態では、第１の期間は８０分であり、第２の期間は１０分である。

第１及び第２の共溶媒の各々は、好ましくは３０～１００％（体積％）のエタノールである。ある特定の実施例によれば、第１及び第２の共溶媒の各々は、好ましくは７５％（体積％）のエタノールである。

選択的に、ステップ（ａ）の前に、本方法は、
（１）臓器を高張液に１０～６０分間浸漬するステップと、
（２）ステップ（１）の高張液処置臓器を低張液に１０～６０分間浸漬するステップと、
をさらに備える。

本開示のある実施形態によれば、高張液は０．５～４．０ＭのＮａＣｌを含む塩類溶液であり、低張液は水である。ある効果的な実施例によれば、臓器は、２．０ＭのＮａＣｌを含む塩類溶液に３０分間浸漬され（ステップ（１））、そして水に３０分間浸漬される（ステップ（２））。ある好ましい実施例では、ステップ（１）及び（２）は、少なくとも２回繰り返される。

さらに選択的に、ステップ（ｂ）の後、本方法は、第２のＳＣＦ処置臓器を０．０１～１．０ＮのＮａＯＨを含む溶液に供するステップをさらに備える。好ましくは、第２のＳＣＦ処置臓器は、０．１ＮのＮａＯＨを含む溶液に供される。

本方法によって処置されるのに適した臓器の例は、心臓、腸、肺、脾臓、腎臓、肝臓、胃、膵臓、膀胱、結腸、直腸又は脳を含むが、これに限定されない。本開示のある実施形態によれば、臓器は心臓である。

本方法によって処置される臓器は、動物、例えば、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、サル、ニワトリ又はヒトから単離又は由来し得る。

また、本開示の任意の実施形態による本方法によって生成される無細胞臓器（例えば、無細胞心臓）も、ここに開示される。

上記のように、本無細胞臓器は主にコラーゲンで構成されており、その生来の構造及び立体配座が保存されているため、被検体に適用（例えば、移植）された後、細胞がその上及び／又はその中で成長することを可能にする３次元生体スキャフォールドとして作用し得る。さらに、結果として生成された臓器は無細胞であり、細胞物質を欠いていることを意味し、そのような無細胞臓器は実質的に非免疫原性であり、移植された被検体において免疫原性応答を誘発しない。

したがって、本無細胞臓器又はその一部を使用することによって被検体の疾患を治療する方法を提供することが、本開示の他の態様である。方法は、疾患に関連する症状を改善又は軽減するように、本無細胞臓器又はその一部を被検体に移植することを備える。ある実施形態によれば、被検体は心臓病を患っており、本方法により生成された無細胞心臓は被検体に移植され、それにより被検体の心機能を改善及び／又は心臓病に関連する症状を改善若しくは軽減する。選択的に、心臓病の治療のための無細胞心臓は、その上／その中で培養される細胞を有し、例えば、その上／その中で培養される心筋細胞、ペースメーカー細胞、幹細胞又はそれらの組合せを有する。意図される目的に応じて、培養される細胞は、自家性であってもよいし、同種異系であってもよい。

本方法で治療可能な心臓病は、冠状動脈性心疾患、心臓弁膜症、心筋梗塞、うっ血性心不全、心筋損傷、心筋虚血、炎症性心疾患（例えば、心内膜炎、炎症性心肥大又は心筋炎）、心筋症、不整脈又は心筋線維症のいずれかであり得る。

本開示の付随する特徴及び効果の多くは、添付の図面に関連して考慮される以下の詳細な説明を参照してより深く理解されることになる。

本記載は、添付図面を考慮して読まれる以下の詳細な説明からより深く理解されるはずである。

図１Ａは、本開示の実施例１．２による特定の脱細胞化手順の前（左の写真）及び後（右の写真）の心臓の写真であり、心臓はウサギから単離された。 図１Ｂは、本開示の実施例１．２による特定の脱細胞化手順の前（左の写真）及び後（右の写真）の心臓の写真であり、心臓はニワトリから単離された。 図２Ａは、本開示の実施例１．２によるヘマトキシリン及びエオシン染色（ＨＥ染色）の写真である。図２Ａは、Ｓ３０～Ｄ６０脱細胞化手順の前後の心臓の（４００倍の大きさでの）写真であり、心臓はウサギ（図２Ａ）又はニワトリ（図３Ｂ）から単離された。 図２Ｂは、本開示の実施例１．２によるヘマトキシリン及びエオシン染色（ＨＥ染色）の写真である。図２Ｂは、Ｓ３０～Ｄ６０脱細胞化手順の前後の心臓の（４００倍の大きさでの）写真であり、心臓はウサギ（図２Ａ）又はニワトリ（図３Ｂ）から単離された。 図２Ｃは、本開示の実施例１．２によるヘマトキシリン及びエオシン染色（ＨＥ染色）の写真である。図２Ｃは、４０倍又は１００倍の大きさでのＳ１０－Ｄ８０及びＳ８０－Ｄ１０無細胞心臓の写真である。 図２Ｄは、本開示の実施例１．２によるヘマトキシリン及びエオシン染色（ＨＥ染色）の写真である。図２Ｄは、４０倍又は１００倍の大きさでのＳ１０－Ｄ８０及びＳ８０－Ｄ１０無細胞心臓の写真である。 図３Ａは、本開示の実施例１．２による４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）染色の写真である。図３Ａは、Ｓ３０－Ｄ６０脱細胞化手順の前後の心臓の（１００倍の大きさでの）写真である。 図３Ｂは、本開示の実施例１．２による４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）染色の写真である。図３Ｂは、４０倍又は１００倍の大きさでのＳ１０－Ｄ８０及びＳ８０－Ｄ１０無細胞心臓の写真である。 図３Ｃは、本開示の実施例１．２による４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）染色の写真である。図３Ｃは、４０倍又は１００倍の大きさでのＳ１０－Ｄ８０及びＳ８０－Ｄ１０無細胞心臓の写真である。 図４は、本開示の実施例によるウエスタンブロットのデータである。ＳＣＦ処置：比較例ＡのＳＣＦ処置によって生成された脱細胞化心臓のタンパク質サンプルである。洗浄剤処置：比較例Ｂの洗浄剤処置によって生成された脱細胞化心臓のタンパク質サンプルである。静的ＳＣＦ処置（Static SCF treatment）：比較例Ｃの静的ＳＣＦ処置によって生成された脱細胞化心臓のタンパク質サンプルである。Ｓ１０－８０処置（S10-80 treatment）、Ｓ８０－Ｄ１０処置（S80-D10treatment）、Ｓ３０－Ｄ６０処置（S30-D60 treatment）：実施例１．１に特定の脱細胞化手順によってそれぞれ生成された脱細胞化心臓のタンパク質サンプルである。コントロール群：大量の水で洗浄される以外は脱細胞化処置に供されない未処置心臓である。Ｐｕｒｅ ｃｏｌ ｏｌｄ：標準的なＩ型コラーゲン；Ｐｕｒｅ ｃｏｌ ｎｅｗ：標準的なＩ型コラーゲンである。 図５は、本開示の実施例１．２による脱細胞化処置の前後の心臓の原線維構造を示す４００倍の大きさでの走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）の写真である。 図６は、本開示の実施例１．２による脱細胞化処置の前後の心臓のコラーゲンのレベル及び分布を示す４００倍の大きさでのマッソントリクローム染色の写真である。 図７Ａは、比較例ＡのＳＣＦ処置によって生成された脱細胞化心臓を示す写真である。図７Ａは、ＳＣＦ処置前後の心臓の形態である。 図７Ｂは、比較例ＡのＳＣＦ処置によって生成された脱細胞化心臓を示す写真である。図７Ｂは、処置後に脱細胞化心臓に残存する残存細胞を示す４０倍又は１００倍の大きさでのＨＥ染色の写真である。残存細胞及びＤＮＡ分子は、それぞれ図７Ｂ及び７Ｃに矢印によって示される。 図７Ｃは、比較例ＡのＳＣＦ処置によって生成された脱細胞化心臓を示す写真である。図７Ｃは、脱細胞化心臓におけるＤＮＡ分子のレベルを示す４０倍又は１００倍の大きさでのＤＡＰＩ染色の写真である。残存細胞及びＤＮＡ分子は、それぞれ図７Ｂ及び７Ｃに矢印によって示される。 図８Ａは、比較例Ｂの洗浄剤処置によって生成された脱細胞化心臓を示す写真である。図８Ａは、洗浄剤処置の前後の心臓の形態である。 図８Ｂは、比較例Ｂの洗浄剤処置によって生成された脱細胞化心臓を示す写真である。図８Ｂは、処置後に脱細胞化心臓に残存する残存細胞を示す４０倍又は１００倍の大きさでのＨＥ染色の写真である。残存細胞及びＤＮＡ分子は、それぞれ図８Ｂ及び８Ｃに矢印によって示される。 図８Ｃは、比較例Ｂの洗浄剤処置によって生成された脱細胞化心臓を示す写真である。図８Ｃは、脱細胞化心臓におけるＤＮＡ分子のレベルを示す４０倍又は１００倍の大きさでのＤＡＰＩ染色の写真である。残存細胞及びＤＮＡ分子は、それぞれ図８Ｂ及び８Ｃに矢印によって示される。 図９Ａは、比較例Ｃの静的ＳＣＦ処置によって生成された脱細胞化心臓を示す写真である。図９Ａは、静的ＳＣＦ処置の前後の心臓の形態である。 図９Ｂは、比較例Ｃの静的ＳＣＦ処置によって生成された脱細胞化心臓を示す写真である。図９Ｂは、処置後に脱細胞化心臓に残存する残存細胞を示す４０倍又は１００倍の大きさでのＨＥ染色の写真である。残存細胞及びＤＮＡ分子のどちらも、図９Ｂ及び９Ｃにおいて検出されなかった。 図９Ｃは、比較例Ｃの静的ＳＣＦ処置によって生成された脱細胞化心臓を示す写真である。図９Ｃは、脱細胞化心臓におけるＤＮＡ分子のレベルを示す４０倍又は１００倍の大きさでのＤＡＰＩ染色の写真である。残存細胞及びＤＮＡ分子のどちらも、図９Ｂ及び９Ｃにおいて検出されなかった。

添付図面との関連で以下に与えられる詳細な説明は、本実施例の説明としてのものであり、本実施例が構成又は利用され得る形態のみを示すものではない。その説明は、実施例の機能及び実施例を構成して動作させるためのステップの配列を説明する。ただし、同一又は同等の機能及び配列は、異なる実施例によっても実現され得る。

Ｉ．定義
便宜上、明細書、実施例及び付随する特許請求の範囲において採用される所定の用語をここにまとめる。ここで特に断りがない限り、本開示で採用される科学的及び技術的専門用語は、一般的に当業者に理解及び使用される意味を有するものとする。また、文脈によってそれ以外が必要とされない限り、単数形の用語はその複数形を含むものとし、複数形の語は単数形を含むものとすることが理解される。具体的には、ここで及び特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」及び「ａｎ」は、それ以外を文脈が明示しない限り、複数の参照を含む。また、ここで及び特許請求の範囲で使用されるように、用語「少なくとも１つの」及び「１以上の」は、同じ意味を有し、１、２、３又はそれ以上を含む。

発明の広い範囲を説明する数値範囲及びパラメータは概数であるものの、特定の実施例で説明される数値は可能な限り正確に報告される。ただし、いずれの数値も、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的にもたらされる所定の誤差を本来的に含む。また、ここで使用されるように、用語「約」は、所与の値又は範囲の１０％、５％、１％又は０．５％内を一般に意味する。あるいは、用語「約」は、当業者によって考慮される場合の平均の許容標準誤差内を意味する。有効な／効果的な実施例以外においても、明示の断りがない限り、ここに開示されるその材料の量、継続時間、温度、動作条件、量の比率などに対するものなどの数値範囲、量、値及び割合の全ては、全ての事例において用語「約」によって変更されるものとして理解されるべきである。したがって、逆のことが示されない限り、本開示及び添付の特許請求の範囲で説明される数値パラメータは、所望のように変化し得る概数である。少なくとも、各数値パラメータは、報告される有効数字の数を考慮してかつ通常の四捨五入手段を適用して少なくとも解釈されるべきである。

ここで使用される用語「高張液」は、水分子が浸透によって臓器から溶液に引き出されるように、溶液と接触又は溶液に浸漬される臓器（例えば、心臓）よりも高濃度の溶質（例えば、ＮａＣｌ）を有する溶液をいう。これに対して、用語「低張液」は、水分子が浸透によって溶液から臓器に引き出されるように、溶液と接触又は溶液に浸漬される臓器（例えば、心臓）よりも低濃度の溶質（例えば、ＮａＣｌ）を有する溶液をいう。

用語「被検体」は、本発明の無細胞臓器（例えば、無細胞心臓）及び／又は方法で治療可能なヒト種を含む哺乳動物のことである。用語「被検体」は、ある性別が具体的に示されない限り雄及び雌の両性別をいうものとする。

ＩＩ．発明の説明
本開示は、（無細胞心臓のような）無細胞臓器を生成する改善された方法、そこから生成される無細胞臓器及び結果として生成された無細胞臓器の種々の疾患（例えば、心臓病）の治療における使用を提供することを目的とする。

したがって、本開示の第１の態様は、無細胞臓器の生来の構造及び立体配座が保存されている無細胞臓器を生成する方法に向けられる。低い免疫原性の特徴に基づいて、結果として生成された無細胞臓器は、移植された患者に望ましくない拒絶反応を誘発することなく、その上／その中での細胞増殖を支持する最適な生体スキャフォールドとして作用し得る。

無細胞臓器を生成する方法は、
（ａ）臓器を、１０～１００分の第１の期間、３０～５０℃の第１の温度で、２００～５００バールの第１の圧力下で、第１の共溶媒の存在下で、第１のＳＣＦに供するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の第１のＳＣＦ処置臓器を、１０～１００分の第２の期間、３０～５０℃の第２の温度で、２００～５００バールの第２の圧力下で、第２の共溶媒の存在下で、第２のＳＣＦの連続流に供するステップであって、第２のＳＣＦの流速が１０～３０リットル／分である、ステップと、
を備える。

本方法は、酵素、イオンキレート剤、洗浄剤、グリセロール及びそれらの組合せからなる群から選択される薬剤のいずれかで臓器を処置するステップを備えないことを特徴とする。

本方法を開始する前に、まず、臓器は、動物から採取される。本開示における使用に適した動物は、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、サル、ニワトリ及びヒトを含むが、これに限定されない。所望の目的に応じて、本方法で処置される臓器は、心臓、腸、肺、脾臓、腎臓、肝臓、胃、膵臓、膀胱、結腸、直腸又は脳であり得る。本開示のある実施形態によれば、臓器は、ニワトリから採取される心臓である。代替の実施形態によれば、臓器は、ウサギから採取される心臓である。好ましくは、臓器は、ヒト又はブタから採取される心臓である。

そして、採取された臓器（例えば、心臓）は、ステップ（ａ）で説明されるようにＳＣＦの静的処置に供される。具体的には、臓器は、１０～１００分の第１の期間、３０～５０℃の第１の温度で、２００～５００バールの第１の圧力下で、第１の共溶媒の存在下で、ＳＣＦに静的に浸漬される。臓器を静的に処置するのに適したＳＣＦの例は、ＳｃＣＯ_２、ＳｃＮ_２Ｏ、超臨界アルカン、超臨界アルケン、超臨界アルコール、超臨界アセトン及びそれらの組合せを含むが、これに限定されない。一実施例では、ＳＣＦはＳｃＣＯ_２である。

第１の共溶媒は、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、ｓｅｃ－ブタノール、ｔ－ブタノール及びシクロブタノールからなる群から選択され得るＣ_１－４アルコールである。ある実施形態によれば、第１の共溶媒は、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００（体積％）のエタノールなどの、３０～１００％（体積％）のエタノールである。好ましくは、第１の共溶媒は、５０～９０％（体積％）のエタノールである。より好ましくは、第１の共溶媒は、７０、７５又は８０％（体積％）のエタノールなどの７０～８０％（体積％）のエタノールである。特定の一実施例では、第１の共溶媒は、７５％（体積％）のエタノールである。

静的処置は、圧力が２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０又は５００バールなどの約２００～５００バールであり、温度が３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０℃などの３０～５０℃である条件で実施される。好ましくは、圧力は約３００～４００バールであり、温度は約３５～４５℃である。静的処置の期間は、約１０～１００分、例えば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００分であり、好ましくは、処置期間は約１０～８０分である。

静的処置の後、臓器は、ステップ（ｂ）で説明されるようにＳＣＦの動的処置にさらに供される。このステップで、ＳＣＦは、ステップ（ａ）の生成物を介して、約０．１～１００リットル／分、例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００リットル／分の流速でポンピングされる。好ましくは、ＳＣＦの流速は、約１～５０リットル／分である。より好ましくは、ＳＣＦの流速は、約１０～３０リットル／分である。本開示の効果的な一実施例では、流速は、約２０リットル／分である。

ステップ（ｂ）のＳＣＦは、ＳｃＣＯ_２、ＳｃＮ_２Ｏ、超臨界アルカン、超臨界アルケン、超臨界アルコール、超臨界アセトン又はそれらの組合せのいずれかであり得る。理解されるように、ステップ（ａ）及び（ｂ）のＳＣＦは、同一でもよいし、異なってもよい。特定の一実施例によれば、ステップ（ａ）及び（ｂ）の双方のＳＣＦは、ＳｃＣＯ_２である。

ステップ（ｂ）の第２の共溶媒は、Ｃ_１－４アルコール、例えば、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、ｓｅｃ－ブタノール、ｔ－ブタノール又はシクロブタノールである。ある実施形態によれば、第２の共溶媒は、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００（体積％）のエタノールなどの、３０～１００％（体積％）のエタノールである。好ましくは、第２の共溶媒は、５０～９０％（体積％）のエタノールである。より好ましくは、第２の共溶媒は、７０、７５又は８０％（体積％）のエタノールなどの７０～８０％（体積％）のエタノールである。特定の一実施例では、第２の共溶媒は、７５％（体積％）のエタノールである。ステップ（ａ）及び（ｂ）の共溶媒、すなわち、第１及び第２の共溶媒は、同一であってもよいし、異なってもよいことが理解されるはずである。当業者は、第１及び第２の共溶媒として適切な薬剤（例えば、Ｃ_１―４アルコール）を独立に選択してもよく、実際の使用に応じてそれらの濃度を調整してもよい。

動的処置は、約２００～５００バールの圧力下で約３０～５０℃の温度で実施され、すなわち、動的処置のための圧力は２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０又は５００バールに設定されてもよく、温度は３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０℃に設定されてもよい。好ましくは、圧力は約３００～４００バールに設定され、温度は約３５～４５℃に設定される。動的処置の期間は、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００分などの約１０～１００分であり、好ましくは、処置期間は約１０～８０分である。

理解され得るように、静的処置及び動的処置のための具体的な期間は、選択されたＳＣＦのタイプ、処置圧力及び温度並びに動的処置の流速などの要因によって変化し得る。一実施形態によれば、臓器は３０分間４０℃で３５０バールの圧力下で静的ＳｃＣＯ_２処置に供され、そして６０分間４０℃で３５０バールの圧力下で２０リットル／分の流速で動的ＳｃＣＯ_２処置に供される。他の実施形態によれば、臓器は１０分間４０℃で３５０バールの圧力下で静的ＳｃＣＯ_２処置に供され、そして８０分間４０℃で３５０バールの圧力下で２０リットル／分の流速で動的ＳｃＣＯ_２処置に供される。さらに他の実施形態によれば、臓器は８０分間４０℃で３５０バールの圧力下で静的ＳｃＣＯ_２処置に供され、そして１０分間４０℃で３５０バールの圧力下で２０リットル／分の流速で動的ＳｃＣＯ_２処置に供される。

実際の状況（例えば、脱細胞化された臓器のタイプ又はサイズ）に応じて、当業者は、脱細胞化手順を最適化するように、ＳＣＦ及び共溶媒のタイプ、共溶媒の濃度、処置の期間、圧力及び温度並びに動的処置の流速を含む、静的及び動的処置の１以上の前述の操作パラメータを調整することができる。

選択的に、ステップ（ａ）の前に、本方法は、臓器を高張及び低張処置に供し、それによって細胞構造を破壊するステップをさらに備える。本開示のある実施形態によれば、高張処置は、臓器を０．５～４．０Ｍ（例えば、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５又は４Ｍ）のＮａＣｌを含む塩類溶液に１０～６０分間浸漬するステップを備え、低張処置は、臓器を水に１０～６０分間浸漬するステップを備える。本開示のある効果的な実施例によれば、臓器は、２．０ＭのＮａＣｌを含む塩類溶液に３０分間浸され、その後、さらに３０分間の水の処置が続く。好ましくは、高張及び低張処置は少なくとも２回繰り返され、すなわち、臓器は少なくとも３回、高張及び低張処置に供される。

さらに選択的に、ステップ（ｂ）の後、本方法は、無細胞臓器のｐＨ値を中和し、無細胞臓器の中及び／又は上の汚染された病原体（例えば、細菌又はウイルス）を除去するための、ステップ（ｂ）の生成物（すなわち、動的ＳＣＦ処置臓器）をＮａＯＨを含む溶液に供するステップをさらに備える。本開示のある実施形態によれば、溶液は、０．０１～１．０ＮのＮａＯＨ、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９又は１．０ＮのＮａＣｌを含む。効果的な一実施例では、ステップ（ｂ）の生成物は、ｐＨ値が７．０に達するまでの期間、０．１ＮのＮａＯＨに浸漬される。

好ましくは、各ステップの後、臓器は、次の処置に供される前に、いずれの可溶性物質も除去するように大量の水で洗浄される。

本方法は、臓器を酵素消化（例えば、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ又はグリコシダーゼ処置）及び／又は（例えば、イオンキレート剤の使用による）イオンキレート化処置に供するステップを有さないことを特徴とする。さらに、本発明の臓器は洗浄剤の処置にも供されない。ここでの酵素消化は、臓器を、その例がペプシン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、キモパパイン、ブロメライン、アクチニダイン、プロテイナーゼＡ、プロテイナーゼＫ、ペプチダーゼ、フィシン、カルパイン、カスパーゼ及びそれらの組合せを含むがこれに限定されないプロテアーゼ、ＤＮＡヌクレアーゼ若しくはＲＮＡヌクレアーゼであり得るヌクレアーゼ、又はセルロース、アミラーゼ、ラクターゼ、キチナーゼ、スクロース、マルターゼ、ノイラミニダーゼ、インベルターゼ、ヒアルロニダーゼ若しくはリゾチームのいずれかであり得るグリコシダーゼで処置することをいう。ここでのイオンキレート化処置は、臓器を金属イオンキレート剤で処置することをいい、その例はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１－０－テトラキス（メチレンホスホン酸）（ＤＯＴＰ）、トランス－１，２－ジアミノシクロヘキサン－四酢酸（ＣＤＴＡ）、４，５－ジヒドロキシベンゼン－１，３－ジスルホン酸（Ｔｉｒｏｎ）、チオ尿素、８－ヒドロキシキノリン－５－スルホン酸、３，６－ジスルホ－１，８－ジヒドロキシ－ナフタレン、Ｅｒｉｏｃｈｒｏｍｅｓｃｈｗａｒｚ Ｔ（１－（１－ヒドロキシ－２－ナフチルアゾ）－２－ヒドロキシ－５－ニトロ－４－ナフタレンスルホン酸）及びプルプリン酸アンモニウムを含むがこれに限定されない。ここでの洗浄剤処置は、臓器を洗浄剤で処置することをいい、特に液体洗浄剤は、カチオン性（例えば、第四級アンモニウム化合物）、アニオン性（例えば、アルキルベンゼンスルホン酸塩、胆汁酸など）、又は非イオン性（例、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）及び／又はＢｒｉｊ（登録商標）シリーズ）である界面活性剤などの両親媒性分子からなる。さらに、本発明の臓器は、ある従来の処理によって必要とされるように、グリセロール溶液に浸漬される必要もない。

本開示の他の態様は、上記の任意の実施形態による方法によって生成された無細胞臓器（例えば、無細胞心臓）に向けられる。結果として生成された無細胞臓器は、生来の臓器のコラーゲン線維の完全性を保持し、移植された臓器を受け入れた患者において免疫応答を誘発し得るいずれの細胞物質も欠いている。本開示のある実施例によれば、本方法によって生成された無細胞臓器は、血管の生来の立体配座を維持しながら、半透明であるように見える。

本開示はまた、上記の方法によって生成された無細胞臓器（例えば、無細胞心臓）の使用によって、疾患（例えば、心臓病）を有する被検体を治療する方法を提供する。疾患を治療する方法は、被検体に本無細胞臓器（例えば、無細胞心臓）又はその一部を移植するステップを備える。

上記の方法によって生成された無細胞臓器は細胞がその中及び／又はその上で成長する生体スキャフォールドとしての使用に適しており、したがって、ある選択的な実施形態では、本開示の無細胞臓器は移植前に生体外で細胞と共に事前に培養され得る。細胞は、当技術分野で知られている任意の細胞培養技術により培養され得る。本開示の無細胞臓器の中及び／又はその上で培養される細胞は、心筋細胞、ペースメーカー細胞、幹細胞又はそれらの組合せであり得る。使用目的に応じて、細胞は、自家性（すなわち、無細胞臓器を移植片として受け取る宿主に由来する）又は同種異系（すなわち、宿主以外の被検体に由来する）であり得る。

本無細胞臓器及び／又は方法で治療可能な例示的な疾患は、心臓、腸、肺、脾臓、腎臓、肝臓、胃、膵臓、膀胱、結腸、直腸及び脳の疾患を含むが、これに限定されない。本無細胞臓器及び／又は方法で治療可能な心臓病の非限定的な例は、冠状動脈性心疾患、心臓弁膜症、心筋梗塞、うっ血性心不全、心筋損傷、心筋虚血、炎症性心疾患（例えば、心内膜炎、炎症性心肥大又は心筋炎）、心筋症、不整脈及び心筋線維症を含む。

本無細胞臓器及び／又は方法で治療可能な被検体は、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、サル、ニワトリ又はヒトであり得る。好ましくは、被検体はヒトである。

以下の実施例は、本発明のある態様を明瞭にして本発明の実施の際に当業者を補助するように提供される。これらの実施例は、いかなる態様においても発明の範囲を限定するものとしてみなされるべきではない。更なる詳述なしに、当業者であれば、ここでの説明に基づいて、本発明をその最大の範囲で利用することができると考えられる。ここに引用される全ての刊行物は、その全体において参照によってここに取り込まれる。

材料及び方法
ヘマトキシリン及びエオシン染色（ＨＥ染色）
心臓切片を１０分間キシレンに浸漬することにより脱パラフィンし、処置は１回繰り返された。そして、脱パラフィン組織を、アルコールの濃度がそれぞれ１００％から９５％、８５％及び７５％まで変化する一連のアルコール浴を通過させることにより水和した。各通過において、組織サンプルを２分間アルコール溶液中に放置し、そして大量の脱イオン水でリンスした。水和後、組織サンプルを３～５分間ヘマトキシリンで染色し、そして脱イオン水及び７５％のエタノールで洗浄した。ヘマトキシリン染色軟骨を約３０秒間１％のエオシンＹでさらに染色し、続いて脱イオン水並びに９５％及び１００％のエタノールで順次洗浄した。

ＤＡＰＩ染色
心臓切片をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で平衡化し、続いてＤＡＰＩ染色溶液（３００ｎＭ）を添加し、１～５分間室温でインキュベートした。サンプルを３～５分間ＰＢＳによって洗浄した。ＤＡＰＩ染色細胞を、適切なフィルタによる蛍光顕微鏡によって検出した。

実施例１ 静的及び動的ＳＣＦ処置によって生成される無細胞心臓
全細胞、細胞デブリ及び細胞成分（例えば、タンパク質、核酸及び脂質）などの細胞物質を、標的組織又は臓器（例えば、心臓）から除去する３つの脱細胞化手順が、この実施例において例示される。この実施例において例示される３つの脱細胞化手順はすべて、その後特定の条件下で静的及び動的ＳＣＦ処置が続き、そして中和ステップが続く、高張及び低張処置を備える。脱細胞化手順の詳細は実施例１．１に説明され、結果として生成された無細胞生成物は実施例１．２に特徴付けられた。

１．１ 無細胞心臓の調製
（１）高張及び低張処置
ウサギ又はニワトリから採取した心臓を最初に約２４時間水に浸漬し、それに続いて高張及び低張処置（すなわち、３０分間室温でＮａＣｌ溶液（２Ｍ）に浸し、そしてさらに３０分間室温で水に浸す）を３回行った。そして、高張／低張処置心臓を大量の水で洗浄していずれの残留塩類も除去した。

（２）静的及び動的ＳＣＦ処置
次に、心臓を組織ホルダに配置し、そしてそれを１００ｍｌのエタノール（７５％）が容器中に存在するＳｃＣＯ_２システム（ＨＥＬＩＸ（商標）、超臨界流体抽出器（ＳＦＥ）システム）の容器に挿入した。そして、ＳｃＣＯ_２システムを１０、３０又は８０分間静的ＳｃＣＯ_２処置について４０℃で３５０バールの圧力で動作させ、それに続いて、残留細胞物質を除去するように８０、６０又は１０分間約２０リットル／分の流速で動的ＳｃＣＯ_２処置を続け、それにより脱細胞化された心臓を生成した。

（３）中和
そして、各脱細胞化心臓をｐＨ値が７．０に達するまで０．１ＮのＮａＯＨで処置し、１０分間水で洗浄した。すべての無細胞心臓を使用まで滅菌状態で保存した。

結果として生成された無細胞心臓を、それらのＳＣＦ処置条件に従って、Ｓ３０－Ｄ６０、Ｓ１０－Ｄ８０及びＳ８０－Ｄ１０無細胞心臓とそれぞれ指定した。
具体的に、
（１）Ｓ３０－Ｄ６０無細胞心臓とは、Ｓ３０－Ｄ６０脱細胞化手順によって生成された心臓をいい、それは高張／低張処置、その後に続く３０分間の静的ＳｃＣＯ_２処置及び６０分間の動的ＳｃＣＯ_２処置、並びにその後の中和ステップを備え、
（２）Ｓ１０－Ｄ８０無細胞心臓とは、Ｓ１０－Ｄ８０脱細胞化手順によって生成された心臓をいい、それは高張／低張処置、その後に続く１０分間の静的ＳｃＣＯ_２処置及び８０分間の動的ＳｃＣＯ_２処置、並びにその後の中和ステップを備え、
（３）Ｓ８０－Ｄ１０無細胞心臓とは、Ｓ８０－Ｄ１０脱細胞化手順によって生成された心臓をいい、それは高張／低張処置、その後に続く８０分間の静的ＳｃＣＯ_２処置及び１０分間の動的ＳｃＣＯ_２処置、並びにその後の中和ステップを備える。

１．２ 無細胞心臓の特徴付け
実施例１．１において生成された無細胞心臓の形態を顕微鏡下で調べ、結果をそれぞれ図１Ａ及び１Ｂに示す。図１Ａの写真は脱細胞化処置の前後のウサギの心臓に向けられ、データはいずれの処置も心臓の構造に影響をしなかったことを示した。図１Ｂに示すように、同様の結果はニワトリの心臓において観察された。脱細胞化手順の後、無細胞心臓は、生来の心臓（Naive heart（iはiウムラウト））（すなわち、大量の水で洗浄される以外は実施例１．１において説明されるいずれの処置もない心臓）と比較して半透明であるように見えた（図１Ａ及び１Ｂ）。

無細胞心臓の立体配座を、ＨＥ染色及びＤＡＰＩ染色によってさらに調べた。ＨＥ染色のデータは、コントロール群（すなわち、未処置心臓）と比較して、本Ｓ３０－Ｄ６０脱細胞化手順は、心臓からすべての常在細胞を実質的に除去し、したがって、Ｓ３０－Ｄ６０無細胞心臓において細胞が検出されなかったことを示した（図２Ａ及び２Ｂ）。同様に、Ｓ１０－Ｄ８０又はＳ８０－Ｄ１０脱細胞化手順の後、細胞シグナルは、Ｓ１０－Ｄ８０及びＳ８０－Ｄ１０無細胞心臓においてＨＥ染色によって検出されなかった（図２Ｃ及び２Ｄ）。ＤＡＰＩ染色のデータは、未処置心臓は相対的に高レベルのＤＮＡカウントを有したが、本方法はＳ３０－Ｄ６０無細胞心臓において細胞物質を効果的に除去したことをさらに確認した（図３Ａ）。脱細胞化効果は、Ｓ１０－Ｄ８０及びＳ８０－Ｄ１０無細胞心臓においても観察され、蛍光顕微鏡下ではＤＮＡシグナルは検出されなかった（図３Ｂ及び３Ｃ）。定量化された結果によれば、Ｓ３０－Ｄ６０、Ｓ１０－Ｄ８０及びＳ８０－Ｄ１０脱細胞化手順を含む本脱細胞化手順は、９０％より多い細胞物質を除去した（図４）。

脱細胞化効果に加えて、本方法が心臓のスキャフォールド構造を破壊するかもまた評価された。図５に示すＳＥＭ画像のように、コントロール群と比較して、Ｓ３０－Ｄ６０無細胞心臓は、移植後に細胞がその上で成長する生物学的なスキャフォールドとして作用し得る相対的に無傷の原線維構造を有した。図６に示すマッソントリクローム染色のデータは、Ｓ３０－Ｄ６０無細胞心臓におけるコラーゲンのレベル及び分布がコントロール群と同様であることをさらに確認した。

まとめると、これらの結果は、Ｓ３０－Ｄ６０、Ｓ１０－Ｄ８０及びＳ８０－Ｄ１０脱細胞化手順を含む本脱細胞化手順が、標的臓器（例えば、心臓）から標的臓器の原線維構造を破壊することなく細胞物質を除去するのに有用であったことを示した。

比較例 比較方法によって生成される無細胞心臓
実施例１に例示した方法に加えて、本発明は、また、それらの脱細胞化効果を評価するように生来の心臓（Naive heart（iはiウムラウト））を代替の脱細胞化方法で処置した。

Ａ．ＳＣＦ処置による脱細胞化心臓の調製及び特徴付け
ウサギから採取した心臓を、３時間３５℃で１００バールの圧力で作動されるＳＣＦ処置に供し、１６ｍｌのエタノール（７５％）が容器中に存在した。そして、ＳＣＦ処置心臓を顕微鏡、並びにＨＥ及びＤＡＰＩ染色によって調べた。

図７Ａに示す写真のように、ＳＣＦ処置は、心臓の形態をそれほど変化させなかった。しかし、そのようなＳＣＦ処置は、心臓に対して低い脱細胞化効果を示し、心臓の大動脈、心房及び心室において常在細胞の約８０％が残存した（図７Ｂ、常在細胞を矢印によって示す）。ＤＡＰＩ染色のデータは、また、高レベルのＤＮＡカウントがＳＣＦ処置心臓において検出されたことも示した（図７Ｃ、常在ＤＮＡ分子を矢印によって示す）。

Ｂ．洗浄剤処置による脱細胞化心臓の調製及び特徴付け
ウサギから採取した心臓をマグネチックスターラープレート及びマグネチックスターラーに供し、２４時間９５ｒｐｍで４℃の蒸留水中で回転させた。蒸留水を０．５％のＴＲＩＴＯＮ（商標） Ｘ－１００を含有する０．０５％の水酸化アンモニウム溶液で置換した後、心臓を７２時間９５ｒｐｍで４℃で回転させた。そして、心臓を２４時間９５ｒｐｍで４℃の蒸留水によって洗浄し、それにより残留洗浄剤を除去した。

図８Ａの写真は、洗浄剤処置が心臓の構造にそれほど影響しなかったことを示した。それにもかかわらず、細胞物質（すなわち、常在細胞及びＤＮＡ分子）の約７０％が洗浄剤処置心臓に残存しており（図８Ｂ及び８Ｃ、細胞物質を矢印で示す）、そのような洗浄剤処置が無細胞臓器の生成に対して十分な効果を提供しない可能性があることを示した。

Ｃ．静的ＳＣＦ処置による脱細胞化心臓の調製及び特徴付け
この実施例の脱細胞化手順は、ＳＣＦ処置ステップ以外は実施例１．１と同様であり、ウサギの心臓はいずれの動的ＳＣＦ処置なしに、静的ＳＣＦ処置で処置されるだけであった。具体的には、高張／低張処置心臓に対して、容器中の１６ｍｌのエタノール（７５％）の存在下での３時間３５℃で１００バールの圧力での静的ＳｃＣＯ_２処置、それに続く実施例１．１で説明するような中和ステップを行った。

図９Ａ～９Ｃのデータは、静的ＳＣＦ処置が心臓からの（それぞれ図９Ｂ及び９Ｃに示されるように常在細胞及びＤＮＡ分子を含む）細胞物質の除去において効果的であったことを示したが、そのような脱細胞化処置は臓器の構造を有害に破壊し、コントロール群と比較して、静的ＳＣＦ処置で処置された心臓は腫れた形態を示した（図９Ａ）。

図４に示すデータのように、細胞物質が実質的に検出されなかった本方法（すなわち、実施例１の方法）によって生成された無細胞心臓と比較して、比較方法によって処置された心臓においては相対的に高レベルの細胞物質が存在した。データは、本方法が（ＳＣＦ、洗浄剤及び静的ＳＣＦ処置を含む）他の方法よりも優れた脱細胞化効果を示したことを実証した。

結論として、本開示は、その生来の構造及び立体配座を破壊することなく、標的臓器（例えば、心臓）から細胞物質を効率良く除去する方法を提供する。その中に高レベルの細胞物質を残存させ、又は破壊的な構造を示した本開示の比較例Ａ～Ｃに例示されるような他の方法によって生成された脱細胞化臓器と比較して、本方法によって生成された無細胞臓器は、種々の疾患、例えば、心臓病を治療する、より可能性及び安全性の高い手段を提供する。

実施形態の上記説明は例示のみのために与えられること及び種々の変形が当業者によってなされ得ることが理解されるはずである。上記仕様、実施例及びデータは、発明の例示的実施形態の構造及び使用の完全な説明を与える。発明の種々の実施形態がある程度の特殊性で又は１以上の個別の実施形態を参照して上述されたが、当業者であれば、本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく開示の実施形態に対して多数の変更を行うことができるはずである。

Claims (12)

1. 無細胞臓器を生成する方法であって、
   （ａ）臓器を、１０～１００分の第１の期間、３０～５０℃の第１の温度で、２００～５００バールの第１の圧力下で、３０～１００％（体積％）のエタノールの存在下で、第１の超臨界流体（ＳＣＦ）に供するステップと、
   （ｂ）前記ステップ（ａ）の前記第１のＳＣＦ処置臓器を、１０～１００分の第２の期間、３０～５０℃の第２の温度で、２００～５００バールの第２の圧力下で、３０～１００％（体積％）のエタノールの存在下で、第２のＳＣＦの連続流に供するステップであって、前記第２のＳＣＦの前記流速が１０～３０リットル／分である、ステップと、
   を備え、
   前記方法は、酵素、イオンキレート剤、洗浄剤、グリセロール及びそれらの組合せからなる群から選択される薬剤で前記臓器を処置するステップを備えない、方法。
2. 前記第１及び第２のＳＣＦが、超臨界二酸化炭素（ＳｃＣＯ_２）、超臨界亜酸化窒素（ＳｃＮ_２Ｏ）、超臨界アルカン、超臨界アルケン、超臨界アルコール、超臨界アセトン及びそれらの組合せからなる群から独立して選択される、請求項１に記載の方法。
3. 前記第１及び第２のＳＣＦの各々が前記ＳｃＣＯ_２である、請求項２に記載の方法。
4. 前記第１及び第２の圧力の各々が３５０バールであり、
   前記第１及び第２の温度の各々が４０℃であり、
   前記第１及び第２の期間の各々が１０～８０分であり、
   前記第２のＳＣＦの前記流速が２０リットル／分である、請求項３に記載の方法。
5. 前記第１の期間が３０分であり、前記第２の期間が６０分である、
   前記第１の期間が１０分であり、前記第２の期間が８０分である、または
   前記第１の期間が８０分であり、前記第２の期間が１０分である、請求項４に記載の方法。
6. 前記ステップ（ａ）の前に、
   （１）前記臓器を１０～６０分間高張液に浸漬するステップと、
   （２）前記ステップ（１）の前記高張液処置臓器を１０～６０分間低張液に浸漬するステップと、
   をさらに備える請求項１に記載の方法。
7. 前記高張液が０．５～４．０ＭのＮａＣｌを含有する塩類溶液であり、前記低張液が水である、請求項６に記載の方法。
8. 前記ステップ（１）において、前記臓器が３０分間２．０ＭのＮａＣｌを含有する前記塩類溶液に浸漬され、
   前記ステップ（２）において、前記塩類溶液処置臓器が３０分間水に浸漬される、
   請求項７に記載の方法。
9. 前記ステップ（１）及び（２）が少なくとも２回繰り返される、請求項６に記載の方法。
10. 前記ステップ（ｂ）の後、前記第２のＳＣＦ処置臓器を０．０１～１．０ＮのＮａＯＨを含有する溶液に供するステップをさらに備える請求項１に記載の方法。
11. 前記臓器が、心臓、腸、肺、脾臓、腎臓、肝臓、胃、膵臓、膀胱、結腸、直腸又は脳である、請求項１に記載の方法。
12. 前記臓器が心臓である、請求項１１に記載の方法。
    

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