CN111714701B - 一种神经脱细胞预处理方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种神经脱细胞预处理方法，所述方法首先通过高渗溶液和低渗溶液交替处理对细胞进行初步裂解，再利用单向冷冻干燥技术得到具有微通道的神经，进一步进行轴向穿刺，得到内部形成大通道的神经。神经经过预处理后，使用浓度较低的温和去污剂就能实现脱细胞效果，且对神经ECM分子破坏性较小。通过上述方法脱细胞得到的神经与传统Sondell脱细胞法制备得到的神经相比，其能更加有效的支持施万细胞渗入和迁移，具有更好的生物相容性，且作为移植物具有更好的神经修复效果。

Description

一种神经脱细胞预处理方法
技术领域
本发明属于神经生物学技术领域，具体涉及一种神经脱细胞预处理方法以及涉及所述预处理方法的一种神经脱细胞方法。
背景技术
周围神经是联络中枢神经和其它组织器官的重要神经结构，但是，临床上每年全球范围内有数百万人遭受周围神经损伤，由于预后不佳，对患者致残率较高。周围神经损伤往往伴有神经完整性的破坏，乃至神经缺损，导致早期无张力的直接缝合无法实施，这时就需要应用移植物来连接神经断端，恢复神经连续性。目前，自体神经移植被认为是修复周围神经缺损的“金标准”，在临床上应用广泛。然而，自体神经来源有限，且可供移植的神经均为皮神经，此外，当神经缺损长度大于7cm或者患者年龄大于50岁时，自体神经移植的修复成功率明显下降。这些因素极大的限制了自体神经的临床应用。
随着生物材料学和组织工程学的不断发展，大量组织工程神经被研发出来，如中空型神经导管。中空型神经导管可以在损伤神经的断端之间形成相对密闭的再生微环境，但是，中空型导管的内部缺乏新生细胞和轴突定向迁移和延伸所需的引导性因素，使新生轴突排列紊乱和错位愈合，难以获得满意的神经修复效果。而且，中空型神经导管主要用于修复长度小于2mm的神经缺损。
除此之外，脱细胞异体神经因为其特有的优势，有望成为自体神经可能的替代物，近来受到相关学者的广泛关注。异体组织移植的主要问题在于免疫排斥反应，会对神经再生造成极大的不利影响，最终导致移植物的排异和修复失败。神经经过脱细胞处理后，施万细胞、血管内皮细胞、束膜细胞等细胞性成分以及神经轴突与髓鞘等结构性成分均被去除，可以获得以基底膜管为主要结构的天然神经ECM(细胞外基质)三维支架。这种脱细胞基质成分的抗原性极小，大大降低了免疫排斥反应发生的可能性。
为了制备脱细胞神经，近年来研究者开发了多种方法。目前，最为学界认可的是Sondell方法和Hudson方法，其作为常规神经脱细胞方法被广泛使用。Sondell方法具体是通过TritonX-100和脱氧胆酸钠反复处理以达到去除细胞性成分的目的。研究表明此方法可能获得较好的脱细胞效果，但是由于离子型强效去垢剂脱氧胆酸钠的应用，使得制备的脱细胞神经往往伴有细胞外基质成分和结构的较大破坏。为了更好地制备脱细胞神经，Hudson等人提出了一种基于TritonX-200、SB-10和SB-16的改良脱细胞方法，但是，近年来Hudson方法中关键试剂TritonX-200已经停售，并且这种试剂也难以自行稳定而有效地合成，因而使得此方法在进一步科研分析以及临床诊治中的应用受到极大限制。
另外，上述神经脱细胞方法均是对正常神经进行洗脱，正常神经的内部微结构比较致密，孔隙率较低，孔隙直径较小，因此就需要浓度较大的去污剂进行洗脱，或者对神经进行长时间多次洗脱，这会对ECM造成较大的破坏。此外，不足的孔隙率和较小的孔隙直径还难以满足再生细胞的渗透和迁移的需要，并使种子细胞加载变得困难，导致细胞黏附率及分布均匀度不佳。上述问题均会影响神经修复效果。
为了解决上述问题，本发明提供一种神经脱细胞预处理方法，经过所述方法预处理后再进行脱细胞，能实现更好的神经脱细胞效果，且对ECM造成的破坏更小。与传统Sondell脱细胞法制备得到的神经相比，本发明提供的神经脱细胞法制备得到的神经能更加有效的支持施万细胞渗入和迁移，且具有更好的生物相容性，神经修复效果更佳。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种神经脱细胞预处理方法，本发明的另一个目的是提供一种神经脱细胞方法，所述方法使用温和去污剂就能达到较好的脱细胞效果。本发明还有一个目的是提供一种基于所述脱细胞方法制备的神经及其用途。
第一方面，本发明提供一种神经脱细胞预处理方法，所述方法包括如下步骤：
(1)初步裂解细胞：将神经在高渗溶液中处理12-24小时后，再在低渗溶液中处理12-24小时；
(2)单向冷冻干燥：将步骤(1)处理的神经置入硅胶模具中，垂直放在提前预冷的钢板上，再整体移入冷冻箱中冷冻1-1.5小时，再将放有神经的硅胶模具放入冷冻干燥装置中，冻干12-24小时，得到具有微通道的神经；
(3)轴向穿刺：将步骤(2)得到的神经沿着神经长轴纵向插入钢针，移去钢针，得到内部形成大通道的神经。
所述高渗溶液选自浓度为5-10％的氯化钠溶液、10-20％葡萄糖溶液、10-20％的甘露醇溶液中的一种或两种以上的组合。
所述低渗溶液为蒸馏水、浓度＜0.9％的氯化钠溶液、浓度＜5％的葡萄糖溶液中的一种或两种以上的组合。
优选的，所述步骤(1)中的神经来自异种神经或同种异体神经，其中，异种神经包括但不限于来自猴、猪、牛、羊、马、狗、鼠的神经，同种异体神经包括但不限于来自人、尸体的神经。
优选的，所述步骤(2)中钢板预冷温度为-80℃，冷冻箱温度为负20-负40℃之间。
优选的，所述步骤(3)中插入钢针的数量依据神经直径决定，钢针的长度贯穿神经全长，优选插入5-8根，钢针直径为100-200μm。
本发明所述的神经脱细胞预处理方法原理为：经过高渗溶液和低渗溶液交替处理后的神经置入硅胶模具中，硅橡胶模具使神经垂直于钢板并隔离垂直方向以外的其他方向的热量传递，钢板在预冷之后，可以在硅橡胶模具之中形成垂直温度梯度，有助于在神经内产生纵向冰晶，通过冷冻干燥升华冰晶，在神经中形成微通道，接着，在神经中轴向插入钢针后能形成数条大通道。经过上述预处理后，得到具有微通道和大通道的神经。对预处理之后的神经进行脱细胞，用低浓度去污剂就能实现较好的脱细胞效果。
在本发明的最优选实施方式中，所述神经脱细胞预处理方法具体包括：
(1)将神经在浓度为6-8％的氯化钠溶液中震荡处理12小时，再将神经放入蒸馏水中震荡处理12小时，震荡速率为120-150rpm；
(2)将步骤(1)处理的神经置入硅胶模具中，垂直放在预冷至-80℃的钢板上，再整体移入-40℃冷冻箱中冷冻1小时，再将放有神经的硅胶模具放入冷冻干燥装置中，冻干24小时，得到具有微通道的神经；
(3)移除硅胶模具，沿着神经长轴纵向插入5-8根钢针，移去钢针，得到内部形成大通道的神经。
第二方面，本发明提供一种神经脱细胞方法，所述方法包括如下步骤：
(1)按照上述方法对神经进行预处理；
(2)将预处理后的神经重新水化；
(3)将步骤(2)得到的神经置入体积浓度为1-2％的Triton X-100溶液中处理12-24小时，用蒸馏水洗涤3-5次，再转移到质量浓度为5-6％的CHAPS溶液中处理12-24小时，用蒸馏水洗涤3-5次，实现脱细胞。
在本发明的优选实施方式中，所述步骤(3)具体脱细胞方法如下：用体积浓度为2％的Triton X-100溶液震荡处理神经24小时，用蒸馏水洗涤3次，每次15分钟，再转移到质量浓度为6％的CHAPS溶液中震荡处理24小时，用蒸馏水洗涤3次，每次15分钟，获得脱细胞神经，置入含1％双抗的PBS溶液中4℃保存备用。
第三方面，本发明提供一种脱细胞神经，所述神经通过上述神经脱细胞方法制备得到。
第四方面，本发明提供一种脱细胞神经在神经移植中的应用。
所述神经移植为＞3cm的神经缺损移植，更优选的，本发明所述的脱细胞神经可实现＞7cm的神经缺损移植。
本发明将渗透压作用、单向冷冻干燥、轴向穿刺技术相结合，提出一种神经脱细胞前的预处理方法，根据所述方法处理的神经具有微通道和大通道，接着使用浓度较低的温和去污剂就能实现脱细胞，制备得到一种具有多通道的脱细胞神经。本发明提供的具有多通道的脱细胞神经具有如下有益效果：(1)在有效脱细胞的同时更好地保存ECM成分和因子；(2)多通道结构更加有效的支持施万细胞渗入和迁移；(3)体内移植研究表明，所述多通道脱细胞神经更有利于神经修复再生。
附图说明
本发明附图标志中A表示天然神经组，B表示Sondell脱细胞神经组，C表示本发明实施例2制备的脱细胞神经组。
图1脱细胞神经大体形貌比较，标尺＝2mm
图2脱细胞神经横切片HE染色，标尺＝50μm
图3脱细胞神经纵切片HE染色，标尺＝50μm
图4脱细胞神经横断面SEM图像
图5Western Blot分析结果
图6神经吸水性检测结果
图7细胞迁移实验结果，标尺＝50μm
图8各组神经移植物大体情况
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中使用的神经均取自Sprague Dawley大鼠坐骨神经。
实施例1脱细胞神经预处理
S1：室温下，将大鼠坐骨神经节段在6.0％(w/v)氯化钠溶液中震荡(120rpm)处理12小时，再在蒸馏水中震荡(120rpm)处理12小时；
S2：将处理后的神经置入硅胶模具中，垂直放在预冷至-80℃的钢板上，再整体移入-40℃冰箱中冷冻1小时，将放有神经的硅胶模具放入冷冻干燥器中，冻干24小时，得到具有微通道的神经；
S3：移除硅胶模具，沿着冻干的神经长轴纵向插入5根钢针(直径＝100μm，针距＝100μm，排列成五边形)，贯穿神经全长，在神经内部形成5个均匀分布的大通道，移去钢针，得到内部形成大通道的神经。
实施例2脱细胞神经的制备
S1：将实施例1预处理后的神经放入PBS溶液中过夜重新水化；
S2：用2％(v/v)Triton X-100溶液震荡(120rpm)处理神经24小时，随后用蒸馏水洗涤3次，每次15分钟，再转移到6％(w/v)CHAPS溶液中震荡(120rpm)处理24小时，用蒸馏水洗涤3次，每次15分钟，获得脱细胞神经，置入含1％双抗的PBS溶液中4℃保存备用。
本发明制备的脱细胞神经性能分析
(1)神经形貌观察
本实验分别设置天然神经组和Sondell脱细胞神经组作为对照，天然神经组为取自大鼠坐骨神经的新鲜神经节段，Sondell脱细胞神经组按照经典Sondell脱细胞法处理得到，具体步骤如下：(1)室温下，将神经节段在蒸馏水中浸泡7h，期间换液一次；(2)在3％Triton X-100中振荡(120rpm)处理12h，在蒸馏水中荡洗3次，每次10min；(3)在4％脱氧胆酸钠中振荡(120rpm)处理24h，在蒸馏水中荡洗3次，每次10min；(4)在3％Triton X-100中振荡(120rpm)处理12h，在蒸馏水中荡洗3次，每次10min；(5)在4％脱氧胆酸钠中振荡(120rpm)处理24h，在蒸馏水中荡洗3次，每次10min；(6)置于含1％双抗的PBS溶液中，4℃储存备用。
图1呈现了大鼠坐骨神经经过脱细胞处理后的大体形貌比较，其中，A为天然神经，可见新鲜神经呈乳白色，质地比较紧实，B和C分别是Sondell脱细胞神经和本发明制备的脱细胞神经，可见脱细胞后神经透明度明显增加，组织膨胀，质地变疏松，直径略有增大。
(2)组织学检测
将天然神经、Sondell脱细胞神经和本发明制备的脱细胞神经分别制备横向石蜡切片和纵向石蜡切片，石蜡切片的制备按照本领域常规方法进行制备。
对上述石蜡切片进行HE染色，HE染色步骤为：(1)石蜡切片脱蜡水化:①二甲苯-I中脱蜡10min；②二甲苯-II脱蜡10min；③无水乙醇-I 2min；④无水乙醇-II 2min；⑤95％乙醇2min；⑥80％乙醇2min；⑦70％乙醇2min；⑧蒸馏水2min；(2)苏木素染液染色10min，自来水冲洗；(3)分化液分化5s；(4)自来水冲洗1h；(5)置伊红染液1min，自来水冲洗；(6)脱水，透明：①80％乙醇2min；②90％乙醇2min；③95％-I乙醇2min；④95％-I乙醇2min；⑤无水乙醇-I 2min；⑥无水乙醇-II 2min；⑦二甲苯-I中脱蜡10min；⑧二甲苯-II脱蜡10min；(8)中性树胶封片。
图2横切片HE染色结果显示，天然神经横切面可见髓鞘化的轴突均匀分布，此外还存在许多散在的施万细胞，细胞核清晰，髓鞘外周淡染呈网格状结构。Sondell脱细胞神经组中，施万细胞和髓鞘基本被去除，神经内膜结构被较好的保留。本发明制备的脱细胞神经组中，神经横切面上轴突及细胞均消失，可见大通道周围由神经内膜构成的不规则孔隙。
图3纵切片HE染色结果显示，天然神经纵切片可见髓鞘和轴突结构完整，还存在平行分布胶原纤维，结构紧密，排列整齐。Sondell脱细胞法在脱细胞后，可观察到波浪状胶原纤维纵行分布，虽然结构稍显紊乱，但仍然致密。本发明提供的脱细胞方法脱细胞后，神经内部结构明显疏松，有较多轴向平行排列的间隙分布在波浪状胶原纤维之间，这些都是单向冻干形成的微通道，此外，在纵切片上还能观察到轴向穿刺形成的大通道结构。
(3)神经内部微结构观察
将天然神经、Sondell脱细胞神经和本发明制备的脱细胞神经样品(每组n＝5)用2.5％戊二醛于4℃固定2h，随后用1％锇酸于4℃后固定30min，PBS冲洗3次，每次5min，随后依次进行乙醇梯度脱水(30％、50％、60％、70％、80％、90％、100％-I，100％-II各20min)，通过CO2临界点干燥处理，然后在液氮中淬断，将横断面喷金后于扫描电子显微镜(SEM)下观察各组神经内部微结构。每组选择五个高倍视野，测量约200个孔隙以获得孔径的分布和平均值。
从图4神经横断面SEM图像可以观察到，天然神经具有完整的神经内膜结构，其中存在轴突和髓鞘。脱细胞处理后，可以观察到两个脱细胞组中的轴突和髓鞘均被去除。其中，Sondell脱细胞法中基底膜管被保留了下来，本发明脱细胞方法得到的神经内部微结构得到了优化，可以观察到存在微通道和大通道结构。
孔隙分析结果表明，天然神经平均孔径为4.06±1.52μm，Sondell脱细胞神经平均孔径为7.04±2.33μm，比天然神经有显著增加(p＜0.05)，而本发明制备的脱细胞神经的平均孔径为15.72±4.90μm，明显大于Sondell脱细胞神经和天然神经(p＜0.05)。此外，孔隙率测试结果表明，天然神经孔隙率仅为14.72±0.85％，Sondell脱细胞神经孔隙率为29.89±2.58％，本发明制备的脱细胞神经孔隙率高达67.28±3.60％，相较于前两者有显著增加(p＜0.05)。
(4)Western Blot分析生物活性ECM分子的含量
Collagen I、Collagen IV、Laminin和Fibronectin是周围神经中的关键生物活性ECM分子，它们在脱细胞过程中可能会受破坏而丧失。在本实验中，通过Western Blot分析来比较这些分子在Sondell脱细胞神经和本发明制备的脱细胞神经中的含量，进而评价改良脱细胞方法对于这些分子保存的影响。称取Sondell脱细胞神经(n＝5)和本发明制备的脱细胞神经(n＝5)样品各50mg，按照本领域常规方法提取总蛋白，进行Western Blot，具体操作按照试剂盒说明书进行。
如图5所示，左图是Western Blot结果，右图是灰度分析，四种ECM分子在Sondell脱细胞神经和本发明制备的脱细胞神经中都有表达，其中Collagen I和Collagen IV的表达量没有显著差异，而对于Laminin和Fibronectin，本发明制备的脱细胞神经中的表达量显著高于Sondell脱细胞神经(p＜0.05)。说明通过本发明提供的改良脱细胞方法制备得到的神经对ECM分子的破坏力更小。
(5)神经吸水性分析
将天然神经、Sondell脱细胞神经和本发明制备的脱细胞神经样品(每组n＝5)浸泡于4℃ PBS中24h使三组样品充分吸水，然后置入-80℃冰箱中冷冻1h，随后转移至冷冻干燥机之中冻干8h使其均获得恒定的干重(Wd)。随后，冻干的样品重新浸泡于PBS中24h使其均充分吸水而获得恒定的吸水后湿重(Ws)，(Ws-Wd)/Wd所得比值即为样品的吸水率(％)。
如图6吸水性检测结果表明，与天然神经(3.15±0.36mg/mg)相比，Sondell脱细胞神经和本发明制备的脱细胞神经在脱细胞处理后的吸水量都显著的升高了(p＜0.05)，而本发明制备的脱细胞神经的吸水量(8.85±0.56mg/mg)显著高于Sondell脱细胞神经(5.92±0.52mg/mg)(p＜0.05)。
(6)神经机械力学性能分析
将天然神经、Sondell脱细胞神经和本发明制备的脱细胞神经样品(每组n＝5)浸泡于37℃ PBS中2h以使各组样品获得均衡的温度。两端夹具的分离速度为10mm/min，平行于神经长轴施力，并且全程保持样品的湿润。样品的牵拉力、形变长度以及耗费时长均记录于设备内置软件中。在样品拉伸测试中，将样品的两端安装在装有砂纸的定制夹具上，两个夹具之间保持10mm的恒定距离，从应力-应变曲线获得杨氏模量，断裂应力和断裂应变等参数。在缝合强度检测中，将每个样品用8-0尼龙缝合线固定在两个新鲜大鼠坐骨神经断端之间。从距边缘1mm的神经外膜进针，每条缝合线的末端至少要打结七个结，以防止打滑。将两个新鲜神经的另一侧夹入夹具中，缝合强度定义为当将缝合线从神经外膜中拉出时的最大应力。结果如下表所示：
表1神经机械力学性能分析结果
Figure BDA0002625467450000101
机械力学性能分析结果表明，本发明制备的脱细胞神经的杨氏模量和断裂应力明显低于Sondell脱细胞神经。与天然神经相比，本发明制备的脱细胞神经的杨氏模量明显更高，但断裂应力无显著性差异。此外，在断裂应变和缝合强度方面，三组的数值之间没有统计学差异。
本发明制备的脱细胞神经体外细胞迁移研究及生物相容性评价
(1)体外细胞迁移评价
取健康新生Sprague Dawley大鼠用于提取大鼠原代施万细胞，所述原代施万细胞的提取和纯化按照本领域的常规实验技术进行。
将原代施万细胞扩增至第三代，胰酶消化，收集细胞并计数，调整细胞密度为1×107/ml，获得相应细胞悬液。实验前将各组神经支架在37℃的培养基中浸泡24h。随后取5μl施万细胞悬液滴加于神经支架一端，待悬液完全渗入，30min后再将另5μl细胞悬液种植于支架的同一端，待悬液完全渗入，30min后在6孔板中每孔加入2.5ml培养基，置于37℃、5％CO2、95％湿度的培养箱中培养。培养3天和7天，制备神经支架纵切片，对细胞核进行DAPI染色，在荧光显微镜下观察并采集图像，分析施万细胞增殖及渗入神经支架的情况。
实验结果如图7所示，培养3d后，可以观察到Sondell脱细胞神经中没有出现明显的细胞向支架内部迁移，大部分细胞仍停留在初始位置。然而，在本发明制备的脱细胞神经中，许多细胞通过大通道渗入支架内部。培养7d后，两组细胞均出现一定程度的增殖。在Sondell脱细胞神经中，大部分细胞仍分布在支架的表浅区域。然而，在本发明制备的脱细胞神经中，可见大量细胞沿着大通道进一步增殖和迁移。同时，还可以发现一些细胞通过微通道迁移到神经支架之中。
(2)细胞毒性评价
为了进一步对Sondell脱细胞神经和本发明制备的脱细胞神经的生物相容性进行分析，我们通过CCK-8试验来评价它们的细胞毒性。根据中华人民共和国国家标准对医疗器械生物学评价的要求，制备各组脱细胞神经的浸提液，具体步骤如下，每组取0.1g样品浸泡1ml DMEM/F12培养基(含10％FBS)中，在37℃条件下的孵育72小时，以制取浸提液。将RSC96细胞以1×104/孔的密度接种于96孔板中，待细胞贴壁后，将培养基分别更换为Sondell脱细胞神经和本发明制备的脱细胞神经的浸提液。将培养于高密度聚乙烯浸提液的细胞设为阴性对照组，将加入DMSO孵育的细胞设为阳性对照组，并且将无细胞培养基作为空白对照。分别于24h、48h和72h检测细胞增殖情况，更换培养基后，每孔加入10μl的CCK-8溶液，37℃孵育2h，通过酶标仪于450nm处测定吸光度。结果如下表所示：
表2细胞毒性实验各组OD450值
24h 48h 72h
阴性对照组 0.900±0.019 1.150± 1.241±0.020
Sondell脱细胞神经 0.859±0.021 1.094±0.043 1.199±0.032
本发明制备的脱细胞神经 0.875±0.024 1.113±0.051 1.225±0.034
阳性对照组 0.033±0.005 0.038±0.021 0.017±0.007
通过CCK-8实验检测细胞毒性，其中OD450值直接反映了细胞数量的多少，进而可以分析浸提液对细胞的毒性作用。在本研究中，可以观察到除了阳性组的施万细胞随着时间的推移不断增殖，数量逐渐增加，在24h、48h和72h三个时间点，Sondell脱细胞神经和本发明制备的脱细胞神经的OD450值与阴性对照组比较也不存在显著性差异(p＞0.05)，但均显著高于阳性对照组(p＜0.05)。这表明Sondell脱细胞神经和本发明制备的脱细胞神经对细胞都没有明显的毒性作用，具有良好的生物相容性。
本发明制备的脱细胞神经促进神经修复再生的体内研究
实验分组
选用48只健康的雄性8周龄Sprague Dawley大鼠建立大鼠坐骨神经损伤模型，根据移植物的类别将48只大鼠随机分为3组，每组16只。自体神经移植组(ANG,autologousnerve grafts)：将切断的自体神经转换方向后用以修复神经缺损；Sondell脱细胞神经组(SDNA,Sondell decellularized nerve allografts)：通过Sondell脱细胞方法制备的同种异体神经来修复神经缺损；本发明制备的脱细胞神经组(MDNA,modifieddecellularized nerve allografts)：通过改良脱细胞方法制备的新型多通道同种异体神经来修复神经缺损。
手术方案
所有实验大鼠术前禁食水8小时，手术部位均为右腿，用1％(w/v)戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(40mg/100g)，麻醉完全后在手术板上固定。手术区的脱毛备皮、消毒、铺巾，无菌条件下在大鼠的股后外侧纵行切开一道长为20mm的切口，沿着肌肉纤维方向钝性分离至坐骨神经暴露，将腘窝以上坐骨神经仔细游离，在距坐骨大孔5mm处切除8mm坐骨神经干，两侧断端退缩后形成10mm长的缺损，然后用等长的神经移植物桥接缺损神经的远近断端，用8-0尼龙显微缝合线对移植物进行外膜缝合，随后用4-0尼龙缝合线缝合肌肉和皮肤，最后伤口处用少量青霉素粉末涂抹。待麻醉苏醒后，将手术大鼠放回笼中正常饲养。
取材时间点设定
分别于术后第6和12周选取各组8只大鼠，进行足迹分析和小腿围度测量，随后暴露神经移植物，将神经移植物及远端部分取出，放入固定液中，以待后续分析，取材完成后，过量麻醉处死大鼠。
(1)足迹分析
足迹分析可以测定各组大鼠的坐骨神经功能指数(Sciatic Functional Index，SFI)，继而评价术后坐骨神经运动功能恢复的情况。具体方法如下，在大鼠双侧后足底部涂上黑墨水，然后让其走过一个40cm×8cm底部铺有白纸，末端连接暗箱的过道，行走后白纸上留下足迹，分别测量实验侧(E)和正常侧(N)的三个参数：足印长度(Print length，PL)，测量值为足跟到足尖的最长距离。EPL为实验侧足印长度，NPL为正常侧足印长度；足距宽度(Toe spread，TS)，测量值为第一趾到第五趾之间的连线距离。ETS为实验侧足距宽度，NTS为正常侧足距宽度；中间足趾宽度(Intermediary toe spread，ITS)，测量值为第二趾到第四趾之间的连线长度，EITS为实验侧中间足趾宽度，NITS为正常侧中间足趾宽度。
将上面三个测得的参数代入Bain公式如下:
SFI＝-38.3(EPL-NPL)/NPL+109.5(ETS-NTS)/NTS+13.3(EITS-NITS)/NITS-8
根据上述公式计算SFI。SFI为0表示功能正常，-100表示坐骨神经功能完全丧失。本实验术后6周和12周的各组SFI值如下表所示：
表3术后6周和12周各组SFI值
术后6周 术后12周
ANG -70.32±4.26 -54.87±5.71
SDNA -74.72±4.43 -65.97±4.38
MDNA -73.14±4.32 -60.24±4.63
MDNA、SDNA和ANG三组的SFI都表现出随时间增加的趋势。其中在术后第6周，三组的SFI之间无显著性差异(p＞0.05)；在术后第12周，MDNA的SFI显著高于SDNA(p＜0.05)，但是与ANG的SFI相比较，显著较低(p＜0.05)。
(2)小腿周长比的检测
测量实验侧和正常侧后肢的小腿中部周长，以评估神经修复后肌肉恢复的情况，数据用实验侧与正常侧周长之比来表示。具体结果如下表所示：
表4术后6周和12周各组小腿周长比(％)
术后6周 术后12周
ANG 64.2±3.2 78.4±5.0
SDNA 61.6±3.6 67.4±3.4
MDNA 62.8±3.3 72.8±3.6
神经损伤修复后，神经再支配重新建立，萎缩的肌肉会得到一定程度的恢复，其中小腿周长比可以反映肌肉的恢复程度。在本实验中可以观察到各组小腿周长比均随时间推移而增大，其中在术后第6周，MDNA、SDNA与ANG三组的小腿周长比之间没有显著性差异(p＞0.05)；在术后第12周，MDNA的小腿周长比显著大于SDNA(p＜0.05)，但明显小于ANG(p＜0.05)。
(3)移植物大体观察
分别在术后6周和12周对实验大鼠进行各项检测后将神经移植物及其相应近远端神经取出，大体情况如图8所示，虚线代表缝合位置。可以观察到，在术后第6周，MDNA、SDNA及ANG三组的移植物的直径比较相似，都小于近端神经的直径；在术后第12周，ANG的移植物直径最大，接近近端神经的直径；MDNA的移植物直径介于ANG和SDNA之间，略小于近端神经的直径；SDNA的移植物直径最小，明显小于近端神经的直径。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种神经脱细胞预处理方法，所述方法包括如下步骤：
（1）将神经在高渗溶液中处理12-24小时后，再在低渗溶液中处理12-24小时；
（2）将步骤（1）处理的神经置入硅胶模具中，垂直放在提前预冷的钢板上，再整体移入冷冻箱中冷冻1-1.5小时，再将放有神经的硅胶模具放入冷冻干燥装置中，冻干12-24小时，得到具有微通道的神经；
（3）将步骤（2）得到的神经沿着神经长轴纵向插入钢针，移去钢针，得到内部形成大通道的神经。
2.根据权利要求1所述的预处理方法，其特征在于，所述步骤（1）中的神经来自异种神经或同种异体神经，其中，异种神经包括来自猴、猪、牛、羊、马、狗、鼠的神经，同种异体神经包括来自人或人的尸体的神经。
3.根据权利要求1所述的预处理方法，其特征在于，所述高渗溶液选自质量浓度为5-10%的氯化钠溶液、10-20%葡萄糖溶液、10-20%的甘露醇溶液中的一种或两种以上的组合；所述低渗溶液为蒸馏水、质量浓度＜0.9%的氯化钠溶液、质量浓度＜5%的葡萄糖溶液中的一种或两种以上的组合。
4.根据权利要求1所述的预处理方法，其特征在于，所述步骤（2）中钢板预冷温度为-80℃，冷冻箱温度为负40℃-负20℃之间。
5. 根据权利要求1所述的预处理方法，其特征在于，所述步骤（3）中插入钢针的数量依据神经直径决定，钢针的长度贯穿神经全长，插入5-8根，钢针直径为100-200 μm。
6.根据权利要求1-5任一所述的预处理方法，其特征在于，所述神经脱细胞预处理方法具体包括：
（1）将神经在浓度为6-8%的氯化钠溶液中震荡处理12小时，再将神经放入蒸馏水中震荡处理12小时，震荡速率为120-150 rpm；
（2）将步骤（1）处理的神经置入硅胶模具中，垂直放在预冷至-80℃的钢板上，再整体移入-40℃冷冻箱中冷冻1小时，再将放有神经的硅胶模具放入冷冻干燥装置中，冻干24小时，得到具有微通道的神经；
（3）移除硅胶模具，沿着神经长轴纵向插入5-8根钢针，移去钢针，得到内部形成大通道的神经。
7.一种神经脱细胞方法，所述方法包括如下步骤：
（1）按照权利要求1-6任一所述的方法对神经进行预处理；
（2）将预处理后的神经重新水化；
（3）将步骤（2）得到的神经置入体积浓度为1-2%的Triton X-100溶液中处理12-24小时，用蒸馏水洗涤3-5次，再转移到质量浓度为5-6%的CHAPS溶液中处理12-24小时，用蒸馏水洗涤3-5次，实现脱细胞。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）具体脱细胞方法如下：用体积浓度为2％的Triton X-100溶液震荡处理神经24小时，用蒸馏水洗涤3次，每次15分钟，再转移到质量浓度为6％的CHAPS溶液中震荡处理24小时，用蒸馏水洗涤3次，每次15分钟，获得脱细胞神经，置入含1%双抗的PBS 溶液中4℃保存备用。
9.一种脱细胞神经，所述神经通过权利要求7-8任一所述的神经脱细胞方法制备得到。
10.一种权利要求9所述的脱细胞神经在神经移植中的应用。
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