CN111068096A - 一种dECM基促伤口修复敷料的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种dECM基促伤口修复敷料的制备方法，采用乙醇等有机溶剂作为共溶剂，通过超临界二氧化碳技术制备动物源的脱细胞化细胞外基质(dECM)，后经过化学偶联的方法将NO供体亚硝酸异戊酯接枝在dECM上，NO供体的修饰提高敷料使用过程中生物信号的传导，进而加速伤口的愈合。本发明制备方法简单、生物相容性好、易降解吸收、可促进伤口的愈合，为dECM基生物敷料的后续应用提供了新的思路。

Description

一种dECM基促伤口修复敷料的制备方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种dECM基促伤口修复敷料的制备方法。
背景技术
敷料是临床上广泛应用的一种用以覆盖疮、伤口或其他损害的医用材料。传统的敷料主要包括天然纱布、合成纤维内敷料、发泡多聚体类敷料、水胶体类敷料等，其生物相容性和降解性较差。并且这些敷料很容易为细菌等微生物的入侵提供了温床，因此对灭菌要求极高。同时，市面上大部分敷料通常只起了隔绝外部环境的作用，难以实现伤口的有效促进愈合。
组织修复过程中，细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)与细胞间的相互作用能够明显影响组织形态的发生或重建。脱细胞的组织特异ECM结构和机械性能与天然组织非常相似，ECM免疫原性低、可降解、具有优良的机械性能和生物相容性，能够为细胞生长提供三维空间，促进细胞附着、增殖、迁移和分化，是理想的伤口敷料材料。而传统制备化学方法，虽然能够得到细胞外基质，但涉及的试剂较多、过程复杂，且原ECM的活性成分往往会受到影响而降低，影响效果。
超临界流体(SCF，Supercritical Fluid)即是物质在超过特定临界点温度压力条件下，液体和气体界面消失的流体，其同时具有液体和气体的特性，因此具有扩散系数大，粘度小，渗透性好等特性。超临界二氧化碳(SC-CO2，Supercritical Carbon Dioxide)其临界温度(31.26℃)接近于室温，临界压力(7.18MPa)较低；且CO2的性质稳定，具有无臭、无味、无毒、不易燃易爆等好的物理化学性质。
一氧化氮(NO)广泛存在于生物体内,在生物体内发挥着重要的生物学作用。NO是一种生物体内的信号分子，在伤口修复和愈合中也发挥着重要的生物学作用，在伤口修复愈合的炎症期、细胞增殖期、细胞外基质贮存和重建期都具有关键作用。现有制备方法中，合成的NO材料与基底无牢固的结合位点，常常导致其稳定性差，不能维持NO催化释放，难以发挥其应有的生物学作用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种dECM基促伤口修复敷料的制备方法，解决了上述背景技术中活性成分低、促伤口修复效果差等问题。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供了一种dECM基促伤口修复敷料的制备方法，一种dECM基促伤口修复敷料的制备方法，包括如下步骤：
1)脱细胞化细胞外基质dECM的制备
利用超临界二氧化碳技术对动物源细胞进行脱细胞处理，用PBS冲洗后用DNA酶、PBS洗涤和冻干，得到脱细胞化细胞外基质dECM；
2)NO供体修饰dECM敷料的制备
将脱细胞化细胞外基质dECM进行巯基修饰、接枝NO供体，得到NO供体化学接枝修饰的dECM，使用京尼平交联dECM制备得到冻干凝胶或固态形式的敷料。
在本发明一较佳实施例中，所述动物源细胞包括猪源、牛源、马源的皮肤、脂肪、肝脏组织的细胞。
在本发明一较佳实施例中，所述NO供体包括亚硝酸异戊酯。
在本发明一较佳实施例中，具体包括如下步骤：
1)脱细胞化细胞外基质dECM的制备
将动物源细胞的冻干品与溶剂一同加入RESS装置反应釜中，在10～45℃、71～300bar条件下，通过超临界CO2与溶剂的共溶作用，将动物源细胞脱细胞0.5～9h，随后将处理过的样品在PBS缓冲液中浸洗12h，以除去溶剂，再将浸入含有8mM MgCl2的20U/mL DNA酶的PBS缓冲液中，在10～45℃、120～150rpm条件下，恒温震荡24h，除去组织中的细胞核质，依次用PBS缓冲液和蒸馏水洗涤经DNA酶处理过的样品，冻干，得脱细胞化细胞外基质dECM。
所述溶剂包括乙醇、二氯甲烷或六氟异丙醇，所述动物源细胞的冻干品与溶剂的用量比为3～5g:50mL。
2)NO供体修饰dECM基敷料的制备
①巯基修饰
将脱细胞化细胞外基质dECM溶于含有胃蛋白酶的0.5M乙酸溶液中，在10～45℃、120～150rpm条件下，恒温震荡2d；待完全溶解后，用10M NaOH溶液将pH值调节至7.2～7.4，透析2d并冻干；将冻干后的dECM与Traut's试剂加入到含有0.5mM EDTA的100mM磷酸钾缓冲液中，并于室温下孵育1h，得到末端-SH接枝的dECM。
所述脱细胞化细胞外基质dECM与胃蛋白酶的质量比为100:10，冻干后的dECM与Traut's试剂的质量比为500～600：15～18。
②NO供体化学偶联修饰
将接枝-SH的dECM与15mM亚硝酸异戊酯于室温下孵育2h，透析2d并冻干，得到NO供体化学接枝修饰的dECM。
在本发明一较佳实施例中，所述敷料的成型方法包括将dECM溶解后再交联成冻干凝胶形式和未溶解的固态dECM经化学偶联接枝制备成的固态敷料形式。
③敷料成型
用蒸馏水将脱细胞化细胞外基质dECM和NO供体化学接枝修饰的dECM溶解，京尼平交联后，定形冻干得到NO供体化学接枝修饰的dECM基敷料。
本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：
1.本发明利用超临界流体技术制备dECM，与传统制备化学方法相比，能更好地保留原ECM活性成分，且超临界状态下兼具灭菌作用，可减小敷料使用过程中的感染和免疫反应等风险；
2.本发明通过亚硝酸异戊酯修饰dECM基敷料，敷料不仅具有良好的生物相容性和降解性，还可促进血管生成、促进伤口愈合。
附图说明
图1为脱细胞前后的猪皮小块的实物图片(脱细胞前：左；脱细胞后：右)；
图2为猪皮小块脱细胞前后的SEM图(脱细胞前：左；脱细胞后：右)；
图3为猪皮小块脱细胞前后H&E染色图(脱细胞前：左；脱细胞后：右)；
图4为脱细胞前组织中DNA的含量；
图5为脱细胞前组织中蛋白质的含量；
图6制备得到的敷料与ECM敷料的实物照片图；
图7经不同处理后的小鼠伤口在1周内的愈合情况对比图。
具体实施方式
实施例1
本实施例的一种dECM基促伤口修复敷料的制备方法，包括如下步骤：
1)脱细胞化细胞外基质dECM的制备
猪皮组织样品切成1cm×1cm大小并冻干，将冻干的样品称重3g，与50mL无水乙醇一同加入RESS装置反应釜中。在37℃，71～300bar条件下，通过超临界CO2与乙醇的共溶作用，将样品脱细胞0.5～9h，随后将处理过的样品在PBS缓冲液中浸洗12h，以除去乙醇，将其浸入含有8mM MgCl2的20U/mL DNA酶的PBS缓冲液中，在37℃，150rpm条件下，恒温震荡24h，除去组织中的细胞核质，依次用PBS缓冲液和蒸馏水(150rpm，15min)洗涤经DNA酶处理过的样品，冻干，得脱细胞化细胞外基质dECM(图1)。通过H&E染色等表征脱细胞效果(图2)，并用DNA检测试剂盒检测dECM中的DNA含量。
图1为本实例中脱细胞前后的猪皮小块(即dECM)实物图片(前：左；后：右)，图2为本实施例中猪皮小块脱细胞前后的SEM图，可以看出脱细胞后(即dECM)中具有许多纤维状结构。图3为猪皮小块脱细胞前后H&E染色图(前：左；后：右)，表明经超临界流体脱细胞后组织中无核质染色。图4为dECM中DNA的含量检测情况，表明dECM中的DNA含量较原组织大大降低。图5为dECM中蛋白质的含量检测情况，表明经超临界脱细胞法制备的dECM中的蛋白质含量较化学方法制备的dECM更高，更好地保留原组织中的蛋白成分。
2)NO供体修饰dECM基敷料的制备
将冻干的dECM样品溶于含有胃蛋白酶(每100mg dECM含10mg胃蛋白酶)的0.5M乙酸溶液中，在37℃，150rpm条件下，恒温震荡2d。待样品完全溶解后，用10M NaOH溶液将pH值调节至7.4，透析2d并冻干。将500mg dECM与16mg Traut's试剂(Thermo ScientificPierce Traut's Reagent)加入到含有0.5mM EDTA的100mM磷酸钾缓冲液中，并于室温下孵育1h，将末端-SH接枝到dECM中。将接枝-SH的dECM与15mM亚硝酸异戊酯于室温下孵育2h。透析2d并冻干，得到NO供体化学接枝修饰的dECM。用少量蒸馏水将dECM和NO供体化学接枝修饰的dECM溶解，京尼平交联后，定形冻干得到NO供体化学接枝修饰的dECM基敷料。另制备未修饰的ECM敷料作为对照组。
图6为制备得到的敷料的实物照片图，经NO供体修饰后的敷料较未修饰敷料显现出淡黄色。
一、NO供体化学接枝修饰的dECM基敷料的促伤口修复考察
使用昆明鼠作为动物模型，麻醉动物后，剪去昆明鼠后背鼠毛，用手术剪剪出0.25cm2皮肤伤口模型，将NO供体化学接枝修饰的dECM基敷料覆盖在伤口处，随后用医用胶布进行包扎固定，定期观察伤口结痂愈合等状况。另未经NO供体修饰的ECM敷料作为对照实验组。
图7为经敷料处理后的小鼠伤口在1周内的愈合情况，表明NO供体修饰的ECM敷料组较未经NO供体修饰组能促进伤口的结痂愈合。
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (10)

1.一种dECM基促伤口修复敷料的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)脱细胞化细胞外基质dECM的制备
利用超临界二氧化碳技术对动物源细胞进行脱细胞处理，用PBS冲洗后用DNA酶、PBS洗涤和冻干，得到脱细胞化细胞外基质dECM；
2)NO供体修饰dECM基敷料的制备
将脱细胞化细胞外基质dECM进行巯基修饰、接枝NO供体，得到NO供体化学接枝修饰的dECM，使用京尼平交联dECM制备得到冻干凝胶或固态形式的敷料。
2.根据权利要求1所述的一种dECM基促伤口修复敷料的制备方法，其特征在于：所述动物源细胞包括猪源、牛源、马源的皮肤、脂肪、肝脏组织的细胞。
3.根据权利要求1所述的一种dECM基促伤口修复敷料的制备方法，其特征在于：所述NO供体包括亚硝酸异戊酯。
4.根据权利要求1所述的一种dECM基促伤口修复敷料的制备方法，其特征在于：
1)脱细胞化细胞外基质dECM的制备
将动物源细胞的冻干品与溶剂一同加入RESS装置反应釜中，在10～45℃、71～300bar条件下，通过超临界CO2与溶剂的共溶作用，将动物源细胞脱细胞0.5～9h，随后将处理过的样品在PBS缓冲液中浸洗12h，以除去溶剂，再将浸入含有8mM MgCl2的20U/mL DNA酶的PBS缓冲液中，在10～45℃、120～150rpm条件下，恒温震荡24h，除去组织中的细胞核质，依次用PBS缓冲液和蒸馏水洗涤经DNA酶处理过的样品，冻干，得脱细胞化细胞外基质dECM。
5.根据权利要求4所述的一种dECM基促伤口修复敷料的制备方法，其特征在于：所述溶剂包括乙醇、二氯甲烷或六氟异丙醇，所述动物源细胞的冻干品与溶剂的用量比为3～5g:50mL。
6.根据权利要求1所述的一种dECM基促伤口修复敷料的制备方法，其特征在于：所述步骤2)包括：
①巯基修饰
将脱细胞化细胞外基质dECM溶于含有胃蛋白酶的0.5M乙酸溶液中，在10～45℃、120～150rpm条件下，恒温震荡2d；待完全溶解后，用10M NaOH溶液将pH值调节至7.2～7.4，透析2d并冻干；将冻干后的dECM与Traut's试剂加入到含有0.5mM EDTA的100mM磷酸钾缓冲液中，并于室温下孵育1h，得到末端-SH接枝的dECM。
7.根据权利要求6所述的一种dECM基促伤口修复敷料的制备方法，其特征在于：所述脱细胞化细胞外基质dECM与胃蛋白酶的质量比为100:10，冻干后的dECM与Traut's试剂的质量比为500～600：15～18。
8.根据权利要求1所述的一种dECM基促伤口修复敷料的制备方法，其特征在于：所述步骤2)包括：
②NO供体化学偶联修饰
将接枝-SH的dECM与15mM亚硝酸异戊酯于室温下孵育2h，透析2d并冻干，得到NO供体化学接枝修饰的dECM。
9.根据权利要求1所述的一种dECM基促伤口修复敷料的制备方法，其特征在于：所述敷料的成型方法包括将dECM溶解后再交联成冻干凝胶形式和未溶解的固态dECM经化学偶联接枝制备成的固态敷料形式。
10.根据权利要求1所述的一种dECM基促伤口修复敷料的制备方法，其特征在于：所述步骤2)包括：
③敷料成型
用蒸馏水将脱细胞化细胞外基质dECM和NO供体化学接枝修饰的dECM溶解，京尼平交联后，定形冻干得到NO供体化学接枝修饰的dECM基敷料。
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