CN107320762B - 胶原/细菌纤维素复合膜敷料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种胶原/细菌纤维素复合膜敷料及其制备方法,包括:对天然细菌纤维素膜进行纯化处理;将纯化后的含水细菌纤维素膜,不经过预冻处理,直接真空冷冻干燥,得到大孔隙结构细菌纤维素膜;在不高于20℃的条件下,用醋酸水溶液溶解天然胶原,得到胶原溶液;将大孔隙结构细菌纤维素膜浸入胶原溶液,在抽真空条件下向细菌纤维素膜中导入胶原;将导入胶原的细菌纤维素膜置入pH为6.0‑8.0磷酸盐缓冲溶液,进行纤维化处理,得到胶原纤维化的复合膜;将胶原纤维化的复合膜,不经过预冻处理,直接真空冷冻干燥,得到胶原/细菌纤维素复合膜敷料。本发明,胶原导入量、胶原生物稳定性以及在膜中的留存稳定性均明显提高。
Description
技术领域
本发明属于医学生物材料技术领域,更具体地,涉及一种胶原/细菌纤维素复合膜敷料及其制备方法。
背景技术
医用敷料在皮肤创伤、烧烫伤治疗等临床外科领域具有极为广泛的应用。高品质的医用敷料要求具有良好的生物安全性、阻隔性、吸水持水性和适宜的机械力学性能等。更高端的医用敷料产品,例如对于大面积烧烫伤敷料,为了促进皮肤组织自愈和减少敷料更换时的患者痛苦,往往还要求敷料具有促组织愈和以及敷料自身可降解等性能。因此,越来越多的具有上述生物功效的天然大分子材料被应用于医用敷料的制造中。其中,天然胶原因具有良好的生物相容性、可降解性和促细胞增殖性能,在医用敷料中具有良好的应用前景。但是,单纯的胶原海绵敷料存在机械力学性能较差、生物稳定性和形态稳定性不足等缺陷,在很大程度上限制了其在医用敷料中的应用范围。细菌纤维素是另一种广泛应用的天然生物材料。天然细菌纤维素是通过生物发酵方法,利用木醋杆菌等微生物通过生物转化合成的一种天然纤维素。这种由细菌合成分泌的纤维素具有高纯度、高结晶度和自然形成的精细网格膜结构等特点,因而在性能上也表现为具有良好的抗拉、抗张机械力学性能,优良的生物相容性,较强的吸水和持水性能等。这些优良的性能使细菌纤维素在医用敷料、面膜基质材料等领域中均具有广泛的应用。上述两种天然材料均具有良好的生物相容性,满足医用敷料的基本要求。而且,胶原所具有的促组织愈合生物功能和细菌纤维素所具有的良好机械力学性能以及吸水持水等性能形成了良好的功能优势互补,二者的结合为高品质医用敷料的制备创造了良好条件。
近年来,已陆续有胶原/细菌纤维素复合材料制备方法的相关成果(专利)报道。这些复合材料的制备方法可以大致归结为以下几种:
(1)向细菌纤维素膜中导入胶原。在细菌纤维素的制备过程中,静态发酵工艺可以在发酵液表面自然形成纤维素膜。这种自然形成的细菌纤维素膜具有天然的精细网络结构,纤维结晶度高,膜的机械力学性能好,且该工艺操作简便,纤维素产出率高,是细菌纤维素制备的主流方法。目前,已经有批量商品化的细菌纤维素膜产品面世。向细菌纤维素膜中导入胶原法就是以这种自然形成的细菌纤维素膜为载体,通过浸润等形式将胶原导入细菌纤维素膜中,形成复合膜敷料。这种导入法虽然操作简单,但是由于天然细菌纤维素膜的空隙非常致密,而天然胶原分子尺寸大(300nm长),在导入胶原时往往很快将纤维素膜空隙堵塞,导致胶原导入量有限。同时,由于导入胶原为单分子状态,易降解,易流失,体内留存时间短,生物功效周期不能完全满足临床需求。为了解决胶原自身稳定性不足以及与纤维素结合不稳定的问题,有部分学者采用化学交联或对纤维素进行化学修饰的方法提高胶原与纤维素的结合稳定性。但是,这种交联或化学修饰的方法往往需要引入非生物友好型的化学试剂,细胞毒性大,产品生物安全性显著降低。
(2)溶解/混合成膜法。该方法首先用强极性溶剂溶解细菌纤维素,形成细菌纤维素溶液,然后与胶原溶液混合均匀并干燥成膜。这种方法很好的解决了复合敷料中胶原含量的问题,但是依然存在不足之处。一是细菌纤维素的溶解需要引入大量非细胞友好型的强极性溶剂,尽管制备工艺中有洗涤工序,但仍有溶剂残留风险;二是这种将细菌纤维素重新溶解造膜的方法破坏了天然细菌纤维素膜的原有精细网络构造和纤维素的结晶度,产品的机械力学性能、吸水持水性能等均有所降低。
(3)添加胶原/共发酵法。这种方法是在发酵液中添加一定量的胶原成分,帮助在细菌纤维素膜自然形成的过程中引入胶原成分。这种方法可以在较好的解决复合膜中胶原含量问题同时保持纤维素膜的天然构造。但是,由于天然细菌纤维素膜在应用前需要经过纯化处理(酸洗、碱洗和高温热处理),在这些高强度的处理操作中,胶原容易流失且发生分子的不可逆变性(天然胶原的热变性温度一般低于40℃)。而大量研究证实,胶原变性后其原有的促细胞增殖等生物功能显著降低。
综上,胶原/细菌纤维素复合膜敷料具有优异的性能和广阔的应用前景,因此不断优化该复合敷料的制备工艺,提升敷料性能具有极大的实际意义。由于现有的胶原/细菌纤维素复合膜敷料(材料)制造工艺仍存在诸多不足之处,如制造过程中引入毒性化学试剂导致敷料生物安全性降低、胶原导入量较低或导入胶原结合不稳定难以满足生物功效发挥的要求、制造过程中存在极端条件导致胶原变性而丧失其生物活性、制造工艺破坏了细菌纤维素膜的天然网络构造而导致膜性能降低等。因此,有必要提供一种能同时兼顾细菌纤维素膜原始构造、足够的胶原负载量和胶原稳定性、不引入有毒化学物质等要求的复合膜敷料制备方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种简便、有效的胶原/细菌纤维素复合膜敷料的制备方法及由该方法制得的胶原/细菌纤维素复合膜敷料。这种方法能在保持天然细菌纤维素膜原始网络结构的同时提高胶原导入量,并提高胶原在复合膜中的生物稳定性,以满足医用敷料、烧烫伤皮肤替代等医用材料对产品各项性能的要求。
为了实现上述目的,本发明的一方面提供一种胶原/细菌纤维素复合膜敷料的制备方法,该制备方法包括:
(1)对天然细菌纤维素膜进行纯化处理;
(2)将纯化后的含水细菌纤维素膜,不经过预冻处理,直接真空冷冻干燥,得到大孔隙结构细菌纤维素膜;
(3)在小于20℃的条件下,用醋酸水溶液溶解天然胶原,得到胶原溶液;
(4)将所述大孔隙结构细菌纤维素膜浸入所述胶原溶液中,在抽真空条件下向细菌纤维素膜中导入胶原;
(5)将导入胶原的细菌纤维素膜置入pH为6.0-8.0的磷酸盐缓冲溶液中,进行纤维化处理,得到胶原纤维化的复合膜;
(6)将所述胶原纤维化的复合膜,不经过预冻处理,直接真空冷冻干燥,得到胶原/细菌纤维素复合膜敷料。
本发明的另一方面提供一种所述的胶原/细菌纤维素复合膜敷料的制备方法制备的胶原/细菌纤维素复合膜敷料。
本发明的技术方案具有如下优点:
(1)本发明解决了天然细菌纤维素膜空隙致密,胶原导入困难的问题,采用将湿态含水细菌纤维素膜在不预冻条件下,进行瞬时抽真空并冷冻干燥的处理方法,制造大孔隙结构细菌纤维素膜。本发明的细菌纤维素膜进行胶原导入,胶原导入量明显提高;
(2)本发明的方法在胶原导入过程中,依然采用抽真空体系。在真空体系中,随着大孔隙结构细菌纤维素膜中空气的移除,促进了胶原的渗入,能实现胶原的高效导入;
(3)本发明针对导入细菌纤维素膜中的胶原进行了纤维化处理,使胶原由单分子(分子长度约300nm,粒径约1.5nm)转变为胶原纤维(粒径50-100nm)。经纤维化处理后的胶原生物稳定性以及在膜中的留存稳定性均明显提高;
(4)本发明的方法,在胶原/细菌纤维素复合膜敷料的制备过程中未引入毒性化学试剂,提高了胶原/细菌纤维素复合膜敷料的生物安全性。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述,本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
图1a示出了本发明的一个实施例的大孔隙结构细菌纤维素膜的扫描电镜图(×10000倍)。
图1b示出了对比例的采用常规预冻并冷冻干燥方法得到的细菌纤维素膜的扫描电镜图(×10000倍)。
图2a示出了根据本发明的一个实施例的大孔隙结构细菌纤维素膜的扫描电镜图(×15000倍)。
图2b示出了根据本发明的一个实施例的胶原/细菌纤维素复合膜敷料的扫描电镜图(×15000倍)。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式,然而应该理解,可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反,提供这些实施方式是为了使本发明更加透彻和完整,并且能够将本发明的范围完整地传达给本领域的技术人员。
本发明的一方面提供一种胶原/细菌纤维素复合膜敷料的制备方法,该制备方法包括:
(1)对天然细菌纤维素膜进行纯化处理;
(2)将纯化后的含水细菌纤维素膜,不经过预冻处理,直接真空冷冻干燥,得到大孔隙结构细菌纤维素膜;
(3)在小于20℃的条件下,用醋酸水溶液溶解天然胶原,得到胶原溶液;
(4)将所述大孔隙结构细菌纤维素膜浸入所述胶原溶液中,在抽真空条件下向细菌纤维素膜中导入胶原;
(5)将导入胶原的细菌纤维素膜置入pH为6.0-8.0的磷酸盐缓冲溶液中,进行纤维化处理,得到胶原纤维化的复合膜;
(6)将所述胶原纤维化的复合膜,不经过预冻处理,直接真空冷冻干燥,得到胶原/细菌纤维素复合膜敷料。
发明人通过实验研究发现,将含水的细菌纤维素膜进行瞬时抽真空处理时,膜中的水分快速向膜表面迁移并蒸发,类似于爆沸现象,在该过程中导致较大孔道的形成。随后,随着水分快速蒸发,带走大量热量又导致膜内残留水分迅速结冰并在接下来的真空环境下完成冰的升华干燥,能较好的保留了膜中的大孔隙构造。采用这种处理方式后得到的细菌纤维素膜进行胶原导入,胶原导入量明显提高。
根据本发明,优选地,所述天然细菌纤维素膜为利用具备转化生产细菌纤维素的微生物,采用静态发酵方法自然形成的纤维素膜。所述具备转化生产细菌纤维素的微生物为木醋杆菌等。
根据本发明,优选地,所述纯化处理包括:将天然细菌纤维素膜依次进行浸泡、碱液煮沸、洗涤、酸液浸泡和洗涤,得到纯化处理后的含水细菌纤维素膜。
作为优选方案,所述纯化处理包括:将天然细菌纤维素膜依次进行去离子水浸泡、氢氧化钠溶液煮沸、去离子水洗涤、乙酸溶液浸泡和去离子水洗涤,得到纯化处理后的含水细菌纤维素膜。
根据本发明,优选地,步骤(2)和步骤(6)中,真空冷冻干燥的条件包括:在3-5分钟内系统绝对压强降低至40Pa以下,冷冻干燥时间为24-72小时。
根据本发明,优选地,所述胶原溶液的浓度为1-10mg/mL。
根据本发明,优选地,所述天然胶原为具有完整三螺旋分子结构的天然Ⅰ型胶原。
作为优选方案,所述天然胶原是从哺乳动物、鱼类、两栖动物的皮肤、跟腱组织中提取并分离纯化的具有完整三螺旋分子结构的天然Ⅰ型胶原。
根据本发明,优选地,所述步骤(4)中,真空度为0.08-0.1MPa,导入胶原时间为2-24h。
根据本发明,优选地,所述步骤(5)中,在25-37℃条件下进行纤维化处理2-48h。
根据本发明,优选地,所述具有较大孔隙结构的细菌纤维素膜的平均孔隙尺度大于1.5μm。
本发明的另一方面提供一种所述的胶原/细菌纤维素复合膜敷料的制备方法制备的胶原/细菌纤维素复合膜敷料。
以下通过实施例进一步说明本发明:
本发明中,细菌纤维素膜的孔隙构造可以通过扫描电镜方法直观分析,胶原导入量可以通过对复合膜敷料中胶原含量的定量测定进行分析;复合膜中胶原的稳定性可以通过胶原酶溶液体系下复合膜敷料中胶原的降解率测定进行分析和比较。
实施例1
将细菌纤维素膜置于烧杯中,用足量的超纯水浸泡24h,使其充分吸水溶胀。然后用0.1mol/L的NaOH溶液煮沸30min,用超纯水洗涤至中性,随后将细菌纤维素膜转移至0.05mol/L的乙酸溶液中浸泡24h,用超纯水洗涤至中性备用。将纯化后的含水细菌纤维素膜置入冷冻干燥机中,抽真空,在5分钟内系统绝对压力降低至20Pa,继续冷冻干燥48小时后得到大孔隙结构细菌纤维素膜(如图1a和图2a)。在不高于20℃条件下用0.1mol/L的乙酸水溶液溶解提取自猪皮的Ⅰ型胶原蛋白,得到浓度为5mg/mL的胶原溶液。将大孔隙结构细菌纤维素膜浸入胶原溶液中,抽真空至真空度为0.09MP促进胶原导入12小时,随后取出膜并转移至pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液(即PBS)中,于30℃条件下纤维化处理12小时,得到胶原纤维化的复合膜,最后将得到的胶原纤维化的复合膜置入冷冻干燥机中,抽真空,在5分钟内系统绝对压力降低至20Pa,继续冷冻干燥48小时后得到胶原/细菌纤维素复合膜敷料产品(如图2b)。
实施例2
将细菌纤维素膜置于烧杯中,用足量的超纯水浸泡24h,使其充分吸水溶胀。然后用0.1mol/L的NaOH溶液煮沸30min,用超纯水洗涤至中性,随后将细菌纤维素膜转移至0.05mol/L的乙酸溶液中浸泡24h,用超纯水洗涤至中性备用。将纯化后的含水细菌纤维素膜置入冷冻干燥机中,抽真空,在5分钟内系统绝对压力降低至30Pa,继续冷冻干燥48小时后得到大孔隙结构细菌纤维素膜。在不高于20℃条件下用0.1mol/L乙酸水溶液溶解提取自草鱼皮的Ⅰ型胶原蛋白,得到浓度为8mg/mL的胶原溶液。将大孔隙结构细菌纤维素膜浸入胶原溶液中,抽真空至真空度为0.1MP促进胶原导入12小时,随后取出膜并转移至pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液(即PBS)中,于35℃条件下纤维化处理12小时,得到胶原纤维化的复合膜,最后将得到的胶原纤维化的复合膜置入冷冻干燥机中,抽真空,在5分钟内系统绝对压力降低至20Pa,继续冷冻干燥48小时后得到胶原/细菌纤维素复合膜敷料产品。
对比例
将细菌纤维素膜置于烧杯中,用足量的超纯水浸泡24h,使其充分吸水溶胀。然后用0.1mol/L的NaOH溶液煮沸30min,用超纯水洗涤至中性,随后将纤维素膜转移至0.05mol/L的乙酸溶液中浸泡24h,用超纯水洗涤至中性备用。将纯化后的含水细菌纤维素膜在-60℃条件下预冻24小时后置入冷冻干燥机中,抽真空(系统绝对压力降低至30Pa)并冷冻干燥48小时后得到干燥的细菌纤维素膜(如图1b)。在不高于20℃条件下用0.1mol/L乙酸水溶液溶解提取自猪皮的Ⅰ型胶原蛋白,得到浓度为5mg/mL的胶原溶液。将干燥的细菌纤维素膜浸入胶原溶液中,持续12小时,随后取出膜,在-60℃条件下预冻24小时后置入冷冻干燥机中,抽真空(系统绝对压力降低至30Pa)并冷冻干燥48小时后得到干燥的复合膜敷料。
测试例1
分别对实施例1的大孔隙结构细菌纤维素膜和胶原/细菌纤维素复合膜敷料以及对比例中真空冷冻干燥后的细菌纤维素膜进行电镜扫描。
如图1a-图2b所示,图1a和图2a示出了实施例1的大孔隙结构细菌纤维素膜的微观结构,其中,图1a的放大倍数为10000倍,图2a的放大倍数为15000倍;图1b示出了对比例的采用常规预冻并冷冻干燥方法得到的细菌纤维素膜的微观结构,图1b的放大倍数为10000倍。图2b示出了实施例1的胶原/细菌纤维素复合膜敷料的微观结构,图2b的放大倍数为15000倍。
通过图1a和图1b,直观的反映了采用常规冷冻干燥方法和本发明的方法干燥处理的细菌纤维素膜孔隙构造情况。可以发现,采用本发明方法制备的细菌纤维素膜比常规冻干方法的细菌纤维素膜具有显著的大孔隙结构,这为胶原的导入提供了良好条件。
图2a和图2b反映了胶原导入前后细菌纤维素膜结构的变化情况。可以发现,在未导入胶原时,细菌纤维素膜表现为稀疏的纤维构造,而导入胶原并进行纤维化处理后,膜的纤维变得更加致密,这一方面证实了胶原的导入行为,另一方面也证实了胶原的纤维化行为。
测试例2
对实施例1-2和对比例进行胶原的负载率的测试;负载率%=(复合膜中胶原总质量/细菌纤维素膜初始干基质量)*100%;测试结果见表1。
表1
试样 | 胶原的负载率 |
实施例1 | 12.8% |
实施例2 | 13.6% |
对比例 | 7.3% |
通过实施例1-2与对比例的胶原的负载率的数据对比可以发现,采用本发明的方法,胶原的负载率明显提高。
测试例3
将实施例1-2和对比例制备的胶原/细菌纤维素复合膜敷料分别置入含有胶原酶的PBS缓冲溶液中酶水解12小时后测定胶原降解率;胶原降解率%=(缓冲溶液中降解胶原总质量/复合膜初始胶原总质量)*100%;测试结果见表2。
表1
试样 | 胶原降解率 |
实施例1 | 72% |
实施例2 | 70% |
对比例 | 98% |
通过实施例1-2与对比例在胶原降解率方面的数据对比可以发现,纤维化处理后胶原的酶降解率明显降低,证实纤维化处理有助于提高复合膜中胶原的生物稳定性。
以上已经描述了本发明的各实施例,上述说明是示例性的,并非穷尽性的,并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下,对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。
Claims (7)
1.一种胶原/细菌纤维素复合膜敷料的制备方法,其特征在于,该制备方法包括:
(1)对天然细菌纤维素膜进行纯化处理;
(2)将纯化后的含水细菌纤维素膜,不经过预冻处理,直接真空冷冻干燥,得到大孔隙结构细菌纤维素膜;
(3)在不高于20℃的条件下,用醋酸水溶液溶解天然胶原,得到胶原溶液;
(4)将所述大孔隙结构细菌纤维素膜浸入所述胶原溶液中,在抽真空条件下向细菌纤维素膜中导入胶原;
(5)将导入胶原的细菌纤维素膜置入pH为6.0-8.0的磷酸盐缓冲溶液中,进行纤维化处理,得到胶原纤维化的复合膜;
(6)将所述胶原纤维化的复合膜,不经过预冻处理,直接真空冷冻干燥,得到胶原/细菌纤维素复合膜敷料;
其中,步骤(2)和步骤(6)中,真空冷冻干燥的条件包括:在3-5分钟内系统绝对压强降低至40Pa以下,冷冻干燥时间为24-72小时;
所述胶原溶液的浓度为1-10mg/mL;
其中,所述步骤(5)中,在25-37℃条件下进行纤维化处理2-48h。
2.根据权利要求1所述的胶原/细菌纤维素复合膜敷料的制备方法,其中,所述天然细菌纤维素膜为利用具备转化生产细菌纤维素的微生物,采用静态发酵方法自然形成的纤维素膜。
3.根据权利要求1所述的胶原/细菌纤维素复合膜敷料的制备方法,其中,所述纯化处理包括:将天然细菌纤维素膜依次进行浸泡、碱液煮沸、洗涤、酸液浸泡和洗涤,得到纯化处理后的含水细菌纤维素膜。
4.根据权利要求1所述的胶原/细菌纤维素复合膜敷料的制备方法,其中,所述天然胶原为具有完整三螺旋分子结构的天然Ⅰ型胶原。
5.根据权利要求1所述的胶原/细菌纤维素复合膜敷料的制备方法,其中,所述步骤(4)中,真空度为0.08-0.1MPa,导入胶原时间为2-24h。
6.根据权利要求1所述的胶原/细菌纤维素复合膜敷料的制备方法,其中,所述大孔隙结构细菌纤维素膜的平均孔隙尺度大于1.5μm。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的胶原/细菌纤维素复合膜敷料的制备方法制备的胶原/细菌纤维素复合膜敷料。
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