KR101721514B1 - 아가로스, 탈세포화된 세포외기질 및 콜라겐을 포함하는 3차원 세포 배양용 세포 지지체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 3차원 세포배양용 세포지지체에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 아가로스, 탈세포화된 세포외기질(ECM) 및 콜라겐을 포함하는 3차원 세포배양용 세포지지체에 관한 것이다. 본 발명에 따른 아가로스, 탈세포화된 ECM 및 콜라겐을 포함하는 3차원 세포배양용 세포지지체를 통한 세포배양은 세포 간의 상호작용을 고려할 수 있으며, 실제 생체 조직 환경에서 일어나는 수용체의 발현, 유전자의 전사조절, 세포의 이동 및 세포자멸사(apoptosis) 등 복잡한 생명 현상에 대한 효과를 고려할 수 있다. 또한 본 발명의 세포지지체는 이온가교 결합을 하지 않고 온도의 변화만으로 겔화가 가능하여 세포친화적이며 세포독성이 없고 세포배양효율이 높다는 특징을 가지고 있어, 궁극적으로 본 발명은 3차원적 세포배양 기술의 확보와 기능 측정 개발을 통하여 향후 다양한 생명과학, 의약학 및 조직공학 관련 분야의 연구 개발에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

아가로스, 탈세포화된 세포외기질 및 콜라겐을 포함하는 3차원 세포 배양용 세포 지지체 {Cell scaffold for three dimensional cell culture comprising agarose, decelluarized extracellular matrix and collagen}

본 발명은 3차원 세포배양용 세포지지체에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 아가로스(agarose), 탈세포화된(decellularized) 세포외기질(extracellular matrix, ECM) 및 콜라겐(collagen)을 포함하는 3차원 세포배양용 세포지지체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

조직공학 분야는 공학과 생명과학의 주요 요소 즉, 생체 세포, 공학, 재료 및 적절한 생화학적/생리-화학적 인자 등을 복합적으로 사용하여 임상적 치료를 위한 응용과학분야이다. 특히 조직공학에서는 세포, 세포가 부착되어 자랄 수 있는 지지체(scaffold) 및 세포의 성장 및 분화를 조절할 수 있는 각종 인자를 적절히 이용하여 손상된 조직의 재생과 장기의 복구에 관한 연구가 중점적으로 수행되고 있다.

세포 배양은 바이오 분야의 연구에서 가장 기본이 되는 연구 방법으로서 생명체의 기능 연구뿐만 아니라 인체 질환을 연구하는데 매우 광범위하게 이용되고 있다. 현재까지 가장 흔히 사용되고 있는 방법은 폴리스티렌(polystyrene) 혹은 유리(glass)로 된 기질(substrate)로 이루어진 2차원 표면에서 세포를 배양하는 것이다.

그러나 2차원 표면에서 세포를 배양하는 것을 중대한 문제는 3차원 상에서 세포가 성장하는 생체의 생리적 환경을 정확히 반영할 수 없다는 것이며, 통상적인 2차원적 세포배양을 통해서는 세포 간의 상호작용을 고려할 수 있고 일어나는 수용체의 발현, 유전자의 전사조절, 세포의 이동 및 세포자멸사(apoptosis) 등 많은 복잡한 생명 현상은 실제 생체 조직 환경에서 일어나는 현상과는 다르다는 문제점이 있다.

따라서, 2차원적 세포배양에서 나타나는 문제를 해결하기 위해 세포의 공간적인 구조(spatial organization)를 고려한 3차원적 세포배양 방법에 대한 연구 및 개발은 매우 중요한 의의를 지닌다.

3차원적 생체조직 모사 세포배양 환경을 조성하기 위해 주로 이용하고 있는 방법은 세포를 구멍이 나있는 생체적합성 지지체(porous biocompatible scaffold)를 이용하여 배양하는 것이다. 생체적합성 지지체의 주된 한 형태인 하이드로겔을 제작하기 위한 재료로서 천연고분자가 널리 사용되고 있으며, 이러한 천연고분자는 천연 물질에서 분리된 소재들이며, 임상용 소재들로 널리 적용되고 있다.

현재까지 이러한 천연고분자의 단독 혹은 복합 소재를 이용하여 다양한 3차원 세포배양용 하이드로겔 지지체를 개발하고자 많은 시도가 이루어지고 있으나, 상기 천연 물질이 가지는 특성으로 인해 3차원 세포배양의 효율성이 높지 않다는 문제점이 있어 이를 보완한 3차원 세포 배양용 하이드로겔 지지체가 요구되고 있다.

본 발명자들은 3차원 세포 배양의 효율성을 높이는 방법을 고안하기 위해 연구하던 중 아가로스, 탈세포화된 세포외기질 및 콜라겐을 이용하여 제작한 복합 하이드로겔 지지체 모델이 3차원 세포 배양에 적합함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

한국등록특허 출원번호 제10-2014-0089858호

본 발명의 목적은 3차원 세포배양용 세포지지체 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 세포지지체를 포함하는 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는 3차원 세포배양 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아가로스(agarose), 탈세포화된 ECM(decellularized extracellular matrix) 및 콜라겐(collagen)을 포함하는, 3차원 세포배양용 세포지지체를 제공한다.

또한, 본 발명은 콜라겐용액과 세포를 혼합하는 단계; 상기 혼합 콜라겐 용액에 탈세포화된 ECM 용액을 첨가하는 단계; 및 상기 콜라겐-탈세포화된 ECM 혼합 용액에 아가로스를 첨가하여 겔화시키는 단계;를 포함하는, 상기 세포지지체의 3차원 세포 배양용 세포 지지체의 제조방법을 제공한다.

또한, 상기 3차원 세포배양용 세포지지체를 포함하는 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는 3차원 세포배양 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 아가로스, 탈세포화된 ECM 및 콜라겐을 포함하는 3차원 세포배양용 세포지지체를 통한 세포배양은 세포 간의 상호작용을 고려할 수 있으며, 실제 생체 조직 환경에서 일어나는 수용체의 발현, 유전자의 전사조절, 세포의 이동 및 세포자멸사(apoptosis) 등 복잡한 생명 현상에 대한 효과를 고려할 수 있다. 또한 본 발명의 세포지지체는 이온가교 결합을 하지 않고 온도의 변화만으로 겔화가 가능하여 세포친화적이며 세포독성이 없고 세포배양효율이 높다는 특징을 가지고 있어, 궁극적으로 본 발명은 3차원적 세포배양 기술의 확보와 기능 측정 개발을 통하여 향후 다양한 생명과학, 의약학 및 조직공학 관련 분야의 연구 개발에 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 돼지 간 조직의 탈세포화를 확인하기 위하여 H&E 염색(A) 및 DNA 농도 측정(B)을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 다양한 농도에서 PLE의 마우스 가슴샘상피세포에 대한 독성효과를 측정한 결과를 위상차현미경 사진(A) 및 그래프(B)로 나타낸 도이다.
도 3은 다양한 농도의 탈세포화된 ECM (PLE)이 포함된 아가로스-탈세포화된 ECM 복합 하이드로겔 및 아가로스겔 지지체에서 3차원적으로 마우스 가슴샘상피세포를 배양한 결과를 위상차현미경 사진(A) 및 그래프(B)로 나타낸 도이다.
도 4는 다양한 농도의 해양콜라겐(MF)이 포함된 아가로스-MF 복합 하이드로겔 및 아가로스겔 지지체에서 마우스 가슴샘상피세포가 하이드로겔로부터 빠져나오는 수를 측정한 결과를 위상차현미경 사진(A) 및 그래프(B)로 나타낸 도이다.
도 5는 다양한 농도의 MF가 포함된 아가로스-MF 복합 하이드로겔 및 아가로스겔 지지체에서 마우스 가슴샘상피세포를 3차원적으로 배양한 결과를 위상차현미경 사진(A) 및 그래프(B)로 나타낸 도이다.
도 6은 아가로스겔(agarose), 아가로스-MF(MF), 아가로스-탈세포화된 ECM(PLE), 아가로스-PLE-MF(PLE/MF) 복합 하이드로겔 등 여러 종류의 지지체에서 마우스 가슴샘상피세포를 2차원 및 3차원적으로 1일, 3일, 5일, 7일, 10일 및 14일간 배양한 후, 세포의 증식능을 관찰한 결과를 위상차현미경 사진(A) 및 그래프(B)로 나타낸 도이다.
도 7은 알지네이트-해양콜라겐-아가로스(AmCA), AmCA-PLE (AmCA+ECM) 및 PLE/MF(MF+ECM) 복합 하이드로겔 지지체에서 마우스 가슴샘상피세포를 3일, 5일, 7일 및 14일간 배양한 후, 세포의 증식능을 관찰한 결과를 위상차현미경 사진(A) 및 그래프(B)로 나타낸 도이다.
도 8은 아가로스겔(agarose), 아가로스-MF(MF), 아가로스-탈세포화된 ECM(PLE) 및 아가로스-PLE-MF(PLE/MF) 복합 하이드로겔 지지체에서 14일 동안 배양한 마우스 가슴샘상피세포의 생존능을 확인한 공초점 레이저 현미경 관찰 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 아가로스겔(agarose), 아가로스-MF(MF), 아가로스-탈세포화된 ECM(PLE) 및 아가로스-PLE-MF(PLE/MF) 복합 하이드로겔 지지체에서 14일 동안 배양한 마우스 가슴샘상피세포의 스페로이드 크기를 측정한 결과를 위상차현미경 사진(A) 및 그래프(B)로 나타낸 도이다.
도 10은 아가로스겔(agarose), 아가로스-MF(MF), 아가로스-탈세포화된 ECM(PLE) 및 아가로스-PLE-MF(PLE/MF) 복합 하이드로겔 지지체에서 14일 동안 배양한 마우스 가슴샘상피세포의 스페로이드 3차원 분포를 F-액틴(F-actin) 염색으로 확인한 공초점레이져현미경 관찰 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 아가로스겔(agarose), 아가로스-MF(MF), 아가로스-탈세포화된 ECM(PLE) 및 아가로스-PLE-MF(PLE/MF) 복합 하이드로겔 지지체에서 마우스 가슴샘상피세포를 2차원 및 3차원적으로 배양한 다음, 가슴샘세포형성 촉진인자인 GM-CSF, IL-7 및 TARK 유전자의 발현을 RT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 아가로스, 탈세포화된 세포외기질 및 콜라겐으로 구성된 복합체를 포함하는 3차원 세포배양용 세포지지체를 제공한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명에서 "세포"는 모든 생물의 기능적, 구조적 기본 단위로서, 가슴샘상피세포, 상피세포, 피부세포, 내피세포, 혈관세포, 골세포, 골아세포, 연골세포, 섬유아세포, 근육세포, 지방세포, 신경세포, 면역세포, 혈액세포, 결합조직세포를 비롯한 다양한 성체세포 외에도 줄기세포 및 조혈모세포와 같이 다양한 세포로 분화할 수 있는 세포도 포함하는 폭넓은 의미로 사용하였으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 “세포 지지체”는 세포의 체외 배양 및 체내 이식이 가능하도록 만들어진 물리적 지지체이다. 지지체의 물리 화학적 특성은 세포를 부착하고 전달할 수 있으며, 세포성장을 유도분화하고 촉진시킬 수 있으며, 생체적합성이며 생분해성인 것이 바람직하며, 용이한 제조과정과 원하는 형태로 자유자재로 만들 수 있는 것이 바람직하다.

본 발명에서 “아가로스”는 해조류에서 추출된 갈락토오스로 구성된 다당류로써, 세포배양 배지로 주로 사용되는 물질로 구조물의 경도를 조정할 수 있어 하이드로겔 형태로 사용가능한데, 이를 통하여 인공지지체 내부에 고르게 세포를 파종할 수 있다는 장점을 가지고 있다. 또한 아가로스는 이온가교 또는 화학가교의 형성 없이 온도 변화만으로도 겔화를 유도할 수 있다.

본 발명에 있어서 “세포외기질(ECM)”은 동물의 구조적 지지 등을 담당하는 조직으로 결합조직에 속한다. 세포외기질은 세포 사이의 기질과 기저막으로 구성되며, 세포 사이의 기질은 여러 세포들 사이의 공간을 채우는 기질로 다당류로 이루어진 겔과 단백질 섬유가 세포 사이에 채워져 있어 세포외기질의 완충작용을 돕는다. 기저막은 얇은 종이처럼 구성되어 있어 그 위에 상피조직이 위치한다.

상기 세포외기질의 기능은 기존에 단순한 세포와 주변 환경 간의 연결체로서 구조적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 그러나 최근 세포외기질은 구성 성분인 수용성 신호 전달 물질(soluble signaling molecules)을 조직 내에 저장하여 이 물질들이 여러 신호를 활성화시키면서 주변 세포의 증식, 분화 그리고 이동 등을 매개하는 것이 밝혀졌다. 이는 세포외기질이 구조적인 역할 뿐만 아니라 세포의 분열, 분화 및 사멸 등 생리 조절인자로서 매우 중요한 역할을 한다는 것을 의미한다.

상기와 같은 세포외기질의 성질을 그대로 보존한 채, 세포외기질을 기능성 지지체로 제작하기 위해 탈세포화 효소를 사용하여 조직(tissue) 또는 장기(organ)의 탈세포화 과정이 필요하다.

본 발명에서 “탈세포화”는 조직 또는 장기의 세포외기질을 분리시키기 위한 생의학 공학 분야에서 사용되는 기술이다. 조직의 ECM 지지체만을 남기는 것이 특징이며 인공 기관 및 조직의 재생에 사용된다. 탈세포화 과정 중 세포 성분은 조직으로부터 제거되지만, 세포외기질의 일부 성장 인자 단백질, 생리 활성 분자 그리고 산소 및 영양 물질 등은 유지된다.

본 발명에서, 상기 탈세포화된 ECM은 동물 조직으로부터 유래된 것일 수 있으며, 바람직하게는 간 조직으로부터 유래된 것일 수 있으고, 더 바람직하게는 돼지 간 조직으로부터 유래된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일실시예에서는 돼지 간 조직 유래 탈세포화된 ECM을 이용하였으며, 이를 PLE로 명명하였다.

본 발명에 있어서 “콜라겐”은 섬유형태의 단백질로써, 결합조직내의 세포외기질 의 주성분을 이루고 있는 천연고분자이다. 콜라겐은 세포의 인식 및 세포의 부착과 증식을 조절하는 역할을 통하여 조직이나 장기를 지탱하고 조직 또는 장기의 형태를 유지시키고 조직 재생의 역할을 하는 물질로 스폰지, 섬유형태, 겔, 솔루션, 심질소재 및 관 형상의 소재 등 다양한 형태의 가공이 가능한 장점이 있다. 그러나 콜라겐은 매우 낮은 수준의 기계적 강도와 분해속도의 제어가 어려울 뿐만 아니라 콜라겐 단독 사용으로는 겔화가 어려운 단점이 있다. 따라서, 콜라겐 용액이 상기 함량 범위를 벗어나면 세포의 캡슐화가 되지 않아 세포가 겔에서 빠져나가거나, 세포의 성장능에 영향을 미치는 등의 문제가 야기될 수 있다.

본 발명에서, 콜라겐은 바람직하게는 해양 생물 유래 콜라겐일 수 있다. 본 발명에서‘해양 생물 유래 콜라겐’이란(이하 “해양콜라겐”으로 지칭한다) 해양 생물에서 유래된 콜라겐으로, 구체적으로는 생선 비늘과 피부(fish scale and skin), 해조류(seaweeds), 해면(sponges), 해파리(jellyfish) 등에서 유래한 콜라겐을 지칭하며, 예컨대 생선 비늘에서 유래한 콜라겐을 의미한다. 본 발명의 해양콜라겐은, 바람직하게는 단백질 가수분해 효소 처리에 의해 저분자화된 것일 수 있다. 상기 저분자란 분자량 0.01 내지 3000, 바람직하게는 2000 이하를 의미하며, 더욱 바람직하게는 1500 이하를 의미한다.

본 발명의 일 실시예에서는 틸라피아(돔계열) 비늘에서 추출한 생선 비늘로부터 유래되고, 이를 단백질 가수분해 효소로 처리하여 저분자화시킨 분자량 2000 이하의 해양콜라겐을 이용하였다.

기존의 콜라겐은 돼지나 소 등의 뼈나 껍질에서 추출한 동물성 콜라겐으로, 광우병, 구제역 등에 따른 다양한 문제점이 도출된 바 있으며, 자가면역 질환을 앓고 있거나, 동물성 콜라겐에 알러지 반응을 보이는 사람들은 사용하지 못하며, 선진국이나 우리나라에서도 육상동물에서 추출한 콜라겐의 사용을 금지하고 있는 실정이다. 이에 따라, 최근에는 식물성 콜라겐을 사용하고 있는데, 식물성 콜라겐은 단백질을 구성하고 있는 아미노산 구성 자체가 인체와 다르기 때문에, 피부에 적용시 흡수성이 낮고, 효능 및 효과 면에서는 동물성 콜라겐과 비교하여 현저하게 떨어진다는 보고가 있다.

이에 반해, 본 발명의 구성인 해양콜라겐(MF)은 해양 생물에서 추출한 콜라겐을 트립신 등의 단백질 가수분해 효소 처리하여 얻어진 가수분해 산물로서, 효소 처리에 의하여 저분자화 된 해양콜라겐은 체내 또는 피부 흡수가 빠르고, 액상으로 사용하기 편리하며, 세린의 함량이 높아서 피부 주름 개선 기능이 우수하며, 프롤린이 함유되어 있어서 보습 기능도 우수하다.

상기 해양콜라겐은 열변성 온도가 높아서 피부 도포 시에도 콜라겐의 3중 나선 구조가 파괴되지 않기 때문에 안정성이 우수하다. 또한, 해양콜라겐은 겔화 온도가 30℃ 이하이기 때문에 사람의 체온 (36.5℃)에서 쉽게 흡수되지만, 동물성 콜라겐은 겔화 온도가 40.1℃ 이기 때문에 체온에서는 굳은 상태여서 흡수율이 낮다. 그리고 동물성 콜라겐은 분자량이 5000 내지 6000으로 구성되어 있지만 해양콜라겐의 분자량은 약 0.01 내지 3000 사이로 저분자 단백질이다. 따라서, 해양콜라겐은 소, 돼지, 닭 등의 뼈나 가죽에서 추출한 일반 육지 동물성 콜라겐 보다 흡수율 및 사용 편의성 측면에서 유리하다.

상기 콜라겐은 본 발명의 세포지지체에서 세포가 겔 밖으로 탈리되는 것을 방지할 수 있다.

상기 세포지지체는 총 중량에 대하여 콜라겐을 1 내지 50 중량부로 포함하고, 바람직하게는 5 내지 20 중량부로 포함하며, 가장 바람직하게는 7.5 내지 15 중량부로 포함하나 이에 제한되지 않는다.

상기 세포지지체는 총 중량에 대하여 탈세포화된 ECM을 0.01 내지 0.15 중량부로 포함하고, 바람직하게는 0.05 내지 0.15 중량부로 포함한다. 만약 탈세포화된 ECM이 0.15 중량부를 넘기는 경우 세포증식률이 감소하므로 3차원 세포 배양 지지체로 사용되기 적절하지 못하다.

상기 세포지지체는 총 중량에 대하여 아가로스를 0.005 내지 0.5 중량부로 포함하고, 바람직하게는 0.01 내지 0.3 중량부로 포함하며, 가장 바람직하게는 0.08 내지 0.2 중량부로 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 만약 아가로스 용액이 상기 함량 범위를 벗어나면 겔화가 이루어지지 않거나, 세포가 손상되거나 사멸하는 문제가 야기될 수 있다.

상기 세포지지체는 하이드로겔 형태일 수 있다. 하이드로겔은 조직공학 및 약물 전달 분야에서 널리 사용되는 물질로서, 하이드로겔에 약물 및 세포를 함께 포함시켜 생물공학 및 의료분야에 널리 사용되며, 상기 세포지지체를 하이드로겔 형태로 변형하는 경우 세포 배양시 인공지지체 내부에 세포를 고르게 시딩(seeding)을 할 수 있다는 이점이 있다.

상기 세포지지체는 알지네이트를 추가로 포함할 수 있다. 알지네이트를 더 포함하는 경우에도 본 발명의 복합체는 3차원 세포 배양용 지지체로 사용하기 적절하다.

본 발명의 세포지지체에 첨가되는 탈세포화된 ECM, 콜라겐, 아가로스 및 알지네이트는 저장용액 형태로 첨가될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에 따른 아가로스, 탈세포화된 ECM 및 콜라겐으로 구성된 복합 하이드로겔 지지체는 기존의 알지네이트 기반의 이온가교결합을 통한 겔화가 아닌 아가로스를 이용하여 겔화를 유도하기 때문에 이온에 의한 세포 독성을 방지할 수 있는 장점을 가진다. 또한 하이드로겔의 세포친화성을 더욱 높일 수 있으므로 기존의 하이드로겔 지지체에 비해 3차원 세포 배양의 효율이 더 뛰어나다는 장점이 있다.

본 발명은 또한 (1) 콜라겐용액과 세포를 혼합하는 단계; (2) 상기 혼합 콜라겐 용액에 탈세포화된 ECM 용액을 첨가하는 단계; 및 (3) 상기 콜라겐-탈세포화된 ECM 혼합 용액에 아가로스를 첨가하여 겔화시키는 단계;를 포함하는, 상기 3차원 세포배양용 세포지지체의 세포 지지체의 제조방법을 제공한다.

보다 상세하게는 상기 3차원 세포지지체의 제조방법은 콜라겐용액과 세포를 혼합하여 25 내지 37 ℃의 온도에서 5 내지 30 분 동안 배양하는 단계; 상기 배양된 콜라겐 혼합 용액에 탈세포화된 ECM을 첨가하여 25 내지 37 ℃의 온도에서 5 내지 30 분 동안 세포의 탈리를 방지하는 단계; 및 상기 콜라겐-탈세포화된 ECM 혼합 용액에 아가로스 용액을 첨가하여 4 내지 25 ℃의 온도에서 5 내지 30 분 동안 정치시켜 겔화시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 3차원 세포지지체의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한 아가로스, 탈세포화된 ECM 및 콜라겐으로 구성된 복합체를 포함하는 3차원 세포배양용 세포지지체를 포함하는 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는 3차원 세포지지체의 제조방법을 제공한다.

상기 배양하는 세포는 정상세포 또는 암세포에서 선택할 수 있으며, 보다 구체적으로 정상세포 중 가슴샘상피세포, 상피세포, 피부세포, 내피세포, 혈관세포, 골세포, 골아세포, 연골세포, 섬유아세포, 근육세포, 지방세포, 신경세포, 면역세포, 혈액세포, 결합조직세포를 비롯한 다양한 성체세포 외에도 줄기세포 및 조혈모세포로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 암세포 중 난소암, 유방암, 위암, 대장암, 직장암, 폐암, 간암, 전립선암, 신장암, 췌장암, 갑상선암, 자궁암, 방광암, 다형성아교모세포종, 피부암, 흑색종, 갑상선암, 두경부암, 후두암, 수모세포종, 인후두암, 구강암, 타액선암, 식도암, 골육종, 혀암, 혈액암, 담도암, 신경아교종, 뼈암, 원인불명원발암으로 이루어진 암질환의 암세포에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 3차원 세포배양 방법은 생체와 매우 유사한 세포배양 환경을 조성하며, 스페로이드 및 스페로이드버딩 형성능, 세포 생존능, 성장능, 증식능, 분화능, 약물확산능 및 세포활성이 우수하다.

이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 세포 및 세포 배양

마우스 가슴샘 피질의 상피세망세포(CREC, 1308.1)는 바바라 노웰 박사(The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA)로부터 공급받았고, 상기 세포는 5% 이산화탄소 및 37 ℃가 유지되는 배양기에서 10% (v/v) 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS; Gibco, Invitrogen), 100 U/mL 페니실린(penicillin; Gibco, Invitrogen) 및 100 ㎍/mL 스트렙토마이신(streptomycin; Gibco, Invitrogen)을 포함하는 둘베코수정이글배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM, HyClone, Logan, UT, USA)에서 배양하였다. 이틀에 한 번씩 신선한 배지로 교체해주었다.

실시예 2. 탈세포화된 간 조직 ECM의 제조

(2-1) 탈세포화된 간조직 ECM의 제조

돼지 간은 인접 도축장에서 공급받았고 PLE(하기의 방법으로 제조된 탈세포화된 돼지 간 조직 유래 세포외기질 분말)로 구성된 하이드로겔을 제조하기 위해 이를 공급자로부터 승인받아 사용하였다. 탈세포화 과정을 위하여 조각낸 간 조직을 2일 동안 일정하게 교반하며 5 mg/mL SDS, 10 mg/mL 트리톤 X-100(Triton X100) 및 0.2 mg/mL EDTA(Ethylene diamine tetra acetic acid)가 포함된 탈이온화된 물에 담지시키고 용액이 피로 오염되면 새 용액으로 바꾸었다. 탈세포화된 간 조직을 2일 동안 인산완충식염수(Phosphate-buffered saline, PBS) 용액으로 세척하고 그 용액을 4시간마다 교체하였다. 그 후 탈세포화 된 간 조직을 4시간 동안 4%의 에탄올로 탈수시키고 2일 동안 동결 건조하였다. 상기 동결 건조된 탈세포화된 간 조직 분말, 즉 PLE 1 g 및 펩신 1 mg을 100 mL의 0.01N HCl에 추가하고 상온에서 2일 동안 계속 교반하였다. 완전한 용해 후에 수득한 탈세포화된 간 조직 분말의 최초 pH는 2.3 내지 2.8로 확인되었고, 펩신의 활성을 완전히 불활성화시키기 위하여 1M NaOH를 이용하여 pH를 7.4까지 높여주었다. 상기 탈세포화된 간 조직 분말 용액의 겔화를 막기 위하여 10℃ 이하의 온도를 유지하였으며 이 후 콜라겐을 겔화시키기 위하여 1시간 동안 60℃로 가열하였다. 상기 과정을 통해 수득한 PLE 용액의 잔여입자를 0.45 μm 주사기 필터(Corning, NY, USA)를 이용하여 제거하고, 최종적으로 PLE의 용액을 10 mg/mL의 농도로 제조하였다.

(2-2) 탈세포화된 간조직 ECM의 탈세포 확인

상기 실시예 (2-1)에서 제조한 PLE에서 탈세포화가 잘 이루어졌는지 여부를 확인하기 위하여, H&E 염색 및 DNA 농도 측정을 수행하였다.

H&E 염색을 위해 탈세포화 처리하지 않은 간 조직과 탈세포화 처리한 간 조직 ECM을 OCT 화합물(Leica Biosystems Richmond, Richmond, IL, USA)에 담지하고 샘플을 6 μm 두께로 동결조직절편을 제작하였다. 동결조직절편을 2시간 동안 50 ℃에서 건조하였고 20분 동안 20 ℃에서 차가운 100 % 에탄올로 고정하였다. 고정 후에 샘플은 팬(fan)으로 3시간 동안 건조하였다. 그리고 나서, 알코올 용액의 농도를 100, 95, 90, 80, 70 및 50 %로 낮추면서 3분 동안 샘플을 수화시켰고 2분 동안 헤마톡실린(hematoxylin, Mayer’s hematoxylin, Abcam, Massachusetts, USA)으로 염색하고 그 후 10분 동안 흐르는 물에 세척하였다. 그리고 나서 1 내지 2분 동안 에오신-Y(Sigma-Aldrich)로 염색하였다. 그리고 나서, 알코올 용액의 농도를 70 %, 80 %, 90 %, 95 % 및 100 %로 올리면서 탈수시켰고 탈수시에 사용했던 잔여 알코올을 제거하기 위해 카복시자일렌(carboxyxylene) 용액에 5 내지 10 회 담가주었다. 10분 동안 자일렌(xylene)에 담근 후 최종적으로 엔텔란(entellan, Sigma-Aldrich)으로 봉입하였으며, 건조 후에 광학현미경(olympus)으로 관찰하였다. 그 결과는 도 1(A)에 나타내었다.

다음으로 DNA 농도 측정을 위해 변형된 GenEX^TM Tissue (GeneAll Biotechnology, Seoul, Korea) 방식을 이용하였다. 탈세포화 처리를 하지 않은 간 조직의 조각 및 탈세포화된 간 조직의 조각 각각 최대 10 mg을 1.5 mL 에펜돌프 튜브에서 300 μL의 버퍼 AL과 혼합하여 균질화하였다. 상기 혼합물에 단백질분해효소 K(20 mg/mL) 1.5 μL를 첨가한 후 교반하여 샘플을 혼합시켰다. 샘플 내용물이 완전히 용해될 때까지 가열기(heating block)에서 56℃의 온도로 유지하였고, 그 후에 1 μL의 RNase 용액을 첨가하고 튜브를 교반하여 혼합시키는 과정을 5회 반복하였다. 혼합 후에, 샘플을 37 ℃에서 30분 동안 배양하였다. 그 후 상온에서 식혀주었다. 100 μL의 버퍼 PP를 혼합물에 첨가해준 뒤 20초동안 강하게 와류시켜 주었고 5분 동안 샘플을 4℃에서 처리하였다. 1분 동안 14000 xg로 샘플을 원심분리하였고 상층액을 1.5 mL 에펜돌프 튜브로 이동시켰다. 아이소프로판올 300 μL을 첨가하고 흰 실타래 모양으로 DNA 가닥 형태가 보일때까지 튜브를 아래 위로 흔들어 주었다. 추가적으로 1분 동안 14000 xg로 샘플을 원심분리하였고, 상층액을 버리고 70% 에탄올 300 μL를 추가하였다. DNA 펠렛(pellet)과 튜브의 측벽을 세척하기 위해 튜브를 부드럽게 교반하였다. 이 후 추가적으로 1분 동안 14,000 xg로 원심분리하였고 에탄올을 버리고 흡착포(clean absorbent paper) 위에 튜브를 뒤집어 세우고 펠렛을 15분 동안 자연 건조 시켰다. 최종적으로 100 μL의 물을 첨가하고 65℃에서 1시간 동안 처리하였다. 상기 추출 DNA의 농도는 나노드롭 2000(Nanodrop 2000)을 이용하여 측정하였다. 그 결과는 도 1(B)에 나타내었다.

도 1A에 나타낸 바와 같이, H&E 염색 결과 탈세포화 처리를 하지 않은 간 조직에서는 핵이 관찰되었으나 탈세포화된 간 조직 ECM(PLE)에서는 세포가 제거되고 ECM만 남아있었다. 또한, 도 1B에 나타낸 바와 같이, DNA 농도 측정 결과 탈세포화된 간 조직 ECM(PLE)에서는 탈세포화 처리를 하지 않은 간 조직에 비해 훨씬 낮은 비율의 DNA(1.8 %)가 존재함을 확인하였으며, 이를 통해 탈세포화가 잘 이루어진 것을 확인하였다.

실시예 3. 탈세포화된 ECM을 포함하는 하이드로겔 지지체의 제조

(3-1) PLE의 세포독성확인(cell cytoxicity assay)

돼지 간 조직에서 탈세포화 시키는 과정 중 사용되는 용액으로 인해 상기 실시예 2에서 제조한 PLE가 세포독성이 있는 지를 측정하기 위해, PLE를 정상세포인 마우스 가슴샘상피세포에 처리한 후 WST-1으로 세포독성효과를 확인하였다. 이를 위하여 먼저, 가슴샘상피세포를 96 웰 플레이트에 1×10⁴ 세포/mL의 농도로 시딩하였다. 6시간 배양 후, 배지를 제거하고 DPBS (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline)로 세척한 뒤, 0%, 0.1%, 0.2%, 0.3% 및 0.4% 농도의 PLE를 200 μL씩 각 웰에 첨가하였다. 그 후 세포를 37℃에서 24 내지 48시간 동안 배양하였다. 배양된 세포의 물질대사 활성 능력을 평가하기 위해, WST-1 기반 분석 용액(EZ-Cytox assay, Daeil Lab Service, Seoul, Korea)을 각 웰에 10배 희석하여 첨가하였다. 생존해 있는 즉, 물질대사가 활발한, 세포에서 탈수소화효소의 반응에 의해 생성된 포르마잔 다이(formazan dye)의 흡광도는 450 nm에서 마이크로플레이트 리더(tecan, Mannedorf, Switzerland)를 사용하여 측정하였고 이를 그래프로 나타내었다. 상기 배양된 세포는 위상차 현미경을 이용하여 관찰하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, PLE에 의한 세포사멸이 나타나지 않았으며, PLE를 처리하지 않은 대조군에 비해 PLE를 처리한 실험군에서 세포증식이 증가함을 확인하였다.

(3-2) 하이드로겔 지지체 제조 및 PLE의 최적 농도 결정

PLE 복합 하이드로겔 지지체 제작에 적합한 PLE의 농도를 확인하기 위하여 여러 가지 농도의 PLE-아가로스겔 지지체를 제작하여 세포 증식능을 비교하였다. 본 비교실험의 실시에 앞서, 하이드로겔을 제조하기 위하여 아가로스를 멸균한 증류수에 20 mg/mL로 첨가하고, 100℃에서 끓을 때까지 가열하여 아가로스 저장액으로 만들었다. 1 mg/mL 펩신을 포함하는 0.01N HCl 100 mL에 1 g의 PLE 분말을 48시간 용해시킨 후, 교반기를 이용하여 PLE 혼합 용액을 제조하였으며, 이 후에 1시간 동안 60℃로 가열하였다. 1% PLE 저장 용액을 준비하기 위해 상기 혼합 용액을 0.45 μm 주사기 필터를 이용하여 한 번 여과하였다.

다음으로 0.125 %의 아가로스겔 용액 100 μL에 세포를 첨가하기 위해 1x10⁵ 세포/mL가 포함된 배지 93.75 μL와 2% 아가로스 저장액 6.25 μL를 혼합하였다. 그리고, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2 및 0.3% PLE-아가로스겔 용액 100 μL에 세포를 첨가하기 위해, 1x10⁵ 세포/mL가 포함된 배지 93.75, 88.75, 83.75, 및 63.75 μL를 각각 1% PLE 저장액 1, 5, 10, 15, 20 또는 30 μL와 2% 아가로스 저장액 6.25 μL와 함께 혼합하였다. 각 혼합액을 1 mL 주사기에 100 μL씩 분주하여 겔화시킨 후 24-웰 플레이드의 웰에 이동시켜 37 ℃에서 배양시켰다.

상기 과정을 통해 제조한 하이드로겔의 구성을 하기 표 1에 나타내었다.

상기 세포를 3 및 5일 동안 배양한 뒤, 위상차현미경과 WST-1 분석법을 이용하여 세포증식능을 분석하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, WST-1 분석법으로 마우스 가슴샘상피세포(CREC)의 증식률을 측정한 결과, PLE가 포함되지 않은 대조군에 비해 PLE가 포함된 실험군에서 모두 세포증식률이 증가하였다. 그 중에서 0.1% PLE-아가로스겔 지지체에서 가장 증식률이 높았고, 0.1% 초과의 PLE-아가로스겔 지지체에서는 세포증식률이 감소함을 통하여 PLE 복합 하이드로겔 지지체 제작에 가장 적합한 PLE의 농도는 0.1%임을 확인하였다.

실시예 4. MF(해양콜라겐)를을 포함하는 하이드로겔 지지체의 제조

(4-1) MF의 제조 및 이의 세포 탈리 억제 효과 확인

콜라겐으로 인한 세포 탈리 억제 효과 [또는 세포피포화 기술(cell encapsulation) 효과]를 확인하기 위하여 여러 가지 농도의 해양콜라겐(MF)-아가로스겔을 제작하였다. 본 비교실험의 실시에 앞서, 하이드로겔을 제조하기 위하여 우선 아가로스를 멸균한 증류수에 20 mg/mL로 첨가하고, 100℃에서 끓을 때까지 가열하여 아가로스 저장액으로 만들었다. 그리고 가수분해 효소 처리된 해양콜라겐(분자량 2,000 이하, 틸라피아(돔계열) 비늘 유래, FCP-P, Geltech, Busan, South Korea)을 멸균된 증류수에 300 mg/mL로 첨가하여 30% 콜라겐 저장액으로 만들었다. 다음으로 0.125 %의 아가로스 하이드로겔 용액 100 μL에 세포를 첨가하기 위해 1x10⁵ 세포/mL가 포함된 배지 93.75 μL와 2% 아가로스 저장액 6.25 μL와 혼합하였다. 그리고 5, 7.5, 10 및 15%의 MF-아가로스겔 용액 100 μL에 세포를 첨가하기 위해, 1x10⁵ 세포/mL가 포함된 배지 77.15, 68.75, 60.45 및 43.75 μL를 각각 30% 콜라겐 저장액 16.6, 25, 33.3 및 50 μL와 2% 아가로스 저장액 6.25 μL와 함께 혼합하였다. 각 혼합액을 1 mL 주사기에 100 μL씩 분주하여 겔화시킨 후 24-웰 플레이드의 웰에 이동시켜 37 ℃에서 하루 동안 배양시킨 뒤, 하이드로겔을 새로운 24-웰 플레이트로 이동시켰다. 24-웰 플레이트를 포함하여 최초의 하이드로겔에서 남아있는 세포는 겔 밖으로 빠져나온 세포로 계수하여 이를 바(bar)그래프로 나타내었다. 그 결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 탈리된 세포수를 측정한 결과, MF가 포함되지 않은 아가로스겔에서 가장 많은 세포가 탈리되었고, MF의 농도가 높아질수록 탈리된 세포수가 감소하는 것을 확인하였다. 이 결과를 통해 기존의 아가로스겔에서 기계적인 강도가 약하여 세포들이 겔에 안정적으로 결합되지 못하고 겔 바깥으로 빠져 나오는 문제점을 MF를 첨가하여 극복할 수 있음을 확인하였다.

(4-2) MF의 최적 농도 결정

PLE 복합 하이드로겔 지지체 제작에 적합한 MF의 농도를 확인하기 위하여 상기의 방법으로 5, 7.5, 10 및 15%의 MF-아가로스겔 지지체를 제작하였다. 3 및 5일 동안 배양한 뒤 위상차현미경으로 세포 스페로이드의 형태를 관찰하고 WST-1을 이용하여 세포 증식능 측정하였다. 그 결과는 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, MF가 포함되지 않은 대조군에 비해 MF가 포함된 실험군에서 모두 세포증식률이 증가하였다. 그 중에서 10% MF-아가로스겔 지지체에서 가장 증식률이 높았다. 따라서 PLE 복합 하이드로겔 지지체 제작에 적합한 MF 농도는 탈리된 세포가 적고, 세포증식률이 가장 높은 10%의 MF가 가장 적합함을 확인하였다.

실시예 5. PLE ( 탈세포화된 ECM), MF 및 아가로스를 포함하는 복합 하이드로겔 지지체의 제조

(5-1) PLE ( 탈세포화된 ECM), MF 및 아가로스를 포함하는 복합 하이드로겔 지지체의 제조

실시예 3에서 확인한 최적 농도인 PLE 0.1%와 실시예 4에서 확인한 최적 농도인 MF 10%를 이용하여 PLE 및 MF를 포함하는 복합 하이드로겔 지지체를 제조하였다.

우선 PLE 및 MF를 포함하는 복합 하이드로겔 용액 100 μL에 세포를 첨가하기 위해, 1x10⁵ 세포/mL가 포함된 배지 50.45 μL를 30% 콜라겐 저장액 33.3 μL와 1% PLE 저장액 10 μL와 혼합하였다. 그리고 2% 아가로스 저장액 6.25 μL를 첨가한 후, 각 혼합액을 1 mL 주사기에 100 μL씩 분주하여 겔화시킨 뒤 24-웰 플레이드의 웰에 이동시켜 37 ℃에서 배양하였다.

(5-2) PLE(탈세포화된 ECM), MF, 아가로스 및 알지네이트 복합 하이드로겔 지지체의 제조

상기 실시예 (5-1)에서 제조한 PLE/MF 복합 하이드로겔에 5% 알지네이트 저장액을 첨가하여 PLE, MF 및 알지네이트 복합 하이드로겔 지지체, 즉 AmCA(알지네이트-콜라겐-아가로스)/PLE (AmCA+ECM) 복합 하이드로겔 지지체를 제조하였다. AmCA/PLE (AmCA+ECM) 복합 하이드로겔 용액 100 μL에 세포를 첨가하기 위해, 1x10⁵ 세포/mL가 포함된 배지 30.45 μL를 5% 알지네이트 저장액 20 μL와 30% 콜라겐 저장액 33.3 μL 그리고 1% PLE 저장액 10 μL와 혼합하였다. 마지막으로 2% 아가로스 저장액 6.25 μL를 첨가한 후, 각 혼합액을 1 mL 주사기에 100 μL씩 분주하여 겔화시킨 뒤 24-웰 플레이드의 웰에 이동시켜 37 ℃에서 배양하였다.

실시예 6. PLE(탈세포화된 ECM)을 포함한 복합 하이드로겔 지지체의 세포증식능 분석

상기 실시예 (5-1)에서 수득한 PLE/MF 복합 하이드로겔 지지체의 세포증식능이 우수함을 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 먼저, 2차원 환경(2D)인 96 웰 플레이트에 가슴샘상피세포를 1x10⁴ 세포/웰의 농도로 시딩하고, 3차원 환경(3D)인 0.125% 아가로스겔, 10% MF-아가로스겔, 0.1% PLE-아가로스겔 및 0.1% PLE/10% MF 복합 하이드로겔 지지체에 가슴샘상피세포를 1x10⁴ 세포/겔의 농도로 시딩하여 제조하였다. 이를 1, 3, 5, 7, 10 및 14일 동안 배양한 뒤, 위상차현미경으로 세포의 형태학적 변화를 관찰하였고, WST-1 assay를 이용하여 세포증식능을 측정하였다. 그 결과는 도 6에 나타내었다.

또한, PLE를 포함하지 않는 복합 하이드로겔 지지체와 PLE를 포함하는 복합 하이드로겔 지지체의 3차원 세포 지지체로서 효과를 비교하기 위하여, AmCA(아가로스, MF 및 알지네이트 복합 하이드로겔 지지체), 7.5% MF/PLE(아가로스+7.5% MF+0.1% ECM), 10% MF/PLE(아가로스+10% MF+0.1% ECM), 그리고 실시예 (5-2)에서 수득한 AmCA/PLE (AmCA+0.1% ECM) 복합 하이드로겔 지지체에 대하여 하기와 같은 실험을 수행하여 세포증식능을 비교하였다. 이를 위해 상기 4가지의 지지체에 가슴샘상피세포를 1x10⁴ 세포/겔의 농도로 시딩하였다. 이를 3, 5, 7 및 14일 동안 배양 한 뒤 위상차현미경으로 세포의 형태학적 변화를 관찰하였고, WST-1 assay를 이용하여 세포증식능을 측정하였다. 대조군으로써 2차원 환경(2D)인 96웰 플레이트에 가슴샘 상피세포를 1x10⁴ 세포/웰 농도로 시딩한 것을 사용하였다. 그 결과는 도 7에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 배양 초기에는 2차원 환경에서 세포가 더 빠르게 증식하였으나 배양 5일 이후에는 3차원 환경에서 더 빠르게 증식함을 확인하였다. 3차원 환경 중에서도 PLE/MF 복합 하이드로겔 지지체에서 세포증식능이 더욱 높고 세포 스페로이드의 크기가 더 증가한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, AmCA(알지네이트-콜라겐-아가로스) 복합 하이드로겔에 비해서 AmCA/PLE 하이드로겔 지지체의 세포증식능이 더 우수하였고, 이에 비해 본 발명의 PLE/MF 하이드로겔 지지체의 세포증식능 및 스페로이드 형성능이 더 우수하였다. 즉, 본 실시예의 결과를 통해 AmCA, AmCA/PLE 및 PLE/MF 하이드로겔 지지체 중에서 본 발명의 아가로스, 탈세포화된 ECM 및 콜라겐을 포함하는 PLE/MF 하이드로겔 지지체의 세포증식능 및 스페로이드 형성능이 가장 우수함을 확인하였다. 이러한 사실은 본 발명의 PLE/MF 하이드로겔 지지체가 기존의 하이드로겔 지지체에 비해 매우 우수한 3차원 세포지지체임을 나타낸다.

이는 MF/PLE 복합 하이드로겔 지지체에서 2차원 세포배양에 비해 생체에 더 유사한 3차원 세포배양 환경이 조성되었으며, 본 발명의 PLE(탈세포화된 ECM) 및 MF를 포함하는 복합 하이드로겔 세포지지체를 이용하여 세포 배양 연구에 적합한 모델을 구축할 수 있음을 나타낸다.

실시예 7. 공초점 현미경 관찰을 통한 PLE 복합 하이드로겔 지지체의 세포 생존 능력 확인

상기 실시예 (5-1)에서 수득한 PLE/MF 복합 하이드로겔 지지체에서 세포 생존 능력(cell viability)이 우수함을 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 우선 0.125% 아가로스겔, 10% MF-아가로스겔, 0.1% PLE-아가로스겔 및 0.1% PLE/10% MF 복합 하이드로겔 지지체에 가슴샘상피세포를 1x10⁴ 세포/겔의 농도로 시딩하였다. 이를 3, 5, 7, 10 및 14일 동안 배양한 뒤, Live/dead 염색을 실시하기 위해 하이드로겔 지지체를 PBS로 1회 세척 후 4 μL calcein AM과 1 μL EthD-1 (LIVE/DEAD Viability Kit, L3224, Molecular Probes-Invitrogen, Grand Island, NY, USA)을 2 mL PBS에 희석하여 빛을 차단시킨 곳에서 30분 동안 염색하여 공초점레이저현미경(confocal laser microscopy, FV1000-IX81, Olympus, Tokyo, Japan)으로 분석하였다. 그 결과는 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 아가로스겔 지지체의 경우 7일 째부터 사멸한 세포가 관찰되어 14일째 대부분의 세포가 사멸하였고, MF-아가로스겔 지지체의 경우 10일째부터 사멸한 세포가 관찰되었다. 또한 PLE-아가로스겔 지지체에서는 14일째 사멸한 세포가 관찰되었지만 PLE/MF 복합 하이드로겔 지지체에서는 14일 째에도 모든 세포가 생존하는 것을 확인하였다. 따라서 PLE(탈세포화된 ECM) 및 MF 복합 하이드로겔 지지체에서 세포의 우수한 생존능을 확인할 수 있었다.

실시예 8. 스페로이드 형성능 분석을 통한 PLE 복합 하이드로겔 지지체의 세포 성장 효율 확인

(8-1) 위상차 현미경 관찰을 통한 스페로이드 형성능 분석

상기 실시예 (5-1)에서 수득한 PLE/MF 복합 하이드로겔 지지체에서 세포 스페로이드 형성능이 우수함을 확인하기 위하여 스페로이드 크기를 측정하는 실험을 수행하였다. 우선 0.125% 아가로스겔, 10% MF-아가로스겔, 0.1% PLE-아가로스겔 및 0.1% PLE/10% MF 복합 하이드로겔 지지체에 가슴샘상피세포를 1x10⁴ 세포/겔의 농도로 시딩하였다. 이를 1, 3, 5, 7, 10 및 14일 동안 배양한 뒤, 위상차현미경으로 스페로이드의 가로와 세로의 지름을 측정하여 평균값을 그래프로 나타내었다. 그 결과는 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, 세포 스페로이드 크기를 비교하였을 때, 배양 3일째부터 다른 하이드로겔 지지체에 비해 PLE/MF 복합 하이드로겔 지지체에서 스페로이드 크기가 증가하여 14일째 그 차이가 확연한 것을 확인하였다.

(8-2) 공초점 현미경 관찰을 통한 스페로이드 형성능 분석

상기 실시예 (5-1)에서 수득한 PLE/MF 복합 하이드로겔 지지체에서 세포 스페로이드의 3차원 분포를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 우선 0.125% 아가로스겔, 10% MF-아가로스겔, 0.1% PLE-아가로스겔 및 0.1% PLE/10% MF 복합 하이드로겔 지지체에 가슴샘상피세포를 1x10⁴ 세포/겔의 농도로 시딩하였다. 이를 3, 5 및 7일 동안 배양한 뒤 F-actin염색을 실시하였다. 하이드로겔 지지체를 4% 파라포름알데하이드 고정액에 의 비율로 상온에서 20분 동안 고정하였다. 그런 다음 PBS로 2회 세척 후 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) 용액으로 상온에서 5분 동안 침투시키고 PBS로 2회 세척하였다. 비특이적인 염색을 제거하기 위해 0.2% BSA (bovine serum albumin, 이하 BSA; Sigma-Aldrich) 용액으로 상온에서 20분 동안 처리 후 PBS로 2회 세척하였다. 그 후 액틴-검출용 Phalloidine-FITC (Promega, Madison, WI, USA)를 0.2% BSA (Sigma-Aldrich) 용액에 1 : 40의 비율로 희석하여 40분 동안 반응시킨 다음 TBS로 3회 세척하여 슬라이드유리에 올려놓고 세포의 핵 염색을 위한 DAPI (Vector Lab, Burlingame, CA, USA)용액으로 대조 염색하여 덮개유리를 덮어 봉입한 후 공초점레이저현미경(Olympus)으로 관찰하였다. Z-스택 이미지는 재구조화한 3D 프로젝션 이미지를 생성하기 위하여 사용하였다. 그 결과는 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타낸 바와 같이, 0.125% 아가로스겔, 10% MF-아가로스겔, 0.1% PLE-아가로스겔 및 0.1% PLE/10% MF 복합 하이드로겔 지지체에에서 배양 된 가슴샘상피세포를 F-actin으로 염색한 결과, 3일 째부터 모든 조건에서 세포가 구형의 스페로이드를 형성하였으며, z-stack으로 확인한 결과, 배양기간이 길어질수록 스페로이드 직경이 증가하였다. 그 중에서 5일째부터 본 발명의 PLE/MF 복합 하이드로겔 지지체에서 형성된 스페로이드의 크기가 다른 조건에 비해 더 증가하는 것을 확인하였다.

실시예 9. 가슴샘상피세포형성 촉진인자 발현 변화 관찰을 통한 PLE 복합 하이드로겔 지지체의 3차원 세포 배양 특성 확인

상기 실시예 (5-1)에서 수득한 PLE/MF 복합 하이드로겔 지지체에서 세포 활성이 우수함을 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 우선 2차원 환경(2D)인 6 웰 플레이트와 3차원 환경(3D)인 0.125% 아가로스겔, 10% MF-아가로스겔, 0.1% PLE-아가로스겔 및 0.1% PLE/10% MF 복합 하이드로겔 지지체에 가슴샘상피세포를 배양 한 후, 가슴샘세포형성 촉진인자인 GM-CSF, IL-7 그리고 TARK 유전자의 발현을 분석하였다. 먼저, RNeasy-mini kit (Qiagen Valencia, CA, USA)의 방법을 참고하여 RNA를 추출하였다. RT-PCR을 수행하기 위해, 0.5 ㎍ 올리고(dT)12-18 [oligo(dT)12-18] Oligo (dT) 프라이머(primer), 50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 40 mM DTT, 0.5 mM deoxynucleotide triphosphate (dNTP) 혼합물, 10 units RNase 억제제 및 200 unit MMLV (Moloney murine leukemia virus) 역전사 중합효소(Promega)를 포함하는 완충용액 25 μL를 사용하여 1 ㎍의 총 RNA로부터 단사슬 cDNA를 합성하였다. 획득한 cDNA는 다음의 유전자 특정 프라이머를 사용한 PCR 증폭을 위한 주형으로 사용하였다 : IL-7, (F) 5’- GCCTGTCACATCATCTGAGTGCC-3’, (R) 5’-CAGGAGGCATCCAGGAACTTCTG-3’; GM-CSF, (F) 5’-GTCACCCGCCTTGGAAGCAT-3’, (R) 5’-ACAGTCCGTTTCCGGAGTTGG-3’; TARC, (F) 5’- TGCTTCTGGGGACTTTTCTG-3’, (R) 5’-TGGCCTTCTTCACATGTTTG-3’; 및 GAPDH (F) 5’-TGGAGAAACCTGCCAAGTATG- 3’, (R) 5’- TTGTCATACCAGGAAATGAGC-3’. 그 후 2% 아가로즈겔 전기영동을 시행하여 가슴샘세포형성촉진인자인 granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), interleukin 7 (IL-7) 및 TARC 유전자의 발현을 분석하였고 이를 동일한 cDNA 샘플로부터 증폭한 GAPDH mRNA에 대한 비로 표현하여, Image J (National Institute of Mental Health; NIH, Bethesda, MD, USA)로 정량화하여 그래프로 나타내었다. 그 결과는 도 11에 나타내었다.

도 11에 나타낸 바와 같이, 2차원 환경에 비해 3차원 환경에서 GM-CSF, IL-7 및 TARK 발현이 증가하였으며 특히, 본 발명에 따른 PLE/MF 복합 하이드로겔 지지체에서 GM-CSF는 5.7배, IL-7은 5.8배 그리고 TARK는 7.2배로 다른 하이드로겔 지지체에 비해 세포 형성 촉진인자인 유전자의 발현이 가장 높음을 확인하였다. 이 결과는 PLE/MF 복합 하이드로겔 지지체에서 배양된 마우스 가슴샘상피세포(CREC)가 세포 활성을 높게 유지한다는 것을 나타낸다.

상기 결과를 통하여, 본 발명에 따른 PLE(아가로스 및 탈세포화된 ECM) 및 MF를 포함하는 3차원 세포배양용 세포지지체를 통한 세포 배양은 세포 간의 상호작용을 고려할 수 있으며, 실제 생체 조직 환경에서 일어나는 수용체의 발현, 유전자의 전사조절, 세포의 이동 및 세포자멸사(apoptosis) 등 많은 복잡한 생명 현상에 대한 효과를 고려한 세포 배양이 가능함을 확인하였다. 궁극적으로 본 발명은 3차원적 세포 배양기술의 확보와 기능 측정 개발을 통한 질병 연구 개발에 크게 기여할 수 있음을 알 수 있다.

Claims (10)

1. 아가로스(agarose), 탈세포화된 ECM(decellularized extracellular matrix) 분말 및 콜라겐(collagen)을 포함하는, 3차원 세포배양용 세포지지체.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 탈세포화된 ECM 분말은 동물 조직으로부터 유래된 것을 특징으로 하는, 3차원 세포배양용 세포지지체.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 콜라겐은 해양 생물 유래 콜라겐인 것을 특징으로 하는, 3차원 세포배양용 세포지지체.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 해양 생물 유래의 콜라겐은 분자량 0.01 내지 2000으로 저분자화 되어 있는 것을 특징으로 하는, 3차원 세포배양용 세포지지체.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 세포지지체는 총 중량에 대하여 콜라겐을 7.5 내지 15 중량부로 포함하는 것을 특징으로 하는, 3차원 세포배양용 세포지지체.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 세포지지체는 총 중량에 대하여 탈세포화된 ECM 분말을 0.05 내지 0.15 중량부로 포함하는 것을 특징으로 하는, 3차원 세포배양용 세포지지체.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 세포지지체는 하이드로겔 형태인 것을 특징으로 하는, 3차원 세포배양용 세포지지체.
   
8. 제1항에 있어서, 상기 세포지지체는 알지네이트를 포함하는 것을 특징으로 하는, 3차원 세포배양용 세포지지체.
   
9. (1) 콜라겐 용액과 세포를 혼합하여 혼합 콜라겐 용액을 제조하는 단계;
   (2) 상기 혼합 콜라겐 용액에 탈세포화된 ECM 분말을 첨가하여 콜라겐-탈세포화된 ECM 분말 혼합 용액을 제조하는 단계; 및
   (3) 상기 콜라겐-탈세포화된 ECM 분말 혼합 용액에 아가로스를 첨가하여 겔화시키는 단계;를 포함하는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 3차원 세포 배양용 세포 지지체의 제조방법.
   
10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 세포지지체를 포함하는 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는 3차원 세포배양 방법.

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