DE112004001553T5

DE112004001553T5 - Verpflanzungsmaterialien, die bioaktive Substanzen enthalten, und Methoden zu deren Herstellung

Info

Publication number: DE112004001553T5
Application number: DE112004001553T
Authority: DE
Inventors: Michael C. Lafayette Hiles; Jasen P. West Lafayette Hodde; David M.J. West Lafayette Ernst; Lal West Lafayette Ninan
Original assignee: Cook Biotech Inc
Current assignee: Cook Biotech Inc
Priority date: 2003-08-25
Filing date: 2004-08-25
Publication date: 2006-08-10
Also published as: GB2424586B; US9504769B2; US20170128628A1; US10471182B2; US20190336650A1; WO2005020847A3; US20110318419A1; GB2424586A; US20200188559A1; US8021692B2; GB0605897D0; WO2005020847A2; US20180228939A1; US20070082060A1; US20100196480A1

Abstract

Ein medizinisches Produkt, das ein verpacktes, steriles, tierisches Material der extrazellulären Matrix umfasst, welches extrahierbaren, biologisch aktiven Fibroblasten-Wachstumsfaktor-2 (FGF-2) in einer Konzentration von mindestens etwa 50 ng/g Trockengewicht umfasst.

Description

Bezugnahme auf zugehörige Anmeldung
Diese Anmeldung beansprucht Rechte aus der U.S.-Patentanmeldung Nr. 60/497,746, angemeldet am 25. August 2003, auf die hiermit Bezug genommen und deren gesamter Inhalt miteinbezogen wird.
Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Materialien, die zur Gewebeverpflanzung dienen können und insbesondere solche Materialien, die aus extrazellulären Matrizes gewonnen wurden und die sowohl Collagen als auch Stoffe wie etwa Wachstumsfaktoren, die zu den nützlichen Eigenschaften der Materialien beitragen, noch beinhalten. In einem Aspekt betrifft die Erfindung Gewebeverpflanzungsmaterialien der extrazellulären Matrix, die einen oder mehrere Wachstumsfaktoren enthalten, welche auf eine im Voraus bestimmte Konzentration eingestellt sind, und zugehörige Herstellungsverfahren.
Materialien der extrazellulären Matrix (ECM), darunter solche, die aus der Gefäß- und Verschiebeschicht (Submucosa) und anderen Geweben stammen, sind bekannte Gewebeverpflanzungsmaterialien. Siehe z.B. die U.S. Patente Nr. 4 902 508, 4 956 178, 5 281 422, 5 372 821, 5 554 389, 6 099 567 und 6 206 931. Gewebearten aus verschiedenen biologischen Strukturen können zu diesen Zwecken verwendet werden, darunter zum Beispiel Dünndarm, Magen, Blase, Haut, Herzbeutel, Dura Mater, Faszie, und ähnliche. Diese Quellen stellen Collagen-haltige Materialien bereit, die bei verschiedenen chirurgischen Verfahren verwendet werden können, bei denen eine Gewebestützung und/oder das Einwachsen erwünscht sind.
Es wurde gezeigt, dass Submucosa und andere ECM-Materialien verschiedene andere Komponenten neben Collagen enthalten, die zur biologischen Aktivität der Materialien und zu ihrer Bedeutung bei der medizinischen Transplantation und anderen Verwendungen beitragen. Beispielsweise können ECM-Materialien Wachstumsfaktoren, Zelladhäsionsproteine und Proteoglycane enthalten. Die ECM-Materialien werden jedoch üblicherweise einer ganzen Reihe von Schritten bei der Herstellung der fertigen Produkte, die diese enthalten, unterzogen. Dies stellt eine Herausforderung bei der Gewinnung fertiger Produkte dar, die nicht nur die notwendigen physischen Eigenschaften und einen angemessenen Grad an biologischer Kompatibilität und Sterilität besitzen, sondern auch die erwünschte biologische Aktivität. Die vorliegende Erfindung erfüllt diese Bedürfnisse.
Zusammenfassung der Erfindung
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung in einem ihrer Aspekte ein Verfahren zur Herstellung eines Gewebeverpflanzungsmaterials, wie etwa eine Collagen-haltige extrazelluläre Matrix, bereit, das zumindest einen extrahierbaren, biologisch aktiven Wachstumsfaktor oder andere Proteinmaterialien außer Collagen enthalten, insbesondere Fibroblasten-Wachstumsfaktor-2 (FGF-2) in einer im Voraus bestimmten Menge. Das Verfahren umfasst die Schritte der Bereitstellung eines nicht-sterilen Materials der extrazellulären Matrix; die Herstellung einer Vielzahl von Transplantationsprodukten aus dem Material der extrazellulären Matrix; das Verpacken der Produkte; ein Sterilisationsverfahren, dem die verpackten Produkte unterzogen werden, das die Konzentration an extrahierbarem, biologisch aktivem Wachstumsfaktor (FGF-2) oder anderer Proteinmaterialien außer Collagen in den Produkten beeinflusst; und die Entnahme und das Testen von Produktproben der sterilisierten, verpackten Produkte, um die Konzentration eines Wachstumsfaktors (FGF-2) in den Produktproben zu bestimmen, wobei diese bestimmte Konzentration für die ungefähre Konzentration dieses Wachstumsfaktors in anderen dieser Produkte der Charge, aus dem die Produktprobe genommen wurde, repräsentativ ist.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein medizinisches Produkt bereit, das verpacktes, steriles Material der extrazellulären Matrix umfasst, das von einem Tier stammt und FGF-2 in einer Konzentration von mindestens etwa 50 Nanogramm pro Gramm Trockengewicht aufweist. Besonders bevorzugte Materialien sind lyophilisiert und/oder enthalten Submucosa.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt verpacktes, steriles Material der extrazellulären Matrix bereit, das aus tierischem Gewebe isoliert wurde und Bestandteile enthält, die natürlich im Gewebe vorkommen, wobei das Matrixmaterial Collagen, Wachstumsfaktoren, Proteoglycane, Glycosaminoglycane umfasst und extrahierbares, biolo gisch aktives FGF-2 in einer Konzentration von mindestens etwa 50 Nanogramm pro Gramm Trockengewicht aufweist.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von sterilem Material der extrazellulären Matrix bereit. Das Verfahren umfasst das Isolieren des Materials der extrazellulären Matrix aus tierischem Gewebe, wobei das isolierte Material der extrazellulären Matrix extrahierbares FGF-2 einer ersten Konzentration enthält; und das Sterilisieren des isolierten Materials der extrazellulären Matrix unter Bedingungen, bei denen mindestens 10 % der ersten Konzentration an extrahierbarem, biologisch aktivem FGF-2 erhalten bleibt.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung medizinischer Produkte dar. Das Verfahren umfasst das Bereitstellen von Material der extrazellulären Matrix in einem nicht-sterilen Zustand und aus tierischem Gewebe isoliert, wobei das Material der extrazellulären Matrix extrahierbares, biologisch aktives FGF-2 enthält; das Verpacken und Sterilisieren des Materials der extrazellulären Matrix, um Produktchargen bereitzustellen, die alle mehrere verpackte Produkte des Materials der extrazellulären Matrix enthalten; das Entnehmen von Produktproben aus den Produktchargen; und das Testen der Produktproben, um festzustellen, ob sie extra-hierbares, biologisch aktives FGF-2 in einer Konzentration oberhalb eines zuvor bestimmten Werts, z.B. über etwa 50 Nanogramm pro Gramm Trockengewicht, enthalten.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein medizinisches Produkt bereit, das dazu angepasst ist, Wunden zu behandeln, wobei das Produkt Material der extrazellulären Matrix, das aus tierischem Gewebe isoliert wurde, umfasst, wobei das Material biologisch aktive Bestandteile umfasst, die zur Behandlung von Wunden nützlich sind, umfassend, aber nicht begrenzt auf, FGF-2. Das FGF-2 liegt in dem Material der extrazellulären Matrix in einer Konzentration von mindestens etwa 50 Nanogramm pro Gramm Trockengewicht vor.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein medizinisches Produkt, das ein trockenes, Collagen enthaltendes Pulver umfasst, das Material der extrazellulären Matrix enthält, wobei das trockene, Collagen enthaltende Pulver in der Lage ist, nach der Rehydratisierung mit einem wässrigen Medium ein Gel zu bilden und FGF-2 in einer Konzentration von mindestens etwa 50 ng/g Trockengewicht enthält.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein medizinisches Produkt, das eine flüssige Zusammensetzung umfasst, die gelöstes oder in einer Suspension vorliegendes Collagen enthaltendes Material der extrazellulären Matrix umfasst, wobei die flüssige Zusammensetzung FGF-2 in einer Konzentration von etwa 0,1 ng/ml bis etwa 100 ng/ml enthält.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Desinfektion einer wässrigen Zusammensetzung aus Hydrolysat der extrazellulären Matrix bereit. Die wässrige Zusammensetzung aus Hydrolysat der extrazellulären Matrix wird für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die ausreichen, die wässrige Zusammensetzung aus Hydrolysat der extrazellulären Matrix zu desinfizieren, mit einem oxidierenden Desinfektionsmittel in Kontakt gebracht.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer desinfizierten Zusammensetzung aus Hydrolysat der extrazellulären Matrix. Dieses Verfahren umfasst die Bildung eines wässrigen Hydrolysats der extrazellulären Matrix. Ein erster Dialyseschritt wird durchgeführt und umfasst das Dialysieren des wässrigen Hydrolysats der extrazellulären Matrix gegen ein wässriges Medium, das ein oxidierendes Desinfektionsmittel enthält, so dass das Hydrolysat der extrazellulären Matrix mit dem oxidierenden Desinfektionsmittel in Kontakt gebracht und desinfiziert wird, und dabei ein desinfiziertes Hydrolysat der extrazellulären Matrix entsteht. Ein zweiter Dialyseschritt umfasst das Dialysieren des desinfizierten Hydrolysats der extrazellulären Matrix unter Bedingungen, bei denen das oxidierende Desinfektionsmittel entfernt wird.
Bei einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Produkt aus Hydrolysat der extrazellulären Matrix bereit, das extrazelluläre Matrixbestandteile aufweist, die durch Kontakt eines wässrigen Mediums, das das Hydrolysat der extrazellulären Matrix enthält, mit einem oxidierenden Desinfektionsmittel desinfiziert werden. Das Produkt aus Hydrolysat der extrazellulären Matrix kann in verschiedenen Formen vorliegen, darunter ein trockenes, pulvriges Material, eine nicht-gelierte wässrige Zusammensetzung, ein Gel oder ein Schwamm.
In noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung stellt Transplantationsmaterial der extrazellulären Matrix bereit, das ein Hydrolysat der extrazellulären Matrix in Verbindung mit Partikeln der extrazellulären Matrix enthält. In einer bevorzugten Form umfasst das Transplantationsmaterial ein wässriges Medium, das dieses Hydrolysat der extrazellulären Matrix in gelöster Form und mit den Partikeln der extrazellulären Matrix darin suspendiert aufweist, wobei wünschenswert ist, dass das Medium die Fähigkeit zur Gelbildung zeigt.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt Transplantationsmaterial der extrazellulären Matrix bereit, das eine sterile, injizierbare, flüssige Zusammensetzung der extrazellulären Matrix umfasst, welche ein wässriges Medium umfasst, das ein Hydrolysat der extrazellulären Matrix enthält. Das Hydrolysat der extrazellulären Matrix liegt in der Zusammensetzung in einer Konzentration von mindestens etwa 20 mg/ml vor, zum Beispiel im Bereich von etwa 20 mg/ml bis etwa 200 mg/ml.
Zusätzliche Aspekte wie auch Merkmale und Vorteile der Erfindung werden dem Durchschnittsfachmann aus den hier vorliegenden Beschreibungen deutlich werden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Zum Zweck eines verbesserten Verständnisses der Prinzipien der Erfindung wird nun auf gewisse Ausführungsformen Bezug genommen und spezifische Ausdrücke werden verwendet, diese zu beschreiben. Nichtsdestotrotz versteht es sich, dass dadurch keine Einschränkung des Umfangs der Erfindung beabsichtigt ist, derartige in Erwägung gezogene Abänderungen und weitere Modifizierungen der dargelegten Vorrichtung, und auch solche weiteren Anwendungen der Prinzipien der Erfindung, wie sie hier beschrieben sind, und wie sie gewöhnlich einem Fachmann auf dem Gebiet, das die Erfindung betrifft, in den Sinn kommen.
Wie oben offenbart, stellt die vorliegende Erfindung in einem Aspekt verpackte, sterile medizinische Produkte bereit, die Materialien zur Gewebetransplantation umfassen, die einen oder mehrere Wachstumsfaktoren enthalten, sowie Verfahren, selbige herzustellen. Das verwendete Gewebeverpflanzungsmaterial ist erwünschterweise ein natürlich gewonnenes Material, wie etwa ein Material der extrazellulären Matrix (ECM). Bevorzugt werden natürlich gewonnene, Collagen enthaltende ECMs, die aus geeigneten tierischen oder menschlichen Gewebequellen isoliert wurden. Geeignete Materialien der extrazellulären Matrix umfassen zum Beispiel Materialien der Submucosa (umfassend zum Beispiel Dünndarm-Submucosa, Magen-Submucosa, Blasen-Submucosa oder Gebärmutter-Submucosa, jede dieser aus jugendlichen oder erwachsenen Tieren isoliert), Membran der Nierenkapsel, Amnion, Dura mater, Herzbeutel, Serosa, Bauchfell oder der Basalmembran, darunter Materialien der Leber-Basalmembran oder der Basalmembran des Epithels. Diese Materialien können in Form intakter, natürlicher Lagen isoliert und verwendet werden, oder als rekonstituierte Collagenschichten, die Collagen, welches aus diesen Materialien gewonnen wurde, und/oder andere collagen-haltige Materialien können verwendet werden. Für zusätzliche Informationen bezüglich der Submucosa-Materialien, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, und deren Isolierung und Behandlung, kann auf die US-Patente Nr. 4 902 508, 5 554 389, 5 993 844, 6 206 931 und 6 099 567 verwiesen werden. Membran der Nierenkapsel kann auch aus warmblütigen Säugetieren erhalten werden, wie genauer in der internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/US02/20499, eingereicht am 28. Juni 2002, als WO03002165 am 9. Januar 2003 veröffentlicht, beschrieben.
Bevorzugte Materialien auf Basis der ECM enthalten verbliebene, biologisch aktive Proteine oder andere ECM-Bestandteile, die aus der Gewebequelle der Materialien stammen. Zum Beispiel können sie Fibroblasten-Wachstumsfaktor-2 (basic FGF), transformierenden Wachstumsfaktor-beta (TGF-beta) und vaskulären endothelischen Wachstumsfaktor (VEGF) enthalten. Es ist auch zu erwarten, dass Materialien auf ECM-Basis der Erfindung zusätzliche biologisch aktive Bestandteile enthalten können, zum Beispiel eines oder mehrere aus Glycosaminoglycanen, Glycoproteinen, Proteoglycanen und/oder Wachstumsfaktoren.
Es wurde entdeckt, dass die verwendeten Sterilisationsbedingungen bei der Herstellung von Gewebeverpflanzungsmaterialien die Konzentration von einem oder mehreren solcher biologisch aktiver Bestandteile oder Wachstumsfaktoren, darunter zum Beispiel FGF-2, signifikant beeinträchtigen können. Entsprechend können Sterilisationsprotokolle in Einklang mit der Erfindung ausgewählt und kontrolliert werden, um die Konzentration an Wachstumsfaktoren einzustellen, zum Beispiel dadurch, dass entweder die Konzentration an Wachstumsfaktor absichtlich auf eine vorher bestimmte Konzentration oder darunter gesenkt wird, oder dass mindestens ein gegebener Prozentsatz oder Konzentration an einem oder mehreren Wachstumsfaktoren, insbesondere FGF-2, in dem Material erhalten bleibt. Bei gewissen Ausführungsformen der Erfindung wird das ECM- oder anderes Transplantationsmaterial zu fertigen, verpackten, sterilen Produkten verarbeitet, die FGF-2 in einer Konzentration von mindestens 50 ng/g Trockengewicht, oder sogar mindestens etwa 60, mindestens etwa 70, mindestens etwa 80, oder mindestens etwa 100 ng/g Trockengewicht enthalten. In anderen Ausführungsformen der Erfindung weist das ECM-Material eine erste Konzentration eines biologisch aktiven Bestandteils, wie etwa FGF-2 oder eines anderen Wachstumsfaktors, nach der Isolierung aus dem tierischen oder menschlichen Spendergewebe und dem Spülen mit einem Spülmittel wie etwa Wasser auf. Das ECM-Material wird daraufhin unter Das ECM-Material wird daraufhin unter kontrollierten Bedingungen, die eine Sterilisierung umfassen, verarbeitet, um verpackte, sterile medizinische Produkte bereitzustellen, die mindestens etwa 10 % dieser ersten Konzentration an FGF-2 oder eines anderen biologisch aktiven Bestandteils, oder sogar mindestens 15 %, 20 %, 30 % oder sogar 50 % oder mehr dieser ersten Konzentration enthalten.
Beispielsweise wurde festgestellt, dass Sterilisationsprotokolle, die eine Sterilisation mit Ethylenoxid (EO), eine Bestrahlung mit einem Elektronenstrahl (E-Beam) und ein Gasplasmasterilisation (z.B. Sterrad^®) umfassen, die Konzentration an extrahierbarem, biologisch aktivem FGF-2 signifikant verringern können. Gleichzeitig haben diese Sterilisationstechniken einen signifikant geringeren oder im Wesent-lichen keinen Einfluss auf die Konzentration an extrahierbarem, biologisch aktivem TGF-beta. Das so durch die Sterilisationstechnik bewirkte Einstellen der Wachstumsfaktoren kann vorteilhaft verwendet werden, um die Konzentrationen an gegebenen Wachstumsfaktoren, deren Verhältnisse, etc. zu beeinflussen und zu optimieren, wodurch ein Transplantationsmaterial erzeugt werden kann, das besser für eine bestimmte medizinische Indikation geeignet ist, bei der der/die beibehaltene(n) Wachstumsfaktor oder Wachstumsfaktoren für die Indikation günstig sind, und/oder wo der/die eliminierte(n) Wachstumsfaktor oder Wachstumsfaktoren für die medizinische Indikation schädlich sind.
Zum Beispiel ist bekannt, dass FGF-2 die Angiogenese, Neuritenwachstum, die Sekretion von Plasminogenaktivator (PA) und die Produktion von Matrixmetalloproteinase 1 (MMP-1) stimuliert. Dementsprechend kann die Konzentration an FGF-2 erhalten und im Transplantationsmaterial optimiert werden zur Verwendung bei der Wundheilung (Angiogenese), der Behandlung von Nervengewebe (Neuritenauswuchs), sowohl peripheres Nervengewebe als auch zentrales Nervengewebe umfassend, der Modulation der Adhäsionsbildung (durch PA-Stimulierung) und der Unterstützung des Umsatzes und Abbaus von Collagen (durch Stimulierung der MMP-1-Herstellung). Somit kann die FGF-2-Konzentration im Material durch Auswahl und Optimierung des Sterilisationsprotokolls so hoch wie möglich gehalten werden. Zum Beispiel wurde festgestellt, dass nicht-sterile isolierte Submucosa-Schichten (und insbesondere aus dem Dünndarm isolierte) relativ hohe Konzentrationen an extrahierbarem, biologisch aktivem FGF-2 enthalten. Zum Beispiel kann Submucosa-Gewebe, das aus dem Dünndarm isoliert und minimal behandelt wurde, z.B. nur durch Spülen, derart gewonnen werden, dass es mehr als etwa 100 Nanogramm FGF-2 pro Gramm Trockengewicht enthält und möglicherweise sogar höhere Konzentrationen wie etwa über etwa 200 oder etwa 400 Nanogramm pro Gramm. Bei der Herstellung kann es güns tig sein, so viel wie möglich dieses FGF-2 in dem Material zu erhalten. Somit können Zwischenschritte zwischen der Isolierung des ursprünglichen Submucosa-Materials und dem fertigen, verpackten medizinischen Artikel ausgewählt und derart reguliert werden, dass so viel wie möglich aktives FGF-2 in dem Material erhalten bleibt.
Als ein Beispiel kann ein isoliertes Material aus Dünndarm-Submucosa, das wie in US-Patent 6 206 931 beschrieben mit Peressigsäure desinfiziert wurde, zwischen etwa 70 und etwa 200 Nanogramm pro Gramm (Trockengewicht) FGF-2 enthalten. Es wurde festgestellt, dass Sterilisationsbehandlungen unter Verwendung von Ethylenoxid, E-Beam und Gasplasma-Sterilisationstechniken die Konzentration an FGF-2 in dem desinfizierten Material signifikant reduzieren. Unter diesen hatte E-Beam-Sterilisation den geringsten Einfluss auf die FGF-2-Konzentration, E-Beam-sterilisierte Submucosa weist FGF-2-Konzentrationen im Bereich von etwa 75 Nanogramm pro Gramm Trockengewicht bis etwa 150 Nanogramm pro Gramm Trockengewicht auf, und allgemein bleiben mehr als etwa 50 % der FGF-2-Konzentration des desinfizierten Submucosa-Materials erhalten. Gasplasma-sterilisiertes Material wies eine FGF-2-Konzentration im Bereich von etwa 60 Nanogramm pro Gramm Trockengewicht bis etwa 110 Nanogramm pro Gramm Trockengewicht auf, und mindestens 40 % der FGF-2-Konzentration des desinfizierten Materials der Submucosa bleiben erhalten. In Ausführungsformen der Erfindung werden daher Materialien, die unter Verwendung von E-Beam- oder Gasplasmatechniken sterilisiert wurden, in derart gestalteten Produkten und Verfahren zur Behandlung von Patienten verwendet, bei denen relativ hohe FGF-2-Konzentrationen erwünscht sind, zum Beispiel zur Wundheilung, zur Behandlung von Geweben des Nervensystems, zur Modulation der Adhäsion oder zur Unterstützung des Collagenumsatzes und -abbaus.
Auf der anderen Seite hatte eine Ethylenoxid-Sterilisation sowohl bei Bedingungen niedriger Temperatur als auch hoher Temperatur eine signifikantere Wirkung bei der Reduktion der FGF-2-Konzentration, wobei die Produkte üblicherweise zwischen etwa 10 und etwa 40 Nanogramm FGF-2 pro Gramm Trockengewicht aufweisen, und weniger als etwa 40 % der FGF-2-Konzentration des desinfizierten Materials der Submucosa (z.B. etwa 10 % bis etwa 40 %) erhalten bleibt. In dieser Arbeit mit Ethylenoxid zeigten Hochtemperaturbedingungen eine Tendenz, eine geringfügig stärkere Wirkung bei der Reduktion der FGF-2-Konzentration zu haben als Bedingungen niedriger Temperatur. Dementsprechend kann bei Ethylenoxid- und möglicherweise anderen Sterilisationstechniken die Temperatur erhöht oder verringert werden, um einen jeweils höheren oder geringeren Grad der Reduktion an FGF-2 und/oder anderer Wachstumsfaktoren oder ECM-Proteinen, die nicht Collagen sind, zu erhal ten. In ähnlicher Weise kann die Gesamtdosis an Sterilisationssubstanz oder -energie erhöht oder verringert werden, um einen jeweils höheren oder geringeren Grad der Reduktion von FGF-2 und/oder anderer Wachstumsfaktoren oder ECM-Proteinen, die nicht Collagen sind, zu erhalten. Erhöhte Dosen an Sterilisationsmittel können zum Beispiel erzielt werden durch eine längere, einmalige Exposition des Transplantationsmaterials mit dem Sterilisationsmittel oder durch mehrfache, einzelne Expositionen des Transplantationsmaterials mit dem Sterilisationsmittel.
Gemäß der Erfindung kann zusätzlich zur Wahl des Sterilisationsprotokolls eine Anzahl weiterer Herstellungsmethoden durchgeführt werden, um ein verpacktes, sterilisiertes Transplantationsprodukt mit einer regulierten Konzentration eines oder mehrerer Wachstumsfaktoren, darunter zum Beispiel FGF-2, zu erhalten. Im Fall dass erwünscht ist, eine so hoch als mögliche Konzentration an FGF-2 zu erhalten, kann in einer ersten Maßnahme die tierische, Collagen enthaltende ECM erzeugt und aufbewahrt werden vom Zeitpunkt der Gewinnung bis zum Zeitpunkt, an dem das FGF-2 oder ein anderer Wachstumsfaktor vor einem weiteren signifikanten Abbau geschützt ist. Für diese Zwecke kann das gewonnene Gewebe, aus dem das ECM-Material isoliert werden soll, bald oder unmittelbar nach der Gewinnung in eine Stabilisierungslösung gegeben werden, die den Abbau, umfassend zum Beispiel durch osmotischen Abbau, Sauerstoffmangel, autolytischen und/oder proteolytischen Abbau, verhindert. Diese Lösung kann auch vorn einer bakteriellen Kontamination schützen. Um diese Wirkungen zu erzielen, kann das stabilisierende Material eine gepufferte Lösung aus Antioxidationsmitteln, Antibiotika, Proteaseinhibitoren, onkotisch aktiven Substanzen oder anderen stabilisierenden Substanzen sein.
Beispielsweise können Enzyme (z.B. Superoxiddismutase und Katalase) verwendet werden, Superoxidanionen und Wasserstoffperoxid zu neutralisieren, oder Verbindungen, die direkt mit anderen freien Radikalen reagieren und diese neu-tralisieren können. Antioxidationsmittel können zugegeben werden und umfassen tertiär-Butylhydrochinon (BHT), alpha-Tocopherol, Mannit, Hydroxyharnstoff, Glutathion, Ascorbat, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und die Aminosäuren Histidin, Prolin und Cystein. Neben Antioxidantien kann die stabilisierende Lösung Substanzen enthalten, die eine hypoxische Veränderung normaler biochemischer Stoffwechselwege verhindern, zum Beispiel Allopurinol zur Inhibierung der Xanthindehydrogenase, Lipoxygenase-Inhibitoren, Calciumkanal-blockierende Mittel, Calcium bindende Substanzen, Eisen bindende Substanzen, Stoffwechselzwischenstufen und Substrate der Adenosintriphosphat (ATP)-Erzeugung.
Die stabilisierende Lösung kann auch ein oder mehrere Antibiotika, Antimykotika, Protease-Inhibitoren, Proteoglycane und einen geeigneten Puffer enthalten. Antibiotika können verwendet werden, die Vermehrung von Bakterien und eine nachfolgende Gewebeinfektion zu inhibieren oder zu verhindern. Antibiotika können ausgewählt werden aus der Gruppe aus Penicillin, Streptomycin, Gentamicin, Kanamycin, Neomycin, Bacitracin und Vancomycin. Zusätzlich können Antimykotika eingesetzt werden, darunter Amphotericin-B, Nystatin und Polymyxin.
Protease-Inhibitoren können Bestandteil der stabilisierenden Lösung sein, um endogene proteolytische Enzyme zu inhibieren, welche, wenn freigesetzt, einen irreversiblen Abbau der ECM ebenso wie die Freisetzung chemischer Lockstoffe bewirken können. Diese chemischen Lockstoffe bewirken den Zustrom polymorphonuklearer Leukozyten, Makrophagen und anderer natürlicher Killerzellen, die eine unspezifische Immunreaktion auslösen, die die ECM weiter schädigen können. Die Protease-Inhibitoren können ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus N-Ethylmaleinimid (NEM), Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Ethylenglykol-bis-(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure (EGTA), Leupeptin, Ammoniumchlorid, erhöhtem pH-Wert und Apoprotinin.
Glycosaminoglycane können der stabilisierenden Lösung zugesetzt werden, um ein kolloidales osmotisches Gleichgewicht zwischen der Lösung und dem Gewebe zu herzustellen, wodurch die Diffusion endogener Glycosaminoglycane aus dem Gewebe in die Lösung verhindert wird. Endogene Glycosaminoglycane haben eine Vielzahl von Aufgaben in der Physiologie des auf Collagen basierenden Bindegewebes. Sie können an der Regulierung von Zellwachstum und -differenzierung beteiligt sein (z.B. Heparinsulfat und Zellen des glatten Muskels), bzw. spielen sie eine wichtige Rolle bei der Vermeidung einer pathologischen Verkalkung (wie bei Herzklappen). Glycosaminoglycane sind auch an der komplexen Regulierung von Collagen- und Elastinsynthese und -umbau beteiligt, der grundlegend für die Funktion des Bindegewebes ist. Die Glycosaminoglycane sind ausgewählt aus der Gruppe aus Chondroitinsulfat, Heparinsulfat und Dermatansulfat und Hyaluronan. Osmotische Substanzen, die nicht Glycosaminoglycane sind und auch in der Lösung enthalten sein können, sind Polymere wie etwa Dextran und Polyvinylpyrrolidon (PVP) und Aminosäuren wie etwa Glycin und Prolin.
Die stabilisierende Lösung kann auch einen geeigneten Puffer enthalten. Die Art des Puffers ist für mehrere Aspekte der Verarbeitungsmethode wichtig. Kristalloide Puffer geringer osmotischer Kraft wurden mit Schäden in Verbindung gebracht, die während der Bevorratung von Vena saphena und bei der Lagerung der Augenhornhaut auftreten. Ein optimaler pH-Wert und Pufferkapazität gegenüber Produkten aus Schäden aufgrund von Sauerstoffmangel (unten beschrieben) ist entscheidend. In diesem Zusammenhang haben organische und Hydrogencarbonatpuffer entscheidende Vorteile. (Bei der Lagerung von roten Blutkörperchen wurde gezeigt, dass Acetat-Citrat-Puffer mit Glycin und Glucose eine verlängerte Haltbarkeit bewirken und die zelluläre Integrität aufrecht erhalten.) Die Erfinder bevorzugen die Verwendung eines organischen Puffers, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 2-(N-Morpholin)-ethansulfonsäure (MES), 3-(N-Morpholin)-propansulfonsäure (MOPS) und N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES). Alternativ kann ein Niedrigsalz- oder physiologischer Puffer, darunter Phosphat-, Hydrogencarbonat- und Acetat-Citrat-Puffer bei gewissen Anwendungen besser geeignet sein.
In einem anderen Aspekt richten sich die Bestandteile der stabilisierenden Lösung nach einem oder mehreren der Ereignisse, die während der Gewinnung der Gewebe auftreten, wie etwa Krämpfe, Sauerstoffmangel, Reperfusion bei Sauerstoffmangel, Freisetzung lysosomaler Enzyme, Aggregation von Blutplättchen, Sterilität und Pufferbedingungen. Die unfreiwillige Kontraktion der glatten Muskulatur kann eine Folge mechanischer Streckung oder Dehnung sein, wie auch der chemischen Wirkung gewisser Kontraktionsfaktoren, die aus Endothelzellen stammen und üblicherweise unter hypoxischen (Sauerstoffmangel-) Bedingungen freigesetzt werden. Diese unfreiwillige Kontraktion kann zu Schäden in der benachbarten ECM führen. Aus diesem Grund kann die stabilisierende Lösung ein oder mehrere Relaxantien des glatten Muskels, ausgewählt aus der Gruppe aus Calcitonin-Gen-ähnlichem Peptid (CGRP), Papaverin, Natriumnitroprussid (NaNP), H7 (ein Proteinkinase C-Inhibitor), Calciumkanalblocker, Calciumchelatoren, Isoproterenol, Phentolamin, Pinacidil, Isobutylmethylxanthin (IBMX), Nifedepin und Flurazin. Das gewonnene Gewebe kann unmittelbar in diese stabilisierende Lösung gegeben werden und wird während des Transports und der gesamten Lagerung vor der weiteren Verarbeitung bei 4 °C gehalten.
Das Gewebeverpflanzungsmaterial der Erfindung kann in jeder geeigneten Form vorliegen, umfassend eine im Wesentlichen zweidimensionale Schichtform (wahlweise eine netzartige Schicht) oder in dreidimensionaler Form wie etwa als Schlauch, Klappensegel oder ähnliches. Das Gewebeverpflanzungsmaterial kann eine einzelne Schicht isolierten ECM-Materials enthalten, oder ein Multilaminat-Konstrukt einer Größe sein, die den sie bildenden Schichten entspricht (z.B. aus direkt übereinander liegenden Schichten) oder die größer als die sie bildenden Schichten ist (z.B. aus teilweise überlappenden Schichten), siehe z.B. US-Patente Nr. 5 885 619 und 5 711 969.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein medizinisches Produkt bereit, das ein trockenes Collagen enthaltendes Pulver umfasst, das zum Beispiel zur Behandlung von Wunden oder einer Stimulierung des Gewebewachstums an dem gewünschten Ort des Implantats auf andere Weise dienen kann und das ein ECM-Material umfasst. Es ist wünschenswert, dass das Pulver nach der Rehydratisierung mit einem wässrigen Medium ein Gel bilden kann und FGF-2 in einer Konzentration von mindestens etwa 50 Nanogramm pro Gramm Trockengewicht enthält. Beispielsweise kann das Pulver Teilchen aus ECM-Material enthalten, die durch Trocknen eines Materials in flüssiger Form hergestellt wurde, welches wie in US-Patenten Nr. 5 516 533 und 5 275 826 beschrieben hergestellt wurde. Das erhaltene Pulver kann allein oder in Verbindung mit anderen Pulvermaterialien zur Unterstützung der Gelbildung des Gesamtpulvers nach der Rehydratisierung mit einem wässrigen Medium, wie etwa einer gepufferten Salzlösung, verwendet werden. In diesem Zusammenhang kann die Pulverzusammensetzung zusätzlich zu den Teilchen aus ECM-Material auch pulverförmiges, gereinigtes Collagen, Gelatin oder ähnliches umfassen, um bei der Gelbildung des Produkts nach der Rehydratisierung zu helfen.
In einer Ausführungsform wird die Herstellung des Pulvers derart durchgeführt, dass es FGF-2 einer Konzentration von mindestens etwa 50 Nanogramm pro Gramm Trockengewicht, vorzugsweise mindestens etwa 60, 70, 80 oder 100 Nanogramm pro Gramm Trockengewicht enthält. Die erhaltenen flüssigen Zusammensetzungen, die gelöstes oder suspendiertes, Collagen enthaltendes ECM-Material enthalten, wird wünschenswerterweise derart hergestellt, dass es FGF-2 in einer Konzentration von etwa 0,1 Nanogramm pro Milliliter oder mehr enthält, z.B. üblicherweise im Bereich von etwa 0,1 Nanogramm pro ml bis etwa 100 Nanogramm pro ml. Wünschenswerterweise ist diese flüssige Zusammensetzung fähig, ein Gel zu bilden, zum Beispiel nach Inkubation für eine gewisse Zeit nach der Rehydratisierung, welche dadurch beschleunigt werden kann, dass die flüssige Zusammensetzung auf einen relativ neutralen pH-Wert und/oder von Zimmertemperatur auf Körpertemperatur gebracht wird. In anderen Ausführungsformen kann das medizinische Produkt in flüssigem Zustand FGF-2 einer Konzentration von etwa 1 bis etwa 15 Nanogramm pro ml enthalten, oder FGF-2 in einer Konzentration von etwa 10 bis etwa 30 Nanogramm pro ml enthalten.
Wie oben dargelegt, stellen gewisse Ausführungsformen der Erfindung verpackte, sterile medizinische Produkte dar. Bekannte Verpackungstechniken und -materialien können bei der Herstellung solcher Produkte verwendet werden, wobei das Verpacken derart gewählt wird, dass es zur angewendeten Methode des letzten Sterilisationsschritts passt, z.B. Ethylenoxidgas-, Elektronenstrahl- oder Gasplasma-Techniken. Außerdem kann das Verpacken Vermerke, die die Verwendung des eingeschlossenen Transplantationsmaterials für eine bestimmte medizinische Indikation, z.B. Wundpflege, enthalten oder in anderer Form aufweisen, und/oder Vermerke zu einem oder mehreren Wachstumsfaktoren (z.B. FGF-2) enthalten oder in anderer Form aufweisen, zu deren Konzentrationseinstellung die Produktherstellung reguliert wurde, z.B. um eine Minimalkonzentration eines solchen Wachstumsfaktors, eine Maximalkonzentration eines solchen Wachstumsfaktors oder einen Bereich eines solchen Wachstumsfaktors anzuzeigen, der in dem eingeschlossenen Gewebeverpflanzungsprodukt enthalten ist.
In anderen Ausführungsformen stellt die vorliegende Erfindung ECM-Gelzusammensetzungen und Verfahren und Materialien zu deren Herstellung bereit, die wahlweise auch in Verbindung mit den oben beschriebenen Techniken zur Einstelung der Konzentration einer oder mehrerer biologisch aktiver Substanzen in dem Produkt verwendet werden können, darunter zum Beispiel Wachstumsfaktoren wie etwa FGF-2. Die Gelzusammensetzungen der Erfindung können aus einem isolierten ECM-Material erzeugt werden, zum Beispiel aus einem der oben angeführten. Das ECM-Material wird verwendet, um ein gelöstes Gemisch zu erzeugen, das Bestandteile des Materials enthält. Dies kann durch Verdau des ECM-Materials in einem sauren oder basischen Medium und/oder durch Kontakt mit einem geeigneten Enzym oder einer Kombination von Enzymen erreicht werden.
Üblicherweise wird das ECM-Material zu Teilchenform zerkleinert, um den Verdauschritt zu unterstützen. Dies kann durch Zerreißen, Zerschneiden, Mahlen oder Scheren des isolierten ECM-Materials erfolgen. Beispielsweise kann das Scheren in einem flüssigen Medium erfolgen und das Mahlen kann mit Material im gefrorenen Zustand durchgeführt werden. Zum Beispiel kann das Material mit flüssigem Stickstoff in Kontakt gebracht werden, um es einzufrieren, damit es leichter zu Pulverform zermahlen werden kann. Solche Techniken können das Einfrieren und Pulverisieren von Submucosa unter flüssigem Stickstoff in einem Industriemischer umfassen.
Jedes geeignete Enzym kann für einen enzymatischen Verdauschritt verwendet werden. Solche Enzyme umfassen zum Beispiel Serinproteasen, Aspartylproteasen und Matrixmetalloproteasen. Die Konzentration des Enzyms kann auf Grundlage des jeweils verwendeten Enzyms, der Menge an zu verdauender Submucosa, der Dauer des Verdaus, der Temperatur der Reaktion und der erwünschten Eigenschaften des Endprodukts angepasst werden. In einer Ausführungsform werden etwa 0,1 % bis etwa 0,2 % Enzym (zum Beispiel Pepsin) verwendet und der Verdau erfolgt unter gekühlten Bedingungen für eine Dauer, die ausreicht, das ECM-Material in Wesentlichen zu verdauen. Der Verdau kann bei jeder geeigneten Temperatur durchgeführt werden, wobei Temperaturen im Bereich von 4-37 °C bevorzugt werden. In ähnlicher Weise kann jede geeignete Verdaudauer verwendet werden, diese fallen typischerweise in den Bereich von etwa 2-180 Stunden. Das Verhältnis der Konzentration an ECM-Material (hydratisiert) zu Gesamtenzym liegt üblicherweise im Bereich bei etwa 25 bis etwa 125 und noch häufiger liegt das Verhältnis bei etwa 50, und der Verdau wird bei 4 °C für 24-72 Stunden durchgeführt. Wenn ein Enzym zur Unterstützung des Verdaus verwendet wird, ist der Verdau bei einem pH-Wert durchzuführen, bei dem das Enzym aktiv ist und es ist von Vorteil, dass er bei einem pH-Wert durchgeführt, bei dem das Enzym seine optimale Aktivität aufweist. Beispielsweise zeigt Pepsin optimale Aktivität bei pH-Werten im Bereich von etwa 2-4 auf.
Die Enzyme oder andere zerstörende Substanzen, die zur Solubilisierung des ECM-Materials verwendet werden, können vor oder während des Gelbildungsprozesses entfernt oder inaktiviert werden, so dass sie die Gelbildung oder die anschließende Stabilität des Gels nicht beeinträchtigen. Auch wird jedes zerstörende Mittel, insbesondere Enzyme, das während der Lagerung des Gewebes noch vorliegt und aktiv ist, möglicherweise die Zusammensetzung verändern und möglicherweise die Gelbildungseigenschaften der Lösung. Enzyme, wie etwa Pepsin, können inaktiviert werden durch Protease-Inhibitoren, eine Verschiebung zu einem neutralen pH-Wert, eine Absenkung der Temperatur unter 0 °C, Hitze-Inaktivierung oder durch die Entfernung des Enzyms mittels eines Trennverfahrens. Eine Kombination dieser Methoden kann verwendet werden, um den Verdau des ECM-Materials zu einem zuvor bestimmten Endpunkt zu stoppen, zum Beispiel kann das ECM-Material sofort eingefroren und später fraktioniert werden, um den Verdau zu beschränken.
Das ECM-Material wird für eine ausreichende Zeit enzymatisch verdaut, um ein Hydrolysat der ECM-Bestandteile zu erzeugen. Die ECM kann mit einem Enzym oder mit einer Mischung von Enzymen behandelt werden, um die Struktur gebenden Bestandteile des Materials zu hydrolysieren und ein Hydrolysat zu erzeugen, das mehrere hydrolysierte Bestandteile mit reduziertem Molekulargewicht aufweist. Die Dauer des Verdaus variiert in Abhängigkeit von der Anwendung, und der Verdau kann verlängert werden, um das ECM-Material vollständig zu solubilisieren. Bei einigen Verfahrensarten wird das ECM-Material ausreichend behandelt, um das Material partiell zu solubilisieren, wodurch eine Zusammensetzung des Verdaus erzeugt wird, die hydrolysierte ECM-Bestandteile und nicht-hydrolysierte ECM-Bestandteile enthält. Die Zusammensetzung des Verdaus kann dann wahlweise weiter verarbeitet werden, um zumindest einige der nicht-hydrolysierten Bestandteile zu entfernen. Zum Beispiel können die nicht-hydrolysierten Bestandteile von den hydrolysierten Anteilen mittels Zentrifugation, Filtration oder anderen auf dem Gebiet bekannten Trennverfahren getrennt werden.
Bevorzugte Gelzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung werden aus enzymatisch verdautem ECM-Material von Säugern hergestellt, das unter sauren Bedingungen fraktioniert wurde, zum Beispiel bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 2 bis weniger als 7, speziell zur Entfernung von Bestandteilen mit geringem Molekulargewicht. Üblicherweise wird das ECM-Hydrolysat mittels Dialyse gegen eine Lösung oder ein anderes wässriges Medium fraktioniert, das einen sauren pH-Wert aufweist, zum Beispiel einen pH-Wert im Bereich von etwa 2 bis etwa 5, vorzugsweise größer als 3 und weniger als 7. Zusätzlich zur Fraktionierung des Hydrolysats unter sauren Bedingungen wird das ECM-Hydrolysat üblicherweise unter Bedingungen geringer Ionenstärke bei minimalen Konzentrationen an Salz fraktioniert, wie sie in der Regel in Standardpuffern, wie etwa PBS (d.h. NaCl, KCl, Na₂HPO₄ oder KH₂PO₄) zu finden sind, die die Dialysemembran passieren und in das Hydrolysat gelangen können. Solche Fraktionierungsbedingungen bewirken eine Verringerung der Ionenstärke des ECM-Hydrolysats und ergeben dadurch verbesserte Gelbildungseigenschaften.
Die Lösung des Hydrolysats, die durch enzymatischen Verdau des ECM-Materials erzeugt wurde, weist ein charakteristisches Verhältnis von Protein zu Kohlenhydrat auf. Das Verhältnis von Protein zu Kohlenhydrat im Hydrolysat wird durch das in dem Verdauschritt verwendete Enzym und die Dauer des Verdaus bestimmt. Das Verhältnis kann ähnlich oder auch substantiell verschieden von dem Protein-zu-Kohlenhydrat-Verhältnis des unverdauten ECM-Gewebes sein. Zum Beispiel erzeugt der Verdau von ECM-Material von Säugern mit einer Protease wie etwa Pepsin, gefolgt von einer Dialyse, ein fraktioniertes ECM-Hydrolysat, das ein niedrigeres Protein-zu-Kohlenhydrat-Verhältnis aufweist als das ursprüngliche ECM-Material.
In Übereinstimmung mit gewissen Ausführungsformen der Erfindung werden die ihre Form bewahrende Gelarten der ECM aus ECM-Material erzeugt, das enzymatisch verdaut und unter sauren Bedingungen fraktioniert wurde, um ein ECM-Hydrolysat zu bilden, das ein Protein-zu-Kohlenhydrat-Verhältnis aufweist, das verschieden ist von dem des ursprünglichen ECM-Materials. Eine solche Fraktionierung kann vollständig oder zumindest teilweise durch Dialyse erfolgen. Die Molekulargewichts-Ausschlussgrenze der ECM-Bestandteile, die in dem Gelmaterial enthalten sind, wird in Abhängigkeit von den erwünschten Eigenschaften des Gels gewählt. Üblicherweise liegt die Molekulargewichts-Ausschlussgrenze der Dialysemembran (das Molekulargewicht, oberhalb dessen die Membran den Durchtritt der Moleküle verhindert) im Bereich von etwa 2000 bis etwa 10000 Dalton, und weiter bevorzugt zwischen etwa 3500 und etwa 5000 Dalton.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird das ECM-Hydrolysat, abgesehen von der möglichen Entfernung von unverdauten ECM-Bestandteilen nach dem Verdauschritt und allen kontrollierten Fraktionierungen, um Bestandteile mit geringem Molekulargewicht zu entfernen, wie oben diskutiert, derart verarbeitet, dass jede weitere substantielle physikalische Auftrennung der ECM-Bestandteile vermieden wird. Wenn zum Beispiel ein konzentrierteres Material aus ECM-Hydrolysat erwünscht ist, kann dies durch Entfernen von Wasser aus dem System (z.B. durch Verdampfen oder Lyophilisieren) erzielt werden, anstelle der Verwendung herkömmlicher "Aussalzungs-"/Zentrifugationsmethoden, welche eine signifikante Selektivität beim Ausfällen und Isolieren von Collagen zeigen würden, wobei gewisse Mengen anderer erwünschter ECM-Bestandteile zurückbleiben. Somit bleiben in gewissen Ausführungsformen der Erfindung solubilisierte ECM-Bestandteile des ECM-Hydrolysats im Wesentlichen unfraktioniert, oder bleiben oberhalb einer zuvor bestimmten Molekulargewichts-Ausschlussgrenze im Wesentlichen unfraktioniert, wie sie bei einer Dialysemembran auftritt, zum Beispiel oberhalb eines gegebenen Werts im Bereich von etwa 2000 bis 10000 Dalton, vorzugsweise etwa 3500 bis etwa 5000 Dalton.
ECM-Material von Säugern kann in gefrorenem Zustand (z.B. bei etwa –20 bis etwa –80 °C) entweder in seiner festen, zerkleinerten oder enzymatisch verdauten Form vor der Bildung der Gelzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung gelagert werden, oder das Material kann nach der Hydrolyse und Fraktionierung gelagert werden. Das ECM-Material kann in Lösungsmitteln gelagert werden, die das Collagen in seiner nativen Form und Löslichkeit erhalten. Zum Beispiel ist ein geeignetes Lösungsmittel zur Lagerung 0,01 M Essigsäure, es können jedoch auch andere Säuren verwendet werden wie etwa 0,01 N HCl. In Übereinstimmung mit einer Ausführungsform wird das fraktionierte ECM-Hydrolysat getrocknet (zum Beispiel durch Lyophilisierung) und in einem dehydrierten/lyophilisierten Zustand gelagert. Die getrocknete Form kann rehydratisiert werden und gelieren, um ein Gel der vorliegenden Erfindung zu bilden.
In Übereinstimmung mit einer Ausführungsform weist das fraktionierte ECM-Hydrolysat die Fähigkeit auf, nach Einstellung des pH-Werts von dem verhältnismäßig saureren wässrigen Medium, in dem es vorliegt, auf etwa 5 bis etwa 9, vorzugsweise etwa 6,6 bis etwa 8,0, und üblicherweise etwa 7,2 bis etwa 7,8, zu gelieren, wodurch die Fibrillogenese und die Ausbildung des Matrixgels induziert werden. In einer Ausführungsform wird der pH-Wert des fraktionierten Hydrolysats durch die Zugabe eines Puffers eingestellt, der keine toxischen Rückstände zurücklässt und eine physiologische Ionenkonzentration sowie die Fähigkeit, physiologische pH-Werte aufrecht zu erhalten, aufweist. Beispiele geeigneter Puffer umfassen PBS, HEPES und DMEM. In einer Ausführungsform wird der pH-Wert des fraktionierten ECM-Hydrolysats durch die Zugabe einer gepufferten NaOH-Lösung auf 6,6 bis 8,0, vorzugsweise 7,2 bis 7,8, erhöht. Jede geeignete Konzentration der NaOH-Lösung kann für diese Zwecke verwendet werden, umfassend zum Beispiel etwa 0,05 M bis etwa 0,5 M NaOH. In Übereinstimmung mit einer Ausführungsform wird das ECM-Hydrolysat mit einem Puffer vermischt und ausreichend 0,25 N NaOH wird zu der Mischung gegeben, um den erwünschten pH-Wert zu erhalten. Falls gewünscht, kann die erhaltene Mischung zu diesem Zeitpunkt in geeignete Mengen oder in vorgesehene Kulturgefäße aliquotiert werden und bei 37 °C für 0,5 bis 1,5 Stunden inkubiert werden, damit sich ein ECM-Gel bildet.
Es wird angenommen, dass die Ionenstärke des ECM-Hydrolysats wichtig ist, die Collagenfasern in einem Zustand zu halten, der die Fibrillogenese und die Ausbildung eines Matrixgels nach dem Neutralisieren des Hydrolysats gestattet. Demgemäß kann die Salzkonzentration des Materials aus ECM-Hydrolysat, falls erforderlich, vor dem Neutralisieren des Hydrolysats verringert werden. Das neutralisierte Hydrolysat kann bei jeder geeigneten Temperatur, z.B. im Bereich von etwa 4 °C bis etwa 40 °C, zum Gelieren gebracht werden. Die Temperatur beeinflusst üblicherweise die Gelbidungsdauer, die von 5 bis 120 Minuten bei höheren Gelbildungstemperaturen und 1 bis 8 Stunden bei niedrigeren Gelbildungstemperaturen reichen kann. Üblicherweise erfolgt die Gelbildung des Hydrolysats bei erhöhten Temperaturen, um den Gelbildungsprozess zu beschleunigen, zum Beispiel bei 37 °C. Diesbezüglich sind bevorzugte neutralisierte ECM-Hydrolysate in der Lage, in weniger als etwa neunzig Minuten bei 37 °C zu gelieren, zum Beispiel in ungefähr dreißig bis neunzig Minuten bei 37 °C. Alternativ kann das Gel bei 4 °C gelagert werden, und unter diesen Bedingungen wird die Ausbildung des Gels verzögert, z.B. um etwa 3-8 Stunden.
Weitere Komponenten können zu der Hydrolysatzusammensetzung vor, während oder nach der Gelbildung zugegeben werden. Zum Beispiel können Proteine, Kohlenhydrate, Wachstumsfaktoren, Therapeutika, biologisch aktive Substanzen, Nukleinsäuren, Zellen oder Pharmazeutika zugegeben werden. In gewissen Ausführungsformen werden solche Materialien vor der Bildung des Gels zugegeben. Dies kann zum Beispiel durch Bildung einer trockenen Mischung eines pulverisierten ECM-Hydrolysats mit der/den zusätzlichen Komponente(n) und anschließender Rekonstituierung und Gelierung der Mischung, oder durch Aufnahme der zusätzlichen Komponente(n) in eine wässrige, nicht-gelierte Zusammensetzung des ECM-Hydrolysats vor, während (z.B. mit) oder nach der Zugabe des Neutralisierungsmittels erfolgen. In anderen Ausführungsformen wird/werden die zusätzliche(n) Komponente(n) zu dem gebildeten ECM-Gel gegeben, z.B. durch Infusion oder Beimischung der Komponente(n) in das Gel und/oder durch Auftragen dieser in einer Schicht auf das Gel.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein teilchenförmiges ECM-Material zu der Hydrolysatzusammensetzung zugegeben, welches dann in das gebildete Gel eingebaut wird. Solche teilchenförmigen ECM-Materialien können durch Zerschneiden, Zerreißen, Mahlen oder anderweitiges Zerkleinern eines ECM-Startmaterials erzeugt werden. Zum Beispiel kann ein teilchenförmiges ECM-Material, das eine durchschnittliche Partikelgröße von etwa 50 μm bis etwa 500 μm aufweist, in das Hydrolysat aufgenommen werden, vorzugsweise etwa 100 μm bis etwa 400 μm. Die teilchenförmige ECM kann in jeder geeigneten Menge bezüglich des Hydrolysats zugegeben werden, wobei bevorzugte Gewichtsverhältnisse von teilchenförmigem ECM zu ECM-Hydrolysat (auf den Trockengewichten basierend) etwa 0,1:1 bis etwa 200:1 sind, vorzugsweise in dem Bereich von 1:1 bis etwa 100:1. Der Einschluss solcher ECM-Partikel in das letztendliche Gel kann dazu dienen, zusätzliches Material bereitzustellen, das bewirken kann, dass das Gel eine biologische Aktivität erhält (z.B. dass es selbst FGF-2 und/oder andere Wachstumsfaktoren oder biologisch aktive Substanzen, wie hierin beschrieben, enthält) und/oder als ein gerüstbildendes Material für das Einwachsen von Gewebe dient.
In gewissen Ausführungsformen enthält das beim Gewebeaufbau, z.B. zu funktionellen oder kosmetischen Zwecken, verwendete Material aus ECM-Hydrolysat teilchenförmiges ECM-Material. In diesen Ausführungsformen kann das enthaltende teilchenförmige ECM-Material eine Größe aufweisen und in einer Menge vorliegen, die die Injizierbarkeit der Hydrolysatzusammensetzung aufrecht erhält, zum Beispiel bei Injektion durch eine Nadel, die eine Größe im Bereich von 18 bis 31 Gauge (Innendurchmesser von 0,047 Zoll bis etwa 0,004 Zoll) aufweist. Auf diese Weise werden nicht-invasive Verfahren zum Gewebeaufbau bereitgestellt, die in bevorzugten Fällen die Injektion eines nicht-gelierten ECM-Hydrolysats, das suspendierte ECM-Partikel enthält, bei relativ niedrigerer Temperatur (z.B. Zimmertemperatur) umfasst, wobei die Bildung einer gelierten Zusammensetzung vorangetrieben wird, wenn die Injektion in einen Patienten erfolgt und dieses dadurch auf physiologische Temperatur (etwa 37 °C) gebracht wird.
Es wurde in einem anderen Aspekt der Erfindung entdeckt, dass Verarbeitungsmethoden, die das Inkontaktbringen des ECM-Materials mit einer desinfizierenden Oxidationsmittel umfassen, nicht nur die Konzentration an biologisch aktiven Substanzen, sondern auch die Gelbildungsqualität der Collagenmoleküle signifikant beeinträchtigen kann. Insbesondere stellte sich heraus, dass der Kontakt eines ECM-Materials mit einem Oxidationsmittel wie etwa Peressigsäure vor dem Verdau, der das ECM-Hydrolysat erzeugt, die Fähigkeit des ECM-Hydrolysats, ein Gel zu bilden, zerstören oder schmälern kann. Andererseits stellt der Kontakt eines wässrigen Mediums, das ECM-Hydrolysatbestandteile enthält, mit einem oxidierenden Desinfektionsmittels wie etwa einer Peroxyverbindung eine verbesserte Möglichkeit, ein desinfiziertes ECM-Hydrolysat zu erhalten, das die Fähigkeit nützliche Gele zu bilden, aufweist. In Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der Erfindung wird ein wässriges Medium, das ECM-Hydrolysatbestandteile enthält, durch Gabe eines Peroxy-Desinfektionsmittels zu dem wässrigen Medium desinfiziert. Dies kann vorteilhaft erreicht werden, indem eine Dialyse zur Zufuhr des Peroxy-Desinfektionsmittels zum und/oder zur Entfernung des Peroxy-Desinfektionsmittels aus dem wässrigen Medium, das das Hydrolysat enthält, verwendet wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das wässrige Medium, das das ECM-Hydrolysat enthält, gegen ein wässriges Medium, das das Peroxy-Desinfektionsmittel enthält, dialysiert, um das Desinfektionsmittel in Kontakt mit dem ECM-Hydrolysat zu bringen, und dann gegen ein geeignetes wässriges Medium (z.B. ein saures wässriges Medium) dialysiert, um das Peroxy-Desinfektionsmittel zumindest im Wesentlichen aus dem ECM-Hydrolysat zu entfernen. Während dieses Dialyseschritts dringt die Peroxyverbindung durch die Dialysemembran und in das ECM-Hydrolysat, und ist für eine ausreichende Dauer in Kontakt mit den ECM-Bestandteilen, um die ECM-Bestandteile des Hydrolysats zu desinfizieren. Hierbei liegen die üblichen Kontaktreiten im Bereich von etwa 0,5 Stunden bis etwa 8 Stunden und für gewöhnlich bei etwa 1 Stunde bis etwa 4 Stunden. Die Kontaktdauer reicht aus, den Verdau im Wesentlichen zu desinfizieren, was die Entfernung von Endotoxinen und die Inaktivierung von anwesendem Virusmaterial umfasst. Die Entfernung des Peroxy-Desinfektionsmittels durch Dialyse kann in ähnlicher Weise für jede geeignete Dauer erfolgen, zum Beispiel für eine Dauer von etwa 4 bis etwa 180 Stunden, üblicherweise von etwa 24 bis etwa 96 Stunden. Im Allgemeinen wird der Desinfektionsschritt wünschenswerterweise eine desinfizierte ECM-Hydrolysatzusammensetzung erzeugen, welche ausreichend niedrige Konzentrationen an Endotoxinen, viraler Ladung und anderen verunreinigenden Materialien aufweist, damit es für eine medizinische Verwendung geeignet ist. Endotoxinkonzentrationen unter etwa 2 Endotoxineinheiten (EUs) pro Gramm (Trockengewicht) werden bevorzugt, besser noch unter etwa 1 EU pro Gramm, wie auch Viruskonzentrationen unter 100 Plaque-bildende Einheiten pro Gramm (Trockengewicht), besser noch unter 1 Plaque-bildende Einheit pro Gramm.
In einer Ausführungsform ist die wässrige Zusammensetzung aus ECM-Hydrolysat eine im Wesentlichen homogene Lösung während des Dialyseschritts zur Zufuhr des oxidierenden Desinfektionsmittels zu der Zusammensetzung aus Hydrolysat und/oder während des Dialyseschritts zur Entfernung des oxidierenden Desinfektionsmittels aus der Zusammensetzung aus Hydrolysat. Alternativ kann die wässrige Zusammensetzung aus Hydrolysat suspendierte Partikel des ECM-Hydrolysats enthalten, wahlweise in Verbindung mit einigen gelösten ECM-Hydrolysatbestandteilen, während eines oder beider Schritte der Zufuhr oder der Entfernung des oxidierenden Desinfektionsmittels. Dialyseverfahren, bei denen zumindest einige der ECM-Hydrolysatbestandteile während der Schritte der Desinfektionsmittel-Zufuhr und/oder -Entfernung gelöst sind, werden bevorzugt, und solche, bei denen im Wesentlichen alle ECM-Hydrolysatbestandteile gelöst sind, werden noch mehr bevorzugt.
Der Desinfektionsschritt kann bei jeder geeigneten Temperatur durchgeführt werden und wird üblicherweise zwischen 0 °C und 37 °C durchgeführt, häufiger noch zwischen etwa 4 °C und etwa 15 °C. Während dieses Schritts liegt die Konzentration der Feststoffe des ECM-Hydrolysats im wässrigen Medium üblicherweise im Bereich von etwa 2 mg/ml bis etwa 200 mg/ml und sie kann im Verlauf der Dialyse aufgrund der Wanderung von Wasser durch die Membran etwas variieren. In gewissen Ausführungsformen der Erfindung wird ein relativ gering konzentrierter Verdau verwendet, der zu Beginn eine Konzentration von etwa 5 mg/ml bis etwa 15 mg/ml an ECM-Feststoffen aufweist. In anderen Ausführungsformen der Erfindung wird ein relativ konzentriertes ECM-Hydrolysat zu Beginn des Desinfektionsschritts verwendet, zum Beispiel mit einer Konzentration von mindestens etwa 20 mg/ml und bis zu etwa 200 mg/ml, vorzugsweise mindestens etwa 100 mg/ml und bis zu etwa 200 mg/ml. Es wurde festgestellt, dass die Verwendung von konzentrierten ECM-Hydrolysaten während dieser Desinfektionsprozedur eine letztendliche Gelzusammensetzung mit höherer Festigkeit des Gels ergibt, als sie bei Verwendung einer ähnlichen Prozedur mit einem ECM-Hydrolysat geringerer Konzentration erhalten wird. Dementsprechend werden Verfahren, die die Entfernung gewisser Mengen an Wasser aus dem ECM-Hydrolysat umfassen, das aus dem Verdau vor dem Desinfektionsverfahrensschritts stammt, bevorzugt. Zum Beispiel können solche Verfahren die Entfernung von nur einem Teil des Wassers (zum Beispiel etwa 10 Gew.-% bis etwa 98 Gew.-% des vorhandenen Wassers) vor dem Dialyse-/Desinfektionsschritt umfassen, oder sie können die Umwandlung des Verdaus in einen Feststoff durch Trocknen des Materials mittels Lyophilisierung oder auf andere Weise, die Rekonstitution des getrockneten Materials in einem wässrigen Medium und die anschließende Behandlung dieses wässrigen Mediums in einem Dialyse-/Desinfektionsschritt umfassen.
Gewisse Einflüsse der Bedingungen des Dialyseverfahrens auf die Gele des ECM-Hydrolysats sind aktuell in den bisherigen Arbeiten dargelegt, die nachfolgend insbesondere in den Beispielen 2-5 beschrieben sind. Im Allgemeinen wurden einige verschiedene Submucosa-Hydrolysate erzeugt, wobei die während des Pepsin-Verdaus anwesende Säure variiert und die vorhandene Konzentration an ECM-Hydrolysat während der Dialyse gegen eine Peressigsäure (PAA)-Lösung variiert wird. Im Einzelnen wurde ein erstes Gel (A1) unter Verwendung von 0,5 M Essigsäure in der Pepsin-Verdaulösung und etwa 5-15 mg/ml ECM-Hydrolysat während der PAA-Desinfektion erzeugt; ein zweites Gel (A2) wurde erzeugt unter Verwendung von 0,5 M Essigsäure in der Pepsin-Verdaulösung und etwa 130-150 mg/ml ECM-Hydrolysat während der PAA-Desinfektion; ein drittes Gel (H1) wurde erzeugt unter Verwendung von 0,01 M Salzsäure in der Pepsin-Verdaulösung und etwa 5-15 mg/ml ECM-Hydrolysat während der PAA-Desinfektion; und ein viertes Gel (H2) wurde erzeugt unter Verwendung von 0,01 M Salzsäure in der Pepsin-Verdaulösung und etwa 130-150 mg/ml ECM-Hydrolysat während der PAA-Desinfektion. Die erzeugten ECM-Hydrolysate wurden in einer Lösung von 0,1 M HCl in einer Konzentration von etwa 30 mg/ml vorgelegt, und dann würde PBS zugegeben und der pH-Wert der Mischung wurde mit 0,25 M NaOH auf 7,5-7,6 eingestellt, damit die Zusammensetzung geliert. Die mechanischen Eigenschaften der verschiedenen Gele wurden dann beurteilt. Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle 1 zusammengefasst. Tabelle 1
Wie ersichtlich, waren die Gele, die unter Verwendung hoher Konzentrationen an Submucosa-Hydrolysat während des Desinfektionsschritts hergestellt wurden (A2, H2), im Verhältnis fester als jene, die unter Verwendung geringer Konzentrationen an Submucosa-Hydrolysat erzeugt wurden(A1, H1). Außerdem zeigten die A2- und H2-Gele in Zellwachstums-Assays ein im Vergleich zu den A1- und H1-Gelen verbessertes Vermögen, die Proliferation primärer humaner Hautfibroblasten und primärer humaner glatter Muskelzellen der Blase zu unterstützen. Eine weitere Beobachtung war, dass die Gele, die aus Materialien aus ECM-Hydrolysat erzeugt wurden, die aus einem HCl/Pepsin-Verdau stammen, im Verhältnis fester waren als die entsprechenden Gele, die aus einem Essigsäure/Pepsin-Verdau stammen. Somit können die während der Herstellung und Verarbeitung der Materialien aus ECM-Hydrolysat verwendeten Bedingungen ausgewählt und reguliert werden, um die physikalischen und biologischen Eigenschaften der letztendlichen ECM-Gelzusammensetzungen einzustellen.
In einer Vorgehensweise kann die Desinfektion des wässrigen Mediums, das das ECM-Hydrolysat enthält, die direkte Zugabe der Peroxyverbindung oder anderer oxidierender Desinfektionsmittel zu dem ECM-Hydrolysat umfassen, zum Beispiel dadurch, dass es in dem wässrigen Medium, das zur Rekonstitution eines getrockneten ECM-Hydrolysats verwendet wird, vorliegt oder dass es direkt zu einer wässrigen Zusammensetzung aus ECM-Hydrolysat zugegeben wird. Das Desinfektionsmittel kann dann mit dem ECM-Hydrolysat für eine ausreichende Dauer unter geeigneten Bedingungen (z.B. wie oben beschrieben) in Kontakt kommen, damit das Hydrolysat desinfiziert wird, und dann aus dem Kontakt mit dem Hydrolysat entfernt werden. In einer Ausführungsform kann das oxidierende Desinfektionsmittel dann unter Verwendung eines Dialyseverfahrens, wie oben beschrieben, entfernt werden. In anderen Ausführungsformen kann das Desinfektionsmittel teilweise oder vollständig entfernt werden unter Verwendung anderer Techniken wie etwa chromatographische oder Ionenaustauschtechniken, oder es kann teilweise oder vollständig zu physiologisch unbedenklichen Komponenten abgebaut werden. Zum Beispiel kann bei Ver wendung eines oxidierenden Desinfektionsmittels, das Wasserstoffperoxid enthält (z.B. Wasserstoffperoxid allein oder als Persäure wie etwa Peressigsäure), das Wasserstoffperoxid sich zu Wasser und Sauerstoff zersetzen oder hierzu gebracht werden, zum Beispiel in einigen Ausführungsformen, die die Verwendung von Mitteln, die den Abbau begünstigen wie etwa thermische Energie oder ionische Strahlung, z.B. ultraviolette Strahlung, umfassen.
Bei einer anderen Vorgehensweise kann das oxidierende Desinfektionsmittel durch Dialyse in das wässrige Medium, das das ECM-Hydrolysat enthält, gebracht und ausreichend verarbeitet werden, um das Hydrolysat zu desinfizieren (z.B. wie oben beschrieben), und dann unter Verwendung anderer Techniken wie etwa chromatographische oder Ionenaustauschtechniken ganz oder zum Teil entfernt werden, oder ganz oder zum Teil sich abbauen gelassen oder hierzu veranlasst werden, wie unmittelbar zuvor diskutiert.
Persauerstoffverbindungen, die in dem Desinfektionsschritt verwendet werden können, umfassen zum Beispiel Wasserstoffperoxid, organische Peroxyverbindungen und vorzugsweise Persäuren. Solche Desinfektionsmittel werden in einem flüssigen Medium, vorzugsweise einer Lösung, verwendet, das einen pH-Wert von etwa 1,5 bis etwa 10,0, vorzugsweise etwa 2,0 bis etwa 6,0, aufweist. Bezüglich der Persäureverbindungen, die verwendet werden können, umfassen diese Peressigsäure, Perpropionsäure, oder Perbenzoesäure. Peressigsäure ist das am meisten bevorzugte Desinfektionsmittel für die Zwecke der vorliegenden Erfindung.
Wenn verwendet, liegt Peressigsäure wünschenswerterweise in etwa 2 Vol.-% bis etwa 50 Vol.-%iger Alkohollösung, vorzugsweise Ethanol, verdünnt vor. Die Konzentration der Peressigsäure kann zum Beispiel im Bereich von etwa 0,05 Vol.-% bis etwa 1,0 Vol.-% liegen. Am meisten wird bevorzugt, dass die Konzentration der Peressigsäure zwischen etwa 0,01 Vol.-% und etwa 0,03 Vol.-% liegt. Wenn Wasserstoffperoxid verwendet wird, kann die Konzentration im Bereich von etwa 0,05 Vol.-% bis etwa 30 Vol.-% liegen. Es wird bevorzugt, dass die Wasserstoffperoxidkonzentration etwa 1 Vol.-% bis etwa 10 Vol.-% beträgt, am meisten bevorzugt etwa 2 Vol.-% bis etwa 5 Vol.-%. Die Lösung kann oder kann nicht auf einen pH-Wert von etwa 5 bis etwa 9 gepuffert sein, wobei die bevorzugten pH-Werte zwischen etwa 6 und etwa 7,5 liegen. Diese Konzentrationen an Wasserstoffperoxid können in Wasser oder in einer wässrigen Lösung mit etwa 2 Vol.-% bis etwa 50 Vol.-% Alkohol, am besten Ethanol, verdünnt sein. Weitere Informationen bezüglich bevorzugter Peroxy- Desinfektionsmittel können in den Diskussionen von US-Patent Nr. 6 206 931 gefunden werden, auf die hier Bezug genommen und deren Inhalt hier einbezogen wird.
ECM-Gelmaterialien der vorliegenden Erfindung können so hergestellt werden, dass sie erwünschte Handhabungs- und Verwendungseigenschaften haben. Zum Beispiel können ECM-Hydrolysate in flüssiger Form in einem wässrigen Medium hergestellt werden, das daraufhin ein Gel bilden kann oder hierzu veranlasst wird. Solche hergestellten wässrigen Medien können jede geeignete Konzentration an ECM-Hydrolysat für die nachfolgende Gelbildung darin aufweisen. Üblicherweise liegt das ECM-Hydrolysat in dem wässrigen Medium, dass das Gel bilden wird, in einer Konzentration von etwa 2 mg/ml bis etwa 200 mg/ml, noch häufiger von etwa 20 mg/ml bis etwa 200 mg/ml, vor und in einigen bevorzugten Ausführungsformen von etwa 30 mg/ml bis etwa 120 mg/ml. In bevorzugten Formen sind die wässrigen Zusammensetzungen aus ECM-Hydrolysat, die das Gel bilden n, in injizierbarer Form, zum Beispiel durch Injektion durch eine Nadel, die eine Größe im Bereich von 18 bis 31 Gauge (Innendurchmesser von etwa 0,047 Zoll bis etwa 0,004 Zoll) aufweisen.
Des Weiteren können die Gelzusammensetzungen derart erzeugt werden, dass zusätzlich zur Neutralisierung auch die Erwärmung auf physiologische Temperaturen (wie etwa 37 °C) die Gelbildungszeit des Materials substantiell verringern wird. Ebenso kann das Material, wenn es einmal geliert ist, wahlweise getrocknet werden, so dass es ein festes Schwammmaterial bildet. Es wird überlegt, jede dieser Arten der ECM-Gelzusammensetzungen zu kommerziellen Produkten zu machen, z. B. (i) verpackte, sterile Pulver, die in einem sauren Medium rekonstituiert und neutralisiert und möglicherweise erhitzt werden können, damit sie ein Gel bilden, (ii) verpackte, sterile, wässrige Zusammensetzungen, die gelösrte ECM-Hydrolysatbestandteile unter nicht-gelbildenden (z.B. sauren) Bedingungen enthalten; (iii) verpackte, sterile Gelzusammensetzungen, und (iv) verpackte, sterile, getrocknete Schwammzusammensetzungen; oder andere geeignete Formen. In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein medizinisches Kit bereitgestellt, das eine verpackte, sterile, wässrige Zusammensetzung enthält, die gelöste ECM-Hydrolysatbestandteile unter nicht-gelbildenden (z.B. sauren) Bedingungen umfasst, und eine separat verpackte, sterile, wässrige Neutralisierungszusammensetzung (die beispielsweise einen Puffer und/oder eine Base enthält), die darauf angepasst wurde, das Medium des ECM-Hydrolysats für die Bildung eines Gels zu neutralisieren. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung umfasst ein medizinisches Kit ein verpacktes, steriles, getrocknetes (z.B. lyophilisiertes) Pulver aus ECM-Hydrolysat, ein separat verpacktes, steriles, wässriges, saures Rekonstituierungsmedium und ein separat verpacktes, steriles, wässriges Neutralisierungsmedium. Bei der Verwendung kann das Pulver aus ECM-Hydrolysat mit dem Rekonstituierungsmedium rekonstituiert werden und so eine nicht-gelierende Mischung bilden, die dann mit dem Neutralisierungsmedium zur Bildung des Gels neutralisiert werden kann.
Medizinisches Kits, wie oben beschrieben, können auch eine Vorrichtung, wie etwa eine Spritze, für die Verabreichung des neutralisierten Mediums des ECM-Hydrolysats an einen Patienten umfassen. Hierbei kann das sterile, wässrige Medium des ECM-Hydrolyats oder das sterile Pulver aus ECM-Hydrolysat solcher Kits in einer Spritze oder einem anderen Verabreichungsinstrument verpackt bereitgestellt werden. Außerdem kann das sterile Rekonstituierungs- und/oder Neutralisierungsmedium in einer Spritze verpackt sein und Mittel bereitgestellt werden für die Zufuhr der Inhalte der Spritze in eine andere Spritze, welche das wässrige Mediums des ECM-Hydrolysats oder das Pulver aus ECM-Hydrolysat enthält, zum Zweck der Vermischung. In noch weiteren Formen der Erfindung kann eine selbst-gelierende wässrige Zusammensetzung des ECM-Hydrolysats in einem Behälter (z.B. einer Spritze) verpackt und sicher vor einer Gelbildung während der Lagerung sein. Zum Beispiel kann die Gelbildung solcher Produkte von physikalischen Bedingungen, wie etwa Temperatur oder dem Kontakt mit der lokalen Umgebung, die an einem Ort der Implantation in einem Patienten vorliegt, abhängig sein. Beispielsweise kann eine wässrige Zusammensetzung des ECM-Hydrolysats, die bei Temperaturen unterhalb der physiologischen Temperatur (etwa 37 °C) nicht oder nur sehr langsam geliert, in einer Spritze oder einem anderen Behälter verpackt und möglicherweise gekühlt (umfassend zum Beispiel auch gefroren) sein vor der Verwendung zur Injektion oder einer anderen Implantation in einen Patienten.
In speziellen Anwendungen werden Zusammensetzungen des ECM-Hydrolysats, die Hydrogele bei oder nahe des physiologischen pH-Werts und Temperatur bilden, bevorzugt für Aufbauanwendungen in vivo, zum Beispiel bei der Behandlung stressbedingter Urin-Inkontinenz, gastroesophagischer Rückflusserkrankung, kosmetischer Chirurgie, vesico-urethrealem Rückfluss, analer Inkontinenz und der Reparatur der Stimmbänder. Diese Formen des Submucosa- oder eines anderen ECM-Gels besitzen, zusätzlich zu Collagen, komplexe Zucker der extrazellulären Matrix und variierende Mengen an Wachstumsfaktoren in anderen biologisch aktiven Substanzen, die dazu dienen können, Gewebe am Ort der Implantation wieder aufzubauen. Diese Zusammensetzungen des ECM-Hydrolysats können zum Beispiel für solche Anwendungen in einen Patienten injiziert werden.
ECM-Gele und trockene Schwämme aus Materialien der Erfindung, die durch Trocknen von ECM-Gelen hergestellt wurden, können in Anwendungen wie zum Beispiel der Wundheilungen und/oder des Wiederaufbaus von Gewebe oder in der Zellkultur verwendet werden.
Im Allgemeinen wurde festgestellt, dass die durchgeführten Handlungen bei der Erzeugung von Zusammensetzungen des ECM-Hydrolysats und deren Formen, die ein Gel bilden können oder geliert sind, auch einen signifikanten Einfluss auf Wachstumsfaktoren und andere ECM-Bestandteile haben können, die zur biologischen Aktivität beitragen können. Techniken zur Veränderung von und zum Testen der Konzentrationen an FGF-2 oder anderen Wachstumsfaktoren oder biologisch aktiven Substanzen können auch in Verbindung mit der Herstellung der beschriebenen Zusammensetzungen des ECM-Hydrolysats der Erfindung verwendet werden. Beispielsweise wurde entdeckt, dass die Dialyse-/Desinfektionsverfahren der Erfindung, die Peroxyverbindungen benutzen, üblicherweise eine Verringerung der Konzentration an FGF-2 in dem Material des ECM-Hydrolysats bewirken. In bisher erfolgten Arbeiten, wie sie in den Beispielen 2-5 beschrieben sind, hat eine solche Vorgehensweise unter Verwendung von Peressigsäure als Desinfektionsmittel eine Verringerung der Konzentration an FGF-2 im Bereich von etwa 30 % bis etwa 50 % bewirkt. Um höhere Konzentrationen an FGF-2 zu erhalten, kann dementsprechend die Verarbeitung für das Minimum an Zeit erfolgen, das notwendig ist, um die erwünschte Desinfektion des Materials zu bewirken; andererseits kann die Desinfektionsprozedur für einen längeren Zeitraum weitergeführt werden, um das FGF-2 auf niedrigere Konzentrationen zu verringern. In einer Ausführungsform der Erfindung erfolgen das Desinfektionsverfahren und nachfolgende Schritte in ausreichender Form, um eine medizinisch sterile, wässrige Zusammensetzung des ECM-Hydrolysats zu erhalten, die unter Verwendung steriler Füllverfahren verpackt werden können. In anderen Ausführungsformen kann jede Schluss-Sterilisation, der das Material des ECM-Hydrolysats (z.B. als getrocknetes Pulver, nicht-geliertes, wässriges Medium, in gelierter oder in Schwammform) unterzogen wird, auch ausgewählt und reguliert werden, um so die Konzentration an FGF-2 oder anderer, biologisch aktiver Substanzen in dem Produkt zu optimieren. Verfahren zur Schluss-Sterilisation können zum Beispiel Ethylenoxid bei hoher oder niedriger Temperatur, Bestrahlung wie etwa E-Beam, Gasplasma (z.B. Sterrad) oder Wasserstoffperoxiddampf-Verfahren umfassen.
Bevorzugte, verpackte, sterilisierte Produkte aus ECM-Hydrolysat, die gemäß der Erfindung erzeugt wurden, weisen eine FGF-2-Konzentration (dieses FGF-2 stammt aus dem ECM-Hydrolysat) von etwa 100 ng/g bis etwa 5000 ng/g auf, basierend auf dem Trockengewicht des ECM-Hydrolysats. Vorzugsweise liegt dieser Wert bei etwa Trockengewicht des ECM-Hydrolysats. Vorzugsweise liegt dieser Wert bei etwa 300 ng/g bis etwa 4000 ng/g. Es versteht sich, dass solche FGF-2-Konzentrationen unter Verwendung von Standard-ELISA-Tests bestimmt werden können (z.B. unter Verwendung des Quantikine Human Basic Fibroblast Growth Factor ELISA-Kits, erhältlich von R&D Systems).
Um ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung und ihrer Merkmale und Vorteile zu erzielen, sind folgende spezifische Beispiele aufgeführt. Es versteht sich, dass diese Beispiele der Illustration dienen und die Erfindung nicht beschränken.
BEISPIEL 1
Material der Dünndarm-Submucosa wurde gewonnen und mit Peressigsäure desinfiziert, wie in US-Patent Nr. 6 206 931 beschrieben. Das Submucosa-Material wurde lyophilisiert, in einer medizinischen Verpackung, bestehend aus Polyester/Tyvek, verpackt und mittels verschiedener Verfahren sterilisiert, umfassend Ethylenoxid (EO), Gasplasma (Wasserstoffperoxiddampf) und E-Beam-Strahlung (20 kGy plus/minus 2 kGy). Das erhaltene Submucosa-Material wurde in flüssigem Stickstoff eingefroren und zu einem Pulver zermahlen. Das Material wurde dann mit einem Extraktionspuffer, der 2 M Harnstoff, 2,5 mg/ml Heparin und 50 mM Tris-Puffer enthält, bei einem pH-Wert von 7,5 und bei 4 °C unter konstantem Rühren für 24 Stunden extrahiert. Nach 24 Stunden wurde das Extraktionsmedium in Zentrifugenröhrchen überführt und die unlösliche Fraktion bei 12000 × g pelletiert. Der Überstand wurde in einen Dialyseschlauch (MW-Ausschlussgrenze 3500) überführt und ausgiebig gegen Wasser hoher Reinheit (18 Megaohm) dialysiert. Im Anschluss an die Dialyse wurde das Dialysat bei 12000 × g zentrifugiert, um sämtliche weiteren festen Substanzen zu entfernen, und das erhaltene lösliche Extrakt wurde lyophilisiert. Vor der Messung wurde das Extrakt auf 10 mg/Trockengewicht pro ml in dem vom Hersteller bereitgestellten Verdünnungsmittel (R&D Systems) rekonstituiert. Die Proben wurden zentrifugiert, um sämtliche unlöslichen Stoffe zu entfernen. Die erhaltenen Überstände wurden entnommen und auf ihren FGF-2-Gehalt unter Verwendung des Quantikine Human Basic Fibroblast Growth Factor Immunoassays (R&D Systems) getestet. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 2 zusammengefasst. TABELLE 2

* basierend auf dem Durchschnitt von 8 Experimenten.

Wie zu sehen ist, hatten E-Beam- und Gasplasma-Sterilisierung eine signifikant geringere Wirkung bei der Reduktion der Konzentration an extrahierbarem, biologisch aktivem FGF-2 in den Materialien. Andererseits hatte Ethylenoxid-Sterilisierung sowohl bei niedrigen als auch bei hohen Temperaturen eine signifikante Wirkung bei der Verringerung der Konzentration an extrahierbarem, biologisch aktivem FGF-2.
BEISPIEL 2
Rohe (isoliert/gewaschen, aber nicht desinfiziert) Dünndarm-Submucosa von Schweinen wurde gefroren, in Stücke geschnitten und mit flüssigem Stickstoff zu einem Pulver gefriergemahlen. 50 g des Submucosa-Pulvers wurde mit einem Liter einer Verdaulösung, die 1 g Pepsin und 0,5 M Essigsäure enthält, gemischt. Der Verdauprozess erfolgte für 48-72 Stunden unter konstantem Rühren bei 4 °C. Am Ende des Prozesses wurde der Verdau zentrifugiert, um unverdautes Material zu entfernen. Die Essigsäure wurde dann mittels Dialyse gegen 0,01 M HCl für ungefähr 96 Stunden bei 4 °C entfernt. Der erhaltene Verdau wurde in eine semipermeable Membran mit einer Molekulargewichts-Ausschlussgrenze von 3500 überführt (ohne Konzentration) und für zwei Stunden gegen 0,2 Vol.-% Peressigsäure in einer 5 Vol.-%igen wässrigen Ethanollösung bei 4 °C dialysiert. Dieser Schritt diente sowohl der Desinfektion des Submucosa-Verdaus als auch der Fraktionierung des Verdaus, um Bestandteile mit einem Molekulargewicht unter 3500 zu entfernen. Der PAA-behandelte Verdau wurde dann gegen 0,01 M HCl für 48 Stunden bei 4 °C dialysiert, um die Peressigsäure zu entfernen. Der sterilisierte Verdau wurde mittels Lyophilisierung aufkonzentriert, wobei sich ein Material bildete, das auf etwa 30 mg/ml Feststoffe in 0,01 M HCl rekonstituiert und mit Phosphat-gepufferter NaOH auf einen pH-Wert von etwa 7,5- 7,6 neutralisiert und auf physiologische Temperatur erwärmt wurde, damit sich ein Submucosa-Gel bildet.
BEISPIEL 3
Ein zweites, mit Essigsäure erzeugtes Submucosa-Gel wurde unter Verwendung eines ähnlichen Verfahrens, wie in obigem Beispiel 2 beschrieben, erzeugt, mit der Ausnahme, dass der Verdau vor der PAA-Behandlung aufkonzentriert wurde. Hierfür wurde der Verdau unmittelbar im Anschluss an die Entfernung der Essigsäure mittels Dialyse zur Trockne lyophilisiert. Eine konzentrierte Paste des Verdaus wurde durch Auflösen einer zuvor gewogenen Menge des lyophilisierten Produkts in einer bekannten Menge an 0,01 M HCl hergestellt, so dass eine Mischung mit einer Konzentration an ECM-Feststoffen von etwa 50 mg/ml entstand. Die konzentrierte Paste wurde dann gegen die PAA-Lösung für 2 Stunden dialysiert und dann gegen 0,01 M HCl zur Entfernung der PAA in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 beschrieben dialysiert. Der Verdau wurde auf etwa 30 mg/ml Feststoffe eingestellt und mit Phosphatgepufferter NaOH auf einen pH-Wert von etwa 7,5-7,6 neutralisiert und auf physiologische Temperatur erwärmt, um ein Submucosa-Gel zu bilden.
BEISPIEL 4
Ein mit HCl gefertigtes Submucosa-Gel wurde unter Verwendung eines ähnlichen Verfahrens wie in Beispiel 2 beschrieben erzeugt, mit der Ausnahme, dass 0,01 M HCl in der Pepsin-Verdaulösung anstelle der 0,5 M Essigsäure verwendet wurde, und der Schritt der Entfernung der Essigsäure weggelassen wurde, da keine vorhanden war. Der Verdau wurde zur Bildung eines Gels wie in Beispiel 2 beschrieben verwendet.
BEISPIEL 5
Ein anderes mit HCl gefertigtes Submucosa-Gel wurde unter Verwendung eines ähnlichen Verfahren wie in Beispiel 3 beschrieben erzeugt, mit der Ausnahme, dass 0,01 M HCl in der Pepsin-Verdaulösung anstelle der 0,5 M Essigsäure verwendet wurde, und der Schritt der Entfernung der Essigsäure weggelassen wurde, da keine vorhanden war. Der Verdau wurde zur Bildung eines Gels wie in Beispiel 3 beschrieben verwendet.
Während die Erfindung in den Zeichnungen und der vorhergehenden Beschreibung ausführlich dargelegt und beschrieben wurde, sind diese nur zur Illustration gedacht und nicht beschränkend auszulegen, wobei zu verstehen ist, dass nur die bevorzugte Ausführungsform dargestellt und beschrieben wurde, und dass alle Änderungen und Modifizierungen, die dem Geist der Erfindung entsprechen, geschützt werden sollen. Außerdem weisen alle in dieser Anmeldung zitierten Veröffentlichungen auf die Fähigkeiten, die ein Fachmann auf dem einschlägigen Gebiet besitzt, und deren Inhalt in seiner Gesamtheit hiermit einbezogen wird, wie wenn jede einzeln durch Bezugnahme einbezogen und vollständig dargelegt worden wäre.
Zusammenfassung
Verpflanzungsmaterialien, die bioaktive Substanzen enthalten, und Methoden zu deren Herstellung
Beschrieben sind verpackte, sterile medizinische Transplantationsprodukte, die regulierte Konzentrationen eines Wachstumsfaktors wie etwa Fibroblasten-Wachstumsfaktor-2 (FGF-2) enthalten. Ebenso sind Verfahren zur Herstellung medizinischer Transplantationsprodukte beschrieben, bei denen die Verarbeitung, die eine Sterilisierung umfasst, reguliert und kontrolliert wird, um medizinische Transplantationsprodukte zu erhalten, die abgestimmte, bekannte Konzentrationen eines Faktors der extrazellulären Matrix wie etwa eines Wachstumsfaktors, z.B. FGF-2, aufweisen. Bevorzugte Verpflanzungsmaterialien sind Materalien der extrazellulären Matrix, die aus menschlichen oder tierischen Spendern isoliert wurden, insbesondere Submucosa enthaltende Materialien der extrazellulären Matrix. Außerdem sind ECM-Zusammensetzungen beschrieben, die Gele sind oder die zur Herstellung dieser verwendbar sind, sowie zugehörige Verfahren zur Herstellung und Verwendung.

Claims

Ein medizinisches Produkt, das ein verpacktes, steriles, tierisches Material der extrazellulären Matrix umfasst, welches extrahierbaren, biologisch aktiven Fibroblasten-Wachstumsfaktor-2 (FGF-2) in einer Konzentration von mindestens etwa 50 ng/g Trockengewicht umfasst.
Das medizinische Produkt aus Anspruch 1, wobei das Material der extrazellulären Matrix Submucosa umfasst.
Das medizinische Produkt aus Anspruch 2, wobei die Submucosa Dünndarm-Submucosa ist.
Das medizinische Produkt aus Anspruch 2 oder 3, wobei die Submucosa vom Schwein stammt.
Das medizinische Produkt aus einem der Ansprüche 1-4, wobei das FGF-2 in einer Konzentration von mindestens etwa 60 ng/g Trockengewicht vorliegt.
Das medizinische Produkt aus einem der Ansprüche 1-4, wobei das FGF-2 in einer Konzentration von mindestens etwa 70 ng/g Trockengewicht vorliegt.
Das medizinische Produkt aus einem der Ansprüche 1-4, wobei das FGF-2 in einer Konzentration von mindestens etwa 80 ng/g Trockengewicht vorliegt.
Das medizinische Produkt aus einem der Ansprüche 1-4, wobei das FGF-2 in einer Konzentration von mindestens etwa 100 ng/g Trockengewicht vorliegt.
Das medizinische Produkt aus einem der Ansprüche 1-8, wobei das Material der extrazellulären Matrix durch Bestrahlung sterilisiert wurde.
Das medizinische Produkt aus Anspruch 9, wobei das Material durch E-Beam-Bestrahlung sterilisiert wurde.
Ein medizinisches Produkt, das ein verpacktes, steriles Material der extrazellulären Matrix, das aus tierischem Gewebe isoliert wurde, umfasst und das natürlich in diesem Gewebe vorkommende Bestandteile, die Collagen, Wachstumsfaktoren, Proteoglycane und Glycosaminoglycane umfassen, enthält und extrahierbaren, biologisch aktiven Fibroblasten-Wachstumsfaktor-2 (FGF-2) in einer Konzentration von mindestens etwa 50 ng/g Trockengewicht aufweist.
Das medizinische Produkt aus Anspruch 11, wobei das Material der extrazellulären Matrix Submucosa umfasst.
Das medizinische Produkt aus Anspruch 12, wobei die Submucosa Dünndarm-Submucosa ist.
Das medizinische Produkt aus Anspruch 12 oder 13, wobei die Submucosa vom Schwein stammt.
Das medizinische Produkt aus einem der Ansprüche 11-14, wobei das FGF-2 in einer Konzentration von mindestens etwa 60 ng/g Trockengewicht vorliegt.
Das medizinische Produkt aus einem der Ansprüche 11-14, wobei das FGF-2 in einer Konzentration von mindestens etwa 70 ng/g Trockengewicht vorliegt.
Das medizinische Produkt aus einem der Ansprüche 11-14, wobei das FGF-2 in einer Konzentration von mindestens etwa 80 ng/g Trockengewicht vorliegt.
Das medizinische Produkt aus einem der Ansprüche 11-14, wobei das FGF-2 in einer Konzentration von mindestens etwa 100 ng/g Trockengewicht vorliegt.
Das medizinische Produkt aus einem der Ansprüche 11-18, wobei das Material der extrazellulären Matrix durch Bestrahlung sterilisiert wurde.
Das medizinische Produkt aus Anspruch 19, wobei das Material durch E-Beam-Bestrahlung sterilisiert wurde.
Ein Verfahren zur Herstellung eines sterilen Materials der extrazellulären Matrix, umfassend: Isolierung eines Materials der extrazellulären Matrix aus tierischem Gewebe, wobei das isolierte Material der extrazellulären Matrix eine erste Konzentration an extrahierbarem FGF-2 enthält; Verarbeitung des isolierten Materials zu einem sterilisierten Material der extrazellulären Matrix unter Bedingungen, bei der mindestens 10 % dieser ersten Konzentration des extrahierbaren FGF erhalten bleiben.
Das Verfahren aus Anspruch 21, wobei das Material der extrazellulären Matrix Submucosa umfasst.
Das Verfahren aus Anspruch 22, wobei die Submucosa Dünndarm-Submucosa ist.
Das Verfahren aus Anspruch 22 oder 23, wobei die Submucosa vom Schwein stammt.
Das Verfahren aus einem der Ansprüche 21-24, wobei das FGF-2 in diesem sterilisierten Material in einer Konzentration von mindestens etwa 60 ng/g Trockengewicht vorliegt.
Das Verfahren aus einem der Ansprüche 21-24, wobei das FGF-2 in diesem sterilisierten Material in einer Konzentration von mindestens etwa 70 ng/g Trockengewicht vorliegt.
Das Verfahren aus einem der Ansprüche 21-24, wobei das FGF-2 in diesem sterilisierten Material in einer Konzentration von mindestens etwa 80 ng/g Trockengewicht vorliegt.
Das Verfahren aus einem der Ansprüche 21-24, wobei das FGF-2 in diesem sterilisierten Material in einer Konzentration von mindestens etwa 100 ng/g Trockengewicht vorliegt.
Das Verfahren aus einem der Ansprüche 21-28, wobei das Material der extrazellulären Matrix durch Bestrahlung sterilisiert wurde.
Das Verfahren aus Anspruch 29, wobei das Material durch E-Beam-Bestrahlung sterilisiert wurde.
Ein Verfahren zur Herstellung medizinischer Produkte, umfassend: Bereitstellen von Material der extrazellulären Matrix, das aus tierischem Gewebe isoliert wurde, wobei das Material der extrazellulären Matrix extrahierbares, biologisch aktives FGF-2 einer ersten Konzentration enthält; Verarbeiten des Materials der extrazellulären Matrix, um Produktchargen zu erhalten, die mehrere verpackte, sterile Produkte aus Material der extrazellulären Matrix umfassen; Entnahme von Produktproben aus diesen Produktchargen; und Testen dieser Produktproben, um zu bestimmen, ob sie extrahierbares, biologisch aktives FGF-2 einer Konzentration von mindestens etwa 10 % dieser ersten Konzentration enthalten.
Das Verfahren aus Anspruch 31, wobei das Material der extrazellulären Matrix Submucosa umfasst.
Das Verfahren aus Anspruch 32, wobei die Submucosa Dünndarm-Submucosa ist.
Das Verfahren aus Anspruch 32 oder 33, wobei die Submucosa vom Schwein stammt.
Das Verfahren aus einem der Ansprüche 31-34, wobei das Testen ein Testen auf FGF-2 mit einer Konzentration von mindestens etwa 50 ng/g Trockengewicht umfasst.
Das Verfahren aus einem der Ansprüche 31-34, wobei das Testen ein Testen der Produktproben umfasst, um zu bestimmen, ob sie extrahierbares, biologisch aktives FGF-2 einer Konzentration von mindestens etwa 15 % der ersten Konzentration enthalten.
Das Verfahren aus einem der Ansprüche 31-34, wobei das Testen ein Testen der Produktproben umfasst, um zu bestimmen, ob sie extrahierbares, biologisch aktives FGF-2 einer Konzentration von mindestens etwa 20 % der ersten Konzentration enthalten.
Das Verfahren aus einem der Ansprüche 31-34, wobei das Testen ein Testen der Produktproben umfasst, um zu bestimmen, ob sie extrahierbares, biologisch akti ves FGF-2 einer Konzentration von mindestens etwa 30 % der ersten Konzentration enthalten.
Das Verfahren aus einem der Ansprüche 31-34, wobei das Testen ein Testen der Produktproben umfasst, um zu bestimmen, ob sie extrahierbares, biologisch aktives FGF-2 einer Konzentration von mindestens etwa 50 % der ersten Konzentration enthalten.
Das Verfahren aus einem der Ansprüche 31-39, wobei das Material der extrazellulären Matrix durch E-Beam-Bestrahlung sterilisiert wurde.
Ein medizinisches Produkt, das für die Behandlung von Wunden angepasst ist, umfassend: ein aus tierischem Gewebe isoliertes Material der extrazellulären Matrix, wobei dieses Material biologisch aktive Bestandteile, die zur Behandlung von Wunden nützlich sind, darunter FGF-2, enthalten, wobei das FGF-2 in diesem Material der extrazellulären Matrix in einer Konzentration von mindestens etwa 50 ng/g Trockengewicht vorliegt.
Das medizinische Produkt aus Anspruch 41, wobei das Material der extrazellulären Matrix Submucosa umfasst.
Das medizinische Produkt aus Anspruch 42, wobei die Submucosa Dünndarm-Submucosa ist.
Das medizinische Produkt aus Anspruch 42 oder 43, wobei die Submucosa vom Schwein stammt.
Das medizinische Produkt aus einem der Ansprüche 41-44, wobei das FGF-2 in einer Konzentration von mindestens etwa 60 ng/g Trockengewicht vorliegt.
Das medizinische Produkt aus einem der Ansprüche 41-44, wobei das FGF-2 in einer Konzentration von mindestens etwa 70 ng/g Trockengewicht vorliegt.
Das medizinische Produkt aus einem der Ansprüche 41-44, wobei das FGF-2 in einer Konzentration von mindestens etwa 80 ng/g Trockengewicht vorliegt.
Das medizinische Produkt aus einem der Ansprüche 41-44, wobei das FGF-2 in einer Konzentration von mindestens etwa 100 ng/g Trockengewicht vorliegt.
Das medizinische Produkt aus einem der Ansprüche 41-48, wobei das Material der extrazellulären Matrix durch Bestrahlung sterilisiert wurde.
Das medizinische Produkt aus Anspruch 49, wobei das Material durch E-Beam-Bestrahlung sterilisiert wurde.
Ein medizinisches Produkt, umfassend: ein trockenes, Collagen enthaltendes Pulver, das Material der extrazellulären Matrix enthält; dieses trockene, Collagen enthaltende Pulver ist in der Lage, nach Rehydratisierung mit einem wässrigen Medium zu gelieren; und dieses trockene, Collagen enthaltende Pulver enthält FGF-2 in einer Konzentration von mindestens etwa 50 ng/g Trockengewicht.
Das medizinische Produkt aus Anspruch 51, wobei das extrazelluläre Matrixmaterial Submucosa umfasst.
Das medizinische Produkt aus Anspruch 52, wobei die Submucosa Dünndarm-Submucosa ist.
Das medizinische Produkt aus Anspruch 52 oder 53, wobei die Submucosa vom Schwein stammt.
Das medizinische Produkt aus einem der Ansprüche 51-54, wobei das FGF-2 in einer Konzentration von mindestens etwa 60 ng/g Trockengewicht vorliegt.
Das medizinische Produkt aus einem der Ansprüche 51-54, wobei das FGF-2 in einer Konzentration von mindestens etwa 70 ng/g Trockengewicht vorliegt.
Das medizinische Produkt aus einem der Ansprüche 51-54, wobei das FGF-2 in einer Konzentration von mindestens etwa 80 ng/g Trockengewicht vorliegt.
Das medizinische Produkt aus einem der Ansprüche 51-54, wobei das FGF-2 in einer Konzentration von mindestens etwa 100 ng/g Trockengewicht vorliegt.
Das medizinische Produkt aus einem der Ansprüche 51-58, wobei das Material der extrazellulären Matrix durch Bestrahlung sterilisiert wurde.
Das medizinische Produkt aus Anspruch 59, wobei das Material durch E-Beam-Bestrahlung sterilisiert wurde.
Ein medizinisches Produkt, umfassend: eine flüssige Zusammensetzung, die gelöstes oder suspendiertes Collagen enthaltendes Material der extrazellulären Matrix enthält; diese flüssige Zusammensetzung enthält FGF-2 in einer Konzentration von etwa 0,1 ng/ml bis etwa 100 ng/ml.
Das medizinische Produkt aus Anspruch 61, wobei diese flüssige Zusammensetzung eine gelierbare Zusammensetzung ist.
Das medizinische Produkt aus Anspruch 61 oder 62, das FGF-2 in einer Konzentration von etwa 1 bis etwa 50 ng/ml enthält.
Das medizinische Produkt aus Anspruch 61 oder 62, das FGF-2 in einer Konzentration von etwa 10 bis etwa 30 ng/ml enthält.
Ein Verfahren zur Herstellung einer desinfizierten Zusammensetzung aus Hydrolysat der extrazellulärer Matrix, wobei das Verfahren umfasst: das Bilden eines wässrigen Hydrolysats der extrazellulären Matrix, das solubilisierte ECM-Bestandteile enthält; einen ersten Dialyseschritt, der das Dialysieren dieses wässrigen Hydrolysats der extrazellulären Matrix gegen ein wässriges saures Medium umfasst, welches ein oxidierendes Desinfektionsmittel enthält, so dass das Hydrolysat der extrazellulären Matrix mit dem oxidierenden Desinfektionsmittel in Kontakt gebracht und desinfiziert wird, und dabei ein desinfiziertes Hydrolysat der extrazellulären Matrix entsteht; und einen zweiten Dialyseschritt, der die Dialyse des desinfizierten Hydrolysats der extrazellulären Matrix umfasst unter Bedingungen, bei denen das oxidierende Desinfektionsmittel entfernt wird.
Das Verfahren aus Anspruch 65, wobei das oxidierende Desinfektionsmittel eine Peroxyverbindung umfasst.
Das Verfahren aus Anspruch 65, wobei die Peroxyverbindung eine Persäure ist.
Das Verfahren aus einem Anspruch 67, wobei die Peroxyverbindung Peressigsäure ist.
Das Verfahren aus einem der Ansprüche 65-68, wobei während dieser Dialyseschritte das wässrige ECM-Hydrolysat eine Konzentration an ECM-Hydrolysat von etwa 2 mg/ml bis etwa 200 mg/ml aufweist.
Das Verfahren aus einem der Ansprüche 65-67, wobei während dieser Dialyseschritte das wässrige ECM-Hydrolysat eine Konzentration an ECM-Hydrolysat von mindestens etwa 20 mg/ml aufweist.
Das Verfahren aus einem der Ansprüche 65-67, wobei während dieser Dialyseschritte das wässrige ECM-Hydrolysat eine Konzentration an ECM-Hydrolysat von etwa 100 bis etwa 200 mg/ml aufweist.
Das Verfahren aus einem der Ansprüche 65-71, wobei das wässrige ECM-Hydrolysat vor dem ersten Dialyseschritt aufkonzentriert wird.
Das Verfahren aus Anspruch 72, wobei das wässrige ECM-Hydrolysat vor dem ersten Dialyseschritt getrocknet und in einem wässrigen Medium rekonstituiert wird.
Das Verfahren aus Anspruch 72, wobei das wässrige ECM-Hydrolysat vor dem ersten Dialyseschritt teilweise entwässert wird, um ein konzentrierteres, wässriges ECM-Hydrolysat zu bilden.
Ein Verfahren zur Desinfektion einer wässrigen Zusammensetzung aus Hydrolysat der extrazellulären Matrix, das das Solubilisieren extrazellulärer Matrixbestandteile umfasst, umfassend das Inkontaktbringen der wässrigen Zusammensetzung aus Hydrolysat der extrazellulären Matrix mit dem oxidierenden Desinfektionsmittel für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die ausreichen, die Zusammensetzung aus Hydrolysat der extrazellulären Matrix zu desinfizieren.
Das Verfahren aus Anspruch 75, wobei das oxidierende Desinfektionsmittel Peressigsäure enthält.
Das Verfahren aus Anspruch 75 oder 76, das auch das Entfernen des oxidierenden Desinfektionsmittels aus der wässrigen Zusammensetzung aus Hydrolysat der extrazellulären Matrix umfasst.
Das Verfahren aus Anspruch 75 oder 76, wobei die extrazelluläre Matrix Submucosa von Säugern umfasst.
Eine Zusammensetzung aus Hydrolysat der extrazellulären Matrix, die extrazelluläre Matrixbestandteile aufweist, welche in Lösung durch Kontakt mit einem oxidierenden Desinfektionsmittel, das eine Peroxyverbindung enthält, desinfiziert wurden.
Die Zusammensetzung aus Anspruch 79, wobei das oxidierende Desinfektionsmittel eine Peroxyverbindung enthält.
Die Zusammensetzung aus Anspruch 80, wobei das oxidierende Desinfektionsmittel Peressigsäure enthält.
Die Zusammensetzung aus Anspruch 79, die ein Pulver, eine nicht-gelierte wässrige Zusammensetzung, ein Gel oder ein Schwamm ist.
Die Zusammensetzung aus Anspruch 82, die ein Gel ist, und wobei die extrazellulären Matrixbestandteile durch Dialyse eines flüssigen Mediums, das die extrazellulären Matrixbestandteile enthält, gegen ein wässriges Medium, das das oxidierende Desinfektionsmittel enthält, desinfiziert wurden.
Die Zusammensetzung aus Anspruch 83, wobei das oxidierende Desinfektionsmittel eine Peroxyverbindung enthält.
Die Zusammensetzung aus Anspruch 84, wobei das oxidierende Desinfektionsmittel eine Persäure enthält.
Die Zusammensetzung nach Anspruch 85, wobei das oxidierende Desinfektionsmittel Peressigsäure enthält.
Die Zusammensetzung aus Anspruch 79, wobei die extrazellulären Matrixbestandteile FGF-2 enthalten.
Die Zusammensetzung aus Anspruch 87, wobei die extrazellulären Matrixbestandteile mit einem Molekulargewicht oberhalb eines Werts im Bereich von etwa 2000 bis etwa 10000 im Wesentlichen unfraktioniert bleiben.
Ein Transplantationsmaterial aus extrazellulärer Matrix, umfassend: ein Hydrolysat der extrazellulären Matrix; und Partikel der extrazelluläre Matrix.
Das Transplantationsmaterial aus Anspruch 89, ein wässriges Medium umfassend, das dieses Hydrolysat der extrazellulären Matrix in gelöstem Zustand mit darin suspendierten Partikeln der extrazellulären Matrix umfasst.
Das Transplantationsmaterial aus Anspruch 90 in injizierbarer Form.
Das Transplantationsmaterial aus einem der Ansprüche 89-91, wobei dieses Hydrolysat der extrazellulären Matrix ein Submucosa-Hydrolysat umfasst, und die extrazellulären Matrixteilchen Submucosa-Partikel umfassen.
Das Transplantationsmaterial aus extrazellulärer Matrix, umfassend: eine sterile, injizierbare, flüssige Zusammensetzung aus extrazellulärer Matrix, die ein wässriges Medium umfasst, das ein Hydrolysat der extrazellulären Matrix enthält, wobei dieses Hydrolysat der extrazellulären Matrix in dieser Zusammensetzung in einer Konzentration von etwa 20 mg/ml bis etwa 200 mg/ml vorliegt.
Das Transplantationsmaterial aus Anspruch 93, wobei das Hydrolysat der extrazellulären Matrix ein Submucosa-Hydrolysat umfasst.
Das Transplantationsmaterial aus Anspruch 93 oder 94, wobei das Hydrolysat der extrazellulären Matrix in einer Konzentration von etwa 30 mg/ml bis etwa 120 mg/ml vorliegt.
Das Transplantationsmaterial aus einem der Ansprüche 93-95, das auch Partikel der extrazellulären Matrix enthält, die eine durchschnittliche Partikelgröße im Bereich von etwa 50 μm bis etwa 500 μm aufweisen.
Das Transplantationsmaterial aus Anspruch 96, wobei die Partikel der extrazellulären Matrix in einem Gewichtsverhältnis von etwa 1:1 bis etwa 100:1.