CN104984398B - 一种注射型组织工程骨凝胶载体的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医学高分子材料技术领域，公开了一种注射型组织工程骨凝胶载体的制备方法及其应用。该制备方法包含下述步骤：(1)对具有成骨活性的细胞体外培养后，进行成骨诱导分化，使其分泌出细胞外基质，然后进行脱细胞处理，得到成骨诱导的细胞外基质；(2)对成骨诱导的细胞外基质进行碎片化处理，得到成骨诱导的细胞外基质颗粒；(3)将成骨诱导的细胞外基质颗粒与凝胶基质混合，即制得注射型组织工程骨凝胶载体。以该种方法构建得到的凝胶载体是一种更具生物活性、更为安全、更能精确模拟生理状态下组织修复微环境的仿生型凝胶载体，将其应用于骨缺损修复中可显著提高注射型组织工程骨在骨缺损部位的原位成骨效果。

Description

一种注射型组织工程骨凝胶载体的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及骨组织工程技术领域，特别涉及一种注射型组织工程骨凝胶载体的制备方法以及该种凝胶载体在骨缺损修复中的应用。

背景技术

骨组织工程领域中，凝胶载体用以携带细胞进入体内。目前常用的凝胶载体据其成份构成大致可分为两类：单纯型凝胶载体和复合型凝胶载体。

单纯型凝胶主要包括有机合成材料类和生物衍生材料两类，如N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)、聚富马酸二羟丙酯(PLGA)等为有机合成材料类；而胶原、透明质酸等为生物衍生材料类。但由于单纯型凝胶载体成份单一，因此其所携带的细胞在凝胶载体中无法充分得到足够的微环境生物信号刺激，因此单纯型凝胶载体活性不理想。

为提高凝胶载体的活性及疗效，在单纯型凝胶载体的基础上，有不少研究者通过物理混合/化学耦合等方法将一些活性因子添加到凝胶基质内，对其进行改性复合，以求得到活性较高的复合型凝胶载体，目前主要应用的复合活性因子包括各种化合物、离子(如羟基磷灰石、锶离子等)、生物活性基团(如RGD等)、生长因子(如TGF、BMP、VEGF等)等。这些活性因子的加入虽然在一定程度上提高了凝胶载体的活性，但是仍存在较多缺陷：首先，添加的活性因子通常为一种或几种，成份仍较为单一；其次，在目前的技术条件下，对这些复合于凝胶内的活性因子的剂量、分布及释放规律，很难模仿生理状态在时间和空间上进行精确地控制，而一些活性因子(尤其是生长因子，如VEGF等)如果过量、过速的释放会带来致瘤性等潜在的安全风险；再次，化学改性时通常会使用到一些毒性较大的交联剂等额外化学成份，若无法完全去除，植入体内会带来的一定安全问题。

总而言之，现有技术中的凝胶载体材料均无法满足骨组织工程领域对于理想的凝胶载体功能性的需求。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种注射型组织工程骨凝胶载体的制备方法，以该种方法构建得到的仿生型凝胶载体是一种更具生物活性、更为安全、更能精确模拟生理状态下组织修复微环境的凝胶载体。

本发明的另一个目的在于提供上述注射型组织工程骨凝胶载体在骨缺损修复中的应用。

为解决上述技术问题，本发明的实施方式提供了一种注射型组织工程骨凝胶载体的制备方法，其特征在于，包含下述步骤：(1)对具有成骨活性的细胞体外培养后，进行成骨诱导分化，使具有成骨活性的细胞分泌出细胞外基质，然后进行脱细胞处理，得到成骨诱导的细胞外基质；(2)对所述成骨诱导的细胞外基质进行碎片化处理，得到成骨诱导的细胞外基质颗粒；(3)将所述成骨诱导的细胞外基质颗粒与凝胶基质混合，制备得到所述注射型组织工程骨凝胶载体。

与现有的凝胶载体制备技术对比，本发明的实施方式所提供的注射型组织工程骨凝胶载体的制备方法具有如下的特点：(1)在制得的凝胶载体的安全性、有效性方面：本发明的实施方式选择具有成骨活性的细胞作为来源，具备很好的临床应用安全性和有效性，成骨诱导的细胞外基质(osECM)中，无论是活性因子的成份组成还是这些因子的剂量、时空分布及释放规律都更贴近自然生理状态；(2)在制备过程的简易性、操作性方面：本发明的实施方式所提供的凝胶载体的制备方法巧妙地避免在了现有凝胶改性策略中，通过复杂的活性成份添加和化学耦合改性方法、模拟适合组织修复的ECM微环境的做法，而是直接利用成骨诱导分化后分泌的自然状态下的细胞外基质(osECM)，在凝胶载体中给细胞生长、分化提供一个适宜的微环境刺激，制备过程中无需使用化学交联剂，更加自然、安全，有助于后期的临床转化。

进一步的，本发明的实施方式所提供的注射型组织工程骨凝胶载体的制备方法中，具有成骨活性的细胞可以有多种选择，各种拥有高成骨活性的细胞均可实现本发明的目的，例如诱导多能干细胞(iPS)、间充质干细胞(MSC)或成骨细胞(Osteoblast)等。

优选地，在上述所提供的各种具有成骨活性的细胞中，间充质干细胞(MSC)为较佳的细胞来源。间充质干细胞的优点在于：(1)更有效、更接近生理状态：MSC特别是骨髓来源的MSC被认为是体内成骨细胞及骨细胞的祖细胞，在机体生理状态下负责着骨组织修复与再生，拥有很强的成骨活性，而使用正处于旺盛成骨诱导分化中间状态下的MSC分泌出来的天然ECM(osECM)更接近骨组织修复生理状态下的ECM微环境；(2)更安全：不同于iPS和ESC具有潜在的畸胎瘤风险，MSC是一种非常安全的干细胞，迄今没有任何关于人类MSC致瘤性的临床报道，因此使用MSC分泌的ECM的凝胶载体有非常好的临床安全；(3)更强的体外扩增能力：不同于成骨细胞，MSC拥有较强的体外扩增能力，容易建立细胞库，可以大规模地、较低成本地培养分泌ECM，有更好的规模化临床应用的前景；(4)无或低的免疫原性：MSC及其分泌出来的ECM免疫原性非常低、甚至没有免疫原性，可安全地适用于同种异体的临床治疗和规模化应用。因此，本发明的实施方式选用MSC作为细胞源，使用其培养分泌出来的ECM，以制备仿生型凝胶载体，具有非常好的临床应用价值和安全性。

优选地，本发明的实施方式所提供的注射型组织工程骨凝胶载体的制备方法中，对间充质干细胞体外培养后，进行成骨诱导分化的时间为2～4周，该成骨诱导分化时间可使间充质干细胞分泌的细胞外基质(ECM)的分量达到充足，保证其具有极强的成骨诱导性。

进一步地，本发明的实施方式所提供的注射型组织工程骨凝胶载体的制备方法中，在具有成骨活性的细胞分泌出充足量的细胞外基质之后，对其脱细胞处理的方法可以为超声波法、冻干法或化学法。在上述脱细胞处理方法中，优选的为冻干法，冻干法的优点是可以最大限度保留细胞外基质(ECM)的结构和成分、且无任何化学试剂残留。

优选地，本发明的实施方式所提供的注射型组织工程骨凝胶载体的制备方法中，对成骨诱导的细胞外基质进行碎片化处理时，使用深低温粉碎法，且通过该碎片化处理将成骨诱导的细胞外基质碎片化至体积为0.01～0.1mm³的颗粒。深低温粉碎法的优点是更进一步地保留细胞外基质(ECM)的结构和成分，使最后制备得到的凝胶载体能更好地模拟体内的成骨微环境。此外，控制碎片化程度为0.01～0.1mm³，可有助于凝胶载体在临床使用过程中的注射应用。

优选地，本发明的实施方式所提供的注射型组织工程骨凝胶载体的制备方法中，所采用的凝胶基质可以为胶原、纤维蛋白凝胶或藻酸钙。上述的凝胶基质在临床上已成熟应用，因而可确保具有较好的安全性。

优选地，本发明的实施方式所提供的注射型组织工程骨凝胶载体的制备方法中，将成骨诱导的细胞外基质颗粒与凝胶基质混合时，每1毫升凝胶基质中混合0.01～1mg成骨诱导的细胞外基质颗粒，上述混合浓度范围可保证细胞外基质(ECM)在凝胶基质中能充分发挥成骨诱导作用。

此外，本发明的实施方式也同时提供以上述方法制备得到的注射型组织工程骨凝胶载体在骨缺损修复中的应用。具体来说，以上述制备得到的凝胶载体携带细胞，与组织工程骨支架材料一起移植入骨缺损部位，可显著提高骨缺损修复效果。

附图说明

图1是实施例1中间充质干细胞经成骨诱导分化4周后的细胞电镜图；

图2是实施例1中经脱细胞处理后得到的成骨诱导的细胞外基质的电镜图；

图3是实施例1中经碎片化处理后得到的成骨诱导的细胞外基质颗粒的电镜图；

图4是实施例3中实验组进行骨缺损修复三个月后的新骨显微CT影像图；

图5是实施例3中对照组进行骨缺损修复三个月后的新骨显微CT影像图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请各权利要求所要求保护的技术方案。

本发明通过制备实验例1～2和应用实验例3分别说明本发明所提供的注射型组织工程骨凝胶载体的制备方法和应用。

实施例1制备实验例(间充质干细胞来源+藻酸钙凝胶基质)

取间充质干细胞培养于10cm的培养皿中，加入1％的三抗、10％的胎牛血清的低糖DMEM，置于37℃、5％CO₂培养箱中，三天换一次液，当细胞达到90％融合时按1：3传代，直到第四代(P4)。当间充质干细胞达到细胞融合后，更换成骨诱导液(10％胎牛血清、50mg/L抗坏血酸、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、1×10-7mol/L地塞米松)对其进行培养，使间充质干细胞发生成骨诱导分化，三天换一次液，持续28天至其生长成致密组织结构，此时，间充质干细胞已分泌出足够量的细胞外基质。然后采用冻干法对其进行脱细胞处理，得到高活性的成骨诱导的细胞外基质。经成骨诱导分化4周后的细胞电镜图如附图1所示；经脱细胞处理后得到的成骨诱导的细胞外基质的电镜图如附图2所示。

对成骨诱导的细胞外基质采用深低温粉碎法进行粉碎，将成骨诱导的细胞外基质碎片化至体积为0.01～0.1mm³的颗粒，深低温粉碎法的具体步骤为：深低温冷冻后进行真空干燥，然后低温粉碎，即得到高活性的成骨诱导的细胞外基质颗粒。经碎片化处理后得到的成骨诱导的细胞外基质颗粒的电镜图如附图3所示。

最后，将成骨诱导的细胞外基质颗粒与藻酸钙凝胶基质混合，每1毫升藻酸钙凝胶基质中混合0.05mg成骨诱导的细胞外基质颗粒，本实施例中所采用的混合方法为：将上述制备得到的成骨诱导的细胞外基质颗粒与藻酸钠溶液混合均匀，加入等比的氯化钙溶液，均匀混合，即制备得到注射型组织工程骨凝胶载体。

实施例2制备实验例(诱导多功能干细胞来源+胶原基质)

取诱导多功能干细胞培养于10cm的培养皿中，加入1％的三抗、10％的胎牛血清的低糖DMEM，置于37℃、5％CO₂培养箱中，三天换一次液，当细胞达到90％融合时按1：3传代，直到第四代(P4)。当诱导多功能干细胞达到细胞融合后，更换成骨诱导液(10％胎牛血清、50mg/L抗坏血酸、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、1×10-7mol/L地塞米松)对其进行培养，使诱导多功能干细胞发生成骨诱导分化，三天换一次液，持续28天至其生长成致密组织结构，此时，诱导多功能干细胞已分泌出足够量的细胞外基质。然后采用超声波法对其进行脱细胞处理，得到高活性的成骨诱导的细胞外基质。

对成骨诱导的细胞外基质采用深低温粉碎法进行粉碎，将成骨诱导的细胞外基质碎片化至体积为0.01～0.1mm³的颗粒，深低温粉碎法的具体方法为：首先深低温冷冻，然后真空干燥，最后低温粉碎，即得到高活性的成骨诱导的细胞外基质颗粒。

最后，将成骨诱导的细胞外基质颗粒与胶原基质混合，每1毫升胶原基质中混合0.06mg成骨诱导的细胞外基质颗粒，即制备得到注射型组织工程骨凝胶载体。

实施例3应用实验例(兔颅骨节段性缺损修复实验)

一.建立动物模型

目前临床中的骨缺损大体上可分为腔穴性骨缺损、节段性骨缺损两大类别，本实施例中选择对注射型组织工程骨凝胶基质的修复性能要求更高的节段性骨缺损模型进行实验。选取成年雄性大白兔，5月龄，颅骨15mm缺损做为本实验动物模型。

二.实验分组

实验组：使用本发明实施例1制备得到的组织工程骨凝胶载体(即间充质干细胞来源+藻酸钙凝胶基质)携带200万BMSC单细胞悬液植入骨缺损部位，具体实验步骤见下文；

对照组：使用单纯藻酸钙凝胶载体携带200万BMSC单细胞悬液植入骨缺损部位，其余实验操作步骤与实验组相同(对照组的具体操作步骤略)。

三.实验组具体实验步骤：

1、首先制备PCL聚己内酯支架材料：

(1)取聚己内酯原料15克，作为3D打印原材料。

(2)先通过计算机建模软件建立几何模型：设计为内部呈蜂窝状立体结构，且内部形成直径为0.5mm的孔隙，最后生成STL格式文件。

(3)打印实体模型：将上述得到的STL格式文件输入到3D打印机中，对打印参数根据需要进行设置，包括喷头行走路径、熔融温度和挤压速度等，然后打印出三维模型，即得到呈蜂窝状立体结构且内部形成直径为0.5mm的孔隙的聚己内酯支架材料。

2、支架材料、凝胶载体携带细胞植入骨缺损部位：

将200万BMSC单细胞悬液接接种于实施例1制备得到的凝胶载体(即间充质干细胞来源+藻酸钙凝胶基质)上，与上一步中制备得到的蜂窝状立体结构PCL聚己内酯支架材料一起植入动物模型的骨缺损部位。

3、实验结果：

附图4和附图5分别显示了实验组和对照组在进行骨缺损修复三个月后的新骨显微CT影像图。从附图4和附图5的对比中可以看到，实验组的缺损修复效果远优于对照组，说明利用本发明所提供的方法制备的凝胶载体与传统凝胶载体相比，可显著促进注射型组织工程骨在兔颅骨缺损部位的原位成骨效果。

本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。

Claims (7)

1.一种注射型组织工程骨凝胶载体的制备方法，其特征在于，包含下述步骤：

(1)对具有成骨活性的细胞体外培养后，进行成骨诱导分化，使所述具有成骨活性的细胞分泌出细胞外基质，然后进行脱细胞处理，得到成骨诱导的细胞外基质；

(2)对所述成骨诱导的细胞外基质进行碎片化处理，得到成骨诱导的细胞外基质颗粒；

(3)将所述成骨诱导的细胞外基质颗粒与凝胶基质混合，制备得到所述注射型组织工程骨凝胶载体；

所述凝胶基质为胶原、纤维蛋白凝胶或藻酸钙凝胶；

将所述成骨诱导的细胞外基质颗粒与凝胶基质混合时，每1毫升凝胶基质中混合0.01～1mg成骨诱导的细胞外基质颗粒。

2.根据权利要求1所述的注射型组织工程骨凝胶载体的制备方法，其特征在于，所述具有成骨活性的细胞为诱导多能干细胞、间充质干细胞或成骨细胞。

3.根据权利要求2所述的注射型组织工程骨凝胶载体的制备方法，其特征在于，所述具有成骨活性的细胞为间充质干细胞。

4.根据权利要求3所述的注射型组织工程骨凝胶载体的制备方法，其特征在于，所述成骨诱导分化的时间为2～4周。

5.根据权利要求1所述的注射型组织工程骨凝胶载体的制备方法，其特征在于，所述脱细胞处理的方法为超声波法、冻干法或化学法。

6.根据权利要求1所述的注射型组织工程骨凝胶载体的制备方法，其特征在于，所述碎片化处理时使用深低温粉碎法。

7.根据权利要求6所述的注射型组织工程骨凝胶载体的制备方法，其特征在于，所述碎片化处理时将成骨诱导的细胞外基质碎片化至体积为0.01～0.1mm³的颗粒。