CN116535494B

CN116535494B - 一种重组类人源ⅲ型胶原蛋白及其应用

Info

Publication number: CN116535494B
Application number: CN202310797546.3A
Authority: CN
Inventors: 左涛; 刘立; 公少华; 王鹏源; 王满朝
Original assignee: Jiangsu Yao Hai Biopharmaceutical Co ltd
Current assignee: Jiangsu Yao Hai Biopharmaceutical Co ltd
Priority date: 2023-07-03
Filing date: 2023-07-03
Publication date: 2023-09-12
Anticipated expiration: 2043-07-03
Also published as: CN116535494A

Abstract

本发明提供一种重组类人源Ⅲ型胶原蛋白及其应用。根据疏水性，对人天然Ⅲ型胶原蛋白进行改造，人为筛选设计获得类人源Ⅲ型胶原蛋白COL3A1‑QS‑1，其具有优异的水溶性和亲水性，同时具有良好的保湿性、吸湿性和生物相容性，以及较好的细胞增殖、修护功效和抗皱紧致功效。此外，本发明还实现了胶原蛋白COL3A1‑QS‑1在毕赤酵母中的高效分泌表达，蛋白产量达到5 g/L，易于进行放大和下游处理。本发明还提供了胶原蛋白COL3A1‑QS‑1的超滤浓缩纯化、冻干方法，冻干粉纯度可达到95%以上。本发明获得的胶原蛋白冻干粉可应用于医美类化妆品或者功能性化妆品，具有广泛的应用前景。

Description

一种重组类人源Ⅲ型胶原蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及医药工程领域，特别是医美原料领域，具体涉及一种重组类人源Ⅲ型胶原蛋白及其应用。

背景技术

胶原蛋白广泛应用于生物、美容、食品保健等领域，并在医药材料领域具有巨大的应用前景，特别是在医疗领域的应用，如在烧伤治疗、创伤治疗、止血、眼科治疗和口腔科治中，发挥非常重要的作用，同时，国外已经开始将胶原蛋白作为支架材料用于构建器官。但限制胶原蛋白应用最大的问题是胶原蛋白的来源。

目前胶原蛋白主要两大来源，一是动物来源，主要从畜禽动物组织及海洋生物（畜禽骨头、猪皮、海参、鱼鳞、鱼皮）中提取天然胶原蛋白及胶原肽，虽然过程简便，但是存在问题：1）胶原蛋白提取效率较低，且提取的胶原蛋白分子量一般不高，同时含有较多杂质。2）受到提取工艺的限制，提取的胶原蛋白分子量在500 Da以上，再小的胶原蛋白很难提取出来。3）不同提取工艺尤其是酸法、碱法提取胶原蛋白时，会对环境造成污染，无法完全达到绿色提取。提取的胶原蛋白存在免疫原性与病原体污染的问题，多用于化妆品、食品领域。另一种获取胶原蛋白是通过微生物发酵获得。和直接提取相比具有很多优势：1）产品安全，生产过程可控。原料相对明确，成分清晰，减少了病毒感染等污染风险。2）产品质量稳定，批次重复性好。采用基因工程技术表达特定的胶原蛋白分子，其成分单一，且菌株稳定性好，生产批次间差异小，产品质量稳定。3）生物相容性好，减少不必要的免疫反应。4）微生物发酵获取胶原蛋白生产周期相对较短，生产成本相对较低。

目前，虽然通过动物组织提取胶原是最主要的手段，成本也较低，但是通过该方法获得的胶原蛋白一般水溶性较差、具有潜在的病毒传染性风险、免疫原性较高、胶原产品质量控制难度高等缺点。通过基因工程的手段制备类人源胶原蛋白分子则可以规避这些缺点，但是天然的胶原蛋白分子过大，无法或很难通过基因工程手段直接生产，而通过生产与天然胶原蛋白序列相似、分子量更小的类人源胶原蛋白分子则是在技术上更为可行。

现有技术公开了不同的重组胶原蛋白以及应用等，专利文献1（CN100391974C，公开/公告日期2008-06-04）公开了一种重组胶原蛋白及其合成和表达纯化方法，该重组胶原蛋白氨基酸序列的主体为Gly-Xaa-Yaa的三联体，其中Xaa和Yaa中至少有一个带电氨基酸残基；其N末端或C末端包含半胱氨酸残基的序列；在整个氨基酸序列中包含有Arg-Gly-Asp残基组合。专利文献2（CN102351954B，公开/公告日期2013-12-18）公开了一种重组胶原蛋白，其特定的氨基酸序列组成，还公开了包含该重组胶原蛋白的敷料，特别是面膜巾。专利文献3（CN107090458A，公开/公告日期2017-08-25）公开了一种酵母重组胶原蛋白的生产方法，包括重组毕赤酵母工程菌构建及其无需甲醇诱导的组成型分泌表达重组胶原蛋白的方法，首先在基因水平上利用毕赤酵母惯用密码子优化胶原基因序列并人工全基因合成，然后整合进酵母染色体中，构建成组成型分泌表达的重组毕赤酵母工程菌。然而，上述现有技术的重组胶原蛋白仍存在水溶性不足、保湿性效果一般等功能缺陷。

虽然，现阶段市场上已有一些重组胶原蛋白产品，然而现有的产品都是针对各自产品特点需要，在人胶原蛋白序列的基础上进行重新构建设计的，但这些设计并不能满足胶原蛋白产品极大的水溶性和亲水性、良好的保湿性和吸湿性等特殊性能需求，同时还满足产业化制备的需要。因此，本领域亟需提供一种水溶性和亲水性、保湿性和吸湿性效果优异的重组胶原蛋白产品，且制备工艺可达到工业化大规模生产，获得的产品可满足医美类等化妆品领域的高标准。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的之一是提供一种人为筛选设计的重组胶原蛋白产品，该产品具有优异的水溶性和亲水性，同时具有良好的保湿性、吸湿性和生物相容性，并且有促进细胞增殖、修复和抗皱紧致功效。本发明还提供所述重组胶原蛋白的串联蛋白和组合物，特别是冻干粉，编码其的核酸，包含所述核酸的载体，特别是酵母载体，包含所述核酸和载体的重组宿主细胞，特别是酵母宿主细胞。本发明还提供发酵表达、纯化所述胶原蛋白的方法，制备冻干粉的方法，以及在制备功能性化妆品或医美类化妆品及医用敷料中的应用。本发明提供的生产、纯化、制备方法，可实现低成本的工业化生产。

本发明进一步提供一种重组类人源Ⅲ型胶原蛋白，其特征在于，命名为COL3A1-QS-1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明的一方面，提供一种重组类人源Ⅲ型胶原蛋白串联蛋白，其特征在于，所述串联蛋白的氨基酸序列由N个核心单元进行重复串联形成，其中N是大于1的自然数，所述核心单元的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步地，所述N选择2-5中的任一个数值。

本发明的另一方面提供一种分离的核酸，其特征在于，编码所述重组类人源Ⅲ型胶原蛋白或所述重组类人源Ⅲ型胶原蛋白串联蛋白。

进一步地，编码所述重组类人源Ⅲ型胶原蛋白的核酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明的另一方面提供一种重组载体，其特征在于，包含所述的核酸。

进一步地，所述载体为酵母系统表达载体。

进一步地，所述酵母系统表达载体为pPICZα A载体或其他酵母载体，其他酵母载体包含pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，或pYAM75P载体。

本发明的另一方面提供一种重组宿主细胞，其特征在于，包含所述的核酸或所述的重组载体。

进一步地，所述重组宿主细胞为酵母。

进一步地，所述酵母为毕赤酵母X33，GS115，SMD1168或其他酵母菌株，其他酵母包含KM71或KM71H菌株等。

本发明的另一方面提供一种组合物，其特征在于，包含所述重组类人源Ⅲ型胶原蛋白或所述重组类人源Ⅲ型胶原蛋白串联蛋白。

进一步地，所述组合物为冻干粉。

本发明的另一方面提供一种发酵表达制备所述重组类人源Ⅲ型胶原蛋白的方法，其特征在于，包含如下步骤：

(1)种子培养；

(2)发酵培养：将种子液接种到发酵培养基中，发酵罐培养，控制适合的DO、搅拌转速、通气量、温度，在适合的生长阶段开始流加、诱导表达；

(3)发酵上清的制备：培养至适合的时间结束培养，取发酵液去除菌体，过滤，获得发酵上清液。

本发明的另一方面提供一种纯化所述重组类人源Ⅲ型胶原蛋白的方法，其特征在于，包含将所述重组类人源Ⅲ型胶原蛋白的发酵上清液进行超滤浓缩的步骤，获得纯化的所述重组类人源Ⅲ型胶原蛋白。

本发明的另一方面提供一种制备所述重组类人源Ⅲ型胶原蛋白的冻干粉的方法，其特征在于，包含将纯化的所述重组类人源Ⅲ型胶原蛋白进行预冻干，以及冻干步骤。

本发明的另一方面提供所述重组类人源Ⅲ型胶原蛋白或所述重组类人源Ⅲ型胶原蛋白串联蛋白在以下任一项中的用途：

(1)制备功能性化妆品；

(2)制备医美类化妆品；或者，

(3)制备医用敷料。

本发明提供的重组类人源Ⅲ型胶原蛋白及其串联蛋白具有以下多种优异的技术效果：

1. 本发明通过对人天然Ⅲ型胶原蛋白进行改造，人为筛选设计获得类人源Ⅲ型胶原蛋白COL3A1-QS-1，该产品具有优异的水溶性(溶解度达50 g/L以上)和亲水性，同时具有良好的保湿性、吸湿性和生物相容性，并且有促进细胞增殖作用。

2. 本发明对类人源Ⅲ型胶原蛋白COL3A1-QS-1的保湿效果进行了测试，通过检测细胞AQP3 蛋白表达量情况来评价胶原蛋白的保湿功效，实验结果表明，类人源Ⅲ型胶原蛋白COL3A1-QS-1在较低的浓度下，例如0.0004%，即可促进人皮肤永生化角质细胞(HaCaT)的水通道蛋白AQP3 的表达，具有较强的保湿功效。

3. 本发明对类人源Ⅲ型胶原蛋白COL3A1-QS-1的促进细胞生长效果进行了测试，通过检测细胞迁移情况来评价胶原蛋白的皮肤屏障损伤修护功效，经本发明低浓度的样品处理后，细胞愈合率显著升高，说明类人源Ⅲ型胶原蛋白COL3A1-QS-1样品具有较好的细胞修护功效。

4. 本发明对类人源Ⅲ型胶原蛋白COL3A1-QS-1的胶原蛋白抗皱紧致效果进行了测试，针对Collagen Ⅰ的含量变化情况，评价胶原蛋白是否具有抗皱紧致功效。类人源Ⅲ型胶原蛋白COL3A1-QS-1对 UVA 辐射诱导成纤维细胞 Collagen Ⅰ含量表现出显著的提升作用(p＜0.01) ，说明本发明的胶原蛋白具有抗皱紧致功效。

5. 本发明还实现了类人源Ⅲ型胶原蛋白COL3A1-QS-1在毕赤酵母中的高效分泌表达。相对于细胞培养，本发明的毕赤酵母发酵工艺培养基成本低廉成分明确，发酵周期较短，发酵参数相对于控制简单，易于工艺放大。并且，本发明方法所制备的类人源Ⅲ型胶原蛋白COL3A1-QS-1蛋白产量达到 5 g/L，易于进行放大和下游处理。

6. 本发明还提供了类人源Ⅲ型胶原蛋白COL3A1-QS-1的超滤浓缩纯化、冻干方法，该方法操作简单，成本低，效果好，工艺稳定，纯化后的产品纯度、内毒素、HCP、微生物限度，重金属离子均满足化妆品原料需求，最终获得的胶原蛋白冻干粉可应用于医美类化妆品或者功能性化妆品。经过本发明的纯化和冻干处理，类人源Ⅲ型胶原蛋白COL3A1-QS-1冻干粉纯度可达到95%以上。

附图说明

图1为本发明用于表达目标蛋白的pPICZα A-COL3A1-QS-1（命名为YH-COL3A1-QS-1）质粒图谱。

图2为本发明重组质粒pPICZα A-COL3A1-QS-1线性化结果电泳图，其中泳道DL10000为标准分子量marker，泳道QS-1质粒为未线性化的重组质粒pPICZα A-COL3A1-QS-1样品，泳道QS-1酶切为线性化的重组质粒pPICZα A-COL3A1-QS-1样品。

图3为本发明高浓度抗生素上筛选到的毕赤酵母工程菌的单克隆菌株上清液SDS-PAGE图，其中泳道4为标准分子量marker，泳道1为亲本毕赤酵母X-33对照样品，泳道2-3、5-15为筛选的表达本发明胶原蛋白的不同克隆编号的毕赤酵母X-33样品，依次为X-33-pPICZa-COL3A1-QS-1-1至X-33-pPICZa-COL3A1-QS-1-13，其中pPICZa即为pPICZα A。

图4为本发明高表达COL3A1-QS-1蛋白的毕赤酵母工程菌不同诱导时间的发酵上清液样品电泳图，其中泳道1为标准分子量marker，泳道2为BSA 2µg，泳道3为诱导0h发酵上清液样品，泳道4为诱导8h发酵上清液样品，泳道5为诱导16h发酵上清液样品，泳道6为诱导28h发酵上清液样品，泳道7为诱导40h发酵上清液样品，泳道8为诱导52h发酵上清液样品，泳道9为诱导64h发酵上清液样品，泳道10为诱导72h发酵上清液样品。

图5为本发明类人源Ⅲ型胶原蛋白COL3A1-QS-1的AQP3 蛋白细胞免疫荧光染色结果，其中包含BC组、0.01%实验组、0.002%实验组、0.0004%实验组的平行1-3细胞免疫荧光染色结果照片。

图6为本发明类人源Ⅲ型胶原蛋白COL3A1-QS-1的AQP3 荧光强度检测定量分析结果。

图7为本发明类人源Ⅲ型胶原蛋白COL3A1-QS-1处理“损伤”细胞的细胞迁移倒置显微镜拍照图。

图8为本发明类人源Ⅲ型胶原蛋白COL3A1-QS-1处理的细胞迁移损伤愈合率结果。

图9为本发明类人源Ⅲ型胶原蛋白COL3A1-QS-1处理细胞的Collagen Ⅰ含量检测分析结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施案例对本发明做进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容；实施案例中主要采用常规的基因工程分子生物学克隆及酵母遗传改造方法，这些方法是熟悉本领域普通生物技术人员所熟知的。

本发明实施例采用的试剂和仪器均是本领域商业可售，均可购买获得。

下述实施例中涉及到的培养基如下：

培养基均使用纯化水配制，配制完成后121℃灭菌15～30 min。

LB培养基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠10 g/L。加入20 g/L琼脂粉，以配制LB固体培养基。

YPD培养基：蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，葡萄糖20 g/L。加入20 g/L琼脂粉，以配制YPD固体培养基。

BMGY培养基：蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，甘油20 g/L，50 mmol/L的磷酸钾缓冲溶液，体积分数10％的10×YNB酵母基础氮源母液，生物素4×10^-4g/L。

BMMY培养基：蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，甲醇10 g/L，50 mmol/L的磷酸钾缓冲溶液，体积分数10％的10×YNB酵母基础氮源母液，生物素4×10^-4g/L。

YP培养基：酵母粉100 g/L，蛋白胨200 g/L。

实施例1 本发明重组类人源Ⅲ型胶原蛋白的筛选与确定

根据本领域已知的人天然Ⅲ型胶原蛋白氨基酸序列（Genbank序列登录号：NP_000081.2），去除相关疏水性氨基酸，设计一系列突变的重组类人源Ⅲ型胶原蛋白，根据突变的蛋白疏水特性及保湿性等功效进行筛选，最终获得本发明的重组类人源Ⅲ型胶原蛋白，命名COL3A1-QS-1，其氨基酸序列和核酸序列如下表1所示。

表1 重组类人源Ⅲ型胶原蛋白COL3A1-QS-1氨基酸序列和核酸序列

	胶原蛋白COL3A1-QS-1
		氨基酸序列	GTSGYQGKDGESGERGHRGRNGEKGETGENGENGERGNDGSDGSNGQRGKNGERGKDGERGEKGERGRDGSDGSQGESGNDGKNGERGKNGETGDKGDTGENGERGERGDKGKDGDKGERGETGQNGERGEKGERGSNGKDGNTGEKGRDGRDGDRGENGKSGDRGESGSRGDKGETGERGHRGQQGKDGTSGNRGERGSE（SEQ ID NO：1）
核酸序列	GGTACTTCTGGTTATCAAGGTAAAGATGGTGAATCTGGTGAAAGAGGTCATAGAGGTAGAAATGGTGAAAAAGGTGAAACTGGTGAAAATGGTGAAAACGGTGAAAGAGGAAACGATGGTTCTGATGGTTCTAATGGTCAAAGAGGTAAAAACGGTGAAAGAGGTAAAGATGGAGAAAGAGGTGAAAAAGGAGAAAGAGGAAGAGATGGTTCTGACGGTTCTCAAGGTGAATCTGGAAACGATGGAAAAAACGGTGAGAGAGGTAAAAATGGTGAAACTGGAGATAAGGGTGACACTGGTGAAAACGGAGAAAGAGGTGAGAGAGGAGATAAAGGTAAAGATGGTGACAAAGGTGAAAGAGGTGAAACTGGTCAAAATGGTGAAAGAGGTGAAAAGGGTGAAAGAGGTTCTAACGGTAAAGATGGTAACACTGGTGAAAAAGGTAGAGATGGTAGAGATGGAGATAGAGGTGAAAACGGTAAATCTGGTGACAGAGGTGAATCTGGTTCTAGAGGTGACAAAGGAGAAACTGGTGAGAGAGGTCATAGAGGACAACAAGGTAAAGACGGTACTTCTGGAAACAGAGGTGAAAGAGGTTCCGAAtaa（SEQ ID NO：2）

实施例2 毕赤酵母表达类人源Ⅲ型胶原蛋白COL3A1-QS-1

2.1．类人源Ⅲ型胶原蛋白COL3A1-QS-1表达质粒构建。将类人源Ⅲ型胶原蛋基因序列的密码子优化为毕赤酵母偏好的密码子，优化后的序列需避免存Sac Ⅰ 酶切位点。将优化后的序列抄送给基因合成公司，合成类人源胶原蛋白COL3A1-QS-1基因（序列如SEQ IDNO：2所示），合成的序列整合在表达载体上，最终构建pPICZα A-COL3A1-QS-1质粒，命名为YH-COL3A1-QS-1，其表达质粒图谱如图1所示。

2.2. 类人源Ⅲ型胶原蛋白COL3A1-QS-1表达质粒扩增。待菌株构建成功后，进行质粒扩增，将10 μL 甘油菌至10 mL LB 培养基中（50 mL 离心管）或100 mL LB 培养基中（500 mL 摇瓶）。置入恒温摇床，220 rpm、37℃过夜培养（12~16 h）。

2.3. 类人源Ⅲ型胶原蛋白COL3A1-QS-1质粒的提取。利用SanPrep 柱式质粒DNA小量抽提试剂盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）或无内毒素质粒大提试剂盒（增强型，离心柱型，天根生化科技（北京）有限公司）提取质粒，提取过程可参考产品说明书。

2.4. 类人源Ⅲ型胶原蛋白COL3A1-QS-1重组质粒的线性化。以SacⅠ（Quick CutSac Ⅰ，TaKaRa）酶切重组质粒pPICZα A-COL3A1-QS-1使其线性化，其线性化结果电泳图如图2所示。利用SanPrep 柱式PCR 产物试剂盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）纯化回收已线性化的重组质粒pPICZα A-COL3A1-QS-1。

2.5. 以1 μL 的P. Pastoris X-33 甘油菌在YPD 平板上划线。倒置于恒温培养箱中， 30℃培养至长出分散的单克隆菌落48 h）。挑取单克隆菌落接入5 mL 的YPD 培养基（50 mL 离心管），置入恒温摇床30℃、220 rpm 培养过夜24 h。100 μL 过夜培养物接入100mL 新鲜YPD 培养基（500 mL 锥形瓶），置入恒温摇床30℃、220 rpm培养过夜24 h至OD₆₀₀=1.5。收集100 mL 的过夜培养物，4℃、2000×g 离心5 分钟，去上清，以100 mL 预冷无菌水重悬细胞。4℃、2000×g 离心5 分钟，去上清，以100 mL 预冷无菌水重悬细胞。4℃、2000×g 离心5 分钟，去上清，以10 mL预冷LiAc 制备液（10 mM Tris-HCl、100 mM LiAc、10 mMDTT、1.0 M Sorbitol；pH 7.5）重悬细胞，4℃静置60分钟。4℃、2000×g 离心5 分钟，去上清，以4 mL 预冷1 M 山梨醇溶液重悬细胞。4℃、2000×g 离心5 分钟，去上清，以2 mL 预冷1 M 山梨醇溶液重悬细胞。4℃、2000×g 离心5 分钟，去上清，以1 mL 预冷1 M 山梨醇溶液重悬细胞。4℃、2000×g 离心5 分钟，去上清，以100 μL 预冷1 M 山梨醇溶液重悬细胞。分装感受态细胞，每份80 μL，冰上保存，用于后续电转化实验。

2.6. 80 μLP. PastorisX-33 感受态细胞中加入20 μg 预冷的线性化类人源Ⅲ型胶原蛋白COL3A1-QS-1重组质粒（≤10 μL），混匀，冰浴5分钟。将混合液转移至预冷的电转杯内，电转杯置入电转仪（Bio-Rad）。电转仪参数设置为 Pichia 预设，电击1 次后立即冰浴冷却30 秒，电击≥5 次。加入1 mL 预冷1 M 山梨醇溶液，轻轻吹打均匀，将内容物转移至无菌离心管中。 2000×g 离心5 分钟，去除部分上清，剩约200 μL 菌液重悬细胞，30℃恒温培养1.5 小时。将细胞悬液涂布Zeocin 抗性（100 μg/mL）YPD 平板，剩余悬液涂布YPD 无抗平板（对照）。室温静止至平板上无显著流动液体，转移至恒温培养箱，30℃倒置培养48-72 h至Zeocin 抗性YPD 平板长出明显的单克隆菌落。

2.7. 类人源Ⅲ型胶原蛋白COL3A1-QS-1高拷贝毕赤酵母工程菌株筛选。取转化后在低浓度Zeocin 抗性YPD 平板长出明显的单克隆菌落，对单克隆进行编号，同时将其转移到不同抗生素浓度Zeocin（100 μg/mL、500 μg/mL、1000 μg/mL、2000 μg/mL）抗性YPD 平板，并做好标记。将转板后的平板在25-30℃倒置培养24-48 h，平板长出明显的单克隆菌落。记录在不同抗生素浓度平板上生长菌落的序号，挑取高浓度抗生素平板上生长的单克隆菌株进行表达验证。

2.8. 毕赤酵母工程菌诱导表达类人源胶原蛋白COL3A1-QS-1。挑取不同抗生素浓度平板上P. PastorisX-33/pPICZα A- COL3A1-QS-1单克隆菌落，分别接入5 mL BMGY（50mL 离心管）。置入恒温摇床，30℃、220 rpm 培养过夜（约16 h）。测定过夜培养物OD₆₀₀，收集10 OD₆₀₀·mL 的菌液。2000×g 离心5 分钟，去上清，以10 mL BMMY 培养基重悬菌体。置入恒温摇床，30℃、220 rpm 培养72 小时。每培养24 小时，每个离心管补充50 μL 甲醇（0.5%）。培养结束后，12000×g 离心5 分钟，收集上清。

2.9. 类人源Ⅲ型胶原蛋白COL3A1-QS-1的鉴定。样品与蛋白Loading Buffer 按比例混匀，使最终样品的蛋白Loading Buffer 浓度不低于1X，98℃或沸水浴变性10 min。随后，安装电泳槽和胶板（去封口胶带），倒入电泳缓冲液，内槽应充溢，外槽液面应高于电极丝。缓慢拔除制孔梳子，取针筒吸取缓冲液，逐个伸入胶孔中吹去甘油。合上槽盖，通电，80 V 电压下电泳~40 分钟，至样品压缩成线。升高电压值120 V 继续电泳，至指示带靠近或抵达凝胶底端。以蛋白染色仪对电泳完的凝胶进行染色、脱色，设置程序为Stain 3min；Destain 2 min；Destain 1 min。将凝胶转移至凝胶成像系统内，成像、修饰图像、设置泳道、标注泳道，并进行相应分析。高浓度抗生素上筛选到的毕赤酵母工程菌的单克隆菌株上清液SDS-PAGE结果如图3所示，其中泳道4为标准分子量marker，泳道1为亲本毕赤酵母X-33对照样品，泳道2-3、5-15为筛选的表达本发明胶原蛋白的不同克隆编号的毕赤酵母X-33样品，依次为X-33-pPICZa-COL3A1-QS-1-1至X-33-pPICZa-COL3A1-QS-1-13，其中pPICZa即为pPICZα A。在高浓度平板筛选的毕赤酵母工程菌有目的条带中，X-33-pPICZa-COL3A1-QS-1-8表达量相对较高，用作后续发酵工程菌。

2.10. 将毕赤酵母工程菌的甘油菌株的种子液按照10%的接种量接入到含灭菌后的分批发酵培养基发酵罐中；设定发酵温度为30℃、pH为4.5-6.5之间、DO设定在10-45%之间；发酵开始后定期取样进行OD₆₀₀和菌体湿重的测定，待基础料中甘油消耗完，溶氧回升时开始流加甘油补料液，补料速度约为18.15 ml/h/L工作体积。当湿重达到300 g/L，本阶段结束。该阶段开始、补料5 h、补料结束各取一次样，并记录参数，测定湿重。在甘油流加阶段结束后，DO迅速上升时，进行饥饿处理15 min，并将准备好的YP溶液加入到发酵罐中（YP溶液加入会引起较严重的起泡现象，需提前加入适量的消泡剂），温度降到22℃。随后进入甲醇诱导阶段，饥饿处理结束，开始流加甲醇。诱导前2小时，补料速度约为3 ml/h/L。诱导第12小时，补料速度约为5 ml/h/L。诱导第12小时，补料速度改为8 ml/h/L。诱导16小时后，补料速度改为12 ml/h/L。诱导第0 h、8 h、16 h及以后每12 h和放罐时取样，并记录各参数，测定湿重。诱导72 h后进行下罐处理，离心收集上清液，不同时间段取样结果跑胶进行检测，其电泳结果如图4所示。图4高表达本发明COL3A1-QS-1蛋白的毕赤酵母工程菌不同诱导时间的发酵上清液样品电泳图，其中泳道1为标准分子量marker，泳道2为BSA 2µg，泳道3为诱导0h发酵上清液样品，泳道4为诱导8h发酵上清液样品，泳道5为诱导16h发酵上清液样品，泳道6为诱导28h发酵上清液样品，泳道7为诱导40h发酵上清液样品，泳道8为诱导52h发酵上清液样品，泳道9为诱导64h发酵上清液样品，泳道10为诱导72h发酵上清液样品。本实施例方法所制备的类人源Ⅲ型胶原蛋白COL3A1-QS-1蛋白产量达到 5 g/L，易于进行放大和下游处理。发酵液产量在5g/L基础上，最终可浓缩到50g/L，表明本发明的类人源Ⅲ型胶原蛋白COL3A1-QS-1溶解度可达50 g/L以上。

实施例3 类人源Ⅲ型胶原蛋白COL3A1-QS-1纯化以及蛋白冻干粉制备

首先，将实施例2得到的发酵液上清进行超滤浓缩换液。前处理：注射用水冲洗3L，排空液体。使用消毒液对膜包进行无热原处理1 h以上，注射用水冲洗膜包至回流、透过均为中性，测量系统死体积。最后使用3个PBS缓冲液冲洗膜包。浓缩PBS缓冲液至透过端pH和Conductivity（电导率）与缓冲液pH和Conductivity一致，管路与产品连接，进行适当浓缩，浓缩过程流速200 ml/min，跨膜压≤2Bar。浓缩5倍左右。换液，浓缩结束后，采用等体积连续换液的方式，用PBS缓冲液对浓缩液进行约8倍置换，至样品电导率与PBS缓冲液一致，完成换液工作后进行冻干，将已经超滤好的样品倒在铺有保鲜膜的冻干盘中，液面高度应不得超过10 mm。预冻阶段：在5 min内降温至-45℃，并维持180 min；预抽真空0 mbar，一次干燥：真空度0.15 mbar，在120 min内升温至-20℃，并维持1200 min；在60 min内升温至0℃，并维持120 min。最终获得类人源Ⅲ型胶原蛋白COL3A1-QS-1冻干粉。经过本实施例的纯化和冻干处理，类人源Ⅲ型胶原蛋白COL3A1-QS-1冻干粉纯度可以达到95%以上。

实施例4 类人源Ⅲ型胶原蛋白COL3A1-QS-1功效测试

4.1.胶原蛋白保湿效果测试

选取以人皮肤永生化角质细胞(HaCaT)为研究对象，通过免疫荧光技术检测细胞AQP3 蛋白表达量情况来评价待测样品的保湿功效。细胞接种：按1×10⁵ 个/孔的接种密度接种细胞至24 孔板，培养箱（37℃、5%CO₂）中孵育过夜。配液：用HaCaT 细胞培养液，按照类人源Ⅲ型胶原蛋白COL3A1-QS-1母液浓度5 g/L进行0.01%、0.002%、0.0004%稀释并配制三个浓度的受试物工作液。待24 孔板中细胞铺板率达到40%~60%时，将原来的细胞培养液吸干净后，进行分组给药。实验组，每孔加入1.0 mL 的样品工作液，每个浓度的工作液设置3 个复孔。对照组（BC 组）每孔加入1.0 mL 的细胞培养液，设置3个复孔。放进培养箱（37℃、5%CO₂）继续培养24 h。弃去上清，PBS 润洗细胞3遍。进行常规的免疫荧光染色过程。主要步骤为：固定，封闭，加一抗，加二抗，DAPI复染，然后利用荧光显微镜进行拍照，其荧光拍照结果如图5所示，其中包含BC组、0.01%实验组、0.002%实验组、0.0004%实验组的平行1-3细胞免疫荧光染色结果照片。

利用Image Pro Plus 软件对AQP3 荧光强度进行定量分析；其荧光检测结果如图6所示，其中纵坐标为相对IOD平均值（IOD即为Integrated Optical Density，相当于面积乘以平均荧光强度）。与对照BC 相比，加入0.0004%、0.002%和0.01%(V/V)浓度的类人源Ⅲ型胶原蛋白COL3A1-QS-1，AQP3 蛋白的荧光显著增强（p＜0.01），相对提升率分别为45.00%、65.00%和122.00%，说明样品可以促进人皮肤永生化角质细胞(HaCaT)的水通道蛋白AQP3 的表达。综上所述，在AQP3 蛋白含量测试中，与对照BC 相比，类人源Ⅲ型胶原蛋白COL3A1-QS-1在浓度为0.0004%、0.002%和0.01%(V/V)时，AQP3 蛋白的荧光显著增强（p＜0.01），相对提升率分别为45.00%、65.00%和122.00%，说明类人源Ⅲ型胶原蛋白COL3A1-QS-1在较低的浓度下可以促进人皮肤永生化角质细胞(HaCaT)的水通道蛋白AQP3 的表达，具有较强的保湿功效。

4.2.胶原蛋白促进细胞生长效果测试

选取以人成纤维细胞为研究对象，通过检测细胞迁移情况来评价待测样品的皮肤屏障损伤修护功效。细胞划痕实验。细胞接种：按1×10⁵ 个/孔的接种密度接种细胞至24孔板，在培养箱（37℃，5%CO₂）中培养 24 h 后，以 200 μL 枪头垂至于 24 孔板划出“损伤”，用 PBS洗细胞 3 次，去除划下的细胞。随后，添加细胞培养基，设置阳性对照（PC组，FBS培养基）和阴性对照（BC组，无FBS培养基）和在无FBS的培养基内添加0.002%、0.01%、0.03%（V/V）浓度的类人源Ⅲ型胶原蛋白COL3A1-QS-1。放入培养箱（37℃, 5%CO₂）培养 24h，每组设置 3 个平行。运用倒置显微镜对迁移的各组细胞进行拍照，其细胞迁移结果如图7所示，其中包含BC组、PC组、0.002%实验组、0.01%实验组、0.03%实验组处理0h和处理后24h的细胞迁移倒置显微镜拍照图。

同时，采用 Image Pro Plus 软件计算出划痕面积的平均值，其统计结果如图8所示，其中，纵坐标为愈合率%，包含BC组、PC组、0.002%实验组、0.01%实验组、0.03%实验组。愈合率%=(初始划痕面积一现划痕面积)/初始划痕面积×100。细胞迁移试验中，因阳性对照组中存在血清，血清具有较高的促进细胞愈合的功能，因此阳性对照组的细胞愈合水平较阴性对照组显著升高（p<0.01），相对提升率为251.51%；与阴性对照组比较，经 0.002%、0.01%和 0.03%（V/V）浓度的样品处理后细胞愈合率显著升高（p<0.05），相对提升率分别为21.58%、124.61%和 153.34%，说明类人源Ⅲ型胶原蛋白COL3A1-QS-1样品具有较好的细胞修护功效。

4.3.胶原蛋白抗皱紧致效果测试

选取以人成纤维细胞为研究对象，通过针对Collagen Ⅰ的含量变化情况，评价类人源Ⅲ型胶原蛋白COL3A1-QS-1是否具有抗皱紧致功效。UVA 刺激人成纤维细胞。细胞接种：按适宜的接种密度（8×10⁴/孔）接种细胞至 24 孔板，培养箱（37℃、5%CO₂）中孵育过夜。实验分组：实验设置空白对照组、阴性对照组、阳性对照组与样品实验组。样品实验组设置3个浓度梯度（0.002%、0.01%和0.03%，V/V）。配液：按测试浓度设定表配制不同浓度的受试物工作液。给药：待 24 孔板中细胞铺板率达到 40%~60%时进行给药。空白对照组（BC组）、阴性对照组（NC）每孔加入 1 mL的细胞培养液；阳性对照组（PC组）每孔加入 1 mL 含有 100μg/mL 维生素 C 和 7 μg/mL 维生素 E 的培养液；样品组每孔加入 1 mL 含有相应浓度受试物的培养液。辐射：给药完成 24 h 后，阴性对照组、阳性对照组及样品组接受总剂量为 9 J/cm2 的 UVA 辐射，与此同时，空白对照组放置于相同的环境（UVA 辐射剂量为 0J/cm2）。收集细胞上清：孵育培养 24 h 后，收集细胞培养上清液于 EP 管中，置于-80℃冰箱冷冻保存。

Collagen Ⅰ含量检测：根据 ELISA 检测试剂盒的操作说明书对 CollagenⅠ的含量进行检测分析，其检测结果如图9所示，其中，纵坐标为Concentration of Collagen Ⅰ(pg/mL)，即Collagen Ⅰ浓度（pg/mL），包含BC组、NC组、PC组、0.002%实验组、0.01%实验组和0.03%实验组。与BC组相比，NC组成纤维细胞接受总剂量为 9 J/cm2 的 UVA 辐射后，Collagen Ⅰ含量水平显著下降(p＜0.01)，说明辐照刺激有效。与NC组相比，PC组的维生 C和维生素 E 可以显著提高 Collagen Ⅰ的含量水平(p＜0.01)，表明本次阳性对照检测有效。与NC组相比，胶原蛋白在0.01%和0.03%（V/V）浓度下均对 UVA 辐射诱导成纤维细胞Collagen Ⅰ含量表现出显著的提升作用(p＜0.01)，说明胶原蛋白具有抗皱紧致功效。

本公开的上述实施例仅是为清楚地说明本公开所作的举例，而并非是对本公开的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本公开的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本公开权利要求的保护范围之内。

Claims

1. 一种重组类人源Ⅲ型胶原蛋白，其特征在于，命名为COL3A1-QS-1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种分离的核酸，其特征在于，编码权利要求1所述的重组类人源Ⅲ型胶原蛋白。

3.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求2所述的核酸。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述载体为酵母系统表达载体。

5. 根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述酵母系统表达载体为pPICZα A，pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，或pYAM75P载体。

6.一种重组宿主细胞，其特征在于，包含权利要求2所述的核酸或权利要求3-5任一项所述的重组载体。

7.根据权利要求6所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞为酵母。

8.根据权利要求7所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述酵母为毕赤酵母X33，GS115，SMD1168，KM71，或KM71H菌株。

9.一种组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的重组类人源Ⅲ型胶原蛋白。

10.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述组合物为冻干粉。

11.一种发酵表达制备权利要求1所述的重组类人源Ⅲ型胶原蛋白的方法，其特征在于，包含如下步骤：

(1)种子培养，所述种子为可诱导表达权利要求1所述的重组类人源Ⅲ型胶原蛋白的毕赤酵母工程菌；

(2)发酵培养：将种子液接种到发酵培养基中，发酵罐培养，控制适合的DO、搅拌转速、通气量、温度，在适合的生长阶段开始流加甲醇，诱导表达；

12.一种纯化权利要求1所述的重组类人源Ⅲ型胶原蛋白的方法，其特征在于，包含将所述重组类人源Ⅲ型胶原蛋白的发酵上清液进行超滤浓缩的步骤，获得纯化的所述重组类人源Ⅲ型胶原蛋白。

13.一种制备权利要求1所述的重组类人源Ⅲ型胶原蛋白的冻干粉的方法，其特征在于，包含将纯化的所述重组类人源Ⅲ型胶原蛋白进行预冻干，以及冻干步骤。

14.权利要求1所述的重组类人源Ⅲ型胶原蛋白在以下任一项中的用途：

(1)制备功能性化妆品；

(2)制备医美类化妆品；

(3)制备医用敷料。