CN117069827B - 一种重组胶原重复序列蛋白的表达及其应用 - Google Patents

一种重组胶原重复序列蛋白的表达及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物蛋白质技术领域，具体涉及一种重组胶原重复序列蛋白的表达及其应用，构建了三种重组胶原重复序列蛋白的表达载体，重复单元分别为人III型胶原438~467和798~839氨基酸序列，以及人I型胶原992~1018氨基酸序列。本发明使用不同种类的大肠杆菌表达菌株进行重组胶原重复序列蛋白的表达，蛋白表达量好，可形成二聚体。活性和伤口愈合效果研究表明，本发明所表达的重组胶原重复序列蛋白具有很好的促进细胞迁移的活性，皮肤修复效果好。

Description

一种重组胶原重复序列蛋白的表达及其应用
技术领域
本发明涉及生物蛋白质技术领域，尤其涉及一种重组胶原重复序列蛋白的表达及其应用。
背景技术
胶原蛋白是人体的皮肤、软骨、牙齿肌腱、韧带、内脏和血管的主要组成成分，是哺乳动物中最丰富的蛋白质之一(占总蛋白质量的25%-30%)。胶原蛋白是一种结构蛋白，能够起到支持、保护、连接等多种作用，其三螺旋结构是理化特性以及生物活性的基础，螺旋区段最大特征是氨基酸呈现Gly-X-Y重复序列(X和Y通常分别是脯氨酸和4-羟基脯氨酸)，能够形成链间氢键和静电相互总用，使得胶原蛋白的三螺旋结构更为稳定。我们人体正常皮肤中的胶原主要以I和III型的胶原纤维形式存在，作用在皮肤的真皮层，维持着人体皮肤的正常组织结构，I型胶原蛋白纤维直径较粗，排列紧密，呈现致密的条束状，是构成皮肤的主体，III型胶原蛋白是由三条α1(Ⅲ)链(Col3A1)组的同源三聚体，纤维较细，呈疏网状，散布于I型胶原周围，起支撑组织，维持皮肤弹性的作用，还具有保护血管神经，改善细胞微环境，促进伤愈合，减轻皮肤炎症的作用。
与I型胶原蛋白可通过刺激纤维细胞的方式促进新生不同，III型胶原蛋白是骨髓细胞来源，当成年骨闭合后之后就会无法自体再生，虽然胶原蛋白的提取方法多种多样，但动物源胶原蛋白均为I型，且存在免疫原性、均一性差、传染病隐患等多个弊端，从动物组织提取III型胶原蛋白仍存在难度大、纯度低、成本高等严峻问题，而通过基因工程技术制备的重组胶原蛋白与动物源胶原蛋白相比，降低了排斥反应、免疫原性以及病毒感染的风险，是目前解决胶原蛋白来源问题最有潜力的方法，如何通过基因工程开发一种免疫原性低、活性高的III性胶原蛋白是亟需解决的技术问题。
发明内容
本发明提出了一种重组胶原重复序列蛋白的表达及其应用，构建了重组胶原重复序列蛋白的表达载体，包括三种含重复单元的氨基酸表达序列，以及组氨酸标签、融合标签、蛋白酶切割位点序列，蛋白表达量高，制成了促进小鼠胚胎成纤维细胞迁移活性较高的重组胶原重复序列蛋白。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种重组胶原重复序列蛋白，包括的氨基酸序列为CR1、CR2、CR3中的一种。
进一步的，所述CR1由310个氨基酸组成，基本重复单元为：GAKGEPGPRGERGEAGIPGVPGAKGEDGKD，来自人III型胶原蛋白438~467的肽段，C端含有III型胶原1191-1200片段，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，DNA序列如SEQ ID NO:2所示。
进一步的，所述CR2由430个氨基酸组成，基本重复单元为GERGETGPPGPAGFPGAPGQNGEPGGKGERGAPGEKGEGGPP，来自人III胶原蛋白798~839的肽段，C端含有III型胶原1191-1200片段，氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，DNA序列如SEQ ID NO:4所示。
进一步的，所述CR3，基本重复单元为GERGPPGPMGPPGL AGPPGESGREGAP，由280个氨基酸组成，来自人I胶原蛋白992~1018对的肽段， C端含有III型胶原1191-1200片段，氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，DNA序列如SEQ ID NO:6所示。
本发明还提出了一种重组胶原重复序列蛋白的表达方法，步骤如下：
(1) 合成重组胶原重复序列蛋白CR1-3的DNA序列；
(2) 将步骤(1)所述DNA序列进行密码子优化后，拼接重组到表达载体上，酶切位点为NcoI和XhoI，于转化平板上转化细菌，构建重组基因工程菌；
(3) 从转化平板上选出单斑克隆菌，采用50 mL LB培养基(含100 mg/L氨苄)，在37℃条件下过夜培养；
(4) 按照1:40的比例将步骤(3)所述单斑克隆菌转接至2 L LB培养基(含100 mg/L氨苄)中，37℃条件下培养至600nm波长处的吸光值(OD600)为0.4-0.6，加入0.5 mM IPTG在20℃条件下诱导蛋白的表达，得到混合菌液；
(5) 将步骤(4)所述混合菌液经7000 rpm离心10 min，收集菌体，菌体沉淀加入10mM咪唑PBS溶液(pH7.5)重悬，高压破碎细菌，4°C，11000 rpm离心15 min，取上清与平衡好的5 mL镍柱孵育，重力洗脱，用10 mM PBS溶液(pH7.5)洗去杂蛋白，300 mM咪唑的PBS溶液(pH7.5)进行洗脱，超滤管超滤进行浓缩并除去咪唑，得到前体重组胶原重复序列蛋白的PBS溶液；
(6) 按1 mg:2 U的比例向前体重组胶原重复序列蛋白PBS溶液加入蛋白酶，4℃过夜反应，SDS-PAGE检测反应完全，蛋白混合溶液与镍柱孵育，除掉标签蛋白和酶，即得改性前重组胶原重复序列蛋白溶液；
(7) 将步骤(6)所得改性前重组胶原重复序列蛋白溶液于磷酸盐缓冲溶液(pH=9.0)在4°C透析3 d，按体积比10:1的比例加入含有辛烯基琥珀酸酐的二甲基亚砜，每毫升二甲基亚砜加入20 mg辛烯基琥珀酸酐，反应体系在15°C下搅拌4 h后，在4°C下与去离子水透析3 d，制得重组胶原重复序列蛋白溶液。
进一步的，步骤(2)所述表达载体为pET32a(+)，细菌为大肠杆菌。
进一步的，所述pET32a(+)表达载体包括组氨酸标签、融合标签(SEQ ID NO:7-12)和蛋白酶切割位点的氨基酸序列(SEQ ID NO:13-17)。
进一步的，所述融合标签为麦芽糖结合蛋白(MBP)、 半胱氨酸蛋白酶(CPD)、 谷胱甘肽巯基转移酶(GST)、 本载脂蛋白格A1(APOI)、 硫氧还蛋白(TrxA)、绿色荧光蛋白(GFP)、杂交融合标签中的一种。
进一步的，所述蛋白酶切割位点序列为烟草蚀纹病毒酶切序列(TEV)、凝血酶切序列(thrombin)、肠激酶切序列(EK)、因子Xa酶切序列(Factor-Xa)、鼻病毒3C酶切序列(HRV3C)中的一种。
进一步的，所述大肠杆菌为BL21 (DE3)、BL21 (DE3) pLysS、BL21Star (DE3)、BL21Star (DE3) pLysS、Rosetta (DE3)、Rosetta (DE3) pLysS、OrigamiB (DE3)、OrigamiB (DE3) pLysS、SHuffle T7、BLR (DE3)、BLR (DE3) pLysS、B834 (DE3)、 B834(DE3) pLysS、BL21(DE3)+HSP60中的一种或多种。
进一步的，步骤(4)所述37℃培养条件，在采用Shuffle T7大肠杆菌时为30℃。
本发明还提供了一种重组胶原重复序列蛋白在制备促进细胞迁移活性产品和皮肤修复产品中的应用，包括以下步骤：
a. 将制得的重组胶原重复序列蛋白溶液于60℃、绝对压强为0.08MPa的条件下浓缩至原体积的20％，通过喷雾干燥制成胶原蛋白粉末；
b. 将重组胶原重复序列蛋白溶液或胶原蛋白粉末添加至细胞培养基中，可制得促进细胞迁移活性培养基，发挥促进细胞迁移的作用；
c. 按1 g：1 L的比例，将胶原蛋白粉末与蒸馏水混匀，涂抹至皮肤受损处，此外还可将胶原蛋白粉末添加至护肤品或药用敷料中，发挥皮肤修复的效果。
进一步的，本发明所述的DNA和氨基酸序列如下所示：
<CR1; AA; SEQ ID NO:1>：
GAKGEPGPRGERGEAGIPGVPGAKGEDGKDGAKGEPGPRGERGEAGIPGVPGAKGEDGKDGAKGEPGPRGERGEAGIPGVPGAKGEDGKDGAKGEPGPRGERGEAGIPGVPGAKGEDGKDGAKGEPGPRGERGEAGIPGVPGAKGEDGKDGAKGEPGPRGERGEAGIPGVPGAKGEDGKDGAKGEPGPRGERGEAGIPGVPGAKGEDGKDGAKGEPGPRGERGEAGIPGVPGAKGEDGKDGAKGEPGPRGERGEAGIPGVPGAKGEDGKDGAKGEPGPRGERGEAGIPGVPGAKGEDGKDGAPGPCCGGV；
<CR1; DNA; SEQ ID NO:2>：
CCATGGCTGGTGCAAAAGGCGAACCGGGTCCGCGTGGTGAACGCGGTGAAGCAGGTATTCCGGGTGTGCCGGGCGCAAAAGGCGAGGATGGTAAAGATGGTGCAAAAGGTGAACCGGGTCCTCGCGGTGAACGTGGCGAAGCCGGCATTCCGGGTGTTCCGGGCGCCAAAGGCGAAGATGGTAAAGACGGTGCAAAAGGAGAACCGGGCCCGCGTGGTGAGCGTGGTGAAGCTGGCATTCCGGGCGTTCCGGGTGCAAAAGGGGAAGATGGCAAAGATGGTGCGAAAGGTGAACCTGGTCCGCGCGGCGAACGTGGTGAAGCAGGCATTCCGGGAGTGCCGGGTGCAAAGGGTGAAGATGGTAAGGATGGTGCCAAAGGCGAGCCGGGTCCGCGCGGTGAACGCGGCGAGGCAGGTATTCCTGGCGTGCCGGGTGCGAAAGGCGAAGACGGTAAAGATGGCGCAAAAGGTGAGCCGGGCCCGCGCGGTGAGCGTGGCGAGGCAGGCATTCCTGGCGTTCCGGGCGCAAAGGGTGAGGATGGTAAGGACGGTGCAAAGGGCGAACCGGGCCCTCGCGGTGAGAGAGGTGAAGCAGGAATTCCGGGTGTCCCGGGCGCAAAAGGAGAGGATGGCAAAGACGGTGCGAAAGGAGAACCTGGCCCGCGTGGCGAACGCGGTGAGGCAGGTATCCCGGGTGTGCCTGGTGCCAAAGGTGAAGATGGCAAGGATGGCGCCAAAGGTGAGCCTGGCCCGCGCGGCGAGCGTGGTGAGGCAGGCATACCGGGCGTTCCTGGCGCAAAAGGGGAGGATGGTAAAGATGGAGCCAAAGGCGAACCTGGCCCTCGTGGCGAACGTGGCGAGGCTGGTATTCCGGGCGTGCCGGGAGCCAAAGGTGAAGACGGTAAGGATGGCGCACCGGGTCCGTGTTGTGGTGGCGTGTAACTCGAG；
<CR2; AA; SEQ ID NO:3>：
GERGETGPPGPAGFPGAPGQNGEPGGKGERGAPGEKGEGGPPGERGETGPPGPAGFPGAPGQNGEPGGKGERGAPGEKGEGGPPGERGETGPPGPAGFPGAPGQNGEPGGKGERGAPGEKGEGGPPGERGETGPPGPAGFPGAPGQNGEPGGKGERGAPGEKGEGGPPGERGETGPPGPAGFPGAPGQNGEPGGKGERGAPGEKGEGGPPGERGETGPPGPAGFPGAPGQNGEPGGKGERGAPGEKGEGGPPGERGETGPPGPAGFPGAPGQNGEPGGKGERGAPGEKGEGGPPGERGETGPPGPAGFPGAPGQNGEPGGKGERGAPGEKGEGGPPGERGETGPPGPAGFPGAPGQNGEPGGKGERGAPGEKGEGGPPGERGETGPPGPAGFPGAPGQNGEPGGKGERGAPGEKGEGGPPGAPGPCCGGV；
<CR2; DNA; SEQ ID NO:4>：
CCATGGCTGGTGAACGTGGTGAAACAGGTCCGCCTGGTCCTGCAGGTTTTCCGGGTGCACCTGGTCAAAATGGTGAACCGGGTGGTAAAGGTGAACGTGGTGCACCGGGTGAAAAAGGTGAAGGTGGTCCGCCGGGTGAACGTGGTGAAACCGGTCCTCCTGGTCCGGCAGGTTTTCCGGGTGCACCTGGTCAAAATGGTGAACCGGGTGGTAAAGGTGAACGTGGTGCACCGGGTGAAAAAGGTGAAGGTGGTCCGCCGGGTGAACGTGGTGAAACAGGTCCTCCTGGTCCGGCAGGTTTTCCGGGTGCACCTGGTCAAAATGGTGAACCGGGTGGTAAAGGTGAACGTGGTGCACCGGGTGAAAAAGGTGAAGGTGGTCCGCCGGGTGAACGTGGTGAAACCGGTCCTCCTGGTCCGGCAGGTTTTCCTGGTGCACCTGGTCAAAATGGTGAACCGGGTGGTAAAGGTGAACGTGGTGCACCGGGTGAAAAAGGTGAAGGTGGTCCGCCGGGTGAACGTGGTGAAACAGGTCCTCCTGGTCCGGCAGGTTTTCCTGGTGCACCTGGTCAAAATGGTGAACCGGGTGGTAAAGGTGAACGTGGTGCACCGGGTGAAAAAGGTGAAGGTGGTCCGCCGGGTGAACGTGGTGAAACAGGTCCTCCTGGTCCTGCAGGTTTTCCGGGTGCACCTGGTCAAAATGGTGAACCGGGTGGTAAAGGTGAACGTGGTGCACCGGGTGAAAAAGGTGAAGGTGGTCCGCCGGGTGAACGTGGTGAAACAGGTCCTCCGGGTCCGGCAGGTTTTCCTGGTGCACCTGGTCAAAATGGTGAACCGGGTGGTAAAGGTGAACGTGGTGCACCGGGTGAAAAAGGTGAAGGTGGTCCGCCGGGTGAACGTGGTGAAACAGGTCCTCCTGGTCCGGCAGGTTTTCCTGGTGCACCTGGTCAAAATGGTGAACCGGGTGGTAAAGGTGAACGTGGTGCACCGGGTGAAAAAGGTGAAGGTGGTCCGCCGGGTGAACGTGGTGAAACAGGTCCTCCTGGTCCGGCAGGTTTTCCGGGTGCACCTGGTCAAAATGGTGAACCGGGTGGTAAAGGTGAACGTGGTGCACCGGGTGAAAAAGGTGAAGGTGGTCCGCCGGGTGAACGTGGTGAAACAGGTCCTCCTGGTCCTGCAGGTTTTCCGGGTGCACCTGGTCAAAATGGTGAACCGGGTGGTAAAGGTGAACGTGGTGCACCGGGTGAAAAAGGTGAAGGTGGTCCGCCGGGTGCACCGGGTCCGTGTTGTGGTGGTTAACTCGAG；
<CR3; AA; SEQ ID NO:5>：
GERGPPGPMGPPGLAGPPGESGREGAPGERGPPGPMGPPGLAGPPGESGREGAPGERGPPGPMGPPGLAGPPGESGREGAPGERGPPGPMGPPGLAGPPGESGREGAPGERGPPGPMGPPGLAGPPGESGREGAPGERGPPGPMGPPGLAGPPGESGREGAPGERGPPGPMGPPGLAGPPGESGREGAPGERGPPGPMGPPGLAGPPGESGREGAPGERGPPGPMGPPGLAGPPGESGREGAPGERGPPGPMGPPGLAGPPGESGREGAPGAPGPCCGGV；
<CR3; DNA; SEQ ID NO:6>：
CCCATGGCTGGTGAACGTGGTCCGCCGGGTCCGATGGGCCCTCCTGGTTTAGCAGGTCCGCCGGGCGAAAGCGGCCGCGAGGGTGCACCTGGTGAACGTGGCCCGCCGGGTCCTATGGGCCCTCCGGGTTTAGCAGGCCCGCCGGGCGAGAGTGGTCGTGAAGGTGCACCGGGTGAACGCGGTCCGCCGGGACCTATGGGCCCACCTGGTCTGGCCGGCCCTCCTGGCGAAAGTGGCCGTGAAGGTGCGCCGGGTGAACGTGGACCGCCGGGTCCAATGGGTCCGCCTGGTCTGGCGGGCCCTCCTGGAGAAAGTGGCCGCGAAGGTGCCCCGGGTGAACGGGGTCCTCCGGGTCCTATGGGTCCGCCAGGTCTGGCAGGCCCGCCTGGTGAAAGTGGCCGGGAAGGTGCCCCTGGTGAACGCGGACCGCCGGGCCCTATGGGTCCTCCTGGTCTGGCTGGTCCGCCGGGGGAAAGTGGCAGAGAAGGCGCACCGGGTGAGCGTGGCCCGCCTGGCCCTATGGGACCTCCTGGTCTTGCCGGCCCGCCGGGAGAAAGCGGTCGTGAAGGCGCACCTGGCGAACGCGGTCCTCCGGGCCCTATGGGCCCGCCTGGATTAGCCGGCCCGCCTGGGGAAAGCGGCCGTGAGGGTGCTCCGGGTGAAAGAGGTCCGCCGGGCCCAATGGGCCCGCCGGGGCTGGCAGGTCCTCCTGGCGAGTCAGGTCGCGAAGGTGCGCCTGGCGAACGTGGTCCTCCGGGACCTATGGGTCCACCGGGCCTGGCTGGTCCTCCGGGGGAGAGCGGTCGTGAGGGTGCACCAGGTCCGTGCTGTGGCGGTGTTTAACTCGAG；
<麦芽糖结合蛋白(MBP)融合标签; AA; SEQ ID NO:7>：
MKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQT；
<半胱氨酸蛋白酶(CPD)融合标签; AA; SEQ ID NO:8>：
MALADGKILHNQNVNSWGPITVTPTTDGGETRFDGQIIVQMENDPVVAKAAANLAGKHAESSVVVQLDSDGNYRVVYGDPSKLDGKLRWQLVGHGRDHSETNNTRLSGYSADELAVKLAKFQQSFNQAENINNKPDHISIVGCSLVSDDKQKGFGHQFINAMDANGLRVDVSVRSSELAVDEAGRKHTKDANGDWVQKAENNKVSLSWDAQG；
<谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合标签; AA; SEQ ID NO:9>：
MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPK；
<本载脂蛋白格A1 (APOI)融合标签; AA; SEQ ID NO:10>：
MLKLLDNWDSVTSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMSKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDRARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHLSTLSEKAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ；
<硫氧还蛋白(TrxA)融合标签; AA; SEQ ID NO:11>：
MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLA；
<绿色荧光蛋白(GFP)融合标签氨基酸SEQ ID NO:12>：
MSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVRGEGEGDATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSVLSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHG；
<烟草蚀纹病毒酶切序列(TEV); AA; SEQ ID NO:13>：
ENLYFQG；
<凝血酶切序列(thrombin); AA; SEQ ID NO:14>：
LVPRGS；
<肠激酶切序列(EK); AA; SEQ ID NO:15>：
DDDDK；
<因子Xa酶切序列(Factor-Xa); AA; SEQ ID NO:16>：
IEGR；
<鼻病毒3C酶切序列(HRV3C); AA; SEQ ID NO:17>：
LEVLFQGP。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1) 本发明采用基因重组技术制得了一种重组胶原重复序列蛋白，选择人体来源的I型和III型胶原蛋白序列作为重复序列，与动物来源的I型胶原蛋白相比，具有无病毒传播隐患、低免疫原性等优点。
(2) 本发明采用辛烯基琥珀酸酐对蛋白进行酰化改性，改性后的蛋白既有亲水基团又有疏水基团，具有良好的水溶性、表面活性以及热稳定性也增强，蛋白酰化后促进细胞迁移的性能也增强，且不会破坏胶原蛋白二聚体结构，操作简单，原料易得，且在pH为9的缓冲液中进行反应，避免了反应过程中产生的羧酸导致反应体系的 pH 值下降，从而使反应速率降低的现象。
(3) 本发明所得一种重组胶原重复序列蛋白，可形成具有胶原特性的二聚体结构和(Gly-X-Y)n重复氨基酸序列。
(4) 本发明采用的pET32a(+)载体包含组氨酸标签、融合标签和蛋白酶切割位点的氨基酸序列，便于蛋白质的纯化；采用不同种类的大肠杆菌表达菌株进行重组胶原重复序列蛋白的表达，蛋白表达量高；采用酶切除重组胶原重复序列蛋白带有的融合标签，得到的蛋白纯度较高。
(5) 本发明得到的重组胶原重复序列蛋白具有促进细胞迁移的活性，活性高于锦波的重组胶原蛋白HC16，皮肤修复效果好，可广泛应用于促进细胞迁移活性产品和皮肤修复产品的制备。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为重组胶原重复序列蛋白的SDS-PAGE鉴定图；
图2为重组胶原重复序列蛋白的二级结构测定图；
图3为一种重组胶原重复序列蛋白的热稳定性测定图；
图4为一种重组胶原重复序列蛋白的细胞划痕恢复情况图；
图5为一种重组胶原重复序列蛋白细胞划痕恢复率图。
图1中，1：未诱导细胞裂解液；2：诱导细胞沉淀；3：诱导细胞上清液；4：诱导细胞上清镍柱洗脱液；a：带融合标签的CR1溶液；b：EK酶切融合标签蛋白溶液；c：镍柱纯化后的CR1溶液。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明，但本发明并不仅限于以下的实施例。
需要说明的是，无特殊说明外，本发明中涉及到的化学试剂均通过商业渠道购买。
实施例1：重组胶原重复序列蛋白的表达和纯化：
(1) 合成重组胶原重复序列蛋白CR1的DNA序列；
(2) 将步骤(1)所述DNA序列进行密码子优化后，拼接重组到pET32a(+)表达载体(融合标签为TrxA，蛋白酶切割位点序列为EK)上，酶切位点为NcoI和XhoI，于转化平板上转化三种大肠杆菌感受态细胞：BL21(DE3)、BL21(DE3)+HSP60和Shuffle T7，构建重组基因工程菌；
(3) 从转化平板上选出单斑克隆菌，采用50 mL LB 培养基(含100 mg/L氨苄)，在37℃条件下过夜培养；
(4) 按照1:40的比例将步骤(3)所述单斑克隆菌转接至2 L LB培养基(含100 mg/L氨苄)中，37℃条件下培养至600nm波长处的吸光值(OD600)为0.5，其中，Shuffle的大肠杆菌表达株在30℃条件下培养，加入0.5 mM IPTG在20℃条件下诱导蛋白的表达，得到诱导菌液，同时设置未添加IPTG组，得到未诱导菌液；
(5) 将步骤(4)所述诱导菌液经7000 rpm离心10 min，收集菌体，将菌体沉淀加入10 mM咪唑PBS溶液(pH7.5)重悬，高压破碎细菌，4°C，11000 rpm离心15 min，得到诱导细胞沉淀和诱导细胞上清液，将诱导细胞上清液与平衡好的5 mL镍柱孵育，重力洗脱，用10 mMPBS溶液(pH7.5)洗去杂蛋白，300 mM咪唑的PBS溶液(pH7.5)进行洗脱，超滤管超滤进行浓缩并除去咪唑，得到诱导细胞上清镍柱洗脱液，将通过3种菌制得的诱导细胞上清镍柱洗脱液混合，制得带融合标签的CR1溶液；
(6) 将步骤(4)所述未诱导菌液经7000 rpm离心10 min，得到未诱导细胞沉淀，将未诱导细胞沉淀加入10 mM咪唑PBS溶液(pH7.5)重悬，高压破碎细菌，4°C，11000 rpm离心15 min，取上清，得到未诱导细胞裂解液；
(7) 按1 mg:2 U的比例向带融合标签的CR1溶液中加入肠激酶，4℃过夜反应，SDS-PAGE检测反应完全，得到EK酶切融合标签蛋白溶液，与镍柱孵育，除掉标签蛋白和酶，得到镍柱纯化后的CR1溶液，即改性前重组胶原重复序列蛋白CR1溶液；
(8) 将步骤(7)所得镍柱纯化后的CR1溶液于磷酸盐缓冲溶液(pH=9.0)在4°C透析3 d，按体积比10:1的比例加入含有辛烯基琥珀酸酐的二甲基亚砜，每毫升二甲基亚砜加入20 mg辛烯基琥珀酸酐，反应体系在15°C下搅拌4 h后，在4°C下与去离子水透析3 d，制得重组胶原重复序列蛋白CR1溶液；
(9) 将未诱导细胞裂解液、诱导细胞沉淀、诱导细胞上清液、诱导细胞上清镍柱洗脱液、带融合标签的CR1溶液、EK酶切融合标签蛋白溶液、镍柱纯化后的CR1溶液进行SDS-PAGE检测，考马斯亮蓝染色。
图1显示3种不同菌体诱导表达后制备得到的重组胶原重复序列蛋白，纯化后为单一条带，表明成功制备高纯度的重组胶原重复序列蛋白CR1。
实施例2 ：重组胶原重复序列的二级结构测定：
将实施例1制得的重组胶原重复序列蛋白CR1溶于PBS (pH7.5)溶液，配置成2 mg/mL的母液。PBS (pH7.5)溶液做空白校准仪器，扫描波长190 nm-250 nm，实验温度25℃，母液使用纯水稀释到合适的浓度，检测样品190 nm-250 nm范围内的CD值。Origin 2021进行数据分析，拟合曲线，样品浓度为0.6 mg/mL。
图2结果显示，非还原loading溶液可见CR1二聚体条带。重组胶原重复序列蛋白CR1在190 nm-216 nm有负峰，波谷为205 nm附近；在217 nm- 239 nm有正峰，波峰为222 nm附近。表明重组胶原重复序列蛋白CR1会形成一定比例的二聚体，改性不会破坏胶原蛋白的二聚体结构。
实施例3：重组胶原重复序列蛋白的热稳定性：
将冷冻干燥的改性前、后重组胶原重复序列蛋白CR1各5 mg分别密封在坩埚中。然后，通过热重分析仪(Netzsch TG 209F1，德国)在氮气气氛下以5℃/min的加热速率从100℃至600℃测定样品剩余重量占初始重量的百分比，结果如图3所示。改性前后CR1的残余重量分别为初始重量的33%和39%。表明通过辛烯基琥珀酸酐改性后，重组胶原重复序列蛋白具有较高的热稳定性。
实施例4：重组胶原重复序列蛋白促进细胞迁移活性：
马克笔在12孔板背后，用直尺均匀划横线，每孔画 3条线。每孔加入约5*104个BALB/c 3T3细胞，培养过夜使细胞贴壁。第二天用无菌枪头对比横线划细胞，用PBS洗3次，去除划下的细胞，加入无血清的DMEM培养基，设置对照组、重组胶原重复序列蛋白CR1、重组全长III型胶原、HC16 (锦波)和改性前重组胶原重复序列蛋白CR1的实验组(30 μg/mL)，细胞放回培养箱。按 0、 6、 12、 24 小时取样拍照。每组设置3个重复孔，每孔选择9个点进行统计。
如图4所示，相比于空白对照组，所述重组胶原重复序列蛋白CR1、重组全长III型胶原和改性前重组胶原重复序列蛋白CR1均表现出良好的促细胞迁移效果。图5显示，作用24小时，30 μg/mL重组全长III型胶原(划痕恢复率为51%)、重组胶原重复序列蛋白CR1 (划痕恢复率为32%)和改性前重组胶原重复序列蛋白CR1实验组(划痕恢复率为22%)与对照组(划痕恢复率为12%)相比，表现出明显促进细胞迁移的活性(有统计学差异)，HC16 (锦波，划痕恢复率为13%)与对照组比无显著差异，表明本发明的蛋白序列具有更高的促进细胞迁移活性，通过辛烯基琥珀酸酐改性的蛋白促进细胞迁移的能力更强。****表示有统计学意义的极显著差异。
实施例5：重组胶原重复序列蛋白皮肤修复效果：
将体重300 g左右的成年雄性大鼠随机分为4组，第1组为空白对照组，第2-4组为实验组，每组10只， 将大鼠麻醉后固定四肢，消毒后在背部距脊柱左侧2 cm、距前肢根部2.5 cm处做一直径5 mm的皮肤伤口。将实施例1制得的重组胶原重复序列蛋白CR1溶液，于60°C、绝对压强0.08MPa的条件下浓缩至原体积的20％，通过喷雾干燥制成胶原蛋白粉末，取1 g胶原蛋白粉末与1 L水混合均匀，制成皮肤修复溶液，实验组每天在皮肤伤口处涂抹2mL本发明皮肤修复溶液；空白对照组每天涂抹2 mL的蒸馏水。每天同一时间清创换药，7 d后，统计各组伤口愈合率，结果如下：
表1 伤口愈合率测试结果
表1显示本发明一种重组胶原蛋白重复序列蛋白，可有效促进伤口愈合，皮肤修复效果较好。
以上实验结果表明，本发明制备的重组胶原重复序列蛋白具有胶原蛋白特征性的二聚体结构和(Gly-X-Y)n重复氨基酸序列；本发明制备的重组胶原重复序列蛋白具有人III型胶原蛋白重要的功能位点，表现出良好的生物相容性和生物活性，可以显著促进细胞的增殖、黏附和迁移；本发明采用辛烯基琥珀酸酐对蛋白进行改性，提高了重组胶原重复序列蛋白的热稳定性和促进细胞迁移活性；本发明通过基因工程菌表达制备重组胶原重复序列蛋白，工艺简单方便，易于实现工业化生产；本发明制备的高生物活性的重组胶原重复序列蛋白，可广泛应用于制备促进细胞迁移活性产品和皮肤修复产品等领域。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本发明的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
本发明旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1. 一种重组胶原重复序列蛋白CR1，其特征在于，所述CR1由310个氨基酸组成，基本重复单元为：GAKGEPGPRGERGEAGIPGVPGAKGEDGKD，来自人III型胶原蛋白438~467的肽段，C端含有III型胶原1191-1200片段， 氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，DNA序列如SEQ ID NO:2所示；
所述重组胶原重复序列蛋白的表达方法，包括如下步骤：
(1) 合成重组胶原重复序列蛋白CR1的DNA序列；
(2) 将步骤(1)所述DNA序列进行密码子优化后，拼接重组到表达载体上，酶切位点为NcoI和XhoI，于转化平板上转化细菌，构建重组基因工程菌；
(3) 从转化平板上选出单斑克隆菌，采用50 mL含100 mg/L氨苄的LB培养基，在37℃条件下过夜培养；
(4) 按照1:40的比例将步骤(3)所述单斑克隆菌转接至2 L含100 mg/L氨苄 的LB培养基中，37℃条件下培养至600 nm波长处的OD600为0.4-0.6，其中，采用Shuffle T7大肠杆菌时，培养温度为30℃，加入0.5 mM IPTG在20℃条件下诱导蛋白的表达，得到混合菌液；
(5) 将步骤(4)所述混合菌液经7000 rpm离心10 min，收集菌体，菌体沉淀加入pH7.5的咪唑PBS溶液10 mM重悬，高压破碎细菌，4°C，11000 rpm离心15 min，取上清与平衡好的5mL镍柱孵育，重力洗脱，用pH7.5的PBS溶液10 mM洗去杂蛋白，pH7.5的咪唑PBS溶液300 mM进行洗脱，超滤管超滤进行浓缩并除去咪唑，得到前体重组胶原重复序列蛋白的PBS溶液；
(6) 按1 mg:2 U的比例向前体重组胶原重复序列蛋白PBS溶液加入蛋白酶，4℃过夜反应，SDS-PAGE检测反应完全，蛋白混合溶液与镍柱孵育，除掉标签蛋白和酶，即得改性前重组胶原重复序列蛋白溶液；
(7) 将步骤(6)所得改性前重组胶原重复序列蛋白溶液于pH=9.0的磷酸盐缓冲溶液中，在4°C透析3 d，按体积比10:1的比例加入含有辛烯基琥珀酸酐的二甲基亚砜，每毫升二甲基亚砜加入20 mg辛烯基琥珀酸酐，15°C下搅拌4 h后，在4°C下与去离子水透析3 d，制得重组胶原重复序列蛋白溶液；
所述表达载体为包含组氨酸标签、融合标签和蛋白酶切割位点的氨基酸序列的pET32a(+)，细菌为大肠杆菌；
所述融合标签为麦芽糖结合蛋白、半胱氨酸蛋白酶、谷胱甘肽巯基转移酶、本载脂蛋白格A1、硫氧还蛋白、绿色荧光蛋白、杂交融合标签中的一种，所述蛋白酶切割位点序列为烟草蚀纹病毒酶切序列、凝血酶切序列、肠激酶切序列、因子Xa酶切序列、鼻病毒3C酶切序列中的一种；
所述本载脂蛋白格A1的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；
所述大肠杆菌为BL21 (DE3)、BL21 (DE3) pLysS、BL21Star (DE3)、BL21Star (DE3)pLysS、Rosetta (DE3)、Rosetta (DE3) pLysS、OrigamiB (DE3)、OrigamiB (DE3) pLysS、SHuffle T7、BLR (DE3)、BLR (DE3) pLysS、B834 (DE3)、 B834 (DE3) pLysS、BL21(DE3)+HSP60中的一种。
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