KR0177300B1

KR0177300B1 - 재조합 인 에리트로포이에틴의 정제방법

Info

Publication number: KR0177300B1
Application number: KR1019960001484A
Authority: KR
Inventors: 박정배; 정지영; 안용호; 박순재
Original assignee: 성재갑; 주식회사엘지화학
Priority date: 1996-01-24
Filing date: 1996-01-24
Publication date: 1999-04-01
Also published as: KR970059186A

Abstract

본 발명은 재조합 인 에리트로포이에틴(recombinant humanerythropoietin)의 정제방법에 관한 것으로, 인 에리트로포이에틴이 발현된 동물세포 배양액을 염료 친화성 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피함으로써 인 에리트로포이에틴을 고순도로 정제할 수 있다.

Description

재조합 인 에리트로포이에틴의 정제방법

제1도는 인 에리트로포이에틴을 함유하는 세포 배양액을 염료(dye) 친화성 크로마토그래피한 결과이다.

제2도는 인 에리트로포이에틴을 함유하는 세포 배양액을 염료 친화성 크로마토그래피로한 분획을 양이온 교환 크로마토그래피한 결과이다.

제3도는 인 에리트로포이에틴을 함유하는 세포 배양액을 염료 친화성 크로마토그래피한 후 양이온 교환 크로마토그래피로하여 얻은 분획을 겔 여과 크로마토그래피한 결과이다.

제4도는 인 에리트로포이에틴을 함유하는 세포 배양액의 각 정제과정에서 얻어진 분확들을 12% 소듐도데실설페이이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)하여 전개한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 재조합 인 에리트로포이에틴(recombinant humanerythropoietin)의 정제방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 중국 햄스터 난소 세포(Chinese hamster ovary(CHO) cel1)에서 발현시킨 유전자 재조합 인 에리트로포이에틴을 10% FBS(fetal bovine serum)을 함유하고 있는 IMDM 배지로부터 고순도로 정제하는 방법에 관한 것이다.

에리트로포이에틴은 주로 신장에서 생성되는 당단백질 호르몬으로 적혈구 전구세포의 증식 및 분화에 관여함으로써 적혈구 조혈작용을 한다. 정상인의 혈액내에는 약 100ng/ℓ의 극미량이 존재하나 빈혈환자나 저산소증 상태에서는 그 생산이 촉진되어 최고 1000배까지 증가하기도 한다. 천연 및 재조합 인 에리트로포이에틴은 165개의 아미노산으로 이루어져 있으며, 전체 단백질 분자량의 약 30 내지 40%에 이르는 많은 양의 당을 가지고 있어 에리트로포이에틴의 생리활성 발현에 중요한 역할을 한다. 에리트로포이에틴 유전자를 곤충 세포나 효모 또는 박테리아에서 발현시켰을 경우에는 당화가 부족한 산출물을 만들어 내며, 이는 생리활성을 거의 갖지 않는다. 이 때문에 재조합 인 에리트로포이에틴은 포유동물세포의 일종인 중국 햄스터 난소(CHO)세포에서 주로 생산되고 있는 실정이다.

인 에리트로포이에틴은 1977년 미야케 등에 의해 재생불량성 빈혈 환자의 뇨에서 최초로 정제되었다(Miyake, T., et al., J. Biol. Chem. 252(15), 5558(1977)). 고순도로 정제된 에리트로포이에틴은 만성 신부전 환자에게 나타나는 빈혈, 화학요법을 받는 암환자에게 나타나는 빈혈, 수술이행환자의 자기혈 저혈 등의 치료에 사용되는 등 적응증의 범위가 확대되면서 그 효용가치가 점차 증대되고 있지만, 천연에서는 임상적으로 사용할 만큼 많은 양을 얻기가 쉽지 않다.

1985년 제이콥스 등(Jacobs, K., et al., Nature, 313, 806(1985))과 린 등(Lin, F. K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 7580(1985))은 인 에리트로포이에틴의 유전자를 찾아내어 유전자 조작을 통해 재조합한 후 포유 동물 세포에서 발현시킨 재조합 인 에리트로포이에틴이 천연형과 거의 유사한 물리화학적 성질 및 조혈 활성을 지니고 있음을 밝혀내었다. 이에 따라 재조합 인 에리트로포이에틴의 대량 생산이 가능하게 되었으며, 1989년 미국 FDA에서 만성 신부전에 기인한 빈혈의 치료용으로 사용 허가를 받아 임상에서 사용되고 있다. 본 출원인도 재조합 인 에리트로포이에틴을 대량 생산할 수 있는 새로운 제조방법을 개발하여 특허출원한 바 있다(대한민국 특허 출원 제94-12082호).

유전자 재조합 기술에 의해 대량 생산된 재조합 인 에리트로포이에틴을 임상적으로 사용하기 위해서는 고순도로 정제하는 것이 중요하다. 효모나 박테리아에서 주로 발현되어온 종래의 단백질 의약품과는 달리, 포유 동물세포에서 생산되는 재조합 인 에리트로포이에틴의 정제를 위해서는 동물세포 유래의 독특한 단백질 뿐만 아니라 배지에 포함되어 있는 FBS(소 태아 혈청)를 효율적으로 제거할 수 있는 정제방법의 개발이 필요하다.

지금까지 알려진 에리트로포이에틴의 정제방법으로는 인뇨에서 정제하는 방법(대한민국 특허 공고번호 83-368)과 역상 액체 크로마토그래피를 이용하는 방법(대한민국 특허 공고번호 93-003665), 단일항체 흡착법 등이 있다.

그러나, 인뇨에서 정제하는 방법으로는 산업적으로 이용할 수 있는 충분한 양을 얻기 힘들고, 역상 액체 크로마토그래피를 이용하는 방법은 정제과정중 유기용매를 사용하기 때문에 단백질의 안정성을 해칠 우려가 있어 적절한 정제법이 되지 못하고, 단일 항체 흡착법은 정제에 필요한 대량의 단일항체를 상업적으로 용이하게 이용할 수 없으므로 보편적으로 널리 사용할 수 있는 정제법이 아니다.

이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하고 재조합 에리트로포이에틴을 고순도로 정제하기 위한 방법을 연구한 결과, 인 에리트로포이에틴이 발현, 생산된 중국 햄스터 난소 세포의 배양액으로부터 염료 친화성 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피를 수행하여 재조합 인 에리트로포이에틴을 고순도로 안정하게 정제할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 중국 햄스터 난소 세포에서 발현시킨 재조합 인 에리트로포이에틴을 고순도로 안정하게 대량 정제하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 인 에리트로포이에틴이 발현된 동물세포 배양액을 염료 친화성 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 및 겔 여과 크로마토그래피하는 단계를 포함하는 재조합 인 에리트로포이에틴의 정제방법을 제공한다.

본 발명의 정제 방법에서는 인 에리트로포이에틴이 포함된 배양액을 먼저 염료 친화성 크로마토그래피하여 배양액내 혈청 단백질을 제거하고, 양이온 교환 크로마토그래피함으로써 다른 단백질 및 계면활성제를 제거하고, 이어서 겔 여과 크로마토그래피를 통해 분자량이 다른 기타 단백질 및 펩티드 등을 효과적으로 제거한 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

먼저, 포유동물 세포의 일종인 종세포주(CHO dhfr-ATCCCRL9096)을 형질전환시켜 인 에리트로포이에틴을 생산하도록 제조한 후, 10% FBS를 함유하고 있는 1MDM배지(Gibco사, 미국)에서 배양하여 재조합 인 에리트로포이에틴을 포함하고 있는 배양액을 수집한다. 인 에리트로포이에틴을 함유하는 배양액에 계면활성제를 포함하는 완충용액을 첨가하면서 한외여과하여 배양액의 염 농도가 20mM 이하로 되게 한 후, 농축 및 원심분리하여 인 에리트로포이에틴을 함유하는 상등액을 얻는다.

그런 다음, 상기 상등액을 pH 6.0 내지 9.0, 바람직하게는 pH 7.5에서 염료 친화성 크로마토그래피를 실시함으로써 컬럼에 흡착되지 않는 대부분의 배양액내 혈청 단백질을 효과적으로 제거한다. 흡착된 단백질은 NaCl의 농도를 증가시키면서 용출시키고 각 분획들을 12% 소듐도데실설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)하여 에리트로포이에틴 함유 분획을 취합한다.

상기 크로마토그래피에 사용될 수 있는 염료 친화성 수지에는 레드 세파로즈 CL-6B(Red Sepharose Cl-6B; Pharmacia 사), 다이 메트렉스 레드 A(Dyematrex Red A), 다이메트렉스 오렌지 A(Dyematrex Orange A), 다이메트렉스 그린 A(Dyematrex Greex A; Amicon 사), 리액티브 레드 120(Reactive Red 120), 리액티브 옐로우 2(Reactive Yellow 2), 리액티브 옐로우 3(Reactive Yellow 3), 리액티브 옐로우 13(Reactive Yellow 13), 리액티브 옐로우 86(Reactive Yellow 86), 리액티브 그린 5(Reactive Green 5), 리액티브 그린 19(Reactive Green 19; Sigma), 미메틱 레드 2(Mimetic Red 2), 미메틱 레드 3(Mimetic Red 3), 미메틱 오렌지 1(Mimetic Orange 1), 미메틱 오렌지 2(Mimetic Orange 2), 미메틱 오렌지 3(Mimetic Orange 3), 미메틱 옐로우 1(Mimetic Yellow 1), 미메틱 옐로우 2(Mimetic Yellow 2) 또는 미메틱 그린 1(Mimetic Grren 1; ACL 사) 등이 포함된다. 또한, 상기 완충용액에 포함되는 계면활성제로는 트윈 20(Tween 20), 트윈 80 또는 트리톤(Triton) X-100을 사용할 수 있다.

취합한 에리트로포이에틴 함유 분획을 다시 1차 증류수를 첨가하면서 한외여과하여 농축액의 염 농도가 20mM 이하로 되게한 후 시트르산, 인산 또는 아세트산 완충액을 가하여 pH를 조정한다. 이를 pH 2.0 내지 7.0, 바람직하게는 pH 3.0 에서 양이온 교환 크로마토그래피를 실시함으로써 다른 단백질들 뿐만 아니라 완충용액중에 포함된 계면활성제를 효과적으로 제거할 수 있다. 흡착된 단백질은 NaCl 농도를 증가시키면서 용출시키고 각 분획들을 12% 소듐도데실설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)하여 에리트로포이에틴이 함유된 분획을 취합한다. 이때 양이온 교환수지로는 설포프로필(SP), 설포닐(S) 또는 카복시메틸(CM)기를 작용기로 하는 수지를 사용할 수 있으며, 예를 들어 SP 쎄파로즈 패스트 플로우(SP Sepharose Fast Flow; Pharmacia사)가 있다.

상기 과정에서 얻은 에리트로포이에틴을 포함하는 분획에 2M 트리즈마 염기 용액을 가하여 pH를 조정한 후 농축하고, 농축액을 PBS(phosphate buffer saline, pH 7.1)로 평형화된 겔 여과 컬럼에 크로마토그래피함으로써 정제된 재조합 인 에리트로포이에틴을 얻을 수 있다. 겔 여과 크로마토그래피를 통하여 에리트로포이에틴과 분자량이 다른 기타 단백질 뿐 아니라, 내독소(endotoxin), 각종 시약 및 펩타이드 등을 효과적으로 제거할 수 있다. 이때 겔 수지로는 세파크릴 S-100(Sephacryl S-100), 세파크릴 S-200 또는 세파크릴 S-300(Pharmacia 사)을 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들 만으로 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

[재조합 인 에리트로포이에틴의 정제]

[단계 1] 인 에리트로포이에틴을 함유하는 세포 배양액의 제조

인 에리트로포이에틴의 유전자 염기 서열을 지닌 벡터 pMI-EPO60(대한민국 특허 출원 제94-12082호, 기탁 번호 KCTC0110BP)로부터 유전자 재조합 방법으로 벡터 pMI-EP070-BiP-DHFR을 제조하였다(KCTC 0220BP(1995. 12. 20); CHO BIP 10-9-27). 이를 포유동물 세포의 일종인 종세포주(CHO dhfr-ATCC CRL9096)에 형질전환시켜 인 에리트로포이에틴을 생산하는 세포주를 제조하였다. 이 형질 전환된 CHO 세포를 10% FBS를 함유하고 있는 IMDM 배지(Gibco사, 미국)에 접종하여 37℃, 5% 이산화탄소 존재하에서 배양하였다. 발현된 재조합 인 에리트로포이에틴을 포함하고 있는 배양액 50ℓ를 수집하여 완충 용액 I(20mM 트리스-HCl, pH 7.5, 0.05% 트윈 20)을 첨가하면서 한외여과기(S10Y10 ultrafiltration cartridge, Amicon사)로 희석농축하여, 최종적으로 희석농축 배양액의 부피가 2ℓ, 염 농도는 20mM이 되게 하였다. 이 용액을 원심분리기(J2-21M, Rotor JA-10, Beckman사)로 원심분리(8500rpm, 20분)하여 인 에리트로포이에틴을 함유하는 상등액을 얻었다.

[단계 2] 염료 친화성 크로마토그래피

상기 단계 1에서 얻어진 용액 2ℓ를 완충용액 I로 평형화된 염료 친화성 컬럼(10㎝×25㎝)에 가하였다. 컬럼에 흡착되지 않은 단백질 및 기타 물질을 10ℓ의 완충용액 I로 씻어내고, 다시 25mM NaCl을 함유하는 완충용액 I 10ℓ로 씻어내었다. 그런 다음 25mM NaCl을 함유하는 완충용액 I 20ℓ와 1.5M NaCl을 함유하는 완충용액 I 20ℓ를 선형구배시키면서 흡착된 물질을 용출시켰다. 이때 용출 속도는 30㎖/분이며, 각 분획은 부피는 1.8ℓ로 하였다.

제1도는 상기와 같이 인 에리트로포이에틴을 함유하는 세포 배양액을 염료 친화성 크로마토그래피한 결과로서, 컬럼에서 용출되어 나오는 단백질을 280nm 파장에서 검출한 결과를 나타낸 것인데 대략 28시간대에 흡광도 0.085의 피크를 볼 수 있다. 여기에서 용출된 각 분획들을 12% 소듐도데실설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)하여 에리트로포이에틴을 함유하는 분획을 취합하였다.

[단계 3] 양이온 교환 크로마토그래피

상기 단계 2에서 얻어진 인 에리트로포이에틴 함유 분획에 증류수를 첨가하면서 한외여과기(S10Y10 ultrafiltration cartridge, Amicon사)로 희석농축하여 최종적으로 희석농축액의 부피가 1ℓ, 염 농도는 20mM이 되게 하였다. 여기에 스트르산 50밀리몰을 가한 후 묽은 수산화나트륨 용액을 가하여 희석농축액을 pH 3.0으로 조정하였다. 이를 완충용액 II(50mM 시트르산나트륨 완충액, pH 3.0)로 평형화된 양이온 교환 컬럼(5㎝×15㎝, SP Sepharose Fast Flow, Pharmacia사)에 가하였다. 컬럼에 흡착되지 않은 단백질 및 기타물질을 1ℓ의 완충용액 II로 씻어낸 다음, 1ℓ의 완충용액 II와 1.5M NaCl을 함유하는 완충용액 II 1ℓ를 선형구배시키면서 흡착된 물질을 용출시켰다. 이때 용출속도는 8ℓ/분, 각 분획은 부피는 48ℓ로 하였다.

제2도는 인 에리트로포이에틴을 함유하는 세포 배양액을 염료 친화성 크로마토그래피하여 얻은 분획을 양이온 크로마토그래피한 결과로서, 컬럼에서 용출되어 나오는 단백질을 280nm 파장에서 검출한 결과를 나타낸 것이다. 각 분획들을 SDS-PAGE하여 에리트로포이에틴 함유 분획을 취합하였다.

[단계 4] 겔 여과 크로마토그래피

상기 단계 3에서 얻어진 에리트로포이에틴 함유 분획에 트리즈마 염기 용액을 가하여 pH 7.1로 조정한 후, 한외여과기(YM10 stirred cell, Amicon사)로 농축하여 최종적으로 농축액의 부피를 50㎖가 되게 하였다. 이를 PBS(pH 7.1)로 평형화된 겔 여과 컬럼(5㎝×80㎝, Sephacryl S-100, Pharmacia사)에 크로마토그래피하여 정제된 재조합 인 에리트로포이에틴을 얻었다. 이때 용출속도는 1㎖/분, 각 분획의 부피는 10㎖로 하였다.

제3도는 인 에리트로포이에틴을 함유하는 세포 배양액을 염료 친화성 크로마토그래피한 후 양이온 교환 크로마토그래피하여 얻은 분획을 겔 여과 크로마토그래피한 결과로서, 컬럼에서 용출되어 나오는 단백질을 280nm 파장에서 검출한 결과를 나타낸 것이다. 각 분획들을 SDS-PAGE하여 에리트로포이에틴 함유 분획을 취합하였다.

제4도는 인 에리트로포이에틴을 함유하는 세포 배양액의 정제 중 상기 단계 2 내지 4의 각 과정에서 얻어진 분획들을 12% 소듐도더실설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)하여 전개한 결과를 나타낸 것이다. 제1열과 제6열은 표준 단백질 분자량 표지로서 위로부터 각각 94, 66, 43, 30, 21.5, 14.4 kd의 분자량을 표시하며, 제2열은 발효 배지를 전개한 것이고, 제3열은 염료 친화성 크로마토그래피로부터 용출된 분획이며, 제4열은 양이온 교환 크로마토그래피로부터 용출된 분획이고, 제5열은 겔 여과 크로마토그래피로부터 용출된 분획이다. 여기에서 보듯이 본 발명에 따라 정제된 재조합 인 에리트로포이에틴은 SDS-PAGE 상에서 34 내지 42kd에 걸쳐 넓은 밴드를 나타내는데 이것은 당화에 기인한 결과이다. 공지의 희석방법에 따라 은착색법으로 발색한 결과 약 99%의 순도를 나타내었다.

[실시예 2]

[정제된 재조합 인 에리트로포이에틴의 생리활성도 측정]

정제된 재조합 인 에리트로포이에틴의 생리활성도를 측정하기 위해, 삼중수소화 티미딘 흡수를 이용한 적혈구 전구세포 증식시험법(Krystal, G., Exp. Hematol., 11, 649(1983))을 시행하였다. 이 방법은 적혈구 전구세포에 에리트로포이에틴을 처리한 후 방사선 표지물질인 삼중수소화 티미딘을 가하여 세포의 성장하는 정도를 정량화하여 측정하는 역가 결정법이다.

먼저 C57BL/6J×C3H/HeB FI 하이브리드 생쥐(Charlos River, 일본)에 페닐하이드라진을 60㎎/㎏의 비율로 이틀간 복강내 주사하였다. 2번째 주사한지 3일후 적혈구 전구세포로 가득찬 비장을 꺼내어, 생쥐 비장 세포의 농도가 1㎖당 1×10⁷세포가 되도록 세포 부유액을 만들었다. 96웰 마이크로플레이트의 각 웰에 상기 세포 부유액 50㎕와 에리트로포이에틴을 2배씩 연속 희석한 용액 50㎕를 섞은 후 37℃, 5% CO₂배양기에서 22 내지 23시간 배양하였다. 이때 에리트로포이에틴 없이 배지만 50㎕처리한 것을 대조군으로 사용하였다. 세포의 성장 정도를 측정하기 위해 삼중수소화 티미딘을 각 웰당 0.5μCi씩 처리한 후 37℃, 5% CO₂배양기에서 2 내지 3시간 동안 추가 배양하였다. 각 웰의 내용물을 세포 배양기에서 2 내지 3시간 동안 추가 배양하였다. 각 웰의 내용물을 세포 수확기를 이용하여 유리섬유 거름종이에 수확하였다. 세포가 수확된 거름종이를 신틸레이션 바이알에 담고 5㎖의 신틸레이션 용액을 넣은 후 방사선 정도를 신틸레이션 측정기로 측정하였다.

세포의 성장정도가 높을수록 DNA의 합성도 많이 일어나며, 따라서 DNA의 구성성분인 티미딘의 흡수량도 많아져서 방사선 정도가 높아지게 된다. 에리트로포이에틴의 활성과 삼중수소화 티미딘의 흡수에 의한 cpm값도 정량적으로 비례하므로 생물학적 활성을 알고 있는 표준품(영국, NlBSC 87/684 : 앰플당 127 국제 단위)과 그에 대응하는 cpm 값으로 표준 직선을 얻은 후, 본 발명에 따라 정제한 재조합 인 에리트로포이에틴의 생리활성도를 측정하였다. 그 결과 본 발명의 방법에 따라 정제된 에리트로포이에틴은 1.2×10⁵내지 1.8×10⁵IU/㎎의 비활성을 유지하는 것으로 확인이 되었다. 표준품이나 기 판매중인 에리트로포이에틴의 비활성이 1.0×10⁵내지 1.8×10⁵IU/㎎인 점을 감안할 때 본 발명에 의해 정제된 재조합 인 에리트로포이에틴은 천연형과 거의 동일한 생리활성도를 지니고 있음을 알 수 있다.

Claims

인 에리트로포이에틴이 발현된 동물세포 배양액을 염료 친화성 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피하는 단계를 포함하는 재조합 인 에리트로포이에틴의 정제방법.
제1항에 있어서, 상기 동물세포가 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 염료 친화성 크로마토그래피에서 염료 친화성 수지가 레드 세파로즈 CL-6B(Red Sepharose CL-6B), 다이메트렉스 레드 A(Dyematrix Red A), 다이메트렉스 오렌지 A(Dyematrex Orange A), 다이메트렉스 그린 A(Dyematrex Green A), 리액티브 레드 120(Reactive Red 120), 리액티브 옐로우 2(Reactive Yellow 2), 리액티브 옐로우 3(Reactive Yellow 3), 리액티브 옐로우 13(Reactive Yellow 13), 리액티브 옐로우 86(Reactive Yellow 86), 리액티브 그린 5(Reactive Green 5), 리액티브 그린 19(Reactive Green 19; Sigma), 미메틱 레드 2(Mimetic Red 2), 미메틱 레드 3(Mimetic Red 3), 미메틱 오렌지 1(Mimetic Orange 1), 미메틱 오렌지 2(Mimetic Orange 2), 미메틱 오렌지 3(Mimetic Orange 3), 미메틱 옐로우 1(Mimetic Yellow 1), 미메틱 옐로우 2(Mimetic Yellow 2) 또는 미메틱 그린 1(Mimetic Green 1)인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 염료 친화성 크로마토그래피가 계면활성제를 포함하는 완충용액을 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 계면활성제가 트윈 20(Tween 20), 트윈 80 또는 트리톤(Triton) X-100인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피에서 양이온 교환 수지가 설포프로필기, 설포닐기 또는 카복시메틸기를 작용기로 하는 수지임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피가 2.0 내지 7.0의 pH에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 겔 여과 크로마토그래피에서 상기 겔 수지가 세파크릴 S-100(Sephacryl S-100), 세파크릴 S-200 또는 세파크릴 S-300인 것을 특징으로 하는 방법.