KR100212071B1 - 활성형 인 과립구 콜로니 자극인자의 정제방법 - Google Patents

활성형 인 과립구 콜로니 자극인자의 정제방법 Download PDF

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Abstract

숙주에서 발현된 인 과립구 콜로니 자극인자를 용해하여 활성화시키고;
활성화된 상기한 용액을 산 침전법으로 처리한 후 원심분리하고;
상기한 원심분리후의 상등액을 정제하는;
공정을 포함하는 활성형 인 과립구 콜로니 정제 방법을 사용하면 공정을 단순화하고 공정 효율을 높일 수 있으며, 아울러 공정 비용을 크게 절감할 수 있다.

Description

활성형 인 과립구 콜로니 자극인자의 정제방법
제1도는 활성화 공정을 거친 인 과립구 콜로니 자극인자 봉입체 용해액의 pH를 7.0에서 4.0로 단계적으로 변화시켰을 때의 상등액을 소듐 도데실 설페이트 플리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)한 그림이다.
제2도는 활성화 공정을 거친 인 과립구 콜로니 자극인자 봉입체 용해액의 pH를 5.5로 낮추었을 때의 상등액을 역상 고속액체 크로마토그래피로 분석한 그래프이다.
제3도는 산 침전 후 상등액을 SP-세파로스 패스트 플로우(sepharose fast folw) 컬럼에 결합시킨 후 용출시킨 그래프이다.
제4도는 유안 침전물을 투석한 후 세파덱스 G-75 슈퍼파인(Sephadex G-75 superfine) 컬럼을 통과시켜 얻은 최종 정제액을 역상 고속액체 크로마토그래피로 분석한 그래프이다.
제5도는 세파덱스 G-75 슈퍼파인 컬럼을 통과시켜 얻은 활성형 인 과립구 콜로니 자극인자의 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 및 네이티브-폴리아크릴아미드 겔 전기영동한 그림이다.
[산업상 이용분야]
본 발명은 활성형 인 과립구 콜로니 자극인자의 정제 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세히는 숙주로부터 생성된 봉입체(inclusion body)형태의 인 과립구 콜로니 자극인자 (human granulocyte colony stimulating factor)를 활성화 공정을 거친후 산 침전법 및 반복적인 컬럼 크로마토그래피를 행하여 정제하는 방법에 관한 것이다.
[종래 기술]
인 과립구 콜로니 자극인자는 조혈계에 작용하는 사이토카인(cytokine)으로 골수(bone marrow)의 다기능 조혈간 세포(pluripotent hemopoietic stem cell)로부터 과립구 세포(granulocyte)와 거식 세포(Macrophage) 등으로의 분화 및 성숙을 유도 조절하며(Metcalf : The Hematopoietic colony stimulating factors, Elsever, Amsterdam, 1984), 특히 과립구 세포중 호중구 세포(neutrophile)의 증식과 활성을 촉진함으로써 (K.M. Xsebo등 : Immunobiology, 172, 175, 1986, A.M. Cohen 등 : Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84, 2484, 1987) 암화학요법에 의한 호중구 감소증, 골수이식시 호중구 증가촉진(J. Neidhart 등 : J.clin. Oncol.,7, 685, 1989, M.Bronchud 등 : Br. J. Cancer, 60, 121, 1989) 등에 임상적으로 유용하다.
종래의 인 과립구 콜로니 자극인자의 정제방법으로는 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피(K.Welte 등 : Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82, 1526, 1985, H.Nomura 등 : EMBO J., 5, 871, 1986, P.Winfield 등 : Biochem. J., 256, 213, 1988)등을 반복적으로 병용하는 방법들이 사용되어 왔다.
그러나 상기한 방법은 소규모 실험실 수준의 실험에 적합한 것일 뿐으로 공정 규모, 공정 효율 및 공정비용 등이 전혀 고려되지 않은 것으로서, 큰 규모로의 산업적 목적으로 이용하기에는 종래의 공정은 매우 복잡하며 아울러 공정 비용 또한 많이 요구된다는 문제점이 있다. 또한 임상적으로 사용하기에 적합한지의 여부, 즉 오염물질의 존재 여부의 확인이 전혀 이루어지지 않았다는 문제점을 지니고 있다.
대장균으로부터 추출한 인 과립구 콜로니 자극인자의 봉입체는 불활성형이므로 임상적으로 사용하기 위해서는 활성화 공정을 필수적으로 거쳐야만 한다. 그러나 활성화 공정을 수행함에 있어서, 중합체 또는 변이체 등의 불활성형의 인 과립구 콜로니 자극인자가 계속 잔존할 우려 및 숙주 세포인 대장균으로부터 유래된 단백질 및 DNA도 다량 포함되어 있을 우려가 있으므로 이들 불순물을 완전히 제거하여 최종 활성형 인 과립구 콜로니 자극인자만을 얻기 위하여서는 여러 단계의 정제 방법을 이용해야만 한다. 그러나 공정의 규모가 확대되는 산업적 이용의 경우, 컬럼 크로마토그래피의 규모가 커지고 그 사용 횟수가 증가되어 공정 비용에 커다란 영향을 미치게 된다는 문제점이 나타난다. 따라서 정제 공정을 단순화하여 공정 비용을 감소시키면서도 높은 순도의 인 과립구 콜로니 자극인자를 얻을 수 있는 정제 방법에 대한 요구가 있어왔다.
[본 발명의 목적]
본 발명은 상기한 종래의 정제 방법의 문제점을 해결하기 위하여 창안된 것으로서, 컬럼사용전의 활성화된 봉입체 형태의 인 과립구 콜로니 자극인자의 순도를 향상시킴으로서 기존의 방법보다 컬럼의 규모와 사용횟수가 현격히 단축된 인 과립구 콜로니 자극인자의 정제 방법을 제공하는데 그 목적을 둔다. 아울러 이에 따라 정제 공정의 효율을 상승시키고 정제 공정의 비용을 크게 절감시키는데도 그 목적을 둔다.
[발명의 구성]
본 발명은 상기한 목적을 달성하기 위하여, 제조공정에 새로이 산 침전법을 도입하였다. 산 침전법으로 처리된 조 인 과립구 콜로니 자극인자(crude hG-CSF)액은 산 침전법으로 처리하지 않은 인 과립구 콜로니 자극인자와 비교하여 그 순도가 월등히 높으므로 컬럼 크로마토그래피의 횟수를 월등히 감소시키고서도 다량의 활성형 인 과립구 콜로니 자극인자를 높은 순도로 정제하고자 하였다.
본 발명은 숙주에서 발현된 인 과립구 콜로니 자극인자 용액을 활성화시키고; 활성화된 상기한 용액을 산 침전법으로 처리한 후 원심분리하고; 상기한 원심분리후의 상등액을 정제하는; 공정을 포함하는 활성형 인 과립구 콜로니 정제 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기한 상등액의 정제는 상기한 원심분리후의 상등액을 이온교환크로마토그래피로 1차 정제하고; 상기한 1차 정제된 용액을 유안 침전법으로 처리하여 침전액을 제조하고; 상기한 침전액을 현탁시킨후 투석하여 농축액을 제조하고; 상기한 농축액을 겔 여과 크로마토그래피로 2차 정제하는; 공정을 포함하는 활성형 인 과립구 콜로니 자극인자의 정제방법으로 행하여진다.
본 발명에 있어서, 상기한 산 침전법은 상기한 인 과립구 콜로니 자극인자의 용액의 pH를 4.0∼7.0의 범위로 조절하여 침전을 형성하게 하는 방법이다.
또한 본 발명에 있어서, 상기 이온교환크로마토그래피는 40mM 인산일나트륨(pH 4.8)의 완충용액으로 평형화된 SP-세파로스 패스트 플로우수지 사용하여 행하여지며 0에서 0.3몰까지의 선형 농도 구배의 염화나트륨을 사용하여 인 과립구 콜로니 자극인자를 용출하였다.
본 발명에 있어서, 상기한 유안 침전법은 30% 황산암모늄 염을 사용하여 인 과립구 콜로니 자극인자를 침전으로 회수하는 방법이며, 상기한 현탁은 0.004% 폴리소르베이트 80이 첨가된 10mM 초산나트륨 용액(pH 4.0)을 사용하여 행하여진다.
본 발명에 있어서, 상기한 겔 여과 크로마토그래피는 세파덱스 G-75 슈퍼파인 수지를 사용하여 행하여진다.
본 발명은 대장균으로부터 추출한 봉입체를 카오트로픽제(chaotrophic agents)등으로 용해시킨 후, 활성화 공정을 통하여 활성형으로 전환시켜 얻은 인 과립구 콜로니 자극인자 봉입체 용액을 출발물질로 사용하였다. 예를 들면, 인 과립구 콜로니 자극인자를 포함하는 봉입체를 1.5∼6몰 농도의 구아니딘-염산(guanidine-HCI)용액 또는 2∼8몰 농도의 요소(urea)용액 등에 용해하여 활성화시키거나, 1몰의 수산화나트륨(NaOH)용액으로 알칼리 pH로 조절하여 용해하여 활성화시키거나, 또는 이 두 방법을 혼합한 방법으로 활성화시킨 것을 출발 물질로 사용하였다.
이 용액들내에는 활성화 공정을 수행한 후에도 완전히 활성형으로 전환되지 않은 불활성형의 인 과립구 콜로니 자극인자들이 일부 존재하고 있으며 아울러 대장균 유래 단백질도 다량 포함되어 있다. 따라서 상기 용액들로부터 활성형의 인 과립구 콜로니 자극인자만을 순수하게 정제하는 것은 많은 정제 단계를 필요로 하는 복잡한 공정이다.
그러나 본 발명에서는 산 침전법을 이용하여 인 과립구 콜로니 자극인자 봉입체 용해액으로부터 대부분의 대장균 유래 단백질과 불활성형의 인 과립구 콜로니 자극인자를 1차 제거함으로써 순도가 우수한 조 인 과립구 콜로니 자극인자를 얻었으며, 이에 따라 이후의 컬럼 크로마토그래피 공정을 단순화시킬 수 있었고 소규모의 컬럼을 통해서도 다량의 순도 높은 활성형 인 과립구 콜로니 자극인자를 회수할 수 있었다.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
활성화 공정을 거친 pH 10∼11의 인 과립구 콜로니 자극인자 봉입체 용액에 1몰 농도의 인산을 서서히 가하여 pH 4.0∼7.0으로 되게한 후 침전으로 생성된 대부분의 대장균 유래 단백질과 불활성형의 인 과립구 콜로니 자극인자를 원심분리 방법으로 제거하였다. 침전이 제거된 상등액의 순도를 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴 아미드 겔 전기영동을 행하여 확인하였다.(제1도 참조) 침전이 제거된 상등액내의 단백질 양은 처음 출발물질의 단백질 양의 1/4∼1/6 정도로 줄어들었다. 그러나 인 과립구 콜로니 자극인자의 활성은 95% 이상 유지되고 있었으므로 2∼3배 이상의 정제 효과를 나타냄을 알 수 있었다. 더불어 이때 활성형 인 과립구 콜로니 자극인자의 순도는 80% 이상이었다. 부분정제된 상등액을 여과한 후 양이온 교환수지에 결합시키고 0∼0.3몰의 염화나트륨(NaCl) 농도구배로 용출시키는 방법으로 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하였다. 양이온 크로마토그래피로부터 얻은 용출액내의 활성형 인 과립구 콜로니 자극인자의 순도는 98% 이상이었으며, 이 용출액을 유안 침전법으로 농축시켜서 이후 수행하는 과정에서의 부피를 최소화하였다. 유안 침전액을 10mM 초산나트륨(CH3COONa)용액(pH 4.0)에서 투석시킨 후 겔 여과 크로마토그래피를 수행하였는데 이때 용출되는 활성형 인 과립구 콜로니 자극인자는 99% 이상의 고순도로서 박테리아 내독소, 대장균 유래 단백질 및 DNA가 완전하게 제거되어 임상용으로 사용하기에 적합한 수준의 것이었다.
[실시예]
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 일예일뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
pH 10∼11의 활성화 공정이 끝난 인 과립구 콜로니 자극인자 봉입체 용해액 150L에 1몰 농도의 인산용액을 적당히 가하여 pH가 5.5로 되게 한 후, 이때 생성된 침전을 10,000g에서 10분 동안 원심 분리하여 제거하고 상등액만을 회수하였다. 역상 고속 액체 크로마토그래피를 행하여 회수된 상등액의 순도를 확인하였다.(제2도 참조)
회수된 상등액의 정제효율은 하기 표 1과 같았다.
[실시예 2]
40mM 인산일나트륨(NaHPO) 완충용액(pH 4.8)으로 평형화시킨 SP-세파로스 패스트 플로우(sepharose fast flow) 컬럼(파마시아사 10×60㎝)에 산 침전 후의 상등액을 시간당 8ℓ의 유속으로 통과시킨 다음 40mM 인산일나트륨 완충액으로 용출액의 280mm에서의 흡광도가 0.1 이하로 될 때까지 세척하였다.
40mM 인산일나트륨 완충용액(pH 4.8)과 이 용액에 연화나트륨이 0.3몰 되게 첨가한 용액을 각각 10ℓ로 하여 선형농도구배에 의한 용출 및 분획을 하게 하였다.(제3도 참조). 이때 활성형의 인 과립구 콜로니 자극인자의 순도를 소듐 도데실 설페이트 및 네이티브 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 측정한 결과 98% 이상의 순도를 나타내었다.
[실시예 3]
SP-세파로스 패스트 플로우 컬럼 크로마토그래피에서 분획한 활성형의 인 과립구 콜로니 자극인자를 모으고 황산암모늄((NH)SO)을 1ℓ당 176g의 양이 되도록 서서히 가하면서 교반하여 활성형의 인 과립구 콜로니 자극인자의 침전이 생성되도록 하였다.
첨가한 황산암모늄이 모두 용해되면 1시간 더 교반을 한 후 10,000g에서 20분간 원심 분리하여 침전을 회수하였다. 모든 상기 과정은 빙조내에서 수행하였다.
[실시예 4]
유안 침전법으로 회수한 활성형 인 과립구 콜로니 자극인자에 0.004% 폴리소르베이트(polysorbate) 80이 첨가된 10mM 초산나트륨용액(pH 4.0)을 최소량 가하여 현탁시킨 후 이 현탁액을 투석막에 담아 동일한 용액데 대하여 투석을 진행하였다. 이 과정은 투석막 속의 황산암모늄이 완전히 제거될 때까지 4℃ 냉장실에서 진행하였다.
[실시예 5]
상기 실시예 4에 따른 투석이 끝난 후의 활성형 인 과립구 콜로니 자극인자를 회수하여 10,000g에서 30분간 원심 분리한 후 상등액만을 0.004% 폴리소르베이트 80이 첨가된 10mM 초산나트륨 용액으로 평형화시킨 세파덱스 G-75 (Sephadex G-75 superfine, 파마시아사 10×90㎝)에 시간당 100㎖의 유속으로 통과시키면서 분획을 하였다(제4도 참조). 분획중 활성형 인 과립구 콜로니 자극인자만을 모아 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 및 네이티브-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 측정한 결과 순도가 99% 이상이었다(제5도 참조).
[실시예 6]
골수 세포 중 과립구 세포의 콜로니 형성에 대한 효과를 측정함으로써 최정 정제된 활성형 인 과립구 콜로니 자극인자의 싱물학적 활성도를 구하였다. 골수 세포 원액을 휘콜(Ficoll : 파마시아사)액에 넣어 1000g에서 10분동안 원심 분리하여 골수 세포만을 분리한 다음 휘셔(Fisher : Gibco사) 배지에 7.5×10 cell/㎖의 농도가 되게 하여 골수 세포 현탁액을 준비하였다. 최종 정제액은 5ng까지 희석 배지로 연속적으로 2배 희석하여 사용하였다. 페트리 디쉬(petri dish, 35×10mm FALCON사)에 휘셔배지 0.5㎖, 20%의 마혈청 0.2㎖, 세포 현탁액 0.1㎖, 최종 정제액 각 희석액 0.1㎖, 3.3% 아가(Agar)액 0.1㎖을 넣어 잘 혼합한 후 반고형(semi-solid) 상태가 되도록 하였다.
각 페트리 디쉬는 37℃, 5% CO배양기에 넣어 7∼10일간 배양시킨 다음 형성된 콜로니(40개 이상 세포군락)의 수를 확인하여 생물학적 활성도를 계산하였다. 이때 골수 세포 5×10 개로부터하나의 콜로니가 형성되는 인 과립구 콜로니 자극인자의 농도를 1 단위로 하였다. 최종 정제액의 생물학적 활성도는 1.2×10 단위/㎎으로서 NIBSC(National Institute of Biological Srandards and Control)에서 분양하는 재조합 인 과립구 콜로니 자극인자의 국제 표준품의 활성도 보다 월등히 우수한 것이었다.
[실시예 7]
겔 여과 크로마토그래피에서 얻은 최종 정제액에 내독소가 포함되어 있는지의 여부를 LAL(Limulus Amebocyte Lysate) 시험으로 확인하였다.
그람 음성균의 내독소는 LAL에 존재하는 전구효소(proenzyme)의 활성화를 촉매하여 활성화된 효소는 기질인 Ac-Ile-Glu- Gly- Arg- PNA로부터 PNA(P-니트로 아닐릴)를 절단해 내는 작용을 촉매한다. 이때 활성화 초기 속도는 내독소의 농도와 비례하므로 이를 이용하여 내독소양을 측정하였다.
즉 최종 정제액과 표준시료를 각각 100㎍를 가하고 잘 섞었다. 6분 경과 후 50%의 초산용액을 50㎍ 넣어 반응을 정지시키고 405nm의 파장에서 각 튜브의 흡광도를 측정하였다. 표준시료의 흡광도로부터 표준곡선을 그리고 최종 정제액의 흡광도 값을 표준곡선에 대입하여 내독소의 양을 계산한 결과 인 과립구 콜로니 자극인자 1mg당 내독소의 양은 0.05EU 이하로 나타났다. 이 값은 임상용으로 사용하는 인 과립구 콜로니 자극인자의 내독소 함유 기준보다 훨씬 낮은 수치로서 임상용으로 사용하기에 적합한 수준이었다.
[실시예 8]
최종 정제액내의 대장균 DNA의 혼입 여부를 알아보기 위해 DNA 표지 및 식별 킷(labeling and detection kit)을 이용하여 확인하였다.
8가지 농도의 대장균 K-12 DNA 표준액, 스파이크 대조액, 최종 정제액을 95℃에서 10분간 열처리하여 변성시킨 후 얼음에서 식히고 물과 SSC 2배액으로 미리 적신 나일론 여지상에 1㎕씩 점상으로 찍었다. 나일론 여지를 80℃에서 2시간 동안 구워 말리면서 DNA를 여지에 완전히 결합시키고 이 여지를 하이브리드화 용액에 들어 있는 플라스틱 백에 넣고 밀봉한 다음 68℃에서 적어도 1시간 프리하이브리드(prehybrid)시켰다. 용액을 디곡시겐닌(digoxigenin)-dUTP(deoxyuridine-triphosphate)표지 DNA가 5㎕ (25ng)들어 있는 하이브리드화 용액으로 교환하여 67℃에서 적어도 6시간 이상 반응시킨 후 실온에서 SSC 0.1 배액, 0.1% SDS용액 50㎖로 15분간 2회 세척하였다. 하이브리드화가 끝난 여지는 항체-효소 접합체 희석액을 넣어 30분간 반응시키고 반응이 끝나면 반응하지 않은 항체-효소 접합체를 제거하고 여지를 100㎖의 트리스 완충액으로 15분간씩 2회 세척한 다음 20㎖의 평형화 완충액으로 2분간 평형화시킨 후 기질 용액을 여지와 반응시켜 고정된 DNA 점상이 변색되도록 하였다. 변색이 되면 여지를 10mM TE(Tris-EDTA) 완충액으로 5분간 세척을 하고 변색된 DNA 점상의 강도를 육안으로 관찰하여 검액 DNA가 나타내는 점상의 강도와 동일한 강도를 나타내는 점상을 표준 DNA액 점상 중에서 찾아 DNA 함량을 구했다. 이때 최종 정제액의 대장균 유래 DNA 함량은 이 과립구 콜로니 자극인자 1㎎당 4pg이하로서 이는 임상용 인 과립구 콜로니 자극인자의 대장균 유래DNA 함량 기준보다 낮은 수치로서 임상용으로 사용하기에 적합한 수준이었다.
[실시예 9]
최종 정제액중 대장균 유래 단백질의 혼입 여부를 알아보기 위하여 효소면역 측정법을 사용하였다.
대장균 유래 단백질에 대한 토끼 항체가 코팅(coating)된 96웰(well)에 대장균 유래 단백질 표준액과 최종 정제액 및 그 희석액을 웰당 200㎕씩 가하고 37℃에서 2시간 방치한 후 다시 세척용 완충액으로 4회 세척하였다. 각 well에 고초냉이 과산화효소(horseradish peroxidase)-대장균 유래 단백질의 항체 접합체 200㎕씩을 가하고 37℃에서 2시간 방치한 후 다시 세척용 완충액으로 4회 세척하였다. 각 웰이 기질-발생 용액 200㎕씩을 가하고 암소에서 30분간 방치한 후 반응 정지액인 2몰 황산을 50㎕가한 후 492 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 이때 검액증의 대장균 세초의 펩타이드 농도는 492 nm에서 얻어지는 흡광도에 비례하게 되므로 표준액의 흡광도(log ng/㎖)의 그래프에서 얻어지는 직선 회귀 방정식을 통하여 검액 중의 대장균 세포 펩타이드 농도를 구했다. 최종 정제액의 대장균 유래 단백질의 함량은 인 과립구 콜로니 자극인자 1mg당 2ng 이하로써 이는 임상용 인 과립구 콜로니 자극인자의 대장균 유래 단백질 함량 기준보다 훨씬 낮은 수치로서 임상용으로 사용하기에 적합한 수준이었다.
[효과]
상기 실시예로부터 활성화 공정을 거친 인 과립구 콜로니 자극인자의 봉입체 용액에 잔존하는 불활성형의 인 과립구 콜로니 자극인자의 대장균 유래 단백질을 산 침전 방법을 통해 다량 침전으로 제거하고; 회수된 상등액을 두번의 컬럼 크로마토그래피만을 수행하여 나머지 오염물질을 완전히 제거할 수 있음을 알 수 있었다. 즉 산 침전법을 도입함으로써 전체 공정을 단순화시키고 이에 따라 공정효율을 높이고 공정 비용이 크게 절감되는 효과를 얻을 수 있음도 알 수 있었다. 더하여 상기 실시예로부터 본 발명의 방법으로 얻은 최종 정제액은 내독소(endotoxin), 대장균 유래 단백질 및 대장균 유래 DNA 및 불활성형의 인 과립구 콜로니 자극인자가 완전히 제거된 임상용으로 사용하기에 적합한 고순도의 활성형 인 과립구 콜로니 자극인자임도 알수 있었다.
따라서 본 발명 방법은 활성화 공정을 거친 인 과립구 콜로니 자극인자 봉입체 용액을 출발 물질로 하여 산 침전법을 사용하여 불순 물질 제거하여, 종래의 방법보다 현격히 감소된 횟수의 크로마토그래피만으로 고수율, 고순도의 임상용으로 사용하기에 적합한 활성형 인 과립구 콜로니 자극인자를 제공한다.

Claims (8)

  1. 활성형 인 과립구 콜로니 자극인자의 정제 방법에 있어서, a) 숙주에서 발현된 인 과립구 콜로니 자극인자 용액을 활성화 시키는 단계; b)상기 a)단계의 활성화된 인 과립구 자극인자 용액을 용액의 pH를 4.0∼7.0의 범위로 조절하여 침전을 형성시키는 산 침전법으로 처리한 후, 원심 분리하는 단계; 및 c) 상기 b)단계의 원심분리 후의 상등액을 정제하는 단계를 포함하는 활성형 인 과립구 콜로니 자극인자의 정제 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기한 상등액의 정제는 상기한 원심분리 후의 상등액을 이온교환크로마토그래피로 1차 정제하고; 상기한 1차 정제된 용액을 유안 침전법으로 처리하여 침전액을 제조하고; 상기한 침전액을 현탁시킨 후 투석하여 농축액을 제조하고; 및 상기한 농축액을 겔 여과 크로마토그래피로 2차 정제하는 공정을 포함하는 활성형 인 과립구 콜로니 자극인자의 정제 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 이온교환크로마토그래피는 SP-세파로스 패스트 플로우 수지를 사용하는 활성형 인 과립구 콜로니 자극인자의 정제 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 SP-세파로스 패스트 플로우 수지는 40mM 인산일 나트륨(pH 4.8)의 완충용액으로 평형화된 활성형 인 과립구 콜로니 자극인자의 정제 방법.
  5. 제2항에 있어서, 상기 이온교환크로마토그래피는 인과립구 자극인자를 0에서 0.3몰까지의 선형 농도 구배의 염화나트륨을 사용하여 용출하는 활성형 인 과립구 콜로니 자극인자의 정제 방법.
  6. 제2항에 있어서, 상기한 유안 침전법은 황산암모늄 염을 30%되게 사용하여 인 과립구 콜로니 자극인자를 침전으로 회수하는 활성형 인 과립구 콜로니 자극인자의 정제 방법.
  7. 제2항에 있어서, 상기한 현탁은 0.004% 폴리소르베이트 80이 첨가된 10mM 초산나트륨 용액(pH 4.0)을 사용하여 행하여지는 활성형 인 과립구 콜로니 자극인자의 정제 방법.
  8. 제2항에 있어서, 상기한 겔 여과 크로마토그래피는 세파덱스 G-75 슈퍼파인 수지를 사용하는 활성형 인 과립구 콜로니 자극인자의 정제 방법.
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