JPS62234097A - ヒト分化誘導因子ｂｕｆ−３ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ヒト分化誘導因子ＢＵＦ　−３（以下、ＢＵ
Ｆ　−３と記す。〕に関し、詳しくは、腫瘍細胞を分化
成熟せしめ、あるいは赤芽球生成を促進せしめる作用を
有するＢＵＦ　−３に関する。即ち、本発明のＢＵＦ　
−３は、ヒト白血病細胞を正常細胞に分化、ｇ熟せしめ
る作用、即ち脱癌作用を有し、かつ赤芽球生成を促進す
る作用を併有する因子であり、また、動物細胞又は微生
物由来のものと異り、ヒトの細胞によって生産されるも
のであることから、ヒトの白血病の治療薬及び貧血治療
薬として利用できる可能性が有る。

従来の技術 癌の治療を目的として、癌細胞を正常細胞に変える脱癌
作用物質、即ち分化誘導物質に関する研究が国際的に活
発に進められている。マウスフレンド白血病細胞やヒト
単球性白血病細胞は薬物や生体因子で処理すると夫々、
マクロファージ、顆粒球様細胞又は赤血球様細胞へ分化
、成熟し、癌としての性質即ち、移植性、増殖性を失う
ことが知られている。

上記薬物としてはＤＭＳＯ等の極性化合物、リポポリサ
ッカライド、免疫賦活剤、プレオマイシン、アクチノマ
イシンＤ等の抗生物質、ピタミ／類ＴＰＡ（１２−０−
ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｏｙｌｐｈｏｒｂｏｌ−１３−ａ
ｃｅｔａｔｅ　）等のホ、ｎ、／、ｙ−ルエステル、ア
ルギナーゼ、ヒストン等の蛋白質等が知られている。一
方、生体因子としてはマウス胎児細胞（ＭＩ細胞〕によ
って生産される分子ｉ４０，０００〜５０，０００の糖
蛋白であるＤ因子（癌と化学療法、９，１０５−１１４
．１９８２）が良く知られている。一方、ヒトの単核性
白血球をコンカナバリンＡ等のマイトゲンで刺激すると
分子量２５，０００と４０，０００のＣ８Ｆ’　（白血
球誘導因子〕とＤ因子が生産され、これらＤ因子がヒト
急性前骨髄球性白血病細胞（ＨＬ−６０３にマクロファ
ージ様細胞に分化させることが明らかにされている。同
様にこのヒト単核性白血球をリポＩリサッカライド等の
マイトジェンで刺激するとヒト骨髄性白血病、単球性白
血病細胞等を分化誘導させる因子が発表されている（日
本癌学会総会記事、第４３回総会Ａ６３９．Ｐ１９０（
１９８４）及び特開昭６０−２８９３４号公報〕。しか
しながら、一般に良く知られているフレンド白血病細胞
を分化誘導せしめるようなヒト由来の分化誘導因子は知
られていない。

一方、貧血の治療薬としては、貧血の原因により薬物が
異るが、一般的に鉄欠乏性貧血には鉄剤。

悪性貧血にはビタミンＢ、２２葉醗、再生不良性。

溶血性貧血にはコルチコイド等の副腎皮質ステロイドが
使われている。この内ステロイドホルモンは、造血促進
効果が確認されており有効な治療薬ではあるが、もりと
本問題になるのは強い副作用であり、長期投与には問題
が有るといわれている。

近年、赤血球生成に深く関与し貧血を改善する生体物質
としてエリスロポエチンが注目されている。エリスロポ
エチンは１ｉｉＦ臓で生産され、α−グロブリン画分に
存在する分子−１４５，０００の糖蛋白であり造血幹細
胞に作用して赤芽球細胞への分化及び赤芽球生成を促進
させる体液性調節因子と定義され、新しい貧血治療剤と
して期待されている。

しかしながら、原料が人尿であり又含飲も極めて少ない
几め大量に供給することが困難である。一方、遺伝子ｍ
換法による生産も研究されているが、糖蛋白である為に
実用化には至りていない。

従って、この発明の課題は、種々のヒト細胞を用いて新
しい腫瘍細胞分化因子、更には貧血の治療に役立つ有効
因子を見つけ出し、その化学的本体特にアミノ酸配列を
明らかにすることに有る。

問題点をｗ４決するための手段本 発明者等は叙上の問題点を解決するため種々ヒト細胞に
ついて分化因子の生産性を検討した結果、ヒト白血病細
胞を特定の分化誘導物質の共存下で培養又は誘導するこ
とによりマウス白血病細胞を正常細胞に分化、成熟せし
めるヒト分化誘導因子ＢＵＦ　−３が産生されることを
発見し、培養液からＢＵＦ　−３を単離し、精製し、そ
の化学的性質、特にアミノ酸配列を＃＃完全に決定する
ことができ次。

更に、このようにして生産されるＢＵＦ　−３が貧゛血
を改善する作用を有することを見出し本発明を完成する
に至りた。以下、本発明について説明する。

本発明でいうヒト白血病細胞としては、ヒト白血病に由
来する樹立株又はヒト骨髄細胞を人為的に悪性化させ念
もの、より具体的に例示すれば次のようなものが有す。

ヒト組織球性リンノ４腫細胞（Ｕ−９３７ＡＴＣＣＣＲ
Ｌ　１５９３　、　Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎａ＠ｒ　１７　
：　５６５（１９７６））、ヒト慢性骨髄性白血病細胞
（Ｋ５６２゜Ｂｌｏｏｄ　４５：３２１（１９７５）〕
、　ヒト単球性白血病細胞（Ｊ−１１１，Ｂｌｏｏｄ　
１０：ＩＱｌｏ（１９５５）　）、ヒト急性単球性白血
病細胞（ＴＨＰ−１、Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎａｅｒ２６：
１７１−１７６（１９８０）　）。特定の分化誘導物質
は、ヒト白血病細胞と接触させｔ時、ＢＵＦ　−３を生
産せしめる作用を有する物質であり、具体的にはアクチ
ノマイシンＤ、マイトマインンＣ１コンカナノ４１Ｊ７
人及びホル♂−ルエステル（ＴＰＡ　）　等の特定の分
化誘導・物質である。

本発明のＢＵＦ　−３’ｉ生成せしめる方法は、ヒト白
血病細胞を少くとも１種又は２樵以上の上記特定の分化
誘導物質の共存下で培養することによりなされ、ＢＵＦ
　−３は培養液中（細胞外）Ｋ産生される。

本発明のヒト白血病細胞を培養する培地は、動物細胞を
培養する通常の培地が用いられる。例を挙げれば、ロー
ズウェル・・母−り・メモリアル・インスティテユート
１６４０培地（Ｒｏａｗ＠ｌｌ　ｐａｒｋＭ＠ｍｏｒｉ
ａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｓ　１６４０　、以下ＲＰＭＩ
　−１６４０と略す。）が好適である。その他ダルベツ
コ変法イーグル基礎培地（Ｅａｇｌｅ’ｓ　′Ａｉｎｉ
ｍｕｍ　ｇｓｓｅｎｔ１ｍ１Ｍ＠ｄｉｕｍ）、クリック
培地（Ｃ１ｌｃｋ　Ｍｅｄｉｕｍ　）等も用いられる。

通常、これらの培地には、牛胎児血清（以下、ＦＢＳと
略す。）か新生児ウシ血清、ウマ血清を添加して用いら
れるが、本発明の場合には特に添加しなくても良い結果
が得られる。

ヒト白血病細胞の培養は、通常１〜５Ｘ１０’ＷＩＬｌ
の細胞密度で、３５〜３８℃にて４〜６チの炭酸ガス気
流中で静置もしくはゆるやかに攪拌しつつ行われる。特
定の分化誘導物質は、通常培養の最初より培地に添ｍし
ても良く又培養の途中から添加しても良い。添加量は分
化誘導物質のｍａによって異なるがアクチノマイシンＤ
、マイトマイ７ンＣ等の場合には０．１〜１０μｍ１／
ＩｎξＴＰＡの場合には１〜５００　ｎｌ／ｌｄである
。このようにして１〜５日間培養するとＢＵＦ　−３は
培養液中に蓄積される。

ＢＵＦ　−３の活性はマウスＦｒ１ｅｎｄウィルス誘発
白血病細胞Ｐ　５−５　（Ｂｉｂ１．Ｈａ＠ｍａｔ、、
４３，３７（１９７６））を用いる公知の方法（Ｐｒｏ
ｅ、Ｎａｔｌ＊、Ａｃａｄ、８ｅｌ　、＃　７Ｌ９８（
１９７５））に従って測定される。又活性の表示はＦ５
−５細胞分化が明瞭に確認される検体原液の稀釈率の逆
数の値を原液１．０７１１１当シの活性とする。この発
明方法でＢＵＦ　−３１生産した時、培養液は４〜１０
００単位／ＩＩＬｌの活性を示す。

ＢＵＦ　−３０ｆ＃製は通常蛋白質の精製法に準じて行
われる。例えば培養液を限外濾過法で′ａｍし、この濃
縮液から蛋白質を塩析し、透析後歯イオン交換体を使用
するイオン交換クロマトグラフィーを行うことにより粗
蛋白標品が得られる。この粗標品について疎水クロマト
グラフィー又はクロマトフオーカシング法により殆んど
の夾雑蛋白が除去される。又この両者を組合せると更に
精製倍率全向上することができる。このようにして精製
し念標品について逆相高速液体クロマトグラフィー又は
スー／々−ローズ又はＭａｎｅ　Ｑ　ＨＲ５／　５　カ
ラム全装備し７’ｊＦＰＬＣ（ファルマシア製Ｆａｓｔ
　ＰｒｏｔｅｉｎＰ＠ｐｔｉｄ＠Ｐｏ１ｙｎｕｃｌ＠ｏ
ｔｉｄｅ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ
ｙ）システムによる高性能ｒル濾過法又はイオン交換ク
ロマトグラフィーを行うことにより精製することができ
る。

このようにして精製されたＢＵＦ−３は以下に示す理化
学的性質を有する。

（＆）分子徽：１６±１ｋｄ（１，０係メルカプトエタ
ノール存在下８ＤＳポリアクリルアミド ｒル電気泳動法〕 ２５±１ｋｄ（メルカプトエタノール非存在下ＳＤＳ電
気泳動法〕 （ｂ）等電点：ｐＩ６，３士０．２（クロマトフオーカ
シング法）ｐＩ７．３（等電点電気泳動法）（ｅ）−安
定性：ｐＨ２，０〜１０．０の範囲で安定（ｄ）熱安定
性：６５Ｃ，６０分の加熱で安定（ｅ）有機溶媒安定性
：低級アルコール、アセトニトリルに対し安定 （ｆ）グロテアーゼ耐性二プロナーゼ処理で完全に失活
する。

優）比活性：２Ｘ１０’Ｕ／■蛋白 （ｈ）アミノ酸配列： Ｇｌｙ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ　　Ｃｙｓ　　Ａｍｐ　　
Ｇｌｙ　　Ｌｙｓ　　Ｖａｌ　　Ａｓｎ　　ｌｌ５Ｃｙ
ｓ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｅ　Ｇｉｎ　Ｐｈ＠Ｐｈｅ　
Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｈ５Ａｌａ　　Ｐｒｏ　　Ｓｅｒ　
　Ｇｌｙ　　Ｔｙｒ　　Ｈｌｓ　　Ａｌａ　　Ａｓｎ　
　Ｔｙｒ　　ＣｙｓＧｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　
Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｈｌｓ　ＩＩｓ　Ａｌａ　ＧｌｙＴｈ
ｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｓｓｒ　Ｌ＠（Ｉ　Ｂａ
ｒ　Ｐｈｅ　Ｈｌｓ　５ｅｒＩＩｓ　Ｌｙｓ　Ｌ７ｍ　
ＡＩＩｐＩＩｓ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｍａｔ　Ｉｌｅ　Ｖ
ａ１Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ＣｙＢＧｌｙ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ尚
、上記理化学的性質よりＢＵＦ　−３の天然型はＳ−８
結合によるポリベグチドのホモダイマーであることがわ
かる。

作用・効果 本発明のＢＵＦ　−３はマウスフレンド白血病細胞全正
常細胞へ分化、成熟せしめる作用即ち脱ｆン作用ｔＶす
ると伴に、又赤芽球生成を促進する作用をも有する。

即ち、ＢＵＦ　−３ｇ貧血状態のマウスに投与するとマ
ウスの貧血が改善される。マウスフレンドウィルス誘発
白血病細胞をマウスに移植するとマウスのへマドクリ、
ト値（赤血球容積ａｔ表わし、赤血球数よりも正確に貧
血の程度を表わす数値）は次第に低下しマウスは１〜２
週間で貧血状態を呈する。これら対照に比較して移植後
ＢＵＦ　−３を静脈内に投与するとマウスのへマドクリ
ット値は殆んど低下せず２１日０には明らかな有意差が
認められる。又移植後１週間目に貧血状態金星するマウ
スにＢＵＦ　−３’に投与するとヘマトクリ、ト値の低
下が抑えられ２．３日後に値の上昇が認められ明らかな
貧血治療効果が認められる。

本発明の貧血治療剤は赤血球産生の低下により生ずる貧
血の予防、治療に有効であり、マウス及びヒトの培養細
胞へ毒性を示さず、ヒトの貧血の予防、治療に有効であ
る。

本発明の貧血治療剤は主として非経口的（筋肉内、皮下
、静脈内）に投与される。前記有効成分ＢＵＦ　−３の
投与量は症状により異るが、通常成人当りｏ、ｏｓ！１
９〜２５ダの用量範囲で一般に数回に分けて、従って一
日当りの投与量は０．１〜５０Ｑである。用量は貧血の
程度、患者の体重及び当業者が認める他の因子によって
変化する。

本発明に使用するＢＵＦ　−３の製剤化は通常の方法に
よって行われ、主として注射剤とされるが、他にカプセ
ル剤、錠剤等の剤型へ製剤化される。

注射剤を調製する場合には生薬のＢＵＦ　−３に必要に
よシーｙ４ｍ剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤など全添加
し常法により皮下、筋肉内、静脈内用注射剤とする。又
、経口用製剤を調製する場合はＢＵＦ−３に賦形剤、さ
らに必要く応じて、結合剤、崩壊剤、着色剤等を加え常
法により錠剤、カプセル剤等とする。

実施例１ 第１表に示すヒト悪性化白血病細胞を夫々１×１０６個
／ｄの細胞濃度で、５％Ｆ’Ｂ８　Ｘを含有するＲＰＭ
Ｉ　−１６４０培地もしくは５憾ＦＢＳを含有するダル
ペ、コ変法イーグル基礎培地に懸濁し、ファルコン社製
平底２４穴マイクロタイタープレートに入れ、夫々３７
℃で培養した。この際培養開始時よりＴＰＡを１０　ｎ
ｇ〜又はＩ　Ｑ　Ｏｎ１〜になるように添加し、培養開
始後より１日、２日、３日、４日。

５日後に培養液を採取し、遠心分離し各々の培養上清液
てついてＦ５−５細胞に対する分化誘導活性を測定した
。″！友対照として分化誘導物質を全く加えないで夫々
の細胞を全く同様の方法で培養し、その培養上清液を使
用した。その結果を第１表に示し之。

に−５６２Ｚｏｏ　　　　　　　５　　　　　６４Ｕ−
９３７１００５１６ Ｊ−１１１１００５１６ ＨＬ−６０１００１０ ＴＨＰ−１１０１１６ ＷＪ１表に示すように、Ｋ−５６２とＴＨＰ　−１細胞
に強い活性が見られ、Ｕ−９３７とＪ−１１１にも活性
が認められたがＨＬ−６０には活性が見られなかった。

次に、　ＴＨＰ　−１細胞を用い上記方法に従い各糧分
化誘導物質の効果について調べた。その結果を第２表に
示した。

第２表　　分化誘導物質の効果 アクチノマイシンＤ　　　１μｌ／ａｔ　　　　３　　
　　　０５　　Ｉ　　　　　３　　　　４ マイトマイシン−〇　　　　５１　　　　３　　　　　
０１０　　　＃　　　　　　３　　　　　２Ｃｏｔ＋Ａ
　　　　　　　　　２５　　　＃　　　　　　３　　　
　　８ＬＰＳ”　　　　　　　　　　５０　　　＃　　
　　　　３　　　　　０ＴＰＡ　　　　　　　　　　１
００　ｎＪ／ａ／　　　　１　　　　６４傘大腸菌（Ｅ
、　ｃｏｉｌ　）由来ＬＰＳ実施例２ ５ｃｓ牛脂児血清ｔ′有するＲＰＭＩ　−１６４０無菌
培地５．０Ｊ１２０ｊ容スピンナーフラスコに張り込み
、この培地に実施例１の方法で培養して得られたＴＨＰ
　−１細胞を２Ｘ１０５個／ａになるように懸濁した。

これを３７℃で４日間培養し、得られ之培養液を遠心分
離しＴＨＰ　−１細胞を無菌的に採取した。

この細胞を別のスピンナーフラスコに入れた血清を含ま
ない上記ＲＰＭＩ　−１６４０培地５．Ｏｌに移し、こ
れにＴＰＡ　を１０ｎｌ／爾添加し、ゆるやかに液を攪
拌（１００ｒ、ｐ、ｍ）しつつ、３７℃で２時間培養（
誘導〕を行り九。このようにして得られ九培養液を遠心
分離して細胞を分離、除去し２０単位／ＩＩＬＩの活性
を有する培養液を得た。このようにして得た培養ｆｉ１
００７に硫安を加え（７０係飽和）、生ずる沈３物を遠
心分＃１！（１０，００Ｏｒｐｍｅ　１０分間）により
採取し、少量の０．０５Ｍ）＋７スー塩酸塩緩衝液（ｐ
Ｈ７，８）に溶解後回緩衝液に対して十分透析し念。透
析内液を同緩衝液で十分平衡化したＤＥＡｇ−トーヨー
／々−ル６５０Ｍ（７Ｘ７０ｃＩ１１）に負荷し次。こ
のカラムを同緩衝液５．Ｏ１で洗浄した後、０−０．２
Ｍの食塩を含有する同緩衝液で溶出し友。

分化誘導活性は０，１Ｍの食塩で溶出され友。この活性
区分を集め固型硫安を７０４飽和し、加えて硫安を沈澱
させ友。遠心分離によりこの沈摩物を集め、水２０ＩＩ
ｌに溶解した。この液に８０憾飽和の硫安溶液ｆｔ２０
１１１ｊ加え、４０係飽和硫安を含む０．０５Ｍ）リス
ーＨＣ２緩衝液（ｐＨ７，７）であらかじめ平衡化させ
九プチルトーヨー・＃−ル６５０Ｍカラム（２５Ｘ　３
０　ｃｓｔ　）に負荷し比。硫安濃度を段階的に下げた
後、３０係エタノールで溶出すると分化誘導活性物質が
溶出され九〇このプチルトーヨー／々−ルによる疎水ク
ロマトグラフィーの溶出ノ４ターン１１図に示す。活性
区分を集め減圧下で濃縮してエタノールを除去し、この
濃縮液ｔ０．０５Ｍ）リスーＨＣＬ緩衝液（ｐＨ７，７
）に対して透析し九。透析内液Ｘを同緩衝液で平衡化し
ｔスー・ぐ−ローズ（ファルマシア社ｍｒル濾適用カラ
ム〕を用いて）ｆｙｖ濾過を行り九。そのグ＃Ｉｌａ過
溶出・ぐターンｋｌＫ２図に示す。第２図に示すように
Ｆ５−５に対する分化誘導活性物質の溶出時間は５６０
分であり、標準蛋白質の溶出時間に基づいてＢＵＦ−３
の分子ｔｒｉｏ±０．５ｋｄと算出した。このサンプル
を０．０５Ｍ）リス−塩酸塩緩衝液（Ｐｉ（８，０）に
対して透析し、これを同緩衝液で平衡化したＭｏｎｏ　
Ｑ　ＨＲ５／　５カラム（ファルマシア製陰イオン交換
体）を使用するファルマシアＦＰＬＣ（ＦａｓｔＰｒｏ
ｔｅｉｎ、　ｐｅｐｔｉｄｅ、　Ｐｏ１ｙｎｕｃｌ＠ｏ
ｔｉｄ＠、　ＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ
ｙ　）システムにより精製した。溶出は０．０５Ｍから
０．１Ｍまでの食塩のグラジェント溶出を行った。ＢＵ
Ｆ　−３活性は０．１Ｍ附近の食塩で溶出された。この
工程に於る精製倍率は約５倍であシ、はぼ単一な蛋白に
精製された。次にこのサンプルをハイボアＲＰ３０４　
（バイオラッド社製。

Ｃ−４逆相用カラム）を用いて逆相高速液体クロマトグ
ラフィーを行った。条件は０．１％トリフルオロ酢酸を
展開液としｎ−ブロックノールの濃度をＯチから８０％
直線的に変えて溶出した。その溶出・９ターンをｔ４３
図に示す。第３図に示す蛋白ピルについてＳＤＳ　−／
　ＩＪアクリルアミドデル電気泳動（グルａ度：Ｌ５．
Ｏ％、１．０％メルカプトエタノール共存下）を行った
。その結果、１６ｋｄに単一なバンド（銀染色法）が認
められ、他に蛋白のバンドは検出されなかった。また、
メルカプトエタノールの非存在下では２５ｋｄであった
。このようにして精製されたサンプルの比活性は約２刈
０６Ｕ／ｊＩ！７蛋白であった。

この電気泳動的に単一に精製されたサンプル３００μｇ
をジチオスレイトール６００μｇで６時間還元した後ピ
リジルエチル化し、１０μｇをアプライド・バイオシス
テムズ社製気相アミノ酸シークエンシングアナライザー
（モデル４７０Ａ）を用い、Ｎ末端よシ順次エドマン分
解を行りた。遊離してくるフェニルチオヒダントイン−
アミノ酸を、高速液体クロマトグラフィー（スペクトロ
フィジクス社製ＨＰＬＣ装置５Ｐ８１００．カラムはデ
ュポン社製ゾルパックスＯＤＳ　）にて分析を行った。

その結果、本発明のＢＵＦ　−３のアミノ末端からのア
ミノ酸配列は下記のとおシであった。

Ｇｌｙ−Ｌ＠ａ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ａｍｐ−Ｇｌｙ−Ｌ
ｙｅ−Ｖａｌ　−Ａｍｎ−１１ｅ−Ｃｙａ　−Ｃｙｓ　
−Ｌｙｓ　−Ｌｙｓ−Ｇｌ　ｎ−Ｐｈｅ　−Ｐｈｅ　−
Ｖａ　ｌ−Ｂ＠ｒ−Ｐｈｓ−Ｌｙｌ−Ａｓｐ−Ｉ　１ｓ
−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｉ　１ｅ
−Ｉ　１ｅ−Ａｌｔ　−Ｐｒ　ｏ−８ｅ　ｒ−Ｇｌ　ｙ
−Ｔｙｒ　−Ｈｌ　ｍ　−Ａｌ　ａ−Ａｓ　ｎ−Ｔｙｒ
−Ｃｙ＋５−Ｇｌ　ｕ−Ｇｌｙ。

次に、非還元ＢＵＦについて、等電点、−安定性等信の
理化学的性質を調べた。その結果を以下に示した。

（ＩＬ）等電点：ｐ１６．３士０．２（クロマトフオー
カシング法） ７．３±０．２（等電点電気泳動法） （ｂ）−安定性：ｐＨ２，０−１０，０の範囲で安定（
４℃７時間） （ｃ）熱安定性＝６５℃、６０分の加熱で安定（ｐＨ７
，４）（ｄ）溶媒安定性ニアセトニトリル、低級アルコ
ールに対して安定（２５℃） （一定量のＢＵＦ　−３を１チのＮｈＨＣＯｓ液に溶解
し、これにＢｔＪＦ　−３の１ＺｌＯ量のグロナーゼを
加え、３７℃で一 夜酵素処理で完全に失活する） 尚、上記クロマトフオーカシングによる等電点の測定は
以下のようにして行った。精製し九す／グルを２５ｍＭ
ピストリス塩酸塩緩衝液（ＰＨ７，０）Ｋ対して透析し
、同緩衝液で平衡化した／　リパクファー交換体ＰＢＥ
　９４　（−ｙアルマシア製）カラム（１，ＯＸ　４０
　ｃｎｓ　）に負荷し、１／ｌ０Ｉｃ稀釈しため５、０
のポリバッファー（ファルマシア製）で溶出する。等電
点は、活性の溶出位置の−で表わされる。

一方、等電点電気泳動法による等電点の測定は、ＬＫＢ
社（スウェーデン）製の等電点電気泳動装置（ＬＫＢ−
Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒｓ　）及び試薬（Ａｍｐｈｏｌｉｎ
ｅ　）を用い、　ＬＫＢ−アンホラインＰＡＧプレート
の測定方法に従い、測定した。試料を平板グル（ＬＫＢ
　１８０４−１０１　、　ｐＨ３，５〜９．５　）に添
加後１５００Ｖで２．５時間泳動を行い、マーカーとし
てファルマシア社製の等電点測定用キク）　（ｐＨ３〜
１０）を用いて等電点を測定した。その結果、等電点け
７．３であ、巳。

本発明に使用したＴＨＰ　−１はＩｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｅ
ｅｒ。

２６．１７１−１７６、（１９８０）に記載されている
ものであり、この雑文の著者よシ分与されたものである
。ＴＨＰ　−１は他にもＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ
、Ｓｃｌ、　：Ｕ、Ｓ、Ａ３０ｐｐ　５３９７−５４０
１（１９８３）、ＣａｎｃｅｒＲｅ５ｅａｒｃｈ　４２
，４８４−４８９（１９８２）にも記載されていて、こ
れらの研究機関にも分与されている。

また更に本発明者らは権利を有するいずれのものに対し
てもＴＨＰ　−１を分与する用意がある。

実施例３ 実施例２にて単離され九ＢＵＦ　−３の一次構造は以下
の方法で決定した。

■　トリプシン分解 ピリジルエチル化し九ＢＵＦ　Ｉ　ＯＯμｇにｌチ炭酸
水素アンモニウム１００μｔに溶解したトリプシン１０
μＩを加え、３７℃６時間反応した。反応終了後反応液
をハイデアＲＰ３１８（バイオラッド社）カラムにアプ
ライし、アセトニトリルと０．１　％　）リフロロ酢酸
でリニアなグラジェントをかけて溶出した（第４図）。

得られ九Ｔ１〜Ｔ４のピークを分取し、各々のペプチド
フラグメントを気相式アミノ酸シークエンサー（ＡＢＩ
社１２０Ａ型）で分析し、次のような結果を得た。

Ｔ　１　　：　　Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｍｅを８ｅ
ｒ−ＭｅをＬｅｕ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｉｌａ−１１ｅＴ２　　：　
　Ｈｌｓ−８ａｒ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−１１ｓ−Ａｓｎ−
Ｈｉｓ−ＴｙｒＴ　３　　：　　Ｈｌｓ−Ａｌａ−Ａｓ
ｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ
−Ｐｒｏ−８ａｒ−Ｈｌｓ−１１ｅ−ＡｌをＧｌｙ−Ｔ
ｈｒ−８ｅｒ−Ｇｌｙ−８ｅｒ−８ｓｒ−Ｌｅｕ Ｔ　４　　：　　Ａｓｐ−１１ｅ−Ｇｉｎ−Ａｓｎ−Ｍ
＠を１１＠−ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙａ−Ｇｌｙ
−Ｃｙｓ−８ｅｒ■ 　ブロムシアン分解 ピリジルエチル化ＢＵＦ　−３１００１４を７０％プ酸
に溶解し、少量のブロムシアンを添加し、室温で２４時
間反応した。反応液をハイボアＲＰ３１８カラム（バイ
オラッド社）を用いて、Ｏ，１％　トリフロロ酢酸と８
０％アセトニトリルのグラジェント溶出を行つた（第５
図）。フラグメントＣＮＩ〜３を分取し、ＡＢＩ社気相
式アミノ酸シークエンサーでアミノ酸配列を分析した。

結果は以下に示した。

ＣＮ　１　：　Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｈｌ　ｓ−８＠ｒ−Ｐ
ｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｉｍ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−８ｓ
ｒ−Ｃｙｓ−Ｃｙｍ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ
−Ｌｅｕ−Ａｒｇ ＣＮ２　　：　　Ｌａｕ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｍｐ−Ａ
＠ｐ−Ｇｌｙ−ＧＩＫＬ−Ａａｎ−Ｉｌａ　−Ｉｌａ−
Ｌｙｓ−Ｌｙｌ−Ａｓｐ−ＩＩｓ−Ｇｉｎ−ＡｓｎＳｓ
ｒ−Ｐｈ・ ■　５ｔａｐｈｙｒｏｃｏｅｕｓ　ａｕｒａｕｓ　Ｖ畠
ｐｒｏｔｅａｓｅ分解ピリジルエチル化ＢＵＦ−３１０
０μＩを１％炭酸水素アンモニウム１００μＬに溶解し
、１０μｓの５ｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｕｓ　ａｕｒｅｕ
ｓ　Ｖｓｐｒｏｔｅａｓｅを用いて３７℃、２８時間分
解し、反応液をハイボアＲＰ３１８（バイオラッド社）
を用いて、トリプシン分解の場合と同様に１分取し得ら
れたフラグメントについて気相法アミノ酸シークエンサ
ー（ＡＢＩ　社１２０Ａ型）で分析をして以下のような
結果を得た。

ＶＩ：　Ｃｙｓ−Ａｍｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｌ−Ｖａｌ−Ａ
ｓｎ−１１ｅ−Ｃｙｓ−Ｃｙａ−Ｌｙ＋−Ｌｙｓ−Ｇｌ
ｎ−Ｐｈｓ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−８ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ
−Ａａｐ−ＩＩｓ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ ＶＩ　：　Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−８＠ｒ−Ｈｌａ−１１ｅ−
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−８ｅｒ−Ｇｌｙ−８ａｒ−８
ｅｒ−Ｌｅａ−８＠ｒ−Ｐｈｅ　−Ｈｌ　ｓ−８＠ｒ−
Ｔｈｒ　−Ｖａｌ−ＩＩｓ−Ａｓｎ−Ｈｌａ−Ｔｙｒ−
Ａｒｇ−ＭｅをＡｒｇ−Ｇｌｙ■、■、■の結果を総合
してＢＵＦ　−３の全アミノ酸配列を以下のように決定
した。

アミノ酸配列： Ｃｙｍ　　Ｃｙｓ　　Ｌｙｓ　　Ｌｙｅ　　Ｇｌｎ　　
Ｐｈｅ　　Ｐｈ＠　Ｖａｌ　　Ｓｅｒ　　ＰｈｅＬｙｓ
　Ａｍｐ　ＩｌａＧｌｙ　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｔ
ｒｐ　Ｉｌａ　ＩＩｓＡｌａ　Ｐｒｏ　Ｓ＠ｒ　Ｇｌｙ
　Ｔｙｒ　Ｈｌｓ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　ＣｙｓＧ
ｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｓｓｒ　Ｈｌ
ｍ　ＩＩｓ　Ａｌａ　ＧｌｙＴｈｒ　８＠ｖ　Ｇｌｙ　
８＠ｒ　Ｂａｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｈｉｓ　Ｓ
ｅｒＴｈｒ　Ｖａｌ　ＩＩｓ　Ａｓｎ　Ｈｌｓ　Ｔｙｒ
　Ａｒｇ　Ｍｅｔ　Ａｒｇ　ＧｌｙＨｌｓ　Ｓｅｒ　Ｐ
ｒｏ　Ｐｈ＠Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｌｓｕ　ＬｙｔＩＳ＠ｒ
　ＣｙｓＣｙｍ　Ｖａｌ　ＰＦ３　Ｔｌｒ　Ｌｙｓ　Ｌ
ａｕ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　５ｓｒＭｅｔ　Ｌ＠ｕ
　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　
Ａｓｎ　Ｉｔ６ＩＩｓ　Ｌｙｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　ＩＩ
ｓ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｍａｔ　ＩｌａＶａ１Ｇｌｕ　Ｇ
ｌｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｂａｒ実施例４ ｄｄＹマウス（雄、５Ａ令、東京実験動物（株））を用
い、１群５匹を被験動物として用いた。上記マウスＫ、
同マウスの腹水中で継代培養したマウスフレンド白血病
細Ｆ５−５を２Ｘ１０’個づつマウスの腹腔内に移植し
た。実験例２で得られ九ＢＵＦ　−３（凍結乾燥標品）
を滅菌した生理食塩水に溶解し５０００Ｕ／ａｌｌｊの
注射用薬剤を調製した。ＢＵＦ　−３投与群には、Ｆ５
−５細胞を移植した翌日よシ３日間上記注射薬を０．２
ｄ（１ｏｏＯＵ　）宛腹腔内及び静脈内投与した。Ｆ５
−５細胞移植後１４日目及び２１日０に尾静脈よシヘマ
トクリット管に採血し、　１２．００Ｏｒ、ｐ、ｍで５
分間遠心分離しヘマトクリット値を常法によシ測定した
。対照群には生理食塩水を投与した。その結果を第３表
に示す。

第３表 対照群　　４４．３±２．３２９．７±１１．９２８．
８±２．９　　※※※靜脈静脈与群　４４．６±３．２
　３９．０±１５．２　４１．９±１２．２＊（奈、衆
）（※※、秦※→５％の棄却率で有意差あシこれと併用
して別のマウスｌ詳を用いＦ５−５細胞移植後１４日目
に静脈内に０．２ｄ投与し、２１日０にヘマトクリット
値を測定した。その結果、ヘマトクリット値は３５±８
．０であシ明らかなヘマトクリット値の上昇が確認され
た。

一方、正常マウスにＢＵＦ　−３を５０μｌｉ　（２，
５ｍｙＡｙ　）静脈内投与して２ケ月間飼育して毒性を
調べたが、マウスは正常であシ何ら異常は認められなか
った。即ち、本発明のＢＵＦ　−３は７し／ド白血病に
よって生ずる貧血を予防、及び治療する効果を有するこ
とが、この実施例によシ立証できた。

従りて本発明のＢＵＦ　−３は白血病、多発性骨髄腫、
リン１４腫等の悪性盾瘍によりて起る赤血球、ヘモグロ
ビン低下に起因する貧血症等に使用できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明ヒト分化誘導因子ＢＵＦ　−３のプテ
ルトーヨーパールによる疎水クロマトグラフィーの溶出
パターンである。 第２図は、本発明のヒト分化誘導因子ＢＵＦ　−３のグ
ル濾過クロマトグラフィーの溶出ノぐターンである。 第３図は本発明ヒト分化誘導因子ＢＵＦ　−３の逆相高
速液体クロマドグ２フイーの溶出ノ母ターンである。 第４図は本発明ヒト分化誘導因子ＢＵＦ　−３のトリプ
シン分解物のハイ４アカラムによる溶出ノーターンでち
る。 第５図は本発明のヒト分化誘導因子ＢＵＦ　−３のブロ
ムシアン分解物のＩ・イボアカラムによる溶出パターン
である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 マウス白血病細胞を正常細胞に分化成熟せしめることが
   できる活性を有し、かつ下記理化学的性質を有するヒト
   分化誘導因子ＢＵＦ−３。 （ａ）分子量：１６±１ｋｄ（１．０％メルカプトエタ
   ノール存在下、ＳＤＳ−電気泳動法） ２５±１ｋｄ（メルカプトエタノール非 存在下、ＳＤＳ−電気泳動法） （ｂ）等電点：ｐＩ６．３±０．２（クロマトフォーカ
   ミング法）ｐＩ７．３（等電点電気泳動法） （ｃ）ｐＨ安定性：ｐＨ２．０〜１０．０の範囲で安定
   （ｄ）熱安定性：６５℃、６０分の加熱で安定（ｅ）有
   機溶媒安定性：低級アルコール、アセトニトリルに対し
   安定 （ｆ）プロテアーゼ耐性：プロナーゼ処理で完全に失活
   する。 （ｇ）比活性：２×１０＾６Ｕ／ｍｇ蛋白 （ｈ）アミノ酸配列： 【アミノ酸配列があります】