CN1328285C - 干细胞增殖抑制因子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开并要求保护的是用于调节异常干细胞周期和加速化疗后外周血细胞恢复的干细胞抑制因子的分离及其应用。同时公开并要求保护的是干细胞增殖抑制因子。

Description

干细胞增殖抑制因子及其应用

发明领域

本发明涉及调节干细胞周期的干细胞增殖抑制因子在治疗患有自身免疫病、衰老、癌症、骨髓发育不良、前白血病、白血病、银屑病或涉及过度增殖情况的其它疾病的人或动物中的应用。本发明也涉及预先或已经接触化疗药物、其它对已进入细胞周期的干细胞有损害的药物或辐射的人或动物的治疗方法。最后，本发明涉及用于自体和异体移植方法或用于基因转移的干细胞的维持培养或扩大培养的改进。

发明背景

在更新系统(renewing system)中的大多数终期细胞是短寿命的且在生命过程中不断地被替代。例如，血细胞来源于具有自我更新能力的多潜能造血干细胞(HSC)。造血干细胞是造血细胞的一个亚群。造血细胞可以从例如骨髓、脐带血或外周血(未活化的或用例如G-CSF的药剂活化的)获得；造血细胞包括干细胞群、祖细胞、分化细胞、辅助细胞、基质细胞以及有助于形成产生成熟血细胞所必需的环境的其它细胞。由于造血干细胞对于造血和免疫系统的所有成熟细胞的发育是必不可少的，因此在患者接受化疗或其它药物治疗时，造血干细胞的存活对于重建机体的全部功能性宿主防御系统是必需的。

造血细胞的产生受一系列因子的调控，这些因子刺激造血细胞的生长，分化，其中一些因子如红细胞生成素和G-CSF目前已用于临床。然而，尚未完全表征的调控网络的一部分是形成了调控过程中的负向调节(negative arm)的反馈机制(Eaves et al，Blood，78：110-117，1991)。

在早期的研究中，Lord和其同事们发现在正常的鼠和猪骨髓提取物中存在着一种可溶性蛋白因子，它能可逆性地抑制造血干细胞的细胞周期(Lord et al.，Br.J.Haem.，34：441-446，1976)。这种活性抑制物(分子量50～100kD)被命名为干细胞抑制因子(SCI)。

由于体内检测需要大量的受照射的小鼠这一固有的困难，初始来源的这种因子的纯化没能完成。为了克服这些困难，Pragnell和其同事们建立了一个体外检测初级造血细胞的方法并筛选了作为活性抑制物来源的细胞系(见Graham et al.，Nature，344：442-444，1990)。

由于早期的研究已鉴定出巨噬细胞是干细胞抑制因子的可能来源(Lord et al.，Blood Cells，6：581-593，1980)，因此选择了小鼠巨噬细胞系J774.2(Graham et al.，Nature，344：442-444，1990)。Graham等用该细胞系的条件培养基进行纯化，分离到一种抑制性肽，它被证明与以前所描述的细胞因子，巨噬细胞炎性蛋白1-α(MIP-1α)，相同。因此，MIP-1α是从细胞系分离得到的，而不是从初级材料得到的。尽管Graham等观察到MIP-1α抗体消除了骨髓粗提取物的活性，但其他工作者的研究表明其它抑制活性是重要的。例如，Graham等(J.Exp.Med.178：925-32，1993)提出TGFβ，而不是MIP-1α是造血干细胞的一个基本抑制因子。Eaves等(PNAS90：12015-19，1993)进一步提出在正常骨髓中MIP-1α和TGFβ两者都处于较理想的水平，而且抑制作用需要两个因子之间的协同作用。

其它工作者描述了另外一些干细胞抑制因子。Frindel和其同事从胎牛骨髓和肝脏提取物中分离了一种四肽，它有干细胞抑制活性(Lenfant et al.，PNAS86：779-782，1989)。Paukovits等(Cancer Res，50：328-332，1990)表征了一种五肽，当它以单体形式存在时是一种抑制因子，当它以二聚体形式存在时是一种干细胞周期刺激因子。在各种离体系统中，还有一些因子也被认为是抑制性的(见Wright和Pragnell，Bailliere’s  ClinicalHaematology v.5，pp723-39，1992(Bailliere Tinadall，Paris))。

Tsyrlova等(SU1561261 Al)公开了干细胞增殖抑制因子的纯化方法。

至今，这些因子还没有一个被批准用于临床。然而，确实需要有效的干细胞抑制因子。与化疗或放疗有关的主要毒性是破坏了正常增殖的细胞，导致骨髓抑制和胃肠毒性。一个有效的干细胞抑制因子将保护这些细胞并使治疗方案最优化。正如根据临床情况，对各种刺激性细胞因子(即如下细胞因子：IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-13、IL-14、IL-15、G-CSF、GM-CSF、红细胞生成素、血小板生成素、干细胞因子，flk2/flt3配基等等，它们刺激造血细胞周期)有确定的需要一样，对各种抑制性因子可能也有不同的临床需要。

血红蛋白是一种高度保守的具有约64,000道尔顿分子量的四聚体蛋白，它由两条α链和两条β链组成。每条链结合一个血红素分子(亚铁血红素IX)，一个含铁辅基。脊椎动物α和β链可能来源于单一的祖先基因，该基因被复制，然后分开；在链自身之间和不同脊椎动物之间，两条链在很大程度上存在序列一致性(见图16A)。在人类中，16号染色体上的α链簇含有两个编码相同多肽的α基因(α₁和α₂)，以及编码其它α样链的基因：ζ、θ和几个非转录的拟基因(见图16B人α链的cDNA和氨基酸序列)。11号染色体上的β链簇由以下基因组成：一个β链基因和几个β样基因：δ、ε、Gγ和Aγ，以及至少两个非表达的拟基因(见图16C人β链cDNA和氨基酸序列)。

在发育过程中，这些基因的表达发生变化。在已被深入表征的人的造血过程中，胚胎成红细胞成功地合成了两个ζ链和两个ε链的四聚体(GowerI)，两个α链和两个ε链的四聚体(GowerII)或两个ζ链和两个γ链的四聚体(Hb Portland)。随着胚胎发生的进程，占优势的形式由胎儿血红蛋白(Hb F)构成，它由两个α链和两个γ链组成。成人血红蛋白(两个α链和两个β链)在胎儿期开始合成，在出生时大约50％的血红蛋白具有成人的形式，大约到6月龄时转换完成。在成人中，血红蛋白的绝大部分(大约97％)是具有两条α链和两条β链的种类(Hb A)以及少量的可检测到的Hb F或δ链(Hb A2)。

血红素对血细胞生成的影响已被广泛地研究(见S.Sassa，Seminars Hemat.25：312-20，1988和N.Abraham et al.，Int.J.Cell Cloning9：185-210，1991 for reviews)。成红细胞的成熟需要血红素，在体外，氯化血红素(氯化亚铁血红素IX-即带有一个氯离子的血红素)增加CFU-GEMM、BFU-E和CFU-E的增殖。同样，氯化血红素增加长期骨髓培养中的细胞结构(cellularity)。

I.癌症的化疗与放疗

对刺激性生长因子的大量有成果的研究导致许多这些因子(红细胞生成素、G-CSF、GM-CSF等等)在临床上的应用。这些因子已经降低了与化疗和放疗有关的死亡率和发病率。通过阻断干细胞进入细胞周期从而使它们避免毒副作用这样的可选择的策略，可以意识到对接受化疗或放疗的病人的其他临床益处。

II.骨髓移植

骨髓移植(BMT)对于各种血液病，自身免疫病和恶性疾病是一个有用的治疗措施；目前的治疗包括从脐带血或外周血(未活化的或用例如G-CSF的药剂活化的)以及骨髓获得造血细胞。造血细胞的间接体内(ex vivo)操作目前被用于将初级干细胞扩增成适于移植的群体。该方法的最适化要求：(1)足够数目的能够维持长期造血重建的干细胞；(2)抗宿主诱导的T淋巴细胞的移植物的排除；(3)残存恶性细胞的缺失。该方法能够用包括干细胞抑制因子的间接体内扩增而被最优化。

为了清除残留的恶性细胞而用细胞毒药物净化造血细胞的效果受到这些化合物对正常造血细胞，尤其是干细胞的毒性的限制。这就需要在净化过程中对正常细胞进行有效保护；保护作用可以通过使用有效的抑制因子使干细胞脱离细胞周期而实现。

III.收集外周干细胞

对于自体移植，外周血干细胞(PBSC)具有许多超过骨髓的潜在优点。由于涉及肿瘤或以前接受放疗而没有合适的骨髓采集部位的病人仍然能进行外周血干细胞收集。血干细胞的应用很好地排除了全身麻醉及对不能耐受的病人进行外科手术的需要。收集血细胞所必需的单采血液成分(apheresis)技术是行之有效的而且在大多数医疗中心可以广泛应用。该方法的主要限制是在用药物或生长因子(例如：环磷酰胺、G-CSF、干细胞因子)活化后在外周血中干细胞的低正常稳定状态频率和高细胞周期状态。一种有效的干细胞抑制因子对使细胞回到静止状态，从而防止它们在分化过程中丢失是有用的。

IV.过度增殖性失调的治疗

许多疾病以过度增殖状态为特征，在该状态中，异常调节的干细胞引起终期细胞过度生成。这些疾病状态包括，但不限于，有上皮细胞过度增生的银屑病，以出现小肠息肉为特征的胃肠道癌前状态。干细胞抑制因子对于治疗这种情况的疾病是有用的。

V.基因转移

将遗传信息转移到造血细胞的能力目前正被用于临床。对于基因治疗来说，造血细胞是最有用的靶，因为间接体内操作及处理这一组织时容易进行且有广泛的经验，而且血细胞能渗入组织。更进一步讲，通过将有功能的基因插入到人的造血系统的初级干细胞中，可以使人的某些遗传缺陷得以纠正。

用逆转录病毒载体或基因转移的物理技术将基因导入人的造血细胞中存在几个限制：(1)造血组织中的干细胞频数低，必须发展高效基因转移技术；(2)周期越短的干细胞对于载体的易感性就越高，但是通过用生长因子刺激干细胞增殖导致感染率的增加对长期基因表达产生相反的效应。因为，含有转基因的细胞被迫进行不可逆分化，并丧失它们的自我更新能力。这些问题能够通过使用干细胞抑制因子得以改善，从而防止分化和自我更新能力的丧失。

发明概述

本发明涉及属于干细胞增殖抑制因子的多肽(“INPROL”)及其应用。

本发明包括以如下性质为特征的干细胞增殖抑制因子：

(a)在鼠脾集落形成(CFU-S)试验中比活(IC₅₀)小于或等于20ng/ml(见实施例4)，

(b)分子量大于10,000，小于100,000道尔顿(通过超滤)，

(c)活性对胰蛋白酶降解敏感，

(d)比MIP-1α和TGFβ更疏水且可通过反相层析与二者分离(见实施例12)，

(e)在水溶液中，在37℃、55℃或75℃下加热1小时后保留生物学活性，

(f)用1％盐酸丙酮沉淀后保留生物学活性。

本发明被进一步表征，并通过在短期预培养(见实施例5)后在体外试验中获得抑制作用的能力将其与其他侯选干细胞抑制因子(例如，MIP-1α、TGFβ和各种寡肽)区分开来。

本发明也包括含有治疗各种疾病的INPROL的药物组合物。

本发明提供一个通过施用有效量的干细胞抑制组合物而治疗预先暴露于能造成干细胞死亡或损伤的药剂的患者的治疗方法。通过这种方法保护的干细胞可能是通常在骨髓中存在或分裂的造血干细胞。此外，干细胞可能是位于例如小肠或头皮或身体的其它部位的上皮细胞，或位于生殖器官的生殖细胞。虽然动物治疗也在本方法的范围内，但本发明的方法可以被合乎需要地应用于人类。作为在此处使用的术语，“患者”或“病人”涉及动物，比如哺乳动物，包括人。

在另一方面，本发明为保护和恢复经受化疗的病人的造血、免疫或其它干细胞系统提供了方法，其包括对病人施用有效剂量的INPROL。

另一方面，本发明涉及对任何癌症的辅助治疗方法，其中包括以实体瘤为特征的那些癌症，该方法是通过对患癌症的病人施用有效剂量的INPROL来保护骨髓、胃肠道及其它器官的干细胞免受化疗和放疗的毒性作用而完成的。

本发明的另一方面还涉及白血病的治疗，包括用有效剂量的INPROL处理含有增殖性白血病细胞的造血细胞，以抑制正常干细胞的增殖，以及用能破坏白血病细胞的细胞毒药剂处理骨髓。该方法可以通过随后使用刺激骨髓增殖的其它药剂(例如集落刺激因子)处理骨髓而提高疗效。在一个具体实施方案中，该方法是在体内进行的。此外，该方法对间接体内净化和扩增用于移植的造血细胞也是有用的。

另一方面，本方法涉及治疗患有由干细胞增殖引起的任何疾病的患者。这些疾病，如银屑病、脊髓发育不良、一些自身免疫病、老年性免疫低下均可通过对患者施用有效剂量的INPROL部分抑制干细胞的增殖而得到治疗。

本发明提供了一种可逆性保护干细胞免于可杀伤或损害干细胞的细胞毒药剂对其损伤的方法。该方法包括对预先暴露于这类药剂的患者施用有效剂量的INPROL。

本发明也提供：

通过下述方法从猪或其它骨髓中(见实施例12)分离的干细胞增殖抑制因子。

(a)提取骨髓，通过过滤去除颗粒状物质，

(b)56℃加热处理40分钟，随后冰浴冷却，

(c)通过4℃，10000g离心30分钟去除沉淀，

(d)将上清加入10倍体积的搅拌的冰冷的丙酮(含1％体积浓盐酸)，4℃，保温16小时进行酸沉淀，

(e)4℃，20,000g离心30分钟分离沉淀，用冷丙酮洗，随后干燥，

(f)通过反相层析分离，用5-氟尿嘧啶预处理并在鼠IL-3存在下培养的骨髓细胞抑制集落形成，以及通过280nm吸收和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳来监测活性。

本发明也提供：

基本上不含其它蛋白类物质的干细胞增殖抑制因子的纯化方法，该方法包括上述步骤，将在下面详述。

本发明也提供：

对人或动物的治疗方法，其中所说的干细胞增殖抑制因子能起到改善由于细胞过度增殖而引起的免疫抑制的作用。

本发明也提供：

对人或动物的治疗方法，其中所述干细胞增殖抑制因子的施用是在将干细胞暴露于细胞毒药剂或辐射而诱导增殖后进行的。干细胞通常是处于静止期，但化疗后被激活而进入细胞周期。这意味着它们对第二次化疗更敏感；本方法保护它们免于这种治疗。

本发明也提供：

对人或动物的治疗方法，其中为了加强免疫应答，所述干细胞增殖抑制因子可作为辅剂在接种前或与接种一起施用。

本发明也提供：

对接受细胞毒药物或辐射治疗的人或动物的治疗方法，它包括施用有效剂量的干细胞增殖抑制因子来保护干细胞免于伤害。

本发明也包括一种药物组合物，它包含血红蛋白和药用载体。

本发明也包括一种药物组合物，它包含：(a)选自血红蛋白α链、β链、γ链、δ链、ε链和ζ链的多肽，和(b)一种药用载体。这种药物组合物可以由从上述物组中选出的带有或不带有血红素的单一多肽，多肽混合物或二聚体或多聚体形式的多肽组成。

本发明也包括具有如下序列的多肽：

Phe-Pro-His-Phe-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val，

Cys-Phe-Pro-His-Phe-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys，

其中的两个半胱氨酸残基形成一个二硫键

Cys-Phe-Pro-His-Phe-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys，

其中的两个半胱氨酸通过一个碳桥相连，和

Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-Ala-His-Val-Asp-Asp-Met-Pro-Asn-Ala-Leu-Ser-Ala，

本发明也包括编码上述已确定的肽的DNA序列，含有所述DNA序列的载体和含有所述载体的宿主细胞。通过用标准化学技术(例如固相合成)或重组技术(例如融合系统，如那些使用谷胱甘肽-S-转移酶(D.B.Smith and K.S.Johnson，Gene67：31-40，1988)，硫氧还蛋白(LaVallie et al.，Biotechnology 11：187-193，1993)或泛素(Butt et al.，PNAS86：2540-4，1989；US Patent5,391,490)的融合系统)合成这些肽类。

此外，本发明还包括抑制干细胞增殖的方法，它包括将造血细胞与一种能结合阿片受体(优选阿片受体的μ亚类)的化合物接触。某些肽类(被称为“hemorphin”)已从血红蛋白中被分离得到，其表现出阿片样的活性(例如：Brantl et al.，Eur.J.Pharm，125：309-10，1986；Davis et al.，Peptides 10：747-51，1989；Karelin et al.，Bioch.Biophys.Res.Comm，202：410-5，1994；Zhao et al，Ann.N.Y.Acad.Sci750：452-8，1995)。各篇文献在此引入作为参考。

本发明还包括抑制干细胞增殖的方法，它包括用选自具有下列序列的hemorphin肽与造血细胞接触：

Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe，

Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg，

Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln，

Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr，

Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp，

Leu-Val-Val-Tyr-Pro，

Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln，

Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe，

Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg，

Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln，和

Tyr-Pro-Trp-Thr。

以上肽类与其它阿片样肽类，如Tyr-MIF-1家族的一些肽类(见Reed et al.Neurosci.Biobehav.Rev.18：519-25，1994 forreview)，酪蛋白衍生的酪吗啡因(Brantl et al.，Hoppe-Seyler’sZ.Physiol.Chem.360：1211-16，1979；Loukas et al.，Biochem.22：4567-4573，1983；Fiat and Jolles，Mol Cell.Biochem.87：5-30，1989)，细胞色素b衍生的，被命名为cytochrophins的肽类(Brantl et al.，Eur.J.Pharm.111：293-4，1985)以及来自被筛选出结合阿片受体的组合文库的肽类有序列相似性。(见Dooley et al.，Peptide Research 8：124-137，1995 forreview)。各篇文献在此引入作为参考。

本发明也包括抑制干细胞增殖的方法，它包括将选自Tyr-MIF-1相关的肽类，酪吗啡因和cytochrophins的一种肽与造血细胞接触。特别包括具有这样序列的Tyr-MIF-1肽类。

Tyr-Pro-Trp-Gly-NH₂，

Tyr-Pro-Lys-Gly-NH₂，

Tyr-Pro-Leu-Gly-NH₂，和

Pro-Leu-Gly-NH₂。

本发明也包括在哺乳动物中实施基因治疗的方法，它包括：

a)从所说的哺乳动物中分离出造血细胞，

b)可选地，用至少一种刺激性细胞因子间接体内地处理所述造血细胞，以诱导干细胞增殖，

c)用预先确定的基因转染所述造血细胞，

d)用INPROL间接体内地接触所述转染的造血细胞，

e)向哺乳动物移植步骤d的造血细胞，

f)可选地，在体内用INPROL处理所述的哺乳动物。

本发明也包括间接体内进行干细胞扩增的方法，它包括用INPROL和至少一种刺激性细胞因子处理所说的造血细胞。在与刺激性细胞因子作用前、作用过程中和/或作用后，INPROL与造血细胞作用。

本发明也包括一种药物组合物，它包括(a)INPROL和(b)至少一种抑制性化合物，它选自MIP-1α、TGFβ、TNFα、INFα、INFβ、INFγ、五肽pyroGlu-Glu-Asp-Cys-Lys，四肽N-乙酰-Ser-Asp-Lys-Pro和三肽谷胱甘肽(Gly-Cys-γGlu)。

本发明还包括一种药物组合物，它包括(a)INPROL和(b)至少一种选自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-13、IL-14、IL-15、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、红细胞生成素、血小板生成素、干细胞因子和flk2/flt3配基的刺激性化合物。

本发明描述一种干细胞抑制因子(INPROL)，它不同于本领域已知的细胞抑制因子，如MIP-1α、TGFβ、Frindel和其同事们的四肽、Paukovits和同事们的五肽(cf.，Wright & Pragnell.1992(op.cit))。通过超滤测得天然存在的INPROL的分子量超过10,000道尔顿，该分子量不同于四肽以及五肽。在反相层析系统中它比MIP-1α或TGFβ更疏水，所以明显不同于那些细胞因子。此外，它的作用方式不同于以前所述的任何一种抑制因子，当仅在预培养阶段使用时，它在体外试验中仍具有活性。例如，MIP-1α仅在预培养阶段使用时活性丧失(实施例5)。此外，天然存在的INPROL在测定“高增殖潜能细胞”(HPP-PFC)试验中是有活性的，而MIP-1α无活性(实施例6)。

附图简述

图1-4显示各阶段的纯化产物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。

图1-第1泳道是糜蛋白酶原，第2泳道是卵白蛋白，第3泳道是牛血清白蛋白，第4泳道是分子量小于30kD的级分，第5泳道是分子量为30-50kD的级分，第6泳道是分子量为50-100kD的级分。

图2-第1泳道是(40-80％)硫酸铵沉淀，第2-5泳道是DEAE级分(第2泳道代表活性级分)。

图3-第1泳道是硫酸铵沉淀后的上清，第2泳道是DEAE活性级分，第3-5泳道是凝胶过滤级分(第5泳道代表活性级分)。

图4-第2泳道代表终产物。

图5-显示最后纯化作用的反相高压液相层析。

图6-显示³H-胸苷掺入(CPM)FDCP-mix系的细胞中，不含(对照＝0％抑制)和含各种浓度从猪骨髓纯化的INPROL(pINPROL)。数据相对对照值而归一化。

图7-显示用丙酸睾酮(TSP)、TSP+pINPROL，或载体(对照)处理小鼠后在细胞周期的S期中的细胞百分数。每组含25只动物(每个时间点3-4只)。

图8-显示用两剂量的5-FU处理小鼠，用或不用pINPROL处理小鼠后，小鼠的存活情况。每组含30只动物。

图9-显示用或不用pINPROL处理的受辐射小鼠的存活情况。每组含50只动物。

图10A和10B-显示用Ara-c或Ara-c+pINPROL处理1周(10A)和3周(10B)后正常骨髓长期培养细胞的再生情况。

图11-显示用致死剂量照射并移植用培养基(对照)或含pINPROL(25ng/ml)培养基培养4小时后的3×10⁴骨髓细胞的小鼠的存活情况(每组75只)。对存活情况监测30天。

图12-显示用致死剂量照射后，小鼠骨髓细胞培养物14天后形成的CFU-GM数，和供体骨髓细胞用pINPROL或培养基预培养4小时后CFU-GM的恢复情况。

图13-显示每周取出的淋巴长期培养物的悬浮细胞，该培养物被清洗，在用培养基或pINPROL预培养4小时后用IL-7(10ng/ml)铺板。

图14-显示用pINPROL处理的白血病外周血细胞改善的再聚集能力。

通过含和不含pINPROL平板的粘附和非粘附LTC细胞测定长期培养初始细胞(LTC-IC)，并在第7天计数CFU-GM。数据与对照值对比使之标准化。

图15A-显示在53％乙腈时洗脱的纯pINPROL的C₄反相层析。第1泳道是粗样品，第2泳道是分子量标准，第3泳道是纯化样品。图15B显示在43.9％乙腈时洗脱的MIP-1α的C₄反相层析。图15C显示pINPROL粗样品和反相层析后纯化样品的SDS-PAGE谱图。

图16-显示血红蛋白序列：图16A显示人α血红蛋白的cDNA和氨基酸序列，图16B显示人β血红蛋白的cDNA和氨基酸序列。根据氨基酸进行计数。图16C显示人、鼠、猪血红蛋白的α、β链的氨基酸序列的比较。

图17-显示pINPROL的C₄反相高压液相色谱图(图17A)与晶化猪血红蛋白的C₄反相高压液相色谱图(图17B)的比较。

图18-显示晶化猪血红蛋白的C₄反相高压液相色谱级分的SDS-PAGE凝胶。第1泳道显示标准分子量，第2泳道显示来自第一个峰(在47.11分钟)的级分48-49，第3泳道显示来自第二个峰(在49.153分钟)的级分50-51，第4泳道显示来自第三个峰(在52.25分钟)的级分54-55，第5泳道显示来自第四个峰(在53.613分钟)的级分56-57。

图19-显示pINPROL(图19A)与纯化的猪β血红蛋白(图19B)的二维凝胶电泳的比较。

图20-显示纯化的猪α血红蛋白、β血红蛋白或pINPROL在FDCP-MIX分析中的作用的比较。

图21-显示用浅洗脱梯度反相分离猪血红蛋白。

为了使本文描述的发明被更充分地理解，下面将对其进行详述。这个描述，是本发明的实例，不能被认为是特别限制本发明，本领域技术人员知道的那些变化将被认为属于本发明的范围。

优选实施方案详述

INPROL可逆性地抑制干细胞分裂。具体地说，在暂时抑制造血干细胞分裂上，INPROL是有效的。因此，本发明方法可被应用于减轻化疗对病人的造血、骨髓和免疫系统的不希望有的副作用，这是通过保护干细胞免于用于消灭癌细胞或病毒感染细胞的化疗药物或辐射所造成的损害而实现的。在本发明的一个实施方案中，给病人以足够剂量的INPROL来抑制干细胞分裂，而化疗药物作用于患病细胞。化疗药物起作用后，由INPROL抑制的干细胞不需要进一步处理即可回复到分裂细胞。如果想要增强造血功能的再生，可另外使用刺激性生长因子或细胞因子。

此处使用的术语“INPROL”包括如在实施例中纯化的哺乳动物蛋白、血红蛋白、血红蛋白的α链(带或不带血红素基团)、血红蛋白的β链(带或不带血红素基团)、α和β链的混合物(带或不带血红素基团)、以及具有抑制干细胞增殖能力的这些蛋白质的片段或类似物，包括胚胎形式，胎儿形式和成人形式(例如α、β、γ、δ、ε或ζ链，单独存在或是混合物，二聚体或是多聚体，含有或是不含有血红素基团)。术语“INPROL”包括天然存在以及非天然存在(例如重组产生的)形式的这些蛋白质。

在典型的临床情况中，病人每天静脉注射或输注剂量单位形式的INPROL，所用剂量为例如0.01-100mg/kg，优选0.1-1.0mg/kg，在例如标准化疗或放疗前4-60小时前施用INPROL。

在本发明的另一实施方案中，用INPROL预先治疗可以提高化疗药物或辐射剂量，使之超出患者能够正常耐受的剂量范围。

大部分造血干细胞在正常情况下处于静止期(不在细胞周期中)。然而作为对化疗诱导的造血损伤的代偿反应，化疗后一大部分干细胞进入细胞周期，这使之特别易受随后的细胞毒化疗或治疗性放射剂量的损害。通过抑制这些干细胞的细胞周期，INPROL治疗允许更早或更频繁地随后施用细胞毒化疗，不管是用常规剂量还是提高的剂量。

在本发明的一个实施方案中，初次剂量的化疗约24小时到10天后施用INPROL(0.1mg～6g，优选1.0～60mg)。再过4-60小时，优选24～48小时后，实施另一剂量的化疗。根据疗效，持续进行化疗和INPROL的交替循环。化疗药物和施用方案是根据适合在标准临床实践中的具体肿瘤类型而选择的。可选地，在化疗或放疗后，为了进一步促进造血功能重建，使用激活性生长因子，如G-CSF、干细胞因子。

对于间接体内应用，可使用0.1ng-100ng/10⁶细胞/ml，优选20-50ng/10⁶细胞/ml的INPROL。

在本发明的另一实施方案中，INPROL被用于制备用于移植的自体造血细胞。用有效量的INPROL间接体内处理造血细胞以抑制干细胞分裂，然后，对骨髓培养物施用有效量的化疗药物或辐射以清除癌细胞。对进入细胞周期的细胞有专一性的化疗药物是优选的。这样处理后的骨髓被再输入自身供体。任选地，用一种已知刺激造血的药物治疗病人以促进病人造血功能的重建。

在本发明的另一实施方案中，INPROL被用于治疗白血病时的辅助性治疗。例如，在白血病细胞不响应INPROL的疾病状态中，用INPROL间接体内处理白血病造血干细胞。正常干细胞的增殖通过施用INPROL而被阻止。因此，在这期间用一个细胞周期特异性的细胞毒药物处理增殖的白血病细胞，防止了正常干细胞群的损伤。此外，在药物或辐射治疗过程中，选择性地使用刺激性细胞因子如IL-3或GM-CSF，诱导白血病细胞进入细胞周期而正常干细胞被所用的INPROL保护。用化疗药物或辐射治疗病人以消灭白血病细胞，然后将净化的骨髓移植给病人以进行造血功能的重建。

同样地，在另一个治疗严重病毒感染血细胞或淋巴细胞如HIV感染病人的实施方案中，造血细胞间接体内地用INPROL处理，随后用抗病毒药物，消灭感染细胞的药物或基于抗体的系统清除感染细胞。随后用成髓(myeloablative)抗病毒剂或成髓化疗根除病人的病毒宿主细胞，将INPROL处理的骨髓细胞回输给病人。

INPROL被用于治疗与干细胞过度增殖有关的疾病。例如，银屑病是一种由皮肤上皮细胞过度增殖引起的疾病，有时用细胞毒药物治疗。其它涉及干细胞增殖的前瘤的损害也适合用有效剂量的INPROL，它被用于完全或部分抑制干细胞的增殖。对于这些应用，含有INPROL的局部或透过皮肤传递的组合物(例如油膏、洗液、凝胶或贴膏)被用于合适的部位，作为肠道用药的替代。在大多数白血病中，白血病祖细胞(leukemia progenitor)是分化的细胞群，它不受INPROL的影响，因此，可用上述的使用INPROL的方法治疗。在白血病祖细胞是非常初级的，并且对INPROL的抑制非常敏感的情况下，可以通过施用有效剂量的INPROL使白血病细胞的增殖减弱。

用标准技术对INPROL多肽产生单克隆或多克隆抗体。用在本领域中已知的许多可检测的标记物标记这些抗体或INPROL多肽。通过以诊断目的直接将其施用给患者，这些标记的INPROL或抗INPROL抗体作为干细胞的标志被用于鉴定和分离干细胞。此外，这些标记的多肽或抗体间接体内地被用于鉴定造血细胞制备物中的干细胞，从而在净化骨髓中的前瘤细胞时能够去除这些干细胞。用相似的方式，这些标记的多肽或抗体被用于鉴定和分离上皮干细胞或其它干细胞。此外，这些标记的或未标记的抗体，可以通过中和INPROL活性而治疗性地应用或通过检测循环的(circulating)INPROL的水平而诊断性地应用。

INPROL能用标准技术从人基因或表达重组的人INPROL的cDNA文库中克隆。例如，用从纯化蛋白中获得的序列信息，构建能被标记(例如用³²P标记)的寡核苷酸探针，用它来筛选合适的cDNA文库(例如：来自骨髓)。可选地，用抗体或合适的功能分析方法(例如实施例2所述)从合适的来源(例如骨髓)中筛选编码INPROL的cDNA表达文库。血红蛋白本身，以及单独的α，β链，已经用在本领域中已知的方法克隆并表达(见Pagnier et al.，Rev.Fr.Transfus.Hemobiol.35：407-15，1992；Looker et al.，Nature 356：258-60，1992；Methods in Enzymology Vol.231，1994)。各篇文章在此引入作为参考。

本发明包括这样的DNA序列，它包括：引入用于选定的非哺乳类宿主表达的“优选”密码子；提供限制性内切酶的切割位点；提供附加的起始、终止或调节DNA序列，该序列有利于构建适于表达载体或产生或纯化血红蛋白的α、β、γ、δ、ε和/或ζ链。

本发明也提供编码血红蛋白α、β、γ、δ、ε和/或ζ链的多肽类似物或衍生物的DNA序列，这些序列从一个或更多氨基酸残基的相同性或其位置来说不同于天然型(即：缺失型类似物含有少于所有特定残基的残基；替代型类似物的一个或更多的特异残基被其它残基取代；添加型类似物中有一个或更多的氨基酸残基被加到多肽的末端或中间部分)，但它具有天然型的部分或所有的性质。

在优选的实施方案中，INPROL是通过基因组或cDNA克隆或通过基因合成得到的外源DNA序列在原核或真核宿主中表达的表达产物(例如通过培养的细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳类细胞)。即，在优选的实施方案中，INPROL是“重组的INPROL”。在典型的酵母(例如酿酒酵母)或原核(例如大肠杆菌)宿主细胞中的表达产物与任何哺乳类的蛋白无关，在脊椎动物细胞中的表达产物(例如非人类的哺乳类(例如COS或CHO)和鸟类)与任何人类蛋白无关。根据所采用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的或非糖基化的。本发明的多肽也可任选地包括起始的甲硫氨酸残基(在第一位)。

本发明也包含如血红蛋白α、β、γ、δ、ε和/或ζ链的多肽类似物的其它产物。这些类似物包括：血红蛋白的α、β、γ、δ、ε和/或ζ链的片段。根据已知方法，人们能容易地设计和制造编码适合多肽的微生物表达的基因，这些多肽的一级序列不同于本文从一个或更多残基的相同性或其位置来具体说明的多肽(例如替代、末端和中间添加及缺失)。通过熟知的定点突变技术很容易地完成cDNA和基因组基因的修饰，并用于产生血红蛋白α、β、γ、δ、ε或ζ链的类似物和衍生物。此类产物至少具有INPROL的生物学活性之一，但在其它方面可能不同。例如，本发明的产物包括α、β、γ、δ、ε或ζ链，它们通过缺失被缩短；或它们对水解更稳定(因此，可能比天然型有更明显或长期的效应)；或它们已被改变为缺失或加入一个或更多个潜在O-糖基化和/或N-糖基化位点，或它们有一个或更多的半胱氨酸残基缺失或被丙氨酸、丝氨酸残基取代，而且从微生物系统中更容易以活性的形式被分离；或者它们有一个或更多的酪氨酸残基被苯丙氨酸取代而且或多或少易与靶蛋白结合或靶细胞的受体结合。也包括的是只复制一部分连续的氨基酸序列的多肽片段或者在α、β、γ、δ、ε或ζ链内的二级结构，这些片段可能具有INPROL的一个特性(例如结合抗体)，没有其它特性(例如干细胞抑制活性)。值得注意的是，为了使本发明的任何一个或多个产物有治疗用途或其它用途(如抑制因子拮抗作用的检测)，这些产物的活性不是必需的(见Weiland et al.，Blut44：173-5，1982)。在干细胞抑制因子或其受体过度产生的情况下，竞争性拮抗剂是有用的。

此外，源于保留了生物学活性的蛋白序列的多肽可以用标准的方法化学合成。本发明也提供编码血红蛋白α、β、γ、δ、ε和/或ζ链的多肽类似物或衍生物序列，从一个或更多氨基酸残基的相同性或其位置来说，这些多肽类似物或衍生物不同于天然型(例如缺失型类似物含有少于所有特定残基的残基；替代型类似物，其中一个或更多的特定残基被其它残基取代；无论是天然存在还是在本领域中已知的其它类似物如D-氨基酸；添加型类似物，其中一个或更多的氨基酸残基被化学修饰以增加稳定性、可溶性和/或抗蛋白水解性)，但它们具有天然型的一些或所有的性质。

通过不同方法能够鉴定以上所述的肽序列。天然血红蛋白活性链(例如α链)的三维结构与结构相关的无活性蛋白(例如肌红蛋白)的比较能够鉴别出在三维空间中具有不同构象的区域，这些区域是活性肽类的候选区域。另一方法用选择性的蛋白水解，在此方法中，用蛋白水解酶有限地消化血红蛋白的链产生可分离(例如通过反相高压液相色谱，然后对干细胞抑制进行分析)的肽类，。通过化学合成也可严生肽类(例如固相合成)；一系列包含感兴趣的血红蛋白链序列(例如：α链)的重复肽类(例如15聚体)能非常容易地产生并在干细胞分析中被检测。通过多步化学合成能产生组合文库，并且选择的氨基酸位置是可变化的，导致有许多肽类似物有待于筛选(例如Dooley et al.，Peptide Research8：124-137，1995)。另外，可以应用重组方法，用直接点突变鉴定特定血红蛋白链的活性所必需的重要残基。被认为具有干细胞抑制因子活性区域的链(例如α链)能够被来自相关但无活性的蛋白(例如肌红蛋白)的区域所替换，并在干细胞活性分析中检测，以鉴定活性必需区。这样鉴定的区域能够被作为肽类表达并在干细胞周期分析中检测活性。

来自其它种系的同源或类似形式的INPROL被用于兽医的不同方面，类似于上面所述的本发明的治疗实施方案。

INPROL通过使细胞可逆性地处在非分裂的“静止状态”而作用于细胞周期干细胞。当需要刺激静止期的干细胞进入分裂期时(例如在用癌症化疗药物或辐射治疗病人后)给病人施用集落刺激因子和其它造血刺激物。这些因子包括但不限于：M-CSF(CSF-1)、GM-CSF、G-CSF、巨核细胞-集落刺激因子、血小板生成素、干细胞因子或其它细胞因子如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14或红细胞生成素。

通过常规的化学方法并结合适当的对干细胞抑制活性的生物分析，纯化或合成了有干细胞抑制活性的INPROL多肽或活性片段，示例见下文描述的方案。

在本发明的实施方案中，治疗有效量的INPROL蛋白或其治疗有效片段与药用载体混合使用。这种INPROL组合物一般通过肠胃外注射或输注给药。根据要达到的治疗效果可以选用皮下注射、静脉内注射或肌肉内注射。

当全身性地施用时，用于本发明的治疗组合物是以无致热原，肠道可吸收的水溶液形式存在。具有一定pH值、等渗性、稳定性、载体蛋白等等的药用无菌蛋白溶液，是本领域技术人员熟知的。

本发明还包括药物组合物，其包含本发明的多肽产物与合适的稀释剂、保护剂、增溶剂、乳化剂、辅助剂和/或在INPROL治疗中有用的载体。这里使用的“治疗有效量”是指对给定情况和实施范围提供治疗效果的剂量。这样的组合物是液体、凝胶、油膏或冻干的或其它的干制剂，而且包括各种缓冲成分的稀释剂(例如：Tris-HCl、醋酸盐、磷酸盐)、pH值和离子强度、添加剂，如防止表面吸附的白蛋白或明胶、去污剂(例如吐温20、吐温80、Pluronic F68、胆酸盐)、增溶剂(例如甘油、聚乙二醇)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠)、保护剂(例如硫抑汞、苯乙醇、对羟苯甲酸酯)、填充剂或渗透压修饰剂(例如乳糖、甘露糖醇)、共价多聚附着物如聚乙二醇与蛋白质，与金属离子形成的络合物，或将这些物质掺入多聚化合物(例如多聚乳酸、多聚乙醇酸、水凝胶等)颗粒制剂内部或表面，或掺入脂质体、niosome、微乳糜颗粒、分子团、单层或多层囊泡、可注射的生物降解胶囊或微球，或蛋白基质、血影、原生质球、皮肤附贴膏或其它已知释放或包装药物的方法。这些组合物将影响INPROL的物理状态、溶解性、稳定性、体内释放率和体内的清除率。可控的或缓释的组合物包括亲脂性容纳物(例如脂肪酸、腊、油)的制剂。本发明也包括用多聚物(例如poloxamers或poloxamine)包裹的颗粒组合物及与抗组织特异性受体、配基或抗原偶联或与组织特异性受体的配基偶联的INPROL。本发明组合物的其它实施方案涉及保护性包衣的颗粒形式、蛋白酶抑制因子或各种途径用药(包括肠道、肺吸入、鼻、局部(皮肤或粘膜)和口腔)的渗透增加剂。在另一实施方案中，含有INPROL的组合物被局部施用，或通过透皮的贴膏使用。

在一实施方案中，本发明的组合物以剂量单位形式封装于无菌小瓶或安瓿中。

本发明也包括这样的组合物，其包含一种或更多的附加因子如化疗药物(例如5-氟尿嘧啶(5FU)、阿糖胞苷、环磷酰胺、顺氯氨铂、卡铂阿霉素、doxyrubicin、鬼臼亚乙苷、紫杉酚、烷化剂)，抗病毒药物(例如叠氮胸苷、无环鸟苷)，肿瘤坏死因子，细胞因子(例如白细胞介素)，抗增殖药物，抗代谢药物，干扰DNA代谢的药物。

对于治疗预先暴露某种细胞毒药物的病人或治疗干细胞过度增殖的方法中涉及的剂量方案由主治医生确定，要考虑各种改变药物作用的因素，例如患者病情、体重、性别、饮食，各种感染的严重性，给药的时间，以及其它临床因素。

病人暴露于细胞毒药物或辐射后，本发明的治疗方法可任选地给病人施用一种或多种淋巴因子、集落刺激因子或其它细胞因子、血细胞生成素、干扰素或生长因子，以全面刺激由先前使用INPROL治疗而被抑制的干细胞(和其子细胞)的生长和分裂。促进造血的治疗性药物包括：IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、Meg-CSF、M-CSF(CSF-1)、GM-CSF、G-CSF或红细胞生成素。这些药物的剂量是根据它们在临床试验中对化疗或干细胞移植后促进造血重建的疗效中获得的知识来选择的。这些剂量将根据病人的身体状况、化疗药的剂量和类型或病人受到的辐射剂量和类型的变化而调整。对接受治疗的病人施用INPROL引起的干细胞抑制的反向进程通过常规方法加以监测。

在白血病的治疗中，在用细胞毒药物治疗或辐射治疗中同时施用抑制正常干细胞周期的INPROL和白血病细胞生长的刺激物(如IL-3或GM-CSF)，是有益处的。通过这个方案，在正常细胞及白血病细胞的细胞周期状态之间和药物敏感性之间可能达到最大的差异。

实施例1：体内干细胞增殖抑制分析

为了测定干细胞的增殖，通过³H-TdR“自杀法”测定细胞周期S期的CFU-S数目(Becker et al.，Blood26：296-308，1965)。

在静脉内注射造血细胞后8-12天，通过受到致死剂量照射的小鼠脾中形成的宏观集落，能够在体内检测未成熟的造血祖细胞-脾脏集落形成单位(CFU-S)(Till & McCulloch 1961)。

对于标准CFU-S增殖检测分析，通常采用³H-TdR“自杀法”(Becker et al.，1965)。该方法基于DNA合成过程中放射性标记的胸腺嘧啶(³H-TdR)作为合成DNA前体物质掺入细胞内。在检测时处于细胞周期S期的CFU-S被高放射活性杀死，因此在脾脏中不能形成集落。那么，通过注射与³H-TdR共同培养的细胞样品和无³H-TdR共同培养的细胞样品所形成的CFU-S数之间的差异表明初始样品增殖CFU-S的百分数。

就抑制因子来说仅影响进入细胞周期的CFU-S，它在正常小鼠骨髓中低于总CFU-S群的7-10％。用未刺激动物的骨髓干细胞群不能进行抑制因子实验。

为了刺激CFU-S增殖，采用苯肼(PHZ)或亚致死剂量的辐射(Lord，1976)。

根据睾酮丙酸化物(TSP)对CFU-S细胞周期的刺激效应(Byron et al.，Nature.228：1204，1970)我们建立了使用TSP的方法，它简化了测定及不引起任何副作用。TSP诱导CFU-S增殖的刺激作用在注射后20～24小时出现，这种效应至少7天内均可观察到。

纯化抑制因子过程中所用筛选级分的方法如下：

小鼠、BDF₁或CBF₁小鼠系被用于全部实验。

为了诱导30-35％的CFU-S进入S期，供体小鼠按10mg/100kg剂量的TSP腹腔注射0.2ml/只鼠。24小时后取股骨骨髓制备细胞悬液。然后以5～10×10⁷/ml细胞与不同对照和实验组分在37℃水浴中培养3.5小时。每组2管(一管用于热实验(有放射性)和一管冷实验(非放射性))。

3.5小时后，³H-TdR(1毫居里/毫升、比活18-25居里/毫摩尔)加入热实验管中以每毫升细胞悬液中加入200μl体积的³H-TdR；冷实验管中什么也不加，在37℃连续培养30分钟以上。

培养30分钟后，加入10ml冷(4℃)培养基含400μg/ml非放射性胸腺嘧啶终止杀伤反应。细胞粗略洗涤(3次)，重悬细胞并稀释至注射所用的理想浓度，通常为2-4×10⁴细胞/只小鼠，用0.3-0.5ml。

受体小鼠每组8-10只，注射细胞前6小时照射，不能迟于6小时。

在第9-12天取受体小鼠脾脏，用Tellesnitsky’s液固定，通过目测计数脾结节。S期细胞的百分数用公式计算：

$\%S=\frac{a-b}{a}\×(100\%)$

其中a-没有用³H-TdR的CFU-S数

b-用³H-TdR的CFU-S数

提供在表1中的INPROL的实验数据表明，用INPROL处理后的细胞周期干细胞对³H-TdR有抗性反应。对这个及以下所有的实施例，术语pINPROL是指从猪骨髓中纯化的蛋白。对S期特异细胞毒药物阿糖胞苷、羟基脲(数据未显示)也看到了相同的保护作用。如果处理的干细胞用含非放射性胸腺嘧啶的冷培养基洗涤，在小鼠脾脏中存活干细胞增殖正常地形成集落。

表1

pINPROL与骨髓细胞培养4小时期间对CFU-S增殖的抑制活性

组别	-3H-TdR	+3H-TdR	3H-TdR杀伤CFU-S百分数
				未培养	22.2±2.0*	13.7±2.4*	38.3±1.7
用培养基培养4小时	18.7±3.0*	11.4±1.3*	43.1±1.4
				用pINPROL培养4小时	21.2±2.3*	20.7±2.6*	2.1±0.08

^*每2×10⁴细胞的CFU-S

实施例2体外干细胞增殖抑制分析

应用下面的检测系统(Lord et al.，The Inhibitors ofHematopoiesis，pp.227-239，1987)显示了INPROL的直接效应。多系因子(IL-3)依赖细胞系FDCP mix A₄(A₄)，维持培养在IMDM培养基中，其中含20％马血清和10％WEHI-3条件培养基作为集落刺激IL-3的来源。

用³H-TdR掺入分析检测增殖：A₄细胞(5×10⁴在100μl培养基中，其中含20％马血清和50％的WEHI-3条件培养上清)在37℃，5％CO₂中培养16小时。

开始加入INPROL或粗制的BME(骨髓提取物)(组分IV)，然后向每组加入³H-TdR(3.7KBq in 50μl at 740GBq/mmol)再继续培养3小时。通过收获细胞和用下列公式计算抑制百分率测定增殖率。

在正常骨髓提取物式pINPROL的阶段剂量存在下生长的FDCPmix-A₄细胞掺入³H-TdR被显示在图6，结果显示纯化的pINPROL组分至少此初始材料活性高1000倍。对于有效抑制来说，暴露时间(16小时)是一个重要因素并显示pINPROL对干细胞A₄细胞系的直接效应。

实施例3体内注射INPROL导致CFU-S增殖抑制：剂量和作用 持续时间

体内注射INPROL的作用研究表明INPROL能有效地阻断CFU-S的募集进入细胞周期。因而，保护这些细胞免于进一步治疗时的细胞毒效应。显示出其临床潜在应用价值。

本实验方案有两个目的：体内注射时检查INPROL对CFU-S的效应及确定涉及细胞周期干细胞的INPROL活性的有效持续时间。

为了刺激CFU-S增殖，根据在例1中所提到的效应，注射睾酮丙酸化物(TSP)。

在0天BDF₁小鼠注射TSP(10mg/100g)，24小时后，每个实验组(4只/每组)的小鼠腹腔内一次性注射pINPROL 0μg、5μg、10μg和15μg/小鼠。

pINPROL注射后24小时，杀死小鼠按例1所述的分析方法测定进入细胞周期CFU-S的百分数。与未处理小鼠7％的细胞周期CFU-S相比TSP注射诱导大约50％的CFU-S进入细胞周期。pINPROL在剂量低于2μg/只鼠时就能抑制由TSP诱导的增殖作用低于正常水平。

对于效应持续时间的评价，一组小鼠(每组21只)只注射TSP，而另一组注射TSP和pINPROL(TSP注射后24h)一周内每24小时从每组中取出3只小鼠按描述的方法(例1)测定进入周期的CFU-S及测定骨髓中CFU-S周期状态。图7提供的资料表明，TSP的效应持续时间至少7天。单次注射INPROL能使CFU-S进入静止期并使它们脱离细胞周期不超过48-72小时。由于大多数用于癌症和白血病化疗的药物在体内有相当短的半衰期通常小于24小时。根据已获得的资料INPROL在体内的效应要比化疗药物如阿糖胞苷或羟基脲在体内具有活性的有效时间长，更重要地，由于在第一次化疗和放疗(对干细胞无损伤)与第二次治疗(对CFU-S损伤)之间有一个较长的间隔(长于24小时，短于96小时)在两次应用化疗药物和放射之间的间隔期内，单次注射INPROL就足够了。对于几个重复周期的细胞毒治疗或辐射治疗、根据INPROL效应的持续时间采用相同的策略。

实施例4INPROL保护用5-FU处理后立即被刺激进入细胞周 期的大多数初级造血干细胞免于暴露于第二次5-FU

5-FU能急剧减少骨髓池和淋巴池中的细胞数目。它通常被认为是细胞周期特异性的，把迅速增殖的细胞作为靶，因为在细胞周期的S期或导致细胞死亡前，核苷酸的类似物掺入到DNA上。单次剂量的5-FU不影响小鼠骨髓的长期存活及免疫造血重建。然而，实验表明(Harrison et al.，Blood 78：1237-1240，1991)多潜能造血干细胞(PHSC)在5-FU首次剂量后3-5天短暂的期间变得易受第二次剂量5-FU的损伤。它被解释为正常情况下PHSC进入细胞周期太慢，以致对单次剂量的5-FU是无效的，而且由于初次5-FU的处理所造成的刺激使PHSC迅速进入细胞同期循环。我们已经提出用INPROL能使PHSC返回到慢细胞周期状态，由此保护PHSC不受第二次5-FU治疗的损伤。

用于这些实验的小鼠是雄性BDF₁小鼠。5-FU贮存液用生理盐水配制10mg/ml。在实验的第0天每只处理小鼠通过尾静脉接受5-FU 2mg/10g体重；24小时后腹腔内注射pINPROL(10μg/100g体重)，在第3天给小鼠第二次注射5-FU，通过监测实验组(用pINPROL治疗)和对照组中的小鼠死亡进行存活研究，每组30只小鼠，存活曲线见图8。

实施例5INPROL与MIP-1α在骨髓细胞预培养中的作用

本实验的目的是比较在体外用pINPROL和MIP-1α对小鼠骨髓细胞预培养的抑制效应。

采用下面的方法：

体内：6-15周龄BDF₁小鼠，在从股骨收集骨髓前48小时在腹腔内注射5-FU，200mg/kg体重。

体外：计数一个细胞合并悬液，总量2ml含5×10⁶细胞，含或不含pINPROL或MIP-1α，含5％马血清，加L-谷氨酰胺的IMDM培养基，在37℃，5％CO₂培养4小时，然后将细胞洗2次，重新计数，按以下最终浓度细胞铺制甲基纤维素平板。

0.8％甲基纤维素

25％马血清

20ng/ml鼠重组IL-3

L-谷氨酰胺

5×10⁵细胞/ml

IMDM培养基

平板在37℃、5％CO₂、100％湿度培养11天，计数50个细胞以上的集落。

表2

组别       集落数       对照百分比

对照       31.0         100％

pINPROL    21.25        68.5％

MIP-1α    35.25        114％

实施例6INPROL抑制HPP-CFC的增殖

用于评价鼠重建干细胞和早期祖细胞的一个体外分析方法是高增殖潜能集落(HPP-PFC)分析。其它相关分析方法，例如CFU-A、CFU-GM、CFU-E和CFU-GEMM，进行性地检测有限的祖细胞群(M.Moore，Blood 177：2122-2128，1991)。这个例子显示用pINPROL预处理细胞抑制它们增殖，然而，在这些条件下MIP-1α却无此作用。

用5-FU(200mg/kg，腹腔注射)处理BDF₁小鼠，然后分析HPP-CFC数。通过离心洗细胞调浓度为1～5×10⁶/ml。培养液中加入pINPROL(25ng/ml)或者MIP-1α(200ng/ml)对照不加药物，培养细胞4小时，培养后，洗细胞并铺制琼脂平板(0.3％)含30％胎牛血清和来自5637和WEHI-3B细胞系的联合条件培养基(7.5％每种条件培养基由Sharp et al 1991推荐)在60mm平皿中铺制平板浓度为5×10⁴细胞/ml，第14天计数集落结果表示如下：

表3

组别       HPP-CFU        对照的百分比(％)

对照组     15.5±1.2      100％

pINPROL    8.3±0.7       53.5％

MIP-1α    15.8±0.9      101％

根据这些结果，MIP-1α仅在预培养期存在时不抑制大多数未成熟祖细胞的增殖。在这些条件下，pINPROL确实能有效地抑制增殖。表明pINPROL和MIP-1α之间在生物学活性方面存在根本差异。

实施例7INPROL对恢复辐射诱导骨髓再生障碍的治疗作用

骨髓再生障碍是癌症放射治疗的基本限制毒性。一些生长因子(例如G-CSF、GM-CSF，红细胞生成素)已经被证明能加速因辐射导致骨髓衰竭的恢复。通过应用干细胞增殖抑制因子起保护作用的概念是在处理造血损伤中的一个不同和互补的方法。按照早期建立的治疗方法(实施例3、4)一个致死剂量照射的小鼠模型被建立。在该领域中众所周知，接受9Gy钴-60照射的小鼠10-14天后开始死亡。到第30天死亡率大约50％。这个致死剂量被用于我们的模型，方法是把它分成两次相继的4.5Gy照射，中间间隔3天。初步数据表明，在那个模型中的存活曲线与单次用9Gy照射的存活曲线非常接近。然而，对CFU-S增殖的实验表明，首次照射后24小时，35-50％的CFU-S被诱导增殖。第二次剂量照射前给予干细胞抑制因子能保护这种细胞。

为了检测这种可能性，在第0天小鼠(50只鼠/组)接受4.5Gy照射。24小时后，一组小鼠接受pINPROL(2μg/只鼠，腹腔注射)，而另一组对照组注射生理盐水。在第3天给予第二次剂量照射(4.5Gy)。

图9表明，单次剂量pINPROL后提高了存活。这种模型的条件对治疗任何癌症与临床密切相关。包括以实体瘤为特征的肿瘤。对患有癌症病人实施这种治疗是在两个连续照射剂量之间给予一个有效剂量的INPROL。因此，对癌症的治疗允许使用较大剂量的辐射。把这种模式扩展到化疗药物也是可能的。

实施例8INPROL被用于自体骨髓移植

骨髓移植仅是已知对几种白血病有效治疗的方法(CML、AML和其它)。对于回输自体骨髓的内外条件将提供无白血病细胞污染的正常干细胞以及能够再集居于受体造血系统并有攻击性和有效治疗的潜在自体源源。

1.长期骨髓培养L₁₂₁₀白血病模型对INPROL在阿糖胞苷净化期间保护造血作用的研究

根据Tcksoz等(Blood 55：931-936，1980)建立的长期骨髓培养及白血病细胞系L₁₂₁₀，它通过2周的共培养适合长期骨髓培养。正常和白血病祖细胞同时生长出现在这些LTBMC/L₁₂₁₀联合培养基中与白血病病人的骨髓中的情况相似。通过在含有或不含WEHI-3的条件培养基(鼠IL-3产生细胞系)上生长的琼脂集落能区分正常集落形成单位(CFU)和白血病的集落形成单位。正常细胞在缺乏IL-3时进行凋亡，而白血病细胞在缺乏IL-3时能形成集落。来自LTBMC-L₁₂₁₀成分的悬浮细胞在IL-3存在下产生大约150个集落(正常造血集落)而当生长在没有IL-3(白血病集落)每50,000细胞制板的情况产生70个集落。

净化方法如下：在第0天从含LTBMC-L₁₂₁₀的培养瓶中去掉悬浮细胞和培养基(Tsyrlova et al in Leukemia：Advames inBiology and therapy v35.1988)换成2ml含200μg阿糖胞苷(AraC)的培养基。培养20小时后，用培养液洗去含AraC的原培养液并换成2ml新鲜培养基（对照组)或含25ng/ml终浓度的pINPROL的培养基培养4小时。这次预培养后，细胞被再次用含100μg/瓶阿糖胞苷的培养基在37℃培养3小时，每组4瓶，LTBMC-L₁₂₁₀培养物被洗3次并换用新鲜的LTBC培养基，继续培养3-4周作为再生研究。

图10所示资料，仅用阿糖胞苷处理的对照培养基中没有细胞生长，而在INPROL保护的培养瓶中由于来自贴壁层祖细胞的增殖造血的再生出现极快。然而，来自实验组的细胞铺在只含有IL-3的琼脂板上生长出大约100个CFU(集落形成单位)每50,000个细胞，至少在4周培养期间没有发现白血病细胞生长。因此，用有效剂量的阿糖胞苷结合INPROL在体内外处理骨髓能清除癌细胞而干细胞被受到保护。有可能把该模式扩展应用到其它形式的化疗和放射治疗中。

2.离体条件下通过INPROL处理提高骨髓再集居能力(MRA)和30天辐射防护作用

骨髓再集居能力(MRA)，是指细胞重新集居于致死剂量照射小鼠骨髓的能力以及授予30天辐射防护的能力。是一个在体内直接测定造血抑制动物的潜在恢复能力(Visser et al Blood Cells14：369-384，1988)。

对于辐射防护研究，BDF₁小鼠被照射9.5Gy通过移植睾酮刺激的供体小鼠骨髓而恢复。一组受体小鼠通过用培养基预培养4小时的骨髓细胞而恢复(对照组-A组)，另一组(B组)通过用含25ng/mlpINPROL的培养基预培养4小时的骨髓细胞而恢复。两组细胞洗涤后以每只小鼠30,000细胞移植给被照射的动物。存活资料见图11。三次实验的总和以正常对照组为100％被描述。到第30天pINPROL培养增加小鼠的存活率从对照组的36.5％升至61.8％。

通过用INPROL预培养诱导的MRA增加可能是提高辐射防护作用机制之一。为了验证这一假说，根据Visser等(op.cit)方法测定了MRA。简述如下，供体小鼠用睾酮预处理，它们的骨髓用培养基或含pINPROL的培养基预培养4小时，然后注射给被照射的动物。在第13天取受体股骨的骨髓细胞以三个不同浓度(0.01、0.05和0.1相当于一个股骨)在含有20％马血清、10％WEHI条件培养中铺制琼脂平板、第7天的细胞集落数代表MRA，就当时受体骨髓中的集落形成而言是供体的未成熟干细胞的祖细胞。

如图12所见，用INPROL预培养细胞的MRA比对照组多(B)。

实施例9INPROL对干细胞的抗过度增殖效应能改变它们的分化异常

CFU-S的过度增殖不仅在细胞毒药物或放射后恢复期可见，而且也作为正常老龄化的结果。并且被认为是脊髓发育不良综合症的一个主要特征，它伴随分化障碍。例如，红系分化占优势而沿粒系途径的分化被减弱。

骨髓细胞用含25ng/ml pINPROL的培养基或培养基(对照组)在37℃培养4小时，洗涤细胞，然后用含20％马血清，2U/ml红细胞生成素和10％WEHI条件培养基铺制琼脂平板，在第7天计数BFU-E和GM-CFU集落数。表4中总结了三次实验的资料，每组每个点4只动物，铺制4个平皿。

由表4可见，来自用INPROL未受伤害的年青动物(BDF1小鼠8-12周龄)的正常骨髓培养不改变各种类型集落的数目或比例。用睾酮-propinate(TSP)预先处理的BDF₁供体显示与以前(例1、3、4)所见的CFU-S增殖一样的增加，在红系祖细胞数目上(BFU-E集落)稍有增加，GM-CFU下降，通过用INPROL预培养这些改变将全部被消除。此外，异常高水平的CFU-S增殖返回到在细胞周期S期中CFU-S的10％。CFU-S过度增殖已知是一些种系小鼠易感于病毒白血病的一个特征，例如，Balb/c小鼠(表4)及在老龄鼠中均能观察到这现象。在TSP处理的BDF₁小鼠中所见的定型祖细胞的同样再分布在Balb/c鼠和老龄(23-25月龄)BDF₁鼠中被观察，它们具有共同的异常高水平的CFU-S增殖。通过用INPROL预培养纠正CFU-S的增殖和分化。什么与临床更密切，研究表明体内注射INPROL(2μg/只小鼠)影响CFU-S的增殖及红系(BFU-E)和GM集落的比率(表4)。

表4

INPROL对CFU-S分化成定型祖细胞BFU-E和CFU-GM的影响

骨髓供体	pINPROL	3H-TdR杀伤CFU-S百分数	BFU-E	CFU-GM
					年轻BDF1老龄BDF1TSP刺激的BDF1Balb/c	-+-+-+-+	12.0±0.315.0±1.347.1±1.911.4±0.753.2±1.67.2±0.457.0±1.923.0±2.4	28.33±1.9122.00±3.7443.75±1.5415.25±1.4532.67±2.4412.00±1.8347.86±2.9624.86±2.53	46.22±3.4447.70±3.7224.0±1.3344.0±7.6315.71±2.2835.50±1.433.57±3.4570.60±4.96

实施例10INPROL的免疫刺激活性

已经观察到含有高比例增殖的CFU-S与INPROL一起培养不仅改变了CFU-S的细胞周期而且也改变了它们的分化。改变了占优势的红系分化以有利于粒系祖细胞和淋巴系祖细胞的分化。由于细胞毒化疗或放疗的免疫抑制副作用以及免疫抑制伴随过度增殖干细胞失调和衰老，INPROL这一特性具有重要作用。

本实施例显示了INPROL对来自根据Wittlock和Witt(Ann.Rev.Immun.3：213-35，1985)建立的淋巴系长期培养(LLTC)未成熟前体细胞分化成前B细胞的直接效应通过在含IL-7的甲基纤维素中形成集落测定这种效应。

按所述方法建立LLTC并用新鲜LLTC培养基(Terry  FoxLabs.，Vancouver，Canada)饲养一周两次。每周收集一次非贴壁细胞、洗涤、用含25ng/ml pINPROL培养基或培养基本身作对照培养4小时，培养后洗涤细胞，以10⁵细胞/ml甲基纤维素含30％胎牛血清和10ng/ml的IL-7铺制平板。图13显示三周的数据。在对照组中大的前B细胞集落的数目变化随时间的增加而增加，但用INPROL预培养总是刺激集落的生长高于对照水平4-8倍。这表明INPROL的免疫刺激特性。这可应用在纠正免疫缺陷状态和增加想要的免疫应答，例如疫苗接种。

实施例11INPROL促进干细胞再集居能力-长期培养物起始来自 患CML的病人的细胞

慢性髓性白血病(CML)是造血干细胞的一种致死性的恶性疾病。CML的治疗在慢性期采用单一药物化疗、联合化疗、脾切除或脾脏照射可以控制临床病症和症状，但是不能有效地延长存活。随着CML由慢性期进展到加速期时标准的治疗方法不起作用。采用不相关供体骨髓移植治疗是困难的由于组织不相容性的问题。然而，不足40％适宜CML病人会有一个合适的相关供体匹配。因此，更喜欢自体移植。回输自体骨髓移植及能够从ph阳性病人在长期培养(LTC)中生长的髓样前体细胞中选择非白血病(ph阴性)的髓样前体细胞的体内外条件提高正常干细胞的潜在自体资源具有攻击性及对慢性白血病的有效治疗。

在骨髓移植的上下文中，造血干细胞从广义讲可以被定义为具有产生成熟血细胞能力的细胞。我们已采用C.Eaves和A.Eaves建立的人长期培养系统用于定量计数干细胞数目和作为处理干细胞用于治疗的一种方法。这包括接种细胞到预先建已照射过的人骨髓贴壁层上，然后这些培养物继续培养5周，5周后收集全部克隆生成细胞成分(贴壁与非贴壁)。在这些条件下克隆生成细胞的产量与初始加入的前体细胞的数量呈线性相关的(Long Term Culture Cell(LTC-IC))单个人LTC-IC的平均产量是每个LTC-IC产生4个克隆生成前体细胞。以前的结果表明，当患有CML病人的骨髓放在相似的条件下，白血病克隆生成细胞(ph阳性)迅速下降。通过定量分析残留正常LTC-IC，在患有CML病人中，选择那些可能从由移植培养的自体移植物支持的加强治疗中获益是可能的(Phillups et al.，Bone Marrow Transplantation 8：477-487，1991)。

下面的方法被用于检测INPROL对建立于CML病人外周血骨髓迁移细胞中的克隆生成细胞(LTC-IC)的效应。培养物被作为长期培养引入到预先照射的基质上，健康供体以外周血被用作对照。来自CML病人的外周血细胞用或不用pINPROL(25ng/ml)预培养4小时，洗涤细胞，放在LTC-IC系统中培养5周以确定对照LTC-IC的数量。对于实验组，其它平行培养物建立10天，用或不用pINPROL预培养生长10天后培养物中的贴壁和非贴壁细胞混合物放到预先建立的滋养物上继续培养8周。通过铺制贴壁与非贴壁细胞在含有合适的生长因子的甲基纤维素平板上来估计每一实验组的培养物中LTC-IC的数目(Terry Fox Labaratories Vancouver，Canada)并计数集落形成细胞总数，用该方法获得的LTC-IC值是由用公式评价总克隆生成细胞(CFC)含量衍化来的。

#LTC-IC＝#CFC/4

图14提供的资料表明，来自健康供体骨髓头10天培养期间没有LTC-IC的丢失。经5周培养后，大约有注入的30％仍然存在。CML病人的LTC-IC的数目在10天培养期间急剧下降到大约8％，进一步培养的过程中不见恢复。而用INPROL预培养的细胞LTC-IC的水平增加到初始数目的30％并维持8周。

通过这些初步的资料预计INPROL的临床相关应用包括：策略地用于选择性促进新鲜或培养骨髓移植物的正常干细胞成分；策略地用于增强残留正常干细胞在体内的再循环也包括转移新的基因材料到人骨髓干细胞中进一步移植给病人的方案。

实施例12A从骨髓制备物中分离干细胞增殖免疫活性抑制因子的 方法

从猪肋骨分离骨髓，来自猪尸体的肋骨被分离，清除肌肉纤维和脂肪，切成碎块，通过用Biophyzpribor制造的水压榨机提取骨髓。通过离心2000rpm，20分钟分离骨髓细胞。提取上清相继易于通过超滤Amicon USA膜XM100，PM30，PM50。根据电泳分析，产物的主要组成是白蛋白(见图1)。

生化纯化

骨髓提取物和组分的蛋白成分在纯化的每一步都用10％聚丙烯酰胺凝胶分电泳分析，含0.1％SDS，直到7％SDS和0.5-1％巯基乙醇加至样品。上样前样品在70℃温育5分钟。

电泳在20cm的胶进行5小时，然后在20℃用0.25％考马斯亮兰CBBC250乙醇∶水∶乙酸5∶5∶1混合液中染色1小时，用7％乙酸洗胶，换洗液几次。通过用造血干细胞增殖抑制的方法测定产物的活性。此后是该方法的详述。

第一阶段用硫酸铵沉淀纯化

根据表5中的结果选用饱和度为40-80％硫酸铵沉淀纯化的蛋白活性是在25％。

表5

硫酸饱和度(％)活性(％)

0-4037.2-35.4＝1.8％

40-6037.2-1.8＝35.4％

60-8037.2-12.8＝24.4％

80-10037.2-26.1＝11.1％

每步纯化后用于检测的样品量是根据纯化水平决定的而且相当于初始产物量的2×10^-2mg通过公式决定活性。

改变(％)＝％Sa-％Sb

其中％Sa是对照组中％S

％Sb是用于测定组分温育后的S％

为了降低硫酸铵浓度20倍，在每次活性测前及下一步纯化前实验组分要除盐。

第二阶段来自第一阶段的抑制因子除盐后使用，而且部分用于离子交换层析，这里用DEAE23纤维素。然后用梯度醋酸钠缓冲液洗脱(pH＝6.0)抑制因子活性洗脱在3-5mM之间。

柱体积是1ml，洗脱流速是4ml/小时通过Millichrome色谱仪在230和280nm进行检测。级分1(见图2)表现最高活性被分离并洗脱在5mM醋酸钠缓冲液中(见表6)。

表6

级分活性

146.3-0＝46.3％

246.3-14.1＝32.2％

346.3-42.1＝4.2％

446.3-19.6＝26.7％

546.3-45.1＝1.2％

电泳结果表明，主要蛋白污染物-白蛋白(见图3)被从该组分除去。这可使纯度另外提高4倍。

第三阶段：来自第二阶段部分纯化的抑制因子被直接用在G-75Sephadex柱

柱体积是20ml(20×1)，洗脱率是2ml/小时，洗脱缓冲液是50mM NaCl，10mM Tris-HCl，pH7.5在色谱仪Millichrome在230和280nm进行监测。具有最高活性的组分5被分离。

表7

组分活性

142.2-19.1＝23.1％

242.2-35.2＝7.0％

342.2-21.5＝20.7％

442.2-38.8＝3.4％

542.2-0＝42.2％

第四阶段应用pro-REC柱的反向层析(Phamacia FPLCSystem)在Ultraslera基质上进行。用0.1％三氟醋酸在乙腈梯度洗脱液洗脱蛋白。

分子量16-17kD的产物同质性等于90％，正如在分析丙烯酰胺/SDS胶所示的结果(见图6)。结果见图4，对组分5测定活性，产物的终产量是5％。结果纯化后分子量16kD的蛋白总量是初始产物的650ng/ml。纯化过程中产物经受热浴70℃几分钟，但经测定生物学活性不丧失。

实施例12B分离较大量INPROL的可选方法

初步分离

取新鲜死猪的肋骨清除肌纤维和脂肪，然后切成碎块以1∶1(重量/体积)比率浸泡于磷酸盐缓冲液。为从固体骨中分离骨髓获得的混合物被用水压挤碎。通过4层奶酪布滤出固体颗粒收集骨髓细胞悬液，滤出物在56℃温育40分钟然后在冰浴中冷却到4℃，在4℃10000g离心30分钟，去除最终沉淀并弃掉。

清亮的上清液中在30分钟内滴加10倍体积搅拌的冰冷的丙酮含1％的浓盐酸，混合物放置4℃，16小时完全形成沉淀。然后沉淀物在4℃20,000g离心30分钟，用冷丙酮洗沉淀团块，干燥。

高压液相纯化

沉淀团块用高压液相缓冲液A溶解，至最终蛋白浓度8-10mg/ml，缓冲液A含5％乙腈和0.1％三氟醋酸。这种溶液(0.5～0.6ml)被加在250×4.6mm装有Polisil ODS-300(10mcm)的高压液相柱上，用相同的缓冲液A平衡柱。

用缓冲液B(9％乙腈，0.1％三氟醋酸)在缓冲液A中根据下列程序以1ml/分钟的流率完成液脱。

时间，分钟    缓冲液B的百分比％

0                 0

4                 0

5                 25

25                90

在重新平衡柱前，用100％的缓冲液B冲洗柱5分钟。然后再平衡柱回到初始状态，下一份蛋白溶液才可以上柱，典型的层析图见图5。

分离过程中为了测定蛋白峰，在280nm监测柱子流出物，收集含有蛋白质的组分，相应的峰汇集到一起，30℃旋转蒸发干燥，获得的残留物溶于蒸馏水用于生物活性测定和SDS-PAGE(14％胶，降低条件)电泳分析。含有活性物质的峰被洗脱在70-80％的B缓冲液中，含有16kD的主要蛋白带和痕量的快速移动蛋白象以前通过SDS-PAGE分析的那样。

通过收集高压液相的第二峰所获得材料分析显示在图15(A和C)。含有两个峰的材料(即：图5)这里被称作pINPROL制品1和只含有第二个峰组成的材料被称之为pINPROL制品2。500μg这种有活性的纯化的pINPROL制品2上C4反向层析柱(vydac)并用59.5％的乙腈在0.1％三氟醋酸的线性梯度洗脱。该物质在53％乙腈中洗脱出一个单一的峰(图15A)。然而，在相同的条件下跑250μg的MIP-1α(R & D System)，它在43.9％乙腈中洗脱出来(图15B，注意14％乙腈前一点的早期峰是人为造成的由于有气泡在检测仪中)。天然INPROL在这些条件下基本上比MIP-1α更疏水。TGFβ被认为在这些条件下比对pINPROL观察到的洗脱浓度更低(Miyazona et al.，J.Biol Chem.263：6407-15，1988)。

图15C所示洗脱的pINPROL材料的电泳胶。第一道是粗材料；第2道是分子量标记；第3道是纯化的材料；有两条主要带，一条在大约14kD；另一条在大约35kD认为35kD的带是一个14kD带的多聚体形式。

实施例13A活性INPROL制备物含血红蛋白β链

pINPROL被制备如图5所示(即pINPROL制品1(见例12B))该物质跑SDS-PAGE电泳并用标准技术转移到硝酸纤维素膜上。使用标准技术用ABI 477A蛋白序列仪带有120A Online PTH-AA分析器易于对该物质的N端序列进行分析。获得了下面N端序列：

VHLSAEEKEAVLGLWGKVNVDEV…………

计算机查询蛋白数据库揭示该序列与猪血红蛋白β链N端序列一致(图16C)。

实施例13B活性INPROL制备物含血红蛋白α链

如图15C所示，通过收集第二个主要峰纯化的蛋白显示在图5(pINPROL制品2)结果2个主要带附和大约15kD和30kD的分子量以及几个小带，用标准技术SDS-PAGE胶被转移到硝酸纤维素膜上。切下单个带，象例13A一样易于N端序列分析。15kD带N端序列如下：

VLSAADKANVKAAWGKVGGQ……

30kD带易被限制性蛋白水解酶消化，获得如下的内部序列：

^**FPHFNLSHGSDQVK……

第一个序列显示与猪血红蛋白α链N端序列一致。而第二个序列显示与猪血红蛋白α链的43-56氨基酸残基一致(见图16C人、鼠、猪α、β血红蛋白链的序列比较)这些带及一些小带的重复序列不断地产生一定比例的α球蛋白序列。那么图15C中观察到的各种带即代表猪血红蛋白α链的片段又代表集合物。

实施例13C猪INPROL的进一步表征

为了进一步比较pINPROL与猪血红蛋白。二次结晶的猪血红蛋白从Sigma化学公司获得，使之经过反向高压液相层析。如例12B中对图15所描述的那样。正如图17所显示的那样，完整的血红蛋白的高压液相色谱图与pINPROL制品1所见的色谱图一样。在进一步的直接比较中，图17A(源于图5的第二个峰)显示的pINPROL制品2被看到与猪血红蛋白(图17B)两个峰的第二个峰相互迭盖。对于主要峰分别有52.51和52.25分钟的滞留时间。应该注意到血红素与血红蛋白中第一个主要峰共迁移，这种情况下在49.153分钟，因此，血红素是pINPROL制品1的组分而不是制品2的组分。这被证明通过pINPROL制品在575nm缺少吸收。一个对血红素存在的诊断波长。

猪血红蛋白α和β链的预计分子量分别是15038道尔顿和16034道尔顿。正如图18中SDS-PAGE色谱所见。头两个峰由较高分子量组成，第二个的两个峰由较低分子量链组成。那么头两峰出现表示血红蛋白β链，第二个的两个峰表示血红蛋白α链。

此外，用浅洗脱梯度进行猪血红蛋白的分离(图21)。这些峰的N端分析表明第一个峰是猪的α链而第二个峰是猪的β链。生物分析结果证实分离的两种血红蛋白链是有生物学活性的(实施例14和例15)。

为了进一步比较pINPROL制品2和血红蛋白β链进行双向电泳(图19)。作为第一向，等电聚焦在玻璃管中用2％pH4-8的两性电解质进行9600伏特小时。用原肌球蛋白(分子量33kD，等电点5.2)作为内参照，它的位置用箭头标在最终的2D胶。胶管在缓冲液中平衡并封在12％丙烯酰胺板胶上面的浓缩胶的上面。SDS板胶电泳在12.5mA/胶中进行4小时。用银染胶并干胶。

比较2D电泳模型揭示，只有1或2个较小的斑点不同与高压液相纯化的血红蛋白β链和pINPROL制品2。用抗猪血红蛋白抗体的Western分析，不论1D和2D电泳证实在制品中存在β血红蛋白。因此，按照例12B制备活性pINPROL制品2基本上是猪血红蛋白的β链。

实施例14血红蛋白α、血红蛋白β链或完整的血红蛋白显示干细胞 抑制活性

为了证明血红蛋白β链有INPROL活性，用例1描述的方法及象例12B纯化的材料进行来自睾酮处理小鼠的骨髓细胞的自杀分析。如表8所示，正常小鼠骨髓细胞的15％被杀死而相对与睾酮处理小鼠为36％。正如所希望的，这表明睾酮处理提高了进入细胞周期细胞的百分数(因此，表示它们对杀死更敏感-实施例1)。相反，来自睾酮处理动物的细胞与pINPROL或纯化血红蛋白β链以40ng/ml培养表现出在细胞周期细胞的急剧下降，分别从36％降到0％和7％。对这两个蛋白剂量高达200ng就不那么有效了。作为阳性对照，以前特征化的干细胞抑制因子MIP-1α减少细胞周期细胞至13％。

在体外能进行相似的分析。用进入细胞周期状态CFU-mix代替CFU-S。这种分析除阿糖胞苷(AraC，30mg/ml)被用作细胞周期特异毒性药物代替高剂量³H-TdR和带有高内源性细胞周期率的小鼠种系(Balb/c)用来代替睾酮处理BDF₁小鼠外象以上对CFU-S分析描述的那样进行(见B.I.Lord，Haemopoiesis-APractical Approach.，N.G.Testa and G.Molineux(Eds.)，IRLPress1993；Pragnell et al.，Culture of Hematopoietic Cells，R.I.Freshney，I.B.Pragnell and M.G.Freshney(Eds.)，Wiley Liss1994)。如图9所示，高度纯化的猪β链或α链在这一分析中均是有活性的。在该分析中应注意，用pINPROL处理的细胞的细胞周期水平偶然有相反的数目。这意味着在阿糖胞苷处理池中有比在非处理池中更多的集落。

如例2所述，在³H-TdR摄入分析中pINPROL抑制鼠干细胞系FDCP-Mix的增殖。图20表明用这一分析方法纯化的血红蛋白α或β链均是有活性的，所见到抑制性＜2mg/ml。

前文提供的证据猪血红蛋白β链显示INPROL活性。其它资料(表9，图20)表明，分离到的α链，以及完整的血红蛋白作为干细胞抑制因子也是有活性的，活性制品也包括α和β链的混合物(图5)。

观察分离的α球蛋白链和/或β球蛋白链是有活性的。表明此处描述的活性不需要一个完整的三维空间结构的血红蛋白。α和β链的片段作为干细胞增殖抑制因子也是有活性的。

表8

处理                 杀死(％)

WBM¹                 15

TPBM²                36

pINPROL 200ng/ml     23

40ng/ml              0

Hbg³ 200ng/ml        25

40ng/ml              7

MIP-1α 200ng/ml     13

¹NBM＝正常骨髓

²TPBM＝睾酮处理小鼠骨髓

³Hbg＝C₄反向纯化猪血红蛋白β链(来自两次结晶的猪血红蛋白)

表9

处理                杀死(％)

对照¹               43

猪α链²             -4

猪β链²             -14

¹对照-来自Balb/c小鼠骨髓

²100ng/ml(如图21纯化的)

实施例15纯化的INPROL、纯化的猪α血红蛋白或纯化的猪β血 红蛋白在体内是有活性的

为了测定纯化的猪血红蛋白在体内起作用的能力，如例1所述BDF₁小鼠注射睾酮丙酸化物。24小时后，小鼠静脉注射500ng、pINPROL或猪血红蛋白α链(如图21，从猪处周血红细胞纯化的)或相当量的载体。48小时后收集每只鼠骨髓按例14所述进行CFU-Mix分析。如表10所示pINPROL、猪α链和猪β链在体内均有活性。降低细胞周期中的CFU-Mix的百分数至基础水平。

表10

处理                 杀死(％)

对照¹                45

pINPROL²             5

猪α链²              5

猪β链²              -5

基质³                4

¹对照-来自睾酮处理BDF₁小鼠的骨髓

²100ng/ml

³基质-来自未处理BDF₁小鼠骨髓

实施例16纯化的人血红蛋白α链、生物素化的人血红蛋白α链、生 物素化的人血红蛋白β链、人血红蛋白γ和人血红蛋白δ链在体外均 显示干细胞抑制活性

从Sigma生化公司或用标准方法从成人外周血或脐带血分离获得人血红蛋白。通过反向高压液相用一个象上面描述的对猪α和β链相似的方法分离各个单独的链。(见B.Masala and Manca，Methodsin Enzymology Vol.231 pp21-24，1994)得到了纯化的α、β、γ和δ链。对于生物素化的α和β链用37μg的NHSLC生物素(Pierce)处理成人血红蛋白1mg通过象上面的反向液相层析分离各链。

如图1、12和13所示，纯化的人α链、生物素化的人α链、生物素化的人β链、人γ链和人δ血红蛋白链在CFU-Mix周期分析中所有的链均是有活性的。

表11

处理             杀死(％)

对照¹            49

人α链²          -1

人β链²          41

人γ链           -63

¹对照-来自Balb/c小鼠骨髓

²100ng/ml

表12

处理           杀死(％)

对照¹          47

人γ链²        12

人δ链²        -4

¹对照-来自Balb/c小鼠骨髓

²100ng/ml

表13

处理                 杀死(％)

对照¹                 68

人α链²               19

生物素化的α链²       7

人β链²               55

生物素化的β链²       25

¹对照-来自Balb/c小鼠骨髓

²100ng/ml

实施例17纯化的人α链、α-β二聚物或血红蛋白在体内是有活性 的

纯化的人α链、α-β二聚物或血红蛋白在一个象例15中描述的体内分析方法中被检测。如表14所示，在每只小鼠500ng的浓度时这些成分的每一个都是有活性的。

表14

处理             杀死(％)

对照¹            49

人α链           -22

人α-β二聚物    14

人血红蛋白       -31

¹对照-来自睾酮处理BDF₁小鼠的骨髓

实施例18猪INPROL在体外对人单核或CD34⁺脐带血细胞是有活性的

为了调查来自猪骨髓纯化的INPROL影响人祖细胞周期的能力，脐带血细胞被获得。不论是用Ficoll分离后获得的单核细胞组分还是用CD34亲和柱分离后获得的CD34⁺组分被应用于该实验。为了确保早期干细胞处于细胞周期，细胞在体外有IL-3和干细胞因子(SCF)(100ng/ml每种细胞因子)存在的情况下培养48小时。经预培养后，按例14中描述的方法除了铺板后第18天计数CFU-GEMM(代替CFU-Mix)外进行细胞周期分析。如表15所示，猪INPROL抑制CFU-GEMM的细胞周期无论是在大量的单核细胞还是在CD34⁺组分中。

表15

              处理               杀死(％)

单核细胞      对照               93

              pINPROL¹           16

CD34⁺细胞     对照               41

              pINPROL¹           21

100ng/ml

实施例19纯化的人α血红蛋白对人CFU-GEMM是有活性的

人脐带血单核细胞被获得并在IL-3和SCF存在的条件下培养，并用于例18所述的细胞周期分析。图16所示，从骨髓中纯化的猪INPROL和从外周血纯化的人α血红蛋白两者在本分析中均是有活性的。

表16

处理          杀死(％)

对照          100

pINPROL¹      -6

人α链¹       -23

²100ng/ml

实施例20从人α血红蛋白和人β血红蛋白序列获得的肽类是有活性 的

为了鉴定活性肽序列，用计算机模型程序把肌红蛋白的三维结构(在这一分析中肌红蛋白是无活性的)放在人血红蛋白α链的天然三维结构上。两个肽(代表氨基酸43-55和64-82区域，这些区域在结构上不同与肌红蛋白三维空间结构)被鉴定在CFU-MIX周期分析中作为有活性的肽类。为了更紧密接近于在天然α链中发现的环状物，一个43-55肽的环行衍生物(c43-55)(用二硫键)也被合成并发现是有活性的。

这些肽类的序列如下：

43-55Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val

c(43-55)Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys

(其中两个Cys残基是二硫键)

64-82Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-Ala-His-Val-Asp-Asp-Met-Pro-Asn-Ala-Leu-Ser-Ala

两个hemorphin序列，Hemorphin10(β链序列的32-41位氨基酸)和Hemorphin7(33-40位氨基酸)被检测并且发现具有活性。

序列如下：

Hemorphin10   Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Try-Thr-Gln-Arg-Phe

Hemorphin7    Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg

为了检测这些序列的活性，按例14所述进行CFU-MIX细胞周期分析，如表17-19所示，在这个分析中这些肽类都是有活性的。

表17

处理            杀死(％)

对照            47

pINPROL¹        0

肽(43-55)

100ng/ml        2

10ng/ml         18

1ng/ml          11

¹100ng/ml

表18

处理              杀死(％)

对照              43

肽(43-55)¹        5

肽(64-82)¹        9

Hemorphin10¹      1

Hemorphin7¹       0

¹所有肽类以100ng/ml测定

表19

处理             杀死(％)

对照             47

环形肽43-55¹     0

¹在100ng/ml浓度

虽然按优选的实施方案描述了本发明，应理解本领域的技术人员会知道各种变化和变更。因此，所附权力要求包括所要保护的本发明的范围内所有等价的变化。

Claims (1)

1.由Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val序列组成的肽，所述肽调节干细胞周期。

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