ES2216019T3 - Inhibidor de la proliferacion de celulas mamdre y utilizaciones del mismo. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBEN Y REIVINDICAN METODOS PARA EL AISLAMIENTO Y USO DE FACTORES DE INHIBICION DE CELULA VASTAGO PARA REGULAR EL CICLO DE CELULA VASTAGO ANORMAL Y PARA ACELERAR LA RECUPERACION DE CELULA SANGUINEA PERIFERICA DESPUES DE QUIMIOTERAPIA. TAMBIEN SE DESCRIBEN Y REIVINDICAN LOS INHIBIDORES DE PROLIFERACION DE CELULA VASTAGO.

Description

Inhibidor de la proliferación de células madre y utilizaciones del mismo.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la utilización de inhibidores de proliferación de células madre para regular el ciclo de células madre en el tratamiento de seres humanos o de animales con enfermedades autoinmunitarias, envejecimiento, cáncer, mielodisplasia, preleucemia, leucemia, psoriasis u otras enfermedades que implican procesos hiperproliferantes. La presente invención se refiere también a un procedimiento de tratamiento para seres humanos o animales en la expectativa de experimentar o que hayan experimentado exposición agentes quimioterapéuticos, a otros agentes que dañan el ciclo de las células madre o exposición a la radiación. Por último, la presente invención se refiere a la mejora del mantenimiento de las células madre o a cultivos de expansión para procedimientos de auto- y -alo-transplante o para la transferencia génica.

Antecedentes de la invención

La mayoría de las células en la etapa final en los sistemas de renovación son de vida corta y deben ser sustituidos continuamente a lo largo de la vida. Por ejemplo, las células de la sangre se originan a partir de una población de células madre hematopoyéticas (HSC) multicomponentes que se autorrenueva. Las células madre hematopoyéticas son una subpoblación de células hematopoyéticas. Las células hematopoyéticas se pueden obtener, por ejemplo, a partir de la médula ósea, de la sangre del cordón umbilical o de la sangre periférica (ya sea inmovilizadas o movilizadas con un agente tal como el G-CSF); las células hematopoyéticas incluyen la población de células madre, células precursoras, células diferenciadas, células accesorias, células del estroma y otras células que contribuyen al medio necesario para la producción de células sanguíneas maduras. Debido a que las células madre hematopoyéticas son necesarias para el desarrollo de todas las células maduras de los sistemas hematopoyético e inmunitario, su supervivencia es esencial para restablecer un sistema de defensa del huésped totalmente funcional en los pacientes tratados por quimioterapia u otros agentes.

La producción de células hematopoyéticas se regula mediante una serie de factores que estimulan el crecimiento y la diferenciación de las células hematopoyéticas, alguno de los cuales, por ejemplo la eritropoyetina y G-CSF, se utilizan actualmente en la práctica clínica. Una parte de la red de control que, sin embargo, no ha sido extensamente caracterizada es el mecanismo de retroalimentación que forma la rama negativa del proceso regulador (Eaves et al. Blood 78:110-117, 1991).

Los estudios iniciales por Lord y colaboradores demostraron la existencia de un factor de proteína soluble en los extractos normales de la médula ósea murina y porcina, que era capaz de inhibir de forma reversible el ciclo de HSC (Lord et al., Br. J. Haem. 34:441-446, 1976). Esta actividad inhibidora (peso molecular 50 a 100 kD) se diseñó para el inhibidor de las células madre (SCI).

La purificación de este factor a partir de fuentes primarias no se realizó debido a las dificultades inherentes en un análisis in vivo que requiere un gran número de ratones irradiados. En un intento para superar estos problemas Pragnell y colaboradores desarrollaron un análisis in vitro para células hematopoyéticas primitivas (CFU-A) y detectaron líneas celulares como fuente de la actividad inhibidora (véase Graham et al. Nature 344:442-444, 1990).

Ya que los estudios más iniciales habían identificado macrófagos como posibles fuentes de SCI (Lord et al. Blood Cells 6:581-593, 1980) se seleccionó una línea celular de macrófagos de ratón, I774.2 (Graham et al. Nature 344:442-444, 1990). El medio acondicionado procedente de esta línea celular fue utilizado por Graham et al. para la purificación; se aisló un péptido inhibidor que demostró ser idéntico a la proteína 1-alfa inflamatoria del macrófago (MIP-1\alpha) de la citocina descrita anteriormente. Así pues, se aisló MIP-1\alpha de la línea celular, no del material primario. Mientras que Graham et al., observaron que el anticuerpo contra MIP-1\alpha eliminaba la actividad de un extracto en bruto de médula ósea, otros colaboradores han demostrado que son importantes otras actividades inhibidoras. Por ejemplo, Graham et al. (J. Exp. Med. 178:925-32, 1993) han sugerido que TGF\beta, no MIP-1\alpha, es un inhibidor primario de las células madre hematopoyéticas. Además, Eaves et al. (PNAS 90:12015-19, 1993) han sugerido que tanto MIP-1\alpha y TGF\beta están presentes en concentraciones sub-óptimas en la médula ósea normal y que la inhibición requiere una sinergia entre los dos factores.

Otros colaboradores han descrito factores inhibidores adicionales de las células madre. Frindel y colaboradores han aislado un tetrapéptido de la médula de ternero fetal y de extractos hepáticos que presentan actividades inhibidoras en las células madre (Lenfant et al., PNAS 86:779-782, 1989). Paukovits et al. (Cancer Res. 50:328-332, 1990) han caracterizado un pentapéptido que, en su forma monomérica, es un inhibidor y, en su forma dimérica, es un estimulante del ciclo de las células madre. Se han reivindicado también otros factores por ser inhibidores en varios sistemas in vitro (véase Wright y Pragnell en Bailliere's Clinical Haematology vol. 5 págs. 723-39, 1992 (Bailliere Tinadall, París)).

Tsyrlova et al., SU 1561261 A1, describió un proceso de purificación para un inhibidor de proliferación de células madre.

Hasta la fecha, ninguno de estos factores ha sido aprobado para su utilización clínica. Sin embargo, hay necesidad de inhibidores eficaces de células madre. La principal toxicidad asociada a la quimioterapia o al tratamiento de radiación es la destrucción de las células proliferantes normales que pueden producirse por supresión de la médula ósea o por toxicidad gastrointestinal. Un inhibidor eficaz de células madre protegería estas células y permitiría la optimización de estos regímenes terapéuticos. Como se acaba de demostrar hay necesidad de una variedad de citocinas estimulantes (es decir, citocinas tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-13, IL-14, IL-15, G-CSF, GM-CSF, eritropoyetina, trombopoyetina, factor de células madre, ligando flk2/flt3, etc., que estimulan el ciclo de las células hematopoyéticas) dependiendo de la situación clínica, así como también es probable que una variedad de factores inhibidores será necesario que se dirijan a necesidades clínicas divergentes.

La hemoglobina es una proteína tetramérica muy conservada con peso molecular de aproximadamente 64.000 daltons. Consta de dos cadenas alfa y dos cadenas beta. Cada cadena se une a una sola molécula de hemo (ferroprotoporfirina IX), grupo prostético que contiene hierro. Las cadenas alfa y beta de los vertebrados se derivan probablemente de un solo gen ancestral que se duplicó y a continuación divergió; las dos cadenas conservan un grado grande de identidad de secuencia tanto entre ellas mismas como entre varios vertebrados (véase Fig. 16A). En los seres humanos, el grupo de la cadena alfa en el cromosoma 16 contiene dos genes alfa (alfa 1 y alfa 2) cuyo código para polipéptidos idénticos, así como genes que codifican otras cadenas de tipo alfa: zeta, theta y diversos pseudogenes no transcritos (véase Fig. 16B para ADNc y secuencias de aminoácidos de la cadena alfa humana). El grupo de la cadena beta en el cromosoma 11 consta de un gen con cadena beta y varios genes de tipo beta: delta, épsilon, G gamma y A gamma, así como al menos dos pseudogenes no expresados (véase Fig. 16C para ADNc y las secuencias de aminoácidos de la cadena beta humana).

La expresión de estos genes varía durante el desarrollo. En la hematopoyesis humana, que ha sido caracterizada extensamente, los eritroblastos embrionarios sintetizan sucesivamente tetrámeros de dos cadenas zeta y de dos cadenas épsilon (Gower I), dos cadenas alfa y dos cadenas épsilon (Gower II) o dos cadenas zeta y dos cadenas gamma (Hb Portland). A medida que avanza la embriogénesis, la forma predominante consta de hemoglobina fetal (Hb F) que se compone de dos cadenas alfa y dos cadenas gamma. La hemoglobina del adulto (dos cadenas alfa y dos beta) se continúa sintetizando durante el periodo fetal; en el nacimiento aproximadamente el 50% de la hemoglobina es de forma adulta y la transición es completa aproximadamente a los 6 meses de edad. La gran mayoría de la hemoglobina (aproximadamente el 97%) en el adulto es de la variedad de dos cadenas alfa y dos beta (Hb A) con pequeñas cantidades de Hb F o de cadena delta (Hb A_{2}) que son detectables.

Se ha examinado extensamente hemo con respecto a su influencia en la hematopoyesis (véase para reseñas S. Sassa, Seminars Hemat. 25:312-20, 1988 y N. Abraham et al., J. Cell Cloning 9:185-210, 1991). Se requiere hemo para la maduración de los eritoblastos; in vitro, hemina (cloroferroprotoporfirina IX, es decir, hemo con un ión cloruro adicional) aumenta la proliferación de CFU-GEMM, BFU-E y CFU-E. Igualmente hemina aumenta la cualidad celular en los cultivos de médula ósea a largo plazo.

I. Quimioterapia y radioterapia del cáncer

La investigación productiva sobre los factores de crecimiento estimulantes ha dado como resultado la utilización clínica de numerosos de estos factores (eritropoyetina, G-CSF, GM-CSF, etc.). Estos factores han reducido la mortalidad y la morbilidad asociada a los tratamientos quimioterapéuticos y de radiación. Los beneficios clínicos adicionales a los pacientes que han experimentado quimioterapia o radiación se podrían realizar mediante una estrategia alternativa de bloqueo de la entrada de células madre en el ciclo celular protegiéndolas de este modo de los efectos secundarios tóxicos.

II. Transplante de médula ósea

El transplante de médula ósea (BMT) es un tratamiento útil para una variedad de enfermedades hematológicas, autoinmunitarias y malignas; las terapias actuales incluyen las células hematopoyéticas obtenidas de la sangre del cordón umbilical o de la sangre periférica (ya sea inmovilizadas o movilizadas con agentes tales como G-CSF) así como de la médula ósea. La manipulación ex vivo de las células hematopoyéticas se está utilizando actualmente para propagar las células madre primitivas a una población adecuada para transplantes. La optimización de este procedimiento requiere: (1) suficiente número de células madre capaces de mantener la reconstitución a largo plazo de la hematopoyesis; (2) la depleción del injerto contra huésped que produce linfocitos T y (3) la ausencia de células malignas residuales. Este procedimiento se puede optimizar incluyendo un(os) inhibidor(es) de células madre para la propagación ex vivo.

La efectividad de la purga de las células hematopoyéticas con fármacos citotóxicos con el fin de eliminar las células malignas residuales está limitada debido a la toxicidad de estos compuestos para las células hematopoyéticas normales y especialmente a las células madre. Existe una necesidad de protección eficaz de las células normales durante la purga; la protección se puede proporcionar extrayendo células madre del ciclo con un inhibidor eficaz.

III. Recogida de células madre periféricas

Las células madre periféricas (PBSC) ofrecen numerosas ventajas potenciales sobre la médula ósea para el transplante autólogo. Los pacientes sin zonas adecuadas de extracción de médula debido a la implicación del tumor o a la radioterapia previa pueden experimentar todavía extracciones de PDSC. La utilización de células madre de la sangre elimina la necesidad de anestesia general y de un procedimiento quirúrgico en los pacientes que no tolerarían bien esto. La tecnología de aféresis necesaria para recoger células sanguíneas es eficaz y disponible ampliamente en la mayoría de los centros médicos. Las limitaciones principales del procedimiento son tanto la baja frecuencia en estado estacionario normal de las células madre en la sangre periférica y sus estados en el ciclo alto después de los procedimientos de movilización con fármacos o factores de crecimiento (p. ej. ciclofosfamida, G-CSF, factor de células madre). Un inhibidor de células madre eficaz sería útil para retornar dichas células a un estado latente, evitando de este modo su pérdida por diferenciación.

IV. Tratamiento de transtornos hiperproliferantes

Están caracterizadas numerosas enfermedades mediante un estado hiperproliferante en el que las células madre disreguladas dan lugar a una superproducción de células en la etapa final. Dichos estados patológicos incluyen, pero no están limitados a, la psoriasis, en la que existe una superproducción de células epidérmicas y a estados premalignos en el aparato gastrointestinal caracterizados por la aparición de pólipos intestinales. Un inhibidor de células madre serviría para el tratamiento de dichos trastornos.

V. Transferencia génica

Actualmente se está utilizando en el marco clínico la capacidad para transferir información genética en las células hematopoyéticas. Las células hematopoyéticas son una diana útil para la terapia génica debido a la facilidad de acceso, la amplia experiencia en la manipulación y en el tratamiento de este tejido ex vivo y debido a la capacidad de las células madre para penetrar en los tejidos. Además, la corrección de determinados defectos genéticos humanos puede ser posible mediante la inserción de un gen funcional en las células madre primitivas del sistema hematopoyético humano.

Existen varias limitaciones para la introducción de genes en las células hematopoyéticas humanas utilizando ya sea vectores de retrovirus o técnicas físicas de transferencia génica: (1) la baja frecuencia de células madre en los tejidos hematopoyéticos ha necesitado el desarrollo de técnicas de transferencia génica muy eficaces; y (2) las células madre que se ciclan más rápidamente han demostrado ser más susceptibles a la infección por el vector, pero el aumento de la frecuencia de infección por estimulación de la proliferación de células madre con factores de crecimiento produce efectos negativos sobre la expresión génica a largo plazo, debido a que las células que contienen los transgenes están forzadas a diferenciarse de forma irreversible y pierden su auto-renovación. Estos problemas se pueden mejorar mediante la utilización de un inhibidor de células madre que impide la diferenciación y la pérdida de auto-renovación.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a polipéptidos que son inhibidores de proliferación de células madre ("INPROL") y a su utilización.

La presente invención incluye un inhibidor de proliferación de células madre caracterizado por las siguiente propiedades:

(a) Actividad específica (IC_{50}) menor o igual a 20 ng/ml en un análisis del bazo murino formador de colonias (CFU-S) (véase Ejemplo 4),

(b) Peso molecular mayor de 10.000 y menor de 100.000 daltons (por ultrafiltración),

(c) Actividad sensible a la degradación por tripsina,

(d) Más hidrófobo que MIP-1\alpha ó TGFb y separables ambos por cromatografía en fase inversa (véase Ejemplo 12),

(e) Actividad biológica mantenida después del calentamiento durante una hora a 37ºC, 55ºC ó 75ºC en solución acuosa y

(f) Actividad biológica mantenida después de precipitación con ácido clorhídrico al 1% en acetona.

La presente invención se caracteriza además y se distingue de otros inhibidores de células madre experimentales (p. ej. MIP-1\alpha, TGF\beta y varios oligopéptidos) por su capacidad para conseguir la inhibición en un ensayo in vitro después de un periodo corto de preincubación (véase Ejemplo 5).

La presente invención comprende asimismo composiciones farmacéuticas que contienen INPROL para el tratamiento de varios trastornos.

La presente invención proporciona un procedimiento para el tratamiento de un paciente para prevenir la exposición a un agente capaz de destruir o dañar las células madre administrando a este paciente una cantidad eficaz de la composición inhibidora de células madre. Las células madre protegidas por este procedimiento pueden ser células madre hematopoyéticas presentes frecuentemente y que se dividen en la médula ósea. Como alternativa, las células madre pueden ser epiteliales, localizadas por ejemplo, en los intestinos o en el cuero cabelludo y otras áreas del cuerpo o células germinales localizadas en los órganos reproductores. El procedimiento de la presente invención se puede emplear de forma deseable en seres humanos, aunque el tratamiento en animales está también comprendido en este procedimiento. Tal como se utiliza en la presente memoria, los términos "sujeto" o "paciente" se refieren a un animal, tal como un mamífero, incluyendo el hombre.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para proteger y restablecer los sistemas de células madre hematopoyéticos, inmunitarios u otros de un paciente que experimenta quimioterapia, que incluye la administración al paciente de una cantidad eficaz de INPROL, teniendo INPROL una secuencia de péptido tal como la definida más adelante.

En otro aspecto todavía, la presente invención implica la utilización de una cantidad eficaz de INPROL para la preparación de un fármaco para el tratamiento complementario de cualquier cáncer, incluyendo los caracterizados por tumores sólidos, para proteger las células madre de la médula ósea, del aparato gastrointestinal o de otros órganos de los efectos tóxicos de la quimioterapia o de la terapia de radiación.

Todavía otro aspecto de la presente invención implica la utilización de una cantidad eficaz de INPROL para la preparación de un fármaco para el tratamiento de la leucemia, comprendiendo el tratamiento de las células hematopoyéticas que tienen células proliferantes de leucemia en éstas, para inhibir la proliferación de las células madre normales y tratar la médula ósea con un agente citotóxico para destruir las células de leucemia. Este procedimiento puede ser mejorado por el tratamiento de la médula ósea siguiente con otros agentes que estimulan su proliferación; p. ej. factores estimulantes de colonias. En una forma de realización este procedimiento se realiza in vivo. Como alternativa, este procedimiento es también útil para la purga y la expansión ex vivo de las células hematopoyéticas para transplantes.

Todavía en otro aspecto, el procedimiento implica el tratamiento de un sujeto que tiene algún trastorno producido por células madre proliferantes. La presente invención se refiere también a la utilización de una cantidad eficaz de INPROL para la preparación de un fármaco para el tratamiento de trastornos, tales como psoriasis, mielodisplasia, algunas enfermedades autoinmunitarias, inmunodepresión en el envejecimiento, inhibiendo parcialmente la proliferación de la célula madre en cuestión.

La presente invención proporciona un procedimiento para proteger de forma reversible las células madre del daño procedente de un agente citotóxico capaz de destruir o dañar las células madre. El procedimiento implica administrar a un sujeto una cantidad eficaz de INPROL previendo la exposición a dicho agente.

La presente invención también proporciona:

la utilización de un inhibidor de proliferación de células madre para la preparación de un fármaco para el tratamiento de seres humanos o animales mejorando la inmunosupresión producida por la hiperproliferación de células madre.

La presente invención también proporciona:

un procedimiento de tratamiento para seres humanos o animales en el que dicho inhibidor de proliferación de células madre se administra después que las células madre son inducidas a proliferarse por exposición a un fármaco citotóxico o a un procedimiento de irradiación. Las células madre están normalmente latentes pero se estimulan para entrar en el ciclo celular después de la quimioterapia. Esto les hace más sensibles a una segunda administración de quimioterapia. El procedimiento actual les protege de este tratamiento.

La presente invención proporciona también:

la utilización de dicho inhibidor de proliferación de células madre para la preparación de un adyuvante para seres humanos o animales antes o junto con la vacunación con el fin de aumentar la respuesta inmunitaria.

La presente invención proporciona también:

la utilización de una cantidad eficaz de inhibidor de proliferación de células madre para la preparación de un fármaco para el tratamiento de seres humanos o animales que reciben fármacos citotóxicos o tratamiento de radiación, para proteger las células madre contra el daño.

La invención incluye también péptidos que tienen las secuencias:

Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val.

Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gin-Val-Cys

en las que los dos restos Cys forman un enlace disulfuro,

Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gin-Val-Cys

en la que los dos restos de Cys se unen mediante un puente de carbono, y

Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-Ala-His-Val-Asp-Asp-Met-Pro-Asn-Ala-Leu-Ser-Ala.

Se incluye también en la invención las secuencias de ADN que codifican los péptidos anteriores identificados, los vectores que contienen dichas secuencias de ADN y las células huésped que contienen dichos vectores. Estos péptidos se pueden sintetizar utilizando técnicas químicas estándar (p. ej. síntesis en fase sólida) o utilizando técnicas recombinantes (p. ej. sistemas de fusión tales como los que emplean glutation-S-transferasa (D.B. Smith y K.S. Johnson, Gene 67:3140, 1988), tiorredoxina (La Vallie et al., Biotechnology 11:187-193, 1993) o ubiquitina (Butt et al., PNAS 86:2540-4, 1989; patente U.S. nº 5.391.490)).

La invención incluye además un procedimiento para inhibir la proliferación de células madre que comprende poner en contacto las células hematopoyéticas con un péptido seleccionado de entre el grupo de péptido de hemorfina con la secuencia:

1

Los péptidos anteriores tienen similitud de secuencia con otros péptidos de tipo opioide, tales como los de la familia Tyr-MIF-1 (véase Reed et al., Neurosci. Biobehav. Rev. 18:519-25, 1994 para reseña), las casomorfinas derivadas de caseína (Brandtl et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 360:1211-16, 1979; Loukas et al., Biochem. 22:4567-4573, 1983; Fiat y Jolles, Mol. Cell. Biochem. 87:5-30, 1989), péptidos derivados del citocromo b, denominados citocrofinas (Brantl et al., Eur. J. Pharm. 111:2934, 1985) así como péptidos derivados de bancos combinatorios cribados para la unión a receptores opioides (véase para reseña Dooley et al., Peptide Research 8:124-137, 1995).

La invención también comprende un procedimiento para llevar a cabo la propagación de las células madre ex vivo que comprende tratar dichas células hematopoyéticas con INPROL y, por lo menos, una citocina estimulante.

INPROL se pone en contacto con las células hematopoyéticas antes, durante y/o después del contacto con la citocina estimulante.

La invención incluye además una composición farmacéutica que comprende (a) INPROL y (b) al menos un compuesto inhibidor seleccionado de entre el grupo que consta de MIP-I\alpha, TGF\beta, TNF\alpha, INF\alpha, INF\beta, INF\gamma, el pentapéptido piroGlu-Glu-Asp-Cys-Lys, el tetrapéptido N-acetil-Ser-Asp-Lys-Pro y el tripéptido glutatión (Gly-Cys-\gammaGlu).

La invención incluye además una composición farmacéutica que comprende (a) INPROL y (b) al menos un compuesto estimulante seleccionado de entre el grupo que consta de IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-13, IL-14, IL-15, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, eritropoyetina, trombopoyetina, factor de células madre y ligando flk2/flt3.

La presente invención describe un inhibidor de células madre (INPROL) que es diferente de los conocidos en la técnica, tales como MIP-1\alpha, TGF\beta, el tetrapéptido de Frindel y colegas o el pentapéptido de Paukovits y colaboradores (véase, Wright & Pragnell, 1992 (op. cit)). El INPROL natural tiene un peso molecular que excede de 10.000 daltons por ultrafiltración que le distingue del tetrapéptido, así como del pentapéptido. Es más hidrófobo que MIP-1\alpha ó TGF\beta en sistemas de cromatografía en fase inversa, distinguiéndose de esas citocinas. Además, su modo de acción se distingue del de cualquier inhibidor descrito anteriormente en que es activo en un ensayo in vitro cuando se utiliza solamente durante un periodo de preincubación. MIP-1\alpha por ejemplo, no es eficaz cuando se utiliza solamente durante un periodo de preincubación (Ejemplo 5). Además, INPROL natural es activo en un ensayo que mide "las células potenciales muy proliferantes" (HPP-PFC) mientras que MIP-1\alpha no lo es (Ejemplo 6).

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1 a 4 presentan una serie de SDS en gel de poliacrilamida del producto después de cada etapa de purificación.

Figura 1 - Banda 1 es quimiotripsinógeno, banda 2 es ovoalbúmina, banda 3 es BSA, banda 4 son las fracciones
< 30 kD, banda 5 son las fracciones 30 a 50 kD y banda 6 son las fracciones 50 a 100 kD.

Figura 2 - Banda 1 es después de la precipitación con sulfato de amonio (40 a 80%) y las bandas 2 a 5 son las fracciones de DEAE (la banda nº 2 representa la fracción activa).

Figura 3 - Banda 1 es el sobrenadante después de la precipitación con sulfato de amonio, banda 2 es la fracción activa de DEAE, las bandas 3 a 5 representan las fracciones de filtración del gel (banda nº 5 representa la fracción activa).

Figura 4 - Banda 2 representa el producto final.

La figura 5 presenta un cromatograma por HPLC en fase inversa de la purificación final.

La figura 6 presenta la incorporación de timidina tritiada (cpm) en las células de una línea mixta de FDCP sin (referencia = % de inhibición) y con varias concentraciones de INPROL purificado procedente de la médula ósea porcina (pINPROL). Los datos están normalizados frente al valor de referencia.

La Figura 7 presenta el porcentaje de células en la fase S del ciclo celular después del tratamiento de los ratones con propionato de testosterona (TSP), TSP más pINPROL, o vehículo (Referencia). Cada grupo contenía 25 animales (3 a 4 por punto de tiempo).

La Figura 8 presenta la supervivencia de los ratones tratados con dos dosis de 5-FU, con o sin tratamiento de pINPROL. Cada grupo contenía 30 animales.

La Figura 9 presenta la supervivencia de ratones irradiados, con y sin tratamiento de pINPROL. Cada grupo contenía 50 animales.

Las Figuras 10A y 10B presentan la regeneración de las células del cultivo a largo plazo de médula ósea normal, 1 semana (10 A) y 3 semanas (10 B) después del tratamiento con Ara-C o Ara-C más pINPROL.

La Figura 11 presenta la supervivencia de ratones (75 por grupo) después de la irradiación letal y del transplante de 3 x 10^{4} células de médula ósea después de la preincubación con medio (Referencia) o pINPROL (25 ng/ml) durante 4 horas. Se controló la supervivencia durante 30 días.

La Figura 12 presenta el número de CFU-GM formado, después de 14 días en cultivo, por células de médula ósea procedentes de ratones después de la irradiación letal y la reconstitución con células de médula ósea del donante preincubadas con pINPROL o medio durante 4 horas.

La Figura 13 presenta las células en suspensión de cultivo linfoide a largo plazo que se extrajeron cada semana, se lavaron y se colocaron en placas con IL-7 (10 ng/lm) después de la preincubación con medio o pINPROL durante 4 horas.

La Figura 14 presenta la capacidad de repoblación mejorada de las células de sangre periféricas leucémicas tratadas con pINPROL. Se determinaron las células que inician el cultivo a largo plazo (LTC-IC) colocando en placas células adherentes y no adherentes LTC con y sin pINPROL y anotando CFU-GM el día 7. Los datos están normalizados a valores de referencia.

La Figura 15A presenta un cromatograma C4 en fase inversa de pINPROL purificado eluyendo en acetonitrilo al 53%. La banda 1 es el material en bruto, la banda 2 son los marcadores por peso molecular y la banda 3 es el material purificado. La Figura 15B presenta un cromatograma C4 en fase inversa de MIP-1\alpha eluyendo en acetonitrilo al 43,9%. La Figura 15C presenta un cromatograma SDS-PAGE de la preparación en bruto de pINPROL y de la preparación purificada después de la fase inversa.

La Figura 16 presenta secuencias de hemoglobina: Fig. 16A presenta las secuencias de ADNc y de los aminoácidos de alfa hemoglobina humana y la Fig. 16B presenta las secuencias de ADNc y de los aminoácidos de la beta hemoglobina humana. La numeración es según el aminoácido. La Fig. 16C presenta una comparación de las secuencias de aminoácido de las cadenas alfa y beta de las hemoglobinas humana, murina y porcina.

La Figura 17 presenta una comparación de los vestigios de pINPROL por HPLC C_{4} en fase inversa (Fig. 17A) y de la hemoglobina de cerdo cristalizada (Fig. 17B).

La Figura 18 presenta una SDS-PAGE en gel de las fracciones procedentes de la separación por HPLC C_{4} en fase inversa de la hemoglobina de cerdo cristalizada. La banda 1 presenta los marcadores por peso molecular, la banda 2 presenta las fracciones 48 a 49, procedentes del primer pico (a 47,11 min), la banda 3 presenta las fracciones 50 a 51, procedentes del segundo pico (a 49,153 min), la banda 4 presenta las fracciones 54 a 55, procedentes del tercer pico (a 52,25 min) y la banda 5 presenta las fracciones 56 a 57, procedentes del cuarto pico (a 53,613 minutos).

La Figura 19 presenta una comparación de la electroforesis bidimensional en gel de pINPROL (Fig. 19A) y de beta hemoglobina de cerdo purificada (Fig. 19B).

La Figura 20 presenta una comparación de los efectos de la alfa hemoglobina de cerdo purificada, de la beta hemoglobina o de pINPROL en el análisis FDCP-MIX.

La Figura 21 presenta la separación en fase inversa de la hemoglobina porcina utilizando un gradiente de elución uniforme.

Para que la invención descrita en la presente memoria se pueda entender más completamente, se indica la siguiente descripción detallada. Esta descripción, en tanto que es a título de ejemplo de la presente invención, no debe considerarse que limita específicamente la invención y dichas variaciones que estarían comprendidas dentro del alcance de un experto en la materia, se deben considerar que están comprendidas dentro del alcance de la presente invención.

Descripción detallada de las formas de realización preferidas

INPROL inhibe reversiblemente la división de las células madre. Específicamente, INPROL es eficaz para inhibir temporalmente la división celular de las células madre hematopoyéticas. Así pues, el procedimiento de la presente invención se puede emplear para aliviar los efectos secundarios indeseables de la quimioterapia en los sistemas hematopoyéticos, mieloideos e inmunitarios del paciente protegiendo las células madre del daño producido por los agentes quimioterapéuticos o por la radiación utilizada para destruir las células infectadas por el cáncer o los virus. En una forma de realización de la invención, se administra INPROL al paciente en una dosis suficiente para inhibir la división de las células madre mientras que el agente quimioterapéutico actúa sobre las células enfermas. Después que el agente quimioterapéutico ha realizado su función, las células madre inhibidas por INPROL revertirán, sin tratamiento posterior, en células en división. Si se desea aumentar la regeneración de los factores de crecimiento estimulantes de hematopoyesis o además se pueden utilizar citocinas.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "INPROL" incluye las proteínas de mamífero, purificadas como en los Ejemplos, hemoglobina, la cadena alfa de hemoglobina (con o sin el grupo hemo), la cadena beta de hemoglobina (con o sin el grupo hemo), mezclas de las cadenas alfa y beta (con o sin el grupo hemo) y los fragmentos o análogos de estas proteínas incluyendo las formas embrionarias, fetales o adultas (p. ej., las cadenas alfa, beta, gamma, delta, épsilon o zeta, bien solas o en mezclas, dímeros o multímeros, (con o sin el grupo hemo) que tienen la capacidad para inhibir la proliferación de células madre. El término "INPROL" incluye las formas naturales así como las no naturales (p. ej. producidas de forma recombinante) de estas proteínas.

En una típica situación clínica, INPROL se administra a un paciente en un régimen diario de inyección intravenosa o infusión en forma de monodosis, por ejemplo, 0,01 a 100 mg/kg, ventajosamente 0, 1 a 1,0 mg/kg, de INPROL administrado, p. ej., 4 a 60 horas antes de los tratamientos habituales de quimioterapia o radiación.

En otra forma de realización de la invención, el pretratamiento con INPROL permite el aumento de dosis de agentes quimioterapéuticos o de radiación más allá de las dosis normalmente toleradas en pacientes.

Una fracción mayor de células madre hematopoyéticas están normalmente latentes (sin ciclo). Sin embargo, como respuesta compensatoria al daño hematopoyético producido por la quimioterapia, se introduce en el ciclo después de la quimioterapia una proporción mayor de células madre, lo que les hace particularmente vulnerables a las dosis posteriores de quimioterapia citotóxica o de irradiación terapéutica. Al inhibir el ciclo de dichas células madre, el tratamiento con INPROL permite la administración inicial o más frecuente de dosis posteriores de quimioterapia citotóxica, bien en dosis convencionales o elevadas.

En una forma de realización de la invención, INPROL (0,1 mg a 6 g, de forma ventajosa 1,0 a 60 mg) se administra aproximadamente 24 horas a 10 días después de una dosis inicial de quimioterapia. Después de otras 4 a 60 horas se administra, de forma ventajosa 24 a 48 horas, otra dosis de quimioterapia. El ciclo de quimioterapia alterno e INPROL se continua según el beneficio terapéutico. En la práctica clínica normal se seleccionan agentes quimioterapéuticos y protocolos para la administración según la idoneidad para determinados tipos de tumor. Opcionalmente, los factores de crecimiento estimulantes tales como G-CSF, el factor de células madre, se utilizan después del tratamiento de quimioterapia o de radiación para mejorar más la reconstitución hematopoyética.

Para aplicaciones ex vivo se utiliza 0,1 ng a 100 ng/10^{6} células/ml, de forma ventajosa de 20 a 50 ng/10^{6} células/ml de INPROL.

En otra forma de realización de la invención, se emplea INPROL en un procedimiento para preparar células hematopoyéticas autólogas para transplante. Las células hematopoyéticas se tratan ex vivo con una cantidad eficaz de INPROL para inhibir la división de las células madre y a continuación se purgan las células cancerosas administrando a los cultivos de médula una cantidad eficaz de agente quimioterapéutico o radiación. Se prefieren los agentes quimioterapéuticos con especificidad para las células del ciclo. La médula tratada de este modo se reinyecta en el donante autólogo. Opcionalmente, el paciente se trata con un agente conocido que estimula la hematopoyesis para mejorar la reconstitución hematopoyética del paciente.

En otra forma de realización de la invención, se emplea INPROL como terapia complementaria en el tratamiento de la leucemia. Por ejemplo, en los estados patológicos en los que las células leucémicas no responden a INPROL, las células hematopoyéticas leucémicas se tratan ex vivo con INPROL. La proliferación de células madre normales se impide mediante la administración de INPROL. De este modo, durante el tiempo en que se tratan las células leucémicas proliferantes con un agente citotóxico específico del ciclo celular, una población de células madre normales se protege del daño. Además, se administra opcionalmente una citosina estimulante, tal como IL-3 o GM-CSF para producir la ciclación en las células leucémicas durante el tratamiento con fármacos o radiación mientras se protegen las células madre normales con INPROL. El paciente se trata con agentes quimioterapéuticos o radiación para destruir las células leucémicas y la médula purgada se vuelve a transplantar al paciente para establecer la reconstitución hematopoyética.

Igualmente, en otra forma de realización de la invención para el tratamiento de pacientes con infecciones víricas graves que implican a las células sanguíneas o linfocitos, tales como la infección por VIH, las células hematopoyéticas se tratan ex vivo con INPROL, seguido de agentes antivíricos, fármacos que destruyen las células infectadas, o sistemas basados en anticuerpo para eliminar las células infectadas. Después del antivírico mieloexerético o de la quimioterapia mieloexerética para erradicar las células huésped víricas del paciente, las células de la médula tratadas con INPROL se retornan al paciente.

En otra forma de realización de la invención, se emplea INPROL para tratar trastornos relacionados con las células madre hiperproliferantes. Por ejemplo, la psoriasis es un trastorno causado por células epiteliales hiperproliferantes de la piel y se trata a veces con fármacos citotóxicos. Otras lesiones preneoplásicas en las que está implicada la proliferación de células madre son también susceptibles en cantidades eficaces de INPROL empleadas para inhibir total o parcialmente la proliferación de células madre. Para estas utilizaciones, se emplean las composiciones de administración tópica o trandérmica (p. ej. pomadas, lociones, geles o parches) que contienen INPROL cuando sea apropiado, como alternativa a la administración parenteral. En la mayoría de los casos de leucemia, los precursores de leucemia son poblaciones de células diferenciadas que no están afectadas por INPROL y que se tratan, por lo tanto, por procedimientos que utilizan INPROL, tales como los descritos anteriormente. En los casos en los que los precursores de leucemia son muy primitivos y son sensibles directamente a la inhibición por INPROL, la proliferación de las células de leucemia está atenuada por la administración de cantidades eficaces de INPROL.

Los anticuerpos, monoclonales o policlonales, se desarrollan mediante técnicas estándar contra los polipéptidos de INPROL. Estos anticuerpos o polipéptidos de INPROL están marcados con marcadores detectables de los cuales se conocen muchos tipos en la técnica. El INPROL marcado o los anticuerpos anti-INPROL se emplean a continuación como marcadores de células madre para identificar y aislar las células madre administrándoles a un paciente directamente con fines de diagnóstico. Como alternativa, estos polipéptidos o anticuerpos marcados se emplean ex vivo para identificar células madre en una preparación de células hematopoyéticas que permite su eliminación antes de purgar las células neoplásicas en la médula. De una forma similar, dichos polipéptidos o anticuerpos marcados se emplean para aislar e identificar células madre epiteliales u otras. Además, dichos anticuerpos, marcados o no marcados, se utilizan terapéuticamente mediante neutralización de la actividad de INPROL o como diagnóstico mediante la detección de concentraciones circulantes de INPROL.

Se puede clonar INPROL procedente del gen humano o bancos de ADNc para la expresión del INPROL recombinante humano utilizando técnicas estándar. Por ejemplo, utilizando la información de la secuencia obtenida de la proteína purificada, se construyen sondas de oligonucleótido que se pueden marcar, p. ej., con fósforo-32 y se utilizan para detectar un banco de ADNc apropiado (p. ej., de médula ósea). Como alternativa, se identifica un banco de expresión de una fuente apropiada (p. ej. médula ósea) para la codificación de ADNc para INPROL utilizando anticuerpo o utilizando análisis funcional apropiado (p. ej., el descrito en el Ejemplo 2). La propia hemoglobina, así como las cadenas alfa y beta individuales, se han clonado y expresado utilizando procedimientos conocidos en el estado de la técnica (véase Pagnier et al., Rev. Fr. Transfus. Hemobiol. 35:407-15, 1992; Looker et al., Nature 356:258-60, Methods in Enzymology vol. 231, 1994).

La presente invención incluye las secuencias de ADN que comprenden: la incorporación de los codones "preferidos" para la expresión por células de mamíferos seleccionadas; la provisión de zonas para la escisión por enzimas de restricción, endonucleasas; y la provisión de secuencias de ADN iniciales, terminales o intermedias adicionales que facilitan la construcción de vectores expresados fácilmente o la producción o purificación de las cadenas alfa, beta, gamma, delta, épsilon y/o zeta de hemoglobina.

La presente invención también proporciona secuencias de ADN que codifican los análogos de polipéptido o los derivados de las cadenas de hemoglobina alfa, beta, gamma, delta, épsilon y/o zeta que se diferencian de las formas naturales desde el punto de vista de la identidad o de la posición de uno o más restos de aminoácido (es decir, análogos de deleción que contienen menos de todos los residuos especificados; análogos de sustitución, en los que uno o más restos especificados se sustituyen por otros residuos; y análogos de adición en los que uno o más restos de aminoácido se añaden a una parte terminal o media del polipéptido) y que comparten alguna o todas las propiedades de las formas naturales.

En una forma de realización ventajosa, INPROL es el producto de la expresión del huésped procariótico o eucariótico (p. ej. células en cultivo bacterianas, de levaduras, de plantas superiores, de insectos y de mamíferos) de secuencias de ADN exógeno obtenido por clonación genómica o de ADNc o por síntesis génica. Esto es, en una forma de realización ventajosa, INPROL es "INPROL recombinante". El producto de la expresión en una levadura típica (p. ej. Saccharomyces cerevisiae) o procariota (p. ej. E. coli) la mayoría de las células están libres de asociación con cualquiera de las proteínas del mamífero. Los productos de expresión en las células de vertebrados (p. ej. mamíferos no humanos (p. ej. COS o CHO) y aviar) están libres de asociación con cualquiera de las proteínas humanas. Dependiendo del huésped empleado, los polipéptidos de la invención se pueden o no glicosilar. Los polipéptidos de la invención opcionalmente también incluyen un resto inicial del aminoácido metionina (en la posición -1).

La presente invención también abarca otros productos tales como los análogos de polipéptido de las cadenas alfa, beta, gamma, delta, épsilon y/o zeta de hemoglobina. Dichos análogos incluyen fragmentos de las cadenas alfa, beta, gamma, delta, épsilon y/o zeta de hemoglobina. Siguiendo procedimientos bien conocidos, se pueden diseñar y preparar fácilmente genes que codifican la expresión microbiana de polipéptidos con secuencias primarias que se diferencian de las especificadas en la presente memoria desde el punto de vista de identidad o de la posición de uno o más restos (p. ej., sustituciones, adiciones terminales e intermedias y deleciones). Como alternativa, las modificaciones del ADNc y de los genes genómicos se pueden realizar fácilmente mediante técnicas de mutagénesis dirigidas al sitio bien conocidas y empleadas para generar análogos y derivados de las cadenas alfa, beta, gamma, delta, épsilon y/o zeta de hemoglobina. Tales productos comparten por lo menos una de las propiedades biológicas de INPROL, pero se pueden diferenciar en otras. Como ejemplos, los productos de la invención incluyen las cadenas alfa, beta, gamma, delta, épsilon y/o zeta de hemoglobina que están reducidas por p. ej. deleciones; o los que son más estables a la hidrólisis (y, por lo tanto , pueden tener efectos más pronunciados o de mayor duración que los naturales); o que se han alterado para eliminar o añadir uno o más zonas potenciales para la O-glicosilación y/o N-glicosilación o que presentan uno o más residuos de cisteína eliminados o reemplazados p. ej. por restos de alanina o serina y se aislan más fácilmente en forma activa de los sistemas microbianos; o que tienen uno o más restos de tirosina sustituidos por fenilalanina y se unen más o menos fácilmente a las proteínas diana o a los receptores en las células diana. También están comprendidos los fragmentos de polipéptido que duplican sólo una parte de la secuencia continua de aminoácido o las conformaciones secundarias dentro de las cadenas alfa, beta, gamma, delta, épsilon o zeta cuyos fragmentos pueden poseer una propiedad de INPROL (p. ej., unión al receptor) y no otras (p. ej., actividad inhibidora de las células madre). Es digno de mención que la actividad no es necesaria para alguno o más de los productos de la invención que tienen utilidad terapéutica (véase, Weiland et al., Blut 44:173-5, 1982) o utilidad en otros contextos, tales como en análisis de antagonismo del factor inhibidor. Los antagonistas competitivos son útiles en los casos de superproducción de inhibidores de células madre o de su receptor.

Además, se pueden sintetizar químicamente péptidos procedentes de la secuencia de proteína que conservan actividad biológica utilizando procedimientos estándar. La presente invención proporciona también secuencias de codificación para análogos de péptido o derivados de la cadena alfa, beta, gamma, delta, épsilon y/o zeta de hemoglobina que se diferencian de las formas naturales desde el punto de vista de la identidad o de la posición de uno o más restos de aminoácido (p. ej. análogos de deleción que contienen menos de todos los residuos especificados; análogos de sustitución, en los que uno o más residuos especificados se reemplazan por otros residuos, ya sean naturales u otros análogos conocidos en el estado de la técnica, tales como D-aminoácidos; y análogos de adición en los que uno o más restos de aminoácidos se modifican químicamente para aumentar la estabilidad, solubilidad y/o resistencia a la proteolisis) y que comparten algunas o todas de las propiedades de las formas naturales.

Las secuencias de péptidos, tales como las descritas anteriormente, se pueden identificar por varios medios. La comparación de las estructuras en tres dimensiones de las cadenas de hemoglobina natural activa en el análisis (p. ej. cadena alfa) con las proteínas relacionadas estructuralmente que son inactivas (p. ej. mioglobina) pueden identificar zonas que tienen diferentes conformaciones en el espacio tridimensional y que son por lo tanto zonas candidatas a péptidos activos. Otro enfoque utiliza proteolisis selectiva, en el que las enzimas proteolíticas se utilizan en digestos limitados de cadenas de hemoglobinas que producen péptidos que se pueden separar, por ejemplo, por HPLC en fase inversa y a continuación se determina la inhibición de las células madre. Los péptidos se pueden también generar por síntesis química (p. ej., síntesis en fase sólida); una serie de péptidos solapantes (p. ej. pentadecámeros) que abarcan la secuencia de la cadena de hemoglobina en cuestión (p. ej. cadena alfa) se pueden generar fácilmente y determinar en análisis de células madre. Se pueden generar bancos combinatorios en los que se realiza la síntesis química múltiple y en los que se preparan posiciones de aminoácidos seleccionados variables que producen numerosos péptidos análogos para cribado (p. ej. Dooley et al., Peptide Research 8:124-137, 1995). Como alternativa se pueden emplear procedimientos recombinantes. Se puede utilizar mutagénesis dirigida al sitio para identificar los restos críticos necesarios para la actividad de una cadena determinada de hemoglobina. Las zonas de una cadena que es conocida por ser activa como inhibidor de células madre (p. ej. cadena alfa) se puede sustituir con zonas de una proteína relacionada pero inactiva (p. ej. mioglobina) y determinar en análisis de células madre, permitiendo la identificación de zonas necesarias para la actividad. Dichas zonas identificadas se pueden expresar como péptidos y determinar la actividad en análisis de ciclación de células madre.

Se emplea versiones homólogas o análogas de INPROL de otras especies en varias utilizaciones veterinarias similares a las formas de realización terapéuticas de la invención descritas anteriormente.

INPROL actúa en las células madre de ciclación colocándolas reversiblemente en un estado de "reposo" no dividido. Cuando se desea estimular las células madre latentes en división, p. ej. después del tratamiento de un paciente con agentes de quimioterapia contra el cáncer o de radiación, se administran al paciente los factores estimulantes de la colonia y otros estimulantes hematopoyéticos. Ejemplo de dichos factores incluyen, pero no están limitados a: M-CSF (CSF-I), GM-CSF, G-CSF, Megacariocito-CSF, trombopoyetina, factor de células madres u otras citocinas tales como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14 o eritropoyetina.

Los polipéptidos o fragmentos activos de INPROL que tienen actividad inhibidora de células huésped se purifican o se sintetizan por procesos químicos convencionales combinados con bioanálisis apropiados de la actividad inhibidora de las células madre, como se ejemplifica en los protocolos descritos más adelante.

En una forma de realización de la invención, se emplea una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de INPROL o un fragmento terapéuticamente eficaz del mismo mezclado con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Esta composición de INPROL se administra generalmente por inyección parenteral o por infusión. Las vías de inyección subcutánea, intravenosa o intramuscular se seleccionan según el efecto terapéutico conseguido.

Cuando se administra de forma generalizada, la composición terapéutica para su utilización en la presente invención está en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable, exenta de pirógenos. La solución de proteína estéril farmacéuticamente aceptable, con la debido atención al pH, isotonicidad, estabilidad, proteínas del portador y similares, está dentro de las posibilidades de la técnica.

También están comprendidas en la invención las composiciones farmacéuticas que comprenden cantidades terapéuticamente eficaces de productos de polipéptido de la invención junto con diluyentes, conservantes, solubilizantes, emulsionantes, adyuvantes y/o portadores adecuados útiles en la terapia con INPROL. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la cantidad que proporciona un efecto terapéutico para una enfermedad y un régimen de administración dados. Dichas composiciones son líquidos, geles, pomadas o liofilizados o si no formulaciones secas e incluyen diluyentes con varios contenidos de tampón (p. ej. Tris-HCl, acetato, fosfato), pH y fuerza iónica, aditivos tales como albúmina o gelatina para impedir la adsorción a las superficies, detergentes (p. ej. Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, sales de ácidos biliares), agentes solubilizantes (p. ej. glicerol, polietilenglicol), antioxidantes (p. ej. ácido ascórbico, metabisulfito sódico), conservantes (p. ej. Timerosal, alcohol bencílico, parabenos), sustancias de relleno o modificadores de tonicidad (p. ej. lactosa, manitol), enlaces covalentes de polímeros a la proteína, tales como polietilenglicol, acomplejamiento con iones metálicos o incorporación del material en o sobre las preparaciones en partículas de compuestos poliméricos tales como el ácido poliláctico, ácido poliglicólico, higrogeles, etc. o en liposomas, niosomas, microemulsiones, micelas, vesículas unilaminares o multilaminares, microcápsulas o microesferas inyectables, biodegradables, o matrices de proteínas, fantasmas de eritrocitos, esferoplastos, parches de piel, u otros procedimientos conocidos de liberación o productos farmacéuticos envasados. Dichas composiciones influirán en el estado físico, la solubilidad, la estabilidad, la velocidad de liberación in vivo y la velocidad de eliminación in vivo del INPROL. Las composiciones de liberación controlada o prolongada incluyen formulaciones en medicamentos lipófilos de liberación lenta (p. ej. ácidos grasos, ceras, aceites). Están comprendidas también en la invención las composiciones en forma de partículas recubiertas con polímeros (p. ej. poloxámeros o poloxaminas) e INPROL acopladas a anticuerpos dirigidos contra receptores específicos del tejido, ligandos o antígenos o acopladas a ligandos de receptores específicos del tejido. Otras formas de realización de las composiciones de la invención incorporan formas de partículas de recubrimientos protectores, factores inhibidores de proteasa o potenciadores de penetración para varias vías de administración, incluyendo la parenteral, pulmonar, nasal, tópica (cutánea o en mucosas) y oral. En otra forma de realización, la composición que contiene INPROL se administra por vía tópica o mediante un parche transdérmico.

En una forma de realización, las composiciones de la invención del asunto se envasan en viales o ampollas estériles en forma de monodosis.

La invención también comprende composiciones que incluyen uno o más factores adicionales, tales como agentes quimioterapéuticos (p. ej. 5-fluorouracilo (5FU), arabinosido de citosina, ciclofosfamida, cisplatino, carboplatino, doxirubicina, etoposido, taxol, agentes alquilantes), agentes antivíricos (p. ej. AZT, aciclovir), TNF, citocinas (p. ej. interleucinas), fármacos antiproliferantes, antimetabolitos y fármacos que interfieren en el metabolismo del ADN.

El régimen de dosificación implicado en un procedimiento para tratar al paciente anticipándose a la exposición a dichos agentes citotóxicos o para el tratamiento de células madre hiperproliferantes lo determina el médico residente considerando varios factores que modifican la acción de los fármacos; p. ej. la enfermedad, peso corporal, sexo y alimentación del paciente, la gravedad de cualquier infección, el tiempo de administración y otros factores clínicos.

Siguiendo la exposición del paciente al agente o a la radiación citotóxica, el procedimiento terapéutico de la presente invención emplea opcionalmente la administración al paciente de uno o más linfocinas, factores estimulantes de colonias u otras citocinas, hematopoyetinas, interleucinas o factores de crecimiento para estimular en general el crecimiento y la división de las células madre (y sus descendientes), inhibidas por el tratamiento anterior con INPROL. Dichos agentes terapéuticos que desencadenan la hematopoyesis incluyen IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, Meg-CSF, M-CSF (CSF-1), GM-CSF, G-CSF o eritropoyetina. Las dosis de estos agentes se seleccionan según el conocimiento obtenido en su utilización en las pruebas clínicas para la eficacia en activar la reconstitución hematopoyética después de la quimioterapia o del transplante de células madre hematopoyéticas. Estas dosis se ajustarían para compensar variaciones en el estado físico del paciente y la cantidad y tipo de agente quimioterapéutico o radiación a la que se expuso el paciente. El avance de la anulación de la inhibición de las células madre producida por la administración de INPROL en el paciente tratado se controla por procedimientos convencionales.

En el tratamiento de leucemia, es beneficioso administrar tanto INPROL para inhibir la ciclación de células madre normales como un estimulante del crecimiento de células leucémicas, tales como IL-3 o GM-CSF, simultáneamente con el tratamiento con fármacos citotóxicos o durante la irradiación. Mediante este protocolo, es posible conseguir las máximas diferencias entre los estados de ciclación y las sensibilidades del fármaco de células normales y leucémicas.

Ejemplo 1 Análisis de inhibición de la proliferación de células madre in vivo

Para la detección de la proliferación de células madre se midió el número de CFU-S en fase S del ciclo celular por el procedimiento "suicida" con ^{3}H-timidina (Becker et al., Blood 26:296-308, 1965).

Se pueden detectar in vivo progenitores hematopoyéticos inmaduros (unidades formadoras de colonias en el bazo (CFU-S)) formando colonias macroscópicas en los bazos de ratones irradiados de forma letal, 8 a 12 días después de la inyección intravenosa de células hematopoyéticas (Till & McCulloch, 1961).

Para el análisis estándar de proliferación de CFU-S se aplica normalmente el procedimiento "suicida" con ^{3}H-timidina (Becker et al., 1965). El procedimiento se basa en la incorporación de timidina radiomarcada, (^{3}H-timidina) precursor de ADN en las células durante la síntesis de ADN. Las CFU-S que están en la fase S del ciclo en el momento del análisis, se destruyen mediante alta radioactividad y por lo tanto no son capaces de formar colonias en el bazo. Así pues, la diferencia entre el número de CFU-S formadas por inyección de la muestra de células incubadas sin ^{3}H-timidina y las mismas células incubadas con ^{3}H-timidina presenta el porcentaje de CFU-S proliferantes en la muestra original.

El análisis de inhibidor no se puede realizar con la población de células madre de médula ósea en animales no estimulados, por lo que el inhibidor solamente efectúa la ciclación de CFU-S, que son tan bajos como del 7 al 10% de la población total de CFU-S en la médula ósea de ratones normales.

Para estimular la proliferación de CFU-S, se utilizaron fenilhidrazina (PHZ) o irradiación subletal (Lord, 1976).

Se ha desarrollado el procedimiento para utilizar propionato de testosterona (TSP) basado en su efecto estimulante sobre la ciclación de CFU-S (Byron et al., Nature 228:1204, 1970) que simplificó el análisis y no produjo efectos secundarios. La estimulación de la proliferación de CFU-S producida por TSP 20 a 24 horas después de la inyección y el efecto se pudieron observar durante al menos 7 días.

El procedimiento utilizado para el cribado de las fracciones durante la purificación del inhibidor fue el siguiente:

Ratones: se utilizaron cepas de ratones BDF_{1} o CBF_{1} en todo el análisis.

Se trataron ratones donantes con una dosis de 10 mg/100g de TSP mediante inyección intraperitoneal de 0,2 ml/ratón para producir del 30 al 35% de CFU-S en fase S.

Veinticuatro horas después la médula ósea se extrae de los fémures para la preparación de la suspensión celular. Se incuban a continuación cinco a diez millones de células por ml con diferentes referencias y las fracciones de análisis durante 3,5 horas a 37ºC en baño de agua, con dos tubos para cada grupo (uno en caliente (radioactivo) y otro en frío (no radioactivo)).

Después de 3,5 horas, se añade ^{3}H-timidina (1 mCi/ml, actividad específica 18 a 25 Ci/mmol) a cada tubo caliente en un volumen de 200 \mul por 1 ml de suspensión celular; no se añade nada a los tubos fríos. La incubación se continúa durante 30 minutos más a 37ºC.

Después de 30 minutos de incubación, se termina la reacción de destrucción añadiendo 10 ml de medio frío (4ºC) que contiene 400 \mug/ml de timidina no radioactiva. Se lavan las células extensamente (3 veces).

Se vuelven a poner en suspensión las células y se diluyen a una concentración deseada para las inyecciones, normalmente 2 - 4 x 10^{4} por ratón en 0,3 a 0,5 ml.

Se irradian los ratones receptores, 8 a 10 por grupo, no después de 6 horas antes de las inyecciones.

Se recogen los bazos de los receptores los días 9 a 12 y se fijan en solución de Tellesnitsky; las colonias se recuentan por recuento visual. Se calculan los porcentajes de las células en fase S utilizando la fórmula:

%S = \frac{a - b}{a} x (100%)

en la que a - número de CFU-S sin ^{3}H-timidina

en la que b - número de CFU-S con ^{3}H-timidina

Los datos de la prueba de INPROL presentados en la Tabla 1 demuestran que la ciclación de células madre después del tratamiento con INPROL se vuelve resistente a la acción de ^{3}H-timidina. Para este y todos los siguientes ejemplos, el término "pINPROL" se refiere a la proteína purificada procedente de la médula ósea porcina. La misma protección se observa en los fármacos citotóxicos específicos en fase S de arabinosido de citosina e hidroxiurea (datos no mostrados). Si las células madre tratadas se lavan a continuación con el medio frío que contiene timidina no radioactiva, las células madre supervivientes proliferan en los bazos de ratón para formar colonias normalmente.

TABLA 1 Actividad inhibidora de pINPROL sobre la proliferación de CFU-S durante cuatro horas de incubación con células de médula ósea

Grupo	-^{3}H-TdR	+^{3}H-TdR	Porcentaje de CFU-S
			destruidas por ^{3}H-TdR
Sin incubación	22,2 \pm 2,0 *	13,7 \pm 2,4 *	38,3 \pm 1,7
4 horas con medio	18,7 \pm 3,0 *	11,4 \pm 1,3 *	43,1 \pm 1,4
4 horas con pINPROL	21,2 \pm 2,3 *	20,7 \pm 2,6 *	2,1 \pm 0,08
* CFU-S por 2 x 10^{4} células

Ejemplo 2 Análisis de inhibición de la proliferación de células madre in vitro

Utilizando el siguiente sistema de análisis (Lord et al., en The Inhibitors of Hematopoiesis págs. 227-239, 1987) se demostró el efecto directo de INPROL. El factor multilinaje (IL-3), dependiente de la línea de células madre, FDCP mix A4 (A4), se mantuvo en medio de IMDM complementado con 20% de suero de caballo y 10% de medio acondicionado con WEHI-3 como fuente de IL-3 estimulante de colonias.

Se utilizó el ensayo de incorporación de timidina tritiada para medir la proliferación: se incubaron células A4 (5 x 10^{4} en 100 \mul de medio con 20% de suero de caballo y 50% de WEHI-3 CM) a 37ºC en 5% de CO_{2} durante 16 horas.

Se añadió al comienzo pINPROL o BME en bruto (fracción IV). Se añadió a continuación timidina tritiada ((^{3}H-Tdr) 3,7 KBq en 50 \mul a 740 GBq/mmol) a cada grupo durante 3 horas más de incubación. Se midió el nivel de proliferación recogiendo las células y se calculó el % de inhibición utilizando la fórmula:

% inhibición = \frac{\text{cpm sin INPROL - cpm con INPROL}}{\text{cpm sin INPROL}} x (100%)

La incorporación de timidina tritiada (^{3}H-Tdr) por desarrollo de las células FDCPmix-A4 en presencia de dosis graduales de extracto de médula ósea normal o pINPROL se representa en la Figura 6. Se puede observar que la composición de pINPROL purificado es al menos 1.000 veces más activa que el material de partida. El tiempo de exposición (16 horas) es un factor importante para la inhibición eficaz y presenta la prueba del efecto directo de pINPROL sobre las células madre de la línea celular A4.

Ejemplo 3 Inhibición de la proliferación de CFU-S por INPROL inyectado in vivo: dosis y duración del efecto

Los estudios del efecto de INPROL inyectado in vivo pusieron de manifiesto que INPROL puede bloquear eficazmente la regeneración de CFU-S en el ciclo, protegiendo de este modo a las células del efecto citotóxico del tratamiento posterior, demostrando su potencial para su utilización clínica.

El protocolo experimental tiene dos objetivos: comprobar el efecto de INPROL sobre CFU-S cuando se inyecta in vivo y definir la duración efectiva de la actividad de INPROL en relación con las células madre de ciclación.

Para estimular la proliferación de CFU-S, se utilizó la inyección de propionato de testosterona basado en el efecto mencionado anteriormente en el Ejemplo 1.

Se inyectaron ratones BDF1 con TSP (10 mg/100 g) el día 0; 24 horas más tarde ratones de cada grupo experimental (4 ratones por grupo) recibieron una sola inyección de pINPROL a dosis de 0 \mug, 5 \mug, 10 \mug y 15 \mug/ratón i.p.

Veinticuatro horas después de la inyección de pINPROL se sacrificaron los ratones y se midió el porcentaje de CFU-S de ciclación mediante el análisis descrito en el Ejemplo 1. La inyección de TSP produjo aproximadamente 50% de CFU-S en ciclación en comparación con el 7% en los ratones no tratados. El pINPROL en dosis tan bajas como 2 \mug/ratón fue capaz de inhibir la proliferación producida por TSP por debajo del nivel normal.

Para la duración de la evaluación del efecto, se inyectó un grupo de ratones (21 ratones por grupo) con TSP sólo y otro grupo se inyectó tanto con TSP como con pINPROL (24 horas después de TSP). Se midió la ciclación de CFU-S cada 24 horas durante una semana tomando 3 donantes de cada grupo y midiendo el estado del ciclo de CFU-S en su médula ósea por el procedimiento descrito (véase Ejemplo 1). Los datos presentados en la Figura 7 demuestran que mientras que la duración del efecto de TSP es por lo menos de 7 días, una sola inyección de INPROL puede colocar a CFU-S en latencia y mantenerlas fuera del ciclo durante no más de 48 a 72 horas. Como la mayoría de los agentes quimioterapéuticos utilizados para la quimioterapia del cáncer y de la leucemia tienen una vida media in vivo relativamente corta, normalmente menos de 24 horas, el efecto de INPROL según los datos obtenidos se mantiene durante más del tiempo efectivo durante el que los agentes quimioterapéuticos como citosina arabinosido o hydroxiurea son activos in vivo. De forma más importante, para los tratamientos quimioterapéuticos y de radiación con intervalos más prolongados (más de 24 horas y menos de 96 horas) entre el primer tratamiento (no dañino para las células madre) y el segundo (dañino para las CFU-S), sería suficiente una sola inyección de INPROL durante los intervalos entre dos aplicaciones de agente quimioterapéutico o de radiación. Para varios ciclos repetibles de terapia citotóxica o de radiación se podría aplicar la misma estrategia basada en la duración del efecto de INPROL.

Ejemplo 4 La mayoría de las células madre hematopoyéticas primitivas estimuladas rápidamente en el ciclo después del tratamiento con 5-FU se protegen con INPROL de la segunda exposición a 5-FU

El fármaco 5-fluorouracilo (5-FU) reduce drásticamente el número de células en los compartimentos mieloide y linfoide. Se cree normalmente que al ser células proliferantes de direccionamiento rápido, específicas del ciclo celular, debido a la incorporación del análogo de nucleótido en el ADN durante la fase S del ciclo celular o antes producen la muerte celular. La supervivencia a largo plazo y la reconstitución inmunohematopoyética de la médula ósea de los ratones no está afectada por una sola dosis de 5-FU; sin embargo, se demostró (Harrison et al. Blood 78:1237-1240, 1991) que las células madre hematopoyéticas pluripotentes (PHSC) se vuelven vulnerables a una segunda dosis de 5-FU durante un breve periodo de aproximadamente 3 a 5 días después de la dosis inicial. Se puede explicar que PHSC normalmente se ciclan muy lentamente con una sola dosis de 5-FU para ser eficaces y se estimulan en la ciclación rápida mediante los estímulos procedentes del tratamiento inicial con 5-FU. Se ha propuesto que PHSC se puede retornar a un estado de ciclo lento por INPROL y proteger de este modo del segundo tratamiento con 5-FU.

Los ratones utilizados en estos experimentos fueron ratones macho BDF1. Se preparó una solución madre de 5-FU (Sigma) en solución salina fisiológica a una concentración de 10 \mug/ml. Cada ratón tratado recibió 2 mg de 5-FU por cada 10 g de peso corporal a través de la vena de la cola el día 0 del experimento; 24 horas después se inyectaron los ratones con pINPROL (10 \mug/100 g de peso corporal) por vía intraperitoneal y el día 3 se les inyectó la segunda dosis de 5-FU. El estudio de supervivencia se realizó controlando la muerte de los ratones en los grupos experimentales (tratamiento con pINPROL) y de referencia de 30 ratones cada uno. En la Figura 8 se presentan las curvas de supervivencia.

Ejemplo 5 Efectos de la preincubación con INPROL frente a MIP-1\alpha en células de médula ósea

El objeto de este experimento fue comparar los efectos inhibidores de la preincubación con pINPROL y MIP-1\alpha en las células de la médula ósea de los ratones in vitro.

Se utilizó el siguiente procedimiento:

in vivo: Se inyectó a ratones BDF1, de 6 a 15 semanas de edad, 200 mg/kg de 5FU i.p. 48 horas antes de recoger la médula de los fémures.

in vitro: Se hizo el recuento en la suspensión agrupada de células individuales y se incubaron 5 x 10^{6} células en un total de 2 ml con o sin pINPROL o MIP-1\alpha, con 5% de suero de caballo, medio IMDM con L-glutamina añadida, a 37ºC y 5% de CO_{2} durante 4 horas. Se lavaron a continuación las células dos veces y se volvió a hacer el recuento. Se colocaron en placas en metilcelulosa en las siguientes condiciones finales:

	0,8% de metilcelulosa
	25% de suero de caballo
	20 ng/ml de IL3 murino recombinante
	L-glutamina añadida
	5 x 10^{5} células por ml
	medio IMDM

Las placas se incubaron durante 11 días a 37ºC y 5% de CO_{2} en 100% de humedad. Se hizo el recuento de colonias de más de 50 células.

TABLA 2

Grupos	Número de colonias	Porcentaje de referencia
Referencia	31,0	100%
pINPROL	21,25	68,5%
MIP-1\alpha	35,25	114%

Ejemplo 6 INPROL inhibe la proliferación de HPP-CFC

Un análisis in vitro para evaluar las células madre reconstituyentes murinas y los precursores primarios consiste en el análisis de la colonia potencial muy proliferante (HPP-PFC): otros análisis relacionados, p. ej. CFU-A, CFU-M, CFU-E y CFU-GEMM, detectan progresivamente poblaciones de precursor restringidas (M. Moore, Blood 177:2122-2128, 1991). Este ejemplo demuestra que el pretratamiento de las células con pINPROL inhibe su proliferación, mientras que MIP-1\alpha fracasa al hacerlo bajo estas condiciones experimentales.

Se trataron ratones BDF1 con 5-fluorouracilo (200 mg/kg i.p.) antes de que se determinasen los números de HPP-CFC en la médula ósea. Se lavaron las células por centrifugación y se incubaron a densidades de 10^{6} a 5 x 10^{6}/ml en medio sin agente añadido (Referencias), pINPROL (25 ng/ml) o MIP-1\alpha (200 ng/ml) durante 4 horas. Después de la incubación, se lavaron las células y se colocaron en placas en agar-agar (0,3%) con FCS al 30% y el medio acondicionado combinado de las líneas celulares 5637 y WEHI-3B (7,5% de cada medio acondicionado, tal como recomienda Sharap et al., 1991). La concentración en las placas fue de 5 x 10^{4} células/ml en placas de 60 mm. Se hizo el recuento de colonias el día 14 y los resultados se indican a continuación.

TABLA 3

Grupo	HPP-CFU	% de Referencia
Referencia	15,5 \pm 1,2	100%
pINPROL	8,3 \pm 0,7	53,5%
MIP-1\alpha	15,8 \pm 0,9	101%

Según estos resultados, MIP-1\alpha no inhibió la proliferación de la mayoría de los precursores inmaduros cuando está presente sólo durante el periodo de preincubación. pINPROL inhibió de forma eficaz la proliferación en estas condiciones, lo que indica diferencias fundamentales entre pINPROL y MIP-1\alpha desde el punto de vista de la actividad biológica.

Ejemplo 7 Efecto de la terapia de INPROL sobre la recuperación de la aplasia de la médula ósea producida por radiación

La aplasia de la médula ósea es la toxicidad limitativa primaria de la terapia del cáncer por radiación. Se ha demostrado que algunos factores de crecimiento (p. ej., G-CSF, GM-CSF y eritropoyetina) pueden acelerar la recuperación de la aplasia de la médula ósea producida por radiación. El concepto de protección utilizando un inhibidor de proliferación de células madre es un planteamiento diferente y complementario en la transcripción con daño hematológico. Al seguir el procedimiento de tratamiento desarrollado anteriormente (Ejemplos 3 y 4) se creó un modelo de irradiación letal de ratones. Es sabido en la técnica que los ratones que reciben 9Gy de cobalto 60 comienzan a morir después de 10 a 14 días; el día 30, la mortalidad se aproxima al 50%. Esta dosis letal se utilizó en nuestro modelo dividiéndola en dos aplicaciones posteriores de 4,5Gy cada una con un intervalo de 3 días entre las dosis. Los datos preliminares demostraron que la curva de supervivencia en este modelo era muy próxima a la conocida para una sola irradiación con 9Gy; además la prueba de proliferación de CFU-S demostró que 24 horas después de la primera irradiación, se producían del 35 al 50% de CFU-S al proliferar. Dichas células pueden estar protegidas mediante un inhibidor de células madre administrado antes de la segunda dosis.

Para examinar esta posibilidad, los ratones (50 ratones/grupo) recibieron 4,5Gy el día 0. Veinticuatro horas después, un grupo recibió pINPROL (2 \mug/ratón i.p.) y otro, grupo de control se inyectó con solución salina. Se administró la segunda dosis de radiación (4,5Gy) el día 3.

La Fig. 9 presenta el aumento de supervivencia después de una sola dosis de pINPROL. Las condiciones del modelo son clínicamente importantes para el tratamiento de algún cáncer, incluyendo los caracterizados por tumores sólidos; dicho tratamiento se administraría a un paciente con cáncer por administración de una dosis eficaz de INPROL entre dos dosis consecutivas de radiación, permitiendo de este modo que se puedan emplear mayores dosis de radiación para el tratamiento del cáncer. Debería ser también posible extender esta modalidad a los agentes quimioterapéuticos.

Ejemplo 8 Utilización de INPROL para el transplante autólogo de médula ósea

El transplante de médula ósea es la única terapia curativa conocida para varias leucemias (CML, AML y otras). El acondicionamiento ex vivo de BMT autólogo para infusión debería proporcionar fuentes potenciales autólogas de células madre normales exentas de contaminación leucémica y ser capaz de repoblar el sistema hematopoyético del receptor para permitir una terapia agresiva y eficaz.

1. Modelo de leucemia del cultivo L1210 de médula ósea a largo plazo para el estudio del efecto del INPROL que preserva la hematopoyesis normal durante la purga con AraC.

Se crearon cultivos de médula ósea a largo plazo (LTBMC) según Toksoz et al. (Blood 55:931-936, 1980) y se adoptó la línea celular L1210 leucémica a los LTBMC por cultivo conjunto durante 2 semanas. El crecimiento simultáneo de los precursores normal y leucémico tuvo lugar en estos cultivos LTBMC/L1210 combinados, similar a la situación en la médula ósea de un paciente leucémico. La discriminación entre las CFU de las unidades formadoras de colonias normales y las CFU leucémicas fue posible al cultivarlas como colonias en agar-agar en presencia o ausencia de medio acondicionado de WEHI-3 (línea celular que produce IL-3 murino). Las células normales experimentan apoptosis en ausencia de IL-3 mientras que las células leucémicas pueden formar colonias en su ausencia. Las células en suspensión de la composición LTBMC-L1210 da aproximadamente 150 colonias en presencia de IL-3 (clones hematopoyéticos normales) y 70 colonias cuando se cultivan sin IL-3 (clones leucémicos) por 50.000 células en placas.

El procedimiento de purga fue el siguiente: el día 0 todas las células en suspensión y el medio (10 ml/matraz) se extrajeron de los matraces con LTBMC-L1210 y se sustituyeron con 2 ml de medio que contenían 200 \mug de arabinosido de citosina (AraC) (Tsyrlova et al. en Leucemia: Advances in Biology and Therapy v. 35, 1988); después de 20 horas de incubación, se lavaron los matraces y se sustituyeron con 2 ml de medio reciente solo (grupo de referencia) o medio conteniendo pINPROL a 25 ng/ml durante 4 horas. Después de esta preincubación, se incubaron las células otra vez con 100 \mug/matraz de AraC durante 3 horas a 37ºC. Cada grupo contenía 4 matraces. Se lavaron los cultivos LTBMC-L1210 3 veces y se sustituyeron con medio LTBC fresco; se mantuvieron como anteriormente para los estudios de regeneración durante 3 a 4 semanas.

En la Fig. 10 se presentan los datos. No se observó crecimiento celular en los cultivos de referencia tratados con AraC solamente, mientras que en la regeneración de los matraces protegidos de la hematopoyesis con INPROL tuvo lugar mucho más rápidamente debido a la proliferación de precursores procedentes de la capa adherente. Además, las células del grupo experimental cuando se colocan en placas de agar-agar crecieron solamente en presencia de
IL-3 dando aproximadamente 100 CFU por cada 50.000 células; no se observó crecimiento de células leucémicas al menos durante 4 semanas. Por lo tanto, la médula tratada ex vivo con una dosis eficaz de AraC en combinación con INPROL se puede purgar de las células cancerosas mientras se protegen las células madre. Sería posible extender esta modalidad a otras formas de tratamientos de quimioterapia o de radiación.

2. La capacidad de repoblación de la médula (MRA) y treinta días de radioprotección aumentan por tratamiento in vitro con INPROL

La MRA, capacidad de las células para repoblar la médula ósea de ratones irradiados de forma letal, junto con la capacidad para conferir radioprotección durante 30 días, es una medida in vivo del potencial para recuperar animales mielosuprimidos (Visser et al. Blood Cells 14:369-384, 1988).

Para estudios de radioprotección se irradiaron ratones BDF1 con 9,5Gy y se restablecieron mediante transplante de médula ósea procedente de donantes estimulados con testosterona. Un grupo de receptores se restableció mediante células de médula ósea preincubadas durante 4 horas con medio (referencias-grupo A) y otro (grupo B) con 25 ng/ml de pINPROL. Se lavaron las células en ambos grupos y se transplantaron 30.000 células por ratón en animales irradiados. Se presentan los datos de supervivencia (Fig. 11). La suma de los 3 experimentos se representa, con las referencias normalizadas al 100%. La incubación de pINPROL aumentó la supervivencia de los ratones desde 36,5% en el grupo de referencia al 61,8% el día 30.

El aumento de MRA producido por preincubación con INPROL podría ser uno de los mecanismos para mejorar la radioprotección. Para examinar esta hipótesis, se midió MRA según Visser et al. (op. cit). En resumen, se pretrataron ratones donantes BDF1 con testosterona, su médula ósea se preincubó con medio o con pINPROL durante 4 horas y se inyectó en animales irradiados. El día 13, las células de médula ósea procedentes de fémures del receptor se colocaron en placas en agar-agar a 3 concentraciones diferentes (0,01, 0,05 y 0,1 equivalente de un fémur) en presencia de 20% de suero de caballo y 10% de WEHI-CM. El número de colonias el día 7 representó el MRA en cuanto a las células formadoras de colonia en la médula ósea de los receptores a la vez fueron los precursores de las células madre inmaduras del donante.

Como se puede apreciar en la Fig. 12 la MRA del grupo preincubado con población de células con INPROL es mayor que en el grupo de referencia (B).

Ejemplo 9 El efecto antihiperproliferante de INPROL sobre las células madre puede cambiar sus anomalías de diferenciación

La hiperproliferación de CFU-S no se observa solamente durante el restablecimiento con fármacos citotóxicos o irradiación sino también como consecuencia del envejecimiento normal y se cree que es una característica principal en el síndrome mielodisplásico (MDS). Se acompaña de trastornos de diferenciación, tales como un predominio de la diferenciación eritroide mientras que la diferenciación a lo largo de la vía granulocítica se reduce.

Se incubaron células de médula ósea durante 4 horas a 37ºC con 25 ng/ml de pINPROL o de medio (Referencias), se lavaron y a continuación se colocaron en placas en agar-agar con 20% de suero de caballo, 2 U/ml de eritropoyetina y WEHI-CM al 10%. Se hizo el recuento del número de colonias de BFU-E y de GM-CFU el día 7. En la Tabla 4 se presentan los datos y se resumen de 3 experimentos - se cogieron 4 animales por punto de cada grupo; se colocaron en 4 placas.

Como es obvio de la Tabla 4, la incubación de médula ósea normal (NBM) de animales jóvenes intactos (BDF1 de 8 a 12 semanas de edad) con INPROL no cambió el número o la proporción de diferentes tipos de colonias. Donantes BDF_{1} pretratados con propionato de testosterona (TSP) presentaron el mismo aumento en la proliferación de CFU-S que se observó anteriormente (Ejemplo 1, 3 y 4) un aumento ligero en el número de precursores eritroideos (colonias BFU-E) y un aumento en GM-CFU, que se eliminaron completamente mediante incubación con INPROL. Además, el alto nivel anormal de proliferación de CFU-S volvió a ser del 10% de CFU-S en fase S del ciclo celular. Es sabido que la hiperproliferación de CFU-S es una característica de algunas cepas de ratones susceptibles a la producción de leucemia vírica, por ejemplo los ratones Balb/c (Tabla 4) y puede también observarse en ratones de más edad (Tabla 4). La misma redistribución de precursores asignados observada en ratones BDF1 tratados con TSP se observa en Balb/c y en BDF1 de más edad (23 a 25 meses de edad), que tienen en común el nivel anormalmente alto de proliferación de CFU-S. La corrección tanto de la proliferación de CFU-S como de la diferenciación se produjo por incubación con INPROL. Lo que es aún más importante clínicamente, el estudio demostró que la inyección in vivo de INPROL (2 \mug/ratón) afectó tanto a la proliferación de CFU-S como a la proporción de colonias eritroides (BFU-E) y GM (Tabla 4).

TABLA 4 Efecto de INPROL sobre la diferenciación de CFU-S en precursores BFU-E y CFU-GM asignados

Donantes de	pINPROL	Porcentaje de	BFU-E	CFU-GM
médula ósea		CFU-S
		destruidos por ^{3}HTdR
BDF_{1} jóvenes	-	12,0 \pm 0,3	28,33 \pm 1,91	46,22 \pm 3,44
	+	15,0 \pm 1,3	22,00 \pm 3,74	47,70 \pm 3,72
BDF_{1} viejos	-	47,1 \pm 1,9	43,75 \pm 1,54	24,0 \pm 1,33
	+	11,4 \pm 0,7	15,25 \pm 1,45	44,0 \pm 7,63
BDF_{1}	-	53,2 \pm 1,6	32,67 \pm 2,44	15,71 \pm 2,28
estimulados con	+	7,2 \pm 0,4	12,00 \pm 1,83	35,50 \pm 1,4
TSP
Balb/C	-	57,0 \pm 1,9	47,60 \pm 2,96	33,57 \pm 3,45
	+	23,0 \pm 2,4	24,86 \pm 2,53	70,60 \pm 4,96

Ejemplo 10 Actividad autoestimulante de INPROL

Se ha observado que la incubación de células de médula ósea que contienen una proporción elevada de CFU-S proliferante con INPROL no cambia únicamente el ciclo de CFU-S, sino también su diferenciación, interrumpiendo la diferenciación predominantemente eritroide a favor de los precursores granulocítico y linfoide. Esta propiedad de INPROL es de importancia debido a los efectos secundarios de la inmunosupresión de la quimioterapia citotóxica o de la radioterapia, así como la inmunosupresión que acompaña los trastornos de las células madre hiperproliferantes y al envejecimiento.

El ejemplo muestra el efecto directo de INPROL sobre la diferenciación de precursores inmaduros procedentes del cultivo linfoide a largo plazo (LLTC) creado según Wittlock y Witte (Ann. Rev. Immun. 3:213-35, 1985) en los precursores pre-B, medido por la formación de colonias en metilcelulosa que contiene IL-7.

Se crearon LLTC tal como se describe y se alimentaron con medio reciente de LLTC (Terry Fox Labs., Vancouver, Canadá) dos veces a la semana. Se recogieron las células no adherentes una vez a la semana, se lavaron exentas de factores y se incubó durante 4 horas con 25 ng/ml de pINPROL o de medio solo para referencia. Después de la incubación, se lavaron las células y se colocaron en placas a una concentración de 10^{5} células/ml en metilcelulosa, conteniendo FCS al 30% y 10 ng/ml de IL-7. En la Figura 13 se presentan los datos de 3 semanas. El número de colonias pre-B grandes varió en la referencia, aumentando con el tiempo, pero la preincubación con INPROL estimuló siempre el desarrollo de las colonias 4 a 8 veces por encima del nivel de referencia. Esto demuestra una propiedad inmunoestimulante de INPROL que es de utilidad para corregir los estados inmunodeficientes y para aumentar las respuestas inmunitarias deseadas, p. ej., en la vacunación.

Ejemplo 11 INPROL mejora la capacidad de repoblación de las células madre - células que inician el cultivo a largo plazo en pacientes con CML

La leucemia mieloide crónica (CML) es un trastorno maligno letal de las células madre hematopoyéticas. El tratamiento de CML en fase crónica por quimioterapia con un solo agente, quimioterapia por combinación, esplenectomía o irradiación esplénica puede controlar los indicios químicos y los síntomas, pero no prolonga de forma significativa la supervivencia. A medida que CML avanza desde la etapa crónica a la acelerada, la terapia habitual no es eficaz. Actualmente, el trasplante de médula ósea (BMT) es la única terapia curativa conocida para la CML. La terapia de BMT en donante no emparentado es difícil debido a problemas de histoincompatibilidad. Menos del 40% de pacientes de CML seleccionados de otra forma tendrán un donante emparentado adecuadamente compatible; por lo tanto se prefiere el transplante autólogo. El acondicionamiento ex vivo de BMT autólogo para la infusión junto con la capacidad de seleccionar precursores mieloides no leucémicos (negativos a Ph) en pacientes positivos a Ph que se cultivan en cultivo a largo plazo (LTC) sugiere el potencial de fuentes autólogas de células madre normales que permiten terapia agresiva y eficaz de la CML.

En el contexto de BMT, se puede definir una célula madre hematopoyética como la que posee la capacidad para generar células sanguíneas maduras durante periodos prolongados. Se ha utilizado el sistema LTC humano desarrollado por C. Eaves y A. Eaves tanto para cuantificar números de células madre y como medio para manipularlas para su utilización terapéutica. Esto implica sembrar las células en una capa adherente preestablecida de médula humana irradiada; estos cultivos se mantienen a continuación durante 5 semanas. El punto final es el contenido de células clonógenas totales (adherentes + no adherentes) de los cultivos recogidos al final de este periodo. El rendimiento en células clonógenas en estas condiciones está linealmente relacionado con el número de precursores (células iniciadoras del cultivo a largo plazo (LTC-IC)) inicialmente añadidas; el rendimiento medio de LTC-IC humano individual son 4 precursores clonógenos por LTC-IC. Se ha demostrado anteriormente que cuando la médula de los pacientes con CML se coloca en condiciones similares, las células leucémicas (positivas a Ph) clonógenas disminuyen rápidamente. Utilizando la cuantificación de LTC-IC normal residual, en pacientes con CML es posible seleccionar aquellos que probablemente se benefician de la terapia intensiva soportada por transplante de autotrasplantes cultivados (Phillips et al., Bone Marrow Transplantation 8:477-487, 1991).

Se utilizó el procedimiento siguiente para examinar el efecto de INPROL sobre el número de células clonógenas (LTC-IC) entre las células de transplante de médula ósea creadas en la sangre periférica de un paciente con CML.

Se iniciaron cultivos como cultivos a largo plazo en el estroma irradiado previamente. La sangre periférica de un donante sano se utilizó como referencia. Las células sanguíneas periféricas de un paciente con CML se preincubaron con o sin pINPROL (25 ng/ml) durante 4 horas, se lavaron y se colocaron en el sistema LTC-IC durante 5 semanas para determinar el número de referencia de LTC-IC. Para los experimentos, se crearon otros cultivos paralelos durante 10 días. La mezcla de células adherentes y no adherentes de los cultivos que se cultivan durante 10 días se preincubó con o sin pINPROL y se colocó en alimentadores preestablecidos durante otras 8 semanas. Se estimó el número de LTC-IC de cada cultivo experimental colocando en placas tanto las células adherentes como las no adherentes en metilcelulosa con los factores de crecimiento apropiados (Terry Fox Laboratories, Vancouver, Canadá) y haciendo el recuento del número total resultante de células formadoras de colonias. Los valores de LTC-IC obtenidos utilizando este procedimiento procedían del contenido total de células clonógenas (CFC) utilizando la fórmula:

nº LTC-IC=nº CFC / 4

Los datos presentados en la Figura 14 demuestran que no hubo pérdida de LTC-IC durante los 10 primeros días de cultivo iniciados de la médula ósea del donante sano y aproximadamente el 30% del número de LTC-IC resultante estuvieron presentes todavía después de 5 semanas de cultivo. El número de LTC-IC del paciente de CML se redujo drásticamente hasta aproximadamente el 8% durante el periodo de 10 días y no se recuperó durante la incubación posterior, mientras que la preincubación de células con INPROL aumentó la concentración de LTC-IC al 30% del número inicial y se mantuvo durante 8 semanas.

Las aplicaciones clínicamente importantes de INPROL predichas por estos datos preliminares incluyen su utilización en estrategias para mejorar la selectividad del contenido de células madre normales de transplantes de médula recientes o cultivadas, en estrategias para mejorar la regeneración de células madre normales residuales in vivo además de protocolos para transferir nuevos materiales genéticos a las células madre de la médula humana para el posterior transplante a pacientes.

Ejemplo 12A

Procedimiento de aislamiento de inhibidor inmunoreactivo de proliferación de células madre a partir de preparaciones de médula ósea

Se aisló médula ósea de costillas de cerdos. Se separaron las costillas procedentes de cadáveres de cerdos y se limpiaron de las fibras musculares y grasa, se cortaron en piezas y se extrajo la médula ósea mediante una prensa hidráulica fabricada por Biophyzpribor. Las células de médula ósea se separan por centrifugación en una centrífuga K-70 a 2.000 rpm durante 20 minutos. El extracto del sobrenadante se somete sucesivamente a continuación a ultrafiltración a través de membranas XM-100, PM30, PM-50 de Amicon USA. Según el análisis por electroforesis, el principal componente del producto es la albúmina (véase Fig. 1).

Purificación bioquímica

El extracto de médula ósea y los componentes de la proteína de las fracciones se analizaron en cada etapa de purificación por electroforesis en gel en poliacrilamida al 10%, conteniendo dodecilsulfato de sodio al 0,1%. Se añadió a las muestras hasta el 7% de dodecilsulfato de sodio y hasta 0,5 a 1% de mercaptoetanol que se incubaron durante 5 minutos a 70ºC antes de cargar sobre el gel.

La electroforesis se realizó en 20Y cm de gel durante cinco horas. A continuación se coloreó el gel en Coomassie CBBC250 al 0,25% en una mezcla de etanol: agua: ácido acético 5:5:1 durante una hora a 20ºC y se lavó en varios cambios de ácido acético al 7%. Se evaluó la actividad del producto por el procedimiento de inhibición de la proliferación de células madre hematopoyéticas (CFU-S). El procedimiento se detalla a continuación.

Etapa 1

Purificación por precipitación con sulfato amónico

Se purificó la actividad por precipitación con sulfato amónico a 25% con saturación del 40 al 80% que se seleccionó basándose en los resultados de la Tabla 5.

TABLA 5

Saturación (%)	0-40	40-60	60-80	80-100
Actividad (%)	37,2-35,4	37,2-1,8	37,2-12,8	37,2-26,1
	=1,8%	=35,4%	=24,4%	=11,1%

Se determinó la cantidad de precipitación utilizada para analizar después de cada etapa de purificación según el nivel de purificación y el equivalente a la dosis de 2 x 10^{-2} mg del producto inicial. Se determinó la actividad mediante la fórmula:

% de cambio = %Sa - %Sb

en la que

%Sa es %S en la referencia

%Sb es %S después de la incubación con la fracción de la prueba.

Se desaló la fracción para reducir 20 veces la concentración de sulfato amónico antes de cada análisis de actividad y antes de cada etapa de purificación siguiente.

Etapa 2

Se aplica el inhibidor impuro de la Etapa 1 después de desalar y fraccionar utizando cromatografía de intercambio iónico, aquí celulosa DEAE 23, y a continuación se eluye con un gradiente de tampón de acetato sódico (pH 6,0).

Las fracciones activas de inhibidor se eluyen entre 3 y 5 mM.

El volumen de la columna fue 1 ml y la velocidad de elución fue de 4 ml/hora. La detección se realizó mediante el cromatógrafo Millicrome a 230 y 280 nm. La fracción 1 (véase Fig. 2) que presentaba la actividad mayor se aisló y se eluyó en tampón de acetato sódico 5 mM (véase Tabla 6).

TABLA 6

Fracciones	1	2	3	4	5
Actividad	46,3-0	46,3-14,1	46,3-42,1	46,3-19,6	46,3-45,1
	=46,3%	=32,2%	=4,2%	=26,7%	=1,2%

Los datos de la electroforesis indican que la principal proteína contaminante- albúmina (véase Fig. 3) se elimina de esta fracción que conduce a una purificación adicional cuadrulicada.

Etapa 3

El inhibidor purificado parcialmente a partir de la Etapa 2 se aplica directamente a una columna G-75 Sephadex.

El volumen de la columna es de 20 ml (20 X 1), la velocidad de elución es de 2 ml/hora. El tampón de elución es NaCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 7,5. Se realizó la detección en un cromatógrafo Millichrome a 230 y 280 nm. Se aisló la fracción 5 que tenía la mayor actividad.

TABLA 7

Fracciones	1	2	3	4	5
Actividad	42,2-19,1	42,2-35,2	42,2-21,5	42,2-38,8	42,2-0
	=23,1%	=7,0%	=20,7%	=3,4%	=42,2%

Etapa 4

Se realiza la cromatografía en fase inversa (Pharmacia FPLC System) utilizando columnas Pro-REC en una matriz Ultrasfera. Se eluye la proteína utilizando ácido trifluoracético al 0,1% en un gradiente de acetonitrilo.

La homogeneidad de un producto con MW 16-17kD es igual a 90%, tal como se demostró analizando el gel de acrilamida/dodecilsulfato sódico (véase Fig. 6). El resultado se representa en la Fig. 4. Se determina la actividad en la fracción 5. El rendimiento final del producto es del 5%. Como resultado, la cantidad total de proteína con MW 16kD después de la purificación es de 650 ng/ml del producto inicial. Durante el proceso de purificación se sometió el producto a incubación con calor a 70ºC durante varios minutos pero no se detectó pérdida de actividad bioló-
gica.

Ejemplo 12B

Procedimiento alternativo para aislar mayores cantidades de INPROL Aislamiento inicial

Se limpian costillas de cadáveres recientes de cerdo de fibras musculares y grasa, a continuación se cortan en piezas y se remojan en solución salina tamponada de fosfato en la proporción 1:1 (peso/volumen). La mezcla obtenida se prensa en una prensa hidráulica para separar la médula ósea del material óseo sólido.

Se recoge la suspensión de células de médula ósea y se filtra exenta de partículas sólidas a través de cuatro capas de estopilla. Se incuba el filtrado a 56ºC durante 40 minutos, a continuación se enfría en un baño con hielo a 4ºC. Se elimina el precipitado resultante por centrifugación a 10.000 g durante 30 minutos a 4ºC y se desecha.

El sobrenadante clarificado se añade gota a gota durante 30 minutos a 10 volúmenes de acetona enfriada con hielo agitada que contiene 1% en volumen de ácido clorhídrico concentrado. La mezcla resultante se mantiene a 4ºC durante 16 horas para la formación completa del precipitado. A continuación se sedimenta el precipitado por centrifugación a 20.000 g durante 30 minutos a 4ºC. Este sedimento se lava con acetona fría y se seca.

Purificación por HPLC

Se disuelve el sedimento en tampón A eluyente de HPLC que contiene acetonitrilo al 5% (MeCN) y ácido trifluoracético al 0,1% (TFA) hasta concentración final de la proteína de 8 a 10 mg/ml. Se carga esta solución (0,5 a 0,6 ml) en una columna de HPLC de 250 x 4,6 mm rellena con Polisil ODS-300 (10 mcm) y equilibrada con el mismo tampón A.

La elución se realiza mediante gradiente de tampón B (90% de MeCN, TFA al 0,1%) en tampón A a un caudal de 1 ml/min según el siguiente programa:

	Tiempo, min	% de B
	0	0
	4	0
	5	25
	25	90

Se utiliza una etapa adicional de B al 100% durante 5 minutos para lavar la columna antes del reequilibrado. A continuación se equilibra la columna de nuevo para retornarla al estado inicial y se puede cargar la siguiente fracción de la solución de proteína. en la Fig. 5 se muestra un cromatograma típico.

Durante la separación se controla el efluente de la columna en 280 nm para la detección de los picos de proteína. Se recogen las fracciones que contienen el material de proteína, se agrupan los picos separados y se evapora por rotación a 30ºC hasta sequedad. Se disuelven los residuos obtenidos en agua destilada y se analizan por análisis de bioactividad y por SDS-PAGE (gel al 14%, condiciones reductoras). El pico que contiene el material activo se eluye entre 70 y 80% de tampón B y contiene la banda principal de proteína de 16kD y los vestigios de proteínas que se mueven más rápido analizados por SDS-PAGE.

En la Figura 15 (A y C) se presenta un análisis del material obtenido recogiendo únicamente el segundo pico principal de HPLC. El material que contiene ambos picos (p. ej., Fig. 5) se denominará en la presente memoria Preparación 1 de pINPROL y los que contienen el único segundo pico se denominará Preparación 2 de pINPROL. Se cargaron 500 \mug de esta Preparación 2 de pINPROL activa, purificada en una columna C4 en fase inversa (Vydac) y se eluyó utilizando un gradiente lineal de acetonitrilo al 59,5% en ácido trifluoroacético al 0,1%. El material eluyó como un solo pico en acetonitrilo al 53% (Fig. 15A). Sin embargo, cuando se introdujo en idénticas condiciones, 250 \mug de MIP-1\alpha (R&D Systems), eluyó en acetonitrilo al 43,9% (Fig. 15B - obsérvese que los picos iniciales antes del acetonitrilo al 14% son artificiales y se deben a burbujas de aire en el detector). Por lo tanto, el INPROL natural es sustancialmente más hidrófobo que el MIP-1\alpha en estas condiciones. Se sabe que TGF\beta eluye a concentraciones más bajas que las observadas para pINPROL en estas condiciones (Miyazono et al., J. Biol. Chem. 263:6407-15, 1988).

En la Figura 15C se presenta un gel del material pINPROL eluido. La banda 1 es el material en bruto, la banda 2 son los marcadores de peso molecular y la banda 3 es el material purificado. Existen dos bandas principales, una aproximadamente a 14kD y otra aproximadamente a 35kD. Se cree que la banda de 35kD es una forma multimérica de la banda de 14kD.

Ejemplo 13A

Preparaciones de INPROL activo que contienen la cadena de beta hemoglobina

Se preparó pINPROL como se muestra en la Fig. 5 (es decir, Preparación 1 de pINPROL (véase Ejemplo 12B)). Se pasó el material por SDS-PAGE y se transfirió a nitrocelulosa utilizando técnicas estándar. Se sometió el material al análisis de la secuencia N-terminal utilizando un secuenciador de proteínas ABI 477A con analizador 120A Online PTH-AA utilizando técnicas estándar. Se obtuvo la siguiente secuencia N-terminal:

VHLSAEEKEAVLGLWGKVNVDEV....

La investigación por ordenador de las bases de datos de la proteína ponen de manifiesto que esta secuencia tiene identidad con la secuencia N-terminal de la cadena beta de la hemoglobina porcina (véase Fig. 16C).

Ejemplo 13B

Preparaciones de INPROL activo que contienen la cadena de alfa de hemoglobina

Tal como se muestra en la Fig. 15C, la proteína purificada recogiendo el segundo pico principal mostrado en la Fig. 5 (es decir, Preparación 2 de pINPROL) produjo dos bandas principales correspondientes a pesos moleculares de aproximadamente 15K y 30K, así como varias bandas menores. Se transfirieron los geles de SDS-PAGE a nitrocelulosa utilizando técnicas estándar y las bandas individuales se escindieron y se sometieron a análisis de la secuencia N-terminal como en el Ejemplo 13A. Para la banda de 15kD se obtuvo la siguiente secuencia N-terminal:

VLSAADKANVKAAWGKVGGQ....

La banda de 30kD se sometió a digestión proteolítica limitada y se obtuvo la siguiente secuencia interna:

** FPHFNLSHGSDQVK....

La primera secuencia presenta identidad con la secuencia N-terminal de la cadena alfa de hemoglobina porcina mientras que la segunda secuencia presenta identidad con los residuos 43 a 56 de la cadena alfa de hemoglobina porcina (véase Fig. 16C para una comparación de secuencias de las cadenas de hemoglobina alfa y beta humana, murina y porcina). El secuenciado repetido de estas bandas, así como de algunas de las bandas menores dio de forma coherente porciones de la secuencia de alfa-globina. Por lo tanto, las diversas bandas observadas en la Fig. 15C representan fragmentos o agregados de la cadena alfa de hemoglobina porcina.

Ejemplo 13C

Otras caracterizaciones de INPROL porcino

Con el fin de comparar además pINPROL con la hemoglobina porcina, se adquirió hemoglobina porcina cristalizada dos veces en Sigma Chemical Company y se sometió a HPLC en fase inversa, tal como se describe en el Ejemplo 12B para la Figura 15. Como se puede apreciar en la Figura 17, el cromatograma de HPLC de la hemoglobina intacta es similar al que se observa para la Preparación 1 de pINPROL. Además, en una comparación directa, la Preparación 2 de pINPROL mostrada en la Fig. 17A (es decir, procedente del segundo pico de la Fig. 5) se observa que se solapa con el de los segundos dos picos de la hemoglobina porcina (Fig. 17B), con tiempos de retención de 52,51 minutos y 52,25 para los picos principales, respectivamente. Debe observarse que hemo emigra conjuntamente con el primer pico principal en la hemoglobina, en este caso a 49,153 minutos; hemo es por lo tanto un componente de la Preparación 1 de pINPROL pero no de la Preparación 2. Esto se confirma por la falta de absorción de esta preparación de pINPROL a 575 nm, diagnóstico por longitud de onda para la presencia de hemo.

Los pesos moleculares previstos de las cadenas alfa y beta de hemoglobina porcina son 15.038 Daltons y 16.034 Daltons, respectivamente. Como se puede apreciar en el cromatograma de SDS-PAGE en la Figura 18, los dos primeros picos se componen de la cadena de peso molecular mayor y los dos segundos se componen de la cadena de peso molecular menor. De este modo los dos primeros picos parecen representar la cadena beta de hemoglobina y los dos segundos picos representan la cadena alfa de hemoglobina.

Se llevaron a cabo separaciones adicionales de hemoglobina porcina utilizando un gradiente de elución uniforme (Fig. 21). El análisis N-terminal de estos picos demostró que el primer pico es la cadena alfa porcina y el segundo es la cadena beta porcina. Los resultados del bioanálisis confirman que ambas cadenas de hemoglobina son biológicamente activas (p. ej. Ejemplos 14 y 15).

Para comparar además la Preparación 2 de pINPROL y la cadena beta de hemoglobina, se realizaron electroforesis bidimensionales (Fig. 19). Como primera dimensión, se realizó el enfoque isoeléctrico en tubos de vidrio utilizando anfolinas al 2%, pH 4 a 8 para 9.600 voltios-hora. Se utilizó tropomiosina (MW 33 kD, pI 5,2) como patrón interno; su posición está marcada en el gel 2D final por una flecha. El gel del tubo se equilibró en tampón y se selló en la parte superior de un gel de apilamiento sobre la parte superior de un fragmento de gel de acrilamida al 12,5%. Se realizó la electroforesis en gel del fragmento por SDS durante 4 horas a 12,5 mA/gel. Los geles se tiñeron con plata y se secaron.

Una comparación de los modelos electroforéticos 2D puso de manifiesto que únicamente una o dos manchas menores que son diferentes entre la cadena beta de hemoglobina purificada por HPLC y la Preparación 2 de pINPROL. Los análisis por Western, utilizando anticuerpos de hemoglobina anti-porcinos y electroforesis 1D ó 2D, confirman la presencia de beta-hemoglobina en la preparación. Por lo tanto la Preparación 2 de pINPROL activa, preparada según el Ejemplo 12B, es sustancialmente la cadena beta de hemoglobina porcina.

Ejemplo 14 La cadena alfa de hemoglobina, la cadena beta de hemoglobina o la hemoglobina intacta presenta actividad inhibidora en las células madre

Para confirmar que la cadena beta de hemoglobina presenta actividad en INPROL, se realizó un análisis suicida utilizando médula ósea procedente de ratones tratados con testosterona utilizando la metodología descrita en el Ejemplo 1 que utiliza material purificado como en el Ejemplo 12B. Como se muestra en la Tabla 8, el 15% de las células normales de médula ósea de ratón se destruyeron en oposición al 36% en animales tratados con testosterona. Como es de esperar, esto indica que el tratamiento de testosterona aumenta el porcentaje de células en el ciclo (resultando de este modo más susceptible a la destrucción - p. ej., Ejemplo 1). En acusado contraste, las células procedentes de animales tratados con testosterona incubados con pINPROL o con cadena beta de hemoglobina purificada a 40 ng/ml, presentaron una drástica disminución del porcentaje de células en el ciclo desde el 36% al 0% y al 7%, respectivamente. La dosis mayor de 200 ng fue menos efectiva para ambas proteínas. Como referencia positiva, el inhibidor de células madre caracterizado anteriormente MIP- 1\alpha redujo la ciclación al 13%.

Se puede realizar un análisis similar in vitro, utilizando el estado de ciclación de CFU-MIX en lugar de CFU-S. El análisis se realiza tal como se describió anteriormente para el análisis de CFU-S excepto que se utiliza arabinosido de citosina (Ara C, 30 mg/ml) como agente tóxico específico del ciclo en lugar de timidina tritiada a alta dosis (véase B.I. Lord en Haemopoiesis - A Practical Approach, N.G. Testa y G. Molineux (Eds.), IRL Press 1993; Pragnell et al. en Culture of Hematopoietic Cells, R.I. Freshney, I.B. Pragnell y M.G. Freshney (Eds.), Wiley Liss 1994) y se utiliza una cepa de ratón con velocidades elevadas de ciclación endógena (Balb/c) en lugar de ratones BDF_{1} tratados con testosterona. Tal como se presenta en la Tabla 9, la cadena beta porcina muy purificada o la cadena alfa porcina muy purificada, son ambas activas en este análisis. Obsérvese que en este análisis, los niveles de ciclación para las células tratadas con pINPROL presentan ocasionalmente números negativos, lo que indica que existen aún más colonias en el grupo tratado con Ara C que en el grupo sin tratar.

Tal como se describe en el Ejemplo 2, pINPROL inhibe la proliferación de células madre murinas FDCP-MIX en un análisis por absorción de timidina tritiada. La Figura 20 demuestra que las cadenas alfa o beta de hemoglobina purificadas son ambas activas en este análisis, con las inhibiciones observadas a <2ng/ml.

Lo anterior proporciona pruebas de que la cadena beta de la hemoglobina porcina presenta actividad a INPROL. Otros datos (p. ej. Tabla 9, Fig. 20) demuestran que la cadena alfa aislada, así como la hemoglobina intacta, son también activas como inhibidores de células madre. Las preparaciones activas también incluyen mezclas de cadenas alfa y beta (p. ej. Fig. 5).

Las observaciones de que la cadena de globina alfa aislada y/o la cadena de globina beta aislada son activas indican que las actividades descritas en la presente memoria no requieren una estructura intacta de hemoglobina tridimensional. Los fragmentos de la cadena alfa y beta son también activos como inhibidores de células madre.

TABLA 8

Tratamiento	% de destrucción
NBM^{1}	15
TPBM^{2}	36
pINPROL 200 ng/ml	23
40 ng/ml	0
Hbg^{3} 200 ng/ml	25
40 ng/ml	7
MIP-1\alpha 200 ng/ml	13
^{1}NBM = Médula ósea normal
^{2}TPBM = Médula ósea de ratones tratados con testosterona
^{3}Hbg = Cadena beta de hemoglobina porcina purificada por C_{4} en fase inversa
(procedente de hemoglobina de cerdo cristalizada 2\times)

TABLA 9

Tratamiento	% de destrucción
Referencia^{1}	43
Cadena alfa porcina^{2}	-4
Cadena beta porcina^{2}	-14
^{1}Referencia - Médula ósea de ratones Balb/c
^{2}100 ng/ml (Purificado como en la Fig. 21)

Ejemplo 15 INPROL purificado, hemoglobina alfa porcina purificada o hemoglobina beta porcina purificada son activas in vivo

Con el fin de determinar la capacidad de las cadenas de hemoglobina porcina purificada para actuar in vivo, se inyectó propionato de testosterona a ratones BDF_{1}, tal como se describe en el Ejemplo 1. Veinticuatro horas más tarde, los ratones recibieron 500 ng de pINPROL, cadena alfa de hemoglobina porcina (purificada en glóbulos rojos periféricos tal como en la Fig. 21) cadena beta porcina (purificada en glóbulos rojos periféricos tal como en la Figl. 21) o el volumen equivalente de excipiente por vía intravenosa. Cuarenta y ocho horas más tarde se recogió la médula ósea de cada ratón y se realizó el análisis de CFU-MIX tal como se describe en el Ejemplo 14. Tal como se muestra en la Tabla 10, pINPROL, la cadena alfa de cerdo y la cadena beta de cerdo fueron todos activos in vivo, reduciendo el porcentaje de CFU-MIX en el ciclo a niveles iniciales.

TABLA 10

Tratamiento	% de destrucción
Referencia^{1}	45
pINPROL^{2}	5
Cadena alfa porcina^{2}	5
Cadena beta porcina^{2}	-5
Inicial^{3}	4
^{1}Referencia - Médula ósea de ratones BDF_{1} tratados con testosterona
^{2}100 ng/ml
^{3}Inicial- Médula ósea de ratones BDF_{1} no tratados

Ejemplo 16 La cadena alfa de hemoglobina humana purificada, la cadena alfa de hemoglobina humana biotinilada, la cadena beta de hemoglobina humana biotinilada, la cadena gamma de hemoglobina humana y la cadena delta de hemoglobina humana presentan todas actividad inhibidora in vitro de células madre

Se adquirió hemoglobina humana en Sigma Chemical Corporation o se aisló por los medios habituales a partir de la sangre periférica humana de adultos o de la sangre del cordón umbilical. Se aislaron cadenas individuales por HPLC en fase inversa de forma similar a la descrita anteriormente para las cadenas alfa y beta porcinas (véase B. Masala y L. Manca, Methods in Enzymology vol. 231 págs. 21-44, 1994). Se obtuvieron cadenas alfa, beta, gamma y delta purificadas. Para las cadenas alfa y beta biotiniladas, se trató 1 mg de hemoglobina humana de adulto con 37 \mug de biotina NHS LC (Pierce) y las cadenas se separaron por cromatografía en fase inversa como anteriormente.

Como se muestra en las Tablas 11, 12 y 13, las cadenas de hemoglobina alfa humana purificada, alfa humana biotimilada, beta humana biotimilada, gamma humana y delta humana son todas activas en el análisis de ciclación de CFU-MIX.

TABLA 11

Tratamiento	% de destrucción
Referencia^{1}	49
Cadena alfa humana^{2}	-1
Cadena beta humana^{2}	41
Cadena gamma humana^{2}	-63
^{1}Referencia - Médula ósea de ratones Balb/c
^{2}100 ng/ml

TABLA 12

Tratamiento	% de destrucción
Referencia^{1}	47
Cadena gamma humana^{2}	12
Cadena delta humana^{2}	-4
^{1}Referencia - Médula ósea de ratones Balb/c
^{2}100 ng/ml

TABLA 13

Tratamiento	% de destrucción
Referencia^{1}	68
Cadena alfa humana^{2}	19
Cadena alfa biotinilada^{2}	7
Cadena beta humana^{2}	55
Cadena beta biotinilada^{2}	25
^{1}Referencia - Médula ósea de ratones Balb/c
^{2}100 ng/ml

Ejemplo 17 Cadena alfa humana purificada, alfa-beta dímero o hemoglobina son activos in vivo

Se analizaron la cadena alfa humana, el alfa-beta dímero o la hemoglobina purificados en un ensayo in vivo tal como se describe en el Ejemplo 15. Tal como se muestra en la Tabla 14, cada uno de éstos fueron activos a una concentración de 500 ng/ratón.

TABLA 14

Tratamiento	% de destrucción
Referencia^{1}	49
Cadena alfa humana	-22
Dímero alfa-beta humano	14
Hemoglobina humana	-31
^{1}Referencia - Médula ósea de ratones BDF_{1} tratados con testosterona

Ejemplo 18 INPROL porcino es activo en las células sanguíneas mononucleares humanas o CD34^{+}de sangre del cordón umbilical

Para investigar la capacidad de INPROL purificado procedente de la médula ósea porcina para afectar la ciclación en precursores humanos, se obtuvieron células de sangre del cordón umbilical. Se utilizó la fracción celular mononuclear total obtenida después de la separación en Ficoll o la fracción CD34^{+} obtenida después del fraccionamiento en columnas de afinidad anti-CD34 (CellPro Inc.). Se incubaron células durante 48 horas in vitro en presencia de interleucina 3 (IL-3) y factor de células madre (SCF) (100 ng/ml cada uno) para asegurar que las células madre estaban inicialmente en el ciclo. Después de esta preincubación, se realizaron análisis de ciclación, tal como se describe en el Ejemplo 14, para el ratón excepto que CFU-GEMM (en lugar de CFU-MIX) se hizo el recuento el día 18 después de la colocación en placas. Tal como se muestra en la Tabla 15, el INPROL porcino inhibió la ciclación de CFU-GEMM en las células mononucleares voluminosas o en la fracción CD34^{+}.

TABLA 15

Tratamiento	% de destrucción
Células mononucleares
Referencia	93
pINPROL^{1}	16
Células CD34+
Referencia	41
pINPROL^{1}	21
^{1} 100 ng/ml

Ejemplo 19 Alfa-hemoglobina humana purificada es activa en CFU-GEMM humana

Se obtuvieron células mononucleares de sangre del cordón umbilical humano y se incubaron en IL-3 y se utilizó SCF en un análisis de ciclación, tal como el descrito en el Ejemplo 18. Como se muestra en la Tabla 16, tanto el INPROL porcino purificado de médula ósea como la alfa-hemoglobina humana purificada procedente de la sangre periférica, fueron activos en este análisis.

TABLA 16

Tratamiento	% de destrucción
Referencia	100
pINPROL^{1}	-6
Cadena alfa humana^{1}	-23
^{1} 100 ng/ml

Ejemplo 20 Los péptidos obtenidos a partir de secuencias de alfa hemoglobina humana y de beta-hemoglobina humana son activos

Para identificar las secuencias activas de péptidos, se sobrepuso la estructura tridimensional de la mioglobina (que es inactiva en este análisis) sobre la estructura natural tridimensional de la cadena alfa presente en la hemoglobina humana de adulto utilizando un programa de modelación por ordenador. Se identificaron dos péptidos (que representan los aminoácidos 43 a 55 y 64 a 82, que son zonas estructuralmente diferentes de la mioglobina en el espacio tridimensional) que tienen actividad en el análisis del ciclo CFU-MIX. Con el fin de encontrar de la forma más aproximada el bucle en la cadena alfa natural, se sintetizó también un derivado cíclico del péptido 43 a 55 (c43-55) (utilizando un enlace disulfuro) y se observó que era activo.

La secuencia de estos péptidos es la siguiente:

43-55.1

\hskip2cm

Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val.

c(43-55)

\hskip1cm

Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys

(en la que los dos restos de Cys forman un enlace disulfuro)

64-82

\hskip1cm

Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-Ala-His-Val-Asp-Asp-Met-Pro-Asn-Ala-Leu-Ser- Ala

Se analizaron dos secuencias de hemorfina, hemorfina 10 (aminoácidos 32 a 41 de la secuencia de la cadena beta) y hemorfina 7 (aminoácidos 33 a 40) y se observó que eran activas.

Las secuencias son las siguientes:

Hemorfina 10 Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe

Hemorfina 7

\hskip0,8cm

Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg

Para analizar la actividad de estas secuencias, se llevó a cabo el ensayo de ciclación de CFU-MIX, tal como se describe en el Ejemplo 14. Como se muestra en las Tablas 17 a 19, estos péptidos son todos activos en este ensayo.

TABLA 17

Tratamiento	% de destrucción
Referencia	47
pINPROL^{1}	0
Péptido (43-55)
100 ng/ml	2
10 ng/ml	18
1 ng/ml	11
^{1}100 ng/ml

TABLA 18

Tratamiento	% de destrucción
Referencia	43
Péptido (43-55)^{1}	5
Péptido (64-82)^{1}	9
Hemorfina 10^{1}	1
Hemorfina 7^{1}	0
^{1}Todos los péptidos se analizaron a 100 ng/ml

TABLA 19

Tratamiento	% de destrucción
Referencia	47
Péptido cíclico (43-55)^{1}	0
^{1}Analizados a 100 ng/ml

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: KOZLOV, VLADIMIR

\hskip3,4cm

TSYRLOVA, IRENA

\hskip3,4cm

WOLPE, STEPHEN D.

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Inhibidor de proliferación de células madre y utilizaciones del mismo

\vskip0.666000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 33

\vskip0.666000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DIRECCIÓN: NIXON & VANDERHYE P. C.

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CALLE: 1100 NORTH GLEBE ROAD

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CITY: ARLYNGTON

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

ESTADO: VIRGINIA

\vskip0.333000\baselineskip

(E)

PAÍS: U.S.A.

\vskip0.333000\baselineskip

(F)

ZIP: 22201-4714

\vskip0.666000\baselineskip

(v)

LISTADO DESCIFRABLE POR ORDENADOR:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

TIPO DE SOPORTE: Disquete

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

PROGRAMA INFORMÁTICO: MS Word

\vskip0.666000\baselineskip

(vi)

DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US95/12268

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 30-SET-1995

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.666000\baselineskip

(vii)

DATOS ANTERIORES DE LA SOLICITUD:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/535.882

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 28-SET-1995

\vskip0.666000\baselineskip

(vii)

DATOS ANTERIORES DE LA SOLICITUD:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/316.424

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 30-SET-1994

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Pro His Phe Asp Leu Ser His Gly Ser Ala Gln Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Phe Pro His Phe Asp Leu Ser His Gly Ser Ala Gln Val Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Ala Leu Thr Asn Ala Val Ala His Val Asp Asp Met Pro Asn Ala Leu Ser Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 7:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 8:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Val Val Tyr Pro Trp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 9:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Val Val Tyr Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 10:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 11:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 12:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Trp Thr Gln Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 13:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Trp Thr Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 14:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Trp Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 15:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 4

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /producto = "posición 4"

\hskip6cm

/marcador = Xaa

\hskip6cm

/nota = "Gly-NH_{2}"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Tyr Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 16:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 4

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /producto = "posición 4"

\hskip6cm

/marcador = Xaa

\hskip6cm

/nota = "Gly-NH_{2}"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Lys Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 17:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 4

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /producto = "posición 4"

\hskip6cm

/marcador = Xaa

\hskip6cm

/nota = "Gly-NH_{2}"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Pro Leu Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 18:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 3

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /producto = "posición 3"

\hskip6cm

/marcador = Xaa

\hskip6cm

/nota = "Gly-NH_{2}"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Leu Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 19:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /producto = "posición 1"

\hskip6cm

/marcador = Xaa

\hskip6cm

/nota = "piroGlu"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Glu Asp Cys Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 20:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /producto = "posición 1"

\hskip6cm

/marcador = Xaa

\hskip6cm

/nota = "N-acetilSer"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Asp Lys Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 21:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DENOMINACIÓN/CLAVE: Sitio modificado

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 3

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /producto = "posición 3"

\hskip6cm

/marcador = Xaa

\hskip6cm

/nota = "GAMMAgLU"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Cys Xaa}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 22:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 423 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 22:

3

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 23:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 141 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 24:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 438 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: una

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\newpage

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 24:

5

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 25:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 146 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 25:

6

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 26:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 141 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 26:

7

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 27:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 146 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 27:

8

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 28:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 141 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 28:

9

10

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 29:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 146 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 29:

11

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 30:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 30:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val His Leu Ser Ala Glu Glu Lys Glu Ala Val Leu Gly Leu Trp Gly Lys Val Asn Val Asp Glu}

\sac{Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 31:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 31:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Leu Ser Ala Ala Asp Lys Ala Asn Val Lys Ala Ala Trp Gly Lys Val Gly Gly Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 32:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 32:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Pro His Phe Asn Leu Ser His Gly Ser Asp Gln Val Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 33:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS:

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 33:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

Claims (17)

1. Péptido que tiene la secuencia Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val.

2. Péptido cíclico que tiene la secuencia Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys, en la que los dos restos de Cys forman un enlace disulfuro o se unen mediante un puente de carbono.

3. Péptido que tiene la secuencia Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-Ala-His-Val-Asp-Asp-Met-Pro-Asn-Ala-Leu-Ser-Ala.

4. Utilización de uno de los péptidos que tienen la secuencia:

Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val,

Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys,

(en la que los dos restos de Cys forman un enlace disulfuro o se unen mediante un puente de carbono),

12

13

para la preparación de un fármaco para inhibir la proliferación de células madre.

5. Utilización de una cantidad de INPROL estimulante de crecimiento para la preparación de un fármaco para estimular el crecimiento de los linfocitos B, siendo INPROL un péptido tal como se ha definido en la reivindicación 4.

6. Utilización de una cantidad de INPROL que inhibe la proliferación de células madre, para la preparación de un fármaco para tratar el cáncer, en particular la leucemia, o para la preparación de un fármaco para inhibir la división de células madre en un mamífero expuesto a un agente que daña o destruye las células madre, tal como un agente antivírico, siendo dicho INPROL un péptido tal como se ha definido en la reivindicación 4.

7. Utilización de una cantidad de INPROL que inhibe la proliferación de células madre, para la preparación de un fármaco para inhibir la división de células madre en un mamífero expuesto a un agente que daña o destruye las células madre, siendo dicho INPROL un péptido tal como se ha definido en la reivindicación 4.

8. Procedimiento de mantenimiento ex vivo de células madre hematopoyéticas que comprende poner en contacto células hematopoyéticas con una cantidad de INPROL que inhibe la proliferación de células madre, siendo dicho INPROL un péptido tal como se ha definido en la reivindicación 4.

9. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que dichas células hematopoyéticas se seleccionan de entre el grupo que consta de células de médula ósea, células de sangre periférica, células movilizadas de sangre periférica y células de sangre del cordón umbilical.

10. Utilización de una cantidad de INPROL que reduce la hiperproliferación, para la preparación de un fármaco para tratar una enfermedad mieloproliferante o autoinmunitaria o la hiperproliferación de células madre epiteliales en un mamífero que padece de ellas, como por ejemplo el síndrome mielodisplásico, siendo dicho INPROL un péptido tal como se ha definido en la reivindicación 4.

11. Utilización de una cantidad de INPROL que protege las células madre, para la preparación de un fármaco para proteger de forma diferenciada de la quimioterapia o de la radiación a las células madre normales y no a las células cancerosas en un mamífero, siendo dicho INPROL un péptido tal como se ha definido en la reivindicación 4.

12. Utilización de INPROL para preparar un adyuvante de una vacuna, siendo dicho INPROL un péptido tal como se ha definido en la reivindicación 4.

13. Utilización de una cantidad de INPROL que invierte la hiperproliferación, para la preparación de un fármaco para tratar un mamífero que padece inmunodepresión producida por hiperproliferación de células madre, siendo dicho INPROL un péptido tal como se ha definido en la reivindicación 4.

14. Procedimiento para realizar la propagación de las células madre ex vivo que comprende poner en contacto las células hematopoyéticas con INPROL y al menos una citosina estimulante, siendo dicho INPROL un péptido tal como se ha definido en la reivindicación 4.

15. Composición farmacéutica que comprende (a) INPROL y (b) al menos un compuesto inhibidor seleccionado de entre el grupo que consta de MIP-I\alpha, TGF\beta, TNF\alpha, INF\alpha, INF\beta, INF\gamma, el pentapéptido piroGlu-Glu-Asp-Cys-Lys, el tetrapéptido N-acetil-Ser-Asp-Lys-Pro y el tripéptido glutatión (Gly-Cys-\gammaGlu), siendo dicho INPROL un péptido tal como se ha definido en la reivindicación 4.

16. Composición farmacéutica que comprende (a) INPROL y (b) al menos un compuesto estimulante seleccionado de entre el grupo que consta de IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-13, IL-14, IL-15, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, eritropoyetina, trombopoyetina, factor de células madre y el ligando flk2/flt3, siendo dicho INPROL un péptido tal como se ha definido en la reivindicación 4.

17. Utilización, procedimiento o composición según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 16, en la que el INPROL se selecciona de entre el grupo que consta de:

Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val,

Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys,

(en la que los dos restos de Cys forman un enlace disulfuro),

14

140