NO319575B1

NO319575B1 - Peptid, anvendelse av INPROL, samt farmasoytisk blanding som omfatter INPROL.

Info

Publication number: NO319575B1
Application number: NO19971444A
Authority: NO
Inventors: Vladimir Kozlov; Irena Tsyrlova; Stephen D Wolpe
Original assignee: Pro Neuron Inc
Priority date: 1994-09-30
Filing date: 1997-03-26
Publication date: 2005-08-29
Also published as: CA2201105A1; CA2201105C; NO971444L; MX9702266A; CN1328285C; CN1168695A; DE69532813D1; NZ294446A; JPH10509422A; FI971000A; US5939391A; HK1071517A1; JP2004256553A; ATE263236T1; ES2216019T3; NZ335108A; FI971000A0; IL115473A; DK0784677T3; FI117468B

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører peptid, anvendelser av INPROL, samt farmasøytisk blanding som omfatter INPROL. Mer spesielt omfattes anvendelser av INPROL-peptider for fremstilling av legemidler for inhibering av stamcelle-proliferasjon, for vedlikehold av pattedyrstamceller ex vivo, eventuelt for fremstilling av legemidler sammen med minst ett stimulerende cytokin for utførelse av ex vivo stamcelle-ekspansjon.

De fleste sluttstadie-celler i fornybare systemer har kort levetid og må kontinuerlig erstattes gjennom hele livet. For eksempel skriver blodceller seg fra en selv-fornyende populasjon av multipotente hematopoetiske stamceller (HSC). Hematopoetiske stamceller er en subpopulasjon av hemotopoetiske celler. Hematopoetiske celler kan for eksempel oppnås fra benmarg, navlestrengsblod eller perifert blod (enten umobilisert eller mobilisert med et middel som f.eks. G-CSF). Hematopoetiske celler inkluderer stamcelle-populasjonen, progenitorceller, differensierte celler, hjelperceller, stromaceller og andre celler som bidrar til det nødvendige miljø for produksjon av modne blodceller. Siden de hematopoetiske stamcellene er nødvendige for utviklingen av alle modne celler av hematopoese- og immunsystemet, er deres overlevelse essensiell for å reetablere et fullt funksjonelt forsvarssystem i individer behandlet ved kjemoterapi eller med andre midler.

Hematopoetisk celleproduksjon reguleres av en rekke faktorer som stimulerer vekst og differensiering av hematopoetiske celler, hvorav enkelte, for eksempel erytropoetin og G-CSF, for tiden benyttes i klinisk praksis. En del av kontroll-nettverket som imidlertid ikke er blitt grundig karakterisert, er den tilbakekoblings-mekanisme som danner den negative gren av regulatorprosessen (Eaves, et al., Blood, 78:110-117, 1991).

Tidlige studier av Lord og medarbeidere viste eksistensen av en løselig proteinfaktor i normale benmargekstrakter fra mus og svin, og som var i stand til reversibelt å inhibere cykliseringen av HSC (Lord, et al., Br. J. Haem., 34:441-446, 1976). Denne inhiberende faktor (50-100 kD molekylvekt) ble betegnet stamcelle-inhibitor (SCI).

Det lot seg ikke gjøre å rense denne faktor fra primærkilder som følge av de vansker som ligger i en in vivo bestemmelse som fordrer store antall bestrålte mus. I et forsøk på å løse disse problemene utviklet Pragnell og medarbeidere en in vitro bestemmelse for primitive hematopoetiske celler (CFU-A) og foretok en screening av cellelinjer som kilde til den inhiberende aktivitet (se Graham, et al., Nature 344:442-444,1990).

Siden tidligere undersøkelser hadde identifisert makrofager som mulige kilder for CSI (Lord, et al., Blood Cells 6:581-593,1980), ble en makrofagcellelinje fra mus, J774.2, valgt (Graham, et al., Nature 344:442-444, 1990). Det kondisjonerte medium fra denne cellelinje ble benyttet av Graham et al., for rensing, og det ble isolert et inhiberende peptid som viste seg å være identisk med det tidligere beskrevne cytokin-makrofag-inflammatoriske proteinl-alfa (MIP-1a). MIP-1able således isolert fra en cellelinje, ikke fra primærmaterialet. Mens Graham et al. registrerte at antistoff mot MIP-1 a motvirket aktiviteten av et rått benmargekstrakt, har andre forskere vist at andre inhibitorvirkninger er viktige. Foreksempel mener Graham et al. (J. Exp. Med. 178:925-32, 1993) at TFGp\ ikke MIP-1 a, er en primær inhibitor av hematopoetiske stamceller. Videre har Eaves et al., (PNAS 90:12015-19,1993) antydet at både MIP-1 a og TGFJ3 forekommer i suboptimale nivåer i normal benmarg og at inhibering fordrer synergisme mellom disse to faktorene.

Andre forskere har beskrevet ytterligere stamcelle-inhiberende faktorer. Frindel og medarbeidere har isolert et tetrapeptid fra føtal kalvemarg og fra leverekstrakter, som har stamcelle-inhiberende virkninger (Lenfant, et al., PNAS 86:779-782, 1989). Paukovits, et al., (Cancer Res. 50:328-332, 1990) har karakterisert et pentapeptid som i sin monomere form, er en inhibitor og som i sin dimere form, er en stimulator av stamcelle-cyklisering. Andre faktorer har også vært hevdet å virke inhiberende i diverse in vitro systemer (se Wright & Pragnell i Bailliere's Clinical Haematology, v. 5 s. 723-39,1992 (Bailliere Tinadall, Paris).

Tsyrlova et al. SU 1561261 A1, har beskrevet en renseprosess for en stamcelle-proliferasjonsinhibitor.

Hittil er ingen av disse faktorene godkjent for klinisk anvendelse. Det er imidlertid behov for effektive stamcelle-inhibitorer. Hovedtoksisiteten assosiert med kjemoterapi eller strålebehandling er destruksjonen av normale prolifererende celler, hvilket kan resultere i benmargsuppresjon eller gastrointestinal toksisitet. En effektiv stamcelle-inhibitor vil kunne beskytte disse cellene og tillate optimalisering av de terapeutiske regimer. På samme måte som det er et klart behov for en rekke stimulerende cytokiner (dvs. cytokiner som f.eks. IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-13, IL-14, IL-15, G-CSF, GM-CSF, erytropoetin, trombopoetin, stamcellefaktor, flk2/flt3 ligand, etc, som stimulerer cykliseringen av hematopoetiske celler) avhengig av den kliniske situasjon, er det også sannsynlig at det vil trenges en rekke inhiberende faktorer for å møte ulike kliniske behov.

Hemoglobin er et sterkt konservert tetramert protein med en molekylvekt på ca. 64.000 dalton. Det består av to alfa- og to beta-kjeder. Hver kjede binder et enkelt hem-molekyl (ferroprotoporfyrin IX), en jernholdig prostetisk gruppe. Virveldyrs alfa- og beta-kjeder ble sannsynligvis utviklet fra et enkelt urgen som duplisertes og deretter utviklet seg i forskjellige retninger, idet de to kjedene har beholdt en stor grad av sekvensidentitet både seg imellom og mellom ulike virveldyr (se Fig. 16A). Hos mennesker inneholder alfakjedeansamlingen på kromosom 16, to alfagener (alfa! og alfa2) som koder for identiske polypeptider, så vel som gener som koder for andre alfa-lignende kjeder: zeta, theta og flere ikke-transkriberte pseudogener (se Fig. 16B angående cDNA og aminosyresekvenser av human alfakjede). Betakjedeansamlingen på kromosom 11 består av et betakjedegen og flere beta-lignende gener: delta, epsilon, G gamma og A gamma, så vel som minst to ikke uttrykte pseudogener (se Fig. 16C angående cDNA og aminosyresekvenser av human betakjede).

Ekspresjonen av disse genene varierer under utviklingen. I human hematopoese som har vært gjenstand for omfattende karakterisering, syntetiserer embryoniske erytroblaster suksessivt tetramerer av to zetakjeder og to epsilonkjeder (Gower I), to alfakjeder og to epsilonkjeder (Gower II) eller to zetakjeder og to gammakjeder (Hb Portland). Etter hvert som embryogenesen skrider frem, består den dominerende form av føtalt hemoglobin (Hb F) som er sammensatt av to alfakjeder og to gammakjeder. Voksent hemoglobin (to alfa- og to betakjeder) begynner å syntetiseres under fostertiden, og ved fødselen er ca. 50% av hemoglobinet av den voksne form, og overgangen fullført ved ca. 6 måneders alder. Den overveiende del av hemoglobinet (ca. 97%) hos voksne er av to alfa- og to betakjede-varianten (Hb A) hvor små mengder Hb F eller deltakjede (Hb A2) er påvisbar.

Hem har vært grundig undersøkt med henblikk på dets innvirkninger på hematopoesen (se S.Sassa, Seminars Hemat. 25:312-20,1988 og N. Abraham et al., Int. J. Cell Cloning 9:185-210, 1991 for oversikt). Hem fordres for modningen av erytroblaster, og in vitro øker hemin (klorferroprotoporfyrin IX - dvs. hem med et ytterligere kloridion) proliferasjonen av CFU-GEMM, BFU-E og CFU-E. Likeledes øker hemin cellularitet i langtidskulturer av benmarg.

I. Kjemoterapi og radioterapi av cancer

Omfattende forskning på stimulerende vekstfaktorer har resultert i klinisk anvendelse av en rekke av disse faktorene (erytropoetin, G-CSF, GM-CSF, etc). Disse faktorene har redusert mortalitet og morbiditet assosiert med kjemoterapeutisk behandling og strålebehandling. Ytterligere fordeler for pasienter som undergår kjemoterapi eller strålebehandling ville kunne realiseres ved hjelp av en alternativ strategi, hvor stamcellers inntreden i cellecyklus blokkeres slik at de beskyttes mot toksiske bivirkninger.

II. Benmargtransplantasjon

Benmargtransplantasjon (BMT) er en egnet behandling for en rekke hematologiske, autoimmune og maligne sykdommer, hvor dagens terapier inkluderer hematopoetiske celler tatt fra navlestrengsblod eller fra perifert blod (enten umobilisert eller mobilisert med midler, så som G-CSF) så vel som fra benmarg. Ex vivo manipulering av hematopoetiske celler benyttes for tiden for å ekspandere primitive stamceller til en populasjon egnet for transplantasjon. Optimalisering av denne prosedyre fordrer: (1) tilstrekkelig antall stamceller som er i stand til å opprettholde langtids rekonstitusjon av hematopoese; (2) utarming av graft versus host-induserende T-lymfocytter og (3) fravær av gjenværende maligne celler. Denne prosedyren kan optimaliseres ved å inkludere stamcelle-inhibitor(er) for ex vivo ekspansjon.

Effekten av rensing av hematopoetiske celler med cytotoksiske medikamenter for å eliminere gjenværende maligne celler begrenses av forbindelsenes toksisitet overfor normale hematopoetiske celler og spesielt overfor stamceller. Det er behov for effektiv beskyttelse av normale celler under rensing, og beskyttelse kan oppnås ved å ta stamceller ut av cyklus med en effektiv inhibitor.

III. Perifer stamcelle-høsting

Perifere blod-stamceller (PBSC) byr på en rekke potensielle fordeler fremfor benmarg ved autolog transplantasjon. Pasienter uten passende steder for uttak av marg som følge av tumorutvikling eller tidligere radioterapi, kan fremdeles underkastes PBSC-uttak. Bruken av blod-stamceller eliminerer behovet for generell anestesi og kirurgi i pasienter som ikke tåler dette godt. Den nødvendige "apheresis"-teknologi for å samle blodceller, er effektiv og tilgjengelig i de fleste større medisinske sentra. Metodens hovedbegrensninger er både den lave normale steady state frekvens av stamceller i perifert blod og deres høye cyklusstatus etter mobilisering med medikamenter eller vekstfaktorer (f.eks. cyklofosfamid, G-CSF, stamcellefaktor). En effektiv stamcelle-inhibitor ville egne seg til å bringe slike celler tilbake til en hvilende tilstand, hvorved deres tap gjennom differensiering forhindres.

IV. Behandling av hyperproliferative forstyrrelser

En rekke sykdommer karakteriseres ved en hyperproliferativ tilstand, hvor dysregulerte stamceller fører til en overproduksjon av celler i sluttstadiet. Slike sykdomstilstander inkluderer, men er ikke begrenset til, psoriasis, hvor det forekommer en overproduksjon av epidermale celler, og premaligne tilstander i gastrointestinaltrakten som kjennetegnes ved forekomsten av intestinale polypper. En stamcelle-inhibitor ville kunne anvendes ved behandlingen av slike tilstander.

V. Genoverføring

Evnen til å overføre genetisk informasjon til hematopoetiske celler utnyttes for tiden i klinikken. Hematopoetiske celler er et egnet mål for genterapi på grunn av deres lette tilgjengelighet, foreliggende omfattende erfaring med håndtering og behandling av dette vev ex vivo og på grunn av blodcellenes evne til å gjennomtrenge vev. Dessuten kan det være mulig å korrigere visse humane genetiske defekter ved å innføre et funksjonelt gen i den primitive stamcelle i det humane hematopoetiske system.

For innføring av gener i humane hematopoetiske celler ved bruk av retrovirusvektorer eller fysikalske genoverføringsteknikker, finnes imidlertid flere begrensninger: (1) den lave hyppighet av stamceller i hematopoetisk vev har nødvendiggjort utvikling av høyeffektive genoverføringsteknikker og (2) hurtigere cykliserende stamceller har vist seg å være mer følsomme overfor vektorinfeksjon, men økningen av infeksjonsfrekvensen ved stimulering av stamcelle-proliferasjon med vekstfaktorer fører til negative effekter på genekspresjon over tid siden celler som inneholder transgenene tvinges til å differensieres irreversibelt og taper deres selv-fornyingsevne. Disse problemene kan minskes ved anvendelse av en stamcelle-inhibitor for å forhindre differensiering og tap av selv-fornyingsevne.

Foreliggende oppfinnelse vedrører polypeptider som er inhibitorer av stamcelle-prolrferasjon ("INPROL") og deres anvendelse.

Foreliggende oppfinnelse innbefatter et peptid kjennetegnet ved sekvensen Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val.

Videre innbefatter oppfinnelsen et cyklisk peptid kjennetegnet ved sekvensen Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys, hvor de to Cys-restene danner en disulfid-binding, samt et peptid med sekvensen Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-Ala-His-Val-Asp-Asp-Met-Pro-Asn-Ala-Leu-Ser-Ala.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse også anvendelse av en stamcelle-proliferasjonsinhiberende mengde av INPROL, hvor nevnte INPROL er valgt fra gruppen bestående av peptider med sekvensen: Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val, Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys, hvor de to Cys-restene danner en disulfid-binding, Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-AIa-His-Val-Asp-Asp-Met-Pro-Asn-Ala-Leu-Ser-Ala, Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe, Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg, Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-GIn, Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr, Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp, Leu-Val-Val-Tyr-Pro, Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-GIn, Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe, Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg, Tyr-Pro-Trp-Thr-GIn, og Tyr-Pro-Trp-Thr for fremstilling av et legemiddel for inhibering av stamcelle-proliferasjon, eventuelt for fremstilling av et legemiddel for å vedlikeholde hematopoetiske pattedyr-stamceller ex vivo.

Foretrukket blir de hematopoetiske cellene valgt fra gruppen bestående av benmargceller, perifere blodceller, mobiliserte perifere blodceller og navlestrengs-blodceller.

I henhold til et ytterligere aspekt omfatter foreliggende oppfinnelse en anvendelse av INPROL hvor nevnte INPROL er valgt fra gruppen bestående av peptider med sekvensen: Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val, Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys, hvor de to Cys-restene danner en disulfid-binding, Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-Ala-His-Val-Asp-Asp-Met-Pro-Asn-AIa-Leu-Ser-Ala, Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe, Leu-Val-VaHyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg, Leu-VaUVal-Tyr-Pro-Trp-Thr-GIn, Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr, Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp, Leu-Val-Val-Tyr-Pro, Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-GIn, Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe, Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg, Tyr-Pro-Trp-Thr-Gin, og Tyr-Pro-Trp-Thr; og minst ett stimulerende cytokin for fremstilling av et legemiddel for utførelse av ex vivo stamcelle-ekspansjon.

Foretrukket er en avendelse hvor nevnte hematopoetiske celler er celler valgt fra gruppen bestående av benmargceller, navlestrengs-celler, perifere blodceller og mobiliserte perifere blodceller.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også farmasøytisk blanding som omfatter; (a) INPROL, hvor nevnte INPROL er valgt fra gruppen bestående av peptider med sekvensen: Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val, Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys, hvor de to Cys-restene danner en disulfid-binding, Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-Ala-His-Val-Asp-Asp-Met-Pro-Asn-Ala-Leu-Ser-Ala, Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe, Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg, Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-GIn, Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr, Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp, Leu-Val-Val-Tyr-Pro, Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-GIn, Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe, Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg, Tyr-Pro-Trp-Thr-GIn, og Tyr-Pro-Trp-Thr; og (b) minst én inhibitorforbindelse valgt fra gruppen bestående av MIP-1 a, TGFB, TNFa, INFa, INFB, INFy, pentapeptidet pyroGlu-Glu-Asp-Cys-Lys, tetrapeptidet N-acetyl-Ser-Asp-Lys-Pro og tripeptidet glutation, Gly-Cys-TGIu.

I enda et ytterligere aspekt, omfatter foreliggende oppfinnelse en farmasøytisk blanding som omfatter; (a) INPROL, hvor nevnte INPROL er valgt fra gruppen bestående av peptider med sekvensen: Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val, Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys, hvor de to Cys-restene danner en disulfid-binding, Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-Ala-His-Val-Asp-Asp-Met-Pro-Asn-Ala-Leu-Ser-Ala, Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe, Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg, Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-GIn, Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr, Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp, Leu-Val-Val-Tyr-Pro, Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-GIn, Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe, Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg, Tyr-Pro-Trp-Thr-GIn, og Tyr-Pro-Trp-Thr; og (b) minst én stimulerende forbindelse valgt fra gruppen bestående av IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-13, IL-14, IL-15, G-CSF, GM-CSF, M-SCF, erytropoetin, trombopoetin, stamcellefaktor og flk2/flt3-ligand.

Det beskrives DNA-sekvenser som koder for de ovenfor angitte peptider, vektorer som inneholder nevnte DNA-sekvenser og vertsceller som inneholder vektorene. Disse peptidene kan syntetiseres ved å benytte kjemisk standardteknikk

(f.eks. fastfase-syntese) eller ved å benytte rekombinant-teknikk (f .eks. slike fusjonssystemer som gjør bruk av glutation-S-transferase (D.B. Smith & K.S. Johnson, Gene 67:31-40,1988), thioredoxin (LaVallie et al., Biotechnology 11:187-193, 1993) eller ubiqurtin (Butt et al., PNAS 86:2540-4, 1989; US-patent 5.391.490)).

Det beskrives i tillegg en fremgangsmåte for inhibering av stamcelle-proliferasjon og som består i at hematopoetiske celler bringes i kontakt med en forbindelse som er i stand til å binde opiatreseptorer, gjerne mu-subklassen av opiatreseptorer. Peptider (betegnet "hemorfiner") er blitt isolert fra hemoglobin som oppviser opiat-lignende virkninger (f.eks. Brantl et al., Eu r. J. Pharm. 125:309-10, 1986; Davis et al., Peptides 10:747-51, 1989; Karelin et al. Bioch. Biophys. Res. Comm. 202:410-5,1994; Zhao et al. Ann. N.Y. Acad. Sei. 750:452-8, 1995). Hver av disse artiklene inkorporeres herved.

Peptidene som anvendes ifølge oppfinnelsen har lignende sekvens som andre opiat-lignende peptider, så som de av Tyr-MIF-1-familien (angående en oversikt, se Reed et al., Neurosci. Biobehav. Rev. 18:519-25,1994), de kasein-avledede kasomorfinene (Brantl et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 360:1211-16, 1979; Loukas et al., Biochem. 22:4567-4573, 1983; Fiat & Jolles, Mol. Cell. Biochem. 87:5-30, 1989), peptider som skriver seg fra cytokrom b, betegnet cytokrofiner (Brantl et ai. Eur. J. Pharm. 111:293-4,1985) så vel som peptider som skriver seg fra kombinasjonsbiblioteker som er underkastet screening med henblikk på binding til opiat-reseptorer (angående oversikt, se Dooley et al., Peptide Research 8:124-137, 1995). Hver av disse artiklene inkorporeres herved.

Det beskrives også en fremgangsmåte for inhibering av stamcelle-proliferasjon og som omfatter at hematopoetiske celler bringes i kontakt med et peptid valgt fra gruppen bestående av Tyr-MIF-1 -beslektede peptider, kasomorfiner og cytokrofiner. Spesielt inkludert er Tyr-MIF-1-peptider som har sekvensene: Tyr-Pro-Trp-Gly-NH2, Tyr-Pro-Lys-Gly-NH2, Tyr-Pro-Leu-Gly-NH2, og Pro-Leu-Gly-NH2.

Foreliggende oppfinnelse beskriver en inhibitor av stamceller (INPROL) som er forskjellig fra de tidligere kjente, så som MIP-1 a, TGFB, tetrapeptidet til Frindel og medarbeidere eller pentapeptidet til Paukovits og medarbeidere (ref. Wright & Prag nei1,1992 (op eit.)). Naturlig forekommende INPROL har en molekylvekt som ifølge ultrafiltrering, er høyere enn 10.000 dalton, hvilket adskiller det fra tetrapeptidet så vel som fra pentapeptidet. Det er mer hydrofobt enn MIP-1 a eller TGFB i kromatografisystemer basert på omvendt fase, hvilket adskiller det fra de nevnte cytokiner. Dessuten er virkningsmåten forskjellig fra noen av de tidligere beskrevne inhibitorer ved at det er aktivt i en in vitro bestemmelse når det bare benyttes under en preinkuberingsperiode. MlP-1oc er for eksempel ikke effektivt når det benyttes kun under en preinkuberingsperiode (Eksempel 5). Dessuten er naturlig forekommende INPROL aktivt i en bestemmelse som måler "high proliferative potential cells"

(HPP-PFC), mens MIP-1 a ikke er det (Eksempel 6).

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Figur 1-4 viser en SDS polyakrylamidgel-undersøkelse av produktet etter hvert rensetrinn. Figur 1 - Bane 1 er chymotrypsinogen, Bane 2 er ovalbumin, Bane 3 er BSA, Bane 4 er fraksjoner <30 kD, Bane 5 er fraksjoner 30-50 kD og Bane 6 er fraksjoner 50-100 kD. Figur 2 - Bane 1 er etter ammoniumsulfat-presipitasjon (40-80%) og Bane 2-5 er DEAE-fraksjoner (Bane #2 representerer den aktive fraksjon). Figur 3 - Bane 1 er supernatanten etter ammoniumsulfat-presipitasjon, Bane 2 er den aktive DEAE-fraksjon, Bane 3-5 representerer gelfiltreringsfraksjoner (Bane #5 representerer den aktive fraksjon).

Figur 4 - Bane 2 representerer sluttproduktet.

Figur 5 viser et omvendt-fase HPLC-kromatogram av sluttrensingen.

Figur 6 viser tritiert thymidin-inkorporering (cpm) i celler av FDCP-blandingslinjen uten (kontroll = 0% inhibering) og med forskjellige konsentrasjoner av INPROL, renset fra svine-benmarg (pINPROL). De viste data er normalisert mot kontrollverdien. Figur 7 viser prosentandelen celler i cellecyklusens S-fase etter behandling av mus med testosteron-propionat (TSP), TSP pluss pINPROL eller bærer (kontroll). Hver gruppe omfattet 25 dyr (3-4 per tidspunkt). Figur 8 viser overlevelsen hos mus behandlet med to doser av 5-FU, med eller uten pINPROL-behandling. Hver gruppe inneholdt 30 dyr. Figur 9 viser overlevelsen hos strålebehandlede mus med og uten pINPROL-behandling. Hver gruppe inneholdt 50 dyr. Figur 10A og 10B viser regenerering av normale benmargceller i langtidskultur 1 uke (10A) og 3 uker (10B) etter behandling med Ara-C eller Ara-C pluss pINPROL Figur 11 viser overlevelse hos mus (75 per gruppe) etter letal bestråling og transplantasjon av 3 x 104 benmargceller etter preinkubering med medium (kontroll) eller pINPROL (25 ng/mL) i 4 timer. Overlevelsen ble fulgt i 30 dager. Figur 12 viser CFU-GM antallet dannet etter 14 dager ved dyrkning av benmargceller fra mus etter letal bestråling og restitusjon med donor-benmargceller preinkubert med pINPROL eller medium i 4 timer. Figur 13 viser suspensjonsceller fra lymfoid langtidskultur som ble uttatt hver uke, utvasket og utplatet med IL-7 (10 ng/mL) etter preinkubering med medium eller pINPROL i 4 timer. Figur 14 viser forbedret evne til repopulasjon av leukemiske perifere blodceller behandlet med pINPROL. LTC-IC (Long term culture initiating cells) ble mått ved å utplate adherente og ikke-adherente LTC-celler med og uten pINPROL og tildele en skår for CFU-GM på Dag 7. Dataene er normalisert mot kontrollverdier. Figur 15A viser et C4 omvendt-fase kromatogram av renset pINPROL under eluering ved 53% acetonitril. Figur 15B viser et C4 omvendt-fase kromatogram av MIP-1 a som eluerer ved 43,9% acetonitril. Figur 15C viser et SDS-PAGE kromatogram av det rå pINPROL-preparat og av det rensede preparat etter omvendt-fase. Bane 1 er råmaterialet, Bane 2 er molekylvektmarkører og Bane 3 er det rensede materialet. Figur 16 viser hemoglobinsekvenser: Fig. 16A viser cDNA- og aminosyresekvensene av human alfa-hemoglobin og Fig. 16B viser cDNA- og aminosyresekvensene av human beta-hemoglobin. Nummereringen angir aminosyrene. Fig. 16C viser en aminosyresekvens-sammenligning av alfa- og betakjedene av hemoglobiner f ra menneske, mus og svin. Figur 17 viser en sammenligning av C4 omvendt-fase HPLC-kurvene av pINPROL (Fig. 17A) og av krystallisert svinehemoglobin (Fig. 17B). Figur 18 viser en SDS-PAGE-gel av fraksjoner fra en C4 omvendt-fase HPLC-separasjon av krystallisert svinehemoglobin. Bane 1 viser molekylvektmarkører, Bane 2 viser fraksjonene 48-49 som skriver seg fra den første topp (ved 47,11 min.). Bane 3 viser fraksjonene 50-51, som skriver seg fra den andre topp (ved 49,153 min.)- Bane 4 viser fraksjonene 54-55 som skriver seg fra den tredje topp (ved 52,25 min.) og Bane 5 viser fraksjonene 56-57 som skriver seg fra den fjerde topp (ved 53,613 min.). Figur 19 viser en sammenligning av den todimensjonale gelelektroforese av pINPROL (Fig. 19A) og av renset svine-betahemoglobin (Fig. 19B). Figur 20 viser en sammenligning av virkningene av renset svine-alfa-hemoglobin, -betahemoglobin eller pINPROL i FDCP-MIX-bestemmelsen. Figur 21 viser den omvendte fase-separasjon av svinehemoglobin ved å benytte en mindre bratt elueringsgradient.

For å lette forståelsen av den her beskrevne oppfinnelse, gis i det følgende en mer detaljert beskrivelse. Denne beskrivelse som tjener som eksempel for foreliggende oppfinnelse.

INPROL inhiberer reversibelt delingen av stamceller. Nærmere bestemt er INPROL virksom når det gjelder temporær inhibering av celledeling av hematopoetiske stamceller. Fremgangsmåten kan således benyttes for å lindre de uønskede bivirkningene ved kjemoterapi på pasientens hematopoetiske, myeloide og immunsystem ved å beskytte stamcellene fra ødeleggelse forårsaket av kjemoterapeutiske midler eller bestråling benyttet for å ødelegge cancerceller eller viralt infiserte celler. Ifølge en utførelse, administeres INPROL til pasienten i en dosering som er tilstrekkelig til å inhibere stamcelledeling, mens det kjemoterapeutiske middel virker på syke celler. Etter at det kjemoterapeutiske middel har utøvd sin funksjon, vil de stamcellene som er inhibert av INPROL, uten ytterligere behandling, igjen bli delende celler. Dersom det er ønskelig å forbedre hematopoese-regenereringen, kan det i tillegg benyttes stimulerende vekstfaktorer eller cytokiner.

I denne sammenheng innbefatter betegnelsen "INPROL" pattedyrproteiner, renset som i Eksemplene, hemoglobin, alfakjeden av hemoglobin (med eller uten hem-gruppen), beta-kjeden av hemoglobin (med eller uten hem-gruppen), blandinger av alfa- og beta-kjeder (med eller uten hem-gruppen) samt fragmenter eller analoger av disse proteiner, inklusivt embryonale, føtale eller voksne former (f.eks. alfa-, beta-, gamma-, delta-, epsilon- eller zeta-kjeder, enten hver for seg eller som blandinger, dimerer eller multimerer, med eller uten hem-gruppen) som har evne til å inhibere stamcelle-proliferasjon. Betegnelsen "INPROL" inkluderer naturlig forekommende så vel som ikke-naturlig forekommende (f.eks. rekombinant fremstillede) former av disse proteinene.

I en typisk klinisk situasjon administreres pasienten et daglig regime gjennom intravenøs injeksjon eller infusjon i enhetsdoseform, ved for eksempel å benytte 0,01 til 100 mg/kg, hensiktsmessig 0,1 til 1,0 mg/kg INPROL, gitt f.eks. 4 til 60 timer før standard kjemoterapi eller strålebehandling.

I henhold til en annen utførelse, kan forbehandlingen med INPROL omfatte doser av kjemoterapeutiske midler eller strålebehandling som går ut over de som normalt tolereres av pasienter.

En stor andel av de hematopoetiske stamcellene er normalt hvilende (ikke-cykliserende). Som en kompensatorisk repons på kjemoterapeutisk indusert hematopoetisk skade, kan imidlertid en større andel stamceller inngå cyklisering etter kjemoterapi, hvilket gjør dem særlig utsatt for etterfølgende doser av cytotoksisk kjemoterapi eller strålebehandling. Ved å inhibere cyklisering av slike stamceller tillater INPROL-behandling tidligere innsettende og hyppigere administrering av senere doser av cytotoksisk kjemoterapi i konvensjonelle eller forhøyede doser.

I én utførelse administreres INPROL (0,1 mg til 6 g - hensiktsmessig 1,0 til 60 mg) ca. 24 timer og inntil 10 dager etter en initial kjemoterapeutisk dose. Etter ytterligere 4 til 60 timer, hensiktsmessig 24 til 48 timer, administreres en ny kjemoterapeutisk dose. Denne cyklus med vekslende kjemoterapi og INPROL fortsettes i henhold til det terapeutiske utbytte. Kjemoterapeutiske midler og administrasjonsmåter velges ut fra egnethet for bestemte svulsttyper i henhold til vanlig praksis i klinikken. Eventuelt benyttes stimulerende vekstfaktorer, så som G-CSF, stamcellefaktor, etter kjemoterapi eller strålebehandling for ytterligere å forbedre hematopoese-gjenopprettelse.

For ex vivo anvendelser benyttes 0,1 ng til 100 ng/10<6> celler/mL, hensiktsmessig 20-50 ng/10<6> celler/mL, av INPROL.

I henhold til en annen utførelsesform av oppfinnelsen anvendes INPROL i en fremgangsmåte for fremstilling av autologe hematopoetiske celler for transplantasjon. De hematopoetiske cellene behandles ex vivo med en effektiv mengde INPROL for å inhibere stamcelle-deling, hvoretter de renses for cancerøse celler ved at margkulturene administreres en effektiv mengde av et kjemoterapeutisk middel eller bestråling. Kjemoterapeutiske midler som er spesifikke for cykliserende celler foretrekkes. Den således behandlede marg reinjiseres i den autologe donor. Eventuelt behandles pasienten med et middel som er kjent for å stimulere hematopoese, for å forbedre hematopoese-gjenopprettelsen i pasienten.

I henhold til en annen utførelse, benyttes INPROL som en tilleggsterapi ved behandling av leukemi. Ved sykdomstilstander hvor leukemicellene ikke responderer på INPROL, behandles for eksempel de leukemiske hematopoetiske cellene ex vivo med INPROL. Proliferasjonen av normale stamceller forhindres ved administrering av INPROL. I løpet av det tidsrom hvor de prolifererende leukemicellene behandles med et cellecyklus-spesifikt cytotoksisk middel, beskyttes en populasjon av normale stamceller mot ødeleggelse. I tillegg administreres eventuelt et stimulerende cytokin, så som IL-3 eller GM-SCF, for å indusere cyklisering i de leukemiske cellene under medikament- eller strålebehandling, mens de normale stamcellene er beskyttet med INPROL. Pasienten behandles med kjemoterapeutiske midler eller bestråling for å ødelegge leukemiske celler, hvoretter den rensede marg transplanteres tilbake i pasienten for å etablere hematopoese-gjenopprettelsen.

I en annen tilsvarende behandling av pasienter med alvorlige virusinfeksjoner som involverer blodceller eller lymfocytter, så som HIV-infeksjon, behandles hematopoetiske celler ex vivo med INPROL og deretter med antivirale midler, medikamenter som ødelegger infiserte celler, eller antistoff-baserte systemer for å fjerne infiserte celler. Etter myelo-ablativ antiviral eller myelo-ablativ kjemoterapi for å utrydde virale vertsceller fra pasienten, returneres de INPROL-behandlede margcellene til pasienten.

I henhold til en annen utførelse, benyttes INPROL for å behandle forstyrrelser relatert til hyperproliferative stamceller. For eksempel er psoriasis en forstyrrelse som forårsakes av hyperprolifererende hudepitelceller som iblant behandles med cytotoksiske medikamenter. Andre pre-neoplastiske lesjoner hvor stamcelle-proliferasjon er involvert, kan også behandles med effektive mengder av INPROL benyttet for helt eller delvis å inhibere proliferasjonen av stamcellene. For disse formål benyttes lokale eller transdermale blandinger (f.eks. salver, lotions, gel eller plastere) som inneholder INPROL som et alternativ til parenteral administrering. I de fleste tilfeller av leukemi er leukemi-progenitorcellene differensierte cellepopulasjoner som ikke påvirkes av INPROL og som derfor kan behandles ved hjelp av metoder hvor INPROL benyttes, f.eks. de ovenfor beskrevne metoder. I de tilfeller hvor leukemi-progenitorcellene er meget primitive og direkte følsomme overfor inhibering med INPROL, svekkes proliferasjonen av leukemiceller ved å administrere effektive mengder av INPROL.

Monoklonale eller polyklonale antistoffer mot INPROL-polypeptider utvikles etter standardteknikk. Disse antistoffene eller INPROL-polypeptidene merkes med påvisbare merkinger, hvorav mange typer allerede er kjent. De merkede INPROL-eller anti-INPROL-antistoffene benyttes deretter som stamcelle-markører for å identifisere og isolere stamceller ved direkte å administrere dem til pasienten for diagnostiske formål. Alternativt benyttes disse merkede polypeptidene eller antistoffene ex vivo for å identifisere stamceller i et hematopoetisk cellepreparat for å gjøre det mulig å fjerne disse før utrensingen av neoplastiske celler i margen. På lignende måte benyttes slike merkede polypeptider eller antistoffer for å isolere og identifisere epitelceller eller andre stamceller. Slike merkede eller umerkede antistoffer benyttes dessuten terapeutisk gjennom nøytralisasjon av INPROL-aktivitet, eller diagnostisk gjennom påvisning av sirkulerende INPROL-nivåer.

INPROL kan klones fra humane gen- eller cDNA-bibliotek for ekspresjon av rekombinant humant INPROL, ved å benytte standardteknikker. Ved for eksempel å benytte sekvensinformasjon oppnådd fra det rensede protein, konstrueres oligonukleotid-prober som kan merkes, f.eks. med 32-fosfor, og benyttes for screening av et passende cDNA-bibliotek (f.eks. fra benmarg). Alternativt underkastes et ekspresjonsbibliotek fra en passende kilde (f.eks. benmarg) screening med henblikk på cDNA som koder for INPROL, ved å benytte antistoff eller ved å benytte en passende funksjonell bestemmelse (f.eks. den beskrevet i Eksempel 2). Hemoglobin som sådant, så vel som de enkelte alfa- og betakjedene, er blitt klonet og uttrykt ved å benytte kjent metodikk (se Pagnier et al., Rev. Fr. Transfus. Hemobiol., 35:407-15,1992; Lookeret al, Nature, 356:258-60,1992; Methods in Enzymology Bd. 231,1994). Hver av disse artiklene inkorporeres herved med hele sitt innhold i foreliggende beskrivelse.

Det beskrives DNA-sekvenser som inkluderer: inkorporeringen av kodoner som "foretrekkes" for ekspresjon av valgte verter utenom pattedyrene; tilveiebringelse av spaltningsseter for restriksjons-endonuklease-enzymer; og tilveiebringelse av ytterligere initiale, terminale eller intermediære DNA-sekvenser som letter konstruksjon av lett uttrykte vektorer eller produksjon eller rensing av hemoglobinets alfa- beta-, gamma-, delta-, epsiolonr og/eller zeta-kjede.

Det beskrives også DNA-sekvenser som koder for polypeptidanaloger eller derivater av hemoglobin alfa-, beta-, gamma-, delta-, epsilon- og/eller zeta-kjeder som adskiller seg fra naturlig forekommende former med hensyn til identitet eller plasseringen av én eller flere aminosyrerester (dvs. delesjonsanaloger som inneholder færre enn alle de angitte rester; substitusjonsanaloger hvor én eller flere av de angitte rester er erstattet med andre rester; og addisjonsanaloger hvor én eller flere aminosyrerester er addert til en terminal eller midtre del av polypeptidet) og som har enkelte eller alle egenskaper tilfelles med de naturlig forekommende former.

I henhold til en fordelaktig utførelsesform er INPROL produktet av prokaryot eller eukaryot vertsekspresjon (f.eks. av bakterie-, gjær-, høyere plante-, insekt- og pattedyr-celler i kultur) av eksogene DNA-sekvenser oppnådd ved genomisk eller cDNA-kloning eller ved gensyntese. Det betyr at ifølge en fordelaktig utførelsesform er INPROL "rekombinant INPROL". Produktet av ekspresjon i typiske gjær- (f.eks. Saccharomyces cerevisiae) eller prokaryote (f.eks. E. coii) vertsceller er fritt for assosiering med et hvilket som helst pattedyrprotein. Ekspresjonsproduktene i vertebrater, f.eks. celler fra pattedyr utenom mennesket (f.eks. COS eller CH og fugl) er frie for assosiering med et hvilket som helst humant protein. Avhengig av hvilken vert som benyttes, kan polypeptidene være glykosylert eller ikke-glykosylert. Polypeptider inkluderer også eventuelt en initial metionin-aminosyrerest (i stilling -1).

Det beskrives også andre produkter, så som polypeptidanaloger av hemoglobinets alfa-, beta- gamma-, delta-, epsilon- og/eller zeta-kjede. Slike analoger inkluderer fragmenter av hemoglobinets alfa-, beta-, gamma-, delta-, epsilon- og/eller zeta-kjede. Ved å følge velkjente prosedyrer kan man lett konstruere og fremstille gener som koder for mikrobiell ekspresjon av polypeptider som har primærsekvenser som adskiller seg fra de som her er angitt når det gjelder identiteten eller plasseringen av én eller flere rester (f.eks. substitusjoner, terminale og intermediære addisjoner og delesjoner). Alternativt kan det lett oppnås modifikasjoner av cDNA og genomiske gener gjennom velkjent stedsrettet mutageneseteknikk, som kan benyttes for å utvikle analoger og derivater av alfa-, beta-, gamma-, delta-, epsilon- eller zeta-kjedene av hemoglobin. Slike produkter har minst én av de biologiske egenskapene til INPROL tilfelles, men kan adskille seg i andre. Som eksempler inkluderer produkter alfa-, beta-, gamma-, delta-, epsilon-eller zeta-kjeder som er forkortet, f.eks. ved delesjoner eller slike som er mer stabile mot hydrolyse (og derfor kan ha mer utpregede eller mer langvarige virkninger enn de naturlig forekommende); eller som er endret gjennom utelatelse eller addisjon av ett eller flere potensielle seter for o-glykosylering og/eller N-glykosylering eller som har utelatt eller erstattet én eller flere cysteinrester med f.eks. alanin- eller serin-rester, og som isoleres lettere i aktiv form fra mikrobielle systemer; eller som kan ha én eller flere tyrosinrester erstattet av fenylalanin, og som binder seg mer eller mindre lett til målproteiner eller til reseptorer på målceller. Med i betraktningen er også polypeptidfragmenter som bare dupliserer en del av den kontinuerlige aminosyresekvens eller sekundære konformasjoner i alfa-, beta-, gamma-, delta-, epsilon- eller zeta-kjedene, hvis fragmenter kan ha en INPROL-egenskap (f.eks. reseptorbinding) og ikke andre (f.eks. stamcelle-inhiberende aktivitet). Det skal bemerkes at aktivitet ikke er nødvendig for at ett bestemt eller flere av produktene skal ha terapeutisk anvendelighet (se Weiland et al., Blut 44:173-5,1982) eller anvendelighet i andre sammenhenger, så som i bestemmelser av inhiberings-faktor-antagonisme. Konkurrerende antagonister er egnet ved overproduksjon av stamcelle-inhibitorer eller deres reseptorer.

Dessuten kan peptider avledet av proteinsekvensen og som bibeholder biologisk aktivitet, syntetiseres kjemisk ved bruk av standardmetoder. Det tilveiebringes sekvenser som koder for peptidanaloger eller derivater av hemoglobin alfa-, beta-, gamma-, delta-, epsilon- og/eller zeta-kjeder som adskiller seg fra naturlig forekommende former med hensyn til identitet eller plassering av én eller flere aminosyrerester (f.eks. delesjonsanaloger inneholdende færre enn de angitte rester; substitusjonsanaloger, hvor én eller flere av de angitte rester er erstattet med andre rester, enten naturlig forekommende eller andre kjente analoger, så som D-aminosyrer; samt addisjonsanaloger hvor én eller flere aminosyrerester er kjemisk modifisert for å øke stabilitet, løselighet og/eller motstandsdyktighet mot proteolyse) og som har enkelte eller samtlige av egenskapene tilfelles med naturlig forekommende former.

Slike peptidsekvenser som er beskrevet ovenfor kan identifiseres på forskjellige måter. Sammenligning av de tredimensjonale strukturene av native hemoglobinkjeder som er aktive ved bestemmelsen (f.eks. alfakjeden) med strukturelt beslektede proteiner som er inaktive (f.eks. myoglobin) kan identifisere regioner som har forskjellige konformasjoner i det tredimensjonale rom og som derfor er kandidatregioner for aktive peptider. Andre måter gjør bruk av selektiv proteolyse, idet proteolytiske enzymer benyttes i begrensede oppslutninger av hemoglobinkjeder som resulterer i peptider som kan separeres, for eksempel ved omvendt-fase HPLC, og deretter analyseres med henblikk på stamcelle-inhibering. Det kan også frembringes peptider gjennom kjemisk syntese (f.eks. fast-fase syntese); en rekke overlappende peptider (f.eks. 15-merer) som omfatter sekvensen for den interessante hemoglobinkjede (f.eks. alfakjeden) kan lett utvikles og testes ved stamcelle-bestemmelser. Det kan utvikles kombinasjonsbibliotek hvor det foretas flere kjemiske synteser og hvor utvalgte aminosyreposisjoner gjøres variable og resulterer i et stort antall peptidanaloger for screening (f.eks. Dooley et al., Peptide Research 8:124-137,1995). Alternativt kan det benyttes rekombinant-metoder. Stedsrettet mutagenese kan benyttes for å identifisere kritiske rester som er nødvendige for aktiviteten av en bestemt hemoglobinkjede. Kjederegioner som er kjent som aktive stamcelle-inhibitorer (f.eks. alfakjede) kan erstattes med regioner fra et beslektet, men inaktivt protein (f.eks. myoglobin) og testes ved stamcelle-bestemmelser som muliggjør identifisering av regioner som er nødvendige for aktivitet. Slike identifiserte regioner kan uttrykkes som peptider og testes med henblikk på aktivitet i stamcelle-cykliseringsbestemmelser.

Homologe eller analoge versjoner av INPROL fra andre arter benyttes for forskjellige veterinære formål i likhet med de ovenfor beskrevne terapeutiske utførelsesformene.

INPROL virker på cykliserende stamceller ved reversibelt å bringe dem i ikke-delende "hvilende" tilstand. Når det er ønskelig å stimulere de hvilende stamcellene til deling, f.eks. etter behandling av en pasient med cancer-kjemoterapi-midler eller bestråling, administreres pasienten kolonistimulerende faktorer og andre hematopoetisk stimulerende midler. Eksempler på slike faktorer innbefatter, men er ikke begrenset til, M-CSF (CSF-1), GM-CSF, G-CSF, megakaryocytt-CSF, trombopoetin, stamcellefaktor eller andre cytokiner, så som IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14 eller erytropoetin.

INPROL-polypeptider eller aktive fragmenter som har stamcelle-inhiberende aktivitet, renses eller syntetiseres ved hjelp av konvensjonelle kjemiske prosesser kombinert med passende bioassay for måling av celleinhiberende aktivitet, som eksemplifisert i de nedenfor beskrevne bestemmelsesmetoder.

I henhold til en utførelsesform, benyttes en terapeutisk effektiv mengde av INPROL-proteinet eller et terapeutisk effektivt fragment derav, i blanding med en farmasøytisk akseptabel bærer. Denne INPROL-blandingen administreres i alminnelighet ved parenteral injeksjon eller infusjon. Valget av subkutan, intravenøs eller intramuskulær injeksjon foretas i henhold til den terapeutiske effekt som ønskes.

Ved systemisk administrering, har den terapeutiske blanding form av en pyrrogenfri, parenteralt akseptabel vandig løsning. Farmasøytisk akseptable sterile proteinløsninger hvor det tas hensyn til pH, isotonitet, stabilitet, bærerproteiner og lignende, vil være kjent for fagmannen.

Oppfinnelsen innbefatter også farmasøytiske blandinger som omfatter terapeutisk effektive mengder av peptidprodukter ifølge oppfinnelsen, sammen med passende fortynningsmidler, konserveringsmidler, solubiliseringsmidler, emulgerings-midler, adjuvanser og/eller bærere, egnet for INPROL-terapi. En "terapeutisk effektiv mengde" viser i denne sammenheng til den mengde som gir en terapeutisk effekt for en gitt tilstand og administrasjonsregime. Slike blandinger er væsker, gel, salver eller lyofiliserte eller på annen måte, tørkede, formuleringer og inkluderer fortynningsmidler av forskjellig bufferinnhold (f.eks. Tris-HCI, acetat, fosfat), pH og ionestyrke, tilsetningsstoffer som albumin eller gelatin for å hindre adsorpsjon til overflater, overflateaktive midler (f.eks. Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, gallesyresalter), solubiliseringsmidler (f.eks. glycerol, polyetylenglykol), antioksydanter (f.eks. askorbinsyre, natriummetabisulfitt), konserveringsmidler (f.eks. Thimerosal, benzylalkohol, parabener), fyllstoffer eller tonisitetsmodifiserende midler (f.eks. laktose, mannitol), kovalent tilkobling av polymerer, så som polyetylenglykol, til proteinet, kompleksering med metallioner eller inkorporering av materialet i eller på partikkelformede preparater av polymere forbindelser så som polymelkesyre, polyglykolsyre, hydrogel, etc, eller i liposomer, niosomer, mikroemulsjoner, miceller, monolamellære eller multilamellære vesikler, biodegraderbare injiserbare mikrokapsler eller mikrokuler, eller proteinmatrikser, "erythrocyte ghosts", sfæroplaster, hudplastere eller andre kjente metoder for frigjøring eller pakking av farmasøytika. Slike blandinger vil påvirke den fysikalske tilstand, løselighet, stabilitet, in wVofrigjøringshastighet og in vivo utskillingshastighet av INPROL. Blandinger for kontrollert eller forsinket frigjøring inkluderer formulering i lipofile depoter (f.eks. fettsyrer, voks, oljer). Oppfinnelsen omfatter også partikkelformede sammen-setninger overtrukket med polymerer (f.eks. poloxamerer eller poloxaminer) og INPROL koblet til antistoffer rettet mot vevsspesifikke reseptorer, ligander eller antigener, eller koblet til ligander av vevsspesifikke reseptorer. Andre utførelsesformer av blandingene ifølge oppfinnelsen innbefatter partikulære former av beskyttende overtrekk, proteaseinhiberende faktorer eller permeasjonsforbedrere for ulike administrasjonsmåler, inklusivt parenteral, pulmonal, nasal, lokal (hud eller mukosa) og peroral. I henhold til en annen utførelsesform administreres den INPROL-holdige blanding lokalt eller via et transdermalt plaster.

I én utførelsesform er blandingene ifølge oppfinnelsen pakket i enhetsdoseform i sterile glass eller ampuller.

Oppfinnelsen omfatter også blandinger som innbefatter én eller flere ytterligere faktorer, så som kjemoterapeutiske midler (f.eks. 5-fluoruracil (5FU), cytosin-arabinosid, cyklofosfamid, cisplatin, karboplatin, doxyrubicin, etopsid, taxol, alkyleringsmidler), antivirale midler (f.eks. AZT, acyklovir), TNF, cytokiner (f.eks. interleukiner), antiproliferative medikamenter, antimetabolitter, samt medikamenter som griper inn i DNA-metabolismen.

Det doseringsregime som inngår i en fremgangsmåte for behandling av vedkommende som står foran eksponering for slike cytotoksiske midler, eller for behandling av hyperprolifererende stamceller, bestemmes av behandlende lege som vil ta i betraktning forskjellige faktorer som modifiserer virkningen av medikamentene; f.eks. pasientens tilstand, kroppsvekt, kjønn og næringsinntak, graden av eventuell infeksjon, administrasjonstidspunktet og andre kliniske faktorer.

Etter pasientens eksponering for det cytotoksiske middel, eller stråle-behandlingen, kan det etter den terapeutiske metode, eventuelt administreres én eller flere lymfokiner, kolonistimulerende faktorer eller andre cytokiner, hematopoetiner, interleukiner eller vekstfaktorer, for generelt å stimulere veksten og delingen av stamceller (og deres etterkommere) inhibert gjennom den forutgående behandling med INPROL. Slike terapeutiske midler som fremmer hematopoese innbefatter IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, Meg-CSF, M-CSF (CSF-1), GM-CSF, G-CSF eller erytropoetin. Doseringene av disse midlene velges ut fra kunnskap oppnådd gjennom deres bruk i kliniske forsøk med henblikk på effektiviteten ved aktivisering av hematopoetisk rekonstituering etter kjemoterapi eller transplantering av hematopoetiske stamceller. Disse doseringene vil måtte justeres for å kompensere for variasjoner i pasientens fysiske tilstand og den mengde og type av kjemoterapeutisk middel eller bestråling som vedkommende er blitt eksponert for. Progresjonen i reverseringen av stamcelle-inhiberingen forårsaket av administrering av INPROL, overvåkes i den behandlede pasient ved hjelp av konvensjonelle metoder.

Ved behandlingen av leukemi er det fordelaktig å administrere både INPROL for å inhibere normal stamcelle-cyklisering, og en stimulator av leukemicellevekst, så som IL-3 eller GM-CSF, samtidig med behandlingen med cytotoksisk medikament eller strålebehandling. Ved hjelp av denne protokoll er det mulig å oppnå de største forskjeller mellom de cykliserende tilstander og medikamentfølsomhet for normale og leukemiske celler.

Eksempel 1: In vivo inhiberingsbestemmelse av stamcelle-proliferasjon

For påvisningen av stamcelle-proliferasjon ble antallet av CFU-S i cellecyklusens S-fase målt ved hjelp av <3>H-thymidin "suicide" metoden (Becker et al., Blood 26:296-308, 1965).

Umodne hematopoetiske progenitorceller--CFU-S (Colony Forming Units in Spleen) - kan påvises in vivo gjennom dannelse av makroskopiske kolonier i milten til letalt bestrålte mus, 8-12 dager etter den intravenøse injeksjon av hematopoetiske celler (Till & McCulloch, 1961).

For standard CFU-S-proliferasjonsbestemmelsen benyttes vanligvis <3>H-thymidin "suicide"-metoden (Becker et al., 1965). Metoden er basert på inkorporering av radioaktivt merket thymidin (<3>H-thymidin), en forløper for DNA, i celler under DNA-syntesen. CFU-S som befinner seg i cyklusens S-fase på undersøkelsestidspunktet, drepes av den høye radioaktiviteten og er derfor ikke i stand til å danne kolonier i milt. Forskjellen mellom antallet av CFU-S dannet ved injeksjon av celleprøven inkubert uten <3>H-thymidin og de samme celler inkubert med <3>H-thymidin viser andelen av prolifererende CFU-S i den opprinnelige prøve.

Inhibitortestingen kan ikke foretas med stamcelle-populasjonen i benmarg fra ustimulerte dyr, idet inhibitoren kun påvirker cykliserende CFU-S som er nede på 7-10% av den totale CFU-S-populasjon i benmargen til normale mus.

For å stimulere CFU-S-proliferasjon ble det benyttet fenylhydrazin (PHZ) eller sub-letal bestråling (Lord, 1976).

Vi har videreutviklet metoden som benytter testosteron-propionat (TSP) på basis av dets stimulerende effekt på CFU-S-cyklisering (Byron et al., Nature, 228:1204, 1970) som forenklet undersøkelsen og ikke forårsaket noen bivirkninger. TSP induserte stimulering av CFU-S-proliferasjon i løpet av 20-24 timer etter injeksjon, og effekten kunne registreres minst 7 dager. Fremgangsmåten benyttet for screening av fraksjonene under rensingen av inhibitoren var som følger: Mus: Stammer av BDFr eller CBFrmus ble benyttet under alle undersøkelser.

Donomnus ble behandlet med en 10 mg/100 g dose av TSP ved intraperitoneal injeksjon av 0,2 mL/mus for å bringe 30-35% av CFU-S over i S-fase. 24 timer senere ble benmargen for cellesuspensjonspreparatet tatt fra lårbenet. Fem til ti millioner celler per ml_ ble deretter inkubert med forskjellige kontroll- og testfraksjoner i 3,5 timer ved 37°C i vannbad, ved bruk av to rør for hver gruppe, et for varmt (radioaktivt) og et for kaldt (ikke-radioaktivt) materiale.

Etter 3,5 timer tilsettes <3>H-thymidin (1 mCi/mL, spesifikk aktivitet 18-

25 Ci/mmol) til hvert varmt rør i et volum på 200 |iL per 1 ml_ cellesuspensjon, mens intet tilsettes til de kalde rør. Inkuberingen fortsettes i ytterligere 30 minutter ved 37°C.

Etter inkuberingen i 30 minutter, avbrytes den drepende reaksjon ved tilsetning av 10 mL kaldt (4°C) medium inneholdende 400 ug/mL ikke-radioaktivt thymidin. Cellene vaskes omhyggelig (3 ganger).

Cellene resuspenderes og fortynnes til ønsket konsentrasjon for injeksjonene, vanligvis 2-4 x 10<4> celler per mus i 0,3-0,5 mL.

Mottagermus, 8-10 per gruppe, bestråles, ikke senere enn 6 timer før injeksjonene.

Milt fra mottagere uttas på dagene 9-12 og fikseres i Tellesnitsky's løsning og koloniene telles visuelt. Prosentandelen av celler i S-fase beregnes ved å benytte formelen:

hvor a angir CFU-S antallet uten <3>H-thymidin

hvor b angir CFU-S antallet med <3>H-thymidin

Av testdatene for INPROL vist i Tabell 1, fremgår det at cykliserende stamceller blir resistente mot virkningen av <3>H-thymidin etter behandling med INPROL. I dette og samtlige etterfølgende eksempler refererer "pINPROL" seg til det rensede protein fra svine-benmarg. Den samme beskyttelse finner man for de S-fase-spesifikke cytotoksiske medikamentene cytosin-arabinosid og hydroksyurea (data ikke vist). Dersom de behandlede stamcellene deretter vaskes med kaldt medium inneholdende ikke-radioaktivt thymidin, prolifererer de overlevende stamceller i musemilt under dannelse av normale kolonier.

Eksempel 2: In vitro bestemmelse av inhibering av stamcelle-proliferasjon

Ved å benytte følgende testsystem (Lord et al., i The Inhibitors of Hematopoiesis s, 227-239,1987), ble den direkte effekt av INPROL vist. Den multilinjefaktor- (IL-3) avhengige stamcellelinje, FDCP mix A4 (A4) ble holdt i IMDM-medium supplert med 20% hesteserum og 10% WEHI-3-kondisjonert medium som kilde for kolonistimulerende IL-3.

En bestemmelse av inkorporering av tritiert thymidin ble benyttet for å måle proliferasjon: A4-celler (5 x 104 i 100 uL. medium med 20% hesteserum og 50% WEHI-3 CM) ble inkubert ved 37°C i 5% C02 i 16 timer.

pINPROL eller den rå BME (fraksjon IV) ble tilsatt i utgangspunktet. Tritiert thymidin ((<3>H-Tdr) 3,7 KBq i 50 pl ved 740 GBq/mmol) ble deretter tilsatt til hver gruppe før ytterligere 3 timers inkubering. Proliferasjonsnivået ble målt ved å høste cellene og beregne prosent inhibering etter formelen:

Inkorporering av tritiert thymidin (<3>H-Tdr) av FDCPmix-A4-celler dyrket i nærvær av graderte doser av normalt benmargekstrakt eller pINPROL, er vist i Figur 6. Av denne fremgår det at den rensede pINPROL-blanding er minst 1000 ganger mer aktiv enn utgangsmaterialet. Eksponeringstiden (16 timer) er en viktig faktor for effektiv inhibering og påviser den direkte effekt av pINPROL på stamceller av A4-cellelinjen.

Eksempel 3: Inhibering av CFU-S-proliferasjon av INPROL injisert in vivo: doser og varighet av effekten

Studier av effekten av INPROL injisert in vivo tilkjennega at INPROL effektivt kan blokkere rekrutteringen av CFU-S til cyklisering, slik at disse cellene beskyttes fra den cytotoksiske effekt av ytterligere behandling, hvilket viser den potensielle kliniske anvendelighet.

Forsøksopplegget hadde to mål: kontrollere effekten av INPROL på CFU-S ved injeksjon in vivo, og definere INPROL-aktivitetens effektive varighet i forhold til cykliserende stamceller.

For å stimulere CFU-S-proliferasjon ble det benyttet injeksjon av testosteron-propionat, basert på den effekt som er nevnt i Eksempel 1.

Mus-BDF1 ble injisert med TSP (10 mg/100g) på Dag 0. Mus fra hver forsøksgruppe (4 mus per gruppe) fikk 24 timer senere en enkelt pINPROL-injeksjon i doser på 0 ug, 5 ug, 10 ug og 15 u.g/mus i.p.

24 timer etter pINPROL-injeksjon ble musene avlivet og prosentandelen cykliserende CFU-S målt med bestemmelsesmetoden beskrevet i Eksempel 1. TSP-injeksjon induserte ca. 50% CFU-S til cyklisering, sammenlignet med 7% i ubehandlede mus. pINPROL i så lave doser som 2 u.g/mus var i stand til å inhibere TSP-indusert proliferasjon ned til normalnivået.

For evaluering av effektens varighet ble en gruppe mus (21 mus per gruppe) injisert kun TSP, mens en annen gruppe ble injisert både TSP og pINPROL (24 timer etter TSP). CFU-S-cykliseringen ble målt hver 24. time i løpet av en uke, ved å ta tre donorer fra hver gruppe og måle CFU-S-cykliseringsstatus i deres benmarg etter den beskrevne metode (se Eksempel 1). Data presentert i Figur 7 viser at mens varigheten av effekten av TSP er minst 7 dager, kan en enkelt injeksjon av INPROL bringe CFU-S til hvile og holde dem ute av cyklisering i maksimalt 48-72 timer. Siden storparten av de kjemoterapeutiske midler som benyttes for cancer- og leukemi-kjemoterapi har en relativt kort halveringstid in vivo, vanligvis mindre enn 24 timer, opprettholdes INPROL-effekten ifølge de oppnådde data, lenger enn den effektive tid som kjemoterapeutiske midler som cytosin-arabinosid eller hydroksyurea, er virksomme i in vivo. Enda viktigere er det at det for kjemoterapeutiske behandlinger og strålebehandlinger som har lengre intervaller (mer enn 24 timer og mindre enn 96 timer) mellom den første behandling (ikke-skadelig for stamcellene) og den andre behandling (skadelig for CFU-S), burde en enkelt injeksjon av INPROL i løpet av intervallene mellom de to anvendelsene av kjemoterapeutisk middel eller strålebehandling, være tilstrekkelig. Ved bruk av flere repeterbare runder av cytotoksisk terapi eller strålebehandling, vil den samme strategi, basert på varigheten av INPROL-effekten, kunne anvendes.

Eksempel 4: De fleste primitive hematopoetiske stamceller stimulert til cyklisering straks etter behandling med 5-FU, beskyttes av INPROL fra den andre 5-FU-eksponering

Medikamentet 5-fluoruracil (5-FU) reduserer drastisk antallet av celler i de myeloide og lymfoide rom. Det ansees vanligvis som cellecyklus-spesifikt, ved hurtig å treffe prolifererende celler, siden inkorporering av nukleotidanalogen i DNA under cellecyklusens S-fase eller tidligere, resulterer i celledød. Den langsiktige overlevelse og immunhematopoetiske rekonstitusjon av benmarg fra mus påvirkes ikke av en enkelt dose av 5-FU. Det ble derimot vist (Harrison et al., Blood 78:1237-1240,1991) at pluripotente hematopoetiske stamceller (PHSC) blir sårbare for en ny dose av 5-FU i en kort periode ca. 3-5 dager etter initialdosen. Det kan forklares ved at PHSC normalt cykliserer for langsomt til at en enkelt dose av 5-FU kan ha virkning, og stimuleres til hurtig cyklisering gjennom stimuli som skyldes den initiale 5-FU-behandling. Vi antar at PHSC ved hjelp av INPROL kan bringes tilbake til en langsom cyklustilstand og således beskyttes fra den andre 5-FU-behandling.

Musene benyttet i disse forsøkene var BDF1-hannmus. En stamløsning av 5-FU (Sigma) ble fremstillet i fysiologisk saltvann i en konsentrasjon på 10 ug/mL. De behandlede mus ble hver gitt 2 mg 5-FU per 10 g kroppsvekt via en halevene på forsøkets Dag 0. 24 timer senere ble musene gitt pINPROL (10 ug/100 g kroppsvekt) intraperitonealt og på Dag 3 injisert den andre dose 5-FU. Overlevelses-undersøkelsen ble foretatt ved å følge med i antall døde mus i forsøks- (behandling med pINPROL) og kontroll-grupper, hver på 30 mus. Overlevelseskurvene er vist i

Figur 8.

Eksempel 5: Virkninger av preinkubering med INPROL i forhold til MIP-1 a i benmargceller

Formålet med dette forsøk var å sammenligne de inhiberende virkninger av preinkubering med pINPROL og MIP-1 a på muse-benmargceller in vitro.

Følgende fremgangsmåte ble benyttet:

in vivo: BDF1 mus, 6-15 uker gamle, ble injisert 200 mg/kg 5-FU i.p. 48 timer etter uttak av marg fra lårben;

in vitro: en samlet enkeltcellesuspensjon telles og 5 x 10<6> celler inkuberes i totalt 2 mL med eller uten pINPROL eller MIP-1 a, med 5% hesteserum, IMDM-medium med tilsatt L-glutamin, ved 37°C under 5% CO2 i 4 timer. Cellene vaskes deretter to ganger og telles på nytt. De utplates på metylcellulose under følgende sluttbetingelser:

0,8% metylcellulose

25% hesteserum

20 ng/mL rekombinant murint IL3

L-glutamin tilsatt

5 x 10<5> celler per mL

IMDM medium

Platene ble inkubert i 11 dager ved 37°C under 5% C02 og 100% fuktighet. Kolonier på mer enn 50 celler ble tellet.

Eksempel 6: INPROL inhiberer HPP-CFC proliferasjon

En in vitro analyse for bestemmelse av murine rekonstituerende stamceller og tidlige forløpere, er HPP-PFC-(high proliferative potential colony) bestemmelse; andre lignende bestemmelser, CFU-A, CFU-GM, CFU-E og CFU-GEMM, påviser progressivt begrensede progenitorpopulasjoner (M. Moore, Blood 177:2122-2128, 1991). Dette eksempel viser at forbehandling av celler med pINPROL inhiberer deres proliferasjon, mens MIP-1 a svikter i så henseende under disse forsøksbetingelsene.

BDF1 mus ble behandlet med 5-fluoruracil (200 mg/kg i.p.) før HPP-CFC-antallet i deres benmarg ble bestemt. Cellene ble vasket ved sentrifugering og inkubert i tettheter på 10<6> til 5 x 10<6>/mL i medium som ikke var tilsatt noe middel (Kontroller), tilsatt pINPROL (25 ng/mL) eller MIP-1 a (200 ng/mL) i 4 timer. Etter inkubering ble cellene vasket og utplatet i agar (0,3%) med 30% FCS og kombinert kondisjonert medium fra 5637- og WEHI-3B cellelinjer (7,5% av hvert kondisjonert medium, som anbefalt av Sharp et al., 1991). Utplatingskonsentrasjonen var 5 x 10<4 >celler/mL i 60 mm skåler. Koloniene ble vurdert på Dag 14 og resultatene er angitt nedenfor.

Ifølge disse resultatene inhiberte ikke MIP-1 a proliferasjon av de fleste umodne forløpere når disse kun var tilstede under preinkuberingsperioden. pINPROL inhiberte effektivt proliferasjon under disse betingelsene, hvilket tyder på fundamentale forskjeller mellom pINPROL og MIP-1 a med hensyn til biologisk aktivitet.

Eksempel 7: Effekt av INPROL-terapi på restitueringen etter bestrål ingsindusert benmargsaplasi

Benmargsaplasi er den primært begrensende toksisitet ved strålebehandling av cancer. Det har vært vist at enkelte vekstfaktorer (f.eks. G-CSF, GM-CSF, erytropoetin) kan påskynde restitusjon fra bestrålingsindusert benmargsaplasi. Beskyttelseskonseptet ved bruk av en inhibitor av stamcelle-proliferasjon utgjør en annen og kompletterende måte å håndtere hematologisk skade på. For å følge den tidligere utviklede behandlingsmetode (Eksemplene 3 og 4) ble det på mus etablert en modell for letal bestråling. Det er på dette felt kjent at mus som får 9Gy av kobolt 60, begynner å dø etter 10-14 dager, og på Dag 30 nærmer mortaliteten seg 50%. Denne letaldose ble benyttet i vår modell ved å dele den på to påfølgende påføringer, hver på 4,5Gy, med et intervall på 3 dager mellom dosene. Foreløpige data viste at overlevelseskurven for denne modell var meget nær den for en enkelt bestråling med 9Gy. I tillegg viste testen på CFU-S-proliferasjon at 35-50% CFU-S induseres til proliferering 24 timer etter den første bestråling. Slike celler kan benyttes av en stamcelle-inhibitor gitt før den andre dosen. For å undersøke denne mulighet fikk mus (50 mus/gruppe) 4,5Gy på Dag 0. 24 timer senere fikk 1 gruppe pINPROL (2 |ig/mus i.p.), mens kontrollgruppen fikk injisert saltvann. Den andre bestrålingsdosen (4,5Gy) ble gitt på dag 3.

Fig. 9 viser den økede overlevelse etter en enkelt dose pINPROL. Betingelsene for denne modell er klinisk relevante for behandling av en hvilken som helst cancer, inklusivt de som kjennetegnes ved solide svulster. Slik behandling vil kunne administreres til en kreftpasient ved å gi en effektiv dose INPROL mellom to påfølgende bestrålingsdoser, hvilket muliggjør anvendelse av større stråledoser for kreftbehandlingen. Det burde også være mulig å tilpasse denne modalitet til kjemoterapeutiske midler.

Eksempel 8: Anvendelse av INPROL for autolog benmargtransplantasjon

Benmargtransplantasjon er den eneste kjente kurative terapi for flere leukemityper (CML, AML med flere). Ex vivo kondisjonering av autologt BMT for infusjon skulle kunne gjøre autologe kilder av normale stamceller fri for leukemisk kontaminering og i stand til å repopulere mottagerens hematopoetiske system, slik at aggressiv og effektiv terapi kan benyttes. 1. Langstids benmargkultur L1210 leukemimodell for studiet av effekten av INPROL for å opprettholde normal hematopoese under rensing med AraC.

LTBMC (Long Term Bone Marrow Cultures) ble opprettet i henhold til Toksoz et al., Blood, 55:931-936,1980) og leukemicellelinjen L1210 tilpasset LTBMC ved kokultivering i 2 uker. Det inntrådte samtidig vekst av normale og leukemiske progenitorceller i disse kombinerte LTBMC/L1210-kulturene, tilsvarende situasjonen i benmargen til en leukemipasient. Det var mulig å skjelne mellom normale CFU (colony forming units) og leukemiske CFU ved å dyrke dem som agarkolonier med eller uten nærvær av det kondisjonerte medium fra WEHI-3 (en murin IL-3-produserende cellelinje). I normale celler skjer det apoptose ved fravær av IL-3, mens leukemiceller kan danne kolonier når IL-3 mangler. Suspensjonsceller fra LTBMC-L1210-blanding gir ca. 150 kolonier i nærvær av IL-3 (normale hematopoetiske kloner) og 70 kolonier ved dyrkning uten IL-3 (leukemiske kloner) per 50.000 utplatede celler.

Renseprosessen ble foretatt som følger: på Dag 0 ble alle suspensjonsceller og medier (10 mL/kolbe) uttatt fra kolbene med LTBMC-L1210 og erstattet med 2 mL medium inneholdende 200 ug cytosin-arabinosid (AraC) (Tsyrlova et al., i Leukemia: Advances in Biology and Therapy, v. 35,1988); hvoretter kolbene etter inkubering i 20 timer, ble vasket ut og erstattet med 2 mL friskt medium (kontrollgruppe) eller medium inneholdende 25 ng/mL pINPROL, i 4 timer. Etter denne preinkubering ble cellene inkubert på nytt med 100 ug/kolbe AraC i 3 timer ved 37°C. Hver gruppe omfattet 4 kolber. LTBMC-L1210-kulturer ble vasket tre ganger og erstattet med friskt LTBC-medium hvoretter de ble opprettholdt som tidligere for regenereringsundersøkelser i 3-4 uker.

Data er presentert i Fig. 10. Det kunne ikke observeres cellevekst i kontrollkulturer behandlet kun med AraC, mens i kolber beskyttet med INPROL skjedde hematopoese-regenerering betydelig hurtigere som følge av proliferasjon av progenitorceller fra det adhererende lag. Ved utplating i agar vokste dessuten cellene fra forsøksgruppen bare i nærvær av IL-3 og ga ca. 100 CFU per 50.000 celler, mens det ikke ble observert vekst av leukemiske celler, i hvert fall ikke i løpet av 4 uker. Marg behandlet ex vivo med en effektiv dose av AraC i kombinasjon med INPROL kan således renses for kreftceller, mens stamcellene beskyttes. Det burde være mulig å benytte denne modalitet på andre former av kjemoterapi eller strålebehandlinger.

2. MRA (Marrow Repopulating Ability) og 30 dagers strålingsbeskyttelse økes gjennom INPROL-behandling in vitro

MRA, cellers evne til å repopulere benmargen til letalt bestrålte mus, sammen med evnen til å gi strålingsbeskyttelse i 30 dager, er en direkte in vivo måling av evnen til å redde myelosupprimerte dyr (Visser et al., Blood Cells 14:369-384,1988).

For undersøkelser av strålebeskyttelse ble BDF1 -mus bestrålt med 9,5Gy og restituert ved transplantasjon av benmarg fra testosteron-stimulerte donorer. En mottagergruppe ble restituert med benmargceller preinkubert i 4 timer med medium (kontroller - gruppe A) og en annen (gruppe B) med 25 ng/mL pINPROL. Celler i begge grupper ble vasket og 30.000 celler per mus transplantert inn i bestrålte dyr. Overlevelsesdataene er vist (Fig. 11). Summen av tre forsøk er gjengitt, med kontroller normalisert til 100%. pINPROL-inkubering øket overlevelsen hos mus fra 36,5% i kontrollgruppen opp til 61,8% på Dag 30.

Økningen av MRA indusert ved preinkubering med INPROL kunne være en av mekanismene ved forbedring av strålebeskyttelsen. For å undersøke denne hypotese ble MRA målt i henhold til Visser et al., (op. eit.). I korthet ble donor-BDF1-mus forbehandlet med testosteron, benmargen fra disse preinkubert med medium eller pINPROL i 4 timer og injisert i bestrålte dyr. På Dag 13 ble benmargceller fra lårben fra mottagermus utplatet i agar i tre forskjellige konsentrasjoner (0,01,0,05, 0,1 lårben-ekvivalent) i nærvær av 20% hesteserum og 10% WEHI-CM. Antallet av Dag 7-kolonier representerte MRA i den utstrekning de kolonidannende celler i benmarg fra mottagere på dette tidspunkt var progenitorcellene for donorens umodne stamceller.

Som det fremgår av Fig. 12 er MRA av cellepopulasjonen preinkubert med INPROL, større enn i kontrollgruppen (B).

Eksempel 9: Antihyperproliferativ effekt av INPROL på stamceller kan endre deres differensierings-abnormiteter

Hyperproliferasjon av CFU-S sees ikke bare under restitusjon fra cytotoksiske medikamenter eller bestråling, men også som konsekvens av normal aldring og antas å være et vesentlig trekk ved myelodysplastisk syndrom (MDS). Den ledsages av differensieringsforstyrrelser så som en utbredelse av den erytroide differensiering, mens differensieringen via den granulocytiske vei er redusert.

Benmargceller ble inkubert i 4 timer ved 37°C med 25 ng/mL pINPROL eller medium (kontroll), vasket og deretter utplatet på agar med 20% hesteserum, 2 U/mL erytropoetin og 10% WEHI-CM. Antallet av BFU-E og GM-CFU-kolonier ble avlest på Dag 7. Data vist i Tabell 4 er sammenfattet fra tre forsøk - fire dyr per punkt ble benyttet for hver gruppe; fire skåler ble utplatet.

Som det klart fremgår fra Tabell 4 endret ikke inkuberingen av normal benmarg (NBM) fra intakte unge dyr (BDF1 8-12 uker gamle) med INPROL antallet eller andelen av ulike kolonityper. BDF1 donorer behandlet med testosteron-propionat (TSP) oppviste den samme økning i CFU-S-proliferasjon som registrert tidligere (Eksempel 1, 3, 4), en svak økning i antallet erytroide progenitorceller (BFU-E kolonier) og en nedgang i GM-CFU, som ble fullstedig opphevet gjennom inkuberingen med INPROL. I tillegg falt det abnormt høye nivå av CFU-S-proliferasjon tilbake til 10% av CFU-S i cellecyklusens S-fase. CFU-S hyperproliferasjon er kjent å utgjøre et trekk ved enkelte musestammer som er følsomme for viral leukemi-induksjon, for eksempel Balb/c-mus (Tabell 4), og kan også iakttas i eldre dyr (Tabell 4). Den samme omfordeling av engasjerte progenitorceller som sees i TSP-behandlede BDF1-mus, registreres i Balb/c og i eldre (23-25 måneder gamle) BDF1 som har det abnormt høye nivå av CFU-S-proliferasjon tilfelles. Korrigeringen av både proliferasjonen av CFU-S og differensieringen ble indusert gjennom inkuberingen med INPROL. Hva som er enda mer klinisk relevant er at undersøkelsen viste at in vivo injeksjonen av INPROL

(2 ug/mus) påvirket både proliferasjon av CFU-S og forholdet mellom erytroide (BFU-E) og GM-kolonier (Tabell 4).

Eksempel 10: Immunstimulerende virkning av INPROL

Det har vært iakttatt at inkuberingen av benmargceller som inneholder en høy andel prolifererende CFU-S, med INPROL ikke bare endrer cykliseringen av CFU-S, men også deres differensiering, ved å endre den dominerende erytroid-differensiering i favør av granulocytiske og lymfoide progenitorceller. Denne egenskap ved INPROL er viktig som følge av immunsuppresjons-bivirkningene av cytotoksisk kjemoterapi eller strålebehandling, så vel som den immunsuppresjon som ledsager hyperproliferative stamcelleforstyrrelser og aldring.

Eksemplet viser den direkte virkning av INPROL på differensieringen av umodne forløpere fra LLTC (Lymphoid Long Term Culture) etablert i henhold til Wittlock & Witte (Ann. Rev. Immun. 3:213-35,1985) til pre-B-progenitorceller, målt gjennom dannelsen av kolonier i metylcellulose inneholdende IL-7.

LLTC ble etablert som beskrevet og foret med friskt LLTC-medium (Terry Fox Labs. Vancouver, Canada) to ganger per uke. Ikke-adhererende celler ble høstet en gang per uke, vasket fritt for faktorer og inkubert i 4 timer med 25 ng/mL pINPROL eller kun med medium, for kontroll. Etter inkuberingen ble cellene vasket og utplatet i en konsentrasjon på 10<5> celler/mL i metylcellulose inneholdende 30% FCS og 10 ng/mL IL-7. Data fra tre uker er vist i Figur 13. Antallet av store pre-B-kolonier. varierte i kontroller, økende med tiden, men preinkubering med INPROL stimulerte alltid veksten av kolonier 4 til 8 ganger over kontrollnivået. Dette viser en immunstimulerende egenskap ved INPROL som kan benyttes ved korrigering av immunsvikt-tilstander og til å forbedre ønskede immunresponser, f.eks. ved vaksinasjon.

Eksempel 11: INPROL forbedrer repopulasjonsevnen til stamceller - LTC-IC (Long Term Culture Initiating Cells) fra pasienter med CML

Kronisk myelogen leukemi (CML) er en dødelig malign sykdom i hematopoetiske stamceller. Behandling av CML i den kroniske fase med et enkelt kjemoterapeutikum, ved kombinasjons-kjemoterapi, splenektomi eller miltbestråling, kan kontrollere kliniske tegn og symptomer, men forlenger ikke levetiden vesentlig. Når CML utvikler seg fra den kroniske til den aksellererte tilstand, er standardterapi ikke effektiv. I dag er benmargtransplantasjon (BMT) den eneste kjente CML-terapi. Terapi med ubeslektet donor-BMT er vanskelig som følge av histokompatibilitets-problemer. Færre enn 40% av de ellers passende CML-pasienter vil ha en hensiktsmessig tilpasset, beslektet donor, og derfor foretrekkes autolog transplantasjon. Ex vivo kondisjonering av autolog BMT for infusjon, sammen med muligheten for å velge ikke-leukemiske (Ph-negative) myeloide progenitorceller fra Ph-positive pasienter, og som vokser i LTC (Long Term Culture) utgjør et potensiale for autologe kilder av normale stamceller som kan gi aggressiv og effektiv CML-terapi.

I sammenheng med BMT kan en hematopoetisk stamcelle defineres som en celle som har evne til å utvikle modne blodceller over lengre tidsrom. Vi har benyttet det humane LTC-system utviklet av C. Eaves & A. Eaves både for å kvantifisere stamcelleantall og som hjelpemiddel for å håndtere disse for terapeutisk anvendelse. Dette innebærer at celler utsås på et pre-etablert, bestrålt adhererende lag av human marg, hvoretter disse kulturene opprettholdes i 5 uker. Sluttpunktet er det totale klonogene celleinnhold (adherente + ikke-adherente) av kulturene høstet på slutten av dette tidspunkt. Klonogen celleproduksjon under disse betingelsene er lineært relatert til antall opprinnelig tilsatte progenitorceller (LTC-IC Long Term Culture Initiating Cells)); idet den gjennomsnittlige produksjon fra individuelle humane LTC-IC er fire klonogene progenitorceller per LTC-IC. Det har tidligere vært vist at når benmarg fra pasienter med CML anbringes under lignende betingelser, avtar leukemiske (Ph-positive) klonogene celler hurtig. Ved å benytte kvantifisering av gjenværende normale LTC-IC i pasienter med CML, er det mulig å velge ut de som sannsynligvis vil har fordel av intensiv terapi understøttet ved transplantasjon av dyrkede autotransplantater (Phillips et al., Bone Marrow Transplantation 8:477-487, 1991).

Følgende fremgangsmåte ble benyttet for å undersøke effekten av INPROL på antallet klonogene celler (LTC-IC) blant benmargstransplantatceller etablert fra det perifere blod til en pasient med CML.

Kulturer ble initiert som langstidskulturer på forutgående bestrålt stroma. Periferblodet fra en frisk donor ble benyttet som kontroll. Perifere blodlegemer fra en CML-pasient ble preinkubert med eller uten pINPROL (25 ng/mL) i 4 timer, vasket og anbragt i LTC-IC-systemet i 5 uker for å bestemme kontrollantallet LTC-IC. For forsøkene ble andre parallelle kulturer etablert i 10 dager. Blandingen av adherente og ikke-adherente celler fra kulturer dyrket i 10 dager, ble preinkubert med eller uten pINPROL og anbragt på tidligere etablerte leeders" i ytterligere 8 uker. Antallet LTC-IC fra hver forsøkskultur ble anslått ved å utplate både adherente og ikke-adherente celler i metylcellulose med passende vekstfaktorer (Terry Fox Laboratories, Vancouver, Canada) og telle det resulterende totalantall av kolonidannende celler. De LTC-IC-verdier som ble oppnådd ved å benytte denne fremgangsmåte, skrev seg fra bestemmelse av det totale klonogene celle- (CFC) innhold ved å benytte formelen:

Data presentert i Figur 14 viser at det ikke var noe tap av LTC-IC i løpet av de første 10 dagers dyrkning med utgangspunkt i den friske donors benmarg, og at ca. 30% av antallet innsatt LTC-IC fremdeles forekom etter 5 ukers dyrkning. CML-pasientens LTC-IC-antall ble redusert drastisk til ca. 8% i løpet av 10 dagers perioden og tok seg ikke opp under videre inkubering, mens preinkubering av celler med INPROL øket LTC-IC-nivået til 30% av det opprinnelige antall og opprettholdt dette i 8 uker.

Klinisk relevante anvendelser av INPROL som kan forutsis ut fra disse foreløpige data, inkluderer deres bruk ved stategier for selektivt å forbedre det normale stamcelle-innhold i friske eller dyrkede margtransplantater, strategier for å øke rekrutteringen av gjenværende normale stamceller in vivo, samt protokoller for overføring av nytt genetisk materiale inn i stamceller i human marg for senere transplantering i pasienter.

Eksempel 12A: Fremgangsmåte for isolering av immunaktiv inhibitor av proliferasjon av stamceller fra benmargpreparater

Benmargen ble isolert fra svine-ribben. Ribben fra svineskrotter ble fraskilt og befridd for muskelfibre og fett og deretter kuttet i biter, hvorpå benmargen ble trukket ut med en hydraulisk presse fremstillet av Biophyzpribor. Benmargcellene ble fraskilt ved sentrifugering i en K-70 sentrifuge ved 2000 rpm. i 20 minutter. Ekstrakt-supematanten ble deretter suksessivt ultrafiltrert gjennom Amicon USA membranene XM-100, PM30, PM-50. Ifølge analyse ved elektroforese er hovedkomponenten av produktet albumin (se Fig. 1).

Biokjemisk rensing

Benmargekstraktet og proteinkomponentene av fraksjonene ble på hvert rensetrinn analysert ved gelelektroforese i 10% polyakrylamid, inneholdende 0,1% natriumdodekylsulfat. Opp til 7% natriumdodekylsulfat og opp til 0,5-1 % merkaptoetanol ble tilsatt til prøvene som så ble inkubert i 5 minutter ved 70°C før anbringelse på gelen.

Elektroforesen ble foretatt ved 20Y cm av gelen i 5 timer. Gelen ble deretter farvet i 0,25% Coomassie CBBC250 i en blanding av etanol:vann:eddiksyre 5:5:1 i 1 time ved 20°C og vasket flere ganger med 7% eddiksyre. Aktiviteten av produktet ble evaluert ved hjelp av en metode for inhibering av proliferasjon av hematopoetiske stamceller (CFU-S). Metoden er mer utførlig beskrevet nedenfor.

Trinn 1: Rensing ved utfelling med ammoniumsulfat

Aktiviteten ble renset ved utfelling med ammoniumsulfat ved 25% med metning av 40 til 80% som bie valgt på grunnlag av resultatene i Tabell 5.

Den preparatmengde som ble benyttet for testing etter hvert rensetrinn, ble bestemt i henhold til rensenivået og tilsvarende dosen på 2 x 10'2 mg av det opprinnelige produkt. Aktiviteten ble bestemt ved hjelp av formelen:

hvor %Sa er %S i kontroll

%Sb er % S etter inkubering med testfraksjonen.

Fraksjonen ble avsaltet for å senke ammoniumsulfatkonsentrasjonen 20 ganger før hver aktivitetstesting og før hvert påfølgende rensetrinn.

Trinn 2. Den urene inhibitoren fra Trinn 1 påsettes etter avsalting og fraksjoneres ved å benytte ionebytterkromatografi, her DEAE23 cellulose, og elueres deretter med en gradient av natriumacetat-buffer (pH 6,0).

De virksomme inhibitorfraksjonene elueres mellom 3-5 mM.

Kolonnevolumet var 1 mL og elueringshastigheten 4 mL/time. Detekteringen ble foretatt ved hjelp av kromatografen Miilicrome ved 230 og 280 nm. Fraksjon 1 (se

Fig. 2) som oppviste høyest aktivitet, ble isolert og eluert i 5 mM natriumacetat-buffer (se Tabell 6).

Elektroforese-dataene tyder på at hoved-proteinkontaminanten - albumin (se

Fig. 3) er fjernet fra denne fraksjon, hvilket fører til en ytterligere fire gangers rensing.

Trinn 3. Den delvis rensede inibitor fra Trinn 2 påføres direkte på en G-75 Sephadex-kolonne.

Kolonnevolumet er 20 mL (20 X 1), elueringshastigheten 2 mL/time. Elueringsbufferen er 5 mM NaCI, 10 mM Tris-HCI, pH 7,5. Påvisning ble foretatt på en Millicrome-kromatograf ved 230 og 280 nm. Fraksjon 5 som hadde høyest aktivitet, ble isolert.

Trinn 4. Omvendt-fase kromatografi (Pharmacia FPLC System) under anvendelse av Pro-REC-kolonner foretas på en Ultrasfera matriks. Protein elueres ved bruk av 0,1% trifluoreddiksyre i en acetonitrilgradient.

Homogeniteten av et produkt med molekylvekt 16-17 kD er 90%, hvilket fremgår av analyse av akrylamid/natriumdodekylsulfat-gelen (se Fig. 6). Resultatet er vist i Fig. 4. Aktiviteten er bestemt på fraksjon 5. Sluttutbyttet av produktet er 5%. Som resultat utgjør den totale proteinmengde med molekylvekt 16 kD etter rensingen, 650 ng/mL av det opprinnelige produkt. Under renseprosessen ble produktet utsatt for varmeinkubering ved 70°C i flere minutter, men det ble ikke påvist noe tap av biologisk aktivitet.

Eksempel 12B: Alternativ metode for isolering av større mengder INPROL Første-isolering

Ribben fra ferske svineskrotter befris for muskelfibre og fett, kuttes deretter i strykker og bløtes i fosfatbuffret saltvann i forholdet 1:1 (vekt/volum). Den oppnådde blanding knuses med hydraulisk presse for å skille benmarg fra fast benmateriale.

Suspensjonen av benmargceller samles og faste partikler frafUtreres gjennom fire lag osteklede. Filtratet inkuberes ved 56°C i 40 minutter og avkjøles deretter i et isbad til 4°C. Det resulterende bunnfall fjernes ved sentrifugering ved 10.000 g i 30 minutter ved 4°C og kasseres.

Den klarnede supernatant tilsettes i løpet av 30 minutter dråpevis til 10 volumer om rørt iskald aceton inneholdende 1 vol% konsentrert saltsyre. Den resulterende blanding holdes ved 4°C i 16 timer for fullstendig presipitatdannelse. Presipitatet utskilles ved sentrifugering ved 20.000 g i 30 minutter ved 4°C. Denne pellet vaskes med kald aceton og tørkes.

HPLC-rensing

Pelletert løses i HPLC-eluentbuffer A inneholdende 5% acetonitril (MeCN) og 0,1% trifluoreddiksyre (TFA) til en endelig proteinkonsentrasjon på 8-10 mg/mL. Denne løsningen (0,5-0,6 mL) avsettes på en 250 x 4,6 mm HPLC-kolonne pakket med Polisil ODS-300 (10 u) og likevektsinnstilles med den samme buffer A.

Elueringen foretas med en gradient av buffer B (90% MeCN, 0,1% TFA) i buffer A med en strømningshastighet på 1 mL/min. i henhold til følgende program:

Et ytterligere trinn med 100% B i 5 minutter benyttes for å vaske kolonnen før re-ekvilibrering. Deretter ekvilibreres kolonnen på nytt for å bringe den tilbake til den opprinnelig tilstand, hvorpå neste porsjon av proteinløsningen kan påsettes. Et typisk kromatogram er vist i Fig. 5.

Under separeringen overvåkes kolonneutløpet ved 290 nm for påvisning av proteintopper. Fraksjoner som inneholder proteinmaterialet oppsamles, separerte topper samles og rotasjonsinndampes til tørrhet ved 30°C. Det oppnådde residuum løses i destillert vann og bestemmes ved en bioaktivitetstest og ved SDS-PAGE (14% gel, reduserende betingelser). Toppen som inneholder det aktive materialet, elueres mellom 70 og 80% av buffer B og inneholder protein-hovedbåndet på 16 kD og ifølge SDS-PAGE, spor av hurtigere vandrende proteiner.

En analyse av materialet oppnådd ved kun å samle den andre hoved-HPLC-topp er vist i Figur 15 (A og C). Materialet som inneholder begge toppene (f.eks.

Fig. 5) vil her bli omtalt som pINPROL-preparat 1 og de som kun består av den andre topp vil bli omtalt som pINPROL-preparat 2. 500 ug av dette aktive, rensede pINPROL-preparat 2 ble avsatt på en C4 omvendt-fase kolonne (Vydac) og eluert under bruk av en lineær gradient av 595% acetonitril i 0,1% trifluoreddiksyre. Materialet eluerte som en enkelt topp ved 53% acetonitril (Fig. 15A). Når 250 ug MIP-1 a (R&D Systems) ble kjørt under identiske betingelser, eluertes det ved 43,9% acetonitril (Fig. 15B - det skal bemerkes at tidligere topper, før 14% acetonitril, skyldes forurensninger og luftbobler i detektoren). Naturlig forekommende INPROL er således vesentlig mer hydrofobt enn MIP-1 a under disse betingelsene. Det er kjent at TGFB elueres i lavere konsentrasjoner enn observert for pINPROL under disse betingelsene (Miyazono et al., J. Biol. Chem. 263:6407-15,1988).

En gel av det eluerte pINPROL-materialet er vist i Figur 15C. Bane 1 er råmaterialet, Bane 2 er molekylvektmarkører og Bane 3 er det rensede materialet. Det forekommer to hovedbånd, et ved ca. 14 kD og et ved ca. 35 kD. Det antas at 35 kD-båndet er en multimer form av 14 kD-båndet.

Eksempel 13A: Aktive INPROL-preparater inneholder hemoglobin betakjede

pINPROL ble fremstillet som vist i Fig. 5 (dvs. pINPROL-preparat 1 (se Eksempel 12B)). Materialet ble kjørt på SDS-PAGE og overført til nitrocellulose ved bruk av standardteknikk. Materialet ble underkastet N-terminal sekvensanalyse ved å benytte en ABI 477A protein-sekvenseringsmaskin med 120A Online PTH-AA analyzer ved bruk av standardteknikk. Følgende N-terminale sekvens ble funnet:

VHLSAEEKEAVLGLWGKVNVDEV....

Datasøk i protein-databaser viste at denne sekvens er identisk med den N-terminale sekvens av betakjede av svinehemoglobin (konf. Fig. 16C).

Eksempel 13B: Aktive INPROL-preparater inneholder hemoglobin alfakjede

Som vist i Fig. 15C, resulterte protein som var renset ved å oppsamle den andre hovedtopp vist i Fig. 5 (dvs. pINPROL-preparat 2) i to hovedbånd som tilsvarte molekylvekter på ca. 15K og 30K, samt flere mindre bånd. SDS-PAGE-gel ble overført til nitrocellulose ved å benytte standardteknikk og de enkelte bånd ble snittet ut og underkastet N-terminal sekvensanalyse som i Eksempel 13A. Følgende N-terminale sekvens for 15 kD-båndet ble funnet.

VLSAADKANVKAAWGKVGGQ

30 kD-båndet ble underkastet en begrenset proteolytisk oppslutning, hvorved følgende indre sekvens ble funnet: <*> FPHFNLSHGSDQVK.... ;Den første sekvens oppviser identitet med den N-terminale sekvens av svinehemoglobin-alfakjeden, mens den andre sekvens viser identitet med restene 43-56 av svinehemoglobin-alfakjeden (se Fig. 16C angående sekvens-sammenligning av alfa- og beta-hemoglobinkjeder fra menneske, mus og svin). Gjentatt sekvensering av disse bånd så vel som av enkelte av de mindre bånd, ga konsekvent deler av alfa-globinsekvensen. De forskjellige bånd observert i Fig. 15C representerer enten fragmenter eller aggregater av svinehemoglobin-alfakjeden. ;Eksempel 13C: Videre karakterisering av svine-INPROL ;For ytterligere å sammenligne pINPROL med svinehemoglobin ble to ganger krystallisert svinehemoglobin anskaffet fra Sigma Chemical Company og underkastet omvendt-fase HPLC, som beskrevet for Figur 15 i Eksempel 12B. Som det fremgår av Figur 17 tilsvarer HPLC-kromatogrammet av intakt hemoglobin det som sees for pINPROL-preparat 1. Ved en direkte sammenligning ser man at pINPROL-preparat 2, vist i Fig. 17A (dvs. avledet fra den andre topp i Fig. 5) overlapper med det for de andre to toppene av svinehemoglobin (Fig. 17B) med retensjonstider på henholdsvis 52,51 og 52,25 minutter for hovedtoppene. Det skal bemerkes at hem migrerer sammen med den første hovedtopp i hemoglobin, i dette tilfelle ved 49,153 minutter, og hem er derfor en komponent av pINPROL-preparat 1, men ikke av preparat 2. Dette bekreftes gjennom manglende absorpsjon av dette pINPROL-preparat ved 575 nm, en bølgelengde som er diagnostisk for nærværet av hem. ;De forventede molekylvekter av hemoglobin-alfa- og betakjedene fra svin er henholdsvis 15038 dalton og 16034 dalton. Som det fremgår av SDS-PAGE-kromatogrammet i Figur 18, er de første to toppene sammensatt av kjeden med høyere molekylvekt og de andre to av kjeden med lavere molekylvekt. De to første toppene synes således å representere hemoglobin-betakjeden og de andre to toppene å representere hemoglobin-alfakjeden. ;Ytterligere separasjoner av svinehemoglobin ble foretatt ved å benytte en mindre bratt elueringsgradient (Fig. 21). N-terminale analyser av disse toppene viste at den første toppen er alfakjeden og den andre betakjeden av svinehemoglobin. Resultater av bioassay bekrefter at begge isolerte hemoglobin-kjeder er biologisk aktive (Eksempel 14 og 15). ;For ytterligere å sammenligne pINPROL-preparat 2 og hemoglobin-betakjeden ble det foretatt todimensjonal elektroforese (Fig. 19). Som første dimensjon ble isoelektrisk fokusering foretatt i glassrør ved å benytte 2% pH 4-8 amfoliner i 9600 volt-timer. Tropomyosin (molv. 33 kD, pl 5,2) ble benyttet som intern standard og posisjonen for dette er på den endelige todimensjonale gel markert med en pil. Gelen i røret ble ekvilibrert i buffer og forseglet til toppen av en "stacking gel" på toppen av en 12,5% akrylamid-"slab"-gel. SDS-"slab"-gelelektroforese ble foretatt i 4 timer ved 12,5 mA/gel. Gelene ble sølvfarvet og tørket. ;En sammenligning av de todimensjonale elektroforetiske mønsterne viste kun én eller to mindre flekker som var forskjellig mellom HPLC-renset hemoglobin-betakjede og pINPROL-preparat 2. Western-analyse under bruk av anti-svinehemoglobin antistoff og enten éndimensjonal eller todimensjonal elektroforese, bekrefter nærværet av betahemoglobin i preparatet. Det aktive pINPROL-preperat 2, fremstillet i henhold til Eksempel 12B, er således i det vesentlige svinehemoglobin-betakjede. ;Eksempel 14: Hemoglobin-alfakjede, hemoglobin-betakjede eller intakt hemoglobin oppviser stamcelle-inhiberende aktivitet ;For å bekrefte at hemoglobin-betakjede har INPROL-aktivitet ble det foretatt en suicid-bestemmelse under bruk av benmarg fra testosteron-behandlede mus under bruk av den metodikk som er beskrevet i Eksempel 1, på materialet renset som i Eksempel 12B. Som vist i Tabell 8 ble det drept 15% av normale benmargceller fra mus i motsetning til 36% i testosteron-behandlede dyr. Som ventet indikerte dette at testosteron-behanding øker prosentdelen av celler i cyklus (hvilket gjør dem mer utsatt for død - f.eks. Eksempel 1). I sterk kontrast til dette oppviste celler fra testosteron-behandlede dyr inkubert med 40 ng/mL av enten pINPROL eller av renset hemoglobin-betakjede, en dramatisk nedgang i prosentandelen celler i cyklus fra 36% til henholdsvis 0% og 7%. En høyere dose på 200 ng var mindre effektiv for begge proteiner. Som positiv kontroll reduserte den tidligere karakteriserte stamcelle-inhibitor MIP-1a, cykliseringen til 13%. ;En lignende bestemmelse kan foretas in vitro, ved å benytte cykliserings-statusen for CFU-MIX i stedet for CFU-S. Bestemmelsen foretas som beskrevet ovenfor for CFU-S-bestemmelsen, bortsett fra at cytosin-arabinosid (Ara C, 30 mg/mL) benyttes som det cyklus-spesifikke toksiske agens i stedet for høydose tritiert thymidin (se B.l. Lord i Haemopoiesis - A Practical Approach, N.G. Testa & G. Molineux (red.), IRL Press 1993; Pragnell et al., i Culture of Hematopoietic Cells, R.l. Freshney, I.B. Pragnell & M.G. Freshney (red.), Wiley Liss 1994), og en musestamme med høye endogene cykliseringshastigheter (Balb/c) benyttes i stedet for testosteron-behandlede BDFi-mus. Som vist i Tabell 9 er både høyrenset betakjede eller høyrenset alfakjede fra svin begge aktive i denne bestemmelse. Det skal bemerkes at ved denne bestemmelse har cykliseringsnivåene for celler behandlet med pINPROL iblant negative tall, hvilket angir at det forekommer enda flere kolonier i den Ara C-behandlede samling enn i den ubehandlede samling. ;Som beskrevet i Eksempel 2, inhiberer pINPROL proliferasjon av den murine stamcellelinje FDCP-MIX i en bestemmelse av opptak av tritiert thymidin. Figur 20 viser at rensede hemoglobin-alfa- eller -betakjeder begge er aktive under denne bestemmelse, hvor det sees inhiberinger ved <2 ng/mL. ;Ovennevnte gir bevis for at betakjeden i svinehemoglobin oppviser INPROL-aktivitet. Andre data (f.eks. Tabell 9, Fig. 20) viser at isolert alfakjede, så vel som intakt hemoglobin, også er aktive som stamcelle-inhibitorer. Aktive preparater inkluderer også blandinger av alfa- og betakjeder (f.eks. Fig. 5). ;Observasjonene av at isolert alfa-globinkjede og/eller isolert beta-globinkjede er aktive, tyder på at de her beskrevne aktiviteter ikke fordrer en intakt tredimensjonal hemoglobinstruktur. Fragmenter av alfa- og betakjeder er også aktive som stamcelle-inhibitorer. ;Eksempel 15: Renset INPROL. Renset alfahemoglobin eller renset betahemoglobin fra svin er aktive in vivo ;For å undersøke muligheten av at rensede svinehemoglobinkjeder virker in vivo, ble BDFi-mus injisert testosteron-propionat som beskrevet i Eksempel 1. Musene fikk 24 timer senere 500 ng av enten pINPROL, svinehemoglobin-alfakjede (renset fra perifere røde blodlegemer som i Fig. 21), svinehemoglobin-betakjede (renset fra perifere røde blodlegemer som i Fig. 21) eller det tilsvarende volum av bærer intravenøst. 48 timer senere ble det uttatt benmarg fra hver mus og CFU-MIX-bestemmelsen foretatt som beskrevet i Eksempel 14. Som vist i Tabell 10 var pINPROL, alfakjede og betakjede fra svin alle aktive in vivo og reduserte prosentandelen av CFU-MIX i cyklus til basalnivåer. ;Eksempel 16: Renset human hemoglobin-alfakjede, biotinylert human hemoglobin-alfakjede, biotinylert human hemoglobin-betakjede, human hemoglobin-gammakjede og human hemoglobin-deltakjede oppviser alle stamcelle-inhiberende aktivitet in vitro ;Human hemoglobin ble anskaffet fra Sigma Chemical Corporation eller isolert på vanlig måte fra humant perifert)lod fra voksne eller fra navlestrengsblod. De enkelte kjeder ble isolert ved omvendt-fase HPLC på lignende måte som beskrevet ovenfor for svine-alfa og -betakjeden (se B. Masala & L. Manca, Methods in Enzymology, bd. 231, s. 21-44,1994). Det ble oppnådd rensede alfa-, beta-, gamma- og delta-kjeder. For biotinylerte alfa- og betakjeder ble 1 mg human-hemoglobin fra voksne behandlet med 37 ug NHS LC Biotin (Pierce) og kjedene separert ved omvendt-fase kromatografi som ovenfor. ;Som vist i Tabell 11, 12 og 13, er rensede humane alfa-, biotinylerte humane alfa-, biotinylerte humane beta-, humane gamma- og humane delta-hemoglobinkjeder samtlige aktive i CFU-MIX-cykliseringsbestemmelsen. ;;Eksempel 17: Renset human alfakjede, alfa-betadimer eller hemoglobin er aktive in vivo ;Renset human alfakjede, alfa-beta-dimer eller hemoglobin ble undersøkt i en in vivo bestemmelse som beskrevet i Eksempel 15. Som vist i Tabell 14, var alle disse aktive i en konsentrasjon på 500 ng/mus. ;Eksempel 18: Svine-INPROL er aktiv på humane mononukleære eller CD34<+> navlestrengs-blodceller in vitro ;For å undersøke evnen til renset INPROL fra svinebenmarg til å påvirke cyklisering av humane progenitorceller, ble det tatt navlestrengs-blodceller. Hele den mononukleære cellef raksjon oppnådd etter separasjon på Ficoll, eller CD34<+->fraksjonen oppnådd etter fraksjonering på antiCD34-affinitetskolonner (CellPro Inc.) ble benyttet. Cellene ble inkubert i 48 timer in vitro i nærvær av interleukin 3 (IL-3) og stamcellefaktor (SCF) (100 ng/mL av hver) for å sikre at de tidligere stamcellene var i cyklus. Etter denne preinkubering ble cykliseringsbestemmelser foretatt som beskrevet for mus i Eksempel 14, bortsett fra at CFU-GEMM (i stedet for CFU-MtX) ble tellet på Dag 18 etter utplating. Som vist i Tabell 15 inhiberte svine-INPROL cyklisering av CFU-GEMM enten i storparten av mononukleære celler eller i CD34<+->fraksjonen. ;Eksempel 19: Renset humant alfa-hemoglobin er aktiv på human ;CFU-GEMM ;Mononukleære celler fra humant navlestrengsblod ble anskaffet og inkubert i IL-3 og CSF og benyttet i en cykliseringsbestemmelse som beskrevet i Eksempel 18. Som vist i Tabell 16 var både svine-INPROL renset fra benmarg, og humant alfahemoglobin, renset fra perifert blod, aktive i denne bestemmelsen. ;Eksempel 20: Peptider oppnådd fra humane alfahemoglobin- og fra humane betahemoglobin-sekvenser er aktive ;For å identifisere aktive peptidsekvenser ble den tredimensjonale struktur av myoglobin (som er inaktiv i denne bestemmelse) overlagret på den native tredimensjonale struktur av den alfakjede som forekommer i human-hemoglobin hos voksne, ved å benytte et data-modelleringsprogram. To peptider (som representerer aminosyrene 43-55 og 64-82, som utgjør regioner som er strukturelt forskjellige fra myoglobin i tredimensjonalt rom) ble fastslått å ha aktivitet i CFU-MIX-cykliseringsbestemmelsen. For å oppnå en bedre tilnærming av den sløyfe som finnes i den native alfakjede, ble det også syntetisert et cyklisk derivat av 43-55 peptidet (c43-55) (ved å benytte en disulfid-binding), og denne viste seg å være aktiv. ;Sekvensen av disse peptidene er som følger: ;(hvor de to Cys-restene er disulfid-bundet) ;;To hemorfinsekvenser, hemorfin 10 (aminosyrene 32-41 i betakjede-sekvensen)og hemorfin 7 (aminosyrene 33-40) ble testet og funnet å være aktive. ;Sekvensene er som følger: ;For å teste aktiviteten av disse sekvensene ble CFU-MIX cykliseringsbestemmelsen foretatt som beskrevet i Eksempel 14. Som vist i Tabell 17-19 var alle disse peptidene aktive i denne bestemmelsen. *

Claims

1. Peptid, karakterisert ved sekvensen Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val.

2. Cykliskpeptid, karakterisert ved sekvensen Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys, hvor de to Cys-restene danner en disulfid-binding.

3. Peptid, karakterisert ved sekvensen Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-Ala-His-Val-Asp-Asp-Met-Pro-Asn-Ala-Leu-Ser-Ala.

4. Anvendelse av en stamcelle-proliferasjonsinhiberende mengde av INPROL, hvor nevnte INPROL er valgt fra gruppen bestående av peptider med sekvensen: Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val, Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys, hvor de to Cys- restene danner en disulfid-binding, Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-Ala-His-Val-Asp- for fremstilling av et legemiddel for inhibering av stamcelle-proliferasjon.

5. Anvendelse av en stamcelle-proliferasjonsinhiberende mengde av INPROL, hvor nevnte INPROL er valgt fra gruppen bestående av peptider med sekvensen: Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val, Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys, hvor de to Cys- restene danner en disulfid-binding, for fremstilling av et legemiddel for å vedlikeholde hematopoetiske pattedyr-stamceller ex vivo.

6. Anvendelse ifølge krav 5, hvor nevnte hematopoetiske celler er valgt fra gruppen bestående av benmargceller, perifere blodceller, mobiliserte perifere blodceller og navlestrengs-blodceller.

7. Anvendelse av INPROL, hvor nevnte INPROL er valgt fra gruppen bestående av peptider med sekvensen: Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val, Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys, hvor de to Cys-restene danner en disulfid-binding, minst ett stimulerende cytokin for fremstilling av et legemiddel for utførelse av ex vivo stamcelle-ekspansjon.

8. Anvendelse ifølge krav 7, hvor nevnte hematopoetiske celler er celler valgt fra gruppen bestående av benmargceller, navlestrengs-celler, perifere blodceller og mobiliserte perifere blodceller.

9. Farmasøytisk blanding, karakterisert ved at den omfatter: (a) INPROL, hvor nevnte INPROL er valgt fra gruppen bestående av peptider med sekvensen: (b) minst én inhibitor-forbindelse valgt fra gruppen bestående av MIP-1 a, TGFp, TNFa, INFa, INFB, IN Fy, pentapeptidet pyroGlu-Glu-Asp-Cys-Lys, tetrapeptidet N-acetyl-Ser-Asp-Lys-Pro og tripeptidet glutation, Gly-Cys-"yGlu.

10. Farmasøytisk blanding, karakterisert ved at den omfatter: (a) INPROL, hvor nevnte INPROL er valgt fra gruppen bestående av peptider méd sekvensen: Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val, Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys, hvor de to Cys-restene danner en disulfid-binding, Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-Ala-His-Val-Asp-Asp-Met-Pro-Asn-Ala-Leu-Ser-Ala, (b) minst én stimulerende forbindelse valgt fra gruppen bestående av IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-13, IL-14, IL-15, G-CSF, GM-CSF, M-SCF, erytropoetin, trombopoetin, stamcellefaktor og flk2/flt3-ligand.