KR100344059B1 - 재조합 인간 에리트로포이에틴의 정제 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재조합 에리트로포이에틴(recombinant erythropoietin, rEPO)을 생산하는 동물세포의 배양상등액으로부터 재조합 에리트로포이에틴을 정제하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명의 에리트로포이에틴 정제 방법은 2가금속 양이온 침전 단계; 음이온교환 크로마토그래피 단계; 및 소수성 크로마토그래피 단계 등 보다 단순화된 공정만을 포함하므로, 본 발명의 재조합 에리트로포이에틴 정제 방법에 따라 재조합 에리트로포이에틴이 고순도·고효율로 정제될 수 있다.

Description

재조합 인간 에리트로포이에틴의 정제 방법{Process for the purification of recombinant human erythropoietin}

본 발명은 재조합 에리트로포이에틴(recombinant erythropoietin, rEPO)을 생산하는 동물세포의 배양상등액으로부터 재조합 에리트로포이에틴을 정제하는 방법에 관한 것이다.

보다 상세하게 본 발명은 2가금속 양이온 침전 단계; 음이온교환 크로마토그래피 단계; 및 소수성 크로마토그래피 단계 등을 필수적으로 포함하고, 이에 더하여 한외 여과 등 세포 배양상등액의 농축 단계 및/또는 추가적인 2차 음이온교환 크로마토그래피 단계를 포함할 수 있는, 보다 단순화된 재조합 에리트로포이에틴 정제 방법에 관한 것이다.

에리트로포이에틴(Erythropoietin, EPO)은 신장에서 생성 분비되는 조혈호르몬으로서, 적혈구계의 세포에 특이적으로 작용하며, 골수 중의 적아구계 전구세포의 분화와 증식을 조절하는 순환당단백질이다(Carnot 등,Compt. Rend., 143:384, 1906). 에리트로포이에틴은 주로 태아의 간이나 성인의 신장에서 생산되며 혈중 저산소 상태에서 생성이 증가하여 적혈구 세포의 생산을 조절한다.

천연형 인간 에리트로포이에틴은 165개의 아미노산으로 구성된 단량체 당단백질로 전체 분자량이 34,000 달톤 정도되며 단백질 부분의 분자량은 약 18,000 달톤이다(Wang 등,Endocrinology, 116:2286, 1985). 인간 에리트로포이에틴 분자는 전체 분자의 약 40% 정도가 당으로 구성되어 있으며, 이 당쇄부분은 에리트로포이에틴의 생체내 활성에 필수적인 역할을 수행한다. 따라서, 에리트로포이에틴 분자내의 당함량이 감소하면 혈액중 에리트로포이에틴 분자의 반감기가 현저히 감소하게 되고 생체내 활성이 소실되게 된다(Goto 등,Biotechnology, 6:67, 1988). 이러한 현상은 에리트로포이에틴 당쇄 말단의 시알산이 소실되면 갈락토오즈가 노출되고 노출된 갈락토오즈를 간에 존재하는 수용체가 인지하여 에리트로포이에틴을 흡수 후 분해함으로써 유발되는 것으로 보고되었다. 이러한 사실에 근거하여 에리트로포이에틴 당쇄 말단에 존재하는 시알산의 역할과 이를 분해하는 효소인 시알산 분해 효소가 에리트로포이에틴의 생체 활성에 미치는 영향 등이 활발히 연구되고 있다. 또한 시알산 이외의 당구조에 대한 연구와 당구조와 에리트로포이에틴 활성에 관한 연구가 병행되고 있는 추세이다.

천연형 인간 에리트로포이에틴은 1906년 조혈 조절인자의 존재 가능성에 대한 연구를 통해 처음 보고되었고 1957년 에리트로포이에틴으로 명명되었다(Jacobson 등,Nature, 179:633, 1957). 이후 지속된 연구의 결과 인간 에리트로포이에틴은 1977년에 Miyake 등이 재생불량성 환자의 뇨로부터 대량 분리 정제하는데 최초로 성공한 이후(Miyake 등,J. Biol. Chem., 252:5558, 1977) 그 연구가 본격화되기 시작하여 Yanagawa 등에 의해 에리트로포이에틴의 N 말단 서열이 보고되었고(Yanagawa 등,J. Biol. Chem., 295: 2707, 1984) 2년뒤 Lai 등이 인간뇨 유래 에리트로포이에틴 시료에서 에리트로포이에틴 전체 아미노산 서열을 결정하여 보고하였다(Lai 등,J. Biol. Chem. 261:3116, 1986).

1980년대 들어 유전공학 기술의 눈부신 발전으로 유용생리활성물질의 대량 생산 기술이 개발됨에 따라 에리트로포이에틴의 대량 생산이 가능하게 되었고 임상치료제로서 안정적인 공급이 이루어지고 있다.

재조합 인간 에리트로포이에틴의 생산 연구는 1986년에 미국 Amgen사에 의해 세계 최초로 인간 에리트로포이에틴 게놈 클로닝이, 1984년 미국 Genetic institute사에 의한 인간 게놈 cDNA의 클로닝이 성공함에 따라 본격화되기 시작하여 1985년 Amgen사의 Lin 등과 Genetic institute사의 Jacob 등이 중국 햄스터 난소 세포(Chinese Hamster Ovary cell, CHO cell)에서 인간 에리트로포이에틴의 발현에 성공하였다. 이후, 대량 생산 연구, 전임상 및 임상 연구등을 진행하여 1988년에 미국 Amgen사로부터 기술을 제공받은 Cilag사가 스위스에서 CHO 세포에서 제조된 재조합 인간 에리트로포이에틴을 세계 최초로 허가받아 발매하였고, 벨기에, 프랑스 등에서도 계속 발매되었다. 미국에서는 1989년 Amgen사에 의해 처음으로 발매되었으며 현재는 재조합 인간 에리트로포이에틴이 일본, 유럽등 전세계에서 임상적으로 널리 사용되고 있다. 이러한 추세에 발맞추어 양질의 에리트로포이에틴을 생산하기 위한 제조 공정의 연구가 활발히 진행되고 있으며 제조 공정의 마지막 단계인 정제 공정의 개선을 통하여 제품의 품질을 향상시키려는 연구 또한 활발히 이루어지고 있다.

현재까지 알려진 정제 방법으로는 에리트로포이에틴에 대한 단일 클론 항체를 이용한 방법(대한민국 특허 0153808)과 블루 세파로즈 칼럼과 하이드록시 아파타이트 칼럼, 이온교환 수지 칼럼을 조합한 방법(대한민국 특허 0162517), 염료 친화성 크로마토그래피와 양이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피를 이용한 방법(대한민국 특허 0177300)등이 있다.

에리트로포이에틴에 대한 단일 항체를 이용하여 정제하는 방법의 경우 고순도로 에리트로포이에틴을 정제할 수 있다는 장점이 있으나 단일 항체 제작이 까다롭고 고가의 비용이 소요되어 경제성이 떨어지는 단점이 있다. 또한, 대한민국 특허 0162517와 대한민국 특허 0177300에 제시된 정제 방법의 경우 정제 공정이 매우 까다롭고 양질의 에리트로포이에틴을 선별할 수 있는 장치가 마련되어 있지 않다는결함을 가지고 있다. 즉, 이 방법에 의한 정제 공정에서는 에리트로포이에틴 중 생물학적 활성이 낮은 이성질체를 분리해 내지 않고 모든 이성질체들을 동시에 수합하므로 실제 생체내 활성도가 낮은 에리트로포이에틴이 다량 포함되어 그 기능을 저하시킬 수 있다는 단점이 있으므로 바람직하지 못하다.

이에 본 발명자들은 보다 단순화된 에리트로포이에틴 정제 방법을 개발하기 위해 연구를 거듭한 결과, 2가금속 양이온 침전 방법과 2단계 내지 3단계의 간단한 크로마토그래피를 통하여 고순도의 에리트로포이에틴을 분리함으로써 전체적인 정제 공정을 단순화하였을 뿐만 아니라 분리된 에리트로포이에틴으로부터 양질의 에리트로포이에틴을 선별하여 고품질의 에리트로포이에틴 제제를 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 기존의 복잡한 다단계 에리트로포이에틴 정제 방법을 대체할 수 있는 최소의 공정으로 양질의 에리트로포이에틴을 정제하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명이 제공하는 에리트로포이에틴 정제 방법의 바람직한 실시예를 보여주는 것이고,

도 2는 본 발명의 정제 공정 중 1단계 정제 공정인 1차 음이온 교환 크로마토그래피의 크로마토그램을 나타낸 것이고,

도 3은 2단계 정제 공정인 소수성 크로마토그래피의 크로마토그램을 나타낸 것이고,

도 4는 3단계 정제 공정인 2차 음이온 교환 크로마토그래피의 크로마토그램을 나타낸 것이고,

도 5a및도 5b는 본 발명의 정제 공정을 통해 분리된 에리트로포이에틴 정제물의 고속 역상 크로마토그래피 분석도이고,

도 6은 본 발명의 정제 공정을 통해 분리된 에리트로포이에틴 정제물의 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 결과이고,

MW: 분자량 표지;

레인 1: 배양상등액;

레인 2: 배양상등액의 농축액;

레인 3: 염화아연 침전 단계 후의 상등액;

레인 4: 1차 음이온교환 크로마토그패피의 용출액;

레인 5: 소수성 크로마토그래피의 용출액;

레인 6: 2차 음이온교환 크로마토그래피의 용출액,

도 7은 2차 음이온 교환 크로마토그래피의 에리트로포이에틴 용출 분획에 대한 등전집속시험 결과이다.

pI: 등전점 표지;

레인 1: 용출 분획 번호 12 ~ 14;

레인 2: 용출 분획 번호 15 ~ 16;

레인 3: 용출 분획 번호 17;

레인 4: 용출 분획 번호 18;

레인 5: 용출 분획 번호 19 ~ 24.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 재조합 인간 에리트로포이에틴을 생산하는 동물세포의 배양 상등액으로부터 재조합 에리트로포이에틴을 분리, 정제하는 방법을 제공한다.

상기 에리트로포이에틴 정제 방법의 특징은 2가금속 양이온 침전 (divalent cation precipitation) 단계, 음이온교환 크로마토그래피 (anion exchange chromatography) 단계 및 소수성 크로마토그래피 (hydrophobic chromatography) 단계를 포함한다는 점에 있다.

상기 에리트로포이에틴 정제 방법의 또다른 특징은, 상기 특징적 정제 단계 이외에도 2가금속 양이온 침전 단계 이전에 한외 여과 등을 수행하여 세포배양액을 농축하는 단계를 포함할 수 있다는 점과, 소수성 크로마토그래피 단계 이후에 추가적인 음이온교환 크로마토그래피 단계를 포함할 수 있다는 점이다.

도 1은 본 발명이 제공하는 에리트로포이에틴 정제 방법의 바람직한 실시예를 보여준다. 이 정제 공정은 염화아연과 같은 2가금속 양이온 침전 단계와 액상 크로마토그래피 단계로 대별되는데, 이중에서 크로마토그래피를 이용한 순수 정제 공정은 2단계 또는 3단계가 된다. 따라서, 기존의 다단계 정제 공정에 비하여 정제 공정이 크게 단순화된 반면, 순도를 포함한 기타 임상 기준 시험항목에 모두 부합하는 순수한 정제물을 얻을 수 있는 공정으로 구성되어 있다.

본 발명의 에리트로포이에틴 정제 방법에서 사용될 수 있는 동물세포는 재조합 에리트로포이에틴을 생산할 수 있는 모든 동물세포를 포함한다. 이때 에리트로포이에틴 (erythropoietin)은 Lai 등이 결정한 에리트로포이에틴 아미노산 서열 (Lai 등,J. Biol. Chem. 261:3116, 1986)로 기재된다. 그러나, 상기 천연형 에리트로포이에틴 이외에도 에리트로포이에틴 변이체를 생산할 수 있는 동물세포 또한 본 발명의 정제 방법에 이용될 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 상기 동물세포로재조합 인간 에리트로포이에틴을 생산하는 CHO 세포주(DCHE715 세포주, 대한민국 특허 출원 제 98-32997호, 기탁번호 KCLRF-BP-00018)와 BHK 세포주(DBHE318 세포주, 대한민국 특허 출원 제 99-37463호, 기탁번호 KCLRF-BP-00024)를 사용하였다.

재조합 인간 에리트로포이에틴을 삽입하여 형질 전환시킨 동물세포를 무혈청 배지에서 유도 인자(inducer)를 첨가하여 배양한 후, 배양상등액을 수거하여 상등액 내에 존재하는 에리트로포이에틴을 회수할 수 있다.

본 발명의 에리트로포이에틴 정제 방법을 각 단계 별로 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

(1) 한외 여과 (diafiltration) 등을 이용한 세포 배양액 농축 단계

본 발명의 에리트로포이에틴 정제 방법에서는 동물세포를 배양한 세포 배양액을 바로 정제 단계에 사용할 수도 있으나, 바람직하게는 세포 배양액을 여과막에 여과한 다음 2가금속 양이온 침전 단계를 수행할 수 있다.

상기 여과막은 분자량 분리능 (molecular weight cut-off, MWCO) 5 ~ 20 K 크기의 여과막이 바람직하며, 수거된 대량의 배양상등액을 한외여과 방법으로 농축하여 용량을 감소시킴으로써 이후 작업에 용이하도록 용량을 조절한다. 이 과정을 통하여 에리트로포이에틴의 소실은 거의 없으며 용량의 감소에 의하여 크로마토그래피 수행시 시료 주입에 소요되는 시간을 크게 단축할 수 있을 뿐 아니라, 세포 파쇄에 의하여 발생한 불순물을 비롯한 배양액 내의 불순물을 제거할 수 있다.

(2) 2가금속 양이온 침전 단계

본 발명의 에리트로포이에틴 정제 방법 중 2가금속 양이온 침전 단계에서는 2가금속염을 상기 동물세포의 배양액에 첨가하여 반응시킨 후 원심분리하여 불순물을 침전시킨다. 2가금속 양이온의 예로는 칼슘(Ca²⁺), 아연(Zn²⁺), 구리(Cu²⁺), 니켈(Ni²⁺), 코발트(Co²⁺) 등이 있으며, 이들은 일반적으로 염화칼슘(CaCl₂), 염화아연(ZnCl₂), 염화코발트(CoCl₂), 황산구리(CuSO₄), 황산니켈(NiSO₄) 등과 같은 금속염의 형태로 배양액에 첨가된다.

상기 2가금속 양이온 침전 단계를 통해 고당단백질(highly glycosylated protein)을 제외한 저당단백질(lowly glycosylated protein) 및 비당단백질(non-glycosylated protein)의 대부분이 침전된다. 미국 특허5,276,141에 따르면, 인간면역결핍바이러스(HIV)의 gp120 단백질, HIV gp160 단백질, 뮤신(mucin), 알파-1-당단백질(α-1-glycoprotein)과 같은 당단백질은 단백질 총 중량에서 당쇄 부분이 차지하고 있는 비율이 20-40% 정도인 고당단백질로 분류되며, 이들은 2가 금속 양이온과 반응시 복합체를 형성하지 않기 때문에 저당단백질, 비당단백질 등과 분리할 수 있다고 알려져 있다. 에리트로포이에틴의 경우 당쇄 부분이 전체 단백질 중량의 40%정도를 차지하는 고당단백질이므로 2가 금속 양이온을 이용한 침전 방법을 이용하여 불순 단백질과의 분리가 가능하다.

본 발명의 에리트로포이에틴 정제 방법에서, 2가금속 양이온은 20 ~ 120 mM농도로 첨가하고 약 30 분 ~ 2 시간 반응시킨 후 원심분리하여 불순물을 침전시키는 것이 바람직하며, 특히 염화아연을 약 80 mM 농도로 첨가하고 약 4℃에서 1시간 정도 반응시킨 후 원심분리하여 불순물을 침전시키는 것이 보다 바람직하다. 본 발명에서는 예비 실험을 통하여 20mM ~ 120mM 까지의 금속 양이온을 처리하였고, 또한 반응 조건도 4℃, 상온, 37℃ 에서 각각 1시간, 2시간, 4시간 동안 처리함으로써 최적의 2가금속 양이온 침전 조건을 결정하였다. 예비 실험 결과 에리트로포이에틴의 경우 40 ~ 120 mM의 염화아연(ZnCl₂)을 4℃에서 1시간 반응시킬 경우 불순물 제거 효과가 크게 나므로 바람직하며, 특히 80 mM의 염화아연을 4℃에서 1시간 반응시킬 경우 불순물 제거 효과가 가장 크면서도 에리트로포이에틴의 소실이 가장 적은 것으로 조사되었다.

2가 양이온 침전 방법으로 침전된 저당단백질 및 비당단백질들은 원심분리에 의하여 쉽게 제거할 수 있으며 상등액 내의 에리트로포이에틴을 회수할 수 있다. 또한 70% 이상의 순도 개선 효과를 나타내어 별도의 정제 공정 없이 단시간 내에 일차적인 정제 효과를 기대할 수 있기 때문에 차후 수행하게 될 정제 단계의 효율을 향상 시킬 수 있다.

원심분리에 의하여 침전물이 제거된 상등액은 1차 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하기 위하여 탈염한다. 탈염은 한외여과 방법을 통하여 이루어 지며, 최종 염의 농도는 희석 배수를 계산하여 5 mM 이하가 되도록 하는 것이 바람직하다.

(3) 음이온 교환 크로마토그래피 단계

본 발명의 에리트로포이에틴 정제 방법 중 음이온 교환 크로마토그래피 단계에서는, 2가금속 양이온 침전 단계에서 분리된 에리트로포이에틴 분획으로 음이온교환 칼럼 크로마토그래피를 수행하되, 100 mM, 250 mM 및 500 mM 염화나트륨의 단계별 농도구배 (step gradient) 용액으로 용출하고 이중 100 mM 염화나트륨 분획을 활성 분획으로 분리한다. 이 방법 이외에도 염화나트륨의 선형 농도구배를 이용하여 단백질을 용출하여 에리트로포이에틴 활성 분획을 수거하는 방법을 사용하거나 염화나트륨 이외의 염으로 염화칼슘을 이용한 단백질 용출 방법을 이용할 수 있다. 전자의 경우 10mM 트리스 완충액과 500mM 염화나트륨 용액을 이용하여 10 칼럼 부피로 선형 농도구배를 형성하고 75mM ~ 120mM 농도에서 용출되는 단백질을 에리트로포이에틴의 활성 분획으로 수거한다. 후자의 경우 5mM 트리스 완충액과 200mM 염화칼슘 용액을 이용하여 10 칼럼 부피로 선형 농도구배를 형성하거나 염화칼슘 5mM, 20mM,100mM, 200mM 용액을 이용하여 단계별 농도구배로 단백질을 용출하여 에리트로포이에틴의 활성 분획을 수거한다. 이때 에리트로포이에틴은 선형 농도구배시 10 ~ 20mM 분획에서, 단계별 농도구배시 20mM 분획에서 용출된다. 상기된 방법들 중 공정 시간 및 수율, 에리트로포이에틴 순도 등을 고려할 때 염화나트륨의 단계별 농도구배를 이용하는 방법이 가장 바람직하다.

본 발명의 실시예에서는, 2가금속 양이온 침전 단계 이후 탈염된 상등액을 음이온교환 칼럼 크로마토그래피 수지(예: DEAE 세파로즈)가 충진된 칼럼에 주입하고 100 mM, 250 mM 및 500 mM 염화나트륨의 단계별 농도 구배 용액으로 용출한다.시료를 주입하기에 앞서 칼럼을 10 mM 트리스 완충액(pH 8.0) 등으로 평형화시키며, 용출시에는 각 단계별로 최소 2 칼럼 부피 이상 용매를 주입한다. 그러나, 상기 수지의 종류, 칼럼의 규격, 평형화 완충액의 종류 및 양, 용출액의 양 등은 통상의 음이온교환 크로마토그래피 기술에 따라 수정될 수 있다. 용출 분획 중 에리트로포이에틴은 100mM 염화나트륨 농도 구간에서 분리되었으며, 대부분의 불순 단백질은 250mM과 500mM의 세척 단계에서 용출되었다 (도 2참조).

(4) 소수성 크로마토그래피 단계

본 발명의 에리트로포이에틴 정제 방법 중 소수성 크로마토그래피 단계에서는, 앞서 수행한 음이온교환 크로마토그래피 용출액 중 에리트로포이에틴을 포함하는 용출 분획을 수거하여 소수성 크로마토그래피를 수행하되, 0 ~ 70 % 에탄올 선형 농도 구배(linear gradient) 용액으로 용출하고, 이중 에탄올 10 ~ 35 % 농도 구간을 활성 분획으로 분리한다.

본 발명의 실시예에서는 페닐(phenyl) 수지가 충진된 칼럼에 1차 음이온 교환 크로마토그래피의 에리트로포이에틴 용출 분획을 주입하고 에탄올 선형 농도 구배에 의하여 에리트로포이에틴을 용출한다. 시료의 주입에 선행하여 칼럼을 1M 구아니딘 용액으로 평형화 시키고, 주입 시료내의 구아니딘 최종 농도가 1M이 되도록 염을 첨가한 후 시료를 주입한다. 그러나, 상기 수지의 종류, 칼럼의 규격, 평형화 완충액의 종류 등은 통상의 소수성 크로마토그래피 기술에 따라 수정될 수 있다.

이상의 정제 과정을 통하여, 에리트로포이에틴의 용출 분획과 불순물의 용출 분획은 완전 분리되는 양상을 나타내며, 내독소 및 숙주유래 DNA, 숙주유래 펩타이드가 식품의약품안전청(KFDA) 허가기준 및 시험방법에 근거한 순도 시험 기준 이하로 제거된 99% 순도의 에리트로포이에틴을 정제할 수 있다 (도 3및표 2참조).

소수성 크로마토그래피에서 수거된 에리트로포이에틴 용출액은 투석(dialysis) 방법을 이용하여 탈염할 수 있다. 이때, 용매에 대한 염의 희석 배수를 계산하여 최종 염의 농도가 5 mM 이하가 되도록 하는 것이 바람직하다.

(5) 추가적인 음이온교환 크로마토그래피 단계

당단백질인 에리트로포이에틴은 생체내 활성이 당쇄 말단의 시알산(sialic acid 또는 N-acetylneuraminic acid)에 의하여 조절되며 시알산의 함량이 높을수록 생체내 활성이 높게 나타나는 것으로 알려져 있다. 이는 당쇄 말단의 시알산이 에리트로포이에틴의 체내 반감기를 연장시키는 기능을 수행하기 때문인데, 이를 위하여 양질의 에리트로포이에틴을 선별하는 공정이 수반되어야 한다. 이를 위하여 추가적인 음이온교환 크로마토그래피 단계를 수행하여 에리트로포이에틴 용출액을 분획한다.

본 발명의 에리트로포이에틴 정제 방법에서 추가적으로 수행될 수 있는 음이온교환 크로마토그래피는 소수성 크로마토그래피 단계 이후에 수행하는데, 바람직하게는 0 ~ 500 mM 염화나트륨 선형 농도구배 용액으로 용출하고, 이중45~ 175 mM 농도 구간을 활성 분획으로 분리할 수 있다. 염화나트륨 이외의 염으로 염화칼슘을 이용한 단백질 용출 방법을 이용할 수 있으며 이때 농도구배 조건은 선형 농도구배를 이용한다. 5mM 트리스 완충액(pH 8.0)과 200mM 염화칼슘 용액을 이용하여 10 칼럼 부피로 선형 농도구배를 형성하고 단백질을 용출하여 에리트로포이에틴의 활성 분획을 수거한다. 이때 에리트로포이에틴은 10 ~ 20mM 분획에서 용출된다. 상기된 방법들 중 공정 시간 및 수율, 에리트로포이에틴 순도, 분획별 분리능 등을 고려할 때 염화나트륨의 선형 농도구배를 이용하는 방법이 가장 바람직하다.

본 발명의 실시예에서는 투석이 종료된 시료를 Q 수지가 충진된 칼럼에 주입하여 0 ~ 500 mM 염화나트륨 선형 농도 구배에 의해 추가적인 2차 음이온교환 크로마토그래피를 실행한다. 2차 음이온 교환 크로마토그래피는 10 mM 트리스 완충액(pH 8.0)으로 평형화된 칼럼에 투석된 시료를 주입하고 염화나트륨 농도 구배를 형성한 후 용출되는 단백질을 일정한 분획 크기(fraction size)로 분획하는 방법으로 수행된다 (도 4참조). 그러나, 상기 수지의 종류, 칼럼의 규격, 평형화 완충액의 종류 등은 통상의 음이온교환 크로마토그래피 기술에 따라 수정될 수 있다.

음이온 교환 크로마토그래피를 통해 45 - 175mM 구간에서 에리트로포이에틴이 주로 용출되며, 이 구간에서 용출되는 에리트로포이에틴을 분획하여 각 분획별 등전집속분석을 통하여 pI 3.5 - 4.5 사이의 에리트로포이에틴만을 포함하는 분획만을 수거하였다. 용출된 각각의 분획을 등전집속시험(isoelectric focusing ; IEF)을 통해 등전점(isoelectric point ; pI)의 분포를 확인한 후 pI 범위가 3.5 ~4.5 사이에 분포하는 분획만을 수합한다 (도 7참조). 이 공정을 통하여 99% 이상의 순도를 나타내는 고순도의 에리트로포이에틴을 분리할 수 있으며 별도의 정제 공정이 수반되지 않아도 생체 활성이 매우 높은 양질의 에리트로포이에틴 만을 선별할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 세포 배양상등액의 수거

안정화된 재조합 에리트로포이에틴 생산 CHO 세포주인 DCHE715 세포주(대한민국 특허 출원 제 98-32997호, 기탁번호 KCLRF-BP-00018) 및 안정화된 재조합 에리트로포이에틴 생산 BHK (baby hamster kidney) 세포주인 DBHE318 세포주(대한민국 특허 출원 제 99-37463호, 기탁번호 KCLRF-BP-00024)를 각각 무혈청 배양하여 배양상등액 100L를 수거하고 실시예 2 이하 단계에 사용하였다. 이때 에리트로포이에틴 생산용 CHO 및 BHK 세포는 37℃에서 각각 6일, 8일간 배양하며 배양 종료시 세포의 농도는 각각 초기 접종 농도의 7.5%, 8.1% 였다. 상기 DCHE715 세포주는 인간 에리트로포이에틴의 유전자 염기서열을 지닌 벡터 pDEP173으로 형질전환시킨 CHO 세포주 중 메토트렉세이트 (methotrexate, MTX) 선별배지에서 선별된 것이고, DBHE318 세포주는 인간 에리트로포이에틴 유전자를 지닌 벡터 pDEP521으로 형질전환시킨 BHK 세포주 중 MTX 선별배지에서 선별된 것이다.

<실시예 2> 세포 배양상등액의 농축

여과막(Pellicon 2 Cassette Filter, Millipore사, MWCO 10K)을 펌프(MasterFlex, Millipore사)와 함께 장착하고 60L의 3차 멸균수로 여과장치의 내부를 세척하였다. 여과장치의 세척이 완료된 후 CHO 세포의 배양상등액을 펌프를 통해 여과장치에 주입하고 여액을 회수하여 재주입하는 방식으로 한외여과를 수행하였다. 한외여과가 완료된 후 배양상등액 농축액의 부피는 3 ~ 4 L 였다.

<실시예 3> 염화아연 전처리

1M 염화아연(ZnCl₂) 용액을 3차 멸균수를 사용하여 제조하고 상기 실시예 2의 농축액에 최종 농도가 80mM이 되도록 첨가하였다. 80mM 염화아연이 첨가된 농축액을 4℃에서 1시간 방치하여 침전반응을 수행한 후, 농축액을 원심분리기용 용기에 분주하고 3000rpm의 속도로 20분간 4℃에서 원심분리하였다. 원심분리 후 침전물이 혼합되지 않도록 상등액을 회수하고 역상 고속 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 이용한 순도 분석과 단백질 농도 측정을 실시하였다 (실험예 1 참조).

그 결과, 염화아연을 전처리한 농축액의 순도는 75 - 80% 였고 약 40%의 불순 단백질이 제거되었다.

<실시예 4> 전처리액의 용매 교환

여과막(Pellicon 2 Cassette Filter, Millipore사, MWCO 10K)을 펌프(MasterFlex, Millipore Co.)와 함께 장착하고 60L의 3차 멸균수로 여과장치의 내부를 세척하였다. 여과장치의 세척이 완료된 후 염화아연 전처리액에 10배 용량의 3차 멸균수를 첨가하여 전처리액을 10배 희석하고 이 희석액을 펌프를 통해 여과장치에 주입한 후 여액을 회수하여 재주입하는 방식으로 한외여과를 수행하였다. 한외여과에 의하여 농축된 농축액을 10배 용량의 3차 멸균수로 재희석하여 한외여과를 2회 더 반복하여 농축액 내의 염의 농도를 5mM 이하가 되도록 하였다.

<실시예 5> 1차 음이온 교환 크로마토그래피(IEC -Ⅰ)

음이온 교환 수지(DEAE-Sepharose Fast Flow, Amersham-pharmacia biotech사)를 200×500칼럼에 충진하고 10mM 트리스 완충액(pH 8.0)으로 2 칼럼 용량만큼 평형화시켰다. 평형화된 칼럼에 실시예 4의 농축액을 주입하고 10mM 트리스 완충액(pH 8.0)으로 칼럼을 세척하였다. 100mM 염화나트륨/10mM 트리스 완충액(pH 8.0), 200mM 염화나트륨/10mM 트리스 완충액(pH 8.0), 500mM 염화나트륨/10mM 트리스 완충액(pH 8.0)을 차례로 각각 2 칼럼 용량 만큼 주입하여 단백질을 용출하고 각각의 용출액을 RP-HPLC를 이용하여 분석하였다 (실험예 1 참조).

1차 음이온 교환 크로마토그래피 결과도 2와 같은 양상으로 단백질이 분리되었고, 각 단백질 용출액을 분석한 결과 에리트로포이에틴은 대부분 100mM 염화나트륨 용출액에서 검출되었으며 순도는 95 ~ 98%에 이르렀다.

<실시예 6> 소수성 크로마토그래피(HIC)

소수성 크로마토그래피 수지(Phenyl-Sepharose Fast Flow, Amersham-pharmacia biotech사)를 칼럼(FineLINE Pilot 35, Amersham-pharmacia biotech사)에 충진하고 1M 구아니딘(Guanidine hydrochloride) 용액으로 평형화 시켰다. 1차 음이온 교환 크로마토그래피의 에리트로포이에틴 용출액에 최종 농도가 1M이 되도록 구아니딘을 첨가하여 용해시킨 후 칼럼에 주입하였다.도 3과 같이 용매 A(1M 구아니딘)에서 용매 B(70% 에탄올/1M 구아니딘)에 이르도록 10 칼럼 용량으로 선형 농도 구배를 형성하여 단백질을 용출하였다. 단백질 용출액은 분획하고 역상 고속 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 이용한 순도 분석 후 에리트로포이에틴이 존재하는 분획만을 모았다 (실험예 1 참조). 에리트로포이에틴은 에탄올 10-35% 농도 구배에서 용출되었으며 이때 순도는 99% 정도로 매우 높게 나타났다.

<실시예 7> 에리트로포이에틴 용출액의 투석(Dialysis)

활성화된 투석막(Spectra/Por ^?? Spectrum사, MWCO 12-14K)에 소수성 크로마토그래피의 용출액을 넣고 봉합한 후 10배 용량의 3차 멸균수에 대하여 6시간 간격으로 3회 투석하여 용출액 내의 염의 농도를 5mM 이하가 되게 하였다.

<실시예 8> 2차 음이온 교환 크로마토그래피

10mM 트리스 완충액(pH 8.0)으로 평형화된 음이온 교환 칼럼(Q-Sepharose Fast Flow, Amersham-pharmacia biotech사)에 투석액을 주입하고 10mM 트리스 완충액(pH 8.0)으로 칼럼내의 잔여 단백질을 세척하였다. 세척이 완료된 후 용매A (10mM 트리스 완충액, pH 8.0)에서 용매B (500mM 염화나트륨/10mM 트리스 완충액, pH 8.0)에 이르도록 10 칼럼 용량으로 선형 농도 구배를 형성하여 단백질을 용출하였다(도 4참조).

에리트로포이에틴은 염화나트륨 45mM ~ 175mM에 이르는 농도 구배 구역에서 광범위하게 용출되었다. 단백질 용출액은 20mL의 분획 크기로 분획 하였고 에리트로포이에틴이 용출된 각각의 분획에 대하여 등전집속시험(Isoelectric Focusing, IEF)을 수행하였다 (실험예 3 참조). 등전집속시험 결과 분석 후 pI 범위가 3.5에서 4.5 사이에 분포하는 에리트로포이에틴을 포함하는 분획만을 모아서 제형화하였다. 이때 pI 3.5 - 4.5 에 분포하는 에리트로포이에틴에서 내독소(Endotoxin), 숙주유래 DNA, 숙주유래 펩타이드의 불순물은 거의 검출되지 않았다

<실험예 1> 역상 고속 액체 크로마토그래피를 이용한 순도 분석

세포 배양상등액, 그 농축액, 염화아연 전처리액 및 각 정제 단계에서 수거된 단백질 용출액에 대한 순도를 역상 고속 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 이용하여 측정하였다. RP-HPLC를 이용한 순도 분석은 각 시료를 100㎕ 취하여 HPLC 칼럼에 주입하여 아세토니트릴 선형 농도 구배에 의하여 시료내의 단백질들을 분리하는 방법으로 수행하였다.

RP-HPLC 장치 및 조건은 다음과 같았다.

- 장치 :

HPLC 펌프 (LC 22, Bruker)

검출기(LAMDA 1000, BISCHOFF)

칼럼(Hi-Pore Reversed phase column, RP-304, BIO-RAD)

- 크로마토그래피조건

용매 A ; 20% 아세토니트릴/0.1% 트리플로로아세트산

용매 B ; 80% 아세토니트릴/0.1% 트리플로로아세트산

유속 ; 0.5 mL/분

검출파장 ; 280nm

전개시간 ; 45분

농도구배 ; 표 1 참조

전개시간(분)	% 용매 A	% 용매 B
0	70	30
10	70	30
35	20	80

37	20	80
38	70	30
45	70	30

이상의 조건으로 정제 단계별 정제물을 분석한 결과를도 5에 나타내었다.

<실험예 2> 폴리아크릴 아미드 젤 전기영동(SDS-PAGE)을 이용한 순도 분석

세포 배양상등액, 그 농축액, 염화아연 전처리액 및 각 정제 단계에서 수거된 단백질 용출액에 대한 순도를 폴리아크릴 아미드 젤 전기영동법을 이용하여 측정하였다.

SDS-PAGE 젤(Pre-cast gel, gradient 4-20%, NOVEX)을 전기영동장치(Xcell Ⅱ Mini-Cell, NOVEX)에 장치하고 이동완충액을 채웠다. 각 시료 50㎕을 샘플 완충용액 50㎕와 혼합한 후 95℃ 에서 5분간 가열한 후 10,000 rpm 에서 3~4분간 원심분리하고 분자량 표준품과 함께 각 웰에 25㎕씩 주입하였다. 시료 주입 후 130V의 전압으로 전기영동하고 전개가 완료되면 젤을 꺼내어 쿠마시염색을 실시하였다. SDS-PAGE 결과를도 6에 나타내었으며 에리트로포이에틴 최종 정제물은 99% 이상의 순도를 보였다.

<실험예 3> 등전집속시험(IEF)

실시예 8에서 용출된 각각의 분획들을 약 60만 IU/mL 정도의 농도가 되도록 농축한 후 농축액과 샘플 완충액을 1:1로 혼합하였다. 전기영동장치(Xcell Ⅱ Mini-Cell, NOVEX)에 IEF 젤(IEF PAGE pH 3-7, NOVEX)을 장치하고 각 시료 20㎕와등전표준품(low pI kit, pH 2.5 ~ 6.5, Pharmacia) 5㎕를 각 웰에 주입한 후 2W에서 2시간 동안 전기영동하였다. 전기영동이 완료된 후 젤을 고정액에서 30분간 서서히 교반하여 고정시키고 쿠마시염색하였다. 탈색용액으로 밴드가 선명히 판별되도록 탈색한 후 각 시료의 밴드 분포를 판독하였다.도 7에서 보여지듯 2차 음이온 교환 크로마토그래피에서 용출된 에리트로포이에틴 분획은 광범위한 pI 범위에서 고르게 나타나며 이들 중 pI 3.5 ~ 4.5 의 범위에서 나타나는 에리트로포이에틴만을 수합하였다.

<실험예 4> 효소면역측정법에 의한 시험관 내 활성도 측정(in vitro activity assay)

세포 배양상등액, 그 농축액, 염화아연 전처리액 및 각 정제 단계에서 수거된 단백질 용출액에 대한 시험관 내 활성도를 효소면역측정법에 의하여 측정하고 이를 통하여 각 정제 단계별 수율을 산출하였다. 효소면역측정 키트(Quantikine™ IVD™ ELISA, R&D System)중 항체흡착 플레이트의 각 웰에 분석용 희석액을 100㎕ 씩 첨가하고 샘플 희석액으로 적절히 희석한 표준액, 국제표준액(86 IU/ample, NIBSC) 및 검액들을 100㎕ 씩 가하여 잘 섞은 후 상온에서 1시간 반응시켰다. 각 웰의 잔여 반응액을 제거하고 세척용액 250㎕로 3회 세척한 후 효소항체 접합체액 200㎕를 가한 후 다시 상온에서 1시간 반응시켰다.

반응 여액을 위의 방법으로 제거, 세척한 후 용시 제조한 기질-발색용액 200㎕를 웰에 첨가하고 상온에서 20분간 발색시켰다. 발색이 완료된 후 반응 정지액 100㎕를 첨가하여 반응을 정지 시키고 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준액의 활성도(log mIU/mL)를 횡축, 흡광도(A_450nm)를 종축으로 하여 표준곡선을 작성하고 작성된 표준곡선으로부터 국제표준액과 검액의 에리트로포이에틴 활성도를 구하고희석배수를 곱하여 시료의 최종 활성도를 산출하였다.

표 2는 CHO 세포주인 DCHE715 세포주의 무혈청 배양액으로부터 상기한 정제 공정을 실시하여 얻은 정제물들의 정제 단계별 분석 예를 나타낸 것이다.

정제 단계	용 량(mL)	EPO 역가(IU/mL)	단백질 농도(mg/mL)	비활성(IU/mg)	내독소(EU/mL)	순도(%)
배양상등액	104,000	7,565	0.237	31,941	ND	46
농축액	3,400	229,086	7.018	32,644	ND	48.9
염화아연 전처리액	3,400	219,830	3.219	70,256	ND	75.5
1단계 (IEC-I)	3,000	133,294	1.453	91,756	ND	96
2단계 (HIC)	3,000	129,885	1.283	101,267	ND	99
3단계 (IEC-II)	400	110,145	0.866	127,243	ND	99
EPO 원액a	350	125,877	0.985	127,845	0.1	99
* a : 상기 3단계 정제를 거친 후 제형화한 EPO 원액ND : 측정하지 않음(not determined)

<실험예 5> 내독소, 숙주유래 DNA, 숙주유래 펩타이드의 불순물 검출

(5-1) 내독소 확인 시험

검액과 표준액을 적당한 희석 비율로 희석한 후 96 웰 플레이트에 50㎕씩 분주하고 LAL(Limulus Amebocyte Lysate) 용액 50㎕을 첨가하여 37℃에서 10분간 반응시켰다. 각 웰에 기질 발색용액 100㎕를 첨가하여 37℃에서 10분간 발색시키고 반응 정지액 100㎕를 첨가한 후 405nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 표준액과 비교하여 검액의 내독소를 환산하고 여기에 희석 배수를 곱하여 검액의 내독소를 산출하였다. 그 결과 본 발명의 3단계 정제방법에 의해 순수정제된 EPO 원액에서는 내독소가 0.1 EU/mL 이하로 검출되었다.

(5-2) 숙주유래 DNA시험

검액내의 단백질을 페놀/클로로포름 추출법에 의해 제거하고 탈염한 후 100㎕의 부피로 농축하였다. 숙주유래 DNA 표준품을 제조하고 니트로셀룰로오스 멤브레인에 검액과 함께 흡착시키고 디그옥시게닌-dUTP로 표지된 탐침을 이용하여 혼성화하였다. 기질 발색 용액을 첨가하여 발색시키고 발색 정도를 표준액과 비교하여 검액내의 숙주유래 DNA 함량을 환산하였다. 그 결과 본 발명의 3단계 정제방법에 의해 순수정제된 EPO 원액에서는 숙주유래의 DNA가 10pg/60,000IU 이하로 검출되었다.

(5-3) 숙주유래 펩타이드 시험

숙주유래 펩타이드에 대한 1차 항체를 96웰 플레이트에 37℃에서 1시간동안 흡착시키고 여액을 세척하였다. 검액 및 숙주유래 펩타이드 표준액을 각 웰에 첨가하여 37℃에서 반응시키고 여액을 세척한 후 효소-항체 접합액을 첨가하여 37℃에서 반응시켰다. 기질 발색 용액을 첨가하여 상온에서 발색시키고 490nm 파장에서 흡광도를 측정한 후 표준액과 비교하여 검액의 숙주유래 펩타이드 농도를 계산한다. 여기에 검액의 희석 배수를 곱하여 최종 숙주 유래 펩타이드 농도를 환산하였다. 그 결과 본 발명의 3단계 정제방법에 의해 순수정제된 EPO 원액에서는 숙주유래의 펩타이드가 78ng/60,000IU 이하로 검출되었다.

본 발명이 제공하는 에리트로포이에틴 정제 방법은 배양상등액 농축 공정, 간단한 2가금속이온 전처리, 2단계 또는 3단계만으로 구성되는 크로마토그래피 단계 등으로 구성되므로, 상기 정제 방법을 이용하면 복잡한 기존의 정제 방법에 비해 정제 소요 시간 및 비용을 감소시킬 수 있다.

Claims (8)

1. 재조합 인간 에리트로포이에틴을 생산하는 동물세포의 배양 상등액으로부터 재조합 에리트로포이에틴을 정제하는 방법에 있어서,

   2가금속 양이온 침전 단계, 음이온교환 크로마토그래피 단계 및 소수성 크로마토그래피 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 에리트로포이에틴 정제 방법.
2. 제 1항에 있어서, 동물세포는 CHO 또는 BHK 세포주인 것을 특징으로 하는 에리트로포이에틴 정제 방법.
3. 제 1항에 있어서, 2가금속 양이온 침전 단계는 2가금속염을 20 ~ 120 mM 농도로 첨가하고 약 30 분 ~ 2 시간 반응시킨 후 원심분리하여 불순물을 침전시키는 것을 특징으로 하는 에리트로포이에틴 정제 방법.
4. 제 3항에 있어서, 2가금속 양이온 침전 단계는 염화아연을 약 80 mM 농도로 첨가하고 약 4℃에서 1시간 정도 반응시킨 후 원심분리하여 불순물을 침전시키는 것을 특징으로 하는 에리트로포이에틴 정제 방법.
5. 제 1항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피 단계는 100 mM, 250 mM 및 500 mM 염화나트륨의 단계별 농도구배 용액으로 용출하고, 이중 100 mM 염화나트륨 분획을 활성 분획으로 분리하는 것을 특징으로 하는 에리트로포이에틴 정제 방법.
6. 제 1항에 있어서, 소수성 크로마토그래피 단계는 0 ~ 70 % 에탄올 선형 농도 구배 용액으로 용출하고, 이중 에탄올 10 ~ 35 % 농도 구간을 활성 분획으로 분리하는 것을 특징으로 하는 에리트로포이에틴 정제 방법.
7. 제 1항에 있어서, 2가금속 양이온 침전 단계 이전에 여과막(MWCO 5 ~ 20 K)을 통한 한외 여과를 수행하는 단계를 수행하는 것을 특징으로 하는 에리트로포이에틴 정제 방법.
8. 제 1항에 있어서, 소수성 크로마토그래피 단계 이후에 추가적인 음이온 교환 pI 3.5 ~ 4.5 사이의 이성체(isomer) 밴드만을 포함하고 있는 분획만을 수거하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생체내 활성이 높은 에리트로포이에틴의정제 방법.