KR20180026688A - 지속형 에리트로포이에틴 함유 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 지속형 에리트로포이에틴 함유 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 EPO-Fc의 시알릭산 함량이 17 mol/mol 이상이고, 숙주세포 유래 단백질(HCP) 불순물이 100 ng/mg 이하로 포함됨으로써 생체 내 지속성이 우수하고 순도가 높은 EPO-Fc 융합 단백질 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

Description

지속형 에리트로포이에틴 함유 조성물 {Composition comprising long-acting Erythropoietin}
본 발명은 지속형 에리트로포이에틴 함유 약학 조성물 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
에리트로포이에틴(Erythropoietin, EPO)은 골수에서 적혈구 모세포의 분화를 촉진하여 적혈구를 생성하는 당 단백질로 165개의 아미노산으로 이루어져 있다. 이것은 주로 신장에서 생성되며, 간에서도 소량 생성되는 것으로 알려져 있다. 만성 신부전증(CRF)에서 볼 수 있듯이 신장 기능의 손실은, 예를 들어 전형적으로 EPO 생성의 감소 및 그에 수반하는 적혈구의 감소를 일으킨다. EPO는 만성 신부전증에 의한 빈혈과 다양한 원인에 의한 각종 빈혈의 치료 및 그 외에 외과수술 보조 등 각종 조혈 작용에 탁월한 효과가 있음이 밝혀졌다.
EPO와 같은 폴리펩타이드는 일반적으로 안정성이 낮아 쉽게 변성되고 혈액 내 단백질 가수분해효소에 의해 분해되어 신장이나 간을 통해 쉽게 제거되기 때문에 생체 내 반감기가 짧다. 따라서 약리성분으로 폴리펩타이드를 포함하는 단백질 의약품의 혈중 농도 및 역가를 유지하기 위해서는 단백질 약물을 환자에게 자주 투여할 필요가 있다. 그러나 대부분 주사제 형태로 환자에게 투여되는 단백질 의약품의 경우, 활성 폴리펩타이드의 혈중 농도를 유지하기 위해 자주 주사를 놓는 것은 환자에게 고통을 야기하게 된다.
EPO 폴리펩타이드의 생체 내 반감기를 증가시키기 위해 면역글로불린 (Ig)를 사용하여 제조된 융합 단백질이 개발되고 있다. Ig는 혈액의 주요 구성성분이다. 인간 Ig (hIg)는 IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE와 같은 다양한 부류(classes)를 포함한다.
면역글로불린은 네 개의 폴리펩타이드 사슬이 포함되는데, 두 개의 중쇄 (heavy chains) 및 두 개의 경쇄 (light chains)인 이들은 사량체(tetramer)를 형성하기 위해 이황화 결합(disulfide bonds)를 통해 연결되어 있다. 각 사슬은 가변 영역 (variable region) 및 불변 영역 (constant region)으로 구성되어 있다. 중쇄 불변 영역은 아이소타입(isotypes)에 따라 셋 또는 네 부위 (CH1, CH2, CH3 및 CH4)로 더 나누어진다. 중쇄 불변 영역의 Fc 영역은 Ig 아이소타입에 따라, 힌지(hinge), CH2, CH3 및/또는 CH4 도메인을 포함한다.
생체 내 반감기와 관련하여, 면역글로불린의 Fc 영역에 융합된 키메릭 단백질(chimeric proteins)은 증가된 안정성 및 증가된 혈청 반감기를 보이는 것으로 알려져 있다.
또한 EPO 단백질 표면에 시알릭산(sialic acids)을 부착하는 방법은 간에서의 단백질 분해의 방지를 유도하는 것으로 알려져 있다. 시알릭산 (sialic acid)은 아시알로 당단백질(asialoglycoprotein) 수용체의 두 번째 갈락토오스기를 보호함으로써 EPO의 생체 내 활성도에 영향을 미친다. 에리트로포이에틴의 당쇄에 존재하는 시알릭산은 에리트로포이에틴의 생체 내 반감기 연장에 중요한 역할을 하며, 궁극적으로는 효능에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 또한, 시알릭산 분해효소(sialidase)가 작용하여 에리트로포이에틴의 생체 내 생물학적 활성을 불활성화시킨다는 사실이 발견된 이후, 에리트로포이에틴의 생물학적 활성에서 시알릭산의 기능에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 대부분의 경우에 치료제로 사용되는 당은 당단백질 고유의 효능을 나타내는데 필수불가결한 역할을 하며, 특히 인간 유래 에리트로포이에틴의 경우에 있어서는 당의 역할이 절대적이다. 즉, 당이 없는 경우에는 에리트로포이에틴의 활성이 전혀 나타나지 않을 뿐만 아니라 당의 조성이나 말단의 시알릭산 함량 등에 따라 EPO의 생체내 활성이 크게 영향을 받는다.
숙주세포의 발현 과정에서 N-아세틸만노사민(N-acetylmannosamine)을 배양액에 첨가하여 EPO-Fc의 시알릭산 함량을 향상시킬 수 있다. 이러한 과정을 거쳐 수득한 EPO-Fc는 통상 시알릭산 함량이 높은 것과 낮은 것이 혼합되어 있는데, 시알릭산 함량이 높은 EPO-Fc가 그렇지 않은 것 보다 생체 내 반감기가 긴 것으로 알려져 있으므로, 시알릭산 함량이 높은 EPO-Fc를 선택적으로 생산할 수 있는 기술의 개발이 필요하다.
EPO-Fc의 생산은 형질전환 된 숙주세포를 배양하여 EPO-Fc를 대량으로 발현한 후 세포를 파쇄하고 EPO-Fc를 정제하는 과정을 거쳐야 하기 때문에, 고품질의 EPO-Fc를 대량 생산하기 위해서는 배양 기술 및 정제 기술의 최적화가 매우 중요한데, 현재까지 개발된 배양 및 정제 기술은 아직 개선의 여지가 많아 여전히 이러한 기술의 개발을 통한 EPO-Fc 제조 공정 최적화에 대한 요구가 절실한 상황이다.
등록특허공보 제897938호 (2009. 5. 8)
본 발명은 생체 내 지속성이 우수한 EPO-Fc 융합 단백질 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 시알릭산의 함량이 높은 EPO-Fc 융합 단백질 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명은 순도가 높은 EPO-Fc 융합 단백질 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명은 숙주세포 유래 불순물의 함량이 적은 EPO-Fc 융합 단백질 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
1. EPO-Fc의 시알릭산 함량이 17 mol/mol 이상이고, 숙주세포 유래 단백질 불순물이 100 ng/mg 이하로 포함하는, EPO-Fc 조성물.
2. 위 1에 있어서, 시알릭산 함량은 20 내지 28 mol/mol인, EPO-Fc 조성물.
3. 위 1에 있어서, EPO-Fc는 pI≤6.0인, EPO-Fc 조성물.
4. 위 1에 있어서, EPO-Fc는 4.5≤pI≤5.3인, EPO-Fc 조성물.
5. 위 1에 있어서, 숙주세포 유래 단백질 불순물은 EPO-Fc의 응집물 또는 절단체인, EPO-Fc 조성물.
6. 위 1에 있어서, 숙주세포 유래 단백질 불순물은 60 ng/mg 이하로 포함된, EPO-Fc 조성물.
7. 위 1에 있어서, 0.5 ng/mg 이하의 숙주세포 유래 DNA 불순물을 더 포함하는, EPO-Fc 조성물.
8. EPO-Fc 세포 배양액을 35℃ 내지 39℃ 및 6.5≤pH≤7.5의 조건 하에서 4 vvd 이하의 속도로 흐르게 하여 관류 배양액을 제조하는 단계; 상기 관류 배양액에서 EPO-Fc 정제액을 수득하는 단계; 및 상기 EPO-Fc 정제액을 음이온 교환수지에 흡착시켜 시알릭산 함량이 17 mol/mol 이상인 EPO-Fc를 포함하는 Q 용출액을 제조하는 단계를 포함하는, EPO-Fc 조성물의 제조 방법.
9. 위 8에 있어서, Q 용출액을 제조하는 단계는 EPO-Fc를 음이온 교환수지에 흡착시키는 단계; 및 0.005 내지 0.02M의 인산나트륨, 0.05 내지 0.2M의 엘-알기닌 및 0.02 내지 0.1M의 염화나트륨을 포함하는, 6.7≤pH≤7.1인 완충액으로 흡착된 EPO-Fc를 용출시키는 단계를 포함하는, EPO-Fc 조성물의 제조 방법.
10. 위 8에 있어서, EPO-Fc 정제액을 수득하는 단계는 관류 배양액을 POD 필터에 통과시키는 단계를 포함하는, EPO-Fc 조성물의 제조 방법.
11. 위 8에 있어서, EPO-Fc 조성물은 숙주세포 유래 단백질(HCP) 불순물이 100 ng/mg 이하인, EPO-Fc 조성물의 제조 방법.
12. 위 8에 있어서, EPO-Fc 세포 배양액은 2.0×105 cells/mL 이상으로 배양기에 접종되는, EPO-Fc 조성물의 제조 방법.
13. 위 10에 있어서, 관류 배양액을 POD 필터에 통과시킨 후, Protein A가 부착된 레진으로 충진된 컬럼에 통과시키는 단계를 더 포함하는, EPO-Fc 조성물의 제조 방법.
14. 위 8에 있어서, Q 용출액에 포함된 EPO-Fc의 pI는 6.0 이하인, EPO-Fc 조성물의 제조방법.
15. 위 8에 있어서, Q 용출액을 POD 필터, 한외여과 멤브레인 및 나노필터로 각각 여과하는 단계를 더 포함하는, EPO-Fc 조성물의 제조방법.
본 발명의 EPO-Fc 조성물은 EPO-Fc의 당사슬 말단의 상당 부분이 시알릭산으로 캡핑되어 있어 반감기가 증가되고 환자의 편의성이 증진된다.
본 발명의 EPO-Fc 조성물은 숙주세포 유래 단백질 및 DNA 불순물의 함량이 낮아 EPO-Fc의 순도가 높다.
본 발명의 EPO-Fc 조성물의 제조방법은 위와 같은 특성을 갖는 EPO-Fc의 선택적 정제에 적합하다.
본 발명의 EPO-Fc 조성물의 제조방법은 EPO-Fc에의 시알릭산 부착률을 현저히 향상시킴과 동시에 숙주 세포의 생존률 및 공정 효율을 향상시킨다.
도 1은 실시예 2의 EPO-Fc 등전집속 시험 결과를 나타낸다.
본 발명자들은 생산성과 시알릭산 함량의 증진을 위한 숙주세포 배양 기술, 시알릭산 함량이 높은 EPO-Fc를 선별하는 기술 및 숙주세포 유래 불순물의 제거를 위한 정제 기술에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 EPO-Fc의 시알릭산 함량이 17 mol/mol 이상이고, 숙주세포 유래 단백질(Host cell protein; HCP) 불순물이 100 ng/mg 이하로 포함하는 EPO-Fc 조성물 및 그 제조방법을 포함한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
EPO-Fc 융합 단백질은 에리트로포이에틴(Erythropoietin)에 인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 Fc 영역을 융합한 것으로서, EPO보다 증가된 생체 내 반감기를 갖는다. 생체 내 반감기의 증가는 생체 내 약효 지속성의 증가를 의미한다.
EPO의 당쇄에 존재하는 시알릭산(sialic acid)은 아시알로 당단백질(asialoglycoprotein) 수용체의 두 번째 갈락토오스기를 보호함으로써 EPO의 생체 내 활성도에 큰 영향을 미치고, 간에서의 EPO 분해의 방지를 유도하여 생체 내 반감기를 증가시킨다.
따라서 EPO-Fc 융합 단백질의 시알릭산 함량을 부착시킴으로써, Fc 융합에 의한 생체 내 반감기 증가 효과에 더하여 추가적인 생체 내 반감기 증가 효과를 얻을 수 있다.
EPO-Fc 숙주세포의 배양 과정에서 N-아세틸만노사민(N-acetylmannosamine, NAM)을 배양액에 첨가하여 EPO-Fc의 시알릭산 함량을 향상시킬 수 있다. 이러한 과정을 거쳐 수득한 EPO-Fc는 통상 시알릭산 함량이 높은 것과 낮은 것이 혼합되어 있는데, 시알릭산 함량이 높은 EPO-Fc가 그렇지 않은 것 보다 생체 내 반감기가 긴 것으로 알려져 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, EPO-Fc에 부착된 시알릭산의 수가 많을수록 pI 값이 낮아지는 점을 이용하여, 음이온 교환수지를 사용하여 시알릭산 함량이 높은 EPO-Fc를 선택적으로 정제할 수 있다. 바람직하게는, 교차결합(cross-linked)된 아가로스(agarose)를 포함하는 음이온 교환수지가 사용될 수 있다. 일 실시예에 따르면, 지이 헬스케어사(GE Healthcare)의 Q-세파로스(Q Sepharose) 레진이 사용될 수 있다.
음이온 교환수지를 사용한 정제 공정을 통하여 pI≤6.0인 EPO-Fc를 선택적으로 정제할 수 있는데, 이러한 공정으로 시알릭산 함량이 17 mol/mol 이상인 EPO-Fc를 수득할 수 있다. 일 실시예에 따르면, 4.5≤pI≤6.0인 경우 시알릭산 함량이 17 내지 28 mol/mol인 EPO-Fc를 포함하는 조성물을 수득할 수 있다. 또 다른 일 실시예에 따르면 4.5≤pI≤5.3인 경우 시알릭산 함량이 20 내지 28 mol/mol인 EPO-Fc를 포함하는 조성물을 수득할 수 있다.
EPO-Fc 생산 공정에서 숙주세포 유래 불순물(Host cell protein; HCP)이 혼입될 수 있다. 숙주세포 유래 불순물은 숙주세포 및 부원료로부터 유래할 수 있는 각종 응집물(aggregate) 및 절단체(fragment) 등의 이상펩티드를 포함하는 단백질 불순물, DNA 불순물, 내인성 바이러스, 외인성 바이러스 및 기타 입자(particle) 등을 포함할 수 있다.
이러한 불순물의 제거는 EPO-Fc 융합 단백질 조성물의 품질에 직접적인 영향을 주는 중요한 공정이며, 본 발명의 일 실시예에 따른 일련의 공정을 통하여 제조 시 숙주세포 유래 단백질 불순물이 100 ng/mg 이하, 보다 바람직하게는 60 ng/mg 이하로 컨트롤할 수 있으며, 숙주세포 유래 DNA 불순물은 0.5 ng/mg 이하로 포함되도록 하는 것이 가능하다.
본 발명의 EPO-Fc 조성물 제조방법은 다음과 같이 구성될 수 있다.
본 발명의 EPO-Fc 조성물 제조방법은 (1) EPO-Fc 세포 배양액을 35℃ 내지 39℃ 및 6.5≤pH≤7.5의 조건 하에서 4 vvd 이하의 속도로 흐르게 하여 관류 배양액을 제조하는 단계; (2) 관류 배양액에서 EPO-Fc 정제액을 수득하는 단계; 및 (3) EPO-Fc 정제액을 음이온 교환수지에 흡착시켜 시알릭산 함량이 17 mol/mol 이상인 EPO-Fc를 포함하는 Q 용출액을 제조하는 단계를 포함하도록 구성될 수 있다.
(1)의 관류 배양액은 다음과 같이 제조될 수 있다.
먼저, EPO-Fc 연구용 세포은행(RCB)으로부터 EPO-Fc 마스터 세포은행(MCB)을 구축하고 EPO-Fc 마스터 세포은행(MCB)으로부터 EPO-Fc 상용세포주은행(WCB)을 구축할 수 있다.
MCB 및 WCB의 구축을 위한 배양은 세포를 엘-글루타민(L-glutamine) 및 메토트렉세이트(methotrexate)를 포함하는 EX-cell CHO DHFR(-) 액상 배지에서 3 내지 7%의 CO2 및 37℃의 조건 하에서 계대 배양한 후 cryo vial에 분주하여 동결 보관할 수 있다.
동결 보관된 WCB의 세포주를 해동시킨 후 배지에 넣어 현탁시켜 세포를 증식시킨다. 예컨대 쉐이크 플라스크를 이용하여 CO2 incubator 설정값 3 내지 7% CO2, 37℃에서 계대배양을 50 내지 90 시간 간격으로 1:2 내지 1:6 비율로 실시할 수 있다. 이들을 여러 개의 쉐이크 플라스크로 배양하여, 배양 중인 세포가 세포배양기에 접종할 수 있는 충분한 양이 되도록 배양할 수 있다.
이 경우 EPO-Fc 배양배지를 사용할 수 있다. EPO-Fc 배양배지는 EX-cell CHO DHFR(-) 분말 배지, 엘-글루타민(L-glutamine), 메토트렉세이트(methotrexate) 및 중탄산나트륨(sodium bicarbonate)을 포함하는 것일 수 있다.
쉐이크 플라스크 배양을 통해 접종에 충분한 수의 숙주세포가 확보되면 주배양기에 세포를 접종하여 관류 배양할 수 있다. 주배양기로는 예컨대 30L 생물배양기를 사용할 수 있다.
주배양기에 접종된 후의 세포 농도는 2.0 x 105 cells/mL 이상일 수 있다.
주배양기의 배양온도는 35 내지 39℃, 36 내지 38℃ 등일 수 있다.
주배양기의 산성도는 6.5≤pH≤7.5 (pH control 이후), 6.8≤pH≤7.2 (pH control 이후) 등으로 유지되도록 할 수 있다.
관류배양 중 필요시 배양액을 채취하여 현미경으로 세포의 상태를 관찰하고 pH, 세포수, 세포활성, 글루코스 농도, 글루타민 농도, 암모니아 농도, 삼투압을 분석하여 공정 검사를 실시할 수 있다.
관류 속도(perfusion rate)는 4 vvd 이하로 통제한다. 관류 속도는 0 내지 4 vvd, 0 내지 2 vvd, 1 내지 3 vvd, 1 내지 2 vvd 등일 수 있다.
관류 배양 배지는 위 EPO-Fc 배양배지에 N-아세틸만노사민(N-acetylmannosamine)을 첨가한 배지(N-아세틸만노사민 첨가 배양배지)를 사용하거나, 위 EPO-Fc 배양배지에 N-아세틸만노사민 및 포도당을 첨가한 배지(생산배지)를 사용하거나, 이 두 배지를 순차적으로 사용할 수 있다.
생산 배지에서 예컨대 하루에 40L씩 4일 동안 관류 배양을 실시하여 총 140 내지 180kg의 EPO-Fc 생산용 세포 배양액을 수득할 수 있으며, 이와 같은 세포 배양액 수집을 1 내지 10회, 2 내지 5회 등으로 반복 수행하여 보다 많은 양의 EPO-Fc 생산용 세포 배양액을 수득할 수 있다.
위와 같이 얻어진 세포 배양액이 본 발명의 (1)의 관류 배양액이다.
본 발명의 관류 배양액을 제조하는 단계에 따라 EPO-Fc에 시알릭산(Sialic acid)이 17 mol/mol 이상, 17 내지 28 mol/mol, 또는 20 내지 28 mol/mol로 부착될 수 있다. 또한, 세포의 생존률이 향상되어 EPO-Fc 조성물의 생산성이 향상된다.
본 발명의 EPO-Fc 조성물의 제조방법은 (2) 관류 배양액에서 EPO-Fc 정제액을 수득하는 단계를 포함한다.
본 단계는 (1) 단계의 관류 배양액에 포함된 EPO-Fc 이외의 성분을 제거하는 것을 주목적으로 한다. 제거 방법은 세포 배양시 사용되는 통상적인 방법일 수 있다. 제거 방법은 하기 설명된 여과 및 정제 방법을 하나 이상 조합하여 구성될 수 있다.
(1) 단계의 관류 배양액을 회수하여 여러 단계의 여과 및 정제를 거쳐 숙주세포 유래 불순물을 제거할 수 있다. 숙주세포 유래 불순물은 숙주세포 및 부원료로부터 유래할 수 있는 각종 응집물 및 절단체 등의 이상펩티드를 포함하는 단백질 불순물, DNA 불순물, 내인성 바이러스, 외인성 바이러스 및 기타 입자 등을 포함한다.
숙주세포는 (1) 단계에서 EPO-Fc의 발현을 위해 사용된 모든 세포를 의미한다.
일 실시예에 따르면 EPO-Fc 생산용 숙주세포 배양액의 숙주세포 유래 단백질 또는 DNA 불순물 제거를 위해 POD 필터(POD depth filter)를 사용할 수 있다. POD 필터는 통상 세포 제거용으로 사용되지만 본 발명에서는 단백질 제거용으로 사용한다.
POD 필터와 함께 여과 필터를 사용하여 단백질 응집물, 절단체 및 기타 입자 등의 숙주세포 유래 단백질 불순물(Host cell protein; HCP)을 제거할 수 있다.
예컨대 POD 필터로는 머크 밀리포어사(Merck Milipore)의 Millistak+ (MA1HC10FS1)가 사용될 수 있고, 여과 필터로는 살토리우스사(Sartorius)의 살토브란 P (Sartobran P) 무균 캡슐이 사용될 수 있다.
또 다른 일 실시예에서 Protein A 정제, Low pH 바이러스 불활화 및/또는 Hydroxyapatite 정제 등으로 EPO-Fc 정제를 수행할 수 있다.
또 다른 일 실시예에서 한외여과(Ultrafiltration) 장치, 예컨대 Tangential Flow Filtration Membrane System을 사용하여 농축 및 버퍼교환을 실시할 수 있다. 버퍼교환을 통해 전도도와 산성도가 기준 안으로 들어오면 농축 및 버퍼교환 공정을 완료한다(기준: 전도도 9.0±1.0 mS/cm, 산성도 pH 6.9±0.1).
(2) 단계의 EPO-Fc 정제액은 위와 같이 제조될 수 있다.
본 발명의 EPO-Fc 조성물의 제조방법은 (3) EPO-Fc 정제액을 음이온 교환수지에 흡착시켜 시알릭산 함량이 17 mol/mol 이상인 EPO-Fc를 포함하는 Q 용출액을 제조하는 단계를 포함한다.
본 단계는 조성물에 포함된 EPO-Fc 중에서 시알릭산의 함량이 17 mol/mol 이상인 것들을 선별하는 것을 주목적으로 한다.
(2) 단계의 EPO-Fc 정제액을 교차결합(cross-linked)된 아가로스(agarose)를 포함하는 음이온 교환수지가 충진된 컬럼에 통과시켜 수행될 수 있다.
일 실시예에 따르면 지이 헬스케어사(GE Healthcare)의 Q-세파로스(Q Sepharose) 레진이 사용될 수 있으며, 예컨대 표 1의 Q Sepharose Fast Flow 레진이 사용될 수 있다.
표 1. Q Sepharose Fast Flow의 특성
Matrix 6% highly cross-linked agarose
Average particle size 90 μm
Type of medium Strong anion
Charged group -N+(CH3)3
Total ionic capacity 0.18 to 0.25 mmol Cl-/mL medium
Dynamic binding capacity1 120 mg HSA/mL medium
Flow velocity2 400 to 700 cm/h
pH stability (CIP3) 1 to 14
pH stability (Working4) 2 to 12
Storage temperature 4℃ to 30℃
Storage buffer 20% ethanol
Chemical stability All commonly used buffers, 1 M NaOH, 8 M urea, 6 M guanidine hydrochloride, and 70% ethanol
Avoid Oxidizing agents, anionic detergents, and buffers
1 Determination of dynamic binding capacity:
DEAE Sepharose Fast Flow, Q Sepharose Fast Flow, SP Sepharose Fast Flow, and CM Sepharose Fast Flow: Samples were applied at 75 cm/h until 50% breakthrough. Columns: 0.5 × 5 cm.
Buffers: 0.05 M Tris, 2 M NaCl (in the elution buffer), pH 7.5 (Q and DEAE) or 0.1 M acetate, 2 M NaCl (in the elution buffer), pH 5.0 (SP and CM).
ANX Sepharose 4 Fast Flow (high sub): Sample was applied at 300 cm/h until 10% breakthrough. Column: 1.6 × 13 cm. Buffer: 0.05 M Tris, 1 M NaCl (in the elution buffer), pH 7.5.
2 1 bar (14.5 psi, 0.1 MPa), XK 50/30 column, bed height 15 cm (SP, CM, Q, and DEAE) or 1 bar (14.5 psi, 0.1 MPa), XK 50/60 column, bed height 25 cm (ANX).
3 Refers to the pH interval for regeneration and cleaning.
4 Refers to the pH interval where the medium is stable over a long period of time without adverse effects on its subsequent chromatographic performance.
Q 용출액을 제조하는 단계는 0.005 내지 0.02M 인산나트륨을 포함하는 평형완충액으로 Q-세파로스 레진을 평형시키는 단계, Q-세파로스 레진에 EPO-Fc 정제액을 투과하여 EPO-Fc를 흡착시키는 단계, 상기 평형완충액으로 Q-세파로스 레진을 재평형시키는 단계 및 0.005 내지 0.02M 인산나트륨, 0.05 내지 0.2M 엘-알기닌 및 0.02 내지 0.1M 염화나트륨을 포함하고 산성도는 6.7≤pH≤7.1인 용출완충액을 상기 컬럼에 투과하여 EPO-Fc의 Q 용출액을 수집하는 단계를 포함하여 실시할 수 있다.
용출은 적절히 반복될 수 있다. 예컨대 용출을 4회 수행하는 경우, 1회부터 3회까지의 정제에서 수득된 Q 용출액 1번부터 3번까지는 용출 직후 초저온냉동고에 보관하고, 4회째 용출이 완료되면 Q 용출액 1번부터 4번까지를 풀링(pooling)할 수 있다.
용출 후에는 필요에 따라 POD필터를 이용하여 여과할 수 있다. POD 필터로는 머크 밀리포어사(Merck Milipore)의 Millistak+(MA1HC10FS1)가 사용될 수 있다.
필요에 따라, 위의 단계 이외에도, 여과필터를 컬럼에 장착하는 단계 및 CIP를 접촉하여 Q-세파로스 레진을 살균 세척하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일 실시예에 따르면, 여과필터는 살토리우스사(Sartorius)의 살토브란 P(Sartobran P) 무균캡슐이 사용될 수 있다.
(3) 단계를 거쳐 수득된 Q 용출액에 포함된 EPO-Fc는 pI≤6.0 이고 시알릭산 함량이 17 mol/mol 이상이다. 예컨대 4.5≤pI≤6.0 이고 시알릭산 함량이 17 내지 28 mol/mol일 수 있고, 4.5≤pI≤5.3 이고 시알릭산 함량이 20 내지 28 mol/mol일 수 있다.
본 발명의 EPO-Fc 조성물의 제조방법은 (4) Q 용출액을 POD 필터, 한외여과 멤브레인 및/또는 나노필터로 각각 여과하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 단계에 따라 EPO-Fc의 농도가 높아지고 버퍼가 교환되며 바이러스가 제거될 수 있다.
POD 필터로는 머크 밀리포어사의 Millistak+(MA1HC10FS1)가 사용될 수 있다.
한외여과(ultrafiltration) 멤브레인으로는 예컨대 Tangential Flow Filtration Membrane System을 사용할 수 있다. 예컨대 주사용수를 이용하여 membrane(Cut off: 30K)을 세척한 후 포뮬레이션 완충액을 이용하여 membrane을 평형시킨다. 포뮬레이션 완충액은 0.01M 시트르산 나트륨(Sodium citric acid), 0.1M 글리신(Glycine) 및 0.1M 염화나트륨(Sodium Chloride)을 포함하고 산성도는 pH 6.2±0.2 일 수 있다.
평형이 완료되면 목적 단백질을 약 1.5±0.3 mg/mL로 농축할 수 있다. 회수액의 단백 농도가 약 1.5±0.3 mg/mL이 되면 회수액과 같은 부피의 원액 제조용 완충액을 연속적으로 첨가하여 버퍼교환을 수행할 수 있다. 최종 회수액의 전도도와 산성도가 기준 안으로 들어오면 농축 및 버퍼교환 공정을 완료할 수 있다(기준: 전도도 12.0±2.0 mS/cm, 산성도 pH 6.2±0.2).
최종 회수액의 농축 및 버퍼교환 공정이 완료되면, 숙주 세포 또는 공정에 사용되는 부원료로부터 유래될 수 있는 바이러스를 제거하기 위하여 나노 필터(PALL(NT6DV20P1G))를 사용하여 여과를 실시할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 바이러스 여과용 필터를 세척한 후 필터에 대한 완전성 시험(integrity test)을 실시하고 원액 제조용 완충액을 바이러스 여과용 필터에 통과시켜 평형시킬 수 있다. 평형이 완료되면 농축 및 버퍼교환 공정이 완료된 최종 회수액을 30±3 psi의 압력으로 통과시켜 바이러스가 제거된 바이러스 여과액을 회수할 수 있다. 여과가 완료된 바이러스 여과용 필터는 주사용수를 이용하여 세척하고 완전성 시험을 실시할 수 있다.
바이러스 여과액에 폴리소르베이트 20(polysorbate 20)을 0.12 g/Kg의 농도로 첨가하고, 포뮬레이션 완충액을 첨가하여 단백 농도를 1.1±0.3 mg/mL로 조정하고, 제균 여과 필터로 여과하여 EPO-Fc 원액을 수득할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 포뮬레이션 완충액은 0.01M 시트르산 나트륨(Sodium citric acid), 0.1M 글리신(Glycine) 및 0.1M 염화나트륨(Sodium Chloride)을 포함하고, 산성도는 pH 6.2±0.2인 것을 사용할 수 있다. 일 실시예에 따르면, 제균 여과 필터로는 살토리우스사(Sartorius)의 살토브란 P300(Sartobran P300)이 사용될 수 있다. 제조된 EPO-Fc 원액은 분주하여 초저온냉동고에 보관할 수 있다.
EPO-Fc 원액에 포뮬레이션 완충액을 첨가하여 단백 농도를 0.5±0.1 mg/mL로 조정하고 제균 여과 필터로 여과하여 EPO-Fc 최종 원액을 제조할 수 있다. 제균 여과 필터로는 살토리우스사(Sartorius)의 살토브란 P 미디캡(Sartobran P midicap)이 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 본 발명의 일 구현예를 나타내는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : EPO- Fc 조성물 제조
<공정 1: EPO-Fc 마스터 세포은행(MCB) 제조>
EX-cell CHO DHFR(-) 액상 배지에 L-glutamine 및 methotrexate를 첨가하여 제조한 배지에 EPO-Fc 연구용 세포은행(RCB)을 접종한 후, 계대 배양으로 총 세포수 및 총 배양부피를 늘려 MCB를 구축하였다. 배양은 5.0±2.0% CO2 incubator에서 배양액의 온도가 37℃가 되도록 실시하였다.
<공정 2: EPO-Fc 상용세포주은행(WCB) 제조>
EX-cell CHO DHFR(-) 액상 배지에 L-glutamine 및 methotrexate를 첨가하여 제조한 배지에 공정 1의 MCB를 접종한 후, 계대 배양으로 총 세포수 및 총 배양부피를 늘려 WCB를 구축하였다. 배양은 5.0±2.0% CO2 incubator에서 배양액의 온도가 37℃가 되도록 실시하였다.
<공정 3: WCB 융해>
동결보관중인 공정 2의 WCB를 해동 후, EPO-Fc 배양배지(EX-cell CHO DHFR(-) 분말 배지, L-glutamine, methotrexate 및 sodium bicarbonate 포함)에 현탁시킨 후 CO2 incubator 설정값 5% CO2, 37℃에서 배양하였다.
<공정 4: 쉐이크 플라스크 세포배양>
공정 3의 배양액을 64 내지 80 시간 간격으로 계대 배양하여 세포 배양기에 접종할 수 있는 충분한 양의 세포수를 확보하였다. 계대배양은 1:3 내지 1:4 비율로 실시하며, CO2 incubator 설정값 5% CO2 및 37℃에서, EPO-Fc 배양배지를 이용하여 배양하였다.
<공정 5: 주배양기(30L 생물배양기) 생산배양>
공정 4의 배양액이 충분한 양이 된 후, 세포를 모아 2.0 x 105 cells/mL 이상이 되도록 주배양기에 접종한 후, N-acetylmannosamine을 추가로 첨가한 EPO-Fc 배양배지를 이용하여 배양하였다. 배양간 배양온도 37±1℃, pH 7.0±0.2(pH control 이후)를 유지하며 perfusion 배양하였다. 필요시 배양액을 채취하여 공정 검사를 실시하였다. 공정 검사 결과에 따라 perfusion rate을 0 내지 2 vvd로 조절하였다. 배양액 생산을 위하여 배지를 EPO-Fc 생산배지(EPO-Fc 배양배지에 N-acetylmannosamine 및 sodium bicarbonate 첨가)로 교체하여 perfusion 배양을 추가로 수행하였다. 하루에 약 40L씩 4일 동안 배양액 140 내지 180kg을 수집하여 1개의 sub-lot을 수득하였으며, 위의 과정을 16일간 총 4번 반복하여 총 4개의 sub-lot이 수집될 때 까지 배양을 실시하여 EPO-Fc 생산용 숙주세포의 배양액(관류 배양액)을 수득하였다.
<공정 6: 배양액 회수 및 여과>
공정 5의 EPO-Fc 생산용 숙주세포 배양액을 POD필터(MA1HC10FS1) 및 여과 필터(살토브란P-무균캡슐)를 이용하여 여과 후, 관류 배양액의 여과액을 수득하여 보관하였다.
<공정 7: Protein A 정제>
Protein A가 부착된 레진을 충진한 컬럼을 평형완충액(0.01M 인산나트륨)으로 평형시키고 공정 6의 여과액을 컬럼에 흡착시킨 뒤 세척완충액(0.7M 엘-알기닌(L-Arginine), pH 5.7±0.05, COND 37.0±1.0 mS/cm)을 이용하여 세척하고 용출완충액(0.02M 무수초산 나트륨(Sodium Acetate), 0.2M 엘-알기닌(L-Arginine), 7.94%(v/v) 글리세롤(Glycerol), pH 3.7±0.05)을 이용하여 목적 단백질(EPO-Fc)을 용출 후 보관하였다.
<공정 8: Low pH 바이러스 불활화>
공정 7의 정제액을 pH 측정하여 기준에 적합하지 않으면 pH조절 완충용액(1M 수산화나트륨(NaOH), 10% 초산(Acetic acid))을 첨가하여 pH(3.7±0.05)를 조정하고 2시간 교반하며 공정을 수행하였다. 수행 후 pH조절 완충용액(1M 수산화나트륨(NaOH), 10% 초산(Acetic acid))을 이용해 약 pH 6.9±0.1로 조정하였다.
<공정 9: Hydroxyapatite 정제>
고정상(Hydroxyapatite)을 충진한 컬럼에 여과 필터(살토브란P-무균캡슐)를 장착하고 평형완충액(0.01M 인산나트륨)으로 평형시키고 공정 8의 정제액을 컬럼에 흡착시킨 뒤 여과 필터(살토브란P-무균캡슐)를 제거하고 용출완충액(0.1M 인산나트륨(Sodium Phosphate), 0.1M 엘-알기닌(L-Arginine), pH 6.9±0.1)을 이용하여 목적 단백질을 용출 후 보관하였다.
<공정 10: 한외여과 농축 및 버퍼교환 1>
공정 9의 정제액을 한외여과장치(Membrane: Cut off 30K, 0.5m2 포함)를 이용하여 농축 후 평형완충액(0.01M 인산나트륨)을 연속적으로 첨가하여 버퍼교환을 진행하였다. 전도도와 pH가 기준 안으로 들어오면 공정을 완료하고 농축 및 버퍼교환 1 Retentate 액을 수집하여, EPO-Fc 정제액을 수득하였다.
<공정 11: Q Sepharose 정제>
고정상(Q Sepharose)을 충진한 컬럼에 여과 필터(살토브란P-무균캡슐)을 장착하고 0.1M 인산나트륨(Sodium Phosphate)을 포함하는 평형완충액으로 Q Sepharose 레진을 평형시키고, 공정 10의 EPO-Fc 정제액을 컬럼에 흡착시킨 뒤 여과 필터 살토브란P-무균캡슐을 제거하고, 평형완충액으로 Q Sepharose 레진을 재평형시킨 후, 용출완충액(0.01M 인산나트륨 (Sodium Phosphate), 0.1M 엘-알기닌(L-Arginine), 0.05M 염화나트륨(Sodium Chloride), pH 6.9±0.1)을 이용하여 목적 단백질을 용출하여, EPO-Fc의 Q 용출액을 수득하여 보관하였다.
<공정 12: Q 용출액 해동 및 여과>
보관된 공정 11의 Q 용출액을 해동하여 pooling하고, POD필터(MA1HC054H1)를 Formulation 완충액(0.01M 시트르산 나트륨(Sodium citric acid), 0.1M 글리신(Glycine), 0.1M 염화나트륨(Sodium Chloride), pH 6.2±0.2)으로 평형하고, 공정 11의 Q 용출액을 통과시켜 여과하였다.
<공정 13: 한외여과 농축 및 버퍼교환 2>
공정 12의 Q Pooling 여과액을 한외여과장치(Membrane: Cut off 30K, 0.1m2 포함)를 이용하여 목표 단백 농도로 농축 후 Formulation 완충액(0.01M 시트르산 나트륨(Sodium citric acid), 0.1M 글리신(Glycine), 0.1M 염화나트륨(Sodium Chloride), pH 6.2±0.2)을 연속적으로 첨가하여 버퍼교환 공정을 진행하였다. 전도도와 pH가 기준 안으로 들어오면 공정을 완료하고, 농축 및 버퍼교환 2 Retentate 액을 수집하였다.
<공정 14: 나노필터 여과>
나노필터(Pall(NT6DV20P1G))에 Formulation 완충액(0.01M 시트르산 나트륨(Sodium citric acid), 0.1M 글리신(Glycine), 0.1M 염화나트륨(Sodium Chloride), pH 6.2±0.2)을 흘려 평형 한 후, 공정 13의 농축 및 버퍼교환 2 Retentate 액을 흘려주어 공정 13의 농축 및 버퍼교환 2 Retentate 액에 존재할지 모르는 바이러스를 제거하였다.
<공정 15: EPO-Fc 원액 제조>
공정 14에서 수득된 바이러스 여과액에 Polysorbate 20을 0.12 g/Kg의 농도로 첨가하고 Formulation 완충액을 이용하여 단백농도를 조정하고 제균여과 필터(살토브란 P300)를 이용해 제균 여과하여 원액 단백 농도(기준: 1.1±0.3 mg/mL)로 맞춰 EPO-Fc 원액을 제조한 후 보관용기에 분주하여 초저온냉동고에 보관하였다.
<공정 16: EPO-Fc 최종 원액 제조>
공정 15의 EPO-Fc 원액을 Water bath에서 해동 후 Formulation 완충액(0.01M 시트르산 나트륨(Sodium citric acid), 0.1M 글리신(Glycine), 0.1M 염화나트륨(Sodium Chloride), pH 6.2±0.2 polysorbate 20 0.12 g/Kg)을 첨가하여 단백농도를 0.5±0.1 mg/mL 로 제조한 후 제균 여과 필터(살토브란 P midicap)로 제균 여과하여 EPO-Fc 최종원액을 제조하였다.
실시예 2: EPO- Fc 조성물의 순도 검사
<검사 1: 숙주세포 유래 단백질(펩티드) 불순물 함량 시험>
EPO-Fc 최종원액의 숙주세포 유래 단백질 불순물 함량을 검사하기 위하여, CHO host cell protein kit를 이용하여 다음과 같이 시험을 실시하였다. 1) 표준액은 kit 내 제공된 표준액을 희석하여 사용하였고, 2) 검액은 희석버퍼로 희석하여 준비하였고, 3) Spiked 검액은 표준액을 검액에 첨가하여 준비하였고, 4) 표준액, 검액 및 spiked 검액을 Anti-CHO(Phosphatase conjugate)와 반응시킨 후, Anti-CHO coated microtiter plate에서 반응시켰고, 5) Plate를 세척한 후 PNPP substrate을 넣고 ELISA plate reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 시료는 뱃치번호 747R0001과 747R0002를 사용하였다. 검사 결과를 아래의 표 2에 정리하였다. 숙주세포 유래 단백질 불순물 함량은 평균 60 ng/mg 이하인 것으로 확인되었다.
표 2. 숙주세포 유래 단백질(펩티드) 불순물 함량
Lot. No. 단백질 함량(ng/mg)
747R0001 58.1
747R0002 57.8
평균(Mean) 57.95
<검사 2: 숙주세포 유래 DNA 불순물 함량 시험>
EPO-Fc 최종원액의 숙주세포 유래 DNA 불순물 함량을 검사하기 위하여, 다음과 같이 시험을 실시하였다. 1) 표준액은 kit에서 제공하는 high calibrator를 희석하여 사용하였고, 2) 검액은 kit에서 제공하는 zero calibrator로 희석하여 사용하였고, 3) Spiked 검액은 표준액을 검체에 첨가하여 준비하였고, 4) Zero calibrator는 kit에서 제공하는 zero calibrator를 사용하였고, 5) Spiked zero calibrator는 zero calibrator에 표준액을 첨가하여 준비하였고, 6) 준비된 표준액, 검액, spiked 검액, zero calibrator, spiked zero calibrator를 DNA labeling 하였고, 7) Threshold system filter unit을 이용하여 stick binging을 하고 stick을 읽어 결과를 확인하였다. 시료는 뱃치번호 GC1113-PUR-0901-PR, GC1113-PUR-0902-PR, 747R0001 및 747R0002를 사용하였다. 검사 결과를 아래의 표 3에 정리하였다. 숙주세포 유래 DNA 불순물 함량은 최대 0.215 ng/mg, 평균 0.143 ng/mg으로서, 0.5 ng/mg 이하인 것으로 확인되었다.
표 3. 숙주세포 유래 DNA 불순물 함량
Lot. No. DNA 함량(ng/mg)
GC1113-PUR-0901 0.198
GC1113-PUR-0902 0.215
747R0001 검출한계 이하
747R0002 0.015
평균(Mean) 0.143
표준편차(SD) 0.111
실시예 3 : EPO- Fc 조성물 중 EPO- Fc의 당 프로파일 검사
<검사 3: EPO-Fc 당질화 자리 분석>
EPO-Fc는 EPO와 Fc region이 IgD hinge에 의해서 결합된 monomer 두 개가 hinge region에서 disulfide bond로 결합된 homo-dimer 형태의 fusion protein이다. EPO sequence에는 3 개의 N-당질화 위치(N24, N38, N83)와 1 개의 O-당질화 위치(S126)가 있다. Fc sequence의 IgD CH2 domain에도 1 개의 N-당질화 위치(N261)가 존재한다. EPO-Fc는 총 8 개의 N-당질화 위치와 2 개의 O-당질화 위치가 있을 것으로 예상된다.
실제 당질화 위치는 Protagen사 에 의뢰하여 확인하였다.
DTT와 iodoacetamide를 처리하여 단백질을 reducing/alkylating한 다음 PNGase F를 처리하여 N-당질화 자리의 당을 제거하였다. 당이 제거된 단백질과 당이 제거되지 않은 단백질에 trypsin과 GluC/trypsin을 처리하여 여러 개의 peptide로 만든 후 MALDI-MS를 이용하여 크기를 비교하고 이를 통해 N-당질화 위치를 확인하였다.
O-당질화 위치를 확인하기 위하여 HexNAc를 표지한 후 PNGase F를 처리하여 N-당질화 위치의 당들을 모두 제거하였다. Arg C, Trypsin/Glu C, Asp N/Trypsin을 처리하여 여러 개의 peptide로 만든 후 MALDI-MS를 이용하여 크기를 비교하고 이를 통해 O-당질화 위치를 확인하였다.
분석 결과를 표 4에 정리하였다. EPO sequence 에 존재하는 3 개의 N-당질화 위치(N24, N38, N83)와 1 개의 O-당질화 위치(S126)를 확인하였고 Fc sequence 의 IgD CH2 domain 에도 1 개의 N-당질화 위치(N261)가 존재함을 확인하였다.
표 4. EPO-Fc 당질화 위치 및 당질화 레벨 검사
예측된 당질화 위치 당질화 여부 확인 당질화 레벨
N24 확인됨 높음
N38 확인됨 높음
N83 확인됨 높음
S126 확인됨 중간
N261 확인됨 중간
<검사 4: EPO-Fc 단당류 조성 분석>
당단백질의 당사슬은 주로 Fucose, N-Acetylglucosamine(GluNAc), N-Acetylgalactosamine(GalNAc), Galactose, Mannose, Sialic acid 등의 단당류로 구성되며 그 외 Glucose 나 Xylose, Mannose-6-phosphate 등이 올 수도 있다.
단당류 조성 분석은 Protagen사 에 의뢰하여 실시하였다. EPO-Fc를 4 M hydrochloric acid (final concentration)로 100 ℃ 에서 4 시간 가수분해한 후 진공 원심분리기를 통해 건조한 다음 3차 증류수에 녹여 액체 크로마토그래피(High Performance Anion-Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection; HPAEC-PAD)를 이용하여 분석하였다. 농도를 알고 있는 단당표준물질을 동일한 조건에서 분석하여 각각의 단당류에 대한 면적을 비교함으로써 당단백질 몰 대비 각 단당류의 몰 비를 구하였다. 표준물질을 이용한 단당류의 몰 비는 표 5 에 정리하였다. 실험 결과 EPO-Fc 1 몰에는 Fucose 약 2.2 몰, GluNAc 약 42.1 몰, Galactose 약 9.3 몰, Mannose 약 7.0 몰이 존재함을 확인하였다.
표 5. EPO-Fc 단당류 조성 분석
샘플 단당류의 양
(pmol/10㎕)		 단백질 1몰 당 단당류의 몰비 상대량(relative amounts)
Fucose 26.12 2.23 4%
GlcN 493 42.05 69%
Galactose 109.53 9.34 15%
Mannose 82.42 7.03 12%
실시예 4 : EPO- Fc 조성물 중 EPO- Fc의 시알릭산 함량 검사
<검사 5: EPO-Fc 등전집속 시험>
제조된 EPO-Fc의 pI 값을 확인하기 위하여, 다음과 같이 Isoelectric Focusing(IEF) gel 전기영동 시험을 실시하였다. 1) 표준액 및 검액은 sample buffer(2X)와 혼합하여 준비하였고, 2) 준비된 시료를 IEF pH 3-7 gel을 이용하여 전기영동을 실시하였고, 3) 전기영동이 완료된 gel은 trichloroacetic acid 용액을 이용하여 고정하였고, 4) Brilliant Blue R, methanol, acetic acid를 혼합한 염색액을 이용하여 염색하고, methanol과 acetic acid를 혼합한 탈색액을 이용하여 탈색한 후 건조시켰다. 시료는 뱃치번호 GC1113-PUR-0902-PR을 사용하였다. 검사결과를 도 1에 정리하였다.
도 1의 시험 결과에서 보여지는 바와 같이, 생산된 EPO-Fc의 주 밴드는 pI 4.5 내지 6.0 영역에 분포하는 것으로 확인되었다.
<검사 6: 시알릭산 함량 시험>
생산된 EPO-Fc의 시알릭산 함량을 검사하기 위하여, 다음과 같이 시험을 실시하였다. 1) 표준액은 N-acetylneuraminic acid를 증류수에 희석하여 준비하였고, 2) 검액은 증류수에 희석하여 준비하였고, 3) 표준액과 검액에 Resorcinol reagent을 처리하고 가열하였고, 4) 추출용액 (1-Butanol, butyl acetate)을 이용하여 반응액을 회수하였고, 5) 회수된 반응액의 흡광도를 580 nm에서 측정하여 검액의 시알릭산 함량을 계산하고 EPO-Fc 1몰 당 시알릭산 함량 (mol/mol)을 구하였다. 시료는 뱃치번호 GC1113-PUR-0901-PR, GC1113-PUR-0902-PR, 747R0001 및 747R0002를 사용하였다. 검사 결과를 아래의 표 6에 정리하였다. 생산된 EPO-Fc의 시알릭산 함량은 20 mol/mol 이상인 것으로 확인되었다.
표 6. 생산된 EPO-Fc의 시알릭산 함량
Lot. No. 결과값(mol/mol)
GC1113-PUR-0901 21.462
GC1113-PUR-0902 21.168
747R0001 22.783
747R0002 22.821
평균(Mean) 22.058
표준편차(SD) 0.867

Claims (15)

  1. EPO-Fc의 시알릭산 함량이 17 mol/mol 이상이고, 숙주세포 유래 단백질 불순물이 100 ng/mg 이하로 포함하는, EPO-Fc 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 시알릭산 함량은 20 내지 28 mol/mol인, EPO-Fc 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 EPO-Fc는 pI≤6.0인, EPO-Fc 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 EPO-Fc는 4.5≤pI≤5.3인, EPO-Fc 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 숙주세포 유래 단백질 불순물은 EPO-Fc의 응집물 또는 절단체인, EPO-Fc 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 숙주세포 유래 단백질 불순물은 60 ng/mg 이하로 포함된, EPO-Fc 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 0.5 ng/mg 이하의 숙주세포 유래 DNA 불순물을 더 포함하는, EPO-Fc 조성물.
  8. EPO-Fc 세포 배양액을 35℃ 내지 39℃ 및 6.5≤pH≤7.5의 조건 하에서 4 vvd 이하의 속도로 흐르게 하여 관류 배양액을 제조하는 단계;
    상기 관류 배양액에서 EPO-Fc 정제액을 수득하는 단계; 및
    상기 EPO-Fc 정제액을 음이온 교환수지에 흡착시켜 시알릭산 함량이 17 mol/mol 이상인 EPO-Fc를 포함하는 Q 용출액을 제조하는 단계를 포함하는, EPO-Fc 조성물의 제조 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 Q 용출액을 제조하는 단계는 상기 EPO-Fc를 음이온 교환수지에 흡착시키는 단계; 및 0.005 내지 0.02M의 인산나트륨, 0.05 내지 0.2M의 엘-알기닌 및 0.02 내지 0.1M의 염화나트륨을 포함하는, 6.7≤pH≤7.1인 완충액으로 상기 흡착된 EPO-Fc를 용출시키는 단계를 포함하는, EPO-Fc 조성물의 제조 방법.
  10. 청구항 8에 있어서, 상기 EPO-Fc 정제액을 수득하는 단계는 상기 관류 배양액을 POD 필터에 통과시키는 단계를 포함하는, EPO-Fc 조성물의 제조 방법.
  11. 청구항 8에 있어서, 상기 EPO-Fc 조성물은 숙주세포 유래 단백질(HCP) 불순물이 100 ng/mg 이하인, EPO-Fc 조성물의 제조 방법.
  12. 청구항 8에 있어서, 상기 EPO-Fc 세포 배양액은 2.0×105 cells/mL 이상으로 배양기에 접종되는, EPO-Fc 조성물의 제조 방법.
  13. 청구항 10에 있어서, 상기 관류 배양액을 POD 필터에 통과시킨 후, Protein A가 부착된 레진으로 충진된 컬럼에 통과시키는 단계를 더 포함하는, EPO-Fc 조성물의 제조 방법.
  14. 청구항 8에 있어서, 상기 Q 용출액에 포함된 EPO-Fc의 pI는 6.0 이하인, EPO-Fc 조성물의 제조방법.
  15. 청구항 8에 있어서, 상기 Q 용출액을 POD 필터, 한외여과 멤브레인 및 나노필터로 각각 여과하는 단계를 더 포함하는, EPO-Fc 조성물의 제조방법.
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