EA022396B1

EA022396B1 - Способ очистки рекомбинантного эритропоэтина человека (epo), эритропоэтин, очищенный данным способом, и фармацевтические композиции, содержащие такой эритропоэтин

Info

Publication number: EA022396B1
Application number: EA201290135A
Authority: EA
Inventors: Вальтер Хиндерер; Штефан Арнольд
Original assignee: Ратиофарм Гмбх
Priority date: 2009-09-23
Filing date: 2010-09-23
Publication date: 2015-12-30
Also published as: MX2012003558A; CN102712688B; EP2480569B1; JP2013505276A; KR20120117728A; AU2010297530B2; CA2775012A1; BR112012006602A2; EP2480569A1; AU2010297530A1; JP5728016B2; UA107678C2; WO2011035914A1; IL218721A0; CN102712688A; EA201290135A1; ZA201202491B; US20120264688A1

Abstract

Предложен способ получения эритропоэтина (ЕРО), в частности рекомбинантного эритропоэтина человека (rhEPO), с определенным составом гликоформ и с высокой степенью чистоты, т.е. с высоким содержанием О-гликозилированных изоформ ЕРО.

Description

Изобретение относится к способу получения эритропоэтина (ЕРО), в частности ЕРО человека (гЬЕРО) в форме с высокой степенью чистоты и с определенным составом гликоформ, т.е. с высоким содержанием О-гликозилированных изоформ ЕРО. Это достигают путем применения специального сочетания этапов хроматографии.

Уровень техники

Эритропоэтин является основным гормоном, регулирующим пролиферацию и дифференцировку клеток-предшественников эритроцитов, а также поддержание физиологического уровня циркулирующих эритроцитов. У плода ЕРО вырабатывается в основном в печени, и после рождения около 90% его выработки переносится в почки. Когда уровень ЕРО снижается вследствие хронической или острой почечной недостаточности, для предупреждения анемии необходимо вводить экзогенный ЕРО. Терапевтически активный эритропоэтин человека стал доступен с момента открытия гена ЕРО и экспрессии его в клетках грызунов. Нативный эритропоэтин человека кодирует ген в хромосоме 7 в 7с|11-с|22 (Ьа\у е! а1., Ргос. Ναΐΐ. Асай. 8сС И8Л 83 (1986), 6920-6924). Рекомбинантный эритропоэтин человека поступил на рынок в 1989 году, когда РИЛ (Управление по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами) дало разрешение на его применение при лечении анемии, связанной с хронической почечной недостаточностью. Как и в случае с другими рекомбинантными гликопротеинами, которые применяют в качестве лекарственных средств, характер гликозилирования ЕРО оказывает заметное влияние на биодоступность, биологическую активность, иммуногенные свойства данного гликопротеина. Клетки-хозяева яичника китайского хомячка (СНО) и почек новорожденных хомячков (ВНК-21) играют важную роль в качестве систем экспрессии для получения гЬЕРО, в связи с чем их тщательно изучали (8аха1й е! а1., 1. Βίο1. Сйет. 262 (1987), 12059-12076; ТакеисЫ е! а1., 1. Βΐοΐ. СЬет. 263 (1988), 3657-36633; Мтй е! а1., Еиг. 1. ΒίοсЬет. 213 (1993), 39-56; Тхийа е! а1., ВюсЬет18йу 27 (1988), 5646-5654). Хорошо известно, что указанные линии клеток вырабатывают гликоформы, которые наиболее близки к гликоформам, характерным для организма человека. Также хорошо известно, что углеводы играют ведущую роль в нацеливании в организме и выведении гликопротеина (Ппскатег е! а1., Аппи. Кеу. Се11. Βΐοΐ. 9 (1003), 237-264; Не1еиш8 е! а1., 8с1еисе 291 (2001), 2364-2369). Позже, ЕМЕА (Европейское агентство по оценке лекарственных средств) и РИА одобрили новую форму эритропоэтина с двумя добавочными сайтами Ν-гликозилирования, получившую название дарбепоэтин (АРАНЕСП®). Ген ЕРО человека кодирует сигнальный пептид из 27 аминокислот и белок из 166 аминокислот с расчетной молекулярной массой 18396 Дальтон. Зрелый белок обычно включает одиночную делецию на Ν-конце, и его длина составляет 165 аминокислот. Сигнальная последовательность направляет пептид в компартменты клетки, обеспечивающие надлежащее гликозилирование, что приводит к образованию зрелого белка с тремя Ν-гликанами и одним Огликаном. Углеводные компоненты, которые составляют около 40% от общей молекулярной массы, важны для целостной биологической активности ЕРО ίη νίνο. В нескольких исследованиях было показано, что количество концевых остатков сиаловой кислоты положительно влияет на период полувыведения ίη νίνο, хотя активность ίη νί!το, т.е. связывание с рецептором, является максимальной для негликозилированной или частично гликозилированной форм (ТакеисЫ апй ΚοЪа!а, Ο1\Όο6ίο1οβ\· 1 (1991), 337-346). Степень сиалирования прямо пропорциональна времени полувыведения, и те изоформы, которые содержат меньше остатков сиаловой кислоты, гораздо быстрее выводятся из организма и, следовательно, демонстрируют низкую активность. В данном контексте РихЬ е! а1. (Апа1. СЬет. 67 (1995), 1442-1452) описали О-ацетилирование остатков сиаловой кислоты в молекуле эритропоэтина и его влияние на увеличение времени циркулирования, показав, что высокая степень О-ацетилирования остатков сиаловой кислоты увеличивает время циркулирования за счет снижения клиренса в печени.

Обычно препараты ЕРО, полученные путем рекомбинантной экспрессии в клетках млекопитающих, особенно в клетках СНО, содержат до 50% ЕРО в виде изоформ, которые не содержат О-гликан, вследствие чего утрачивают способность к присоединению двух дополнительных остатков сиаловой кислоты на одну молекулу.

Следовательно, было бы желательно получить препарат ЕРО, который не содержал бы таких дефектных изоформ без О-гликозилирования, и разработать способы получения такого препарата.

Способы выделения/очистки ЕРО, которые известны из научной и патентной литературы, включают различные этапы хроматографии. Чаще всего применяют анионообменную хроматографию (АОХ) и ВЭЖХ (высокоэффективную жидкостную хроматографию) с обращенной фазой (ВЭЖХ-ОФ). Также применяют другие способы хроматографии, например, хроматографию на гидроксиапатите, хроматографию гидрофобного взаимодействия (ХГВ), катионообменную хроматографию (КОХ), аффинную хроматографию (т.е. иммуноафинную или с красителями в качестве лигандов) и эксклюзионную хроматографию (гель-фильтрацию) (ЭХ). Также часто применяют некоторые промежуточные этапы, такие как концентрирование, диафильтрацию, ультрафильтрацию, диализ, осаждение этанолом, солями и другие. В Европейском патенте ЕР 205564 описан способ очистки ЕРО с применением этапа катионообменной хроматографии и последующей ВЭЖХ-ОФ.

В ЕР 205564 описана очистка ЕРО посредством анионообменной хроматографии и последующей хроматографии с ОФ и гель-хроматографии.

- 1 022396

В ЕР 205564 описано усовершенствование способа согласно заявке ЕР 228452, относящейся к выделению (в частности кислых) изоформ посредством введения дополнительного анионообменника после хроматографии с ОФ.

В ЕР 428267 описано усовершенствование способа согласно заявке ЕР 228452, относящееся к выделению (в частности кислых) изоформ посредством введения дополнительного анионообменника после хроматографии с ОФ.

В ЕР 205564 описан способ очистки, включающий аффинную хроматографию с красителем, ХГВ, хроматографию на гидроксиапатите, ВЭЖХ-ОФ и анионообменную хроматографию.

В ЕР 428878 описан способ очистки богатых сиаловой кислотой изоформ ЕРО посредством применения первого этапа анионообменной хроматографии в качестве этапа захвата и необязательного этапа промывки в кислых условиях, хроматографии гидрофобного взаимодействия, аффинной хроматографии и второго этапа анионообменной хроматографии с этапом промывки в кислых условиях.

В заявке АО99/28346 описана очистка ЕРО с получением препарата с высоким содержанием единиц Ν-ацетиллактозамина и/или ветвей с четырьмя антеннами в структуре углевода. Способ очистки начинают с получения супернататнта культуры клеток, проводят захват посредством аффинной хроматографии, проводят очистку посредством хроматографии гидрофобного взаимодействия, хроматографии на гидроксиапатите и хроматографии с обращенной фазой.

В заявке АО99/28346 описан способ восстановления и очистки гЬЕРО из культуральной среды клеток, включающий помимо прочего этапы анионообменной хроматографии, хроматографии с обращенной фазой и эксклюзионной хроматографии. В заявке АО 99/28346 описан способ получение ЕРО, включающий, по меньшей мере, этапы хроматографии с красителем, хроматографии гидрофобного взаимодействия и анионообменной хроматографии, и необязательно включающий этап гель-фильтрации.

В М1уаке е! а1., 1. ΒίοΙ. СЬет 252 (1977), 5558-5564 описана очистка ЕРО, получаемого из мочи, посредством процедуры из семи этапов, включающих ионообменную хроматографию, осаждение этанолом, гель-фильтрацию и адсорбционную хроматографию.

В Вгоибу е! а1., АгсЬ. ВюсЬет. ВюрЬув. 265 (1988), 329-336 применяли линию трансфецированных клеток ВНК для очистки ЕРО посредством хроматографии с Айг-Ое1 В1ие, анионообменной хроматографии и хроматографии с обращенной фазой. В Сокаиа е! а1., ί. СЬгота!одгарЬу 791 (1997), 109-118 описано разделение изоформ рекомбинантного ЕРО человека посредством хроматографии на диаминоэтиламиноэтиле (ДЭАЭ), следующей за этапом очистки ЕРО иммуноаффинным методом. Указанное разделение изоформ ЕРО основано на их разных р1.

В Οοΐο е! а1., Вю/ТесЬпо1оду 6 (1988), 67-71 описана очистка ЕРО посредством иммуноаффинной хроматографии, гель-хроматографии и хроматографии на гидроксиапатите.

В Нокке е! а1., Еиг. ί. ВюсЬет. 228 (1995), 981-1008 описан анализ гликанов в ЕРО, включающий обработку ПНГазой для раздельного анализа Ν-гликанов и О-гликанов. В КгвЫио аиб Μίν;·ιζ;·ι1<ί. ί. СЬгота!одгарЬу 699 (1997), 371-381 дан обзор способов анализа гликопротеинов, включая очистку ЕРО, получаемого из мочи с применением хроматографии ОФ.

В ΝίιηΙζ е! а1., Еиг. ί. ВюсЬет. 213 (1993), 39-56 описан анализ гликозилирования ЕРО, включающий расщепление ПНГазой Р, который демонстрирует, что рекомбинантный ЕРО человека, экспрессированный в клетках почек новорожденного хомячка (ВНК) и получаемый из указанных клеток, Огликозилирован только на 60%.

В ЦиеНе е! а1., В1ооб 74 (1989), 652-657 описана очистка ЕРО, полученная из клеток насекомых, причем способ очистки включает анионообменную хроматографию и ВЭЖХ, а также последующий этап аффинной хроматографии с применением лектина.

В §авак1 е! а1., ί. Вю1. СЬет. 262 (1987), 12059-12076 апб 8авак1 е! а1., ВюсЬетМгу 27 (1988) 86188626 описан анализ структуры углеводных компонентов в рекомбинантном ЕРО человека, экспрессируемом в клетках яичника китайского хомячка (СНО) и получаемого из указанных клеток. ЕРО очищали при помощи ВЭЖХ-ОФ наряду с другими способами.

В 8к|Ье11 е! а1., В1ооб 98 (2001), 3626-3634 описано изучение структуры гликанов ЕРО из сыворотки человека в сравнении с рекомбинантным ЕРО, которое продемонстрировало, что О-гликозилирование также происходит и в ЕРО, циркулирующем в крови.

В 8у1ко\У51б апб ЭопаЬие ί. Вю1. СЬет. 262 (1987), 1161-1166 определяли сайт связывания с рецептором в молекуле ЕРО (косвенно, посредством нейтрализации) с применением моноклональных антител (тАЬ). В Таблице II указано, тАЬ, направленные против последовательности аминокислот в 111-129 в молекуле ЕРО, демонстрируют наиболее сильный эффект нейтрализации, что указывает на то, что Огликан, находящийся у серина 126, может участвовать в связывании с рецептором.

Следовательно, хотя установлена значимость гликозилирования ЕРО, ни в одном из упоминаемых документов не раскрывается способ получения препарата ЕРО, который бы (ί) по существу не содержал изоформ с отсутствующим О-гликозилированием, (ίί) был очищен до фармацевтической степени чистоты, (ίίί) не был загрязнен вирусами и (ίν) был пригоден для его производства в промышленном масштабе. Данную техническую проблему решают варианты реализации, охарактеризованные в формуле изобретения и описанные ниже.

- 2 022396

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к способу выделения и очистки эритропоэтина человека (гЬЕРО) из среды, полученной при культивировании рекомбинантных клеток, при этом указанный способ включает этап хроматографии с обращенной фазой (ОФ), предпочтительно, ВЭЖХ-ОФ, и последующий этап катионообменной хроматографии (КОХ), перед которым предпочтительно осуществляют этап анионообменной хроматографии (АОХ).

Рекомбинантный эритропоэтин человека (гЬЕРО), очищенный способом согласно настоящему изобретению, подвергали нескольким аналитическим процедурам, чтобы охарактеризовать состояние Ν- и О-гликозилирования ЕРО. Как упоминалось в разделе Уровень техники, ЕРО содержит один сайт Огликозилирования на 8126, и три сайта Ν-гликозилирования на N24, N38 и N83. Было показано, что общий рисунок гликозилирования препарата ЕРО согласно настоящему изобретению в значительной степени сходен с рисунком, обнаруживаемом в международном стандарте ВРР, и эталонном коммерческом продукте. Однако для связанных с О (атомом кислорода) олигосахаридов было выявлено, что по сравнению со стандартом ВРР относительное количество негликозилированных форм ЕРО было значительно ниже, если они вообще присутствовали. Это может приводить к получению улучшенного препарата ЕРО согласно настоящему изобретению по сравнению с другими коммерческими продуктами.

Без связи с какой-либо теорией, предполагают, что практически селективное отделение О-дегликозилированных (Эс5-О) изоформ ЕРО во фракциях ВЭЖХ происходит за счет того, что отсутствует вся цепь О-углевода. В случае же Ν-гликанов различия не столь значительны. Здесь утрачивается лишь определенная антенна и редко, если вообще такое случается, гликан отсутствует полностью. Количество изоформ, утративших Ν-гликаны (минус четыре остатка сиаловой кислоты на гликан), можно было бы сильно сократить на этапе анионообменной хроматографии (АОХ). В случае, когда отсутствует О-цепь, на поверхность молекулы выходит гидрофобный фрагмент (приблизительно АК121-130), который в норме экранируется этой углеводной цепью. Действительно, при более подробном рассмотрении сайта О-гликозилирования можно заметить плотное скопление гидрофобных аминокислот поблизости от остатка серина 126. Четыре аланина входят в непосредственное окружение серина 126, а три пролина (121, 122, 129) определяют характерную гидрофобную область. Кроме того, лейцин 130 также гидрофобен и вносит определенный вклад в данный эффект. Указанный дополнительный гидрофобный сайт в молекуле ЕРО увеличивает общую силу связывания с матрицей С4 колонки для ВЭЖХ. Таким образом, форма Эс5-О элюирует в более поздний момент времени.

Согласно особенно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения предложен способ хроматографии на 5 колонках для получения ЕРО в чистой форме, применимой в качестве лекарственного вещества, указанный способ включает:

(a) аффинную хроматографию с красителем для захвата и концентрирования раствора, содержащего ЕРО, и для значительного сокращения потенциальных примесей;

(b) анионообменную хроматографию для обогащения кислыми изоформами ЕРО, дополнительного удаления примесей (например, ДНК, белков клетки-хозяина) и исключения любого лиганда-красителя, который мог выделиться из первой колонки;

(c) ВЭЖХ-ОФ при условиях, которые позволяют удалить молекулы ЕРО, не гликозилированные по сайту 8ег126, и удалить примеси;

(ά) катионообменную хроматографию для удаления растворителей, применяемых при ВЭЖХ-ОФ и агрегатов, для замены буфера и для концентрирования фракции ЕРО; и (е) эксклюзионную хроматографию в качестве финального этапа хроматографии, применяемого для удаления любых возможных оставшихся агрегатов и других примесей.

Кроме того, в способ получения ЕРО включены два специфических этапа для удаления/инактивации вирусов. Во-первых, после ВЭЖХ-ОФ элюат выдерживают в кислой смеси ацетонитрил:вода плюс 0,1% (объемные проценты) ТФУ (трифторуксусной кислоты) в течение 60-180 мин при 22±3°С. Вовторых, после финального этапа хроматографии включают этап нанофильтрации, чтобы повысить вирусную безопасность лекарственного вещества. Кроме того, было продемонстрировано, что анионообменная хроматография также является эффективной мерой для удаления вирусов. Полученное лекарственное вещество ЕРО можно подавать, например, при помощи перистальтического насоса, в контейнеры для хранения нерасфасованного лекарственного препарата объемом 250 или 30 мл, и можно хранить при <-70°С.

Следовательно, настоящий способ обеспечивает получение ЕРО с определенными характеристиками (профилем) и позволяет получать продукт с высокой степенью однородности и высокого качества. Кроме того, настоящее изобретение делает возможным получение больших количеств биологически активного ЕРО с высокой степенью чистоты и желаемым профилем О-гликозилированных изоформ ЕРО.

Чистота препарата ЕРО является высокой благодаря достижению содержания, превышающего по меньшей мере 99% от общего белка и предпочтительно превышающей 99,9% от общего белка, что определяют при помощи ВЭЖХ и гель-электрофореза. Кроме того, риск заражения вирусами и подобными частицами снижен, а, следовательно, клиническая безопасность продукта повышается за счет снижения

- 3 022396 риска инфекций. В данном контексте положительный побочный эффект применения ВЭЖХ-ОФ и органического растворителя для элюирования и хранения образца ЕРО до проведения следующего этапа в процессе очистки заключается в инактивации вирусов, которые в другом случае могут оставаться жизнеспособными в других растворителях, например, применяемых при хроматографии гидрофобного взаимодействия или ионообменной хроматографии.

В данном контексте специалист в этой области техники должен понимать, что одна важная особенность настоящего изобретения состоит в проведении ВЭЖХ-ОФ и последующего этапа КОХ, тогда как любые другие этапы хроматографии могут быть изменены или вообще исключены. Это также применимо к этапу АОХ, который, хотя и предпочтительно следует включать в способ согласно настоящему изобретению, но можно и заменить другим этапом очистки. Этап АОХ также можно исключить в зависимости от применяемого образца ЕРО и/или в том случае, если это желательно, например, для получения препарата О-гликозилированного ЕРО, но гетерологичного или с низким содержанием сиаловой кислоты.

Тот факт, что О-гликозирование ЕРО, выделенного способом согласно настоящему изобретению, было более полным, по сравнению со стандартом ВКР, указывает на то, что время полувыведения препарата ЕРО можно значительно увеличить. Следовательно, логично ожидать, что время полувыведения препарата ЕРО согласно настоящему изобретению ίη νίνο по меньшей мере близко к времени полувыведения рекомбинантных препаратов ЕРО, существовавших на рынке до настоящего времени, или является улучшенным. Это также свидетельствует о том, что фармакокинетические и фармакодинамические свойства в остальном должны быть сходны с таковыми у продуктов, существующих на рынке. ЕРО, полученный способом согласно настоящему изобретению, следовательно, особенно пригоден для применения в лекарственных препаратах для человека.

Краткое описание рисунков

Файл патента или заявки могут содержать один или несколько рисунков, выполненных в цвете, и/или одну или более фотографий. Копия настоящего патента или опубликованной патентной заявки с цветными рисунками и/или фотографиями может быть предоставлена Европейским Патентным Бюро или Бюро по патентам и товарным знакам США по запросу и при внесении необходимой оплаты.

Фиг. 1 - схема процедуры очистки для выделения специфической смеси изоформ ЕРО с высоким содержанием сиаловой кислоты и О-гликозилированных изоформ. Значимость и предназначение отдельных этапов очистки объясняется далее в описании.

Фиг. 2 - фотография окрашенного кумасси 12,5% δΌδ-РАСЕ геля (электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) фракций ВЭЖХ после расщепления ПНГазой. 5 мкг белка загружали на слот. МА, маркер молекулярной массы; ВКР, партия 1 стандарта ВКР (=биологический препарат для сравнения = смесь эпоэтина-альфа и бета); 1= образец ЕРО после анионообменной хроматографии (пул АОХ) и до этапа ВЭЖХ-ОФ; 2 - 10 = образцы элюированных фракций ЕРО, полученные после того, как пул АОХ подвергли ВЭЖХ-ОФ и применили линейный градиент растворителя, как описано в примерах; см. также табл. 6. Каждая партия ЕРО показана после расщепления Ν-гликозидазой полипептидов (ПНГаза), которая отщепляет Ν-гликаны, но оставляет присоединенный О-гликан, если он присутствует. Ниже, более тонкая полоса - это не-О-гликозилированная (Эев-О) форма. Сам по себе этот фермент может также определяться в геле, как следовая полоса в средней части геля. Левая дорожка показывает стандарт ВКР, дорожка, следующая за ним, показывает нанесение в колонку (содержит Эев-О форму, как и стандарт ВКР), после которого идут девять фракций градиентного элюирования. Можно заметить, что первые пять фракций явно не содержат Эев-О формы, которая в основном присутствует в последних трех-четырех фракций, что подтверждает тот факт, что Эев-О изоформа осталась связанной с хроматографическим материалом и элюировала из колонки в более поздний момент времени. Критерии пула регулируют остающуюся долю Эев-О изоформ.

Фиг. 3 - Фотография окрашенного Кумасси 12,5% δΌδ-РАСЕ геля. МА, маркер молекулярной массы; 1-4 = препараты ЕРО, полученные способом, как проиллюстрировано в примерах; 5+6 = стандарт ВКР, партия 1 (=биологический препарат сравнения = смесь эпоэтина-альфа и бета); 7 = пустая проба. Каждая партия ЕРО показана до (1, 3, 5) и после (2, 4, 6) расщепления ПНГазой. Сам по себе этот фермент может также определяться в геле, как следовая полоса. Стандарт ВКР проявляется двойной полосой после расщепления. Ниже, более тонкая полоса - это не-О-гликозилированная (Эев-О) форма. Можно заметить, что препарат ЕРО, полученный способом согласно настоящему изобретению, не имеет нижней полосы, что подтверждает тот факт, что Эев-О изоформу удалось удалить во время этапа ВЭЖХ.

Подробное описание изобретения

В настоящем изобретении предложен способ выделения и очистки улучшенных препаратов ЕРО лишь с незначительным содержанием изоформ, у которых отсутствует О-гликозилирование (не-Огликозилированных изоформ), или с полным отсутствием таких изоформ и, по существу, не содержащих агрегатов. Данной цели достигают путем снижения содержания не-О-гликозилированных изоформ ЕРО посредством высокоэффективной хроматографии (ВЭЖХ) с обращенной фазой (ОФ) при соответствующих условиях, и последующего применения этапа катионообменной хроматографии (КОХ). Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу очистки гликозилированных изоформ эритропоэти- 4 022396 на (ЕРО) из сложной смеси белков, при этом указанный способ включает этап анионообменной хроматографии (АОХ) и этап катионообменной хроматографии (КОХ), которые разделены этапом хроматографии с обращенной фазой (ОФ).

В настоящей заявке термин изоформа относится к препарату/фракции гликопротеина, который содержат гликопротеины, обладающие идентичной последовательностью аминокислот, но разными изоэлектрическими точками, что определяют, например, изоэлектрическим фокусированием (ИЭФ) в гелях, или разным количеством зарядов, что определяют, например, посредством капиллярно-зонального электрофореза (КЗЭ). Указанные различия отражают гетерогенность характера гликозилирования. Отдельные молекулы ЕРО могут различаться по степени, сложности, природе, количеству ветвей (антенн), и по порядку присоединенных гликозил-, сиалил- и ацетильных групп. Даже заряженные неорганические группы, такие как фосфат и сульфат, могут вносить вклад в природу специфической изоформы. Так, изоформы гликопротеина согласно настоящему изобретению характеризуются своей особой изоэлектрической точкой и своей идентичной последовательностью аминокислот, и, следовательно, каждая изоформа может на самом деле включать много разных молекул ЕРО в строгом химическом смысле.

В соответствии со способом согласно настоящему изобретению анионообменную хроматографию применяют предпочтительно для отбора изоформ ЕРО, в частности кислых изоформ ЕРО с высоким содержанием сиаловой кислоты; см. также фиг. 1. Согласно настоящему изобретению кислые изоформы ЕРО включают те изоформы, в которых высоко содержание гликозил-, и предпочтительно сиалил-групп, благодаря чему они проявляют низкую (кислую) р1. Рекомбинантный ЕРО человека, когда проводят его анализ методом В>>А из надосадочной жидкости культуры клеток, демонстрирует широкий профиль изоформ по изоэлектрической точке (р1), и максимально обнаруживают 14 разных изоформ с диапазоном р1 3-9 (Сокаиа с1 а1., 1. СЬготаЮдг. 791 (1997), 109-118). Изоформы ЕРО появляются в основном из-за их разного содержания гликозилов в сочетании с разным числом отрицательно заряженных концевых остатков сиаловой кислоты. Известно, что формы ЕРО, в которых больше остатков сиаловой кислоты, и, следовательно, более кислая р1, обладают более высокой биологической активностью и терапевтической ценностью, поскольку концевые остатки сиаловой кислоты на углеводных структурах препятствуют быстрому выведению ЕРО ίη νίνο по пути асиалового рецептора.

Этап анионообменной хроматографии можно проводить с применением анионообменных смол или мембран, которые содержат диэтиламиноэтильные группы (ΌΕΑΕ), четвертичные аминоэтильные группы (ΟΑΕ). группы четвертичного аммония (О), диэтиламинометильные группы (ΌΕΑΜ) и/или триметиламинэтильные группы (ТМАЕ) в качестве функциональных групп. Примерные анионообменные материалы включают Оо\\е\.РТМ. 1, поставляемый компанией Оо\у сЬеписа1 сотрапу, ЛС.РТМ. (например, тип 1, 2, 4), Вю-Ке\.КТМ. 5, ΌΕΑΕ Вю-Се1 1, Масго-Ргер.КТМ. ΌΕΑΕ, поставляемые компанией ВюКа4 ЬаЬога1ог1е8, анионообменную смолу 1 типа, поставляемую компанией ΕΚΙιιόπι Тес1то1оДе5 1пс., Зоигсе 0, ΑΝΧ-сефарозу 4, ΌΕΑΕ сефарозу (например, тип СЬ-6В, ЕЕ), Ц-сефарозу, СарЮ Ц, СарЮ 8, поставляемые компанией ΟΕ НеаЬЬсате, ΑΧ-300, поставляемый компанией Ре^к^ηΕ1те^, Л5аЫрак Ε8-502Ο ΑXрак νΑ (например, тип 624, С), ШС ΌΕΑΕ, поставляемые компанией ЗЬоко ΑιικιΟι 1пс., Αιι^ιΙ^.ΡΤΜ. ΙΚ.Α-96, ТоуореаткКТМ. ΌΕΑΕ, Т8Кде1 ΌΕΑΕ, поставляемые компанией То5оЬ Вю501епсе СтЬН, Ми51ап§ Ц, поставляемый компанией Ра11 СогрогаОоп. Согласно предпочтительному варианту реализации способа согласно настоящему изобретению этап анионообменной хроматографии проводят с применением Ц-сефарозы; также см. Примеры. Как было описано, исключение основных изоформ с низким содержанием остатков сиаловой кислоты и отбор кислых изоформ ЕРО с высоким содержанием остатков сиаловой кислоты, соответственно, предпочтительно проводят в линейном градиенте соли от 0 до 200 мМ №-1С1 в буфере, содержащем 20 мМ Трис-НС1 при рН приблизительно 7,0.

Кроме того, в соответствии со способом согласно настоящему изобретению этап хроматографии с обращенной фазой применяют для отбора О-гликозилированных изоформ ЕРО. Как описано в разделе Примеры, такие изоформы ЕРО можно элюировать в линейном градиенте органического растворителя, предпочтительно, 0-70% ацетонитрила в воде, содержащего около 0,1% ТХУ. Дополнительно, или в качестве альтернативы применяют изократическое элюирование ЕРО с растворителем. Включающим ацетонитрил и около 0,1 ТФУ в воде. Средства и способы проведения хроматографии с обращенной фазой (ОФ) хорошо известны специалистам в данной области техники; см. также известный уровень техники, на который есть ссылки в разделе Уровень техники, выше. Предпочтительно этап хроматографии с ОФ включает высокоэффективную жидкостную хроматографию с обращенной фазой (ВЭЖХ-ОФ). Обычно ВЭЖХ-ОФ проводят с применением смол, которые в качестве функциональных групп содержат метил-, бутил-, пентил-, пропил- и/или октальные группы. Согласно предпочтительному варианту реализации способа согласно настоящему изобретению ВЭЖХ-ОФ проводят с применением коммерческого материала С4 для хроматографии с обращенной фазой. Примерные материалы обращенной фазы включают: Уу4ас 214ТРВ1015, С4 поставляемый компанией Сгасе Оа\л5оп; Оа15орак ЗР-300-15-С4-В10, поставляемый компанией ΌΑΙ80 Еше СЬет. СтЬН;УМС Се1 Ви1у1 8рЬат15сЬ С4, 15мкм, 300А, поставляемый компанией УМС Бигоре СтЬН; Дир11ег 15мкм, С4, 300Α, поставляемый компанией РЬепотепех.

Более предпочтительно, применяют Уу4ас С4 (Видак), состоящий из частиц геля, на поверхности которого присутствуют цепи С4-алкилов. Отделение ЕРО от белковых примесей основано на разной силе

- 5 022396 гидрофобных взаимодействий. Элюирование проводят в градиенте ацетонитрила в воде в присутствии разбавленной трифторуксусной кислоты. Обычно часть пика ЕРО требуется отсекать посредством фракционирования. Например, среди ряда из примерно 9 или 10 элюируемых фракций, содержащих ЕРО, последние одну-четыре фракции, которые, как правило, могут составлять до 40% от всего пика ЕРО, следует сливать, тогда как оставшийся пул подвергают дальнейшей очистке на последующих этапах; см. также фиг. 2.

Согласно настоящему изобретению препаративную ВЭЖХ-Оф обычно проводят при высоком давлении > 10 бар (на препаративной колонке до 30-40 бар) и с маленькими гранулами (5-10 мкм), обычно силикагелем, что приводит к более хорошему разрешению. Предпочтительно, рН растворителей, подкисленных ТФУ, составляет приблизительно 2. Загрузка элюата АОХ при низкой концентрации ацетонитрила (например, 10% или чистая вода) и повышение градиента концентрации ацетонитрила будет приводить к элюированию изоформ ЕРО.

В данном контексте очевидно, что ВЭЖХ-ОФ, применяемая в соответствии со способом согласно настоящему изобретению, значительно отличается от обычной хроматографии ОФ (ХОФ), которую проводят при низком давлении (также называется способ с низким давлением, <10 бар, обычно 3±5 бар). Например, ХОФ обычно проводят с гранулами 15 мкм или гранулами 30 мкм, как описано в заявке на международный патент АО 03/045996 (РР-8оигсе 30). Кроме того, хотя можно применять органический растворитель. Как и при ВЭЖХ, этап ХОФ в заявке АО 03/045996 начинают после осаждения сульфата аммония с содержанием 0,24 М сульфата аммония в пробе, что было бы не желательно для ВЭЖХ, но исключительно пригодно для ХГВ (хроматографии гидрофобных взаимодействий), в которой для элюирования обычно применяют понижающийся градиент соли. Следовательно, ХОФ, которая описана в заявке на международный патент АО 03/045996, проводят системе только водных растворителей, т.е. буфере Трис/ НС1 при рН 7, поскольку до этого не был описан подходящий способ для быстрого разделения органического растворителя и позволяющего избежать образования/перемещения агрегатов в препарате ЕРО. Однако цена исключение этапа ВЭЖХ с применением органического растворителя -это менее эффективное разделение изоформ ЕРО, например, вследствие более крупных гранул, применяемых в ХОФ и менее строгих условий разделения. Так или иначе, возможности разделения при ВЭЖХ-ОФ превосходят возможности при ХОФ.

Еще один важный фактор, влияющий на эффективность схемы очистки, - это катионообменная хроматография (КОХ), которую проводят на третьем этапе, непосредственно после ВЭЖХ. Этот этап является новаторским, что касается способа его применения. После хроматографии с ОФ ЕРО необходимо быстро подвергнуть замене буфера, поскольку в кислом ацетонитриле ЕРО не стабилен, т.е. со временем и при повышении температуры происходит постепенное образование агрегатов. Кроме того, для последующей гель-хроматографии, которую применяют в качестве конечного этапа, объем образца должен быть очень мал, т.е. концентрацию ЕРО на этапе с ОФ необходимо значительно повысить. С другой стороны, объединенная фракция после ВЭЖХ-ОФ обладает значительно большим объемом в связи с относительно малым градиентом, который требуется для отделения Эек-О-формы. Согласно настоящему изобретению был разработан этап КОХ с применением выбранного материала (Масгоргер 8) вместо применения стандартного этапа ультра-/диафильтрации, который широко применяется, но является слишком затратным по времени способом. КОХ позволяет достигать чрезвычайно высокой скорости и допускает применение ацетонитрила в высоких концентрациях. Ввиду того факта, что ЕРО заряжен положительно в кислой среде, он сильно связывается и десорбируется при очень большом градиенте, в маленьком объеме и при высокой концентрации в желаемом буфере. Неожиданно оказалось, что КОХ также приводит к отделению агрегатов ЕРО, которые неминуемо образуются в ацетонитриле, поскольку выясняется, что агрегаты ЕРО не элюируют, а остаются в колонке и элюируют в дальнейшем с раствором С1Р в составе регенерата. Таким образом, согласно настоящему изобретению этап катионообменной хроматографии применяют после этапа хроматографии с ОФ, в частности ВЭЖХ-ОФ для замены буфера, концентрирования ЕРО и исключения агрегатов ЕРО; см. также фиг. 1.

Доступны разные типы катионообменных материалов под разными названиями и производимые разными компаниями, такие как Βίο-Кех.КТМ. (например, тип 70), СКе1ех.КТМ. (например, тип 100), Масго-Ргер.КТМ. (например, тип СМ, Ηί§Κ 8, 25 8), АО.КТМ (например, тип 50А, МР,) поставляемые компанией ВюКай ЬаЪогаФпек; АСХ 2, поставляемый компанией ОрКегдеи, Эо\уех.РТМ. МАС-3, поставляемый компанией Эо\у сКетюа1 сотрапу, Мик1аид С и Мик1аид 8, поставляемые компанией Ра11 Согрогайои, Целлюлоза СМ (например, тип 23, 52), Курег-Ό, РаШ8рЬеге, поставляемые компанией АКа1таи р1с, АтЪегШе.КТМ. 1КС (например, типы 76, 747, 748), АтЪегШе.КТМ. ОТ 73, Тоуореаг1.КТМ (например, типы 8Р, СМ, 650М), поставляемые компанией ТокоК Вюкаеисе ОтЪН, СМ 1500 и СМ 3000, поставляемые компанией ВюСШот ЬаЪк, 8Р-8ерКагоке.ТМ., СМ-8ерКагоке.ТМ., поставляемые компанией ОЕ НеаИЪсаге, пористые смолы, поставляемые компанией Рег8ерОуе Вюкук1етк, АкаЫрак Е8 (например, тип 502С), СХрак Р, 1ЕС СМ (например, тип 825, 2825, 5025, ЬО), 1ЕС 8Р (например, тип 420Ν, 825), 1ЕС СА (например, тип ЬО, 825), поставляемые компанией 8Коко Атепса 1ис., катионообменная смола 50А, поставляемая компанией ЕюКгот ТесЬио1од1ек 1ис. Предпочтительно, чтобы материал катионообменной смолы представлял собой материал с сильным обменом катиона- 6 022396 ми, такой как Масго-Ргер.КТМ. Ηί§1ι 8 или 258, МасгоСар 8Р, Тоуореаг1.КТМ. 8Р 650М, 8оигсе δ, 8Р Сефароза или РОЬУСАТ А. Согласно одному варианту реализации катионообменный материал - это катионообменный материал на основе сульфопропила. Согласно одному предпочтительному варианту реализации способа согласно настоящему изобретению этап катионообменной хроматографии проводят с применением Масго-Ргер Ηί§1ι 8; также см. раздел Примеры.

Согласно предпочтительному варианту реализации способа согласно настоящему изобретению перед описанными выше этапами хроматографии проводят аффинную хроматографию в качестве этапа захвата. Обычно этап аффинной хроматографии проводят с применением смолы на основе красителей, например, коммерчески доступной синей сефарозы (В1ие 8ерЬаго5е); также см. раздел Примеры. Предпочтительно, чтобы этапы хроматографии при реализации способа согласно настоящему изобретению проводили в следующем порядке:

(a) этап аффинной хроматографии в качестве этапа захвата;

(b) этап анионообменной хроматографии;

(c) этап хроматографии с обращенной фазой и (й) этап катионообменной хроматографии; см. также фиг. 1.

На первом этапе в ходе хроматографии с красителями главным образом удаляют примеси протеаз. В качестве красителя предпочтительно применяют триазиновые красители, такие как цибакрон® синий (СтЬасНгоп® Ь1ие). Также подходят другие триазиновые красители. Несущий материал для хроматографии с красителем не критичен, однако предпочтительно применяют несущий материал на основе полисахаридов, например сефарозу, предпочтительно сефарозу 6 Ра§1 Р1о\\\ Обогащение изоформами ЕРО с высоким содержанием остатков сиаловой кислоты согласно настоящему изобретению проводят на последующих этапах хроматографии; также см. фиг. 1.

Согласно одному предпочтительному варианту реализации способа согласно настоящему изобретению элюирование ЕРО на одном или более этапах хроматографии проводят путем ступенчатого или градиентного элюирования. Термины ступенчатое элюирование и способ ступенчатого элюирования, которые взаимозаменяемо употребляются в настоящей заявке, относятся к способу, при котором концентрацию вещества, которое хотят элюировать, т.е. растворить связанное соединение из материала, повышают или понижают единовременно, т.е. непосредственно с одного значения/уровня до следующего значения/уровня. При таком ступенчатом элюировании одно или несколько условий, например рН, ионную силу, концентрацию соли, концентрацию органического соединения и/или скорость потока при хроматографии меняют все сразу с одного, например, начального значения до второго, например конечного. Это означает, что условия меняют поступательно, т.е. пошагово, в отличие от постепенного линейного или нелинейного изменения. При способе ступенчатого элюирования новую фракцию отбирают после повышения каждого из перечисленных условий: ионной силы или содержания органического соединения. Указанная фракция содержит соединения, десорбированные с ионообменного материала при соответствующем повышении ионной силы и гидрофобности, соответственно. После каждого повышения условия поддерживают неизменными до тех пор, пока не перейдут на следующий этап способа элюирования. Обычно при промышленном производстве, если возможно, градиентное элюирование заменяют ступенчатым или изократическим элюированием.

В данном контексте любой из этапов хроматографии, проводимых в соответствии со способом согласно настоящему изобретению, можно проводить либо градиентным, либо изократическим способом; для обзора см., например, 8сйеШидег апй Сагг, ί. СЬгоша1одгарйу. 1109 (2006), 253-266. В частности и этап ВЭЖХ-ОФ, и этап анионообменной хроматографии предусматривают применение изократического элюирования вместо линейного градиента. Следовательно, согласно одному варианту реализации способа согласно настоящему изобретению этап ОФ и/или АОХ проводят посредством изократического элюирования.

На последующем этапе хроматографии в способе согласно настоящему изобретению препарат ЕРО, полученный на этапе катионообменной хроматографии (КОХ), проходит дополнительную очистку при помощи эксклюзионной хроматографии (ЭХ), которая позволяет исключить потенциальные димеры, агрегаты более высокой степени и нежелательные мелкие молекулы, такие как технологические примеси, а также провести замену буфера для получения конечного препарата, если есть необходимость. Обычно этап эксклюзионной хроматографии проводят с применением среды для гель-фильтрации, которую выбирают из группы, включающей Супердекс (8ирегйех), Сефакрил (8ерЬасгу1), Сефадекс (8ерйайех), Сефарозу (8ерйаго5е), Фрактогель (Ргас1оде1), Тойоперл (Тоуореаг1) и Вю-Ое1. Предпочтительно проводить эксклюзионную хроматографию с применением коммерческого Супердекса-8200; также см. раздел Примеры.

Для достижения более высокой концентрации продукта в препарате ЕРО, полученного после КОХ, элюат подвергают дальнейшему концентрированию перед гель-фильтрацией (ЭХ). Его обычно проводят путем ультрафильтрации с применением УФ-мембраны с отсекаемой массой 5-10 кДа, что приводит приблизительно к 10-кратному концентрированию УФ-ретената, и во фракции, отправляемой на ЭХ, концентрация ЕРО составляет приблизительно от 5 до 20 мг на мл; также см. раздел Примеры.

- 7 022396

Для удаления потенциальных вирусов в способ согласно настоящему изобретению включают дополнительный этап отфильтровывания вирусов на тупиковом фильтре. Указанную фильтрацию проводят при помощи специальной мембраны, разработанной для удаления частиц размером 15 нм, такой как мембрана Иаиоуа 15Ν (ЛкаЫ). В качестве альтернативы можно применять фильтрационные установки для тупиковой нанофильтрации, такие как РЛЬЬ ИШрот УЕ Сгабе ИУ20 или капсулы или картриджи Μί1Нроте Упеюке ΝΡΡ. Особенно для мелких вирусов без оболочки (например, парвовирусов) практически нет других средств удаления или инактивации вирусов. Стерильная отфильтрованная объединенная фракция для ЭХ проходит через тупиковый фильтр с соответствующей мембраной, и указанный фильтрат представляет собой конечную нерасфасованный лекарственный препарат. В качестве альтернативы между УФ-концентрированием и эксклюзионной хроматографией можно включать этап нанофильтрации. Следовательно, способ согласно настоящему изобретению может включать перед одним или более этапами хроматографии этап ультрафильтрации или, необязательно, этап нанофильтрации, последний предпочтительно в качестве конечного этапа; также см. фиг. 1.

Согласно конкретному предпочтительному варианту реализации способ согласно настоящему изобретению включает следующие этапы:

(b) этап анионообменной хроматографии;

(c) этап хроматографии с обращенной фазой (ОФ);

(б) этап катионообменной хроматографии;

(е) этап эксклюзионной хроматографии;

(ί) этап нанофильтрации; и (д) этап ультрафильтрации перед этапом (а), (Ь) и/или (е).

Содержание продукта в разных фракциях можно определять при помощи δΌδ-РЛСЕ в качестве технологического контроля, и избранные фракции можно объединять или сливать, при необходимости; например, см. фиг. 2, где показан контроль элюирования ЕРО на этапе ВЭЖХ-ОФ.

Согласно одному предпочтительному варианту реализации ЕРО, очищенный в соответствии со способом согласно настоящему изобретению, представляет собой рекомбинантный ЕРО человека. Таким образом, молекулу ЕРО предпочтительно получают путем индукции экспрессии гена, кодирующего ЕРО, в клетке-хозяине. Под клеткой-хозяином понимают клетку животного или человека, геном которой содержит активный ген ЕРО, и указанный ген ЕРО транскрибируется и транслируется во время культивирования указанной клетки в бессывороточной среде. Ген ЕРО может быть введен в указанную клетку в виде экзогенного гена, предпочтительно с регулирующими элементами (например, см. заявки на Европейский патент ЕР-В 0148605 и ЕР-В 0209), может уже присутствовать в клетке-хозяине в виде активного эндогенного гена или может быть активирован как эндогенный неактивный ген. Указанной активации эндогенных генов можно достигнуть посредством специфического введения регулирующих элементов в геном, например, посредством гомологичной рекомбинации. В заявках на Международный патент \УО 91/09955 и \УО 93/09222 описаны примеры таких способов.

В качестве клеток-хозяев обычно применяют клетки млекопитающих. Если вводят экзогенный ген ЕРО человека, в качестве клеток-хозяев можно применять клетки СНО или ВНК. Если для экспрессии применяют эндогенный ген ЕРО, целесообразно применять клетки человека, такие как клетки почек, печени или лимфоидной ткани. Предпочтительно ЕРО представляет собой рекомбинантный ЕРО человека, полученный из клеток СНО. Рекомбинантное получение ЕРО в клетках СНО обычно проводят с добавлением в культуральную среду эмбриональной бычьей сыворотки и необязательно - бычьего инсулина. В результате препарат ЕРО, полученный таким способом, несет потенциальный риск инфицирования разными агентами, вызывающими губчатый энцефалит, поскольку он может содержать по меньшей мере следовые количества таких агентов животного происхождения даже после очистки. Известно, что культивирование в бессывороточной среде клеток СНО, содержащих ген ЕРО, можно проводить посредством способов, известных из уровня техники; например, см. заявки на Европейский патент ЕР 1394179, ЕР 0513738 и ЕР 0267678, а также общее описание в Ка\уатоЮ е! а1., Лиа1уИса1 Вюсйет. 130 (1983) 445-453, Ко\\аг апб Егапек,, Ме1йоб8 ίη Еи/уто1оду 421 (1986), 277-292, ВауМег. Ехрсо1оду 271 (1981), 45-51, заявках на Европейский патент ЕР 0248656, ЕР 0481791, ЕР 0307247, ЕР 0343635, Международной заявке на патент \УО 88/00967, раскрытие содержания которых включено в настоящей документ посредством ссылки. Производные и фрагменты ЕРО, которые обладают аналогичной активностью и которые получают после культивирования клеток-хозяев, вырабатывающих ЕРО, можно также получить в чистой форме при помощи способов согласно настоящему изобретению. Последовательности ДНК и белка для ЕРО человека описаны, например, в заявках на Европейский патент ЕР 0205564 и ЕР 0209539.

В целях получения ЕРО клетки-хозяева, содержащие ген ЕРО, можно адаптировать к среде, которая не содержит белков из природных источников, путем пересева в малые объемы среды. Адаптированные клетки необязательно хранят замороженными при низких температурах, берут по мере необходимости из общепризнанного банка клеток и распределяют в бессывороточной среде, как описано, например, в заявке на Европейский патент ЕР 1394179. Для очистки надосадочной жидкости бессывороточной среды клетки-хозяева предпочтительно удаляют, и среду подвергают способу очистки согласно настоящему

- 8 022396 изобретению после фильтрации. Перед осуществлением способа очистки можно проводить дополнительную фильтрацию, если необходимо отделить загрязнения или остатки клеточного материала и/или провести концентрирование посредством ультрафильтрации.

Согласно дополнительному аспекту настоящее изобретение относится к препарату гликозилированных изоформ ЕРО, очищенных при помощи способа согласно настоящему изобретению, который описан выше, и который реализуют предпочтительно, как проиллюстрировано в разделе Примеры. Обычно ЕРО представляет собой рекомбинантный ЕРО человека. Преимущественно, препарат ЕРО согласно настоящему изобретению по существу не содержит не-О-гликозилированных изоформ ЕРО. Термин по существу не содержит не-О-гликозилированных изоформ ЕРО означает, что препарат ЕРО согласно настоящему изобретению обычно содержит менее 10% не-О-гликозилированных изоформ ЕРО, предпочтительно менее 5% не-О-гликозилированных изоформ ЕРО и преимущественно менее 1% не-Огликозилированных изоформ ЕРО. Иными словами препарат ЕРО согласно настоящему изобретению обычно содержит по меньшей мере 90% О-гликозилированных изоформ ЕРО, предпочтительно по меньшей мере 95% О-гликозилированных изоформ ЕРО, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% О-гликозилированных изоформ ЕРО, благодаря чему препарат ЕРО согласно настоящему изобретению может отличаться от препаратов ЕРО, очищенных способами, известными в технике; например см. страницу Технических требований к проектируемой системе, как проиллюстрировано на фиг. 2 и 3. Основные способы анализа, которые позволяют охарактеризовать состояние гликозилирования, включают время-пролётную ионизацию лазерной десорбцией с использованием матрицы (ΜΑΕΌΙ-ΤΟΡ-Μ8) и высокоэффективную анионообменную хроматографию-импульсное амперометрическое детектирование (НРАЕС-РАО). Другие способы анализа, которые позволяют охарактеризовать указанные образцы, включают δΌδ-РАСЕ, изоэлектрическое фокусирование (ΙΕΡ), УФ, СИ, флуоресцентную спектроскопию и ЯМР. Например, определение уровня О-гликозилирования препаратов ЕРО можно проводить при помощи ΜΑΣΌΙ-ΤΟΡ-Μδ анализа типичных пептидов молекулы ЕРО после разделения смеси пептидов при помощи С4-фазы в ходе ВЭЖХ-ОФ согласно монографии Европейской Фармакопеи. Тогда как негликозилированный пептид, полученный при расщеплении с участием трипсина, содержащий мотив сер-126, обладает массой 1466,6, соответствующий пептид с мотивом СаВДАс (Нех-ΝΑε) должен обладать массой, увеличенной на 203 (т/ζ = 1669), а производное Са1-СаШАс (Нех^Ас-Нех) должно обладать массой, увеличенной на 365, что соответствует массе т/ζ = 1830. Соответствующие эксперименты, проведенные в рамках области настоящего изобретения с применением ΜΑ^^1/ΤΟΡ-Μδ анализа, подтвердили выявленный при δΌδ-РАСЕ характер препаратов ЕРО после отщепления Ν-гликанов ферментом полипептид-^гликозидазой (ПНГазой), в котором удавалось определить почти исключительно Огликозилированные формы ЕРО, тогда как в стандартных препаратах ЕРО присутствовало около 15% неО-гликозилированных изоформ.

В данном контексте минимальное значение активности ЕРО обычно составляет 100000 ΜΕ (международных единиц) на мг (гликопротеина). Согласно одному варианту реализации, препарат ЕРО согласно настоящему изобретению обладает активностью > 110000 МЕ/мг, чего удается достигнуть благодаря обогащению изоформами ЕРО, богатыми остатками сиаловой кислоты.

Таким образом, препарат ЕРО согласно настоящему изобретению исключительно пригоден для терапевтических целей. Следовательно, настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей препарат ЕРО согласно настоящему изобретению, который описан выше. В данном контексте настоящее изобретение также относится к способу получения указанной фармацевтической композиции, способу, включающему приготовление и выделение ЕРО в форме смеси гликоизоформ, которые описаны выше, и производство смеси приготовленного и выделенного указанным способом ЕРО с фармацевтичеки приемлемой основой. Согласно одному варианту реализации настоящее изобретение также относится к стабильной лекарственной форме препарата ЕРО, содержащей в качестве стабилизатора трис-(гидроксиметил)метиламин, при этом не содержащей аминокислот или сывороточного альбумина человека, наиболее предпочтительно содержащего в качестве рН-буфера фосфатный буфер, в качестве стабилизатора трис-(гидроксиметил)метиламин в количестве 10-200 мМ и/или ΝαΟ в количестве 20-150 мМ, и фармацевтически приемлемое количество ЕРО. Информацию о дальнейшем применении лекарственной формы ЕРО согласно настоящему изобретению можно найти в заявке на Европейский патент ЕР 1537876, содержание раскрытия которой входит в настоящий документ посредством ссылки. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению можно охарактеризовать как по меньшей мере стерильные и не содержащие пирогенов. Применяемый в настоящей заявке термин фармацевтическая композиция включает в себя лекарственные формы для медицинского и ветеринарного применения. Способы получения фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению известны в данной области техники и, например, описаны в КеттдЮи'к РНагтасеиНса1 δ^ι^. 171П ей., Μаск РиЬЬкЫид Сотрапу, ЕаЧоп, Ра. (1985) и в обновленном издании РетпщЮп: ТНе δ^η^ аий РтасНсе оГ РНагтасу (2000) Ьу (Не ИтуегеНу οί δ^η^5 ίη РЫ1айе1рЫа, ΙδΒΝ 0-683-306472, содержание которых включено в настоящую заявку посредством ссылки.

Эти и другие варианты реализации раскрываются и включены в описание и примеры настоящего изобретения. Дополнительную литературу касательно любых материалов, способов, областей примене- 9 022396 ния и соединений, которые требуется применять согласно настоящему изобретению, можно найти в общедоступных библиотеках и базах данных. Например, можно воспользоваться базой данных общего доступа МебБпе, которая расположена на сайте Национального центра биотехнологической информации и/или Национальной медицинской библиотеки Национального института здоровья. Дополнительные базы данных и адреса сайтов, такие как ресурсы Европейского Института биоинформатики (ΕΒΙ), который является частью Европейской лаборатории по молекулярной биологии (ЕМВЬ), известны специалистам в данной области техники, а также могут быть обнаружены посредством поиска в интернете. Обзор патентной информации в биотехнологии и обзор соответствующих источников патентной информации, полезных для ретроспективного поиска и для текущего ознакомления, приведен у Веткк, Т1ВТЕСН 12 (1994), 352-364.

В представленном выше раскрытии настоящее изобретение описано в общих чертах. Если не указано другого, любой термин, применяемый здесь, имеет определение как в Оксфордском справочнике по биохимии и молекулярной биологии, Ох&тб ишуег&у Рге88, 1997, обновленном в 2000 г. и переизданном в 2003 г., ΙδΒΝ 0198506732. В тексте данного описания процитированы несколько документов. Содержание всех цитированных ссылок (включая ссылки на литературу, выпущенные патенты, опубликованные заявки на патенты, процитированные в настоящей заявке и спецификациях производителей, инструкциях и др.) включены в настоящую заявку посредством ссылок; однако подразумевается, что ни один из цитируемых документов не является прототипом настоящего изобретения.

Более полное представление можно получить, обратившись к следующим конкретным примерам, которые приведены здесь только в целях иллюстрирования и не должны ограничивать область настоящего изобретения. В частности, примеры относятся к предпочтительным вариантам реализации настоящего изобретения.

Примеры

Если не указано другое, все технические и научные термины, применяемые в настоящей заявке, имеют значения, общепринятые среди специалистов в данной области техники (например, культура клеток, молекулярная генетика, химия нуклеиновых кислот, метод гибридизации, химия белков и биохимия). В ходе молекулярных, генетических и биохимических манипуляций (для общей информации см. 8ашЬтоок е1 ак, Мо1еси1аг СЧошпд: А ЬаЬота&гу Мапиа1, 2^пб еб. (1989) Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬота&гу Рте88, Со1б δρτίη^ НагЬог, Ν.Υ. и Аи8иЬе1 е1 ак, 81юг1 Рго&соН ίη Мо1еси1аг Вю1оду (1999) 4'¹' Еб, 1окп \УПеу & 8оп8, 1пс. - и полные версии текущих протоколов в молекулярной биологии, которые включены в настоящую заявку посредством ссылки) и химических манипуляций применяют стандартные методики.

Исходное сырье

Среду, содержащую белок ЕРО, получают из выращиваемой в промышленном масштабе проточной культуры трансформированной линии клеток яичника китайского хомячка (СНО бМт^-), содержащих амплифицированный ген ЕРО человека, как описано ранее; например, см. литературу, цитируемую выше. Концентрация ЕРО в культуральной среде зависит от роста клеток. В частности уровень экспрессии продукта (мг на объем) ограничено максимально достигаемым числом клеток. Таким образом, получение максимизируют путем применения системы непрерывной перфузии, которая позволяет получать культуру с высокой плотностью клеток в течение продолжительного периода культивирования. Перфузию инициируют при определенной плотности клеток, и скорость перфузии поддерживают в пределах определенного диапазона вручную, подстраивая указанную скорость в зависимости от количества клеток. Удерживания клеток достигают при помощи стандартных способов, таких как акустические отстойники, фильтрация или центрифугирование. Получаемый перфузат отбирают частями при температуре охлаждения. Вся кампания обычно состоит из перфузирования культуры в течение нескольких недель, за время которого продукт собирают 5-10 раз. Оставшиеся клетки и фрагменты их распада, содержащиеся в перфузате, удаляют из него посредством глубинной фильтрации, а белок предпочтительно концентрируют посредством фильтрования тангенциальным потоком с исключением молекулярных масс выше 30 кДа. Концентраты разделяют на аликвоты и хранят при <-70°С, пока не будет собран весь продукт. Концентрированный продукт изымают из морозильника и помещают в установку для замораживанияразмораживания. Объединенный и размороженный продукт осветляют посредством фильтрации с применением глубинного фильтра с диаметром пор 0,45 мкМ. Все нижеперечисленные этапы очистки, проводимые после размораживания, проводят при комнатной температуре (17-25°С).

Состав буферов и растворов

Буферные растворы для каждого этапа очистки описаны в табл. 1 ниже.

- 10 022396

Таблица 1. Состав буферов

Для очистки каждого объединенного концентрата применяют способы хроматографии с пятью последовательно соединенными колонками, и в результате получают партию О-гликозилированного и богатого остатками сиаловой кислоты ЕРО с фармацевтической степенью чистоты; см. также фиг. 1.

- 11 022396

Пример 1. Захват ЕРО и сокращение количества потенциальных примесей посредством аффинной хроматографии с синей сефарозой 6ЕЕ.

Синяя сефароза ЕЕ представляет собой смолу на основе агарозы, ковалентно связанной с красителем цибакроном синим, и ее применяют для предпочтительного связывания ЕРО в присутствии примесей, содержащихся в продукте после ферментации. Струю с продуктом сначала очищают посредством аффинной хроматографии, как указано в табл. 2.

Таблица 2. Параметры проведения хроматографии с применением синей сефарозы

1.8	колонки	Концентрация Время 2. ΝαΟΗ: Концентрация время	30 мин, 90 см/ мин. 0,1 Н 1 ч, 90 см/ мин.
Продолжительность цикла: Приблизительно 5 ч

Колонку заполняют смолой на основе синей сефарозы 6ЕЕ. После заполнения проводят проверку колонки, определяя количество теоретических тарелок и коэффициент асимметрии. Колонку дезинфицируют при помощи 0,5М ΝαΟΗ в течение 1 ч, а затем промывают водой для инъекций (ВДИ). Перед загрузкой колонку уравновешивают при помощи 20 мМ Трис НС1, 1,5 М №С1, рН 7,5, после чего при помощи 20 мМ Трис-НС1, рН 7,5. Образец загружают в колонку, и колонку промывают 20 мМ Трис НС1, рН 7,5. Десорбцию образца проводят при помощи 20 мМ Трис НС1, 1,5 ЫаС1, рН 7,5. Отбор образца начинают после того, как минимальная ΟΙ) (оптическая плотность) между предварительным пиком и основным пиком будет не менее 0,15. Отбор прекращают, когда ΟΙ) становится равной или меньше 0,15. Указанный элюат отбирают в стерильный пакет.

После элюирования колонку промывают ВДИ и затем освобождают от остаточных фракций путем промывания 5М мочевиной. После дополнительных этапов промывки ВДИ колонку дезинфицируют при помощи 0,5М ΝαΟΙ Н Колонку промывают ВДИ и хранят заполненной 0,01М ΝαΟΙ Н

Дополнительная информация о смоле для хроматографии представлена в файле нормативноправовой информации производителя (представительский файл нормативно-правовой информации по синей сефарозе СЕ НеаНйеаге).

Пример 2. Концентрирование ЕРО посредством диафильтрации.

Указанный элюат концентрируют посредством ультрафильтрации и проводят его диафильтрацию с применением мембраны, отсекающей массы 10 кДа, на фильтрационной установке с тангенциальным потоком; см. табл. 3.

- 12 022396

Таблица 3. Параметры для проведения . диафильтрации

№	Способ получения	Контроль	Желаемое значение / Допустимое отклонение
2.	Диафильтрация
	- Установка: Ргойих - 0,1 м² мембраны Нусйозаг! с отсекаемой массой 10 кДа - 500 мл элюата, концентрированного до 300 мл, диафильтрат с 6-кратным объемом, промывка 2 х 200 мл = 700 мл ретената
2.1	Проверка мембраны	Водный эквивалент
2.2	Дезинфекция мембраны	Реагент Время	1 Η ΝηΟΗ как минимум 30 мин.
2.3	Проведение диафильтрации	Скорость потока ретената Температура Давление на входе Давление на выходе Объем диафильтрации	22 ± 2°С 1 бар 0,5 бар 6-кратный
2.4	Хранение концентрата	Температура Время	4±2°С Непосредственное повторное применение, макс. 24 ч
2.5	Последующая обработка мембраны	Реагент Время	1 Η Ν30Η Как минимум 30 мин.
2.6	Проведение технологического контроля	Проводимость	< 2,5 мС / см
Продолжительность диафильтрации: приблизительно 2 ч + 2 ч на предварительную и последующую обработку

Перед применением фильтрационной установки проводят пробу на нормализованную проводимость воды (ΝΨΡ). Фильтрационную установку дезинфицируют при помощи 1 М ΝαΟΗ по меньшей мере в течение 1 ч и затем промывают ВДИ. После промывки фильтрационную установку уравновешивают при помощи 20 мМ Трис-НС1, рН 7,0. Затем загружают образец и фильтруют его при трансмембранном давлении не более 1 бара. Диафильтрацию прекращают, когда проводимость фильтрата становится ниже 2,5 мС/см.

Пример 3. Обогащение кислыми изоформами ЕРО и дальнейшее устранение примесей посредством анионообменной хроматографии с Р-сефарозой НР.

Анионообменную хроматографию с Р-сефарозой НР в качестве смолы применяют в целях обогащения кислыми изоформами ЕРО, дальнейшего устранения примесей (например, ДНК, белков клетокхозяев) и исключения любых лигандов-красителей, которые могли вынестись из первой колонки. Кроме того, анионообменная хроматография является эффективной мерой для удаления попавших из вне вирусов. Таким образом, диафильтрат подвергают анионообменной хроматографии, которая охарактеризована в табл. 4, после чего проводят фильтрацию на фильтре с диаметром пор 0,2 мкм, причем фильтруют Р-фракцию и объединенные фракции.

Таблица 4. Параметры для проведения анионообменной хроматографии

№	Способ получения	Контроль	Желаемое значение / Допустимое отклонение
3.	Высокоэффективная хроматография с Ц-сефарозой - 6,2 х 16,5 см = 500 мл (Уап1а§е УА 60 х 500) - Установка: АКТА Рипйег - Загрузка: 700 мл диафильтрата = макс. 1 500 мг ЕРО - Элюат: Приблизительно 2 000 мл в 250 мл пробирках ЗсЬоН: фракции по 100 200 мл
3.1	Загрузка и оценка колонки	НЕТР / асимметрия	N > 4,000 / м 0,6 < А₅ < 2,0
3.2	Размораживание концентратов	Концентрация ЫаОН Время	1 ± 0,05 Н 1 ч, 90 см /ч
3.3	Фильтрация концентратов	рН после уравновешивания Скорость потока Температура Загрузка Градиент	7,0 ±0,1 45 ± 3 мл / мин. = 90 см/ч 22 ± 2°С макс. 3 мг ЕРО/мл геля макс. 1,500 мг ЕРО 0 - 25 М ЫаС1 в 30 СУ
3.4	Дезинфекция колонки	Начало объединения Окончание объединения	ОЦ ~ 85% максимума пика, О О ~ 25% от максимума пика, Для белков и ЕРО
3.5	Цикл выполнения	Температура Время	КТ = 22±2°С В течение ночи, макс. 18 ч
3.6	Критерии объединения	Концентрация ПаОН Время	1 ± 0.05 Н 1 ч, 90 см / ч
3.7	Хранение образцов	Следует определять отношение белок / ЕРО	< Г5 После цикла оптимизации
Продолжительность цикла: Приблизительно 6 ч

- 13 022396

Колонку заполняют смолой на основе ^-сефарозы НР. После заполнения колонку проверяют, определяя количество теоретических тарелок и коэффициент асимметрии. Колонку промывают ВДИ и затем дезинфицируют при помощи 1М ЫаОН в течение 1 ч. После дезинфицирования колонку промывают ВДИ. Перед загрузкой колонку уравновешивают при помощи 20 мМ Трис НС1, 1,0 ЫаС1, рН 7,0, и далее 20 мМ Трис НС1, рН 7,0. Образец загружают в колонку, и колонку промывают 20 мМ Трис НО, рН 7,0. Проводят десорбцию образца, создавая линейный градиент при помощи 20 мМ Трис НС1, 5,0 ЫаС1, рН 7,0. ЕРО отбирают в составе фракций с линейным градиентом. Главная фракция начинает выходить на спадающем фронте приблизительно от 85 до 95% максимума пика (УФ) и заканчивается, когда значение УФ снижается приблизительно до 25% от максимума пика.

Каждую элюируемую при анионообменной хроматографии фракцию фильтруют при помощи фильтрационной установки с диаметром пор 0,2 мкм. Фракции перед их объединением выдерживают при 22±3°С до 20 ч (этап выдержки I) в стерильных одноразовых пакетах, пока проводят технологический контроль. Избранные фракции следует объединять для соответствия требованиям к желаемому распределению изоформ. Чтобы определить, какие фракции следует объединять, готовят малые пробы фракций и анализируют их посредством капиллярно-зонального электрофореза (КЗЭ). Для объединения желательно отбирать фракции, которые по распределению изоформ ближе всех к желаемому профилю, и их объединяют для дальнейшей очистки.

Между периодами использования смолу восстанавливают посредством промывания 20 мМ ТрисНС1, 1 М ЫаС1, рН 7,0, и дальнейшего промывания ВДИ. Затем колонку дезинфицируют при помощи 1М ЫаОН в течение 1 ч и промывают ВДИ. Хранят колонку заполненной 0,01 М ЫаОН.

Дополнительная информация о смоле для хроматографии представлена в файле нормативноправовой информации производителя (представительский файл нормативно-правовой информации по 9сефарозе ОБ НеаЕБсаге).

Пример 4. Сокращение числа молекул ЕРО, которые не гликозилированы по Сер126 и удаление оставшихся примесей посредством ВЭЖХ-ОФ с применением смолы С4. ВЭЖХ-ОФ с применением смолы С4 позволяет отделить ЕРО от потенциальных примесей на основании гидрофобности и, при желании, можно сократить количество молекул ЕРО, которые не гликозилированы по остатку Сер126. Кроме того, данный этап позволяет исключить лиганд-краситель, который мог вынестись из первой колонки.

Профильтрованную объединенную фракцию, полученную в ходе анионообменной хроматографии, очищают посредством хроматографии с обращенной фазой, как указано в табл. 5.

Таблица 5. Параметры для проведения ВЭЖХ-ОФ

Колонку заполняют смолой С4. Затем ее уравновешивают 0,1% (о/о) ТФУ в ВДИ. Перед применением работу колонки оценивают, определяя количество теоретических тарелок и коэффициент асимметрии. Образец загружают в колонку, проводят десорбцию образца, создавая линейный градиент, как описано в табл. 1 и 6. Элюат начинают отбирать, как только поглощение на длине волны 280 нм достигает 0,01 ИЛ (единиц поглощения), и прекращают его собирать, когда поглощение спадает до 40-45% от максимума пика на спадающем фронте. Элюат собирают в стеклянный флакон.

Как упоминалось, градиент создают при помощи воды/ ТФУ 0,1% (растворитель А) и воды 30%/ацетонитрила 70% (о/о)/ТФУ 0,1% (растворитель В). В частности, применяют объединенные размо- 14 022396 роженные фракции элюата с Р-сефарозы НР и фильтруют их через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. После промывки колонки двукратным объемом (СУ) воды шПН-Р и уравновешивания 4 СУ растворителя А в колонку загружали образец, и создавался градиент, как указано в таблю 6.

Таблица 6. Градиент для проведения ВЭЖХ-ОФ

Время (мин.)	%А	%В
0	100	0
9,2	50	50
18,3 52,7 59.5 75.6 91.6	50 20 0 0 100	50 80 100 100 0
108,8	100	0
Общий объем (л)	~5	~6

Элюат отбирают в виде фракций по 50 мл, которые хранят при -20°С.

Между периодами использования смолу восстанавливают, а работу колонки оценивают, определяя количество теоретических тарелок и коэффициент асимметрии. Сначала колонку промывают, применяя градиент от 70% (о/о) до 100% (о/о) ацетонитрила. Затем колонку промывают 100% (о/о) ацетонитрила. Концентрацию ацетонитрила снижают, промывая колонку с применением градиента от 100% (о/о) до 60% (о/о) ацетонитрила, и затем колонку хранят, заполненную 60% (о/о) ацетонитрила.

Дополнительная информация о смоле для хроматографии представлена в файле нормативноправовой информации производителя (Представительский файл нормативно-правовой информации по смоле Уу4ас С4).

Пример 5. Инактивация вирусов посредством инкубации ЕРО в растворе ацетонитрила / ТФУ.

После этапа ВЭЖХ-ОФ элюат выдерживают от 60 до 180 мин при 22±3°С. Концентрация ацетонитрила в элюате составляет приблизительно 41% (о/о), а концентрация ТФУ составляет приблизительно 0,1% (о/о). Во время данной стадии процесса контролируют температуру и время выдерживания.

Пример 6. Удаление растворителя, применяемого при ВЭЖХ-ОФ, и агрегированных видов ЕРО посредством катионообменной хроматографии со смолой МасгоРгер Ηΐ§Η 8.

Для удаления растворителя, применяемого при ВЭЖХ-ОФ, и агрегированных видов ЕРО, а также в целях замены буфера в достаточно короткое время применяют катионообменную хроматографию со смолой МасгоРгер Ηΐ§Η 8. Элюат, полученный в ходе ВЭЖХ-ОФ, подвергают катионообменной хроматографии, как описано в табл. 7, после чего проводят фильтрацию элюата МасгоРгер на фильтре с диаметром пор 0,2 мкм.

Таблица 7. . Параметры для проведения катионообменной хроматографии

№	Способ получения	Контроль	Желаемое значение/ Допустимое отклонение
5.	Масгоргер №§Ь8 - 5 х 12,5 см = 250 мл - Установка: АКТА Рипйег - Загрузка: 400 - 500 мл элюата из колонки с ОФ = макс. 1,250 мг ЕРО - Элюат: - 250 мл в 50 мл пробирках фирмы Ра1соп (~ 3 мг ЕРО / мл)
5.1	Загрузка и проверка колонки	НЕТР / асимметрия	N > 2,500 / м 0,6 < А, < 1,8
5.2	Дезинфекция колонки	Концентрация ΝαΟΗ Время	1 ± 0,05 Н 1 ч
5.3	Цикл выполнения	рН после уравновешивания Скорость потока Температура Загрузка Градиент	2.0 ±0,2 50 ± 3 мл / мин = 150 см / ч 22±2°С макс. 5 мг ЕРО/мл геля макс. 1,250 мг ЕРО Ступенчатый градиент по рН нИаСЛ после цикла оптимизации
5.4	Критерии объединения	Начало объединения Окончание объединения	ОО?8о > 0,03 ООо#о < 0,03
5.5	Хранение образца	Температура Время	КТ = 22 ± 2°С Концентрат непосредственно после цикла, макс. 24 ч
5.6	Последующая обработка колонки	Концентрация ЫаОН Время	1 ± 0,05 Н 1 ч
Продолжительность цикла: приблизительно 3 ч + 3 ч на предварительную и последующую обработку

Колонку заполняют смолой МасгоРгер Ηΐ§Η 8. После заполнения колонку проверяют, определяя

- 15 022396 количество теоретических тарелок и коэффициент асимметрии. Колонку промывают ВДИ и затем дезинфицируют при помощи 1М ΝαΟΗ в течение 1 ч. После дезинфицирования колонку промывают ВДИ. Перед загрузкой проводят предварительное уравновешивание колонки при помощи 100 мМ глицинаНС!, рН 2,0, а затем уравновешивают колонку при помощи 20 мМ глицина-НС1, рН 2,0. Образец загружают в колонку, и колонку промывают 20 мМ глицин-НС1, рН 2,0. Проводят десорбцию образца, создавая сильный градиент, как описано в табл. 1. Элюат начинают отбирать, как только поглощение на длине волны 280 нм достигает 0,03 ИЛ, и прекращают его собирать, когда поглощение достигнет 0,03 ИЛ. Элюат хранят в стерильных одноразовых пакетах.

Элюат, полученный при катионообменной хроматографии, фильтруют при помощи фильтра с диаметром пор 0,2 мкм перед дальнейшей очисткой и/или началом выдерживания при 22±3°С до 20 ч в стерильном одноразовом пакете.

Между периодами использования смолу восстанавливают. Колонку промывают при помощи 10 мМ №РО₄. 1,0 М №С1, рН 7,2, затем прополаскивают ВДИ. Агрегаты ЕРО десорбируют, и они элюируют из колонки. Колонку дезинфицируют при помощи 1 М №О11 по меньшей мере в течение 1 ч и промывают ВДИ. Колонку хранят заполненной 0,01 М №О11.

Дополнительная информация о смоле для хроматографии представлена в файле нормативноправовой информации производителя (Представительский файл нормативно-правовой информации по смоле Масго Ргер I ПдЬ 8 ВюРаб).

Пример 7. Ультрафильтрация.

Элюат, полученный на этапе катионообменной хроматографии, который необязательно был профильтрован, подвергают дальнейшему концентрированию посредством ультрафильтрации, применяя фильтрацию тангенциальным потоком с отсечкой молекулярных масс более 10 кДа в целях достижения желаемого уменьшения объема. Информация об указанном этапе фильтрации приведена в табл. 8.

Таблица 8. Параметры для проведения ультрафильтрации

№	Способ получения	Контроль	Желаемое значение / Допустимое отклонение
6.	Ультрафильтрация
	- Установка: кювета с перемешиванием Апйсоп - плоская мембрана 76 мм ΥΜ-10 кДа - концентрат 250 мл до 80 мл, промывка 2 х 10 мл =	100 мл
6.1	Проверка мембраны	Водный эквивалент
6.2	Дезинфекция мембраны	Реагент Время	0,1 ΗΝβΟΗ как минимум 1 ч
6.3	Проведение ультрафильтрации	Температура Давление на выходе УФгво в ретенате УФ₂»о в фильтрате	22 ± 2°С 1 бар <0,05
6.4	Хранение концентрата	Температура Время	КТ = 22 ± 2°С В течение ночи, макс. 18 ч
6.5	Последующая обработка мембраны	Реагент Время	0,1 НЫаОН как минимум 1 ч
6.6	Проведение технологического контроля	Концентрация ЕРО Объем ретената	5 < X <7 мг / мл < 100 мл
Продолжительность цикла: приблизительно 1 ч + 2 ч на предварительную и последующую обработку

Фильтрационную установку дезинфицируют при помощи 1 М №О11 и затем промывают ВДИ. После промывки фильтрационную установку уравновешивают при помощи буфера 10 мМ №РО₄. 0,15 М №С1, рН 7,2. Затем загружают образец и фильтруют ее при 22±3°С при давлении подачи от 0,7 до 1,1 бар. Ретенат отбирают в стерильный одноразовый пакет.

Пример 8. Удаление любых оставшихся агрегатов ЕРО и других примесей посредством эксклюзионной хроматографии с применением Супердекса 8200 Ргер Огабе.

Эксклюзионная хроматография с применением Супердекса 8200 Ргер Огабе является конечным этапом хроматографии (этап доочистки), и его проводят с целью удаления оставшихся агрегатов и получения нерасфасованной лекарственной формы. Концентрат, полученный при ультрафильтрации (пример 7), или элюат, полученный после КОХ (пример 6), подвергают эксклюзионной хроматографии, как описано в табл. 9, после чего элюат, полученный в ходе ВЭЖХ-ЭХ, фильтруют через мембрану с диаметром пор 0,2 мкм, как описано в примере 9.

Таблица 9. Параметры проведения эксклюзионной хроматографии

- 16 022396

№	Способ получения	Контроль	Желаемое значение / Допустимое отклонение
7.	Супердекс 200 р§ - 10 х 70 см = 5,5 л (ВРС 100/950) - Установка: АКТА Рипйег - Загрузка: 100 мл концентрата после УФ - Элюат: ~ 300 мл в 50 мл пробирках фирмы Ра1соп (~ 1,5 мг ЕРО / мл)
7.1	Загрузка и проверка колонки	НЕТР / асимметрия	N > 5,000 / м 0,7 < А₈< 1,8
7.2	Дезинфекция колонки	Концентрация ЦаОН Время	0,5 ± 0,05 Н как минимум 1 ч
7.3	Цикл выполнения	рН после уравновешивания Скорость потока Температура Загрузка Концентрация ЕРО при загрузке Объем загрузки Х% ν СУ	7,2 ± 0,2 32 ± 2 мл/ мин. = 24 см/ч 22 ± 2°С 5 < X < 7 мг ЕРО/мл макс. 4%
7.4	Критерии объединения	Начало объединения Окончание объединения	ОЦ₂₈о > 0,01 00₂8о<0,01, макс. 300 мл
7.5	Хранение объединенных фракций	Температура Время	Подвергается нанофильтрации в тот же день
7.6	Последующая обработка колонки	Концентрация ЦаОН Время	0,5 ± 0,05 Н как минимум 1 ч
7.7	Проведение технологического контроля	Концентрация ЕРО	1 < X < 3 мг / мл

Продолжительность цикла: приблизительно 3 ч + 12 ч на предварительную и последующую обработку

Колонку заполняют смолой Супердекс 8200 Ргер Огаде. После заполнения колонку проверяют, определяя количество теоретических тарелок и коэффициент асимметрии. Колонку дезинфицируют при помощи 0,5М NаΟΗ в течение 1 ч, а затем промывают ВДИ. Перед загрузкой проводят предварительное уравновешивание колонки при помощи 100 мМ ΝαΡΟ₄, рН 7,2, а затем уравновешивают колонку при помощи 10 мМ ΝαΡΟ₄, 0,15 М ЫаС1, рН 7,2. Образец загружают в колонку, и элюат начинают отбирать, как только поглощение на длине волны 280 нм достигает 0,01 ИЛ, и прекращают его собирать, когда поглощение достигнет 0,01 ИЛ. Элюат отбирают в стерильные одноразовые пакеты. Элюат, полученный при эксклюзионной хроматографии, фильтруют в стерильный одноразовый пакет и хранят в нем до дальнейшей обработки на фильтре с диаметром пор 0,2 мкм.

После применения колонку промывают ВДИ. Затем колонку дезинфицируют при помощи 0,5-1 М NаΟΗ (0,6 СУ) в течение 1 ч и хранят заполненной 0,01 М №ΟΙ I.

Дополнительная информация о смоле представлена в файле нормативно-правовой информации производителя (Представительский файл нормативно-правовой информации по смоле Супердекс ОЕ НеаНйсаге).

Пример 9. Удаление вирусов из препарата ЕРО посредством нанофильтрации.

В конце способа очистки включают этап нанофильтрации через фильтр с диаметром пор 15 нм в целях повышения противовирусной безопасности лекарственного вещества. Элюат, полученный в ходе эксклюзионной хроматографии, подвергают нанофильтрации с применением фильтра Р1апоуа 15Ν, который служит для удаления занесенных вирусных агентов из элюата. Установку для нанофильтрации готовят путем промывки 150 мл 10 мМ ΝοΡΟΐ₄, 0,15 М ЫаС1, рН 7,2. Элюат, полученный при эксклюзионной хроматографии и прошедший через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм, прокачивают через нанофильтр, а фильтрат собирают в стерильный одноразовый пакет.

Пример 10. Разлив, хранение и транспортировка.

Процесс разлива - это финальный этап технологического процесса по получению лекарственного вещества ЕРО. Перед разливом конечную тару стерилизуют и обрабатывают для удаления пирогенных агентов. Фракцию, полученную при нанофильтрации, распределяют с применением перистальтического насоса в контейнеры для хранения нерасфасованной лекарственной формы объемом по 30 мл. Данную операцию проводят в вытяжном шкафу с ламинарным потоком (местная защита) в фасовочном отделении при комнатной температуре. Хранение готового продукта можно производить при -70°С, например, в полипропиленовых пробирках с тефлоновым покрытием. Лекарственное вещество можно перевозить на предприятие по производству препаратов, и температуру нерасфасованного лекарственного препарата

- 17 022396 во время транспортировки поддерживают ниже -70°С при помощи сухого льда.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ очистки биологически активных О-гликозилированных изоформ эритропоэтина (ЕРО) из сложной смеси белков, включающий этап анионообменной хроматографии и этап катионообменной хроматографии, которые разделены этапом хроматографии с обращенной фазой (ОФ), при этом этап катионообменной хроматографии проводят после этапа ОФ хроматографии.
2. Способ по п.1, который включает следующие этапы, осуществляемые в следующем порядке:

(a) этап аффинной хроматографии в качестве этапа захвата;

(b) этап анионообменной хроматографии;

(c) этап хроматографии с обращенной фазой (ОФ) и (б) этап катионообменной хроматографии.
3. Способ по п.1 или 2, который дополнительно включает следующий этап:

(е) этап эксклюзионной хроматографии.
4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что элюирование ЕРО на одном или более из указанных этапов хроматографии осуществляют посредством ступенчатого или градиентного элюирования.
5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что этап анионообменной хроматографии проводят с применением анионообменных смол или мембран, которые в качестве функциональных групп содержат диэтиламиноэтильные группы (ΌΕΑΕ), четвертичные аминоэтильные группы (ΟΛΕ), группы четвертичного аммония (О), диметиламиноэтильные группы (ΌΜΛΕ) и/или триметиламиноэтильные группы (ТМАЕ).
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что этап анионообменной хроматографии проводят с применением коммерчески доступной О-сефарозы.
7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что этап хроматографии с обращенной фазой (ОФ) представляет собой высокоэффективную жидкостную хроматографию с обращенной фазой (ВЭЖХ-ОФ).
8. Способ по п.7, отличающийся тем, что ВЭЖХ-ОФ проводят с применением смол, которые содержат в качестве функциональных групп метил-, бутил-, фенил-, пропил- и/или октальные группы.
9. Способ по п.8, отличающийся тем, что ВЭЖХ-ОФ проводят с применением коммерчески доступного материала С4 для хроматографии с обращенной фазой.
10. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что этап катионообменной хроматографии проводят с применением смол, которые включают катионообменный материал на основе сульфопропила.
11. Способ по п.10, отличающийся тем, что этап катионообменной хроматографии проводят с применением коммерчески доступной смолы Масго-Ргер НфН 8.
12. Способ по любому из пп.2-11, отличающийся тем, что этап аффинной хроматографии проводят с применением хроматографической смолы с красителями.
13. Способ по п.12, отличающийся тем, что этап аффинной хроматографии проводят с применением коммерчески доступной голубой сефарозы.
14. Способ по любому из пп.3-13, отличающийся тем, что этап эксклюзионной хроматографии проводят в среде для гель-фильтрации, выбранной из группы, включающей Супердекс, Сефакрил, Сефадекс, Сефарозу, Фрактогель, Тойоперл и Бю-Ое1.
15. Способ по п.14, отличающийся тем, что этап эксклюзионной хроматографии проводят с применением коммерчески доступного Супердекса-8200.
16. Способ по любому из пп.1-15, отличающийся тем, что анионообменную хроматографию применяют для отбора изоформ ЕРО.
17. Способ по п.16, отличающийся тем, что применяют линейный градиент концентрации соли ЫаС1 от 0 до 200 мМ в буфере, содержащем 20 мМ Трис-НС1 при рН около 7,0.
18. Способ по любому из пп.1-17, отличающийся тем, что этап хроматографии с обращенной фазой применяют для отбора О-гликозилированного ЕРО.
19. Способ по п.18, отличающийся тем, что ЕРО элюируют при помощи линейного градиента органического растворителя.
20. Способ по п.19, отличающийся тем, что применяют линейный градиент ацетонитрила в воде от 0 до 70% и растворители содержат приблизительно 0,1% ТФУ.
21. Способ по п.20, отличающийся тем, что применяют изократическое элюирование ЕРО с применением растворителя, содержащего ацетонитрил и приблизительно 0,1% ТФУ в воде.
22. Способ по любому из пп.1-21, который перед одним или более из указанных этапов хроматографии включает этап ультрафильтрации и возможно этап нанофильтрации в качестве завершающего этапа.
23. Способ по любому из пп.1-20, включающий следующие этапы:

(а) этап аффинной хроматографии в качестве этапа захвата;

- 18 022396 (b) этап анионообменной хроматографии;

(c) этап хроматографии с обращенной фазой (ОФ);

(б) этап катионообменной хроматографии;

(е) этап эксклюзионной хроматографии;

(ί) этап нанофильтрации и (д) этап ультрафильтрации перед этапом (а), (Ь) и/или (е).
24. Способ по любому из пп.1-23, отличающийся тем, что ЕРО представляет собой рекомбинантный ЕРО человека.
25. Способ по любому из пп.1-24, отличающийся тем, что ЕРО представляет собой рекомбинантный ЕРО человека, получаемый из клеток яичника китайского хомячка (СНО).
26. Препарат биологически активных О-гликозилированных изоформ ЕРО, очищенный способом по любому из пп.1-25, по существу, не содержащий изоформ ЕРО, не являющихся Огликозилированными.
27. Препарат по п.26, отличающийся тем, что ЕРО представляет собой рекомбинантный ЕРО человека.
28. Фармацевтическая композиция, содержащая препарат ЕРО по любому из пп.26 или 27.