MX2012009919A - MÉTODO PARA LA PURIFICACIÓN DE INTERFERÓN BETA 1A RECOMBINANTE HUMANO (RHU IFN-ß1A) POR CROMATOGRAFIA LIQUIDA. - Google Patents

Abstract

Esta invención tiene lugar en el campo de la ingeniería bioquímica y concierne a métodos de cromatografía líquida para la purificación de interferón beta humano recombinante a partir de células CHO en cultivos monocapa. Se describen métodos secuenciales para la purificación de la proteína a partir de medio de cultivo. Los métodos descritos incluyen: a) una cromatografía de afinidad en una matriz de azul de sepharosa; b) una cromatografía en fase reversa en una columna de perlas de poliestireno; y c) una cromatografía de filtración en gel en una matriz de sephacryl. Además, se describe un paso de ultrafiltración centrífuga así como un paso de liofilización. Con los métodos descritos en esta invención es posible obtener una proteína con alto nivel de pureza disminuyendo su heterogeneidad. Con la secuencia de pasos aquí descrita no se requieren pasos adicionales de purificación que pondrían en riesgo la integridad de la molécula. La presente invención asegura un método rápido y fiable para obtener inteñerón beta humano recombinante que cumpla con los requisitos establecidos en las normatividades sanitarias para una proteína terapéutica para su uso en humanos.

Description

MÉTODO PARA LA PURIFICACIÓN DE INTERFERÓN BETA 1a RECOMBINANTE HUMANO (rHu IFN-j01a) POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA OBJETO DE LA INVENCIÓN Esta invención está enmarcada en el campo de la purificación de glicoproteínas recombinantes obtenidas a partir de cultivos de células eucariotas superiores. Particularmente, la presente invención refiere a métodos secuenciales de aislamiento y purificación de interferón beta 1a humano recombinante (rHu IFN- ? 1a) por cromatografía líquida de alta resolución hasta la obtención de una proteína de alta pureza y actividad biológica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Con el nombre de ¡nterferones (IFNs) se agrupa a un conjunto de proteínas que poseen actividad tanto antiviral como inmuno-reguladora. Los IFNs son proteínas producidas naturalmente por el sistema inmune de la mayoría de los animales como respuesta a agentes externos, tales como virus, ARNs de cadena doble, diversos microorganismos o citocinas, como el factor de necrosis tumoral (TNF) o las interleucinas (IL) así como de células cancerígenas [Postka S., Langer J. A. & Zoon K. C, Annu. Rev. Biochem., 56:727 (1987)]. Los IFNs pertenecen a la clase de las glicoproteínas conocidas como citocinas. La actividad antiviral de los IFNs se expresa no directamente como consecuencia de una infección viral inmediata sino como una respuesta en las células blanco de la invasión viral brindándoles una protección a éstas contra la infección. Uno de los efectos más importantes que poseen los IFNs es el antiproliferativo del crecimiento de diversos tumores cancerígenos, esto les confiere un uso muy útil en terapias contra el cáncer. Además, pueden tener influencia en el sistema inmunológico activando macrófagos y células NK (asesinas naturales, por sus siglas en inglés, un tipo de linfocitos pertenecientes al sistema inmune) y con ello intensificar la expresión de varias proteínas inmunológicas.

De acuerdo a sus características fisicoquímicas y funcionales, los IFNs se han agrupado en dos clases: tipo 1 y tipo 2. Entre los IFNs de tipo 1 se encuentran el alfa {a), beta {ß), tau (r) y épsilon {e) [Weissman C. & Weber H. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol., 33:251 (1986)], mientras que el interferón gamma (?) pertenece al tipo 2.

Los IFNs y ? son producidos por varios tipos celulares, tales como células T y B, macrófagos, fibroblastos, células endoteliales y osteoblastos, entre otras, y son importantes componentes de la respuesta antiviral. Estimulan a los macrófagos y las células NK y son activas contra los tumores. El IFN t es secretado por células trofoblásticas en el lumen uterino en vacas y ovejas al inicio del período de gestación. El IFN e es ampliamente expresado de manera constitutiva en el cerebro, aunque sus características bioquímicas y biológicas son poco comprendidas [(Peng F.W., Prot. Exp. & Purif., 53(2):356 (2007)]. El IFN gamma (?) tiene efecto en la regulación de las respuestas inmune e inflamatoria, además, tiene efectos antivirales y antitumorales, pero generalmente son débiles. Una propiedad particular del IFN y es la de potenciar los efectos de los IFNs a y ß. En humanos, sólo hay un tipo de IFN ? produciéndose éste en células T activadas [The Merck Index, Merck & Co. Inc., 13 Ed., New Jersey, USA (2001 )].

El IFN ß, perteneciente al tipo 1 , es una proteína que exhibe especificidad de acuerdo a la especie y es llamado "interferón de fibroblastos", por su origen de expresión, y como "interferón pH 2-estable", por ser este valor de pH vital para la estabilidad de la proteína. La molécula de IFN ß tiene una masa molecular de alrededor de 20 kDa y una sola cadena consistente en 166 aminoácidos. Se conoce que un sitio de glicosidación N juega un papel fisicoquímico importante particularmente en el aumento de la estabilidad de la molécula o su solubilidad, más que en participar en la actividad biológica o la antigenicidad de la misma [Karpusas M., Whytty A., Runkel L, & Hochman P., Mol. Life Sci., 54:1203 (1998)].

El avance en la tecnología de recombinación genética permitió la determinación de la secuencia aminoacídica del IFN ß humano y su clonación y expresión en cepas bacterianas de E. coli. [Taniguchi T., Ohno S., Fujii-Kuriyama Y. & Muramatsu M., Gene, 10:11 (1980)] y después se ha reportado la expresión en células ováricas de hámster chino (CHO; USP 4,966,843, USP 5,376,567 & USP 5,795,779).

Actualmente, los IFNs ?son producidos por tecnología de ADN recombinante y se encuentran bajo los nombre comerciales de Betaseron® (BAYER HEALTHCARE PHARMACEUTICALS), Avonex® (BIOGEN IDEC, INC.), y Rebif® (EMD SERONO, INC.). Se conoce que los IFNs ß recombinantes son efectivos en el retardo del progreso de la esclerosis múltiple (enfermedad característica por la desmielinización y las lesiones neurodegenerativas y crónicas del sistema nervioso central) y alivio de las dolencias en pacientes con los síntomas de esta enfermedad, haciéndolos muy útiles como agentes terapéuticos para este padecimiento. Al mismo tiempo, estos IFNs son efectivos en la regulación no específica de la respuesta inmune humana, la respuesta inmune a infecciones virales y la antiproliferación de células cancerígenas.

El IFN ß humano (Hu IFN- 3) es una glicoproteína con un peso molecular (MW) de alrededor de 23 kDa, su secuencia aminoacídica fue determinada por K. Hosoi et at. [J. Interferon Res., 8:375 (1988)] y la estructura del glucósido fue reportada por Y. Kagawa et al. [J. Biol. Chem., 263:17508 (1988)]. El Hu IFN-/? es una proteína secretada por fibroblastos en respuesta a una infección viral o bacteriana o a la exposición a células extrañas, macromoléculas o ARN. Particularmente, el Hu IFN- ? inhibe la proliferación de células infectadas y estimula el sistema inmune. Se considera que la actividad específica antiviral del Hu IFN-/? homogéneo oscila entre 3 * I08 y 1 * 109 lU/mg (unidades internacionales por miligramo de proteína total), inclusive (ver: USP 4,289,689 y EP-A-94 672).

Generalmente, el Hu IFN-/? puede ser producido a partir de cultivos de fibroblastos humanos mantenidos bajo condiciones de super-inducción, por ejemplo con ácido polirribosínico [poli (I)] y ácido polirribocitidílico [poli (C)]. Su purificación es llevada a cabo usando métodos cromatográficos, principalmente. Sin embargo, a pesar de las variadas técnicas de purificación usadas, los rendimientos de Hu IFN-/? obtenido de fibroblastos han sido muy bajos lo que ha impedido la disponibilidad de grandes cantidades de producto empleando esta vía de obtención.

Para superar este problema, los IFNs ß humanos recombinantes (rHu IFN-S) han sido obtenidos a partir de organismos huésped (grupos selectos de bacterias, levaduras o células de mamífero) transformados con un vector de expresión conteniendo el gen codificador para Hu IFN-/?.

Detalles de la clonación del cADN de IFN y su expresión directa, especialmente en E. coli, han sido objeto de numerosas publicaciones. Por ejemplo, la preparación de IFNs recombinantes descrita por Wetzel er a/., J. Interferon Res., 1 :381 (1981 ); Nagata er a/., Nature, 284:316-320 (1980); Goeddel et al., Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); Devos et al., Nucleic Acids Res., 10:2487 (1982); Gray ef al., Nature, 295:503 (1982), al igual que del Germán Offenlegllngsschriften Nos. 31 25 706, 31 38 096 y 31 44 469.

Debido a que los IFNs de origen microbiano (preferentemente de E. coli), después de su aislamiento del microorganismo o del medio de cultivo, se presentan contaminados por una serie de impurezas microbianas, la presencia de las cuales es prohibida para su uso terapéutico, la purificación de los materiales recombinantes juega un papel particularmente importante.

Actualmente, células tumorales de ovario de hámster chino (CHO) han sido domesticadas para la producción de IFN ß humano recombinante [CHO-rHu IFN-ß H. Conradt, S. ef al., J. Biol. Chem., 262:14600 (1987); Chermajobsky, Y. ef al., DNA, 3:297 (1984); McCormick, F. ef al., Mol. Cell. Biol., 4:166 (1984)]. Estas células tienen la ventaja de permitir que las proteínas expresadas en el medio de cultivo presenten una composición de carbohidratos muy similar a las proteínas naturales obtenidas de fibroblastos.

Generalmente, las tecnologías disponibles para la purificación de CHO-rHu IFN- ? establecen de 3 a 5 procedimientos de purificación incluyendo una purificación primaria por cromatografía de afinidad (USP 4,278,661 , USP 4,289,689, USP 4,541 ,952, USP 4,808,523, etc.), cromatografía de quelatos de metal (USP 4,257,938, USP 4,359,389, USP 4,541 ,952, USP 5,244,655, etc.), cromatografía CPG (vidrio de poro controlado; USP 4,359,389, USP 5,066,786, USP 5,244,655, etc.) o cromatografía de afinidad a Concanavalina A (USP 4,289,689, USP 4,658,017, etc.) seguida de cromatografía de intercambio catiónico y cromatografía de fase reversa.

En el caso particular de la purificación de grandes cantidades de rHu IFN-a por medio de cromatografía de inmunoafinidad con anticuerpos monoclonales, se ha encontrado no sólo que los materiales purificados contienen fragmentos de IFN (interferón en donde falta una parte de la secuencia aminoacídica) sino también oligómeros de IFN (e.g., dímeros). Estos subproductos indeseables tienen sólo una parte de la actividad biológica del IFN puro y una afinidad comparable a los anticuerpos.

Hoy en día, gran parte de las ciencias biomédicas están basadas en el uso de proteínas con actividad farmacológica y propiedades terapéuticas, sean éstas de origen natural, obtenidas mediante el empleo de técnicas de extracción, o de origen sintético, obtenidas por técnicas de ADN recombinante. El nivel de pureza de los productos de interés es de vital importancia en ambos casos ya que la actividad de las proteínas purificadas está determinada por la correlación entre el efecto biológico y la presencia de una cantidad fija de la proteína.

Con base en lo anterior, los procesos de purificación de proteínas activas farmacológicamente han cobrado una gran importancia ya que la pureza de la proteína obtenida asume una significancia notable cuando están involucrados diversos principios activos o excipientes en formulaciones terapéuticas para consumo humano. La posibilidad de efectos tóxicos y/o adversos durante la terapia médica ha impulsado a las autoridades mundiales, responsables del registro y autorización para la comercialización de medicamentos basados en proteínas, a introducir medidas regulatorias de control más estrictas para determinar la calidad y consistencia de fabricación de principios activos de origen proteico contenidos en medicamentos destinados a la terapia humana.

Este hecho es particularmente indiscutible para aquellas proteínas farmacológicamente activas obtenidas de fuentes naturales, e.g. sangre, extractos de órganos de animales o vegetales; así como en el caso de proteínas derivadas de técnicas de ADN recombinante debido a que estas proteínas muestran propiedades fisicoquímicas similares independientemente de su origen.

Para lograr un grado de pureza deseado en una proteína terapéutica, normalmente se utilizan varios pasos de purificación. Por esta razón, los procesos de purificación pueden llegar a ser muy complejos y el éxito de la fabricación de una proteína a niveles industriales está relacionado directamente a la eficiencia del proceso mismo de purificación y éste a su vez determinará ampliamente los costos de fabricación.

Esta invención tiene lugar en el campo de la ingeniería bioquímica. Más particularmente, la invención concierne a métodos de cromatografía líquida para la purificación de CHO-rHu IFN-/?, tales métodos resultan en el incremento de la pureza y en la disminución de la heterogeneidad del producto.

Anteriormente, el Hu IFN-/? era generalmente producido por cultivos de fibroblastos super-inducidos y el aislamiento y la purificación por técnicas cromatográficas y electroforéticas. Las proteínas o polipéptidos que exhibían actividad como IFN- ? nativo podían también ser producidas empleando tecnología de ADN recombinante por extracción de ARN mensajero(mARN) 12S, rico en región poli-A, de varias células humanas inducidas, posteriormente se sintetizaba el cADN de doble cadena, usando como una plantilla mARN, se introducía el cADN en un vector de clonación apropiado, se transformaban microorganismos adecuados con el vector para posteriormente cosechar las bacterias y extraer el IFN-/?. Los manuscritos publicados por Scandella & Kornberg, Biochemistry, IQ.4447 (1971 ); Derynck et al., Nature, 287:193 (1980); Nagola. S. et al., Nature, 284:316 (1980); Goeddel. D.V. et al., Nature, 287:411 (1980), Yelverton. E. et al., Nuc. Acid Res., 9:731 (1981 ). Streulí, M. ef al., Proc. Nati Acad. Sci. (U.S.), 78:2848 (1981 ); así como las patentes: EP 28033; EP 32134; EP 34307; BP 837397; US 4315852; US 4343735; US 4343736 y US 4450103, describen varios métodos usados anteriormente para la producción de IFN-/? empleando técnicas de ADN recombinante.

Generalmente, con los métodos descritos en las referencias anteriores, el IFN no era producido en una forma suficientemente pura y en cantidades suficientes para propósitos clínicos y terapéuticos resultando en preparaciones de IFN con cantidades residuales de químicos empleados durante su purificación así como de una considerable microheterogeneidad de moléculas de IFN.

Varias son las referencias que describen procesos enfocados a mejorar la purificación y formulación de Hu IFN- ?. En cuanto a la seguridad de la purificación y la actividad de proteínas heterólogas precipitadas, las patentes US 4462940; EP 114,506; US 4511502; US 4511503; US 4512922 y US 4518526 describen diversos métodos alternativos para mejorar los niveles de pureza de la proteína y selección de componentes en la formulación del Hu IFN-/?.

Además, la patente US 4289689 (publicado en Septiembre 15, 1981 ), presentada por Friesen et al., desglosa cómo recuperar y purificar Hu IFN-/? nativo por cromatografía de afinidad y cromatografía líquida de alta presión.

Sin embargo, hay que tener en cuenta varias consideraciones importantes en la manipulación de una proteína biológicamente activa, tal como el rHU IFN-/?, incluyendo la necesaria preservación de la delicada estructura terciaria para proteger su actividad biológica, la cual requiere, por ejemplo, evitar las condiciones de pH desnaturalizante.

Este punto en particular al igual que otras variantes esenciales en el tema de purificación de proteínas ha sido explorado por más de cincuenta años. La literatura científica en este tema es amplia y numerosas técnicas han sido descritas, incluyendo cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de adsorción, electroforesis en gel, precipitaciones con sulfato de amonio y filtración en gel. Por ello, a lo largo de los años ha habido constantes mejoras en el desarrollo de tecnologías de purificación y, en particular, se ha llegado a la automatización y con ello a la aceleración de los procesos de cromatografía en columna y el desarrollo de geles de electroforesis. A pesar de estos avances, y a pesar de que numerosas proteínas han sido sometidas a esos procedimientos, la elección de un procedimiento, o la combinación de varios, que sea exitoso para una proteína en particular es siempre imprescindible y con ello, la realización de una experimentación considerable para cada caso en particular.

Esta invención prueba unos procesos mejorados de purificación incorporando métodos específicos de cromatografía en fase reversa (RPC) para IFN- ? recombinante. Con este paso cromatográfico se obtiene un producto de IFN- ?de alta pureza a niveles muy reducidos de especies de IFN- ?, endotoxinas bacterianas y proteínas ajenas a IFN- ?. El proceso aquí descrito proporciona opciones flexibles para simplificar y mejorar la eficiencia de la purificación de IFN- ? recombinante al igual que mejora la pureza y homogeneidad del producto.

Recientemente se han detallado diversos procesos de purificación de interferón humano, por ejemplo, la Patente Europea 0108585 describe el empleo subsecuente de tres tipos de cromatografía: a) inmuno-afinidad; b) intercambio catiónico; y c) exclusión molecular y, por otro lado, la Patente Americana 4765903 describe un uso secuencial de cuatro tipos de cromatografía: a) inmuno-afinidad con un anticuerpo monoclonal; b) fase reversa; c) intercambio catiónico; y d) exclusión molecular.

Otro proceso descrito en la literatura es el publicado en la Patente Europea 0679718 que describe un proceso para la producción de interferón alfa que prevé el uso de cuatro pasos cromatográficos: a) quelatos de metales; b) intercambio catiónico; c) intercambio aniónico; d) filtración en gel.

Otras publicaciones y patentes describen tres o más tratamientos necesarios para la purificación de interferones, por ejemplo, USP 4732683, International Patent Application WO 8604067 y la publicación de Khan F.R. & Rai V.R., Bioprocess Technol., 7:161 (1990).

Estos ejemplos muestran cómo la purificación de interferón es particularmente difícil y requiere muchos pasos de purificación. Más aún, se tiene que subrayar cómo los altos niveles de purificación son obtenidos particularmente por cromatografías de inmuno-afinidad empleando para ello anticuerpos monoclonales de origen de ratón. Sin embargo, la presencia de dicha técnica cromatográfica, en procesos de producción industrial destinada a la fabricación de principios activos para uso farmacéuticos en humanos, pone en riesgo posibles contaminaciones vírales con virus de origen de ratón debido a la presencia de posibles fragmentos inmunogénicos provenientes de inmunoglobulinas de roedor en el producto final y por el hecho de las dificultades para validar las matrices cromatográficas desde el punto de vista industrial.

Actualmente, gran parte de la producción de CHO-rHu IFN- 7 es realizado con el modelo de células tumorales de ovario de hámster chino (CHO) [Conradt, H.S. et al., J. Biol. Chem., 262:14600 (1987); Chermajobsky, Y. et al., DNA, 3:297 (1984); McCormick, F. et al., Mol. Cell. Biol., 4:166 (1984)]. Estas células tienen la ventaja de permitir que las proteínas expresadas en el medio de cultivo se obtengan con una composición de carbohidratos ampliamente similar a las proteínas naturales de fibroblastos. Los métodos de purificación para CHO-rHu IFN-/?son similares a los empleados en los casos mencionados anteriormente, esto es, cromatografía de afinidad con Azul de Sepharosa, cromatografía de inmuno-afinidad con anticuerpos monoclonales y cromatografía en fase reversa [Utsumi, J. ef al., J. Biochem., 181:545 (1989)], cromatografía de absorción en CPG y cromatografía de intercambio iónico (Protasi, O. er a/., EPA-0446850 presentado en Dic. 3, 991 ).

En el caso de los interferones recombinantes, las técnicas de purificación antes mencionadas no satisfacen plenamente los requerimientos de producción a gran escala en la que el uso de cromatografía de afinidad o inmuno-afinidad, que permite la obtención de proteínas homogéneas, es muy costoso e involucra un proceso considerable de operación y problemas de validación. Estos problemas son ampliamente reducidos si se emplean fases estacionarías de origen inorgánico o sintético, aunque hasta el momento no han permitido obtener un rHu IFN- ? como producto de la pureza deseada. Consecuentemente, se ha intentado combinar pasos de purificación cromatográfica, las cuales, usando matrices inorgánicas tales como el CPG y matrices sintéticas como la Superosa IDA para uso en cromatografía de metales quelantes (MCC), permitan obtener CHO-rHu IFN-/?con una pureza comparable con la obtenida por cromatografía de afinidad pero con las ventajas antes mencionadas típicas de esas fases. Sin embargo, un serio obstáculo al combinar las técnicas cromatográficas CPG y CC en serie tiene que ser tomado en cuenta por el hecho de que el producto adsorbido en CPG deber ser eluido a pH ácido y la subsecuente adsorción en MCC requiere pH neutro, con el conocimiento de que variaciones en el pH de valores ácidos a neutros resultan en la desactivación completa de CHO-rHu IFN-/? [Tan, Y.K. et al., J. Biol. Chem., 254:8067 (1979)]. La adición de aditivos tales como la albúmina humana, propilenglicol, etc., que reducen el nivel de desactivación, tiene el inconveniente de obstruir las fases de purificación siguientes y por ello deben ser removidos.

Además, cabe señalar que Hu IFN- ? en MCC es normalmente eluido con soluciones que contienen fuertes agentes complejos capaces de desacoplar el metal adherido a la columna (ver: JP-A-8281505) o con soluciones a pH ácido (USP 4,551 ,271). Ambos métodos tienen varios inconvenientes, en el primer caso, el agente complejo contenido en el eluyente remueve no sólo el Hu IFN- ? sino también el metal pesado, el cual contamina el producto purificado y por ello la columna debe ser regenerada después de cada corrida. El segundo método resulta en una menor recuperación en términos de actividad biológica y además el producto purificado es colectado en un medio ambiente ácido haciéndolo inadecuado para su inyección directa en el paciente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención describe a detalle los métodos para el aislamiento y la purificación, de manera secuencial, de CHO-rHu IFN- ? obtenido a partir de cultivos de células CHO y presentes en muestras biológicas de medios de cultivo hasta obtener un producto final con una pureza mayor al 98%. La invención comprende la siguiente secuencia de pasos: (a) una concentración de la proteína presente en el medio biológico mediante filtración de flujo tangencial (TFF) utilizando un agente amortiguador adecuado, preferentemente solución salina o equivalente hasta llegar a ¾¼ del volumen original de la solución filtrada; (b) una primera separación de la proteína objetivo mediante cromatografía de afinidad en una columna de azul de cibacrón mediante un paso de equilibrio de columna empleando un agente amortiguador a pH preferentemente de 7.0, tres pasos de remoción de impurezas con agentes amortiguadores apropiados tales como sales de fosfato de sodio y cloruro de sodio y conteniendo propilenglicol no mayor al 50% y a un pH no mayor a 7.2; (c) una concentración de la proteína aislada del paso anterior mediante ultrafiltración centrífuga a través de una membrana molecular no mayor a 10 kDa; (d) una segunda separación de la proteína objetivo mediante cromatografía líquida de fase reversa (RPC) en una columna de poliestireno y utilizando un agente amortiguador apropiado preferentemente a base de ácido clorhídrico y propilenglicol y en un gradiente de elución lineal a un pH no mayor a 2.5; (e) una concentración de la proteína aislada del paso anterior mediante ultrafiltración centrífuga a través de una membrana molecular no mayor a 10 kDa; (f) una tercera separación de la proteína objetivo mediante cromatografía líquida ¡socrática de filtración en gel (GF; también conocida como cromatografía de exclusión molecular o SEC) empleando una columna de Sephacryl S-100 y un agente amortiguador apropiado preferentemente acetato de sodio a pH no mayor a 4.0; y (g) una liofilización del eluato del paso anterior a una presión de vacío no mayor a 0.1 mBar y una temperatura no mayor a -50°C en una secuencia de pasos no mayor de 16 horas.

El proceso de purificación de CHO-rHu IFN- ?de acuerdo a la presente invención consiste en la secuencia de pasos de tres cromatografías: (1 ) de afinidad en columna Blue-sepharose; (2) fase reversa y (3) filtración en gel en columna de Sephacryl S-100.

El primer paso cromatográfico, llevado a cabo en una columna de azul de cibacrón, es considerado el más importante y crítico en esta invención. La matriz base de esta columna es una Sepharose de alto rendimiento. La naturaleza de carbohidratos de la base de agarosa proporciona un entorno hidrofílico y químicamente favorable para el acoplamiento aunado a una estructura altamente entrecruzada de una matriz esférica de 34 µp\. La tinción del ligando, azul de cibacrón, pertenece a una especial clase de ligandos grupo-específicos de considerable utilidad, muestra ciertas similitudes estructurales con moléculas naturales, como los co-factores NAD+ y NADP+, que le permite unirse fuertemente y de forma específica a una amplia gama de proteínas, incluyendo quinasas, deshidrogenasas, y la mayoría de otras enzimas que requieren sustancias que contengan grupos adenilil.

Este ligando está unido covalentemente a la matriz de Sepharose de alto rendimiento a través de la parte de triazina de la molécula colorante. La estructura química del ligando es: y se comercializa con el nombre de Cibacron™ Blue F3G-A (GE HEALTHCARE).

Sin embargo, la remoción de impurezas, e.g. pirógenos, no es satisfactoria usando sólo la cromatografía de afinidad con azul de cibacron como ligando, por ello, el empleo de subsecuentes pasos de purificación como la cromatografía en fase reversa y la cromatografía de filtración en gel son indispensables.

El segundo paso cromatográfico es realizado en una columna de fase reversa, la cual ofrece grandes ventajas por la naturaleza de la matriz de la fase estacionaria. La columna empleada en la presente invención está empacada con una matriz a base de perlas de poliestireno. Un esquema parcial de la estructura de la fase estacionaria empleada en esta invención es: Las perlas de poliestireno tienen una excelente estabilidad química en condiciones amplias de pH, por lo que presenta grandes ventajas en la separación de mezclas de proteínas así como trabajar con una amplia gama de gradientes de amortiguadores y flujos a través de la columna.

El paso final de cromatografía es realizado en una columna de Sephacryl S-100. El Sephacryl es un medio compuesto por la unión covalente de un alilo de dextrano con la ?/,?/'-metilen bisacrilamida para formar una matriz hidrofílica de alta fuerza mecánica. Su estructura molecular se detalla a continuación: En la presente invención se utilizó el Sephacryl S-100 HR cuya capacidad es la separación de moléculas proteicas en el rango de 1 ? 103 a 1 * 105 Da.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención describe los métodos para el aislamiento y la purificación eficientes, de forma secuencial, de interferón beta humano recombinante obtenido a partir de cultivos de células tumorales de ovario de hámster chino (CHO-rHu IFN- 3) y presente en muestras biológicas de medios de cultivo hasta obtener una proteína con un nivel de pureza 98%.

Definiciones Las definiciones descritas a continuación y utilizadas en esta invención tienen sólo propósitos ilustrativos y no limitan su alcance. Otros términos utilizados en la presente invención podrán ser entendidos de manera apropiada por un experto en el área del conocimiento específico de la misma.

El término "CHO-rHu IFN-/?" refiere a una proteína de interferón recombinante humano obtenido a partir de cultivos de células tumorales de hámster chino las cuales han sido modificadas por técnicas de ADN recombinante haciéndolas capaces de expresar la proteína de interferón humano al medio de cultivo.

Como se utiliza en la presente invención, "cultivos de células CHO" describe un conjunto de técnicas de laboratorio que permiten tanto la proliferación de colonias de células tumorales de hámster chino (CHO) adherentes, formando monocapas de células, en recipientes de cultivo, como la expresión de interferón beta recombinante humano (rHu IFN- 3). Éstas técnicas de laboratorio incluyen la criopreservación de los cultivos celulares (bancos celulares) en condiciones criogénicas en nitrógeno líquido, la activación de los mismos de su almacenamiento criogénico, el cultivo secuencial en medios de cultivo específicos con el fin de obtener mayor cantidad de biomasa celular, pasando de recipientes con 5 ml_ de medio de cultivo, para proliferación celular, hasta sistemas de cultivo celular con 3 L o más de medio de cultivo, para expresión de la proteína de interferón [para mayor información véase: Freshney, R.I., Culture of Animal Cells, John Wiley & Sons, Eds., 5th Ed., New Jersey, USA (2005); Butler, M., Animal Cell Culture & Technology, BIOS Scientific Pubs., 2nd Ed., Abingdon, UK (2004)].

Cuando se utiliza el término "muestras biológicas" se refiere a los medios de cultivo extraídos de los cultivos celulares, en su fase de expresión de proteína, y que han sido conservados en a -70°C.

El término "filtración de flujo tangencial (TFF)" se refiere a un proceso de separación llevada a cabo bajo presión y en el cual se utiliza una membrana para separar los componentes, en una solución líquida o suspensión, basada en su tamaño molecular o diferencia en sus cargas eléctricas. En la TFF el fluido es bombeado tangencialmente a la superficie de la membrana de filtración. La aplicación de una presión sirve para forzar a una porción del fluido a pasar a través de la membrana hacia el lado del filtrado. Las partículas y las macromoléculas que son demasiado grandes para atravesar los poros de la membrana son retenidas, sin embargo, no se acumulan en la superficie de ésta, ya que son removidas por el flujo tangencial [para mayor información véase: Ng, P. et al., Sep. Sci., 11:499 (1976); van Reís, R. et al., Biotech. & Bioeng., 56:71 (1997); van Reis, R. et al., J. Membrane Science, 130:123 (1997); Walsh, G., Biopharmaceuticals: Biochemistry and Biotechnology, John Wiley & Sons, Chichester, UK (2001)].

En esta invención se utiliza el término "ultrafiltración centrífuga". La ultrafiltración es un proceso convectivo que emplea membranas semi-permeables anisotrópicas para separar macromoléculas y solventes con base principalmente en su tamaño. Este proceso es particularmente apropiado para la concentración de macromoléculas y se utiliza para la purificación de especies moleculares o el intercambio de solventes. La ultrafiltración es un proceso suave, no desnaturalizante además de ser más eficiente y flexible que otros procesos alternativos. La ultrafiltración centrífuga se caracteriza por ser un método rápido, delicado y que trabaja con la mayoría de los solventes comunes en purificación de proteínas. La muestra es colocada en el recipiente superior de un dispositivo que contiene una membrana de ultrafiltración. La muestra en el dispositivo es sometida a centrifugación y la solución filtrada es recibida en el recipiente inferior del dispositivo. Las moléculas mayores al diámetro de poro de la membrana se concentran en el recipiente superior mientras que el solvente con las moléculas menores al diámetro de poro de la membrana se reciben en el recipiente inferior [para mayor información véase: Radhakrishna S. ef al., Mol. & Cell. Prot, 2:1096 (2003); Lyn, C.Y. et al., Electrophoresis, 29:3024 (2008)].

El término "cromatografía de afinidad" se refiere a un proceso de separación de proteínas basado en la interacción reversible entre una proteína (o grupo de proteínas) y un ligando acoplado a una matriz cromatográfica. Entre las ventajas que presenta la cromatografía de afinidad está la de tener una alta selectividad, y con ello una alta resolución, y usualmente una alta capacidad para proteínas de interés. La purificación de proteínas por esta técnica cromatográfica puede llegar al orden de varios miles de veces y la recuperación de proteínas activas generalmente es muy alta. La cromatografía de afinidad es ideal en los procesos de purificación ya que es la única técnica que permite la purificación de una biomolécula sobre la base de su función biológica o la estructura química individual. La purificación de proteínas se puede lograr fácilmente con la cromatografía de afinidad que, de otro modo, sería muy dilatado, difícil o incluso imposible utilizando otras técnicas. La técnica se puede utilizar para separar las biomoléculas activas de diferentes formas desnaturalizadas o funcionales, para aislar las sustancias puras presentes a bajas concentraciones en grandes volúmenes de muestras crudas al igual que para eliminar contaminantes específicos [para mayor información véase: Cuatrecasas, P., J. Biol. Chem., 245:3059 (1970); Voet, D. & Voet, J., Biochemistry, John Wiley & Sons., New York, USA (1995); Affinity Chromatography, Principies and ethods, Amersham Biosciences (2002); Hagel, L, Jagschies, G. & Sofer, G., Handbook of Process Chromatography, Academic Press, Amsterdam, Holanda (2008)].

Como se utiliza en la presente invención, "cromatografía líquida de fase reversa (RPC)" hace referencia a una técnica cromatográfica basada, al igual que la cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC), en las interacciones de regiones hidrofóbicas en la superficie de biomoléculas y las superficies hidrofóbicas de un medio cromatográfico. Generalmente, la superficie de un medio RPC es más hidrofóbica que la de un medio HIC. Esto provoca interacciones más fuertes con las biomoléculas que, para obtener una elución más satisfactoria, debe ser invertida usando solventes orgánicos no polares como el acetonitrilo o metanol. Generalmente, la separación de biomoléculas por RPC depende de la interacción hidrofóbica reversible entre las moléculas en el eluyente (fase móvil) y el medio cromatográfico (fase estacionaria). Las condiciones iniciales de la RPC son principalmente acuosas, esto es, favorecen un alto grado de estructura acuosa organizada alrededor de las moléculas de la muestra. Frecuentemente, en esta primera fase de separación por RPC, se adiciona un pequeño porcentaje de modificador orgánico (e.g., de 3 a 5% de acetonitrilo) con el fin de "humedecer" las superficies de la fase estacionaria. Ya que la muestra se asocia a la fase estacionaria, es minimizada el área hidrofóbica de aquella expuesta al eluyente. La separación se basa en el equilibrio de las moléculas de la muestra existente entre el eluyente y la superficie de la fase estacionaria. La distribución de la muestra dependerá de su hidrofobicidad, las propiedades de la fase estacionaria y la composición de la fase móvil. Inicialmente, las condiciones de la RPC favorecen un estado de equilibrio extremo donde prácticamente el 100% de la muestra se asocia con la fase estacionaria. Debido a que las proteínas y los péptidos se constituyen de una mezcla de aminoácidos hidrofílicos e hidrofóbicos accesibles en cadenas largas, la interacción con la fase estacionaria tiene una naturaleza de acoplamiento multi-puntual. La elución de la proteína de interés es obtenida al incrementar la concentración de un solvente orgánico con el fin de convertir la solución de elución más hidrofóbica. Tanto la asociación de la muestra a la fase estacionaria como su elución ocurren de manera continua a lo largo de la columna cromatográfica. Debido a que las muestras son eluidas de acuerdo a su hidrofobicidad, las muestras más hidrofóbicas tienden a moverse más lentamente en la RPC [para mayor información véase: Hodges, R.S., & Mant, C.T., High Performance Liquid Chromatography of Peptides and Proteins: Separation, Analysis and Conformation, CRC Press, Boca Ratón, USA (1991 ); Olson, C.V., eí al., J. Chromatogr. A, 675:101 (1994); Walker, J.M., The Protein Protocols Handbook, Humana Press, 2nd Ed., New Jersey, USA (2002)].

El término empleado en esta invención, "cromatografía líquida ¡socrática de filtración en gel (GF)", se refiere a la técnica más simple y suave de separación de moléculas basada en el tamaño molecular de éstas. Como resultado de la introducción del Sephadex™ (marca registrada, por PHARMACIA en 1959, para un gel entrecruzado compuesto por perlas macroscópicas sintéticas derivadas del polisacárido dextrano que forman una red tridimensional con grupos iónicos funcionales acoplados por uniones éter a las unidades de glucosa de las cadenas de poiisacáridos), la cromatografía por filtración en gel ha jugado un papel fundamental en la purificación de proteínas y enzimas, polisacáridos, ácidos nucleicos y otras moléculas biológicas. Esta técnica puede ser usada para remover contaminantes de alto o bajo peso molecular, remoción de sales, intercambio de amortiguadores, aislamiento de uno o más biomoléculas, separación de monómeros de agregados o para el análisis de distribución de pesos moleculares [para mayor información véase: Creighton, T.E., Proteins, Structures and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., 2nd Ed., New York, USA (1993); Bollag, D.M., Methods in Mol. Biol., 36:1 (1995); Hagel, L, Curr. Prot. in Protein Sci., 14:8.3 (2001 )].

El término "amortiguadores" se refiere a soluciones que contienen una mezcla de un ácido débil y su base débil conjugada y capaz de resistir cambios sustanciales en el pH a la adición de sustancias ácidas o básicas [para mayor información consúltese: Stenesh, J., Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons, 2nd Ed., New York, USA (1989); Stryer, L, Biochemistry, W.H. Freeman & Co., 4th Ed., New York, USA (1995)].

Cuando se emplea el término, "Sephacryl S- 00" se refiere a una matriz de un copolímero entrecruzado de un alilo de dextrano y ?/,?/'-metilen bisacrilamida. Este medio entrecruzado ofrece una buena rigidez y estabilidad química. La estrecha distribución de tamaños de las partículas, junto con pronunciadas curvas de selectividad, se traduce en buenas características de preparación que mantiene una alta resolución. La naturaleza hidrofílica del medio minimiza la adsorción no específica y maximiza la recuperación [para mayor información véase: Ward, W.W. & Swiatek, G., Curr. Anal. Chem., 5:1 (2009); Gel Filtration, Principies and Methods, GE Healthcare (2010)].

Como se utiliza en la presente invención, "liofilización" describe un proceso donde el agua u otro solvente es removida de un material congelado convirtiendo el agua congelada directamente en vapor sin la formación intermedia de agua líquida. Este proceso es conocido como sublimación y está basado en la absorción de calor por la muestra congelada para vaporizar el hielo en condiciones de alto vacío. El empleo de una bomba de vacío a un sistema de liofilización incrementa la remoción de vapor de agua de la superficie de la muestra, transfiere el vapor de agua a una trampa colectora que a su vez remueve el calor para condensar el vapor de agua. En esencia, el proceso de liofilización es un equilibrio entre el calor absorbido por la muestra para vaporizar el hielo y el calor removido por la trampa de condensación para convertir el vapor de agua en hielo [para mayor información véase: Meryman, H.T., Ann. New York Acad. Sci., 85:630 (2006); Adams, G., Methods in Mol. Biol., 368:15 (2007)].

Descripción del proceso La presente invención describe una secuencia de métodos para la purificación de ¡nterferón beta humano recombinante a partir de cultivos de células CHO. Dicha secuencia incluye tres pasos de cromatografía preparativa suficientes para la obtención de una proteína de alta pureza. Pasos adicionales de cromatografía no son necesarios para obtener este alto nivel de pureza.

La proteína de interés puede ser obtenida a partir de distintas células huésped que han sido genéticamente modificadas. Los métodos para la modificación genética de células huésped son muy conocidos en la literatura [véase: Alberts, B.( et. al., Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing, Inc., 3rd Ed. (1994); Freshney, R.I., Culture of Animal Cells, John Wiley & Sons, Eds., 5th Ed., New Jersey, USA (2005); Butler, M., Animal Cell Culture & Technology, BIOS Scientific Pubs., 2nd Ed., Abingdon, UK (2004)] e incluyen la introducción de ácidos nucleicos que codifican y permiten la expresión de la proteína deseada en la célula huésped. Estas células huésped pueden ser bacterias, hongos o preferentemente células animales crecidas en cultivos. Las cepas de bacterias más empleadas para la expresión de proteínas recombinantes pertenecen a la especie Escherichia coli. Ejemplos de algunas cepas usadas en la producción de diversas proteínas incluyen: HB101 , DR5a, GM2929, JMI09, KW251 , NM538 y NM539, entre otras. Ejemplo de hongos usados para la producción de proteínas a nivel industrial son, entre otras, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris y Aspergillus spp. Dentro de las diversas líneas celulares de animales empleadas con este propósito se tienen: CHO, VERO (aislada de tejido epitelial de riñon del mono verde africano Chlorocebus sp.; conocido anteriormente como Cercopithecus aethiops), DXB1 1 (derivada de la línea CHO-K1 ; también referida como CHO-DUKX o CHO-DUK-XB1 1 ), BHK (extraída de riñon de crías de hámster), HeLa (obtenida de tejido humano canceroso cérvico-uterino), Cos (obtenida al "inmortalizar" la línea celular CV-1 derivada de células de riñon de mono verde africano), MDCK (extraída de epitelio renal canino), HEK 293 (derivada de epitelio renal embrionario humano), 3T3 (derivada de fibroblastos embrionarios de ratón), NSO (derivada de mieloma de ratón) y la WI138 (obtenida de pulmón normal fetal humano). Particularmente existen varios tipos de células CHO usados en diversas disciplinas de investigación en biotecnología y en producción de proteínas recombinantes, e.g., aunque no limitantes a, CHO-K1 , CHO-DG44, CHO-DXB1 1 , CHO/dhfr" and CHO-S. El proceso de la presente invención describe una secuencia de purificación de interferón humano recombinante proveniente de cultivos de una línea celular de CHO, derivada de la línea CHO-DG44.

La preparación de un extracto de cultivo celular para la purificación de proteínas depende principalmente de la forma de expresión de la proteína. Cuando se utilizan técnicas de ADN recombinante, la proteína de interés puede ser producida intracelularmente, en el espacio periplásmico (e.g., cultivos bacterianos) o directamente secretada en el medio de cultivo (e.g., cultivos de células de mamífero). Para las proteínas producidas intracelularmente, la célula debe ser lisada mediante algún método sea éste mecánico (e.g., rompimiento mecánico y choque osmótico) o enzimático. Con el rompimiento de la pared celular se libera todo el contenido intracelular en el homogenízado además de producir fragmentos subcelulares que deben eliminarse ya sea por centrifugación o filtración. Un problema similar surge, aunque en menor medida, con las proteínas secretadas directamente debido a la muerte natural de las células huésped y la liberación de proteínas indeseables del interior celular durante el curso de la producción de proteínas.

Para lograr la mejor obtención de la proteína deseada, cualquier método puede ser empleado por un técnico experimentado en el área. Si la proteína se produce intracelularmente, como un primer paso, los residuos, ya sean células huésped o fragmentos lisados, se pueden eliminar, por ejemplo, con un paso de centrifugación o filtración con el fin de preparar una mezcla limpia para el proceso de purificación. Por otro lado, si la proteína es secretada al medio, las células huésped recombinantes pueden ser separadas del medio de cultivo celular mediante filtración de flujo tangencial (TFF) o filtración de profundidad, con el fin de obtener una mezcla libre de residuos celulares (e.g., membranas u organelos celulares) a fin de preparar una mezcla para la purificación.

De acuerdo a la presente invención, una vez obtenido el medio sobrenadante a partir de los cultivos celulares, éste es centrifugado, bajo condiciones apropiadas (e.g., aunque no limitante a, aplicando una fuerza de entre 10,000 a 15,000 * g, preferentemente 13,500 * g durante 20 a 40 minutos), para remover residuos y organelos celulares. El medio centrifugado es ultrafiltrado mediante la técnica de filtración tangencial empleando una membrana de corte molecular de 10 kDa y una presión hidráulica de, aunque no de forma limitante, entre 0.5 y 2.0 bar (kg/cm2), preferentemente 1.0 bar. Con la filtración tangencial, el volumen del medio de cultivo recuperado y centrifugado es reducido a un 10% de su volumen original, incrementando sustancialmente la concentración de la proteína deseada y facilitando su purificación en los pasos subsecuentes de cromatografía líquida.

En particular, la presente invención utiliza el sistema de filtración tangencial Pellicon 2 (MILLIPORE, Massachusetts, USA) con una membrana de filtración de celulosa regenerada PLCGC-C (MILLIPORE, Massachusetts, USA) de 10 kDa de corte molecular.

El medio ultrafiltrado es sometido a cromatografía de afinidad. La columna empleada en la presente invención es la HiTrap™ Blue HP de 5 mi (GE HEALTHCARE, Uppsala, Suecia). Esta columna pre-empacada con Blue Sepharose™ de alto rendimiento permite la separación rápida y segura de la proteína deseada con una alta eficiencia de afinidad. La base de agarosa presenta una naturaleza compuesta por carbohidratos que permite un medio ambiente muy favorable para el acoplamiento de la proteína de interés aunado a un diámetro de 34 µt? de su matriz esférica. Además, el ligando Cibacron™ Blue F3G-A (GE HEALTHCARE, Uppsala, Suecia), acoplado a la Sepharosa por la estructura de triazina de la molécula de tinción, permite un acoplamiento muy fuerte y específico.

En una modalidad, se empleó la matriz Blue Sepharose 6 Fast Flow (GE HEALTHCARE, Uppsala, Suecia). Este medio tiene covalentemente acoplado el ligando Cibacron™ Blue 3G. Las propiedades de esta matriz de afinidad son idénticas a aquéllas de las columnas pre-empacadas permitiendo un acoplamiento de la proteína deseada mayor a 18 mg/mL de medio eluido. Esta matriz fue empacada en una columna de vidrio para aumentar la capacidad de procesamiento de medio filtrado.

En ambos casos, para el equilibrio de la columna se empleó una fase móvil a base de fosfato de sodio y pH neutro, preferentemente con un flujo no mayor a 5 mL/min. La captura de la proteína deseada así como su elución se llevó a cabo de una forma discontinua, a saber: a) un paso de acoplamiento de la proteína deseada a un flujo menor a 5 mL/min, preferentemente 3 mL/min y más preferentemente entre 1 y 2 mL/min; b) tres pasos de elución de impurezas empleando una fase móvil a base de fosfato de sodio, propilenglicol y/o cloruro de sodio y en condiciones óptimas de pH y un flujo de fase móvil menor a 5 mL/min, preferentemente 3 mL/min y más preferentemente entre 1 y 2 mL/min; c) una paso de elución de la proteína deseada empleando una fase móvil a base de fosfato de sodio, propilenglicol y cloruro de sodio y en condiciones óptimas de pH y un flujo de fase móvil menor a 5 mL/min, preferentemente 3 mL/min y más preferentemente entre 1 y 2 mL/min.

La proteína eluida de la columna de afinidad fue concentrada empleando la técnica de ultrafiltración centrífuga. La solución de proteína proveniente de la columna de afinidad fue ultrafiltrada a través de una membrana de celulosa regenerada Ultracel® PL (MILLIPORE, Massachusetts, USA) con punto de corte de 10 kDa. La ultrafiltración se llevó a cabo empleando un rotor de cubeta oscilatoria aplicando una fuerza centrífuga relativa no mayor a 3,000 * g, preferentemente 1 ,500 * g durante un período no mayor a 40 minutos, preferentemente de 15 a 20 minutos. Este método permitió remover la fase móvil de la columna de afinidad y con ella el contenido de propilenglicol y sales empleadas en el paso de elución de la proteína. La proteína concentrada, una vez lavada y ajustado el pH apropiadamente, fue resuspendida en la fase móvil de la columna de fase reversa.

El siguiente paso fue la segunda separación cromatográfica con base en las propiedades hidrofóbicas de la proteína de interés mediante cromatografía en fase reversa (RPC). Se empleó una columna SOURCE 15RPC ST 4.6/100 column (GE HEALTHCARE, Uppsala, Suecia) de 15 cm de longitud y 15 µp\ de tamaño de partícula de la fase estacionaria. El primer paso fue la adsorción de la proteína de interés a la matriz de la columna empleando una fase estacionaria a base de ácido clorhídrico y propilenglicol a pH menor a 4, preferentemente a pH de 1.0 a 3.0 y más preferentemente a pH entre 1.5 y 2.5. El flujo de la proteína en solución a través de la columna fue establecido menor a 3 mL/min, preferentemente < 2 mL/min. Después del paso de adsorción, se llevó a cabo una limpieza de impurezas de la fase móvil de la columna empleando un amortiguador a base de ácido clorhídrico a pH < 2.5. Para la elución de la proteína de interés se empleó un gradiente de elución lineal de <50% de amortiguador A (compuesto de ácido clorhídrico y propilenglicol, pH < 3.0) a <80% de amortiguador B (compuesto de ácido clorhídrico y etanol, pH < 3.0). Una vez eluida la proteína de interés, la muestra fue sometida a ultrafiltracion centrífuga como se mencionó anteriormente. La proteína concentrada fue resuspendida en la fase móvil de la tercera columna de separación.

La tercera cromatografía líquida empleada en la presente invención fue de filtración en gel (GF) teniendo en consideración el peso molecular de la proteína de interés. Para ello, se utilizó una columna de Sephacryl S-100 (GE HELTHCARE, Uppsala, Suecia) que permite la separación de proteínas con un rango de 1.0 - 100 kDa en condiciones ¡socráticas. La proteína concentrada fue cargada a la columna cromatográfica a un flujo < 2.0 mL/min, preferentemente entre 1.0 - 1.5 mL/min y más preferentemente < 1.0 mL/min. La elución de la proteína de interés se llevó a cabo empleando una fase móvil a base de acetato de sodio y a un pH < 4.5, preferentemente a pH entre 2.0 - 4.0 y más preferentemente a pH <4.0.

Si se requiere una formulación de proteína grado terapéutico, se puede llevar a cabo una clarificación de partículas virales, e.g., a través de un paso de filtración. Los dispositivos de filtración para la remoción de partículas virales son muy conocidos en el campo (e.g., Ultipor® VF Grade DV20 o DV50 y Filtran® TFF, PALL CORPORATION; Viresolve, ILLIPORE; VR CDNO, CDNO; Planova®, ASAHI KASEI PHAR A; y Virosart®, SARTORIUS). Estos dispositivos y similares, remueven partículas virales y materiales biológicos menores a 20nm y con retenciones virales de 4 a 6 logi0l con ello pueden ser removidos partículas virales de la familia del virus de la poliomielitis. Cabe aclarar que este paso de remoción de virus no es requerido para la obtención del nivel de pureza de la proteína en la presente invención.

Finalmente, la proteína eluida de la columna de GF fue sometida a liofilización durante un penodo no mayor a 16 horas, preferentemente 14 horas, a una presión de vacío <5.0 mBar, preferentemente entre 1.0 - 3.0 mBar y más preferentemente <1.0 mBar y una temperatura del colector de humedad <-50°C. Estas condiciones de liofilización permitieron una proteína en polvo con una humedad relativa <2.0% m/v y con una pureza de la proteína >98.0%.

Breve Descripción de las Figuras FIG. 1. Diagrama de Flujo que muestra los pasos de purificación de la presente Invención.

FIG. 2. Cromatograma de muestra eluida de la columna de afinidad. El análisis se realizó por HPLC en una columna Lichrosorb C-8 de fase reversa, de 200 mm, 4.6 I.D. y 10 µt? de tamaño de partícula, en un gradiente de fases lineal de 30% acetonitrilo - 0.1 % ácido trifluoroacético a 80% acetonitrilo - 0.1% ácido trifluoroacético, durante 20 volúmenes de columna.

FIG. 3. Electroforogramas de proteína eluida de la columna de afinidad. Panel izquierdo: SDS-PAGE - Western Blotting - Quimioluminiscencia. Panel Derecho: SDS-PAGE - Tinción con plata. Los carriles a, b y c son correspondientes entre ambas imágenes. El carril a la extrema derecha en el panel de tinción de plata corresponde a los estándares de pesos moleculares. Proteína total por carril: 2 µ§.

FIG. 4. Cromatograma de muestra eluida de la columna de fase reversa (RPC). El análisis por HPLC se realizó tal como se indica en la FIG.2.

FIG. 5. Electroforogramas de proteína eluida de la columna de fase reversa. Panel izquierdo: SDS-PAGE - Western Blotting - Quimioluminiscencia. Panel Derecho: SDS-PAGE - Tinción con plata. Los carriles a, b y c son correspondientes entre ambas imágenes. El carril a la extrema derecha en el panel de tinción de plata corresponde a los estándares de pesos moleculares. Proteína total por carril: 2 µ .

FIG. 6. Cromatograma de muestra eluida de la columna de filtración en gel (GF). El análisis por HPLC se realizó como se indica en la FIG. 2.

FIG. 7. Electroforogramas de proteína eluida de la columna de filtración en gel.

Panel izquierdo: SDS-PAGE - Western Blotting - Quimioluminiscencia. Panel Derecho: SDS-PAGE - Tinción con plata. Los carriles a, b y c son correspondientes entre ambas imágenes. El carril a la extrema derecha en el panel de tinción de plata corresponde a los estándares de pesos moleculares. Proteína total por carril: 2 µg.

EJEMPLO A continuación se describen a detalle los métodos empleados en la presente invención. Sin embargo, la descripción de los pasos del proceso de purificación de una proteína recombinante, objeto de la presente invención, es sólo de carácter ilustrativo y por ello la presente invención no está limitada o se encuentra restringida a este ejemplo. La secuencia de los pasos del proceso aquí descrito se muestra en la FIG. 1.

Filtración de flujo tangencial (TFF) Previo a este paso, el medio de cultivo fue descongelado de su conservación criogénica y acondicionado entre 4-10°C. La filtración de flujo transversal fue llevada a cabo en un sistema Pellicon 2 (MILLIPORE, Massachusetts, USA) con una membrana de filtración de celulosa regenerada PLCGC-C (MILLIPORE, Massachusetts, USA) de 10 kDa de corte molecular. Por cada paso de filtración se pasaron de 3-12 L de medio de cultivo a una presión de entrada al sistema de 0.5-2.0 bar, preferentemente de 1.0 bar. El medio fue concentrado entre 3 y i¾ de su volumen inicial.

Cromatografía de afinidad en columna pre empacada Este paso se llevó a cabo en una columna pre empacada HiTrap™ Blue HP (GE HEALTHCARE, Uppsala, Suecia) de 5 mi de volumen de columna. Primeramente, la columna fue equilibrada haciendo pasar alrededor de 10 volúmenes de columna (CV) de una solución de amortiguador de fosfato de sodio 20 mM conteniendo EDTA a una concentración no mayor a 1.0 mM a un flujo <5.0 mL/min. Una vez equilibrada la columna, se inyectaron hasta 50 mL de medio de cultivo concentrado, del paso de TFF, a un flujo <5.0 mL/min, seguido de un lavado de la columna con alrededor de 3 a 5 CV del amortiguador de equilibrio. Una vez inyectado el medio de cultivo y realizado el lavado de la columna, se procedió a la remoción de las impurezas proteicas no acopladas a la matriz de la columna mediante tres pasos de lavados secuenciales, a saber: a) alrededor de 3 CV de una solución de fosfato de sodio 20 mM conteniendo hasta 50% de propilenglicol y a pH 7.0, preferentemente 7.2 y un flujo no mayor a 5 mL/min; b) alrededor de 3 a 5 CV de un amortiguador de fosfato de sodio 20 mM conteniendo cloruro de sodio hasta 2.0 M y a pH 7.0, preferentemente 7.2 y un flujo no mayor a 5 mL/min, preferentemente 3 mL/min; y c) un lavado con 3 a 5 CV, preferentemente 3 CV, de una solución de fosfato de sodio 20 mM conteniendo cloruro de sodio 2 mM y 20% de propilenglicol y a pH 7.0, preferentemente 7.2, con un flujo no mayor a 5 mL/min. La elución de la proteína deseada se obtuvo al hacer pasar alrededor de 3 CV de un amortiguador a base de fosfato de sodio 20 mM conteniendo 50% de propilenglicol y cloruro de sodio a una concentración no mayor a 2.0 M y a pH fisiológico, preferentemente 7.2, con un flujo no mayor a 5 mL/min.

En una variante de la cromatografía de afinidad, 50 mi de Blue-Sepharose 6 Fast Flow (GE HEALTHCARE, Uppsala, Suecia) fueron empacados en una columna de vidrio XK-16/40 (GE HEALTHCARE, Uppsala, Suecia) para hacer una columna de cromatografía de afinidad. Previo a la cromatografía, la columna fue dejada en reposo por 24 h a 4°C con el fin de verificar la homogeneidad y óptimas condiciones de empaque. La columna fue equilibrada como se indica para la columna pre empacada y el medio concentrado e inyectado a la columna fue de hasta 200 mL. Tanto los lavados como la elución de la proteína fueron llevados a cabo conforme a lo descrito anteriormente. La pureza de CHO-rHu IFN-/2, proveniente, tanto de la elución de la proteína de la columna pre empacada como de la columna de vidrio empacada en el laboratorio, fue de alrededor de 90%. La FIG. 2 muestra el análisis por HPLC en columna de fase reversa de una muestra representativa de la proteína eluida de la columna de afinidad. Para comprobar la naturaleza del pico de resolución en el análisis por HPLC, la solución de proteína eluida de la columna fue analizada por electroforesis vertical en gel de poliacrilamida seguido por una electrotransferencia Western-blotting a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) y resuelto con un anticuerpo monoclonal anti-Hu IFN- ? empleando la técnica de quimioluminiscencia y fotodocumentación digital. El electroforograma y su resolución quimioluminiscente se muestran en la FIG. 3.

Ultrafiltración centrífuga La proteína eluida de la columna de afinidad fue sometida a ultrafiltración centrífuga a través de una membrana de celulosa regenerada Ultracel® PL (MILLIPORE, Massachusetts, USA) con un corte de 10 kDa. 50-70 ml_ de solución de proteína fueron cargados en un filtro Centricon® (MILLIPORE, Massachusetts, USA) y sometidos a centrifugación a una fuerza centrífuga relativa no mayor a 3,500 * g, preferentemente de 2,500 - 3,000 ? g, durante un período no mayor a 40 minutos, preferentemente de 15-20 minutos y 4-10°C hasta concentrar la solución a un volumen de 200-500 µ?.

Cromatografía líquida de fase reversa (RPC) La proteína en solución y ultrafiltrada, proveniente de la columna de afinidad, fue inyectada en una columna de fase reversa SOURCE 15RPC ST (GE HEALTHCARE, Uppsala, Suecia) de 100 mm de longitud, 4.6 mm de diámetro interno y un tamaño de partícula de 15 µt?. Primero, la columna fue equilibrada con alrededor de 5 CV con un amortiguador a base de ácido clorhídrico al 0.1 % y 3.0% de propilenglicol con un flujo 1.0 mL/min, preferentemente 0.5 mL/min. Una vez equilibrada la columna, la proteína en solución fue inyectada con un flujo <2.0 mL/min, preferentemente de 1.0 mL/min. Una vez que la solución de proteína fue inyectada, se realizó un lavado de la columna con alrededor de 3 CV de amortiguador de lavado a base de ácido clorhídrico al 0.1 % y pH <2.5, preferentemente 2.1 y con un flujo <1.0 mL/min, preferentemente 0.5 mL/min. Para la elución de la proteína de interés se realizó una elución en gradiente lineal de 45% de un amortiguador a base de ácido clorhídrico al 0.1 % conteniendo 3.0% de propilenglicol, pH <2.5, preferentemente 2.1 , a 80% de ácido clorhídrico al 0.1 % en una solución de 90% de etanol. Un análisis por HPLC, en columna C-8 de fase reversa, de la proteína eluida después de la cromatografía en fase reversa se muestra en la FIG. 4. La pureza de CHO-rHu IFN-/? fue de alrededor de 70%. Como se indicó en el paso de cromatografía de afinidad, para la identidad del pico resuelto en el análisis por HPLC de la solución de proteína eluida de la columna de fase reversa, se realizó un análisis por electroforesis en gel de poliacrilamida seguido de una electrotransferencia Western-blotting y una resolución empleando un anticuerpo monoclonal anti-Hu IFN- ? mediante una técnica de quimioluminiscencia y fotodocu mentación digital. El electroforograma y su resolución quimioluminiscente se muestran en la FIG. 5.

Cromatografía líquida de filtración en gel De acuerdo al análisis por HPLC y la identificación por quimioluminiscencia, la solución que contenía CHO-rHu IFN-/?, proveniente de la columna de fase reversa, fue sometida a separación por cromatografía de filtración en gel (GF). Para ello se empleó una columna HiPrep 26/60 Sephacryl S-100 (GE HEALTHCARE, Uppsala, Suecia) de un promedio de 47 µp\ de tamaño de partícula y un volumen de columna de 320 mL. La columna fue equilibrada con 2 CV de un amortiguador a base acetato de sodio 20 M, pH <4.5, preferentemente 4.0, y un flujo <3.0 mL/min, preferentemente de 2.6 mL/min. La proteína en solución fue inyectada a la columna en un volumen < 15 mL, preferentemente de 10 a 13 mL, con un flujo < 1.5 mL/min, preferentemente de 1.0 mL/min y más preferentemente de 0.5 mL/min y eluida con un amortiguador a base acetato de sodio 20 mM, pH <4.5, preferentemente 4.0, y un flujo < 1 .5 mL/min, preferentemente de 1.3 mL/min. La pureza de CHO-rHu IFN-/? fue de alrededor de 90% como se muestra en el cromatograma de la FIG. 6. Como se ha indicado en los ejemplos anteriores, se realizó una identificación del pico resuelto por HPLC mediante electroforesis seguido por electrotransferencia Western blotting y reacción por quimioluminiscencia, empleando un anticuerpo anti-Hu IFN-/?, y fotodocumentación digital. La FIG. 7 muestra el electroforograma y el registro quimioluminiscente.

Aplicación Industrial Con la presente invención se puede lograr la purificación de interferón beta humano recombinante mayor al 98%. Con la secuencia de pasos aquí descrita no son necesarios pasos adicionales de purificación que pudieran poner en riesgo la integridad de la molécula o generar productos de degradación en la proteína purificada. Con la presente invención se asegura un método rápido y fiable para obtener interferón beta humano recombinante que cumpla con los requisitos establecidos en las normatividades sanitarias para una proteína terapéutica para su uso en humanos.

Claims (11)

REIVINDICACIONES Habiendo descrito mi invención, como antecede, considero como una novedad y reclamo de mi propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un proceso para purificar interferón beta humano recombinante, que se caracteriza porque comprende los siguientes pasos : a) la obtención de una muestra biológica que contiene interferón beta humano recombinante; b) una ultrafiltración de la muestra biológica por flujo tangencial; c) una cromatografía de afinidad en una columna de azul de sepharosa que incluye: el equilibrio de la columna de afinidad, la inyección de la muestra, la remoción de impurezas y la elución del interferón; d) una concentración por ultrafiltración centrífuga; e) una cromatografía en fase reversa en una columna de perlas de poliestireno que incluye: un equilibrio de la columna de fase reversa, una inyección de la muestra y una elución de la proteína mediante un gradiente lineal de fases de los amortiguadores; y f) una cromatografía por filtración en gel en una columna de sephacryl que incluye: un equilibrio de la columna de sephacryl, una inyección de la muestra y una elución del interferón beta.

2. El proceso para purificar interferón beta humano recombinante de conformidad con la reivindicación 1 , en donde la muestra de interferón es obtenida de cualquier tipo de muestra biológica tales como extractos de tejidos u órganos, fluidos corporales o medio de cultivo proveniente del cultivo de cualquier tipo de células eucariotas.

3. El proceso para purificar interferón beta humano recombinante de conformidad con la reivindicación 1 , en donde dicho interferón se permite que sea del tipo ß 1a o del tipo /? 1 b.

4. El proceso para purificar interferón beta humano recombinante de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la ultrafiltración de flujo tangencial de dicha muestra biológica se lleva a cabo con volúmenes de entre 3 y 12 L, a una presión de entrada al sistema de entre 0.5 y 2.0 bar y se concentra por ultrafiltración de flujo tangencial hasta un volumen entre \ y ¾ de su volumen inicial.

5. El proceso para purificar interferón beta humano recombinante de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque en la que la cromatografía de afinidad el equilibrio de la columna se lleva a cabo hasta con 10 volúmenes de columna con una solución a base de fosfato de sodio 20 mM conteniendo EDTA a una concentración de hasta 1.0 mM y un flujo de hasta 5.0 mUmin.

6. El proceso para purificar interferón beta humano recombinante de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque en la cromatografía de afinidad se inyectan hasta 200 ml_ de la muestra biológica concentrada a un flujo máximo de 5.0 mL/min, seguido de un lavado de la columna de entre 3 a 5 volúmenes de columna del amortiguador de equilibrio.

7. El proceso para purificar interferón beta humano recombinante de conformidad con la reivindicación 1 , en la que la cromatografía de afinidad se caracteriza además porque la remoción de impurezas es llevada a cabo por tres lavados secuenciales, a saber: a) hasta 3 volúmenes de columna de una solución de fosfato de sodio 20 mM conteniendo hasta 50% de propilenglicol con pH entre 7.0 y 7.2 y un flujo de hasta 5 mL/min; b) de 3 a 5 volúmenes de columna de un amortiguador de fosfato de sodio 20 mM conteniendo cloruro de sodio hasta 2.0 M, pH entre 7.0 y 7.2 y un flujo de 3 a 5 mL/min; y c) de 3 a 5 volúmenes de columna de una solución de fosfato de sodio 20 mM conteniendo cloruro de sodio 2 mM y 20% de propilenglicol a un pH entre 7.0 y 7.2 con un flujo de hasta 5 mL/min.

8. El proceso para purificar interferón beta humano recombinante de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque en la cromatografía de afinidad la elución del interferón es llevada a cabo por el flujo de hasta 3 volúmenes de columna de un amortiguador a base de fosfato de sodio 20 mM conteniendo 50% de propilenglicol y cloruro de sodio a una concentración no mayor a 2.0 M, un pH entre 7.0 y 7.2 y con un flujo de hasta 5 mL/min.

9. El proceso para purificar interferón beta humano recombinante de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la ultrafiltración centrífuga se lleva a cabo con un volumen de entre 50 y 70 mL de solución de interferón y sometidos a una fuerza centrífuga relativa de entre 2,500 y 3,500 * g durante un período de entre 15 y 40 minutos a una temperatura de entre 4 y 10°C y caracterizado además porque la concentración de la solución se lleva a cabo con un volumen de 200 a 500

10. El proceso para purificar interferón beta humano recombinante de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la cromatografía de fase reversa tiene las siguientes características: a) la columna es equilibrada con un flujo de hasta 5 volúmenes de columna de un amortiguador a base de ácido clorhídrico al 0.1% y 3.0% de propilenglicol y un flujo de entre 0.5 y 1.0 mL/min; b) el interferón en solución es inyectado a la columna a un flujo entre 1.0 y 2.0 mL/min; c) el lavado de impurezas se realiza con alrededor de 3 volúmenes de columna de una solución a base de ácido clorhídrico al 0.1% y un pH entre 2.1 y 2.5 y con un flujo entre 0.5 y 1.0 mL/min; d) la elución del interferón se realiza con un gradiente lineal de 45% de un amortiguador a base de ácido clorhídrico al 0.1% conteniendo 3.0% de propilenglicol, con un pH entre 2.1 y 2.5, a 80% de ácido clorhídrico al 0.1 % en una solución de hasta 90% de etanol.

11. El proceso para purificar interferón beta humano recombinante de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la cromatografía de filtración en gel tiene las siguientes características: a) una columna de 320 mL de sephacryl equilibrada con 2 volúmenes de columna de un amortiguador a base acetato de sodio 20 mM, con un pH de entre 4.0 y 4.5, con un flujo de entre 2.6 y 3.0 mL/min; b) la solución conteniendo el interferón es inyectada a la columna en un volumen de entre 10 y 15 mL con un flujo de entre 0.5 y 1.5 mL/min; c) el interferón es eluido con un amortiguador a base acetato de sodio 20 mM, a un pH entre 4.0 y 4.5, con un flujo de entre 1.3 y 1.5 mL/min.