JP2000034299A - ヒトγ―インタ―フェロンに於ける糖鎖 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒトγ−インターフェロンに於ける糖鎖を解
明しその用途を提供することを課題とする。 【解決手段】 ヒトγ−インターフェロンのポリペプチ
ド鎖に結合している糖鎖結合位置と構造を解明し、その
用途を確立することにより前記課題を解決する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトγ−インター
フェロンとその糖鎖およびそれらの用途に関するもので
あり、より詳細には、新規構造を有するヒトγ−インタ
ーフェロンとその糖鎖およびそれらの用途に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒトインターフェロンには、α−インタ
ーフェロン（別名、白血球インターフェロン）、β−イ
ンターフェロン（別名、線維芽細胞インターフェロン）
およびγ−インターフェロン（別名、免疫インターフェ
ロン、タイプＩＩインターフェロン）が知られており、
このうち、α−インターフェロンについてはリンパ芽球
などから、β−インターフェロンについては、線維芽細
胞などからの天然型ヒトインターフェロンの製造方法が
確立され、最近、これらを利用した医薬品が市販される
までに至った。

【０００３】一方、ヒトγ−インターフェロンについて
は、多数の製造方法が提案されているものの、いずれも
未だ工業的に実施されるに至っていない。

【０００４】一般に、ヒトγ−インターフェロンの大量
製造方法として最も期待され、可能性が高いとされてき
た方法は、遺伝子組換え技術による大腸菌を用いたγ−
インターフェロンの製造方法である（特開昭５８−２０
１９９５号公報、特開昭６０−２０２８９９号公報参
照）。

【０００５】しかしながら、この方法で製造されるγ−
インターフェロンは、ポリペプチド鎖構造のみからなっ
ていて、糖鎖構造を有する天然型ヒトγ−インターフェ
ロンには程遠いものである。そこで、ヒトγ−インター
フェロン遺伝子をチャイニーズハムスター卵巣細胞（Ｃ
ＨＯ細胞）に導入し、この細胞から糖鎖構造を有するヒ
トγ−インターフェロンを製造する方法が検討された
（特開昭６２−２８９６００号公報）。

【０００６】また、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・
バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第１５６巻、
６５１〜６５４頁（１９８６年）では、このチャイニー
ズハムスター卵巣細胞から製造されるヒトγ−インター
フェロンの糖鎖構造について詳細に報告し、その構造
は、化７に示す糖鎖構造であると結論している。

【０００７】

【化７】

【０００８】しかしながら、これらは、あくまでチャイ
ニーズハムスター卵巣細胞からのヒトγ−インターフェ
ロンの糖鎖構造を示しているに過ぎない。

【０００９】ヒト由来細胞からのγ−インターフェロン
の糖鎖構造については、「日経バイオテク」、１９８６
年９月２２日号、５頁にその一部が報告され、その構造
は、化８に示す構造であるとしている。

【００１０】

【化８】

【００１１】しかしながら、その糖鎖構造の結合様式は
不明であり、チャイニーズハムスター卵巣細胞からのも
のとの異同も明らかでない。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】ヒト疾患を治療し、ま
たは、予防するには、本質的にヒト由来の細胞から産生
され、かつ、構造の解明されたヒトγ−インターフェロ
ンを使用することが、抗原、抗体反応などの副作用の懸
念もなく、安全であり優れている。本発明は、天然型ヒ
トγ−インターフェロンの糖鎖構造を解明することを目
差し、併せてそれらの用途を確立しようとするものであ
る。

【００１３】

【課題を解決するための手段】ヒト由来の細胞に誘導剤
を接触させて天然型ヒトγ−インターフェロンを産生さ
せ、これを高度に精製、採取し、そのポリペプチド鎖並
びに糖鎖を解析し、その天然型ヒトγ−インターフェロ
ンの構造を解明した。その結果、ヒト由来細胞に誘導剤
を接触させ産生されるヒトγ−インターフェロンは、新
規な構造を持つ糖蛋白質であって、配列表に於ける配列
番号１乃至５のいずれかのポリペプチド鎖のＮ末端側か
ら第２５番目および第９７番目に存在するアスパラギン
の一方または双方に、化１乃至６のいずれかの構造（た
だし、これら化１乃至６中のＮｅｕＡｃ、ＧｌｃＮＡ
ｃ、Ｇａｌ、ＭａｎおよびＦｕｃは、本明細書を通じ
て、それぞれ、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−アセチ
ル−Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノ
ース及びＬ−フコースを示すものとする。）で示される
糖鎖を結合しているヒトγ−インターフェロンであるこ
とを見い出し、更に、このヒトγ−インターフェロンの
用途を確立して本発明を完成した。

【００１４】

【化１】

【００１５】

【化２】

【００１６】

【化３】

【００１７】

【化４】

【００１８】

【化５】

【００１９】

【化６】

【００２０】本発明のヒトγ−インターフェロンの製造
方法は、本発明で新規構造のヒトγ−インターフェロン
を確立したことより、種々の製造方法を適宜選択できる
こととなった。

【００２１】一般には、ヒト由来の細胞に誘導剤を接触
させて天然型ヒトγ−インターフェロンを産生させ、こ
れを精製採取する。

【００２２】また、遺伝子組換え技術によって、ヒトγ
−インターフェロン遺伝子を他のヒト由来細胞に導入す
るか、または細胞融合技術によって、ヒトγ−インター
フェロン産生能を有するヒト由来の細胞を他のヒト由来
の細胞と融合させて、ヒトγ−インターフェロンを誘導
剤の接触を必要とすることなく産生させたり、その産生
量を高めたりして、本発明のヒトγ−インターフェロン
を製造することも有利に実施できる。

【００２３】また、必要ならば、遺伝子組換え技術によ
る大腸菌などの微生物から産生したヒトγ−ポリペプチ
ド鎖または有機化学的若しくは生化学的に合成されるポ
リペプチド鎖などに、例えば、グリコシル トランスフ
ェラーゼを用いて糖鎖を生化学的に転移させるなどの方
法を採用して本発明のヒトγ−インターフェロンを製造
することも随意である。

【００２４】ヒト由来の細胞としては、例えば、特公昭
６３−１２９６号公報に開示されているＢＡＬＬ−１細
胞、ＴＡＬＬ−１細胞、ＭＯＬＴ−３細胞などの培養株
化されたヒト由来の細胞、特開昭６３−１５２９９３号
公報に開示されているＨＢＬ−３８細胞、ＨＬ−６０細
胞、ＫＧ−１細胞、ＭＬ−１細胞などの培養株化された
ヒト由来の骨髄単球系細胞などが適宜使用され、更に必
要ならば、ヒト末梢血から調製されるバフィーコートな
どの白血球細胞を用いることもできる。

【００２５】これら細胞を用いて、ヒトγ−インターフ
ェロンを産生せしめる方法は、通常、ヒト由来の細胞を
約２０〜４０℃に保った栄養培地に細胞濃度約１０^５〜
１０ ^８／ｍｌになるように浮遊させ、これに誘導剤を加
えて接触させることにより行なわれる。

【００２６】誘導剤としてはγ−インターフェロンが産
生されるものであればよく、通常、例えば、フィトヘマ
グルチニン、コンカナバリンＡ、ポークウィードミトー
ゲン、リポポリサッカリド、リピドＡ、エンドトキシ
ン、多糖類、細菌などのミトーゲンが好適である。

【００２７】また、感作化された細胞にとっては、抗原
もγ−インターフェロン誘導剤である。これらγ−イン
ターフェロン誘導剤を用いる場合には、通常約０．００
１μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で使用される。必
要ならば、例えば、ウイルス、核酸、ポリヌクレオチド
などのα−インターフェロン誘導剤を併用することもで
きる。

【００２８】このようにして産生されたヒトγ−インタ
ーフェロンは、公知の分離精製方法、例えば、塩析・透
析、濾過、遠心分離、濃縮、凍結乾燥などを行うことに
よって容易に精製分離し、採取することができる。

【００２９】更に高度の精製を必要とする場合には、例
えば、イオン交換体への吸着・溶出、ゲル濾過、アフィ
ニティークロマトグラフィー、等電点分画、高速液体ク
ロマトグラフィー、電気泳動などの公知の方法を更に組
み合わせればよく、とりわけ、モノクローナル抗体を利
用したクロマトグラフィーなどにより最高純度のヒトγ
−インターフェロンを採取することも可能である。

【００３０】このようにして得られるヒトγ−インター
フェロンは、ヒトγ−インターフェロン感受性疾患の治
療剤、予防剤などとして有利に利用できる。ヒトγ−イ
ンターフェロン感受性疾患とは、ヒトγ−インターフェ
ロンによって治療され、若しくは予防される疾患であ
り、それがウイルス性疾患、例えば、流行性血膜炎、ヘ
ルペス性角膜炎、インフルエンザ、風疹、血清肝炎、エ
イズなどであってもよく、また、非ウイスル性疾患、例
えば、大腸癌、腎癌、肺癌、肝癌、骨肉腫などの悪性腫
瘍、更には、アトピー性アレルギー、重症筋無力症、膠
原病、悪性貧血、関節リウマチ、全身性エリテマトーデ
スなどの免疫疾患などであってもよい。

【００３１】また、ヒトγ−インターフェロン感受性疾
患の治療剤、予防剤は、その目的に応じて、その形状を
自由に選択できる。その一例を上げれば、噴霧剤、点眼
剤、うがい剤、注射剤などの液剤、軟膏のようなペース
ト剤、粉剤、顆粒剤、錠剤などの固剤などである。

【００３２】これら薬剤に、ヒトγ−インターフェロン
を、通常、グラム当り１〜１０，０００，０００単位程
度の活性を含有させればよく、必要に応じてヒトγ−イ
ンターフェロンとともに他のリンホカイン、例えば、α
−インターフェロン、β−インターフェロン、ツモア・
ネクロシス・ファクター、リンホトキシン、インターロ
イキン２、Ｂ細胞分化因子など、更には、他の天然また
は合成化学療法剤などの１種または２種以上を有効成分
として含有せしめ、その治療、予防効果を更に高めるこ
とも有利に実施できる。

【００３３】更に必要ならば、補助剤、増量剤、安定剤
などの１種または２種以上を併用することも随意であ
る。このようにして製造される本発明のヒトγ−インタ
ーフェロン感受性疾患の治療剤、予防剤は、例えば、抗
ウイルス剤、抗腫瘍剤として、また、抗腫瘍性化学療法
剤の抗腫瘍効果増強剤、悪性腫瘍の転移抑制、再発防止
剤、免疫調節剤、免疫疾患治療剤などとして有利に利用
できる。

【００３４】ヒトに種特異性の高いインターフェロンの
活性は、「蛋白質 核酸 酵素」、第２０巻、第６号、
６１６〜６４３頁（１９７５年）に報告されているヒト
羊膜由来のＦＬ細胞を使用して、公知のプラーク半減法
で測定した。

【００３５】なお、ヒトγ−インターフェロンの活性
は、抗ヒトα−インターフェロン抗体及び抗ヒトβ−イ
ンターフェロン抗体を共存させて、ヒトα−インターフ
ェロン及びヒトβ−インターフェロンを中和後測定し
た。

【００３６】以下、実施例で本発明を説明する。

【００３７】なお、これら実施例は、本発明を例示して
いるものであって、本発明の限定を意図しているもので
はない。

【００３８】

【実施例Ａ−１】＜ヒトγ−インターフェロン＞

【実施例Ａ−１（１）】＜高純度ヒトγ−インターフェ
ロンの調製＞新生児のハムスターに、ウサギから公知の
方法で調製した抗血清を予め注射し、ハムスターの免疫
反応を弱めた後、その皮下にＫＧ−１細胞（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ２４６）を移植し、その後、通常の方法で３週間
飼育した。皮下に生じた約１５ｇの腫瘍を摘出した後、
コラゲナーゼ含有生理食塩水に懸濁して、細胞を分散、
分取した。この細胞をＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄した
後、同じ組成の培地に細胞濃度が約２×１０^６／ｍｌに
なるように浮遊させ、これにｍｌ当り約５μｇのリポポ
リサッカリドを加え、３７℃、２日間保ち、ヒトγ−イ
ンターフェロンを産生させた。これを遠心分離し、上清
ｍｌ当り約４５，０００単位、ハムスター１匹当り約３
５，０００，０００単位のヒトγ−インターフェロンを
得た。この上清を膜濃縮し、精密濾過後、常法に従っ
て、抗ヒトγ−インターフェロン抗体カラム（商品名、
γ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、英国セルテック社製造）を用
いるカラムクロマトグラフィーを行い、次いで濃縮、ゲ
ル濾過してヒトγ−インターフェロン活性を有する画分
を採取し、活性収率約８０％でヒトγ−インターフェロ
ン溶液を得た。

【００３９】本品は、高度に精製されたヒトγ−インタ
ーフェロンであって、その比活性は約２×１０^７単位／
ｍｇ蛋白質であった。

【００４０】

【実施例Ａ−１（２）】＜ヒトγ−インターフェロンの
分子量＞実施例Ａ−１（１）の方法で調製した高純度ヒ
トγ−インターフェロンを用いて、ユー・ケー・レムリ
（Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒ
ｅ）、第２２７巻、６８０頁（１９７０年）に記載され
ている方法に準じて、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動方法により測定したところ、約２４，０００、
約２０，０００、約１６，０００を中心に複数のバンド
が観察された。それらの量は、モル比で、それぞれ、約
７：２：１であった。また、そのいずれのバンドにもヒ
トγ−インターフェロンの活性がみとめられた。更に、
アール・エイ・カピタニー（Ｒ．Ａ．Ｋａｐｉｔａｎ
ｙ）等、アナリティカル バイオケミストリー（Ａｎａ
ｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第５６
巻、３６１頁（１９７３年）に記載されている方法に準
じてＰＡＳ染色（ｐｅｒｉｏｄｉｃ ａｃｉｄ Ｓｈｉ
ｆｆ ｂａｓｅ ｓｔａｉｎ）により糖鎖の存在を調べ
たところ、分子量約２４，０００および約２０，０００
のバンドが陽性を示した。

【００４１】

【実施例Ａ−１（３）】＜ヒトγ−インターフェロンの
アミノ酸配列＞実施例Ａ−１（１）の方法で調製した高
純度ヒトγ−インターフェロンを用いて、エルンスト・
リンデルクネヒト（Ｅｒｎｓｔ Ｒｉｎｄｅｒｋｎｅｃ
ｈｔ）等、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２５６巻、６
７９０〜６７９７頁（１９８４年）に記載されている方
法に準じてアミノ酸配列を調べた。

【００４２】即ち、ヒトγ−インターフェロンを、トリ
プシンまたはＶ８プロテアーゼ（米国、シグマ社製造）
で分解し、得られるペプチド断片を高速液体クロマトグ
ラフィーで分取し、それぞれを気相プロテインシークエ
ンサー（商品名４７０Ａ型、米国、アプライドバイオシ
ステム社製造）にかけ、次いで高速液体クロマトグラフ
ィーにより分析して、アミノ酸配列を求めた。ただし、
糖鎖を結合したペプチド断片は、グリコペプチダーゼＡ
（生化学工業株式会社製造）で糖鎖をはずした後、気相
プロテインシークエンサーにかけた。

【００４３】以上の分析結果から、ヒトγ−インターフ
ェロンは、主要構造として、配列表に於ける配列番号１
乃至５で示されるいずれかのポリペプチド鎖を有してお
り、そのＮ末端側から第２５番目および第９７番目に存
在するアスパラギンの一方または双方に糖鎖をグリコシ
ルアミン型で結合していることが判明した。

【００４４】換言すれば、配列表に於ける配列番号２で
示されるポリペプチド鎖は、配列表に於ける配列番号１
で示されるポリペプチド鎖のＣ末端側から９個のアミノ
酸を欠失しているポリペプチド鎖であり、同様に、配列
表に於ける配列番号３、配列表に於ける配列番号４およ
び配列表に於ける配列番号５で示されるポリペプチド鎖
は、式Ｉで示されるポリペプチド鎖のＣ末端側から、そ
れぞれ、１０個、１１個および１２個のアミノ酸を欠失
しているポリペプチド鎖である。これらポリペプチド鎖
のうち、とりわけ、配列表に於ける配列番号４で示され
るポリペプチド鎖の含量が高く、モル比で約５０乃至８
０％を占めることも判明した。

【００４５】

【実施例Ａ−１（４）】＜ヒトγ−インターフェロンの
糖鎖構造＞実施例Ａ−１（１）の方法で調製した高純度
ヒトγ−インターフェロンを用いて、それに結合してい
る糖鎖構造を調べた。

【００４６】

【実施例Ａ−１（４）（ａ）】＜糖鎖を構成する中性糖
及びアミノ糖＞ヒトγ−インターフェロンを、ヨーロピ
アン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ
ｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ）、第１５６巻、６５１〜６５４頁（１９８６
年）に記載されている方法に準じてメタノリシス後、ト
リメチルシリル化し、ガスクロマトグラフィーを行って
中性糖を分析した。また、ヒトγ−インターフェロン
を、アール・ジェイ・シンプソン（Ｒ．Ｋ．Ｓｉｍｐｓ
ｏｎ）等、ザ・ジャーナル・オブ・バイロジカル・ケミ
ストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２５巻１、１９
３６〜１９４０頁（１９７６年）に記載されている方法
に準じて、メタンスルホン酸で加水分解後、エイ・エム
・ベラ（Ａ．Ｍ．Ｂｅｌｌａ）等、ジャーナル・オブ・
クロマトグラフィー（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｃｈｒｏｍ
ａｔｏｇｒａｐｈｙ）、第５１巻、３１４〜３１５頁
（１９７０年）に記載されている方法に準じて、アミノ
酸分析器によりアミノ糖を分析した。

【００４７】以上の中性糖およびアミノ糖の分析結果か
ら、ヒトγ−インターフェロンに結合している中性糖お
よびアミノ糖は、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、
Ｌ−フコース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンから構
成され、その組成比は、それぞれ、３．００：２．１
６：０．８２：３．９４であることが判明した。

【００４８】

【実施例Ａ−１（４）（ｂ）】＜構成糖の配列とその結
合様式＞ヒトγ−インターフェロンを、エス・ハセ
（Ｓ．Ｈａｓｅ）、ザ・ジャーナル・オブ・バイオケミ
ストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ）、第９５巻、１９７〜２０３頁（１９
８４年）に記載されている方法に準じてヒドラジン分解
し、ピリジルアミノ化し、次いで、ゲル濾過して過剰試
薬を除去し、得られたピリジルアミノ化糖鎖を用いて構
成糖の配列とその結合様式を調べた。

【００４９】まず、このピリジルアミノ化糖鎖を陰イオ
ン交換クロマトグラフィーにかけたところ、モノシアロ
糖鎖（ｍｏｎｏｓｉａｌｙｌａｔｅｄ ｏｌｉｇｏｓａ
ｃｃｈａｒｉｄｅ）とジシアロ糖鎖（ｄｉｓｉａｌｙｌ
ａｔｅｄ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を含んで
いることが判明した。

【００５０】また、このピリジルアミノ化糖鎖をノイラ
ミニダーゼで処理し、脱シアロピリジルアミノ化糖鎖を
得、これを高速液体クロマトグラフィーで分子サイズ別
に分画した。得られた各画分をエキソグリコシダーゼに
よる逐次分解法で構成糖の配列を決定した。

【００５１】更に、このピリジルアミノ化糖鎖を逆相カ
ラムクロマトグラフィーで分画し、得られた各画分を５
００−ＭＨｚ ^１Ｈ−ＮＭＲスペクトロスコピー（ｓｐ
ｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）にかけその結合様式を決定し
た。

【００５２】以上の分析結果から、ヒトγ−インターフ
ェロンは、先に解明したポリペプチド鎖に、化１乃至６
で示されるいずれかの糖鎖をグリコシルアミン型で結合
していることが判明した。

【００５３】

【化１】

【００５４】

【化２】

【００５５】

【化３】

【００５６】

【化４】

【００５７】

【化５】

【００５８】

【化６】

【００５９】これら糖鎖構造は、α−インターフェロ
ン、β−インターフェロンはもちろんのこと、チャイニ
ーズハムスター卵巣細胞からのヒトγ−インターフェロ
ンでも見い出されておらず、いずれも、本発明で初めて
解明された構造である。

【００６０】また、これら新規糖鎖構造の含量は高く、
モル比で約５０乃至８０％を占めることが判明した。

【００６１】なお、これら糖鎖構造以外に、比較的少量
ではあるが、チャイニーズハムスター卵巣細胞からのヒ
トγ−インターフェロンで知られている糖鎖構造も存在
していることが判明した。

【００６２】上述の結果から、本発明のヒトγ−インタ
ーフェロンは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法での分子量約２４，０００のものは、該ポリペプチ
ド鎖のＮ末端側から第２５番目および第９７番目のアス
パラギンの双方に糖鎖を結合し、分子量約２０，０００
のものは、該アスパラギンのいずれか一方に糖鎖を結合
しているものと判断される。

【００６３】以上をまとめると、ヒト由来細胞からのヒ
トγ−インターフェロンは、主要構造として、配列表に
於ける配列番号１乃至５のいずれかのポリペプチド鎖の
Ｎ末端側から第２５番目および第９７番目に存在するア
スパラギンの一方または双方に、化１乃至６のいずれか
で示される糖鎖を結合している新規構造のヒトγ−イン
ターフェロンであると結論される。

【００６４】

【化１】

【００６５】

【化２】

【００６６】

【化３】

【００６７】

【化４】

【００６８】

【化５】

【００６９】

【化６】

【００７０】本品は、各種ウイルス性疾患、悪性腫瘍な
どの治療剤、予防剤の有効成分として、またヒトγ−イ
ンターフェロン誘導体の製造原料などとして有利に利用
できる。

【００７１】

【実施例Ａ−２】＜ヒトγ−インターフェロン＞実施例
Ａ−１（１）の方法に準じて、新生児ハムスターの皮下
にＨＢＬ−３８細胞を移植し、その後、通常の方法で、
４週間飼育した。皮下に生じた約２０ｇの腫瘍を摘出し
た後、コラゲナーゼ含有生理食塩水に懸濁して、細胞を
分散、分取した。

【００７２】この細胞を、イーグルの最少基本培地で洗
浄した後、３７℃に保った同じ組成の培地に、細胞濃度
が約２×１０^６／ｍｌになるように希釈し、これにｍｌ
当りフィトヘマグルチニン２００μｇ及びリピドＡ５μ
ｇを加え、３７℃で、２日間保ってインターフェロンを
産生させた。これを遠心分離し、上清ｍｌ当り約９３，
０００単位のγ−インターフェロンを得た。ハムスター
１匹当り、約１８３，０００，０００単位のγ−インタ
ーフェロンが得られた。

【００７３】この上清を実施例Ａ−１（１）の方法に準
じて、精製し、活性収率約８０％でヒトγ−インターフ
ェロン溶液を得た。

【００７４】本品は、高度に精製されたヒトγ−インタ
ーフェロンであって、その比活性は約２×１０^７単位／
ｍｇ蛋白質であった。

【００７５】この高度に精製されたヒトγ−インターフ
ェロンを用いて、実施例Ａ−１（２）、（３）、（４）
の方法に準じて、その分子量、アミノ酸配列、糖鎖構造
を調べたところ、本実施例のヒトγ−インターフェロン
は、主要構造として、実施例Ａ−１の場合と同一の新規
構造を有するヒトγ−インターフェロンであることが判
明した。

【００７６】本品は、実施例Ａ−１の場合と同様に、各
種疾患の治療剤、予防剤の有効成分として、またヒトγ
−インターフェロン誘導体の製造原料などとして有利に
利用できる。

【００７７】

【実施例Ａ−３】＜ヒトγ−インターフェロン＞ヒト末
梢血から調製されたバフィーコートを、細胞濃度が２．
５×１０^６／ｍｌになるように仔牛血清１０ｖ／ｖ％を
補足したイーグルの最少基本培地に浮遊させ、これにｍ
ｌ当り約１０μｇのフィトヘマグルチニンを加え、３７
℃、３日間保ち、ヒトγ−インターフェロンを産生させ
た。これを遠心分離し、上清ｍｌ当り約１，０００単位
のヒトγ−インターフェロンを得た。

【００７８】この上清を実施例Ａ−１（１）の方法に準
じて、精製し、活性収率約７５％でヒトγ−インターフ
ェロン溶液を得た。

【００７９】本品は、高度に精製されたヒトγ−インタ
ーフェロンであって、その比活性は約２×１０^７単位／
ｍｇ蛋白質であった。

【００８０】この高度に精製されたヒトγ−インターフ
ェロンを用いて、実施例Ａ−１（２）、（３）、（４）
の方法に準じて、その分子量、アミノ酸配列、糖鎖構造
を調べたところ、本実施例のヒトγ−インターフェロン
は、主要構造として、実施例Ａ−１の場合と同一の新規
構造を有するヒトγ−インターフェロンであることが判
明した。

【００８１】本品は、実施例Ａ−１の場合と同様に、各
種疾患の治療剤、予防剤の有効成分として、またヒトγ
−インターフェロン誘導体の製造原料などとして有利に
利用できる。

【００８２】

【実施例Ｂ−１】＜液 剤＞生理食塩水に、実施例Ａ
−１の方法で調製した高度に精製されたヒトγ−インタ
ーフェロンをｍｌ当り５０単位の割合で含有せしめ、無
菌的に濾過し、得られる濾液を滅菌した５０ｍｌ容プラ
スチック容器に充填し、キャップシールして液剤を製造
した。

【００８３】本品は、流行性結膜炎やインフルエンザな
どのウイルス性疾患の治療剤、予防剤として噴霧用、点
眼用、点鼻用、うがい用などに好適である。

【００８４】

【実施例Ｂ−２】＜注 射 剤＞生理食塩水に、実施例
Ａ−１の方法で調製した高度に精製されたヒトγ−イン
ターフェロンをｍｌ当り１００，０００単位の割合で含
有せしめ、これを無菌的に濾過し、得られる濾液を滅菌
したガラス容器に２ｍｌずつ採り、凍結乾燥して密栓
し、乾燥注射剤を製造した。

【００８５】本品は、実施例Ｂ−１の場合と同様にウイ
ルス性疾患の治療剤、予防剤として有利に利用できる。

【００８６】また、乳癌、肺癌、肝癌、白血病などの悪
性腫瘍の治療剤、予防剤として、また、アトピー性アレ
ルギー、悪性貧血、関節リウマチ、全身性エリテマトー
デスなどの免疫疾患の治療剤、予防剤としても好適であ
る。

【００８７】更に、メルファラン、メソトレキサート、
ドキソルビシンなどの化学療法剤の抗腫瘍効果増強剤と
して利用することも好都合である。

【００８８】

【実施例Ｂ−３】＜注 射 剤＞生理食塩水に、実施例
Ａ−２の方法で調製した高度に精製されたヒトγ−イン
ターフェロンをｍｌ当り２５０，０００単位の割合で含
有せしめ、これを、実施例Ｂ−２の方法に準じて、ガラ
ス容器に充填し、凍結乾燥、密栓し、乾燥注射剤を製造
した。

【００８９】本品は、実施例Ｂ−２の場合と同様に各種
ウイルス性疾患、悪性腫瘍などの治療剤、予防剤として
有利に利用できる。

【００９０】

【実施例Ｂ−４】＜注 射 剤＞生理食塩水に、実施例
Ａ−３の方法で調製した高度に精製されたヒトγ−イン
ターフェロン、リンパ芽球様細胞由来のα−インターフ
ェロン及びリンパ芽球様細胞由来のツモア・ネクロシス
・ファクターをｍｌ当りそれぞれ、１，０００単位、１
００，０００単位および１００，０００単位の割合で含
有せしめ、これを無菌的に濾過し、実施例Ｂ−２と同様
に凍結乾燥して乾燥注射剤を得た。

【００９１】本品は、各種ウイルス性疾患の治療剤、予
防剤として好適である。また、乳癌、肺癌、肝癌、胃
癌、白血病などの各種悪性腫瘍の治療剤、予防剤とし
て、また、アトピー性アレルギー、膠原病、関節リウマ
チ、全身性エリテマトーデスなどの免疫疾患の治療剤、
予防剤としても好適である。

【００９２】更に、テガフール、マイトマイシンＣ、硫
酸ビンクリスチンなどの化学療法剤の抗腫瘍効果増強剤
として利用することも好都合である。

【００９３】

【実施例Ｂ−５】＜錠 剤＞常法に従って、澱粉とマ
ルトースとを基材として錠剤を製造するに際し、実施例
Ａ−１の方法で調製した高度に精製されたヒトγ−イン
ターフェロンおよびリンパ芽球様細胞由来のツモア・ネ
クロシス・ファクター（ＴＮＦ−α）を１錠（２００ｍ
ｇ）当り１０，０００単位ずつ含有せしめて錠剤を製造
し、これにメチルセルロースフタレートをコーティング
して腸溶性錠剤を得た。

【００９４】本品は、小腸、大腸などの各種ウイルス性
疾患の治療剤、予防剤として有利に利用できる。また、
大腸癌、結腸癌、腎癌、肝癌などの治療剤、予防剤とし
て、また、アトピー性アレルギー、重症筋無力症、関節
リウマチ、全身性エリテマトーデスなどの免疫疾患の治
療剤、予防剤としても有利に利用できる。

【００９５】更に、ドキソルピシン、フルオロウラシ
ル、マイトマイシンＣなどの化学療法剤の抗腫瘍効果増
強剤として利用することも好都合である。

【００９６】

【発明の効果】本文で詳記したように、ヒト疾患の治
療、予防に使用するヒトγ−インターフェロンとして
は、本質的にヒト細胞由来のものであって、その構造の
解明されたものが望ましい。

【００９７】しかしながら、従来、ヒト由来細胞からの
γ−インターフェロンの詳細な構造は知られておらず、
ヒトγ−インターフェロン遺伝子を導入したチャイニー
ズハムスター卵巣細胞からのヒトγ−インターフェロン
との異同も明らかでなかった。

【００９８】本発明は、天然型ヒトγ−インターフェロ
ンの構造を解明するとともに、その製造方法を確立し、
安心して使用しうる治療剤、予防剤を確立した。

【００９９】また、本発明は、天然型ヒトγ−インター
フェロンの構造を解明したことにより、これを大量生産
する上での製造方法の選択の幅を拡大できるだけでな
く、この構造の解明されたヒトγ−インターフェロンを
原料としてその誘導体の製造、更には類似構造の新薬開
発を促進するなど、その波及効果も著しく、医薬品工業
分野での産業的意義は極めて大きい。

【０１００】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo <120> Sugar Chains of Interferon-γ <130> 10037104 <141> 1999-5-27 <150> JP 184,069/88 <151> 1988-07-23 <160> 5 <210> 1 <211> 138 <212> PRT <213> Human cell <220> <221> PEPTIDE <223> The amino acid 1, Glu, is a pyroglutamic acid, i.e., a pyrrolidone carboxylic acid. <400> 1 Glu Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe 1 5 10 15 Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu 20 25 30 Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met 35 40 45 Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe 50 55 60 Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu 65 70 75 Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp 80 85 90 Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val 95 100 105 Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu 110 115 120 Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu 125 130 135 Phe Agr Gly <210> 2 <211> 129 <212> PRT <213> Human cell <220> <221> PEPTIDE <223> The amino acid 1, Glu, is a pyroglutamic acid, i.e., a pyrrolidone carboxylic acid. <400> 2 Glu Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe 1 5 10 15 Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu 20 25 30 Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met 35 40 45 Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe 50 55 60 Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu 65 70 75 Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp 80 85 90 Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val 95 100 105 Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu 110 115 120 Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg 125 <210> 3 <211> 128 <212> PRT <213> Human cell <220> <221> PEPTIDE <223> The amino acid 1, Glu, is a pyroglutamic acid, i.e., a pyrrolidone carboxylic acid. <400> 3 Glu Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe 1 5 10 15 Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu 20 25 30 Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met 35 40 45 Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe 50 55 60 Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu 65 70 75 Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp 80 85 90 Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val 95 100 105 Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu 110 115 120 Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys 125 <210> 4 <211> 127 <212> PRT <213> Human cell <220> <221> PEPTIDE <223> The amino acid 1, Glu, is a pyroglutamic acid, i.e., a pyrrolidone carboxylic acid. <400> 4 Glu Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe 1 5 10 15 Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu 20 25 30 Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met 35 40 45 Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe 50 55 60 Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu 65 70 75 Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp 80 85 90 Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val 95 100 105 Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu 110 115 120 Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly 125 <210> 5 <211> 126 <212> PRT <213> Human cell <220> <221> PEPTIDE <223> The amino acid 1, Glu, is a pyroglutamic acid, i.e., a pyrrolidone carboxylic acid. <400> 5 Glu Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe 1 5 10 15 Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu 20 25 30 Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met 35 40 45 Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe 50 55 60 Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu 65 70 75 Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp 80 85 90 Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val 95 100 105 Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu 110 115 120 Ser Pro Ala Ala Lys Thr 125

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/00 ６３７ Ａ６１Ｋ 31/00 ６３７Ａ 31/715 ６０９ 31/715 ６０９ 38/21 ＡＢＨ 37/66 ＡＢＨＦ

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表に於ける配列番号１乃至５のいず
   れかに示すポリペプチド鎖を有するヒトγ−インターフ
   ェロンに結合してなる化１乃至６のいずれかに示す構造
   を有する糖鎖。 【化１】 【化２】 【化３】 【化４】 【化５】 【化６】 ただし、これら化１乃至６中、ＮeuＡc、ＧlcＮＡc、Ｇ
   al、ＭanおよびＦucは、それぞれ、Ｎ−アセチルノイラ
   ミン酸、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラク
   トース、Ｄ−マンノース及びＬ−フコースを示すものと
   する。）
2. 【請求項２】 配列表に於ける配列番号１乃至５に示す
   いずれかのポリペプチド鎖のＮ末端側から第２５番目お
   よび第９７番目に存在するアスパラギンの一方または双
   方に結合している請求項１に記載の糖鎖。
3. 【請求項３】 ヒトγ−インターフェロン産生能を有す
   るヒト由来の細胞に誘導剤を接触させて産生されるヒト
   γ−インターフェロンに結合してなる請求項１または２
   に記載の糖鎖。