JPH0789935B2 - 安定性の高い組換えガンマインタ−フエロン - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 本発明は、組換えDNA技術の領域に係り、安定性の高い
組換えガンマインターフェロンの製造に前記の如き技術
を利用する手段及び方法、前記インターフェロンの産生
並びに産生される種々の産物及びそれらの用途に係る。

［発明の背景］ 本発明のバックグラウンドを明らかにし且つ特定の場合
には本発明の実施に関する詳細を補う目的で、多くの刊
行物及びその他の文献を引用して本明細書中に包含し、
便宜上、これらの参考文献に参照番号を付し、本明細書
末尾に目録として添附した。本文中では参考文献を参照
番号で示す。

ヒトインターフェロンは、抗原性，生物学的特性及び生
化学的特性の違いに基いて３種のグループに分類し得
る。第１のグループは、通常ウィルスによって誘発され
たヒト血液構成細胞が主として産生する白血球インター
フェロン類である。これらのインターフェロンは、既に
微生物によって産生され、生物学的に活性であることが
知見されている（参考文献1,2及び３参照）。このイン
ターフェロンは、その生物学的特性故に、ウィルス感染
症及び悪性腫瘍状態の治療薬としての臨床使用が目論ま
れている（４）。

第２のグループのヒト線維芽細胞インターフェロンは、
通常、ウィルスに誘発された線維芽細胞によって産生さ
れる。これらのインターフェロンも同じく既に微生物に
よって産生されており、広範な生物学的活性を示すこと
が知られている（５）。臨床試験においてもこれらのイ
ンターフェロンの潜在的治療価値が示唆されている。白
血球インターフェロンと線維芽細胞インターフェロン
は、アミノ酸レベルでの相同（homology）の程度が比較
的低いにもかかわらず、生物学的特性が極めて類似して
いる。又、これらのグループのインターフェロンはいず
れも、約165乃至約166個のアミノ酸を含み且つ酸に対し
て安定なタンパクである。

ヒトガンマインターフェロン（免疫インターフェロン，
γ−インターフェロン,IIF又はIFN−γともいう）は、
前記インターフェロンの抗ウィルス特性及び抗細胞増殖
特性を示すが、白血球インターフェロン及び線維芽細胞
インターフェロンとは対照的にpH2で不安定である。こ
れらガンマインターフェロンは、組換えDNA技術によっ
て産生される以前には主としてリンパ球のマイトゲン誘
発によって産生されていた。ヒトガンマインターフェロ
ンは、白血球インターフェロン及び線維芽細胞インター
フェロンとは抗原的に明らかに異なっている。Gray,Goe
ddel等は組換えガンマインターフェロンの発現を最初に
報告しており（６）、これによってヒトガンマインター
フェロンに特有な性質即ちpH2での不安定性と共に抗ウ
ィルス活性及び抗細胞増殖活性を示すことが確められ
た。大腸菌（E.coli）中で産生されたGray及びGoeddel
の組換えガンマインターフェロンは146個のアミノ酸か
ら成り、この分子のＮ末端部は配列CYS−TYR−CYS−で
始まっていた。続いて、Derynck等が、同じＮ末端を有
し且つ１個のアミノ酸が置換されている別の組換えガン
マインターフェロンを報告した（７）が、おそらくこの
ポリペプチドはそれより前に参考文献（６）に報告され
たインターフェロンの対立変異型（allelic variant）
であろう。更に、他の研究者等によって別の組換えガン
マインターフェロンの産生についての報告がなされてお
り、彼らによって産生された組換えガンマインターフェ
ロンでは、Gray及びGoeddelが最初に開示したアミノ酸
配列（６）のうち１個又はそれ以上のアミノ酸が置換さ
れていると報告されている。

例えば、Alton等は、Gray等のガンマインターフェロン
（６）の81番目のアミノ酸を１つ置換した一連のIFN−
γを報告している（17）が、得られたIFN−γは70％
（相対基準）の活性しか有しておらず、さらにこのIFN
−γの1,2,3番目のCYS−TYR−CYSを欠失させると、相対
活性が更に低下し、Gray等のガンマインターフェロン
（６）の49％の活性しか有していないIFN−γとなる。

本発明者等の研究によって、Ｎ末端アミノ酸配列にシス
テイン残基を含む組換えガンマインターフェロンは、１
個又はそれ以上のシステイン残基のスルフヒドリル基が
ジスルフィド結合形成に関与するオリゴマー化という見
地から問題を醸し出すことが確認された。本発明者等の
研究に於いてこれらの推定ジスルフィド結合を完全に還
元することができなかったことから、問題はより複雑で
あり、おそらくはシステインと結合したチロシン残基の
ヒドロキシル官能基を介する反応が含まれると思われ
る。又、これらの組換えインターフェロンは多少不安定
であり、不安定性のためかその他の原因によるかは明ら
かでないが、最適な効果が得られないことが判明した。

［発明の大要］ 本発明は、安定性及び活性が優れた組換えガンマインタ
ーフェロンに係る。最も好ましい態様では、Ｎ末端から
伸延して続く下記アミノ酸配列（以下、「完全配列」と
いう）を有する組換えガンマインターフェロン、及び前
記配列のカルボキシ末端の特定部位を欠く種々のインタ
ーフェロンアナログ（類似体）が提供される。

ここで、Ｘはメチオニン残基又は水素であり、Ｙは、グ
ルタミン残基であるか、又はＸが水素であるときはグル
タミン残基若しくはピログルタミン酸残基である。本発
明はまた、対応するクローン化遺伝子，これらを含む発
現ベクター及び本発明のインターフェロンの組換えDNA
技術による産生に有用な形質転換体を提供する。本発明
の好ましい組換えガンマインターフェロンは、（文献中
に既に記載されているインターフェロンと比較して）天
然ガンマインターフェロンの真のアミノ酸配列に最も近
似していると思われる。この天然ガンマインターフェロ
ンは本発明者等が天然起源から精製し充分に特性を明ら
かにしたものである。本発明の好ましい態様のインター
フェロンは、文献中に既に記載されているインターフェ
ロンに比べて大幅に改良された安定性と活性を示す。

本発明の前記及び他の目的を達成する様相は、以下の詳
細な説明及び添附の図面の記載から明らかになるであろ
う。

第１図は、本発明の組換えガンマインターフェロンのア
ミノ酸１〜143、並びにシグナル配列が先行している該
アミノ酸配列をコードしており且つ非翻訳DNAからなる
５′−及び３′−フランキング領域を有するDNA配列を
示す。

第２図は、E.coliによる本発明の組換えガンマインター
フェロンの直接合成のための情報をコードしているプラ
スミド及びその調製法を示す模式図である。

第３図は、本発明によって調製されたガンマインターフ
ェロンの優れた安定性を示すデータである。

［詳細な説明］ 本発明者等は、天然ヒトガンマインターフェロン（即
ち、ヒト末梢血リンパ球のマイトゲン誘発によって産生
されて精製されたもの）が、Gray等が組換えガンマイン
ターフェロンと指称し参考文献（６）に示した配列を有
するポリペプチドのＮ末端CYS−TYR−CYSが欠くポリペ
プチドであることを解明した。本発明者等の研究に係る
高度に精製した天然ガンマインターフェロンをトリプシ
ン消化して得られる物質中には、Gray等の組換えガンマ
インターフェロン（６）のＮ末端部にほぼ相当するアミ
ノ酸組成を有するが、但しCYS−TYR−CYSを欠く配列が
含有されていた。天然ガンマインターフェロンのアミノ
酸配列解析をＮ末端から行なうことはできなかったの
で、この分子のＮ末端のα−アミノ酸は保護されている
と推定された。Gray等（６）によるとcDNAがコードして
いる２つ目のシステインの次の第１アミノ酸はGLN（グ
ルタミン）であるので、GLN残基が環化してピログルタ
ミン酸に代りその結果Ｎ末端がブロックされていると推
測された。ピログルタミン酸アミノペプチダーゼによっ
てピログルタミン酸を除去すると、次にコードされてい
るアミノ酸すなわちASPのα−アミノ基が遊離し、配列
解析が続行できるようになり、その結果天然のヒトガン
マインターフェロンの最初に報告されたものと同じ結果
が得られた。

CYS−TYR−CYSを含有する組換えヒトガンマインターフ
ェロンのcDNAを適当に改造することにより、上記の完全
配列（但し、ＸはMETであり、ＹはGLNである）を有する
タンパクをコードしているcDNAから新規な組換えガンマ
インターフェロンをE.coli中で直接発現させることが可
能になった。Ｎ末端のメチオニンはmRNAの翻訳“開始”
シグナルAUGによってコードされている人為構造であ
り、例示したE.coliによる発現という特定の場合には宿
主系により除去処理されない。他の微生物系、例えばシ
ュードモナス（pseudomonas）では、メチオニンが除去
され得る。いずれにせよ活性に必要であるとは思われな
い。メチオニンが除去されると、使用する系に応じて、
GLN残基がピログルタミン酸の形態に環化し得るがこの
場合も活性が損われることはない。

本発明者等の研究によると、Gray等により以前に報告さ
れたCYS−TYR−CYSを含有する組換えガンマインターフ
ェロンは、ヒト血清アルブミンを用いて処方することで
安定化し得た。しかしながら、最終凍結乾燥産物中に血
清アルブミンが存在する場合は、最終産物に対してでは
なく凍結乾燥に先立って或る種の品質調整処理を行なう
必要がある。一方、本発明の新規な組換えガンマインタ
ーフェロンの場合には、凍結乾燥状態の物質は、血清ア
ルブミンを含有しなくとも充分に安定であることが判明
した。しかしながら、所望であれば、本発明のガンマイ
ンターフェロンを薬剤上許容される程度のヒト血清アル
ブミンと調合してもよい。

更に、本発明のCYS−TYR−CYSを欠く組換えヒトガンマ
インターフェロンは、細胞変性阻害試験に於いて、抗ウ
ィルス剤としてCYS−TYR−CYS含有アナログよりも顕著
な活性を示すように思われる。活性は通常、マイクロタ
イタープレート上でヒト肺癌由来の細胞株A549に対する
脳心筋炎ウィルスの細胞変性効果（CPE）の阻害により
アッセイされる（12）。

本発明の組換えガンマインターフェロンは、前記完全配
列のアミノ酸１〜約126を含有するインターフェロンを
全て包含する。完全配列に対してカルボキシ末端部を種
々切り取ったガンマインターフェロンは、アミノ酸１〜
約126が存在する限り、或る場合に多少レベルが低下す
るとしても、依然としてヒトガンマインターフェロンに
特有の性質を示す。実際、（７）に報告されたCYS−TYR
−CYS含有アナログを用いた実験で、アミノ酸132（本発
明の番号付けによる）に続くアミノ酸配列を、活性を損
失することなく他の配列（extraneous sequences）で置
換された例が示された（例えば、（８）参照）。本発明
者等の予備的データは、アミノ酸１から126（THR）付近
までの配列は比較的強固に結合して活性と関連すると思
われる三次元立体配置をとっているが、完全配列の残り
のアミノ酸は比較的構造上の制限が緩くタンパク分解に
比較的敏感であるという仮説を支持している。制限条件
下でのトリプシン消化によって、アミノ酸126より下流
の配列は種々の部分が除去されるがこれより上流は除去
されない。本発明者等が研究した天然ガンマインターフ
ェロンは、アミノ酸127,128,129,130,132及び134にわた
る種々の分子を含む。本発明者等は、メチオニンに続く
アミノ酸配列が（METの後の）アミノ酸１〜約139及び１
〜約131の種々のものから成る完全に活性な組換えガン
マインターフェロンを発見した。後者のアミノ酸１〜約
131は、組換えガンマインターフェロンをトリプシンで
制限消化しその後配列確認することによって得られた。
（METより先の）アミノ酸約128及び129に末端を有する
同様のトリプシン消化断片は、実質的に低下していると
はいっても活性を保持していた。一方、126番目のスレ
オニンとそれに続くアミノ酸を消化して除去した（Ｎ末
端メチオニンに加えて）125個のアミノ酸を有する物質
は、CPE阻害アッセイに於いて未消化物の活性の１％未
満の活性しか示さなかった。

組換えによって誘導されたガンマインターフェロンは、
メチニオンが細胞内では開裂されないような宿主内で産
生された場合に先頭メチオニンを有するのに加えて、13
9個のアミノ酸（第１図の番号付による）を有するもの
が多量で143個のアミノ酸を有するものが少量であると
考えられる。この２種の組成はアミノ酸139個の種が約9
5％より多く、最も好ましくは約97％より多い。制限条
件下のトリプシン消化はまた、アミノ酸126付近から下
流の種々の部分の配列を除去する。本発明者等の研究に
係る組換えガンマインターフェロンのこのような制限ト
リプシン消化物は、アミノ酸125（先頭メチオニンを含
めると126）,129,131及び134にわたる種々の種を含む。
これらの種は、アミノ酸125付近から129付近に伸びる場
合、実質的に低下するとしても活性を保持している。少
なくともほぼ129個のアミノ酸、特に少なくとも131個の
アミノ酸を有する種、すなわち約129〜143個のアミノ酸
を有する種が本質的、又機能的に完全な活性を保持して
いる。

以上のことから明らかなように、本発明は、上記の完全
配列を有する組換えガンマインターフェロンだけでな
く、アミノ酸143を欠くか又はＺ→アミノ酸143のアミノ
酸配列（但し、Ｚはアミノ酸127,128,129,130,131,132,
133,134,135,136,137,138,139,140,141又は142である）
を欠く種々の組換えガンマインターフェロン及びこれら
の混合物をも含む。本発明の組換えガンマインターフェ
ロンをコードしている二本鎖DNA配列が、上記の完全配
列をコードしているDNA配列だけでなく、上記した種々
のカルボキシ末端を切り取ったアナログのみをコードし
ている配列をも含むことを同様に明らかであろう。この
種々のカルボキシ末端を切断した場合には次に続くコド
ンが翻訳終了シグナルをコードする。

本明細書中、「組換えガンマインターフェロン」とは、
組換えDNA技術によって得られる複製可能な発現ベヒク
ルから形質転換細胞中で発現されるポリペプチド（これ
を産生する細胞によってグリコシル化されているかいな
いかにかかわらず）を意味する。本発明のポリペプチド
は、天然ヒトガンマインターフェロンに特有の性質即
ち、程度の差はあれ多少ともヒトに於ける抗ウィルス活
性及び抗細胞増殖活性並びにpH2に於ける不安定性を示
す。

本明細書に記載した組換えガンマインターフェロンは、
本発明の目的として少なくとも１〜約126のアミノ酸を
各々有する前記の如きポリペプチドの２個の組換え（各
ポリペプチドは同数又は異なる数のアミノ酸を有し得
る）として定義される「二量体」を形成すると考えられ
る。化学結合形成機構に関する性質は充分には解明され
ていないが、共有結合以外の結合であると思われる。二
量体を生ずる結合は自然に起こるようであり、本明細書
に記載する系では不可避であると思われる。従って、本
発明の組換えガンマインターフェロンを投与するときに
は、通常二量体の形態であろう。

更に、別に特徴づけられた組換えガンマインターフェロ
ンに関する文献（8,9）の開示と同様に、本明細書中に
開示した組換えガンマインターフェロン中、アミノ酸12
6付近の上流若しくは下流又はＣ末端部分で、保有する
インターフェロン活性を損うことがなければ、アミノ酸
の置換又は付加、特に１個のアミノ酸の置換及び複数の
アミノ酸の付加又は置換が可能であると理解すべきであ
る。本発明の範囲を超えることなく、前記の如き置換も
しくは付加をなし得ることは当業者には明らかであると
思われる。さらに本発明の組換えガンマインターフェロ
ンは完全配列（第１図参照）の改変種及び対立変異種で
あって完全配列のものと同等、あるいはそれ以上の生物
学的活性を持つ種を包含する。

本発明の特徴として、精製した組換えガンマインターフ
ェロンは実質的にヒト由来の他のタンパクを含まないで
あろうし、この特徴によって、今まで入手可能であった
天然のヒトガンマインターフェロン組成物とは区別され
るであろう。

本発明は、（処方前に）約95％より高純度、好ましくは
約98％より高純度の組換えガンマインターフェロン組成
物を包含し、このため、該組成物は今までに入手可能で
あった天然のガンマインターフェロンと区別される。

同様に、Ｎ末端アミノ酸残基がメチオニンである本発明
の具体例の１つの組換えガンマインターフェロンはヒト
の体内で産生されるガンマインターフェロンと区別さ
れ、CYS−TYR−CYSの欠失以外にも同様な理由で、Gray
等（６）が報告した配列を有するインターフェロンとは
区別されるであろう。

本明細書中、複製可能な発現ベヒクルとは、二本鎖DN
A、好ましくはプラスミドを意味し、これは、複製開始
領域，プロモーター又はプロモーター−オペレーター，
リボソーム結合部位をコードする配列，翻訳開始シグナ
ルコドン及びこれらと適切な解読相にあり所望の組換え
ガンマインターフェロンをコードしている遺伝子、更に
これに続く翻訳終了コドンから成る。現在では、組換え
DNA技術の一般的技術及び用語は当業者には充分理解さ
れており、いずれにせよ当業者は、本発明の全ての具体
例及び合法的に均等であると認識される例の実施に関す
るバックグラウンド情報として必要な変更を加えて（1
1）を参照できるであろう。

実施例 A.クローニング 参考文献（６）及び特開昭58−90514号公報の記載に従
い、誘発ヒト末梢血リンパ球から得たメッセンジャーRN
Aを用いて、ガンマインターフェロンcDNA配列を有する
組換えDNAクローンを調製した。クローンp67のDNA配列
を第１図に示す。５′−非翻訳領域に続いて、23個のア
ミノ酸から成る前駆体即ちシグナルペプチドをコードし
ている69個のヌクレオチド,143個のアミノ酸から成る成
熟インターフェロンポリペプチドをコードしている429
個のヌクレオチド及び３′−非翻訳配列を形成する587
個のヌクレオチドがある。

B.発現 1.E.coliによる例 E.coli中で組換えIFN−γを高レベルで発現させるため
には、シグナルペプチドのATG（アミノ酸S1）ではな
く、成熟ポリペプチドのグルタミンコドン（アミノ酸
１）の直前のATGコドンからタンパク合成を開始すべき
である（第１図参照）。E.coli中で直接にp67のcDNAイ
ンサートを発現させるためにとった手順の概略を第２図
に示す。Gray等（６）のcDNAインサートをE.coli中で発
現するために使用したアプローチと同様のアプローチを
とった。

シグナルペプチドコード領域を除去するために、推定成
熟コード配列のコドン２に位置するAva II制限部位を用
いた。２種の合成デオキシオリゴヌクレオチドを、アミ
ノ酸１及び２のコドンを再生し、ATG翻訳開始コドンを
組み込み且つXba I粘着性末端を作成するようにデザイ
ンした。これらの２種のオリゴマーを、cDNAインサート
の残りに結合して、144個のアミノ酸から成るポリペプ
チドをコードし且つ両端にXba I及びPst I部位を有する
1063塩基対の合成−天然ハイブリッド遺伝子を組み立て
た。この遺伝子をプラスミドpLeIFA25（10）のXba I及
びPst I部位の間に挿入して、発現プラスミドｐγ−CYC
5を作製した。このプラスミドでE.coli W3110株（F^-,
λ^-,原栄養株protrophic）（ATCC No.27325）を形質転
換して、宿主−ベクター系E.coli W3110/pγ−CYC5を
得た。

2.培養細胞の例 第１図に示したようなＮ末端アミノ酸を含む成熟ガンマ
インターフェロン遺伝子からの産物であることを確認す
るために、第１図に示したようなシグナルペプチド及び
ガンマインターフェロンの双方をコードしている遺伝子
を、放射活性標識システイン及びメチオニンの存在下で
COS−７細胞（16）中で発現させた（E.coliによる発現
の場合と異り、ここに例示したような哺乳動物細胞系の
発現産物はＮ末端メチオニンを欠いている）。

60mmペトリ皿中のCOS−７細胞の集密単層（confluent
monlayer）に、改良DEAE−デキストラン法を使用してDN
Aをトランスフェクトしたものを２組調製した。DNA添加
の３日後、培地を除去した。各プレートに、100μCiS³⁵
−メチオニン又はS³⁵−システインを添加したDMEM2mlを
加えた。放射活性標識アミノ酸の存在下で16時間インキ
ュベートした後、培地を除去し、抗ガンマインターフェ
ロンモノクローナル抗体又はHBsAgモノクローナル抗体
を第１抗体としウサギ抗マウスIgG抗体（Cappell In
c.）を第２抗体として500μの免疫沈降を実施した。
前記抗体との反応及びその後のスタフィロコッカス（St
aphlycoccus）Ａ細胞（Calbiochem）への結合は、P.Ber
man等によって記述されている（18）。サンプルをSDS−
メルカプトエタノール中に再懸濁し、10％SDS−PAGEゲ
ル上で電気泳動にかけた。ゲルをエタノール中７％酢酸
で固定し、Enhance（New England Nuclear）螢光溶液
に浸し、乾燥し、Kodak AR5フィルム及び増感スクリー
ン（Dupont）を使用して２週間露光させた。

本研究に使用したプラスミドはpSVγ69（11）、pDL RI
（19）（Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原発現ベクター,pSVγ
69の前駆体）及びpDL RIγ Sau（pSVγ69（11）の830
bp Sau3A断片を含有するポリシストロンプラスミドで
あり、pDL RIのEcoRI部位に挿入されたガンマインター
フェロンをコードしている全配列を含むもの）であっ
た。後者のプラスミドはガンマインターフェロン及びHB
sAg双方のコード領域を含む転写産物を産生する。

抗ガンマインターフェロン抗体（Ａ）又は抗HBsAg抗体
（Ｂ）と反応するS³⁵−システイン及びS³⁵−メチオニン
標識タンパクを比較すると、pDL RI−γ Sauでトラン
スフェクトしS³⁵−システインで標識した細胞では、抗
ガンマインターフェロン抗体を使用して特異的に免疫沈
降する物質は、グリコル化物（MW29,000）の位置に移動
するものもモノグリコシル化物（MW18,000）の位置に移
動するものもないのに対し、これとは対照的に、S³⁵−
メチオニン標識細胞ではガンマインターフェロンの免疫
沈降が生じた。

C.発酵生産 E.coli W3110/pγ−CYC5を用いる組換えヒトインター
フェロン−ガンマ（rIFN−γ）の産生は、容量10乃至10
00の範囲のバッチで実施する。発酵後、インターフェ
ロンを含有するE.coli細胞をブロスから回収し、rIFN−
γを単離精製する。以下に発酵及び細胞回収方法を記載
する。

１）ストックカルチャーの調製及び維持 次の組成； バクトトリプトン 10g/L 酵母抽出物 5g/L 塩化ナトリウム ５〜10mg/L を有する無菌培地150〜500mLを含有する無菌のバッフル
板付培養フラスコ中で、ストックカルチャーを調製す
る。

次に、E.coli W3110/pγ−CYC5の一次培養物を培地に
接種する。

次いで、550nmに於ける吸光度が約1.0になるまで、接種
したフラスコを振盪器上25〜37℃でインキュベートす
る。30％（V/V）のジメチルスルホキサイド約50％（V/
V）をブロスに添加する。直ちに1mLのアリコートを無菌
バイアルに分与し、ふたを閉める。バイアルは−60℃以
下で保存する。各々の発酵は、接種用複製ストックカル
チャーを用いて開始する。

２）接種物の調製 接種物を振盪フラスコ又は小型ファーメンター内で前記
の培地（LBブロス）を用いて調製する。約37℃で約８時
間インキュベートした後、接種物をファーメンターに移
す。接種物の容量は、発酵容量の２乃至10％である。

３）発酵 組換えインターフェロン−ガンマの産生は、約10乃至10
00の作用容積を有するファーメンター内で行なう。発
酵培地は、１当り次の組成を有する。

グルコース（＊） 50−100g 硫酸アンモニウム 4.0−8.0g 一塩基性リン酸カリウム 3.0−5.0g 二塩基性リン酸カリウム 5.0−8.0g 硫酸マグネシウム七水塩 0.5−5.1g クエン酸ナトリウム二水塩 0.5−2.0g UCON LB−625 0.5−2.0mL 塩化第二鉄六水塩 0.05−0.15g 硫酸亜鉛七水塩 0.001−0.15g 塩化コバルト六水塩 0.001−0.005g モリブデン酸ナトリウム二水塩 0.001−0.005g 硫酸第二銅五水塩 0.001−0.005g ホウ酸 0.001−0.005g 硫酸マンガン一水塩 0.001−0.005g 塩酸 0.0−1.0mL チアミン−HCl 0.0−0.1g テトラサイクリン−HCl 0.001−0.01g Ｌ−トリプトファン（＊） 0.1−0.5g 酵母抽出物 2.0−8.0g ３−β−インドールアクリル酸 0.02−0.10g （＊）グルコース及びトリプトファンは一部を最初にフ
ァーメンターに入れ、残部は発酵中に供給する。

培地中の成分は、発酵に使用する前に、熱処理又は過
により殺菌する。

発酵は25〜40℃で行う。他の操作条件は次の通りであ
る； 攪拌（rpm） 100〜1000 通気（vvm） 0.5〜1.5 （必要なときなは酵素を補充） pH 6.5〜7.5 （水酸化アンモニウムの添加により調節） ４）精製 ａ）組換えガンマインターフェロンの抽出 塩及びpH6乃至９、好ましくは約９の適当な緩衝液を含
有する培地中にE.coli細胞を懸濁させる。ガウリン（Ga
ulin）ミルの如き高圧コロイドミル中で細胞懸濁液をホ
モゲナイズして組換えガンマインターフェロンを抽出す
る。充分なポリエチレンイミンを前記溶液に添加して、
0.1乃至１％（W/V）の溶液に調製する。上清にガンマイ
ンターフェロンが含まれている。

ｂ）組換えガンマインターフェロンのシリカをベースと
する吸着剤上での部分精製 pH6乃至９の範囲の適当な塩溶液で洗浄して不純物を除
去したシリカをベースとする吸着剤に上記（ａ）の上清
を吸着させる。0.5乃至1.0Mの塩化テトラメチルアンモ
ニウムを含有する溶液を用いて組換えガンマインターフ
ェロンを溶出する。本工程の全操作はpH7乃至９で行な
う。

ｃ）アニオン交換クロマトグラフィーによる組換えガン
マインターフェロンの部分精製 上記（ｂ）の溶出液を透析し、アニオン交換クロマトグ
ラフィー媒体に吸着させ、次いで洗浄して不純物を除去
する。増大する塩勾配で組換えガンマインターフェロン
を溶出する。本工程で使用できる典型的アニオン交換樹
脂には、カルボキシメチルセルロース及びスルホエチル
セルロースがある。全操作はpH7乃至９で行なう。

ｄ）リン酸カルシウムゲルクロマトグラフィーによる組
換えガンマインターフェロンの部分精製 上記（ｃ）の溶出物をリン酸カルシウム媒体に吸着さ
せ、次いで洗浄して不純物を除去する。リン酸塩濃度勾
配中で塩濃度を増加させて組換えガンマインターフェロ
ンを溶出する。本工程の全操作は、pH7乃至９で実施す
る。

ｅ）アニオン交換クロマトグラフィーによる組換えガン
マインターフェロンの部分精製 上記（ｄ）の溶出物を透析し、アニオン交換クロマトグ
ラフィー媒体に吸着させ、次いで洗浄して不純物を除去
する。アニオン交換媒体から塩濃度を増大する勾配で組
換えガンマインターフェロンを溶出する。典型的なアニ
オン交換クロマトグラフィー媒体は、カルボキシメチル
セルロース及びスルホエチルセルロースである。本工程
の全操作はpH7乃至９で実施する。

ｆ）ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる組
換えガンマインターフェロンの部分精製 上記（ｅ）の溶出物をゲルパーミエーション媒体に適用
し、カラムを塩含有溶媒で展開する。組換えガンマイン
ターフェロンを含有する適当な画分をプールして、精製
バルクを得る。本工程の全操作はpH7乃至９で行なう。

ｇ）Ｃ末端アミノ酸配列 Ｃ末端配列を決定するために、サンプルを70％蟻酸中に
透析し、臭化シアンで開裂し、得られたペプチドをAlte
x Ultrasphere C8逆相HPLCカラムで分離した。ピーク
を集め、アミノ酸及びその配列解析を行った。検知され
たＣ末端ペプチドは、−LEU−PHE−ARG−GLY−ARG（残
基135〜139、第１図）であり、ある場合には他のペプチ
ドが追加されており、その配列は−LEU−PHE−ARG−GLY
−ARG−ARG−ALA−SER−GLN（残基135〜143、第１図）
であった。これらの２種のペプチドの割合を決定するた
めに、（アミノ酸分析により）既知の量を逆相HPLCカラ
ムにかけ、それぞれのピークの高さを測定した。３回の
産生において長鎖のペプチド（135〜143,第１図）の含
有量はそれぞれ約２％未満であり、残りは５量体（アミ
ノ酸５個のもの）であった。このデータは、E.coliによ
る139個のアミノ酸含有及び143個のアミノ酸含有のガン
マインターフェロン（いずれの場合も存在するＮ末端メ
チオニンを含まない）の混合物の産生と一致するもので
あり、それぞれの相対比率は約98:2％である。

５）製剤化 前記工程に従い製造した組換えガンマインターフェロン
を、次表の好ましい非経口投与用の製剤にする。

本発明のインターフェロンは、医学的に適切な投与量範
囲、例えば体表面積1M²当り1.0mgで使用し得る。

D.トリプシン消化を経た種々のガンマインターフェロン
の活性測定 カルボキシ末端の違った種々のガンマインターフェロン
の活性を決定するために、上記のE.coliの例に記述した
ように調製したガンマインターフェロンを種々の程度に
トリプシン消化し、前述のA549細胞を用いるCPEアッセ
イによって試験した。

前述のように調製した組換えガンマインターフェロン
（ｒ−HuIFN−γ）の試料（6.5mg）をSephadex G−25モ
レキュラーシーブ小カラム（PD−10,Pharmacia）により
pH8.5の0.10M重炭酸アンモニウム緩衝液中に脱塩し、最
終タンパク濃度2.1mg/mlとした。希釈トリプシン溶液
（Worthington TPCK トリプシン,0.001M HCl中10μg/
ml,16μ）をｒ−HuIFN−γ溶液の1.9ml（4.0mg）に加
え、混合して室温でインキュベートした（トリプシン：
タンパク質＝1:25,000）。インキュベート混合物から、
１時間後、3.5時間後、5.75時間後、８時間後及び10.25
時間後にそれぞれ試料を取り出した。８時間目に15μ
（150ng）の希釈トリプシン溶液を再度加えて10.25時間
後の最終試料採取のための反応を促進した。

各時点の試料の各成分への分画化はBio Rad Biogel HP
HTカラムを使用するWaters HPLCシステムで行なった。
重炭酸緩衝液中の各時点でのアリコートは試料採取時に
カラムに直接（手操作による注入により）入れた。0.01
Mリン酸ナトリウム,pH8.0,30μＭ塩化カルシウムにより
カラムの平衡化し、平衡化緩衝液の直線勾配及び0.5Mリ
ン酸ナトリウム緩衝液,pH8.0,0.6μＭ塩化カルシウムを
使用してタンパクをカラムから溶出した。

214nm及び280nmにおける吸光度により検出したタンパク
のピークを分取し、分析に使用するまで４℃で密閉保存
した。選択されたピークに対する典型的な分析は以下の
ものを含む。

1.ヒト肺癌由来の細胞A549/EMCウィルスアッセイシステ
ムにおける抗ウィルス活性（13）。

2.Laemmliゲルシステムを使用する標準法によるSDS/PAG
E分画化（14）。

3.市販の色素（Pierce Chemical Co.,Rockford,IL.）結
合法によるタンパク濃度決定。

4.臭化シアンによるタンパク開裂とそれに続くペプチド
同定のためのHPLC分析（15）。

タンパクの試料は70％蟻酸に対して一晩透析（12,000−
14,000MWカットオフ）し、ロータリーエバポレーション
により乾燥し500μの70％蟻酸に再度懸濁した。12×7
5mmガラス管中の各サンプルに固体臭化シアンを加え、
密封して溶解するまで混合し、アルミホイルをかけ、通
気のよい場所で室温において一晩インキュベートした。

開裂の後、試料をロータリーエバポレーションにより乾
燥し、0.5mlの水に再懸濁し、再度乾燥した。HPLCによ
る分画化に先立ち、試料を50％蟻酸中に再溶解してタン
パク濃度約1mg/mlとした。

Altex Ultrasphere Octylカラム及びトリフルオロ酢
酸／水−トリフルオロ酢酸／アセトニトリル直線溶出勾
配を使用すつWaters HPLCシステムにより、ペプチドを
分画化した。可能な場合はアミノ酸分析によりペプチド
を同定した。短縮された形態のｒ−HuIFN−γの比較デ
ータを表１に示した（aaはアミノ酸を表わす）。

126aa〜143aaの範囲（Ｎ末端メチオニンは含まない）の
任意の長さのガンマインターフェロンは適切に末端調整
された遺伝子から発現されることがわかるであろう。例
えば第１図に示された遺伝子は、 にFnu4H制限部位を有する。Fnu4Hによる制限の後に、
“終了”コドンの付いた所望の配列をコードする合成オ
リゴヌクレオチド及び発現プラスミド中で使用可能な制
限部位に適合するリンカーをガンマインターフェロン遺
伝子の前部に結合することができる。例えば、配列： （Ｘは１個以上のアミノ酸をコードする）はFnu4HとBgl
IIでプラスミドを消化した後に前記例示のE.coli発現
ベヒクルに結合でき、結合の結果の終了コドンは下記の
ようになる。

E.アッセイ，細胞変性阻害 1.テスト方法 Eagle′ｓ MEM中に４×10⁵細胞/mlの含有量に調整した
ヒト肺癌由来（M549）細胞（ATCC No.CCL185）の懸濁
液100μを各ウェルに加える。

プレートを37℃で約18時間インキュベートする。

18〜24時間インキュベートした後、第１列目の各ウェル
に培地80μを追加する。

インターフェロン活性を測定する試料20μを第１列目
のウェルに加える。

第１列の各ウェルの内容物100μをそれぞれの横の第
２列目のウェルに移す。

ウェルの内容物100μを次列へ移し、これを全部で10
回繰り返して、第11列目まで移す。

24時間インキュベートした後、セルコントロールを除き
全てのウェルに脳心筋炎ウィルス50μを感染させ、感
染後24時間後の細胞変性効果が100％となるよう感染を
繰り返す。

トレイをふたで覆い37℃で24時間インキュベートする。

全てのウェルから液体を抜き、５〜15分間0.5％クリス
タルバイオレットで染色する。

細胞の生存能力を染色細胞を観察することにより測定す
る。

試料のタイターは、50％生存可能細胞が残存する希釈度
の逆数である。

2.計算 全ての試料の活性を、下記により計算されるReference
Units Conversion Factorによって規格化する。

3.比活性 NIHによるIFN−γ基準物質により標準化されたA549/EMC
Vバイオアッセイシステムを使用すると、組換えヒトIFN
−γの抗ウィルス比活性は、Ｎ末端に３つの付加アミノ
酸（CYS−TYR−CYS）のついた改変rIFN−γ分子の活性
により約３倍高い。

4.安定性 上記の生物学的活性の測定（A549/EMCV）によると、調
合後バイアル中に保存してあるrIFN−γは、生産後３ケ
月間（４℃で貯蔵）安定である（生物学的活性の損失は
ない）。

F.他のタイプのヒトインターフェロンと比較したrIFN−
γの抗細胞増殖活性 1.材料及び方法 rIFN−γ： 溶液形態のCYS−TYR−CYS−欠失組換えインターフェロ
ン−γ（20mMコハク酸ナトリウム,0.15M NaCl,pH6）。
前記のE.coliの例に依る方法で調製した。比活性は2.7
×10⁷IU/mgタンパクであった。

CTC−rIFN−γ： 溶液形態の、分子のＮ末端に“CYS−TYR−CYS"構造を有
する組換えインターフェロン−γ（20mMコハク酸ナトリ
ウム,0.15M NaCl,pH6）。比活性は1.3×10⁷IU/mgタン
パクであった。

HuIFN−β： ヒト二倍体包皮線維芽細胞内で産生されたヒト線維芽細
胞インターフェロンの凍結乾燥物で、比活性は１×10⁷I
U/mgタンパクより高く、トーレ インド.,インク．（To
ray Ind.,Inc.）により調製されたもの。バイアル中に
HuIFN−β３×10⁶IU及びヒト血清アルブミン3mgを含
む。

HuIFN−α： ドクター ケー．カンテル（Dr.K.Cantell），セントラ
ル パブリック ヘルス ラボラトリー（Central Pub
lic Health Laboratory），ヘルシンキ（Helsinki），
フィンランド（Finland）より供与された溶液形態のヒ
ト天然白血球インターフェロンで、比活性は４×10⁶IU/
mgタンパクである。

コントロール： ヒト血清アルブミン3mgを含有するプラシーボ。

培養培地： HeLa,KB,HMV−1,FL及びＪ−111細胞については、10％熱
不活化初乳前新生子牛血清（PNCS）及び2mM Ｌ−グル
タミンを添加したEagle′ｓ最少必須培地を使用した。A
549細胞には10％熱不活化PNCS、100μg/mlカナマイシン
及び2mM Ｌ−グルタミンを含有するDulbecco′ｓ最少
必須培地を使用した。表２に挙げた残りのヒト細胞には
熱不活化PNCS及び100μg/mlカナマイシンを添加したRPM
I1640培地を使用した。

2.抗細胞増殖活性の評価 培養培地に懸濁した試験細胞をプラスチック組織培養プ
レートに５×10³細胞/0.5ml/ウェルの濃度で接種した。
続いて対応する培地（0.5ml）に溶解した種々の量のイ
ンターフェロンを添加した（０日）。培養は37℃におい
て５％CO₂,95％空気の湿潤大気中で行った。浮遊増殖型
細胞については、６日目に培養培地を除去し、懸濁培養
液中の細胞をCoulterカウンターでの細胞計数のために
直接Isoton II（Coulter Electronics Inc.）中に懸
濁した。プラスチック容器中でシートを形成する細胞
は、測定に際し、Isoton II中での単一細胞懸濁物を調
製するために0.05％トリプシン−0.02％EDTAで前処理し
た。インターフェロンの抗細胞増殖活性は、コントロー
ル培養物（インターフェロンなし）と比較して細胞数を
50％減少するのに要する抗ウィルス単位数として表わし
た（IC₅₀,IU/mg）。

表に示した通り、rIFN−γの抗細胞増殖活性はヒト細胞
種により著しく異っていた。この場合、KATO−IIIすな
わち胃癌siglet−ring細胞は高度に敏感で1.2IU/mgのIC
₅₀を示すが、Daudi細胞すなわちBurkittリンパ種はＩ型
インターフェロン（Hu IFN−α,Hu IFN−β）に対して
は高度に敏感であるのに対して、rIFN−γを含むII型イ
ンターフェロンに対しては非感受性であった。肺腺癌
（PC−8,PC−12）は試験した全てのインターフェロンに
対して非感受性であった。rIFN−γとCTC−rIFN−γ間
の抗細菌スペクトルは殆んど同一であるが、一般的にrI
FN−γの抗細胞増殖効果はCTC−rIFN−γのそれよりも
優れているようである。４つのインターフェロンを比較
した場合、Daudi細胞を除いてrIFN−γにおいて最も高
い効果が得られた。

G.in vitroの種々の液中におけるrIFN−γとCTC−rIFN
−γの安定性の比較 10mgヒト血清アルブミン，リン酸緩衝液及び等張量のNa
Clをそれぞれ含有している、前記のE.coliの例に従って
調製したrIFN−γの凍結乾燥物１×10⁶IU/バイアル及び
Ｎ末端に“CYS−TYR−CYS"構造を有するrIFN−γの凍結
乾燥物１×10⁶IU/バイアルを蒸留水で溶解し、濃度を４
×10⁴IU/mlに調整した。

インターフェロンのin vitroにおける安定性は、種々の
液体中における残存抗ウィルス活性を測定することによ
って評価した。上記のインターフェロン溶液を、37℃又
は４℃の水浴インキュベーターで10分間プレインキュベ
ートした９倍容量のウサギ血清、ヒト血清あるいはEagl
e′s MEMに加えることによってインキュベートを開始し
た。0,0.25,0.5,1,4,8,24,72及び144時間後にアリコー
トを採取し、９倍容量のEagle′s MEMと混合した。試料
は、インターフェロンタイターの測定まで、ディープフ
リーザー中において−80℃で凍結保存した。インターフ
ェロンタイターは、Sindbisウィルスを感染させたヒト
羊膜細胞（FL細胞）を使用するCPE₅₀法により測定し
た。結果は初期タイターに対する残存タイターのパーセ
ンテージとして第３図に示した。

E.coli及びCOS−７細胞中で発現させる好ましい具体例
を参照して本発明を例示したが、本発明の組換えガンマ
インターフェロンが他の細菌株，酵母及び組織培養系の
如き他の系内に於いても産生され得ることは明らかであ
る。特開昭58−90514号公報及び参考文献（６）参照。
即ち、本発明は最も好ましい具体例に限定されず、むし
ろ前記特許請求の範囲の全ての適法範囲の均等物に亙
る。

参考文献 1.ディ，ゲデルら（D.Goeddel et al.），ネイチャー
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ン，キャラクタリゼーション アンド バイオロジカル
エフェクツ オブ リコンビナントDNA デライブド
ヒューマン IFN−アルファ アンド IFN−ガンマ
アナログズ（Production,Characterization and Biolog
ical Effects of Recombiant DNA Derived Human IF
N−alpha and IFN−gamma Analogs）",ザ バイオロジ
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バイオール．（Mol.Cell.Biol.），3,2250（1983）

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の組換えガンマインターフェロン遺伝
子のヌクレオチド配列及びそれから推定されるアミノ酸
配列を示す図であり、 第２図は本発明によって直接合成される組換えガンマイ
ンターフェロンをコードしているプラスミドの調製法を
示す説明図であり、 第３図は本発明のガンマインターフェロンの優れた安定
性を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ０７Ｋ 14/57 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｆ 9282−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） //(Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 特開 昭58−90514（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−51792（ＪＰ，Ａ) 国際公開83／4053（ＷＯ，Ａ) Ｎａｔｕｒｅ，295（1982）Ｐ．503− 508 Ｅｄ ｗａｒｄ Ｄｅ Ｍａｅｙｅｒ, Ｈｕｕｂ Ｓｃｈｅｌｌｅｋｅｎｓ編「Ｔ ｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｉ ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ 1983 −Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｅｃｏｎｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ ｌ ＴＮＯ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｎ ｔｈ ｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎ ｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ，ｈｅｌ ｄ ｉｎ Ｒｏｔｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄ ｏｎ 18−22 Ａ ｐｒｉｌ」（1983）Ｐ．121−128

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】コード鎖及び相補鎖からなる二本鎖DNAで
   あって、前記コード鎖が、Ｎ末端から伸延する下記アミ
   ノ酸配列： ［但し、Ｘがメチオニン残基を表しＹがグルタミン残基
   を表すか、またはＸが水素を表しＹがグルタミン残基ま
   たはピログルタミン残基を表す］ からなる天然のヒトガンマインターフェロンの特性を示
   すポリペプチドをコードしていることを特徴とする前記
   ２本鎖DNA。
2. 【請求項２】コード鎖及び相補鎖からなる二本鎖DNAで
   あって、前記コード鎖が、Ｎ末端から伸延する下記アミ
   ノ酸配列： ［但し、Ｘがメチオニン残基を表しＹがグルタミン残基
   を表すか、またはＸが水素を表しＹがグルタミン残基ま
   たはピログルタミン残基を表す］ からなる天然のヒトガンマインターフェロンの特性を示
   すポリペプチドをコードしていることを特徴とする前記
   ２本鎖DNAを発現し得る複製可能な発現ベヒクル。
3. 【請求項３】コード鎖及び相補鎖からなる二本鎖DNAで
   あって、前記コード鎖が、Ｎ末端から伸延する下記アミ
   ノ酸配列： ［但し、Ｘがメチオニン残基を表しＹがグルタミン残基
   を表すか、またはＸが水素を表しＹがグルタミン残基ま
   たはピログルタミン残基を表す］ からなる天然のヒトガンマインターフェロンの特性を示
   すポリペプチドをコードしていることを特徴とする前記
   ２本鎖DNAを発現し得る複製可能な発現ベヒクルで形質
   転換された細菌または哺乳動物細胞。