DK166832B1

DK166832B1 - Rekombinante gamma-interferon-polypeptider, dna, som koder for dem, replicerbare udtrykkelsesvektorer, som kan udtrykke dem, transformante celler, som er transformeret med udtrykkelsesvektorerne, og farmaceutiske praeparater indeholdende polypeptider

Info

Publication number: DK166832B1
Application number: DK600984A
Authority: DK
Inventors: Patrick William Gray; Ernst Heinrich Rinderknecht
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1983-12-16
Filing date: 1984-12-14
Publication date: 1993-07-19
Also published as: HK175996A; KR850004273A; DE3486424D1; DK600984A; HU202278B; US5595888A; ES8801553A1; ES538620A0; JPS60202899A; US4855238A; JP2545206B2; US6497871B1; GR82468B; JPH07173196A; JPH0789935B2; IL73803A; LV11633A; IE72494B1; FI91884C; JPH03201979A

Description

i DK 166832 B1

Denne opfindelse angår rekombinante-interferonpoly-peptider med forhøjet stabilitet, dobbeltstrenget DNA, som koder for dem, udtrykkelsesv/ektorer som kan udtrykke dem, transformante celler, som er transformeret med 5 udtrykkelsesvektorerne, og farmaceutiske præparater indeholdende polypeptiderne.

Opfindelsens baggrund

De publikationer og andre materialer,' som der henvises til i denne beskrivelse for at belyse opfindelsens bag-10 grund og i særlige tilfælde at give yderligere detaljer med hensyn til dens udøvelse, betragtes som inkorporeret i denne beskrivelse ved denne henvisning og er af nemheds-grunde samlet i den vedføjede bibliografi,‘til hvis numre der henvises i den følgende tekst.

15 Humane interferoner kan klassificeres i tre grupper på basis af forskellig antigenicitet og forskellige biologiske og biokemiske egenskaber. Den første gruppe omfatter en familie af leukocyt-interferoner, som normalt produceres hovedsageligt af celler, som udgør en 20 bestanddel af humant blod, efter viral induktion. Disse interferoner er blevet produceret mikrobielt og fundet at være biologisk aktive (1,2,3). Deres biologiske egenskaber har givet anledning til deres anvendelse i klinikken som terapeutiske midler til behandling af virusinfek-25 tioner og maligne tilstande (4).

I den anden gruppe er humant fibroblast-interferon, som normalt produceres af fibroblaster efter viral induktion, og som ligeledes er blevet produceret mikrobielt og fundet at udøve et bredt område af biologiske aktivi-30 teter (5). Kliniske afprøvninger tyder også på dets potentielle terapeutiske værdi. Leukocyt- og fibroblast-interferonerne udviser meget klare ligheder i deres biologiske egenskaber til trods for, at graden af homologt på aminosyreniveauet er relativt lav. Begge grupper 2 DK 166832 B1 af interferoner indeholder fra omkring 165 til omkring 166 aminosyrer og er syrestabile proteiner.

Humant X- -interferon (også i forskellige sammenhænge betegnet som immun-interferon, IIF eller IFN-.'^) udviser 5 de antivirale og antiproliferative egenskaber, som er karakteristiske for interferonerne, men er i modsætning til leukocyt- og fibroblast-interferoner pH2-labile.

Før fremstillingen af ^-interferoner via rekombinant-DNA-teknologi er de hovedsageligt blevet produceret efter 10 mitogenisk induktion af lymfocyter. Humant ^-interferon er klart antigenisk forskelligt fra leukocyt- og fibroblast-interferoner. Gray, Goeddel og medarbejdere var de første til at rapportere udtrykkelse af et rekombinant $-inter feron-polypeptid .'( 6 ), som har vist sig at have 15 humant ^-interferons karakteristiske egenskaber, dvs.

antiviral og antiproliferativ aktivitet koblet med pH2-labilitet. Det samme £-interferon-polypeptid er genstand for dansk patentansøgning nr. 4608/82 (DK fremlæggelses-skrift nr. 163 187 B). Gray og Goeddel's rekombinante &-20 interferon, som produceret i E. coli, bestod af 146 aminosy-syrer, hvor molekylets N-terminale del begyndte med sekvensen Cys-Tyr-Cys-, nemlig aminosyresekvensen udledt af den længst åbne aflæsningsramme i den følgende cDNA: 3 DK 166832 B1 S'

SI

TGAAGATCAGCTATrAGWGAGAAAG^TCAGnASGTCCTnGG^CTGftTCAGCTTGATACMiftACTACTGA'nTC/WiTTCTTTGGCn'AATTCTCllCGGftAACG ATG AM TAT

so too SIO S20 i 10

chr ser tvr ile leu ala phe gin leu cys ile val leu gly ser leu elv CYS TYR CYS CLH ASP PRO TYR VaL US CLO ALA CLU ASN

Aa AST TAT ATC TTG GCT T7T CAG CTC TGC ATC GTT TTG GGT TCT CTT GGC TGT TAC TGC CAG GAC CCA TAT GTA AM GAA GCA GM AAC

iTo 200

20 30 LO

LEU LYS LYS TYR PHE ASN ALA CLY HIS SER ASP VAL AU AS? ASN GLY THR LEU PHE LEU CLY ILE LEU LYS ASN TRP- LYS GLO CLU SER

07 AAG AM TAT TTT AAT GCA GGT CAT TCA GAT GTA GCG aT MT Ga ACT CTT TTC TTA GGC ATT TTG AAG MT TGG AM GAG GAG AGT

250 SO 60 20

ASP ARC LYS ILE MET CLN SER CLN ILE VAL SER PHE TYR PHE LYS LEU PHE LYS ASN PHE LYS ASP ASP CLN SER ILE CLN LYS SER VaL

GAC AM AM ATA ATG CAG AGC CM ATT GTC TCC TTT TAC TTC AM CTT TTT MA AAC TTT AM GAT GAC CAG AGC ATC CM AAG AGT GTG

300 350 80 90 too

CLU THR ILE LYS CLU ASP ÆT ASN VAL LYS PHE PHE ASM SER ASN LYS LYS LYS ARC ASP ASP PKE CLU LYS LEU THR ASN TYR SER VAL

GAG ACC ATC AAG GM GAC ATG MT GTC AAG TTTTTC MT AGC AAC AM AAG AM CGA GAT G<!C TTC GM AAG CTG ACT MT TAT TCG GTA

400 450 110 120 130

THR ASP LEU ASN VAL CLN ARG LYS AU ILE HIS CLU LEU ILE CLN VAL MET AU CLU LEU SER PRO AU AU LYS THR CLY LYS ARC LYS

ACT GAC TTG MT GTC CM CGC AM GCA ATA CAT GM CTC ATC CM GTG ATG GCT GM CTG TCG CCA GCA GCT AM ACA GGG AAG CGA AM

500 550

140 146 STOP

ARC SER CLN MET LEU PHE ARC CLY ARC ARC AU SER CLN

AGG AGT CAG ATG CTG TTT CGA GGT CGA AGA GCA TCC CAG TM TGGTTGTCCTGCCTGCMTATTTGMTTTTAMTCTAMTCTATTTATTMTATTTAAaTTA

600 650

TTrATATGGGGMTATATTTTTAGACTaTCMTCAMTAAOTATTTATMTAGCAACTTTTGTGTMTGAAMTGMTATCTATTMTATATGTATTATn'ATMTTCCTATATCCTG

700 750

TGACTGTCTCACTTMTCCTTrGTITTCTGACTMTTAGGCAAGGCTATCTaTTACMGGCTTTATCTCAGGGGCCAACTAGGCAGCCAACCTAAGCAAaTCCaTGGTTGTGTGTT

800 850 900

TATTTC/tl7aTGAT/aATGAACACTrATAMTGAAG|aTACTATCCAGTTACTGCCGGTiTGAAMTATGCCTGCMTCTGAGCCAGTGCTTTMTGGaTGTCAGACAGAAC'iT

950 1000 GMTGrGTMGGTGCCCTGATGMAAaTAGaTCTCAGGAGAnTaTGCCTGGTGCTTCCAMTATnjTTGACAACTGTGACTGTACCCAMTGGAAAGTAACTaTTTGTTAAM 1050 uoo

TTATCMTATCTMTATATATGMTAAAGTGTAAGTTCACAACTAAAAAAAAAAAAAAAAAM

1150 1200 3* 4 DK 166832 B1

Derynck og andre har senere rapporteret (7) et yderligere rekombinant ^-interferon med den samme N-terminus og en enkelt aminosyre-udskiftning, hvilket polypeptid måske udgør en allelisk variant af det tidligere rap-5 porterede (6). Andre forskere har rapporteret produktionen af endnu flere rekombinante&-interferoner, hvori én eller flere af de aminosyrer, som er til stede ifølge Gray et al.'s oprindelige publikation (6), angiveligt er blevet udskiftet.

2Q For eksempel rapporterer Alton et al. (17) en rakke IFN-Y'er, hvori en enkelt aminosyre-udskiftning ved position 81 i Gray et al.'s (6) ^-interferon resulterede i et IFN-Y, der kun bevarende 70 % af aktiviteten (på relativ basis), og hvori en yderligere deletion 15 af Cys-Tyr-Cys-sekvensen ved position 1,2,3 i dette IFN-Y yderligere reducerede den relative aktivitet, hvilket resulterede i et IFN-Y med kun 49 % af Gray et al.'s (6) ^interferons aktivitet.

I vore hænder har rekombinante y^-interferoner, hvis 20 N-terminale aminosyresekvens omfatter cysteinrester, vist sig at være problematiske med hensyn til oligome-risering, som kan involvere sulfhydrylgrupper i én eller flere af cysteinresterne i dannelse af disul fidbinding.

Vores manglende evne til fuldstændigt at reducere disse 25 formodede disulfidbindinger tyder på, at problemet kan være mere komplekst, idet det muligvis involverer reaktion via hydroxy funktionen i den cysteinbundne tyrosin-rest. Disse rekombinante interferoner har vist sig at være noget ustabile og har, hvad enten det skyldes en 30 sådan ustabilitet eller noget andet, vist sig at være af mindre end optimal anvendelighed.

5 DK 166832 B1

Sammenfatning af opfindelsen

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer rekombinante Ί -interferon-polypeptider med forhøjet stabilitet og aktivitet, som er særegne ved at have den i krav 1 an-5 givne aminosyresekvens.

Opfindelsen tilvejebringer også tilsvarende klonede gener, udtrykkelsesvektorer omfattende disse, og trans-formanter, som ved rekombinant-DNA-teknologi er nyttige til fremstilling af interferonerne ifølge opfindelsen.

10 De foretrukne rekombinante ^-interferoner ifølge op findelsen (sammenlignet med dem, der tidligere er karakteriseret i litteraturen) synes at ligge nærmest ved den sande aminosyresekvens af nativt ^-interferon, hvilket sidstnævnte nu er blevet renset fra native kil-15 der og fuldstændigt karakteriseret. Foretrukne udfø relsesformer af opfindelsen udviser stærkt forbedret stabilitet og aktivtet i forhold til dem, der tidligere er beskrevet i litteraturen.

6 DK 166832 B1

Forklaring af tegningerne

Dsn måde, hvorpå dette og andre formål for opfindelsen opnås, vil fremgå af den følgende detailbeskrivelse og de ledsagende tegninger, på hvilke: 5 fig. 1 belyser aminosyrerne 1 - 143 i et rekombinant y'-interferon ifølge opfindelsen og DNA-sekvensen, der koder for aminosyresekvensen og en forudgående signalsekvens, hvilken DNA-sekvens er flankeret af områder af 5'- og 3'-utranslaterst DNA; 10 fig. 2 skematisk belyser et plasmid, der koder for direkte syntese af et rekombinant Y^-interferon ifølge opfindelsen i E. coli, og dens fremstilling; og fig. 3 registrerer data, som viser den forhøjede stabilitet af ^interferon fremstillet ifølge den foreliggende 15 opfindelse.

Detailbeskrivelse

Vi har lært, at nativt humant Y^-interferon (dvs. det, der stammer fra mitogen-induktion af humane perifere blod-lymfocyter og efterfølgende oprensning) er et poly-20 peptid, som mangler den N-terminale Cys-Tyr-Cys-sekvens, som af Gray et al. blev tilskrevet det rekombinante Y^-interferon, hvis sekvens er afbildet i (6). Trypsin-nedbrydninger af højrenset nativt interferon i vore hænder inkluderede sekvenser, hvis aminosyresammensstning 25 alment svarede til den N-terminale portion af Gray et al.'s rekombinante interferon fra (6) undtagen Cys-Tyr-Cys. Aminosyresekvensanalyse fra N-terminus i nativt ^-interferon viste sig forgæves, hvilket førte til den slutning, at α-aminosyren ved molekylets N-terminus var beskyttet.

30 Eftersom den første aminosyre efter det andet cystein hos 7 DK 166832 B1

Gray et al. (6), for hvilket cDNA'en kodede, var Gin (glutamin), formodede vi, at cyclisering af Gin-resten i stedet havde efterladt pyroglutamat, således at N-terminus var blokeret. Fjernelse af pyroglutamat med pyroglu-5 tamat-aminopeptidase efterlod en fri a-aminogruppe forbundet med Asp, den næste indkodede aminosyre, og sekvensanalysen kunne gå videre, hvilket muliggjorde den første rapporterede karakterisering af nativt humant /-interferon.

10 Passende ændring af cDNA for Cys-Tyr-Cys-holdigt rekombi- nant humant ^interferon muliggjorde den direkte udtryk-kelse i E. coli af hidtil ukendt rekombinant ^-interferon fra en cDNA, som kodede for det protein, hvis fulde sekvens er anført ovenfor, idet X er Met, og Y er Gin.

15 Det N-terminale methionin er et kunstprodukt indkodet af mRNA-translations-"start"-signalet AUG, som i det særligt eksemplificerede tilfælde af E. coli-udtryk-kelse ikke forarbejdes væk af værtssystemer. I andre mikrobielle systemer, f.eks. Pseudomonas, kan methionin 20 fjernes; det forekommer ikke i noget tilfælde nødvendigt for aktivitet. Hvor methionin fjernes og afhængigt af det anvendte system, kan Gin-resten cyclisere til pyro-glutamatformen, igen uden nogen formentlig skade for aktivitet.

25 I vore hænder nød det Cys-Tyr-Cys-holdige rekombinante Y'-interferon, som tidligere er rapporteret af Gray et al., gavn af sammensætning med humant serumalbumin til hjælp for stabilisering. Tilstedeværelsen af serum-albumin i det endelige lyofiliserede produkt kræver 30 imidlertid, at der gennemføres visse kvalitetskontroltrin forud for lyofilisering snarere end på det færdige produkt.

I tilfælde af det hidtil ukendte rekombinante ^interferon ifølge den foreliggende opfindelse har materialet i -·=ν- - --- DK 166832 B1 8 lyofiliseret form på den anden side vist sig at vare tilstrækkeligt stabilt uden inklusionen af serumalbumin.

Om ønsket kan /-interferonerne ifølge opfindelsen imidlertid sammensattes med farmaceutisk acceptable 5 niveauer af humant serumalbumin.

Udover det foranstående viser de Cys-Tyr-Cys-manglende rekombinante humane y'-interferoner ifølge opfindelsen sig ved cytopatisk-effekt-inhiberingsprøvning at vare betydeligt mere aktive som antivirale midler end deres 10 Cys-Tyr-Cys-holdige analoge. Aktiviteten prøves konven tionelt i mikrotiterplader ved inhibering af den cytopa-tiske effekt (CPE) af encephalomyocarditis-virus på humane lungecarcinomaceller A549; se (12).

De rekombinante ^-interferoner ifølge opfindelsen inklu-15 derer alle dem, der omfatter aminosyrerne 1 til omkring 126 af den ovenfor angivne fulde sekvens, ^-interferoner afkortet på forskellig måde i den carboxyterminale ende i forhold til den fulde sekvens vedbliver med at udvise de karakteristiske egenskaber for humant /-interferon, 20 trods formindskede niveauer i nogle tilfalde, så lange aminosyrerne 1 til omkring 126 er til stede. Faktisk viste vore forsøg med den Cys-Tyr-Cys-holdige analoge rapporteret i (7), at fremmede sekvenser kunne erstatte aminosyresekvensen efter aminosyre 132 (ifølge det fore-25 liggende nummereringssystem) uden tab af aktivitet; se f.eks. (8). Forløbige vidnesbyrd i vore hænder understøtter den hypotese, at medens aminosyrerne 1 til omkring 126 (Thr) er relativt tæt bundet i en tre-dimensional konfiguration, som vi forbinder med aktivitet, er de 30 resterende aminosyrer i den fulde sekvens i sammenlig ning mindre indesluttede og relativt følsomme for pro-teolyse. Trypsin-nedbrydning under begrænsende betingelser fjerner forskellige portioner af sekvensen nedenfor pp^' 9 DK 166832 B1 aminosyre 126, men ikke ovenfor denne. Native j^-inter-feron-dele i vore hænder inkluderer molekyler, som varierende strækker sig til aminosyrerne 127, 128, 129, 130, 132 og 134. Vi har set fuldt aktiv rekombinant J^-interfe-5 ron, hvis aminosyresekvens efter methionin bestod henholds vis af aminosyrerne (udover Net) 1 til omkring 139 og 1 til omkring 131, det sidstnævnte opnået ved begrænset nedbrydning af rekombinant finterferon med trypsin efterfulgt af sskvensbekrsftelse. Lignende trypsin-nedbrudte 10 fragmenter, som henholdsvis endte ved omkring aminosyrerne (udover Met) 128 og 129, bevarede aktivitet, omend væsentligt formindsket. På den anden side udviste materialet med 125 aminosyrer (foruden det N-terminale methionin), efter at threoninet ved position 126 og de følgende 15 aminosyrer var blevet spist væk, mindre end 1 % af det ikke-nedbrudte materiales aktivitet ved CPE-inhiberings-prøvning.

Rekombinant-afledt Y-interferon viser sig, foruden at bære et start-methionin, når det fremstilles i værter, 20 hvor methioninet ikke fraspaltes intracellulsrt, at udvise en overvejende art med 139 aminosyrer (baseret på nummereringsystemet i figur 1) og en mindre betydende art med 143 aminosyrer. Blandingen af de to arter indeholder mere end ca. 95 %, og oftest mere end ca. 97 % af 25 arten med 139 aminosyrer. Trypsin-nedbrydning under begrænsende betingelser fjerner ligeledes portioner af sekvensen nedenfor omkrino aminosyre 126. Rekombinant V- interferon i vore hænder inkluderer efter en sådan begrænsende trypsin-nedbrydning arter, som varierende 30 strækker sig til aminosyre 125 (126 med et start-nethio-nin), 129, 131 og 134. Disse arter har bevaret aktivitet, omend væsentligt formindsket, i den zone, der strækker sig fra omkring aminosyre 125 til omkring aminosyre 129. Arter med mindst omkring 129 aminosyrer og især 35 mindst omkring 131 aminosyrer, dvs. arter med fra om- 10 DK 166832 B1 kring 129 til 143 aminosyrer, er i hovedsagen funktionelt fuldt aktive.

I betragtning af det forudgående vil det vsre klart, at opfindelsen ikke kun omfatter rekombinante ^-interfe-5 roner, der udviser den fulde sekvens, som angivet ovenfor, men også sådanne, og blandinqer af forskellige af sådanne, hvori aminosyre 143 mangler, eller hvori aminosyresekven-sen Zaminosyre 143 mangler, hvor Z betegner aminosyre 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 10 138, 139, 140, 141 eller 142. Det vil ligeledes vsre klart, at dobbeltstrengede DNA-sekvenser, der koder for rekombinante ν'-interferoner ifølge opfindelsen, ikke kun omfatter sådanne, der koder for den fulde sekvens, som afbildet ovenfor, men også sådanne, der kun koder 15 for de forskellige, netop beskrevne carboxyterminal-afkort- ede analoge, idet de følgende codoner efter hver forskellig afkortning koder for translationsstopsignaler.

Med henvisningen til "rekombinant ^-interferon" i denne beskrivelse skal forstås et polypeptid (hvadenten det 20 er glycosyleret af cellen, hvori det produceres, eller ej) udtrykt i en transformantcelle udfra et replicer-bart udtrykkelsesmedium stammende fra rekombinant-DNA-tek-nologi, hvilket polypeptid i større eller mindre grad udviser den antivirale og antiproliferative aktivitet 25 hos mennesker og de pH2-labile egenskaber, som er karak teristiske for nativt humant V-interferon.

De her beskrevne rekombinante y^-interferoner antages at danne "dimere", som med henyn til denne beskrivelse defineres som en kombination af to sådanne polypeptider, 30 der hver har mindst aminosyrerne fra 1 til omkring 126 (hvilke polypeptider kan have det samme eller et forskelligt antal aminosyrer). Arten af den kemiske kombinerings- 11 DK 166832 B1 mekanisme forstås ikke fuldt ud, men antages at være en anden end kovalent binding. Denne kombination til dimere viser sig at ske spontant og antages at være uundgåelig i de her beskrevne systemer. Således vil 5 de rekombinante ^-interferoner ifølge opfindelsen, når de indgives, sædvanligvis være i den dimeriserede form.

Endvidere må det' forstås, at der i de her angivne rekombinante ^-interferoner ligesom i litteraturangivelserne 10 vedrørende to forskelligt karakteriserede rekombinante ^-interferoner (8, 9) vil kunne forekomme aminosyre-udskiftninger eller -tilføjelser, især udskiftninger af enkelte aminosyrer og tilføjelse eller udskiftning af grupper af aminosyrer ovenfor eller nedenfor omkring 15 aminosyre 126 eller C-terminus. Uden ødelæggelse af den interferonaktivitet, som de har. Det vil være indlysende for fagfolk at foretage sådanne udskiftninger eller tilføjelser uden at komme udenfor opfindelsens omfang. Igen inkluderer de rekombinante ^-interferoner 20 ifølge opfindelsen arter, som har modifikationer og alleliske variationer af den fulde sekvens (se fig.

1), som udviser biologisk aktivitet ækvivalent med eller større end aktiviteten af den fulde sekvens.

Karakteristisk vil rensede rekombinante ^-interferoner 25 være i hovedsagen frie for andre proteiner af human oprindelse og adskiller sig således fra de native humane /- interferon-præparater, som hidtil har været til rådighed.

Opfindelsen inkluderer rekombinante if-interferon-prspa-30 rater, som (før sammensætning) er mere end ca. 95 % rene, fortrinsvis mere end 98 % rene, hvilke.præparater af den grund ligeledes adskiller sig fra native ^-interferoner, som hidtil har været til rådighed.

12 DK 166832 B1

Udførelsesformer af opfindelsen, hvori den N-terminale aminosyrerest er methionyl, adskiller sig ligeledes fra ^-interferoner produceret i den menneskelige krop og viser sig også af den grund, udover deres deletion 5 af Cys-Tyr-Cys, at adskille sig fra dem, hvis sekvens er rapporteret af Gray et al. (6).

De replicerbare udtrykkelsesmedier, som der henvises til i denne beskrivelse, er dobbeltstrengede DNA-dele, fortrinsvis plasmider, som omfatter et repliceringsori-10 gin, en promotor eller promotor/operator, en sekvens, der koder for et ribosombindingssted, en codon for et translationsstartsignal og i rigtig aflssningsfase dermed et gen, der koder for det rekombinante ^-interferon af interesse, efterfulgt af én eller flere codoner for 15 translationsstop. På det nuværende stade forstås den almene teknik og lexikografi for rekombinant-DNA-tekno-logi godt af fagfolk, som i alle tilfælde henvises til (11) med hensyn til baggrundsinformation vedrørende udøvelsen af den foreliggende opfindelse, med nødvendige 20 ændringer af uvæsentlige træk, i alle dens udførelses- former og juridisk erkendelige ækvivalenter.

Eksempel A. Kloning

Rekombinante DNA-kloner indeholdende j(-interferon-cDNA-25 sekvenser blev fremstillet som beskrevet i (6), og i den før nævnte beslægtede danske patentansøgning nr.

4608/82 med mRNA fra inducerede·humane perifere blod-lymfocyter. DNA-sekvensen af klon p67 er vist i fig.

1. Et 5' utranslateret område efterfølges af 69 nucleotid-30 er, som koder for et forstadie- eller signalpeptid på 23 aminosyrer, 429 nucleotider, som koder for et modent interferon-polypeptid på 143 aminosyrer, og 587 nucleotider af 3' utranslateret sekvens.

13 DK 166832 B1 B. Udtrykkelse 1. E. coli eksempel

For at udtrykke høje niveauer af rekombinant IFN-tf i E. coli må starten af proteinsyntesen ske ved en ATG-codon, 5 som kommer umiddelbart før glutamincodonen (aminosyre 1) i det modne polypeptid, snarere end ved ATG-codonen i signalpeptidet (aminosyre SI) (fig. 1). Den procedure, som blev fulgt for at udtrykke cDNA-indsætningen af p67 direkte i E. coli, er skitseret i fig. 2. Arbejdsmåden 10 mindede om den, der blev anvendt til at udtrykke cDNA-ind- sætningen i E. coli hos Gray et al. (6).

Et AvalI-restriktionscenter beliggende ved codon 2 i den formodede modne kodesekvens blev anvendt til at fjerne signalpeptid-kodeområdet. Der blev udformet synte-15 tiske deoxyoligonucleotider, som genopretter codonerne for aminosyre 1 og 2, inkorporerer en ATG-translations-startcodon og skaber en Xbal-kohæsiv terminus. Disse to oligomere blev ligeret til resten af cDNA-indsætningen, hvorved der blev konstrueret et 1063 bp syntetisk-natur-20 ligt hybridgen, som koder for et polypeptid på 144 amino syrer og er afgrænset af Xbal- og Pstl-centre. Dette gen blev indsat i plasmidet pLeIF A25 (10) mellem Xbal-og Pstl-centrene til opnåelse af udtrykkelsesplasmidet pV^-CYCS. E. coli stamme W3110 (F -, prototroph ) 25 ATCC no. 27325) blev transformeret med dette plasmid til opnåelse af vsrt-vektor-kombinationen E. coli W3110/p/-CYC5.

2. Cellekultur-eksempel

Udtrykkelse af et gen, som koder for både signalpeptidet 30 og ^-interferon, som vist i fig. 1, blev gennemført i COS-7-celler (16) i nærvær af radioaktivt mærket cystein DK 166832 Bl 14 og methionin, hvilket bekræftede produktionen udfra genet af modent ^interferon, hvis N-terminale aminosyrer er som vist i fig. 1 (til forskel fra hvad der var tilfældet ved E. coli-utrykkelse mangler udtrykkelses-5 produktet fra pattedyrcellesystemer som det her eksempli ficerede N-terminalt methionin).'

Sammenflydende monolag af C0S-7-celler i 60 mm petriskåle blev transficeret dobbelt med DNA under anvendelse af den modificerde DEAE-dextran-procedure. Tre dage efter 10 DNA-tilsætningen blev mediet fjernet. Hvert sst plader modtog 2 mL DMEM suppleret med 100 /UCi ^S-methionin 35 - eller S-cystein. Efter 16 timers inkubation i nærvær af den radiomsrkede aminosyre blev mediet fjernet og 500 ^,uL immunofsldet under anvendelse af et monoklonalt 15 anti- ^-interferon-antistof eller et monoklonalt anti- HBsAg-antistof som det første antistof og et kanin-anti(mu- se-IgG)-antistof (Cappell Inc.) som det andet antistof.

Omsætningen med antistoffet og den efterfølgende binding til Staphylococcus A celler (Calbiochem) er som beskrevet 20 af Berman, P. et al. (18). Prøverne blev gensuspenderet i SDS-mercaptoethanol og underkastet elektroforese på 10Δ SDS-PAGE-geler. Gelen blev fikseret i 7Δ eddikesyre i ethanol, udblødt i "Enhance" (New England Nuclear) fluoropløsning, nedbørret og eksponeret i to uger under 25 anvendelse af "Kodak AR5" film og en intensiveringssksrm (Dupont).

De plasmider, som anvendtes ved denne undersøgelse, var pS\/9 (11); pDL RI (19), en hepatitis-B-virus-overfladeantigen-udtrykkelsesvektor, hvorpå pS\l)^69 var 30 baseret; og pDL-RI-V^au, et polycistronisk plasmid inde holdende 830 bp Sau3a-fragmentet af pS\/y&9 (11), der spænder over hele -interferon-kodesekvensen indsat i EcoRI-centret i pDL RI. Det sidstnævnte plasmid producerer en transkript indeholdende både ^interferon- og 35 HBsAg-kodeområderne.

15 DK 166832 B1 35 35

Sammenligning af S-cystein- og S-methionin-mærkede proteiner, som reagerer med enten anti- {^-interferon-(A) eller anti-HBsAg-(B)-antistoffer viste, at intet materiale som vandrede ved enten den glycosylerede (mole-5 kylvsgt 29000) eller nonoglycosylerede (molekylvægt 18000) position, blev specifikt immunofsldet fra ^S-Cys-msrkede pDL-RI- K^sau-transficeredé celler under anvendelse af anti- V-interferon-antistof, i modsætning til de ^^S-Met-msrkede celler, som viste immunofældning 10 af Ί^-interferon.

C. Garinqsproduktion

Produktionen af rekombinant humant V’-interferon (rIFN-iO under anvendelse af E. coli k!3110/p /-CYC5 udføres i charger varierende i volumen fra 10 til 1000 liter.

15 Efter gæringen udvindes de interferon-holdige E. coli- celler fra væsken til isolering og rensning af rlFN-^·

Det følgende er en beskrivelse af gærings- og celle-udvindings-processerne.

1. Fremstilling og opretholdelse af laqerkulturer 20 En lagerkultur fremstilles i sterile, med skovle forsynede dyrkningskolber indeholdende 150 - 500 nL af et sterilt medium med følgende sammensætning:

bactotrypton 10 g/L

gærekstrakt 5 g/L

25 natriumchlorid 5-10 mg/L.

Mediet podes derpå med en primær kultur af E. coli W3100/p)f-CYC5.

Den podede kolbe inkuberes derefter på et rysteapparat ved 25 - 37 °C, indtil absorbansen ved 550 nm når til-30 nærmelsesvis 1,0. Der sættes omkring 50 volumen-S 30 vo- DK 166832 Bl 16 lumen-?i dimethylsulfoxid til væsken. Derpå aftappes øjeblikkeligt 1 mL aliquoter i sterile ampuller, som lukkes med hætte. Ampullerne opbevares ved -60 °C eller derunder. Hver gæring startes under anvendelse af en 5 replikat lagerkultur som inoculum.

2. Inoculumfremstilling

Inoculumet fremstilles i det tidligere beskrevne medium (LB-væske) i enten rystekolber eller små fermentorer.

Efter inkubation ved omkring 37 °C i tilnærmelsesvis 10 8 timer overføres inoculumet til en fermentor. Inocu- lumets volumen er 2 - 10 % af gæringsvolumenet.

3. Gæring

Produktionen af rekombinant ^-interferon udføres i fermentorer med arbejdsvolumen på fra omkring 10 til 15 omkring 1000 liter. Gæringsmediet er sammensat af: 17 DK 166832 B1 pr. liter *alucose 50-100 g ammoniumsulfat 4,0-8,0 g kaliumphosphat, monobasisk 3,0-5,0 g kaliumphosphat, dibasisk 5,0-8,0 g magnesiumsulfat, heptahydrat 5,0-5,1 g 5 natriumcitrat, dihydrat 0,5-2,0 g

"UC0N LB-625" 0,5-2,0 mL

ferrichlorid, hexahydrat 0,005-0,15 g zinksulfat, heptahydrat 0,001-0,15 g cobaltchlorid, hexahydrat 0,001-0,005 g 10 natriummolybdat, dihydrat 0,001-0,005 g cuprisulfat, pentahydrat 0,001-0,005 g borsyre 0,001-0,005 g mangansulfat, monohydrat 0,001-0,005 g

saltsyre 0,0-0,1 mL

15 thiamin-HCl 0,0-0,1 g tetracyclin-HCl 0,001-0,01 g *L-tryptophan 0,1-0,5 g gsrekstrakt 2,0-8,0 g 3-f-indolacrylsyre 0,02-0,10 g 20 * En portion af glucosen og tryptophanet sættes til fermentoren fra starten, og resten tilføres under gæringsprocessen .

Ingredienserne i mediet steriliseres ved varmebehandling eller filtrering før anvendelse ved gæringen. Gæringen 25 udføres ved 25 - 40 °C. Andre arbejdsbetingelser er som følger:

Omrøring 100 - 1000 omdr./min.

Beluftning 0,1 - 1,5 vol./vol. min. (suppleret med oxygen, hvor det var nødvendigt) 30 pH 6,5 - 7,5 (styret ved tilsætning af ammoniumhydroxid) 18 DK 166832 B1 4. Rensning a. Ekstraktion af rekombinant ^-interferon E. coli-celler suspenderes i et medium, som indeholder salte og passende puffer i pH-området 6-9, fortrinsvis 5 omkring 9. Rekombinant V^-interferon ekstraheres ved homogenisering af cellesuspensionen i en højtryks-kolloid-mølle, såsom en Gaulin-mølle. Der sættes tilstrækkeligt polyethylenimin til opløsningen til at frembringe en 0,1 - 1 vsgt/vol.-% opløsning. Supernantanten indeholder 10 ^ -interferon.

b. Delvis rensning af rekombinant V^-interferon på en siliciumdioxid-baseret adsorbant._

Supernantanten fra (a) adsorberes til en siliciumdioxid-baseret adsorbant, som vaskes med passende saltopløsninger 15 i pH-området 6-9 for at fjerne urenheder. Rekombinant ^ -interferon elueres under anvendelse af en opløsning indeholdende 0,5 - 1,0 M tetramethylammoniumchlorid.

Alle operationer i dette trin gennemføres i pH-området 7 - 9.

20 c. Delvis rensning af rekombinant V^-interferon ved anionbytter-chromatoqrafi_

Eluenten fra afsnit (b) dialyseres oq adsorberes på et anionbytter-chromatografi-medium, som derpå vaskes for at fjerne urenheder. Rekombinant '^-interferon elu-25 eres med en gradient af stigende saltkoncentration.

Typiske anionbytterharpikser, som kan anvendes til dette trin, inkluderer carboxymethylcellulose og sulfoethylcellu-lose. Alle operationer gennemføres i pH-området 7-9.

19 DK 166832 B1 d. Delvis rensning af relcombinant ^-interferon ved chromatoqrafi på calciumphosphat-qel_

Eluenten fra afsnit (c) adsorberes på et medium af calcium-phosphat, som derpå vaskes for at fjerne urenheder.

5 Det rekombinante Y-interferon elueres ved forøgelse af saltkoncentrationen i en gradient af stigende phos-phatkoncentration. Alle operationer i dette trin gennemføres i pH-området 7-9.

e. Delvis rensning af rekombinant ^-interferon ved 10 anionbytter-chromatoqrafi._

Eluenten fra afsnit (d) dialyseres og adsorberes på et anionbytter-chromatografi-medium, som derpå vaskes for at fjerne urenheder. Det rekombinante ^interferon elueres fra anionbyttermediet med en gradient af stigende 15 saltkoncentration. Typiske anionbytter-chromatografi-medier er carboxymethylcellulose og sulfoethylcellulose. Alle operationer i dette trin gennemføres i pH-området 7-9.

f. Delvis rensning af rekombinant Y-interferon ved qelpermetionschromatoqrafi_ 20 Eluenten fra afsnit (e) påføres et gelpermetionsmedium, og kolonnen udvikles med et saltholdigt medium. De passende fraktioner indeholdende rekombinant V^-interferon hældes sammen til opnåelse af det farmaceutiske stof. Alle operationer i dette trin gennemføres i pH-området 7-9.

25 g. C-terminal aminosyresekvens

For at bestemme den C-terminale sekvens blev prøver dialyseret i 70 % myresyre, spaltet med cyanbromid, og de resulterende peptider adskilt på en "Altex Ultra-sphere C8" revers fase HPLC-søjle. Maksima blev opsam- / DK 166832 Bl 20 let og analyseret ved aminosyre- og sekvensanalyse.

Der fandtes ét C-terminalt peptid: -Leu-Phe-Arg-Gly-Arg (resterne 135 - 139, figur 1). I nogle tilfalde blev der detekteret et yderligere peptid: Leu-Phe-Arg-5 Gly-Arg-Arg-Ala-Ser-Gln (resterne 135 - 143, figur 1).

For at bestemme forholdet mellem disse to peptider blev kendte mængder (ved aminosyreanalyse) sat på reversfase HPLC-søjlen, og de respektive maksimumshøjder bestemt.

Hvert af tre produktionspartier indeholdt mindre end 10 ca. 2 % af det lange peptid (135 - 143, figur 1), idet resten var 5-meren. Disse data stemmer overens med E. coli-produktion af en blanding af ^-interferoner indeholdende 139 aminosyrer og 143 aminosyrer (foruden det N-terminale methionin, som også er til stede i hvert 15 tilfælde) i de relative mængdeforhold på omkring 98,2 %.

5. Sammensætning af præparater

Rekombinant /-interferon fremstillet i overensstemmelse med det forudgående sammensættes fortrinsvis til parenteral indgivning ifølge den nedenstående tabel.

DK 166832 Bl 21 Mængde pr. ampul

Ingrediens 0,5 mg ampul (1) 2,0 mg ampul (2)

Rekombinant humant /-interferon 0,5 2,0

Mannitol 100 80

Dinatriumsuccinat- hexahydrat 12,4 9,9

Glycin 5,6 4,5

Natriumchlorid 4,4 3,5 "Polysorbat20" 0,8 0,6

Ravsyre 0,5 0,4 (1) Ampullerne rekonstitueres med 2,5 mL sterilt vand til injektion.

(2) Ampullerne rekonstitueres med 2,0 mL sterilt vand til injektion.

5 Interferonerne ifølge opfindelsen kan anvendes i medicinsk 2 passende doseringsområder, f.eks. 1,0 mg/m legemsoverfladeareal.

D. Bestemmelse af aktiviteten af forskellige /-interferoner efter trypsin-nedbrydninq_ 10 For at fastlå aktiviteten af forskellige Y-interferoner, som er forskellige mht. deres carboxy-termini, blev /-interferon, fremstillet som beskrevet i E. coli-eksemp-let ovenfor, nedbrudt med trypsin i forskellig grad og prøvet ved CPE-prøvning med A549-celler som beskrevet 15 nedenfor.

22 DK 166832 B1

En prøve af rekombinant ^-interferon (r-HuIFN- Y) (6,5 mg), fremstillet som tidligere beskrevet, blev afsaltet over en lille "Sephadex® G-25" molekylsi-søjle (PD-10, Pharmacia) ned i 0,10 M ammoniumhydrogencarbonat-puffer, 5 pH 8,5 til en endelig proteinkoricentration på 2,1 mg/mL.

En fortyndet trypsinopløsning (Worthington TPCK trypsin, 10 ^,ug/ml_ i 0,001 M HC1, 16 ^uL) sattes til 1,9 mL (4,0 mg) af r-HuIFN- V-opløsningen og blandingen blev inkuberet ved stuetemperatur (trypsin protein 1:25000). Prøver 10 blev udtaget fra inkubationsblandingen efter 1 time, 3,5 timer, 5,75 timer, 8 timer og 10,25 timer. Efter 8 timer tilsattes yderligere 15 ^uL (150 ng) fortyndet trypsinopløsning for at fremskynde reaktionen til den sidste prøveudtagning ved 10,25 timer.

15 Fraktionering af hver tidspunktprøve i dens respektive (R\

komponenter blev gennemført på et Waters^ HPLC-system under anvendelse af en Biogel HPHT søjle. Tidspunkts-aliquoten i hydrogencarbonat-pufferen blev sat direkte (ved manuel injektion) på søjlen ved tidspunktet for 20 prøveudtagningen. Søjlen blev skvilibreret i 0,01 M

natriumphosphat pH 8,0, 30 ^uM calciumchlorid, og protein blev elueret fra søjlen under anvendelse af en lineær gradient af skvilibreringspufferen og 0,5 M na-triumphosphat-puffer pH 8,0, 0,6 ^uM calciumchlorid.

25 Proteinmaksima, bestemt ved absorbans ved 214 nm og 280 nm, blev opsamlet præparativt og opbevaret tildækket ved 4 °C, indtil de blev analyseret. Typiske analyser for udvalgte maksima inkluderede: 1. Antiviral aktivitet i prøvningssystemet med humant 30 lungecarcinomavirus A549/EMC (13).

2. SDS/PAGE-fraktionering ved standardteknik under anvendelse af Laemmli-gelsystemet (14).

23 DK 166832 B1 3. Bestemmelse af proteinkoncentration ved den kommercielle farvebindingsprocedure (Pierce Chemical Co. Rockford, IL, U.S.A).

4. Proteinspaltning med cyanbromid og efterfølgende 5 HPLC-analyse til peptididentifikation (15).

Prøver af protein dialyseres (molekylvægt 12000 - 14000 afskåret) natten over imod 70 % myresyre, inddampes til tørhed ved rotationsinddampning og gensuspenderes i 500 ^uL 70 % myresyre. Fast cyanbromid sættes til 10 hver prøve i et 12 x 75 mm reagensglas, forsegles, bland es til det er opløst, dskkes med aluminiumfolie og inkuberes natten over ved stuetemperatur i et godt ventileret område.

Efter spaltning inddampes prøverne til tørhed ved rotations-15 inddampning, gensuspenderes i 0,5 mL vand og tørres igen. Inden fraktionering ved HPLC blev prøverne genopløst i 50 % myresyre til en proteinkoncentration på omkring 1 mg/mL.

Peptider blev fraktioneret i et Waters^ HPLC system 20 under anvendelse af en Altex Ultrasphere Octyl søjle og en trifluoreddikesyre/vand - trifluoreddikesyre/aceto-nitril lineær elueringsgradient. Hvor det var muligt, blev peptider identificeret ved aminosyreanalyse. I tabel 1 er anført sammenligningsdata for afkortede former 25 af r-HuIFN- Y: 24 DK 166832 B1

Tabel 1 r-HuIFN-/ form* C-Terminus** Specifik aktivitet (¾) 139aa 143aa 98:2 LFRGR 100 (til sammenligning) 131aa AAKTGKRKR 40 - 30 129aa AAKTGKR 6-9 125aa AAK ca. 1 * Baseret på nummereringssystemet i figur 1, men uden det N-terminale methionin, som også er til stede i hvert tilfalde.

** Konventionelle enkelt-bogstavsymboler for aminosyreres-5 ter: A = alanin F = phenylalanin G = glycin K = lysin L - leucin R = arginin T = threo'fiin

Det vil indses, at ^-interferoner af enhver længde indenfor området aminosyre 126-143 (foruden N-terminalt methionin) vil blive udtrykt fra passende tildannede gener. Således indeholder f.eks. det i figur 1 afbillede 10 gen et Fnu4H-restriktionscenter ved 123 124

Ala Ala

GC|A GCT CGT| CGA

25 DK 166832 B1

Efter restriktion med Fnu4H kan syntetiske oligonucleo-tider, som koder for enhver ønsket sekvens, efterfulgt af en "stop"-codon og en linker, som er forenelig med et tilrådighed værende restriktionscenter i udtrykkelses-5 plasmidet, ligeres til den forreste del af j^-interferon- genet. F.eks. kan sekvensen hvori X koder for en eller flere aminosyrer, ligeres ind i det ovenfor eksemplificerede E. coli udtrykkelses-medium efter nedbrydning af plasmidet med Fnu4H og Bglll, 10 idet en stop-codon opstår ved ligeringen således.

E. Prøvning: Inhiberinq af cytopatisk effekt (CPE) 1. Prøvningsprocedure

Til hvert hul sættes 100 ^uL af en suspension af humane lungecarcinoma- (A549) 15 celler (ATCC nr. CCL 185), som er blevet indstil let til at indeholde 4 x 10^ celler/mL i Eagle's minimalmedium.

Pladerne inkuberes ved 37 °C i omkring 18 timer.

Efter 18 - 24 timers inkubation sættes 80 yUL 20 yderligere medium til hvert hul i den første række.

26 DK 166832 B1

Til et hul i den første række sættes 20 ^uL af en prøve, som skal prøves for interferonaktivitet .

100 yUL af indholdet i hvert hul i den første 5 række overføres horisontalt til hvert hul i anden række.

Der fortsættes med at overføre 100 yuL af indholdet i et hul fra en række til den efterfølgende række, indtil der er gennemført i alt 10 over-10 førsler, som ender i række 11.

Efter 24 timers inkubation konfronteres alle huller undtagen cellekontroller, med 50 ^uL encephalomyo-carditis-virus i en infektionsmultiplicitet, som resulterer i 100 % cytopatisk effekt i 24 timer 15 efter infektionen.

Bakkerne dakkes med låg og inkuberes ved 37 °C i 24 timer.

Vaske hældes af fra alle huller og farves 5-15 minutter med 0,5 % krystalviolet.

20 Cellers levedygtighed bestemmes ved observation af farvede celler.

En prøves titer er den reciprokke værdi af den fortynding, hvor der bliver 50 % levedygtige celler tilbage.

25 2. Udregning

Aktiviteten af alle prøver normaliseres med refe-renceenheds-omsatningsfaktoren, som udregnes af: 27 DK 166832 B1

Faktisk titer af standard-interferon _ Referenceenheds-

Observeret titer " omsætningsfaktor (RUCF) 3. Specifik aktivitet

Under anvendelse af A549/EMCV-bioprøvningssystemerne 5 standardiseret med IFN-)^ referencemateriale leve ret af the National Institutes of Health er den specifikke antivirale aktivitet af rekombinant humant IFN- ^ omkring tre gange højere end aktiviteten af det modificerede rIFN-^-molekyle 1Q med tre yderligere aminosyrer (Cys-Tyr-Cys) ved N-terminus.

4. Stabilitet

Igen baseret på den ovennævnte måling af bioaktivitet (A549/EMCV) fortsætter rlFN-V^ , sammensat 15 til præparat og fyldt på ampul, med at være stabilt (intet tab af biologisk aktivitet) tre måneder efter fremstillingen (opbevaret ved 4 °C).

F. Antiproliferativ aktivitet af rlFN-)^ sammenlignet med de andre typer af humant interferon__ 20 1. Materialer og metoder rIFN-y': rekombinant des-(Cys-Tyr-Cys)-J/-interfe- ron i form af en opløsning (20 mM natrium-succinat, 0,15 M NaCl, pH 6). Materialet blev fremstillet i overensstemmelse 25 med E. coli-eksemplet ovenfor. Den speci- 7 fikke aktivitet var 2,7 x 10 lU/ng protein.

28 DK 166832 B1 CTC-rIFN- : Rekombinant ^-interferon med "Cys-Tyr-Cys"-struktur ved molekylets N-terminus i form af en opløsning (20 mM natriumsuccinat, 0,15 M NaCl, pH 6). Den specifikke aktivi-5 tet var 1,3 x 10^ TU/mg protein.

HuIFN-f: Lyophiliseret humant fibroblast-interferon produceret i human diploid forhudsfibro-blast med en specifik aktivitet på mere end 1 x 10^ IU/mg protein, fremstillet 10 af Toray Ind., Inc. En ampul indeholder 3 x.106 IU HuIFN-P og 3 mg humant serum-albumin .

HuIFN-α: Humant naturligt leukocyt-interferon med en specifik aktivitet på 4 x 10^ 15 IU/mg protein, leveret i form af en opløsning af Dr. K. Cantell, Central Public Health Laboratory, Helsinki,

Finland.

Kontrol: Placebo indeholdende 3 mg humant serum- 20 albumin.

Dyrkningsmedium: Eagle's minimalmedium suppleret med 10 % varmeinaktiveret serum fra nyfødte prækolostrum-kalve ("PNCS") og 2 mM 25 L-glutamin blev anvendt’med Hela-, KB-, HIW-1-, FL- og 3-111-celler. Dulbec-co's minimalmedium indeholdende 10 % varmeinaktiveret PNCS, 100 ^ug/mL kanamy-cin og 2 mM L-glutamin blev anvendt 30 med A549 celler. RPMI 1640 medium supple ret med varmeinaktiveret PNCS og 100 ^ug/mL kanamycin blev anvendt med de resterende humane celler anført i tabel 2.

‘ 29 DK 166832 B1 2. Evaluering af antiproliferativ aktivitet.

Prøvecellerne suspenderet i dyrkningsmediet blev podet i vævskultur-plastikplader i en koncentration på 5 x 10 celler/0,5 mL/hul. Derpå tilsattes forskellige mængder 5 interferon opløst i det tilsvarende dyrkningsmedium (0,5 ml) (dag 0). Dyrkning udførtes ved 37 °C i en befugtet atmosfære af 5 % CO2 og 95 % luft. På dag 6 blev dyrkningsmedierne fjernet, og cellerne i suspensionskultur blev direkte suspenderet i "Isoton II" (Coulter Electronics 10 Inc.) til celletælling i en Coultér-tæller. Cellerne, som dannede et ark i plastikbeholdere blev forbehandlet med 0,05 % trypsin/0,02 % EDTA for at fremstille enkeltcellesuspension i Isoton II (Coulter Electronics Inc.). Interferonets antiproliferative aktivitet blev 15 udtrykt som de antivirale enheder, som krævedes til at frembringe 50 % reduktion af celletal (IC^g, IU/mL) sammenlignet med kontrolkulturen (uden interferon).

DK 166832 B1 a 30 z

Lu HH vf <f ΙΛ η ΙΆ 3 I I I I I O C2 CD m C! C3 Cl I I I fx I O X 11111-H.HCMVOi-Hr-lrHIII 1 i—l Λ A =° Λ Λ Λ A· ca.

Z

Lu cc HH <3- m <1· b-i 3 ιιιιινοαοΓ^σσο ιιΐΓ^ι<ί

·“ '-v 3: I I I I I -xj* 1—ΙΓΛΓΛγ—irHrHI I I | O

1 \ X

2 o >0

O HH I

0= W 3Z

U! Li-

Li- O HH

ΙΛ P

LhI O I ΙΛ I— HH U “ ΙΛ ΙΛ ΙΛ ΙΛ ΓΆ 1Ά ΙΛ tn 2 H- <ΗΟΟΟΟΟΜΟιΛΟιΛΟΟΙ I ΙΟΟ-vf

U tn 1—! rH ι-H m m <5* i—I'd**—I*—I I I !i—li—ICO

tn Λ A Λ i ! ΓΛ ^ ΛΛ λ/ν

Lu

CC

Q 1*,

2 T

< 2

Lu CM m Q Η » ΙΛ ΙΛ ΙΛ m m -tn tn bJ p rHr'.OOOCM'5}-CDlACD,OOmLr\inOC3m

s tniHrHrHCMinminin’rHrHin rH .H CM

^ f\ t\ 1—I K h* /\.N

Lul ^ 03

C3 C

1-1 P

—I (D

2 1—I

Ul rH

CM S 0

2; O

1-1 ^ 03 C C C

03 C/3 35 03 03 03 -o s > > > ro co x p co co ro Ξ >— o. e ε ε o I c

2 <4- -Η ·Η -h -H

b- CD C3 M ro ro ro ρ t-1 03 C E E E ro

03 03 O O O O

b- r-i>-CCC ^xo

QD CO C -Η ·Η -H 03 C CO

DE03OOO 0303 C0E

*— C > Ρ Ρ Ρ ι-ΗΌ EO

b-1 -H -ri (3 O O (0 0) CO OC

>- Ρ ΞϋΟϋ "Dl C-H

1-5 Q. CO OOO CO C 03 ·ΗΟ ^ OE -H CCC Ε -Η σι Ufn

M 00303030 p C PCD

·“ pccotj-docdc q.3 roroo ^ ro-HEcororoS-H o<-h eoi ^ I—I O O O G CO CO o I 03

1—I PC-P-P-pCpE C -Ρ E C 03 Ή CO

> 03 CO -H 03 03 03 ’’Μ CO O ΟΙΟΟηΟΙΗΟιιΙη

1-1 OOPPPL3qc -rH p C OCQ3EEE

I— 0 03 p 03 03 03 ·*Η ro ·Η03·ΗΡ3Οθα83 < Q. Ή CD ·Η ·Η -H CO .μ ,-h Ι0Ήθ ΟΗ·β£Γ3Ι b- >3 1—I O -Ρ -Ρ -P L3 1—i Q3 Ε -Ρ P o | EQ.Q.3 bJ -P 03 CCC'COE 1 C CO | ø ø £ E 03

b- 003030303 "Hø OIOICJøhH ,H

1-1 PC CnQPPplHQi^ ^pOoiM^C'-irH

—1 rocEororo^cco pc o c c 0 03 pc 0 ·Η ·Η ® P P L- p >s ·Η -H lp 0 3 O ·Η 0 03 03

^ CT pnCt-tPCi_.3p4Jøw0_T3^H|4j__.,H

b- q I O" ·Η ·Η ·Η I CO O E Ή CO 03 03 -Ρ -Ρ -P

1-1 r-H 4J03-OOOXX:COCOlr-HHffl+J4-)>x 0030 -ΉΟ-COCO 0ΟΕΉ-Ή-ΗΟ 2 p> <HC-p-p-P>o>Hro-H-Pcnøroo.P!;pco < 0 CJim-'-3 3-'-3POQ3rHC>C>3ropPC •Η ·ΗΧΙΟΠΚΐα3ΟΕ03ΕΟ3ΉΟ·Ο33Ο x LO<x_jxoz<s:<_i_j<a:c/3«icocos:

HH

HH ro

HH CD 1A1 <f Lu B

0 I r-H CM χ3" px 1—I I CM ·ιΗ ·ιΗ r-H

rp ΟΙ I liro I HH CD rH C3N Ό O "O ffir—i

*—l I— Z Z Z Z i—i 1 I <j- m 0\ 3 E rH

03 <ϋϋϋ:ϋα3οηΣΐΡ_ιοοιηΐ3θ®ο i CP XZZZZIXXUlluQ_Q.<COOZn 31 DK 166832 B1

Som vist i tabellen varierede antiproliferationsaktiviteten af rIFN-/ betydeligt afhængigt af de humane celle-arter. I dette tilfælde var KATO-III, siglet-ringcelle-carcinoma i maven, højfølsom, idet cellelinien viste 3 IC^g IU/mL, medens Daudi-celler, Burkitt's lymphoma, som var højfølsomme for type II interferon (HuIFN-a,

HuIFN-β),·var ufølsomme for type II interferon, herunder rIFN- / . Lunge-adenocarcinoma (PC-8, PC-12) var ufølsom for alle prøvede interferon-arter. Det anticellulære 10 spektrum mellem rIFN-^Γ og CTC-rIFN- / var næsten det samme, og det var i almindelighed klart, at den antiproliferative effektivitet af rIFN- / var bedre end af CTC-rIFN- Y' . Ved sammenligning mellem fire interferoner blev den højeste effektivitet opnået fra rIFN- Y , undtag-15 en for Daudi-celler.

G. Sammenligning af stabilitet mellem rIFN-/ og CTC-rIFN-Y i forskellige væsker in vitro_ 1 x 106 IU/ampul lyofiliseret rIFN-/" , fremstillet i overensstemmelse med E. coli-eksemplet ovenfor, og 20 1 x 10^ IU/ampul lyofiliseret rIFN- Y med en "Cys-Tyr-Cys"- struktur ved N-terminus, begge med 10 mg humant serumalbumin, phosphatpuffer og en isotonisk mængde NaCl, blev rekonstitueret med destilleret vand, og koncentrationen blev indstillet til 4 x 10^ IU/mL.

25 Interferonernes in vitro stabilitet blev bedømt ved bestemmelse af den resterende antivirale aktivitet i forskellige væsker. Inkubationer blev startet ved tilsætning af de ovennævnte interferonopløsninger til ni volumener kaninserum, humant serum eller Eagle's minimalmedium, 30 som var forinkuberet 10 minutter i en vandbadsinkubator ved 37 °C eller 4 °C. Efter 0, 0,25, 0,5, 1, 4, 8, 24, 72 og 144 timer blev en aliquot udtaget og blandet med de ni volumener Eagle's minimalmedium. Prøverne blev 32 DK 166832 B1 holdt frosne ved -80 °C i en dybfryser, indtil prøvningen af interferontiter. Interferontiteren blev prøvet ved CPE50-reduktionsmetoden under anvendelse af humane amnio-tiske celler (FL-celle) inficeret med Sindbis-virus.

5 Resultaterne er anført i fig. 3 som procent resterende titer over for den yderligere titer.

Selv om opfindelsen er blevet eksemplificeret ved de foretrukne udførelsesformer, hvor udtrykkeisen er frembragt i E. coli og i COS-7-celler, vil det være klart, 10 at de rekombinante ^interferoner ifølge opfindelsen ligesåvel kan produceres i andre systemer, såsom andre bakteriestammer, gær og vævskultursystemer, i hvilken forbindelse der kan henvises til dansk patentansøgning nr. 4708/82 og (6).

Claims

1. GLY-LYS-ARG-LYS-ARG-SER-GLN-MET-LEU-PHE-ARG-GLY-ARG 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 og

2. GLY-LYS-ARG-LYS-ARG-SER-GLN-MET-LEU-PHE-ARG-GLY-ARG-ARG-ALA-SER-GLN 15 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143.

2. Polypeptid ifølge krav 1, hvori X er methionin. 2q

3. Polypeptid ifølge krav 1 eller 2, hvori Z består af aminosyresekvensen: GLY- LYS-ARG- LYS-ARG-SER-GLN-MET-LEU-PHE-ARG-GLY-ARG 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139.

4. Polypeptid ifølge krav 1 eller 2, hvori Z består af aminosyresekvensen: GLY-LYS-ARG-LYS-ARG-SER-GLN-MET-LEU-PHE-ARG-GLY-ARG-ARG-ALA-SER-GLN 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143, 30 når X er methionin, og aminosyresekvensen: GLY-LYS-ARG-LYS-ARG-SER-GLN-MET-LEU-PHE-ARG-GLY-ARG-ARG-ALA-SER 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142, 35 DK 166832 B1 når X er hydrogen.

5 SER-GLN-MET 132 133 134, SER-GLN-MET-LEU 132 133 134 135, SER-GLN-MET-LEU-PHE 132 133 134 135 136,

5. Polypeptid ifølge krav 1 eller 2, hvori Z består af aminosyresekvensen: 5 GLY-LYS-ARG 127 128 129.

6. Polypeptid ifølge krav 1 eller 2, hvori Z består af ^ aminosyresekvensen: GLY-LYS-ARG-LYS-ARG 127 128 129 130 131.

7. Polypeptid ifølge krav 1 eller 2, hvori Z består af 1 s aminosyresekvensen: GLY-LYS-ARG-LYS-ARG-Z1 127 128 129 130 131 20 hvori Z^ er H, SER 132, SER-GLN 132 133,

25 SER-GLN-MET 132 133 134, SER-GLN-MET-LEU 132 133 134 135, SER-GLN-MET-LEU-PHE 132 133 134 135 136,

30 SER-GLN-MET-LEU-PHE-ARG 132 133 134 135 136 137, SER-GLN-MET-LEU-PHE-ARG-GLY 132 133 134 135 136 137 138 eller SER-GLN-MET-LEU-PHE-ARG-GLY-ARG 132 133 134 135 136 137 138 139. 16 DK 166832 B1

8. Polypeptid ifølge krav 1 eller 2, hvori z består af aminosyresekvensen: GLY-LYS-ARG-LYS-ARG-Z2 _ 127 128 129 130 131 5 hvori Z2 er H, , „ SER 10 132, SER-GLN 132 133, SER-GLN-MET 132 133 134, SER-GLN-MET-LEU 15 132 133 134 135, SER-GLN-MET-LEU-PHE 132 133 134 135 136, SER-GLN-MET-LEU-PHE-ARG 132 133 134 135 136 137, SER-GLN-MET-LEU-PHE-ARG-GLY 20 132 133 134 135 136 137 138, SER-GLN-MET-LEU-PHE-ARG-GLY-ARG 132 133 134 135 136 137 138 139, SER-GLN-MET-LEU-PHE-ARG-GLY-ARG-ARG 132 133 134 135 136 137 138 139 140, SER-GLN-MET-LEU-PHE-ARG-GLY-ARG-ARG-ALA 25 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141, SER-GLN-MET-LEU-PHE-ARG-GLY-ARG-ARG-ALA-SER 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 eller SER-GLN-MET-LEU-PHE-ARG-GLY-ARG-ARG-ALÅ-SER-GLN 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143, 30 2 når X er methionin, og Z er 35 DK 166832 B1 H, SER 132, SER-GLN 132 133,

9, Polypeptid ifølge krav 1, hvori X er methionin, og po-lypeptidet strækker sig 126+n aminosyrer ud over X, hvor n er nul eller et helt tal fra 1 til 17.

10. Polypeptid ifølge krav 9, hvori de n aminosyrer er taget fra N-terminalen af sekvensen:

30 GLY-LYS-ARG-LYS-ARG-SER-GLN-MET-LEU-PHE-ARG-GLY-ARG-ARG-ALA-SER-GLN 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143. 35 DK 166832 Bl

10 SER-GLN-MET-LEU-PHE-ARG 132 133 134 135 136 137, SER-GLN-MET-LEU-PHE-ARG-GLY 132 133 134 135 136 137 138, SER-GLN-MET-LEU-PHE-ARG-GLY-ARG 132 133 134 135 136 137 138 139,

11. Polypeptid ifølge krav 1, hvori X er hydrogen, og po-lypeptidet strækker sig 126+m aminosyrer ud over X, hvor m er nul eller et helt tal fra 1 til 16.

12. Polypeptid ifølge krav 11, hvori de m aminosyrer er taget fra N-terminalen af sekvensen: GLY-LYS-ARG-LYS-ARG-SER-GLN-MET-LEU-PHE-ARG-GLY-ARG-ARG-ALA-SER 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142. 10

13. Dobbeltstrenget DNA omfattende en kodestreng og en komplementærstreng, hvor kodestrengen omfatter en DNA-se-kvens, som koder for et polypeptid ifølge ethvert af kravene 1-12. 15

14. Replicerbar udtrykkelsesvektor, som er i stand til i en transformant mikroorganisme eller cellekultur at udtrykke et polypeptid ifølge ethvert af kravene 1-12.

15. Udtrykkelsesvektor ifølge krav 14, hvor udtrykkeisen af polypeptidet ikke ledsages af dannelsen af noget tilknyttet signalpeptid.

15 SER-GLN-MET-LEU-PHE-ARG-GLY-ARG-ARG 132 133 134 135 136 137 138 139 140, SER-GLN-MET-LEU-PHE-ARG-GLY-ARG-ARG-ALA 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 eller SER-GLN-MET-LEU-PHE-ARG-GLY-ARG-ARG-ALA-SER 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142, 20 når X er hydrogen.

15 GLN-SER-GLN-ILE-VAL-SER-PHE-TYR-PHE-LYS-LEU-PHE-LYS-ASN-PHE- 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 LYS-ASP-ASP-GLN-SER-ILE-GLN-LYS-SER-VAI.-GI.U-THR-ILE-LYS-GLU-61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75

16. Udtrykkelsesvektor ifølge krav 14 eller 15 til anvendelse i en mikroorganisme. <u O

17. Udtrykkelsesvektor ifølge krav 15 til anvendelse i en bakterie. __

18. Transformant celle omfattende en værtscelle, som er 30 blevet transformeret med en replicerbar udtrykkelsesvektor ifølge krav 14 eller 15.

19. Transformant mikroorganisme omfattende en værtsmikroorganisme, som er blevet transformeret med en replicerbar O o udtrykkelsesvektor ifølge krav 16. DK 166832 B1

20. Transformant bakterie omfattende en værtsbakterie, som er blevet transformeret med en replicerbar udtrykkel-sesvektor ifølge krav 17.

20 ASP-MET-ASN-VAL-LYS-PHE-PHE-ASN-SER-ASN-LYS-LYS-LYS-ARG-ASP- 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 ASP-PHE-GLU-LYS-LEU-THR-ASN-TYR-SER-VAL-THR-ASP-LEU-ASN-VAL-91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 25 GLN-ARG-LYS-ALA-ILE-HIS-GLU-LEU-ILE-GLN-VAL-MET-ALA-GLU-LEU-106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 SER-PRO-ALA-ALA-LYS-THR-Z 121 122 123 124 125 126 , 30 hvori enten X betyder en methioninrest, Y betyder en glutaminrest, og Z betyder n aminosyrer i sekvensen 35 DK 166832 B1 GLY-LYS-ARG-LYS-ARG-SER-GIiN-MET-LEU-PHE-ARG-GIiY-ARG-ARG-AIiA-SER-GLN 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143, hvor n er nul eller et helt tal fra 1 til 17; eller X be-tyder hydrogen, Y betyder en glutamin- eller pyrogluta-matrest, og Z betyder m aminosyrer i sekvensen 127-143, hvor m er nul eller et helt tal fra 1 til 16; eller r-interferon, som består af en modifikation eller allelisk variation af førstnævnte aminosyresekvens, hvilken modifikation eller variation har en biologisk aktivitet, som er lig med eller større end aktiviteten af r-interferon med aminosyresekvensen 1-143 ovenfor, hvor Y er Gin, undtagen de modifikationer og variationer, som , _ indeholder nogen r-interferon-aminosyresekvens fortsat 15 ovenfor Y eller fortsat nedenfor Z.

21. Farmaceutisk præparat indeholdende et r-interferon- polypeptid ifølge ethvert af kravene 1-12.

22. Præparat ifølge krav 21 indeholdende en blanding af to polypeptider ifølge krav 1, hvori Z omfatter amino- 10 syresekvenserne henholdsvis

23. Præparat ifølge krav 22, som omfatter mere end ca. 95% af polypeptidet, hvori Z er sekvensen 1).

24. Præparat ifølge krav 22, som omfatter mere end ca. 97% af polypeptidet, hvori Z er sekvensen 1).

25. Præparat ifølge ethvert af kravene 21-24, som yderligere omfatter et farmaceutisk acceptabelt niveau af hu-25 mant serumalbumin. 30 35