JP2719128B2 - 組換えガンマインターフェロン組成物 - Google Patents
組換えガンマインターフェロン組成物Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の分野
本発明は、組換えＤＮＡ技術の領域に係り、安定性の高
い組換えガンマインターフェロンの製造に前記の如き技
術を利用する手段及び方法、前記インターフェロンの産
生並びに産生される種々の産物及びそれらの用途に係
る。 【０００２】発明の背景 本発明のバックグラウンドを明らかにし且つ特定の場合
には本発明の実施に関する詳細を補う目的で、多くの刊
行物及びその他の文献を引用して本明細書中に包含し、
便宜上、これらの参考文献に参照番号を付し、本明細書
末尾に目録として添付した。本文中では参考文献を参照
番号で示す。 【０００３】ヒトインターフェロンは、抗原性、生物学
的特性及び生化学的特性の違いに基いて３種のグループ
に分類し得る。第１のグループは、通常ウィルスによっ
て誘発されたヒト血液構成細胞が主として産生する白血
球インターフェロン類である。これらのインターフェロ
ンは、既に微生物によって産生され、生物学的に活性で
あることが知見されている(参考文献１,２及び３参
照)。このインターフェロンは、その生物学的特性故
に、ウィルス感染症及び悪性腫瘍状態の治療薬としての
臨床使用が目論まれている(４)。 【０００４】第２のグループのヒト線維芽細胞インター
フェロンは、通常、ウィルスに誘発された線維芽細胞に
よって産生される。これらのインターフェロンも同じく
既に微生物によって産生されており、広範な生物学的活
性を示すことが知られている(５)。臨床試験においても
これらのインターフェロンの潜在的治療価値が示唆され
ている。白血球インターフェロンと線維芽細胞インター
フェロンは、アミノ酸レベルでの相同(homology)の程度
が比較的低いにもかかわらず、生物学的特性が極めて類
似している。又、これらのグループのインターフェロン
はいずれも、約１６５乃至約１６６個のアミノ酸を含み
且つ酸に対して安定なタンパクである。 【０００５】ヒトガンマインターフェロン(免疫インタ
ーフェロン,γ−インターフェロン,ＩＩＦまたはＩＦＮ
−γともいう)は、前記インターフェロンの抗ウィルス
特性及び抗細胞増殖特性を示すが、白血球インターフェ
ロン及び線維芽細胞インターフェロンとは対照的にpＨ
２で不安定である。これらガンマインターフェロンは、
組換えＤＮＡ技術によって産生される以前には主として
リンパ球のマイトゲン誘発によって産生されていた。ヒ
トガンマインターフェロンは、白血球インターフェロン
及び線維芽細胞インターフェロンとは抗原的に明らかに
異なっている。Ｇray,Ｇoeddel等は組換えガンマインタ
ーフェロンの発現を最初に報告しており(６)、これによ
ってヒトガンマインターフェロンに特有な性質即ちpＨ
２での不安定性と共に抗ウィルス活性及び抗細胞増殖活
性を示すことが確かめられた。大腸菌(Ｅ．coli)中で産
生されたＧray及びＧoeddelの組換えガンマインターフ
ェロンは１４６個のアミノ酸から成り、この分子のＮ末
端部は配列ＣＹＳ−ＴＹＲ−ＣＹＳ−で始まっていた。
続いて、Ｄerynck等が、同じＮ末端を有し且つ１個のア
ミノ酸が置換されている別の組換えガンマインターフェ
ロンを報告した(７)が、おそらくこのポリペプチドはそ
れより前に参考文献(６)に報告されたインターフェロン
の対立変異型(allelic variant)であろう。更に、他の
研究者等によって別の組換えガンマインターフェロンの
産生についての報告がなされており、彼らによって産生
された組換えガンマインターフェロンでは、Ｇray及び
Ｇoeddelが最初に開示したアミノ酸配列(６)のうち１個
又はそれ以上のアミノ酸が置換されていると報告されて
いる。 【０００６】例えば、Ａlton等は、Ｇray等のガンマイ
ンターフェロン(６)の８１番目のアミノ酸を１つ置換し
た一連のＩＦＮ−γを報告している(１７)が、得られた
ＩＦＮ−γは７０％(相対基準)の活性しか有しておら
ず、さらにこのＩＦＮ−γの１,２,３番目のＣＹＳ−Ｔ
ＹＲ−ＣＹＳを欠失させると、相対活性が更に低下し、
Ｇray等のガンマインターフェロン(６)の４９％の活性
しか有していないＩＦＮ−γとなる。 【０００７】本発明者等の研究によって、Ｎ末端アミノ
酸配列にシステイン残基を含む組換えガンマインターフ
ェロンは、１個又はそれ以上のシステイン残基のスルフ
ヒドリル基がジスルフィド結合形成に関与するオリゴマ
ー化という見地から問題を醸し出すことが確認された。
本発明者等の研究に於いてこれらの推定ジスルフィド結
合を完全に還元することができなかったことから、問題
はより複雑であり、おそらくはシステインと結合したチ
ロシン残基のヒドロキシル官能基を介する反応が含まれ
ると思われる。又、これらの組換えインターフェロンは
多少不安定であり、不安定性のためかその他の原因によ
るかは明らかでないが、最適な効果が得られないことが
判明した。 【０００８】発明の概要 本発明は、安定性及び活性が優れた組換えガンマインタ
ーフェロンに係る。最も好ましい態様では、Ｎ末端から
伸延して続く下記アミノ酸配列(以下、「完全配列」とい
う)を有する組換えガンマインターフェロン、及び前記
配列のカルボキシ末端の特定部位を欠く種々のインター
フェロンアナログ(類似体)が提供される。 【化１３】【０００９】［ここで、Ｘがメチオニン残基であると
き、Ｙはグルタミン残基であり、Ｘが水素であるとき、
Ｙはグルタミン残基若しくはピログルタミン酸残基であ
る］。本発明はまた、対応するクローン化遺伝子、これ
らを含む発現ベクター及び本発明のインターフェロンの
組換えＤＮＡ技術による産生に有用な形質転換体を提供
する。本発明の好ましい組換えガンマインターフェロン
は、(文献中に既に記載されているインターフェロンと
比較して)天然ガンマインターフェロンの真のアミノ酸
配列に最も近似していると思われる。この天然ガンマイ
ンターフェロンは本発明者等が天然起源から精製し充分
に特性を明らかにしたものである。本発明の好ましい態
様のインターフェロンは、文献中に既に記載されている
インターフェロンに比べて大幅に改良された安定性と活
性を示す。 【００１０】本発明の前記及び他の目的を達成する様相
は、以下の詳細な説明及び添付の図面の記載から明らか
になるであろう。 【００１１】図１および図２は、本発明の組換えガンマ
インターフェロンのアミノ酸１〜１４３、並びにシグナ
ル配列が先行している該アミノ酸配列をコードしており
且つ非翻訳ＤＮＡからなる５'−及び３'−フランキング
領域を有するＤＮＡ配列を示す。 【００１２】図３は、Ｅ．coliによる本発明の組換えガ
ンマインターフェロンの直接合成のための情報をコード
しているプラスミド及びその調製法を示す模式図であ
る。 【００１３】図４は、本発明によって調製されたガンマ
インターフェロンの優れた安定性を示すデータである。 【００１４】詳細な説明 本発明者等は、天然ヒトガンマインターフェロン(即
ち、ヒト末梢血リンパ球のマイトゲン誘発によって産生
されて精製されたもの)が、Ｇray等が組換えガンマイン
ターフェロンと指称し参考文献(６)に示した配列を有す
るポリペプチドのＮ末端ＣＹＳ−ＴＹＲ−ＣＹＳを欠く
ポリペプチドであることを解明した。本発明者等の研究
に係る高度に精製した天然ガンマインターフェロンをト
リプシン消化して得られる物質中には、Ｇray等の組換
えガンマインターフェロン(６)のＮ末端部にほぼ相当す
るアミノ酸組成を有するが、但しＣＹＳ−ＴＹＲ−ＣＹ
Ｓを欠く配列が含有されていた。天然ガンマインターフ
ェロンのアミノ酸配列解析をＮ末端から行なうことはで
きなかったので、この分子のＮ末端のα−アミノ酸は保
護されていると推定された。Ｇray等(６)によるとcＤＮ
Ａがコードしている２つ目のシステインの次の第１アミ
ノ酸はＧＬＮ(グルタミン)であるので、ＧＬＮ残基が環
化してピログルタミン酸に代りその結果Ｎ末端がブロッ
クされていると推測された。ピログルタミン酸アミノペ
プチダーゼによってピログルタミン酸を除去すると、次
にコードされているアミノ酸すなわちＡＳＰのα−アミ
ノ基が遊離し、配列解析が続行できるようになり、その
結果天然のヒトガンマインターフェロンの最初に報告さ
れたものと同じ結果が得られた。 【００１５】ＣＹＳ−ＴＹＲ−ＣＹＳを含有する組換え
ヒトガンマインターフェロンのcＤＮＡを適当に改造す
ることにより、上記の完全配列(但し、ＸはＭＥＴであ
り、ＹはＧＬＮである)を有するタンパクをコードして
いるcＤＮＡから新規な組換えガンマインターフェロン
をＥ．coli中で直接発現させることが可能になった。Ｎ
末端のメチオニンはmＲＮＡの翻訳“開始"シグナルＡＵ
Ｇによってコードされている人為構造であり、例示した
Ｅ．coliによる発現という特定の場合には宿主系により
除去処理されない。他の微生物系、例えばシュードモナ
ス(pseudomonas)では、メチオニンが除去され得る。い
ずれにせよ活性に必要であるとは思われない。メチオニ
ンが除去されると、使用する系に応じて、ＧＬＮ残基が
ピログルタミン酸の形態に環化し得るがこの場合も活性
が損われることはない。 【００１６】本発明者等の研究によると、Ｇray等によ
り以前に報告されたＣＹＳ−ＴＹＲ−ＣＹＳを含有する
組換えガンマインターフェロンは、ヒト血清アルブミン
を用いて処方することで安定化し得た。しかしながら、
最終凍結乾燥産物中に血清アルブミンが存在する場合
は、最終産物に対してではなく凍結乾燥に先立って或る
種の品質調整処理を行なう必要がある。一方、本発明の
新規な組換えガンマインターフェロンの場合には、凍結
乾燥状態の物質は、血清アルブミンを含有しなくとも充
分に安定であることが判明した。しかしながら、所望で
あれば、本発明のガンマインターフェロンを薬剤上許容
される程度のヒト血清アルブミンと調合してもよい。 【００１７】更に、本発明のＣＹＳ−ＴＹＲ−ＣＹＳを
欠く組換えヒトガンマインターフェロンは、細胞変性阻
害試験に於いて、抗ウィルス剤としてＣＹＳ−ＴＹＲ−
ＣＹＳ含有アナログよりも顕著な活性を示すように思わ
れる。活性は通常、マイクロタイタープレート上でヒト
肺癌由来の細胞株Ａ５４９に対する脳心筋炎ウィルスの
細胞変性効果(ＣＰＥ)の阻害によりアッセイされる(１
２)。 【００１８】本発明の組換えガンマインターフェロン
は、前記完全配列のアミノ酸１〜約１２６を含有するイ
ンターフェロンを全て包含する。完全配列に対してカル
ボキシ末端部を種々切り取ったガンマインターフェロン
は、アミノ酸１〜約１２６が存在する限り、或る場合に
多少レベルが低下するとしても、依然としてヒトガンマ
インターフェロンに特有の性質を示す。実際、(７)に報
告されたＣＹＳ−ＴＹＲ−ＣＹＳ含有アナログを用いた
実験で、アミノ酸１３２(本発明の番号付けによる)に続
くアミノ酸配列を、活性を損失することなく他の配列(e
xtraneous sequences)で置換された例が示された(例え
ば、(８)参照)。本発明者等の予備的データは、アミノ
酸１から１２６(ＴＨＲ)付近までの配列は比較的強固に
結合して活性と関連すると思われる三次元立体配置をと
っているが、完全配列の残りのアミノ酸は比較的構造上
の制限が緩くタンパク分解に比較的敏感であるという仮
説を支持している。制限条件下でのトリプシン消化によ
って、アミノ酸１２６より下流の配列は種々の部分が除
去されるがこれより上流は除去されない。本発明者等が
研究した天然ガンマインターフェロンは、アミノ酸１２
７,１２８,１２９,１３０,１３２及び１３４にわたる種
々の分子を含む。本発明者等は、メチオニンに続くアミ
ノ酸配列が(ＭＥＴの後の)アミノ酸１〜約１３９及び１
〜約１３１の種々のものから成る完全に活性な組換えガ
ンマインターフェロンを発見した。後者のアミノ酸１〜
約１３１は、組換えガンマインターフェロンをトリプシ
ンで制限消化しその後配列確認することによって得られ
た。(ＭＥＴより先の)アミノ酸約１２８及び１２９に末
端を有する同様のトリプシン消化断片は、実質的に低下
しているとはいっても活性を保持していた。一方、１２
６番目のスレオニンとそれに続くアミノ酸を消化して除
去した(Ｎ末端メチオニンに加えて)１２５個のアミノ酸
を有する物質は、ＣＰＥ阻害アッセイに於いて未消化物
の活性の１％未満の活性しか示さなかった。 【００１９】組換えによって誘導されたガンマインター
フェロンはメチオニンが細胞内では開裂されないような
宿主内で産生された場合に先頭メチオニンを有するのに
加えて、１３９個のアミノ酸(図１および図２の番号付
による)を有するものが多量で１４３個のアミノ酸を有
するものが少量であると考えられる。この２種の組成は
アミノ酸１３９個の種が約９５％より多く、最も好まし
くは約９７％より多い。制限条件下のトリプシン消化は
また、アミノ酸１２６付近から下流の種々の部分の配列
を除去する。本発明者等の研究に係る組換えガンマイン
ターフェロンのこのような制限トリプシン消化物は、ア
ミノ酸１２５(先頭メチオニンを含めると１２６),１２
９,１３１及び１３４にわたる種々の種を含む。これら
の種は、アミノ酸１２５付近から１２９付近に伸びる場
合、実質的に低下するとしても活性を保持している。少
なくともほぼ１２９個のアミノ酸、特に少なくとも１３
１個のアミノ酸を有する種、すなわち約１２９〜１４３
個のアミノ酸を有する種が本質的、又機能的に完全な活
性を保持している。 【００２０】以上のことから明らかなように、本発明
は、上記の完全配列を有する組換えガンマインターフェ
ロンだけでなく、アミノ酸１４３を欠くか又はＺ→アミ
ノ酸１４３のアミノ酸配列(但し、Ｚはアミノ酸１２７,
１２８,１２９,１３０,１３１,１３２,１３３,１３４,
１３５,１３６,１３７,１３８,１３９,１４０,１４１又
は１４２である)を欠く種々の組換えガンマインターフ
ェロン及びこれらの混合物をも含む。本発明の組換えガ
ンマインターフェロンをコードしている二本鎖ＤＮＡ配
列が、上記の完全配列をコードしているＤＮＡ配列だけ
でなく、上記した種々のカルボキシ末端を切り取ったア
ナログのみをコードしている配列をも含むことも同様に
明らかであろう。この種々のカルボキシ末端を切断した
場合には次に続くコドンが翻訳終了シグナルをコードす
る。 【００２１】本明細書中、「組換えガンマインターフェ
ロン」とは、組換えＤＮＡ技術によって得られる複製可
能な発現ベヒクルから形質転換細胞中で発現されるポリ
ペプチド(これを産生する細胞によってグリコシル化さ
れているかいないかにかかわらず)を意味する。本発明
のポリペプチドは、天然ヒトガンマインターフェロンに
特有の性質即ち、程度の差はあれ多少ともヒトに於ける
抗ウィルス活性及び抗細胞増殖活性並びにpＨ２に於け
る不安定性を示す。 【００２２】本明細書に記載した組換えガンマインター
フェロンは、本発明の目的として少なくても１〜約１２
６のアミノ酸を各々有する前記の如きポリペプチドの２
個の組合せ(各ポリペプチドは同数又は異なる数のアミ
ノ酸を有し得る)として定義される「二量体」を形成する
と考えられる。化学結合形成機構に関する性質は充分に
は解明されていないが、共有結合以外の結合であると思
われる。二量体を生ずる結合は自然に起こるようであ
り、本明細書に記載する系では不可避であると思われ
る。従って、本発明の組換えガンマインターフェロンを
投与するときには、通常二量体の形態であろう。 【００２３】更に、別に特徴づけられた組換えガンマイ
ンターフェロンに関する文献(８,９)の開示と同様に、
本明細書中に開示した組換えガンマインターフェロン
中、アミノ酸１２６付近の上流若しくは下流又はＣ末端
部分で、保有するインターフェロン活性を損うことがな
ければ、アミノ酸の置換又は付加、特に１個のアミノ酸
の置換及び複数のアミノ酸の付加又は置換が可能である
と理解すべきである。本発明の範囲を超えることなく、
前記の如き置換もしくは付加をなし得ることは当業者に
は明らかであると思われる。さらに本発明の組換えガン
マインターフェロンは完全配列(図１および図２参照)の
改変種及び対立変異種であって完全配列のものと同等、
あるいはそれ以上の生物学的活性を持つ種を包含する。 【００２４】本発明の特徴として、精製した組換えガン
マインターフェロンは実質的にヒト由来の他のタンパク
を含まないであろうし、この特徴によって、今まで入手
可能であった天然のヒトガンマインターフェロン組成物
とは区別されるであろう。 【００２５】本発明は、(処方前に)約９５％より高純
度、好ましくは約９８％より高純度の組換えガンマイン
ターフェロン組成物を包含し、このため、該組成物は今
までに入手可能であった天然のガンマインターフェロン
と区別される。 【００２６】同様に、Ｎ末端アミノ酸残基がメチオニン
である本発明の具体例の１つの組換えガンマインターフ
ェロンはヒトの体内で産生されるガンマインターフェロ
ンと区別され、ＣＹＳ−ＴＹＲ−ＣＹＳの欠失以外にも
同様な理由で、Ｇray等(６)が報告した配列を有するイ
ンターフェロンとは区別されるであろう。 【００２７】本明細書中、複製可能な発現ベヒクルと
は、二本鎖ＤＮＡ、好ましくはプラスミドを意味し、こ
れは、複製開始領域、プロモーター又はプロモーター−
オペレーター、リボソーム結合部位をコードする配列、
翻訳開始シグナルコドン及びこれらと適切な解読相にあ
り所望の組換えガンマインターフェロンをコードしてい
る遺伝子、更にこれに続く翻訳終了コドンから成る。現
在では、組換えＤＮＡ技術の一般的技術及び用語は当業
者には充分理解されており、いずれにせよ当業者は、本
発明の全ての具体例及び合法的に均等であると認識され
る例の実施に関するバックグラウンド情報として必要な
変更を加えて(１１)を参照できるであろう。 【００２８】 【実施例】 Ａ．クローニング 参考文献(６)及び特開昭５８−９０５１４号公報の記載
に従い、誘発ヒト末梢血リンパ球から得たメッセンジャ
ーＲＮＡを用いて、ガンマインターフェロンcＤＮＡ配
列を有する組換えＤＮＡクローンを調製した。クローン
p６７のＤＮＡ配列を図１および図２に示す。５'−非翻
訳領域に続いて、２３個のアミノ酸から成る前駆体即ち
シグナルペプチドをコードしている６９個のヌクレオチ
ド,１４３個のアミノ酸から成る成熟インターフェロン
ポリペプチドをコードしている４２９個のヌクレオチド
及び３'−非翻訳配列を形成する５８７個のヌクレオチ
ドがある。 【００２９】Ｂ．発 現 １．Ｅ．coliによる例 Ｅ ．coli中で組換えＩＦＮ−γを高レベルで発現させる
ためには、シグナルペプチドのＡＴＧ(アミノ酸Ｓ１)で
はなく、成熟ポリペプチドのグルタミンコドン(アミノ
酸１)の直前のＡＴＧコドンからタンパク合成を開始す
べきである(図１および図２参照)。Ｅ．coli中で直接に
p６７のcＤＮＡインサートを発現させるためにとった手
順の概略を図３に示す。Ｇray等(６)のcＤＮＡインサー
トをＥ．coli中で発現するために使用したアプローチと
同様のアプローチをとった。 【００３０】シグナルペプチドコード領域を除去するた
めに、推定成熟コード配列のコドン２に位置するＡvaＩ
Ｉ制限部位を用いた。２種の合成デオキシオリゴヌクレ
オチドを、アミノ酸１及び２のコドンを再生し、ＡＴＧ
翻訳開始コドンを組み込み且つＸbaＩ粘着性末端を作成
するようにデザインした。これらの２種のオリゴマー
を、cＤＮＡインサートの残りに結合して、１４４個の
アミノ酸から成るポリペプチドをコードし且つ両端にＸ
baＩ及びＰstＩ部位を有する１０６３塩基対の合成−天
然ハイブリッド遺伝子を組み立てた。この遺伝子をプラ
スミドpＬeＩＦＡ２５(１０)のＸbaＩ及びＰstＩ部位の
間に挿入して、発現プラスミドpγ−ＣＹＣ５を作製し
た。このプラスミドでＥ．coli Ｗ３１１０株(Ｆ-,
λ-,原栄養株protrophic)(ＡＴＣＣ Ｎo．２７３２５)
を形質転換して、宿主−ベクター系Ｅ．coli Ｗ３１１
０／pγ−ＣＹＣ５を得た。 【００３１】２．培養細胞の例 図１および図２に示したようなＮ末端アミノ酸を含む成
熟ガンマインターフェロン遺伝子からの産物であること
を確認するために、図１および図２に示したようなシグ
ナルペプチド及びガンマインターフェロンの双方をコー
ドしている遺伝子を、放射活性標識システイン及びメチ
オニンの存在下でＣＯＳ−７細胞(１６)中で発現させた
(Ｅ．coliによる発現の場合と異り、ここに例示したよ
うな哺乳動物細胞系の発現産物はＮ末端メチオニンを欠
いている)。 【００３２】６０mmペトリ皿中のＣＯＳ−７細胞の集密
単層(confluent monolayer)に、改良ＤＥＡＥ−デキス
トラン法を使用してＤＮＡをトランスフェクトしたもの
を２組調製した。ＤＮＡ添加の３日後、培地を除去し
た。各プレートに、１００μＣiＳ35−メチオニン又は
Ｓ35−システインを添加したＤＭＥＭ２mlを加えた。放
射活性標識アミノ酸の存在下で１６時間インキュベート
した後、培地を除去し、抗ガンマインターフェロンモノ
クローナル抗体又は抗ＨＢsＡgモノクローナル抗体を第
１抗体としウサギ抗マウスＩgＧ抗体(Ｃappell Ｉn
c．)を第２抗体として５００μlの免疫沈降を実施し
た。前記抗体との反応及びその後のスタフィロコッカス
(Ｓtaphlycoccus)Ａ細胞(Ｃalbiochem)への結合は、
Ｐ．Ｂerman等によって記述されている(１８)。サンプ
ルをＳＤＳ−メルカプトエタノール中に再懸濁し、１０
％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動にかけた。ゲルを
エタノール中７％酢酸で固定し、Ｅnhance(Ｎew Ｅngl
and Ｎuclear)蛍光溶液に浸し、乾燥し、Ｋodak ＡＲ
５フィルム及び増感スクリーン(Ｄupont)を使用して２
週間露光させた。 【００３３】本研究に使用したプラスミドはpＳＶγ６
９(１１)、pＤＬＲＩ(１９)(Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原
発現ベクター,pＳＶγ６９の前駆体)及びpＤＬ ＲＩγ
Ｓau(pＳＶγ６９(１１)の８３０bp Ｓau３Ａ断片を
含有するポリシストロンプラスミドであり、pＤＬ Ｒ
ＩのＥcoＲＩ部位に挿入されたガンマインターフェロン
をコードしている全配列を含むもの)であった。後者の
プラスミドはガンマインターフェロン及びＨＢsＡg双方
のコード領域を含む転写産物を産生する。 【００３４】抗ガンマインターフェロン抗体(Ａ)又は抗
ＨＢsＡg抗体(Ｂ)と反応するＳ35−システイン及びＳ35
−メチオニン標識タンパクを比較すると、pＤＬ ＲＩ
−γＳauでトランスフェクトしＳ35−システインで標識
した細胞では、抗ガンマインターフェロン抗体を使用し
て特異的に免疫沈降する物質は、グリコシル化物(ＭＷ
２９,０００)の位置に移動するものもモノグリコシル化
物(ＭＷ１８,０００)の位置に移動するものもないのに
対し、これとは対照的に、Ｓ35−メチオニン標識細胞で
はガンマインターフェロンの免疫沈降が生じた。 【００３５】Ｃ．発酵生産 Ｅ ．coli Ｗ３１１０／pγ−ＣＹＣ５を用いる組換え
ヒトインターフェロン−ガンマ(rＩＦＮ−γ)の産生
は、容量１０乃至１０００lの範囲のバッチで実施す
る。発酵後、インターフェロンを含有するＥ．coli細胞
をブロスから回収し、rＩＦＮ−γを単離精製する。以
下に発酵及び細胞回収方法を記載する。 【００３６】１)ストックカルチャーの調製及び維持 次の組成; バクトトリプトン １０g／Ｌ 酵母抽出物 ５g／Ｌ 塩化ナトリウム ５〜１０mg／Ｌ を有する無菌培地１５０〜５００mＬを含有する無菌の
バッフル板付培養フラスコ中で、ストックカルチャーを
調製する。 【００３７】次に、Ｅ．coli Ｗ３１１０／pγ−ＣＹ
Ｃ５の一次培養物を培地に接種する。次いで、５５０nm
に於ける吸光度が約１．０になるまで、接種したフラス
コを振盪器上２５〜３７℃でインキュベートする。３０
％(Ｖ／Ｖ)のジメチルスルホキサイド約５０％(Ｖ／Ｖ)
をブロスに添加する。直ちに１mＬのアリコートを無菌
バイアルに分与し、ふたを閉める。バイアルは−６０℃
以下で保存する。各々の発酵は、接種用複製ストックカ
ルチャーを用いて開始する。 【００３８】２)接種物の調製 接種物を振盪フラスコ又は小形ファーメンター内で前記
の培地(ＬＢブロス)を用いて調製する。約３７℃で約８
時間インキュベートした後、接種物をファーメンターに
移す。接種物の容量は、発酵容量の２乃至１０％であ
る。 【００３９】３)発 酵 組換えインターフェロン−ガンマの産生は、約１０乃至
１０００lの作用容積を有するファーメンター内で行な
う。発酵培地は、１l当り次の組成を有する。 グルコース(＊) ５０ − １００g 硫酸アンモニウム ４．０ − ８．０g 一塩基性リン酸カリウム ３．０ − ５．０g 二塩基性リン酸カリウム ５．０ − ８．０g 硫酸マグネシウム七水塩 ０．５ − ５．１g クエン酸ナトリウム二水塩 ０．５ − ２．０g ＵＣＯＮ ＬＢ−６２５ ０．５ − ２．０mＬ 塩化第二鉄六水塩 ０．００５ − ０．１５g 硫酸亜鉛七水塩 ０．００１ − ０．１５g 塩化コバルト六水塩 ０．００１− ０．００５g モリブデン酸ナトリウム二水塩 ０．００１ − ０．００５g 硫酸第二銅五水塩 ０．００１ − ０．００５g ホウ酸 ０．００１ − ０．００５g 硫酸マンガン一水塩 ０．００１ − ０．００５g 塩酸 ０．０ − １．０mＬ チアミン−ＨＣl ０．０ − ０．１g テトラサイクリン−ＨＣl ０．００１ − ０．０１g Ｌ−トリプトファン(＊) ０．１ − ０．５g 酵母抽出物 ２．０ − ８．０g ３−β−インドールアクリル酸 ０．０２ − ０．１０g (＊)グルコース及びトリプトファンは一部を最初にファーメンターに入れ、残部 は発酵中に供給する。 培地中の成分は、発酵に使用する前に、熱処理又は濾過
により殺菌する。発酵は２５〜４０℃で行う。他の操作
条件は次の通りである; 撹拌( rpm) １００〜１０００ 通気( vvm) ０．５〜１．５ (必要なときには酸素を補充) pＨ ６．５〜７．５ (水酸化アンモニウムの添加により調節) 【００４０】４)精 製 a)組換えガンマインターフェロンの抽出 塩及びpＨ６乃至９、好ましくは約９の適当な緩衝液を
含有する培地中にＥ．coli細胞を懸濁させる。ガウリン
(Ｇaulin)ミルの如き高圧コロイドミル中で細胞懸濁液
をホモゲナイズして組換えガンマインターフェロンを抽
出する。充分なポリエチレンイミンを前記溶液に添加し
て、０．１乃至１％(Ｗ／Ｖ)の溶液に調製する。上清に
ガンマインターフェロンが含まれている。 【００４１】b)組換えガンマインターフェロンのシリカ
をベースとする吸着剤上での部分精製 pＨ６乃至９の範囲の適当な塩溶液で洗浄して不純物を
除去したシリカをベースとする吸着剤に上記(a)の上清
を吸着させる。０．５乃至１．０Ｍの塩化テトラメチル
アンモニウムを含有する溶液を用いて組換えガンマイン
ターフェロンを溶出する。本工程の全操作はpＨ７乃至
９で行なう。 【００４２】c)アニオン交換クロマトグラフィーによる
組換えガンマインターフェロンの部分精製 上記(b)の溶出液を透析し、アニオン交換クロマトグラ
フィー媒体に吸着させ、次いで洗浄して不純物を除去す
る。増大する塩勾配で組換えガンマインターフェロンを
溶出する。本工程で使用できる典型的アニオン交換樹脂
には、カルボキシメチルセルロース及びスルホエチルセ
ルロースがある。全操作はpＨ７乃至９で行なう。 【００４３】d)リン酸カルシウムゲルクロマトグラフィ
ーによる組換えガンマインターフェロンの部分精製 上記(c)の溶出物をリン酸カルシウム媒体に吸着させ、
次いで洗浄して不純物を除去する。リン酸塩濃度勾配中
で塩濃度を増加させて組換えガンマインターフェロンを
溶出する。本工程の全操作は、pＨ７乃至９で実施す
る。 【００４４】e)アニオン交換クロマトグラフィーによる
組換えガンマインターフェロンの部分精製 上記(d)の溶出物を透析し、アニオン交換クロマトグラ
フィー媒体に吸着させ、次いで洗浄して不純物を除去す
る。アニオン交換媒体から塩濃度を増大する勾配で組換
えガンマインターフェロンを溶出する。典型的なアニオ
ン交換クロマトグラフィー媒体は、カルボキシメチルセ
ルロース及びスルホエチルセルロースである。本工程の
全操作はpＨ７乃至９で実施する。 【００４５】f)ゲルパーミエーションクロマトグラフィ
ーによる組換えガンマインターフェロンの部分精製 上記(e)の溶出物をゲルパーミエーション媒体に適用
し、カラムを塩含有溶媒で展開する。組換えガンマイン
ターフェロンを含有する適当な画分をプールして、精製
バルクを得る。本工程の全操作はpＨ７乃至９で行な
う。 【００４６】g)Ｃ末端アミノ酸配列 Ｃ末端配列を決定するために、サンプルを７０％蟻酸中
に透析し、臭化シアンで開裂し、得られたペプチドをＡ
ltex Ｕltrasphere Ｃ８逆相ＨＰＬＣカラムで分離し
た。ピークを集め、アミノ酸及びその配列解析を行っ
た。検知されたＣ末端ペプチドは、−ＬＥＵ−ＰＨＥ−
ＡＲＧ−ＧＬＹ−ＡＲＧ(残基１３５〜１３９、図１お
よび図２)であり、ある場合には他のペプチドが追加さ
れており、その配列は−ＬＥＵ−ＰＨＥ−ＡＲＧ−ＧＬ
Ｙ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＳＥＲ−ＧＬＮ(残基１
３５〜１４３、図１および図２)であった。これらの２
種のペプチドの割合を決定するために、(アミノ酸分析
により)既知の量を逆相ＨＰＬＣカラムにかけ、それぞ
れのピークの高さを測定した。３回の産生において長鎖
のペプチド(１３５〜１４３、図１および図２)の含有量
はそれぞれ約２％未満であり、残りは５量体(アミノ酸
５個のもの)であった。このデータは、Ｅ．coliによる
１３９個のアミノ酸含有量及び１４３個のアミノ酸含有
のガンマインターフェロン(いずれの場合も存在するＮ
末端メチオニンを含まない)の混合物の産生と一致する
ものであり、それぞれの相対比率は約９８:２％であ
る。 【００４７】５)製剤化 前記工程に従い製造した組換えガンマインターフェロン
を、表１の好ましい非経口投与用の製剤にする。 【００４８】 【表１】表１ バイアル１本当りの量 成 分 0.5mgバイアル(1) 2.0mgバイアル(2) 組換えヒトインターフェロン−γ ０．５ ２．０ マンニトール １００ ８０ コハク酸二ナトリウム六水塩 １２．４ ９．９ グリシン ５．６ ４．５ 塩化ナトリウム ４．４ ３．５ ポリソルベート２０ ０．８ ０．６ コハク酸 ０．５ ０．４ (1) 注射用にはバイアルを２．５mlの無菌水で再構成する。 (2) 注射用にはバイアルを２．０mlの無菌水で再構成する。 【００４９】本発明のインターフェロンは、医学的に適
切な投与量範囲、例えば体表面積１Ｍ2当り１．０mgで
使用し得る。 【００５０】Ｄ．トリプシン消化を経た種々のガンマイ
ンターフェロンの活性測定 カルボキシ末端の違った種々のガンマインターフェロン
の活性を決定するために、上記のＥ．coliの例に記述し
たように調製したガンマインターフェロンを種々の程度
にトリプシン消化し、前述のＡ５４９細胞を用いるＣＰ
Ｅアッセイによって試験した。 【００５１】前述のように調製した組換えガンマインタ
ーフェロン(r−Ｈu ＩＦＮ−γ)の試料(６．５mg)をＳ
ephadex Ｇ−２５モレキュラーシーブ小カラム(ＰＤ−
１０,Ｐharmacia)によりpＨ８．５の０．１０Ｍ重炭酸
アンモニウム緩衝液中に脱塩し、最終タンパク濃度２．
１mg／mlとした。希釈トリプシン溶液(ＷorthingtonＴ
ＰＣＫ トリプシン,０．００１Ｍ ＨＣl中１０μg／m
l,１６μl)をr−ＨuＩＦＮ−γ溶液の１．９ml(４．０m
g)に加え、混合して室温でインキュベートした(トリプ
シン:タンパク質＝１:２５,０００)。インキュベート混
合物から、１時間後、３．５時間後、５．７５時間後、
８時間後及び１０．２５時間後にそれぞれ試料を取り出
した。８時間目に１５μl(１５０ng)の希釈トリプシン
溶液を再度加えて１０．２５時間後の最終試料採取のた
めの反応を促進した。 【００５２】各時点の試料の各成分への分画化はＢio
Ｒad Ｂiogel ＨＰＨＴカラムを使用するＷaters Ｈ
ＰＬＣシステムで行なった。重炭酸緩衝液中の各時点で
のアリコートは試料採取時にカラムに直接(手操作によ
る注入により)入れた。０．０１Ｍリン酸ナトリウム,p
Ｈ８．０,３０μＭ塩化カルシウムによりカラムを平衡
化し、平衡化緩衝液の直線勾配及び０．５Ｍリン酸ナト
リウム緩衝液,pＨ８．０,０．６μＭ塩化カルシウムを
使用してタンパクをカラムから溶出した。 【００５３】２１４nm及び２８０nmにおける吸光度によ
り検出したタンパクのピークを分取し、分析に使用する
まで４℃で密閉保存した。選択されたピークに対する典
型的な分析は以下のものを含む。 １．ヒト肺癌由来の細胞Ａ５４９／ＥＭＣウィルスアッ
セイシステムにおける抗ウィルス活性(１３)。 ２．Ｌaemmliゲルシステムを使用する標準法によるＳＤ
Ｓ／ＰＡＧＥ分画化(１４)。 ３．市販の色素(Ｐierce Ｃhemical Ｃo．,Ｒockfoe
d, ＩＬ．)結合法によるタンパク濃度決定。 ４．臭化シアンによるタンパク開裂とそれに続くペプチ
ド同定のためのＨＰＬＣ分析(１５)。 【００５４】タンパクの試料は７０％蟻酸に対して一晩
透析(１２,０００−１４,０００ＭＷカットオフ)し、ロ
ータリーエバポレーションにより乾燥し、５００μlの
７０％蟻酸に再度懸濁した。１２×７５mmガラス管中の
各サンプルに固体臭化シアンを加え、密封して溶解する
まで混合し、アルミホイルをかけ、通気のよい場所で室
温において一晩インキュベートした。 【００５５】開裂の後、試料をロータリーエバポレーシ
ョンにより乾燥し、０．５mlの水に再懸濁し、再度乾燥
した。ＨＰＬＣによる分画化に先立ち、試料を５０％蟻
酸中に再溶解してタンパク濃度約１mg／mlとした。 【００５６】Ａltex Ｕltrasphere Ｏctylカラム及び
トリフルオロ酢酸／水−トリフルオロ酢酸／アセトニト
リル直線溶出勾配を使用するＷaters ＨＰＬＣシステ
ムにより、ペプチドを分画化した。可能な場合はアミノ
酸分析によりペプチドを同定した。短縮された形態のr
−Ｈu ＩＦＮ−γの比較データを表２に示した(aaはア
ミノ酸を表わす)。 【００５７】 【表２】表 ２ r−ＨuＩＦＮ−γ(形態*) Ｃ末端** 比活性(％) 139aa:143aa＝98:2 ＬＦＲＧＲ 100 (比較用) 131aa ＡＡＫＴＧＫＲＫＲ 40−50 129aa ＡＡＫＴＧＫＲ 6−9 125aa ＡＡＫ 約 1 ＊ 図１および図２の番号付けによるが、それぞれ
において存在するＮ末端メチオニンは除く。 ** 一文字の略記号はアミノ酸残基の常用の略記号であ
る。 Ａ＝アラニン Ｆ＝フェニルアラニン Ｇ＝グリシン Ｋ＝リジン Ｌ＝ロイシン Ｒ＝アルギニン Ｔ＝スレオニン 【００５８】１２６aa〜１４３aaの範囲(Ｎ末端メチオ
ニンは含まない)の任意の長さのガンマインターフェロ
ンは適切に末端調整された遺伝子から発現されることが
わかるであろう。例えば図１および図２に示された遺伝
子は、 【化１４】 にＦnu４Ｈ制限部位を有する。Ｆnu４Ｈによる制限の後
に、“終了"コドンの付いた所望の配列をコードする合
成オリゴヌクレオチド及び発現プラスミド中で使用可能
な制限部位に適合するリンカーをガンマインターフェロ
ン遺伝子の前部に結合することができる。例えば、配
列: (Ｘは１個以上のアミノ酸をコードする)はＦnu４ＨとＢ
glＩＩでプラスミドを消化した後に前記例示のＥ．coli
発現ベヒクルに結合でき、結合の結果の終了コドンは下
記のようになる。 【化１５】 【００５９】Ｅ．アッセイ,細胞変性阻害 １．テスト方法 Ｅagle's ＭＥＭ中に４×１０5細胞／mlの含有量に調
整したヒト肺癌由来(Ａ５４９)細胞(ＡＴＣＣ Ｎo．Ｃ
ＣＬ１８５)の懸濁液１００μlを各ウェルに加える。プ
レートを３７℃で約１８時間インキュベートする。１８
〜２４時間インキュベートした後、第１列目の各ウェル
に培地８０μlを追加する。インターフェロン活性を測
定する試料２０μlを第１列目のウェルに加える。第１
列の各ウェルの内容物１００μlをそれぞれの横の第２
列目のウェルに移す。ウェルの内容物１００μlを次列
へ移し、これを全部で１０回繰り返して、第１１列目ま
で移す。２４時間インキュベートした後、セルコントロ
ールを除き全てのウェルに脳心筋炎ウィルス５０μlを
感染させ、感染後２４時間後の細胞変性効果が１００％
となるよう感染を繰り返す。トレイをふたで覆い３７℃
で２４時間インキュベートする。全てのウェルから液体
を抜き、５〜１５分間０．５％クリスタルバイオレット
で染色する。細胞の生存能力を染色細胞を観察すること
により測定する。試料のタイターは、５０％生存可能細
胞が残存する希釈度の逆数である。 【００６０】２．計 算 全ての試料の活性を、下記により計算されるＲeference
Ｕnits Ｃonversion Ｆactorによって規格化する。 【数１】 【００６１】３．比活性 ＮＩＨによるＩＦＮ−γ基準物質により標準化されたＡ
５４９／ＥＭＣＶバイオアッセイシステムを使用する
と、組換えヒトＩＦＮ−γの抗ウィルス比活性は、Ｎ末
端に３つの付加アミノ酸(ＣＹＳ−ＴＹＲ−ＣＹＳ)のつ
いた改変rＩＦＮ−γ分子の活性より約３倍高い。 【００６２】４．安定性 上記の生物学的活性の測定(Ａ５４９／ＥＭＣＶ)による
と、調合後バイアル中に保存してあるrＩＦＮ−γは、
生産後３ケ月間(４℃で貯蔵)安定である(生物学的活性
の損失はない)。 【００６３】Ｆ．他のタイプのヒトインターフェロンと
比較したrＩＦＮ−γの抗細胞増殖活性 １．材料及び方法 rＩＦＮ−γ：溶液形態のＣＹＳ−ＴＹＲ−ＣＹＳ−欠
失組換えインターフェロン−γ(２０mＭコハク酸ナトリ
ウム,０．１５ＭＮaＣl,pＨ６)。前記のＥ．coliの例に
依る方法で調製した。比活性は２．７×１０7ＩＵ／mg
タンパクであった。 ＣＴＣ−rＩＦＮ−γ：溶液形態の、分子のＮ末端に
“ＣＹＳ−ＴＹＲ−ＣＹＳ"構造を有する組換えインタ
ーフェロン−γ(２０mＭコハク酸ナトリウム,０．１５
Ｍ ＮaＣl,pＨ６)。比活性は１．３×１０7ＩＵ／mgタ
ンパクであった。 ＨuＩＦＮ−β：ヒト二倍体包皮線維芽細胞内で産生さ
れたヒト線維芽細胞インターフェロンの凍結乾燥物で、
比活性は１×１０7ＩＵ／mgタンパクより高く、Ｔoray
Ｉnd．,Ｉnc．により調製されたもの。バイアル中にＨ
uＩＦＮ−β３×１０6ＩＵ及びヒト血清アルブミン３mg
を含む。 ＨuＩＦＮ−α：Ｄr．Ｋ．Ｃantell,Ｃentral Ｐublic
Ｈealth Ｌaboratory,Ｈelsinki,Ｆinlandより供与
された溶液形態のヒト天然白血球インターフェロンで、
比活性は４×１０6ＩＵ／mgタンパクである。 コントロール：ヒト血清アルブミン３mgを含有するプラ
シーボ。 培 養 培 地：ＨeＬa,ＫＢ,ＨＭＶ−１,ＦＬ及びＪ−１
１１細胞については、１０％熱不活化初乳前新生子牛血
清(ＰＮＣＳ)及び２mＭ Ｌ−グルタミンを添加したＥa
gle's最少必須培地を使用した。Ａ５４９細胞には１０
％熱不活化ＰＮＣＳ、１００μg／mlカナマイシン及び
２mＭ Ｌ−グルタミンを含有するＤulbecco'最少必須
培地を使用した。表３に挙げた残りのヒト細胞には熱不
活化ＰＮＣＳ及び１００μg／mlカナマイシンを添加し
たＲＰＭＩ１６４０培地を使用した。 【００６４】２．抗細胞増殖活性の評価 培養培地に懸濁した試験細胞をプラスチック組織培養プ
レートに５×１０3細胞／０．５ml／ウェルの濃度で接
種した。続いて対応する培地(０．５ml)に溶解した種々
の量のインターフェロンを添加した(０日)。培養は３７
℃において５％ＣＯ2,９５％空気の湿潤大気中で行っ
た。浮遊増殖型細胞については、６日目に培養培地を除
去し、懸濁培養液中の細胞をＣoulterカウンターでの細
胞計数のために直接Ｉ soton ＩＩ(Ｃoulter Ｅlectro
nics Ｉnc．)中に懸濁した。プラスチック容器中でシ
ートを形成する細胞は、測定に際し、Ｉ soton ＩＩ中
での単一細胞懸濁物を調製するために０．０５％トリプ
シン−０．０２％ＥＤＴＡで前処理した。インターフェ
ロンの抗細胞増殖活性は、コントロール培養物(インタ
ーフェロンなし)と比較して細胞数を５０％減少するの
に要する抗ウィルス単位数として表わした(ＩＣ50,ＩＵ
／ml)。 【００６５】 【表３】表３ 他種インターフェロンと比較したrＩＦＮ−γの抗細胞増殖活性 試験細胞の組織学的 IC50(IU/ml) 細胞 タイプ又は起源 rIFN-γ CTC-rIFN-γ HuIFN-β HuIFN-α KATO-III 胃癌Siglet-ring細胞 1.2 1.3 − − MKN-1 胃扁平上皮癌 37 330 − − MKN-28 高分化型胃腺癌 ＞103 ＞103 − − MKN-45 低分化型胃腺癌 ＞103 ＞103 − − MKN-74 高分化型胃腺癌 ＞103 ＞103 − − HeLa 子宮頸癌 22 132 446 ＞103 KB 鼻咽腔癌 54 330 ＞104 ＞104 HMV-1 無メラニン性悪性黒色腫 38 45 130 820 SEKI-F 悪性黒色腫 135 ＞103 137 663 FL 羊膜(非悪性腫瘍起源) 38 45 ＞103 ＞104 PC-8 低分化型肺腺癌 ＞103 ＞103 ＞104 ＞103 PC-12 肺腺癌 ＞103 ＞103 ＞104 ＞103 A549 肺胞癌 55 − − − QG-56 肺扁平上皮癌 5 − − − QG-90 未分化型肺小細胞癌 5.5 − − − Daudi Burkitt リンパ腫 ＞103 ＞103 47 7 Namalwa Burkitt リンパ腫 ＞103 ＞103 − − J-III 単球性白血球 25 84 204 ＞１０３ 【００６６】表３に示した通り、ｒＩＦＮ−γの抗細胞
増殖活性はヒト細胞種により著しく異っていた。この場
合、ＫＡＴＯ−ＩＩＩすなわち胃癌siglet−ring細胞は
高度に敏感で１．２ＩＵ／mlのＩＣ50を示すが、Ｄaudi
細胞すなわちＢurkittリンパ腫はＩ型インターフェロン
(ＨuＩＦＮ−α,ＨuＩＦＮ−β)に対しては高度に敏感
であるのに対して、rＩＦＮ−γを含むＩＩ型インター
フェロンに対しては非感受性であった。肺腺癌(ＰＣ−
８,ＰＣ−１２)は試験した全てのインターフェロンに対
して非感受性であった。rＩＦＮ−γとＣＴＣ−rＩＦＮ
−γ間の抗細胞スペクトルは殆んど同一であるが、一般
的にrＩＦＮ−γの抗細胞増殖効果はＣＴＣ−rＩＦＮ−
γのそれよりも優れているようである。４つのインター
フェロンを比較した場合、Ｄaudi細胞を除いてrＩＦＮ
−γにおいて最も高い効果が得られた。 【００６７】Ｇ．in vitroの種々の液中におけるrＩＦ
Ｎ−γとＣＴＣ−rＩＦＮ−γの安定 性の比較 １０mgヒト血清アルブミン,リン酸緩衝液及び等張量の
ＮaＣlをそれぞれ含有している、前記のＥ．coliの例に
従って調製したrＩＦＮ−γの凍結乾燥物１×１０6ＩＵ
／バイアル及びＮ末端に“ＣＹＳ−ＴＹＲ−ＣＹＳ"構
造を有するrＩＦＮ−γの凍結乾燥物１×１０6ＩＵ／バ
イアルを蒸留水で溶解し、濃度を４×１０4ＩＵ／mlに
調整した。 【００６８】インターフェロンのin vitroにおける安
定性は、種々の液体中における残存抗ウィルス活性を測
定することによって評価した。上記のインターフェロン
溶液を、３７℃又は４℃の水浴インキュベーターで１０
分間プレインキュベートした９倍容量のウサギ血清、ヒ
ト血清あるいはＥagle's ＭＥＭに加えることによって
インキュベートを開始した。０,０．２５,０．５,１,
４,８,２４,７２及び１４４時間後にアリコートを採取
し、９倍容量のＥagle's ＭＥＭと混合した。試料は、
インターフェロンタイターの測定まで、ディープフリー
ザー中において−８０℃で凍結保存した。インターフェ
ロンタイターは、Ｓindbisウィルスを感染させたヒト羊
膜細胞(ＦＬ細胞)を使用するＣＰＥ50法により測定し
た。結果は初期タイターに対する残存タイターのパーセ
ンテージとして図４に示した。 【００６９】Ｅ．coli及びＣＯＳ−７細胞中で発現させ
る好ましい具体例を参照して本発明を例示したが、本発
明の組換えガンマインターフェロンが他の細菌株,酵母
及び組織培養系の如き他の系内に於いても産生され得る
ことは明らかである。特開昭５８−９０５１４号公報及
び参考文献(６)参照。即ち、本発明は最も好ましい具体
例に限定されず、むしろ前記特許請求の範囲の全ての適
法範囲の均等物に亙る。 【００７０】参 考 文 献 １．Ｄ.Ｇoeddel et al.,Ｎature,287,411(1980) ２．Ｄ.Ｇoeddel et al.,Ｎature,290,20(1981) ３．Ｅ.Ｙelverton et al.,Ｎucleic Ａcids Ｒesearc
h,9,731(1981) ４．Ｇutterman et al.,Ａnnals of Ｉnt.Ｍed.93,399
(1980) ５．Ｄ.Ｇoeddel et al.,Ｎucleic Ａcids Ｒesearch,
8,4057(1980) ６．Ｐ.Ｇray et al.,Ｎature,295,503-508(1982) ７．Ｒ.Ｄerynck et al.,Ｎucleic Ａcids Ｒesearch,1
0,3605(1982) ８．Ｒ.Ｄerynck et al.,Ｉnterferon Ｓcientific Ｍe
moranda,Ａugust 1982,Ｍemo-Ｉ-Ａ1193/2 ９．Ｒ.Ｄerynck et al.,“Ｅxpression of Ｈuman Ｉn
terferon Ｇamma in Ｈeterologous Ｓystems" in Ｅxp
erimental Ｍanipulation of Ｇene Ｅxpression,Ａcad
emic Ｐress,Ｉnc.247(1983) 10．Ｄ.Ｇoeddel et al.,Ｎature,287,411-416(1980) 11．Ｄ.Ｇoeddel et al.,欧州特許出願公開第0,077,670
号 12．Ｗ.Ｅ.Ｓtewart ＩＩ,“Ｔhe Ｉnterferon Ｓyste
m",Ｓpringer Ｖerlag(Ｎew Ｙork)pp.13-26(1979) 13．Ｓtewart,“Ｉnterferon Ｓystems" 'Ｅd,:Ｓtewa
rt,p.13,Ｓpringer−Ｄerlag,Ｎew Ｙork(1979) 14．Ｌaemmli,Ｎature,227,680(1970) 15．Ｇross,et al.,Ｍethods in Ｅnzymology,ＸＩ,238 16．Ｇluzman,Ｃell,23,175(1981) 17．Ａlton et al.,“Ｐroduction,Ｃharacterization
and Ｂiological Ｅffects of Ｒecombinant ＤＮＡ Ｄ
erived Ｈuman ＩＦＮ−alpha and ＩＦＮ−gamma Ａna
logs",Ｔhe Ｂiology of the Ｉnterferon Ｓystem,Ｄe
Ｍaeyer and Ｓchellekens,Ｅds.,Ｅlselvier Ｓcienc
e Ｐubl.(1983)． 18．Ｂerman et al.,Ｓcience,222,524(1983) 19．Ｓimonsen et al.,Ｍol.Ｃell.Ｂiol 3,2250(1983)
い組換えガンマインターフェロンの製造に前記の如き技
術を利用する手段及び方法、前記インターフェロンの産
生並びに産生される種々の産物及びそれらの用途に係
る。 【０００２】発明の背景 本発明のバックグラウンドを明らかにし且つ特定の場合
には本発明の実施に関する詳細を補う目的で、多くの刊
行物及びその他の文献を引用して本明細書中に包含し、
便宜上、これらの参考文献に参照番号を付し、本明細書
末尾に目録として添付した。本文中では参考文献を参照
番号で示す。 【０００３】ヒトインターフェロンは、抗原性、生物学
的特性及び生化学的特性の違いに基いて３種のグループ
に分類し得る。第１のグループは、通常ウィルスによっ
て誘発されたヒト血液構成細胞が主として産生する白血
球インターフェロン類である。これらのインターフェロ
ンは、既に微生物によって産生され、生物学的に活性で
あることが知見されている(参考文献１,２及び３参
照)。このインターフェロンは、その生物学的特性故
に、ウィルス感染症及び悪性腫瘍状態の治療薬としての
臨床使用が目論まれている(４)。 【０００４】第２のグループのヒト線維芽細胞インター
フェロンは、通常、ウィルスに誘発された線維芽細胞に
よって産生される。これらのインターフェロンも同じく
既に微生物によって産生されており、広範な生物学的活
性を示すことが知られている(５)。臨床試験においても
これらのインターフェロンの潜在的治療価値が示唆され
ている。白血球インターフェロンと線維芽細胞インター
フェロンは、アミノ酸レベルでの相同(homology)の程度
が比較的低いにもかかわらず、生物学的特性が極めて類
似している。又、これらのグループのインターフェロン
はいずれも、約１６５乃至約１６６個のアミノ酸を含み
且つ酸に対して安定なタンパクである。 【０００５】ヒトガンマインターフェロン(免疫インタ
ーフェロン,γ−インターフェロン,ＩＩＦまたはＩＦＮ
−γともいう)は、前記インターフェロンの抗ウィルス
特性及び抗細胞増殖特性を示すが、白血球インターフェ
ロン及び線維芽細胞インターフェロンとは対照的にpＨ
２で不安定である。これらガンマインターフェロンは、
組換えＤＮＡ技術によって産生される以前には主として
リンパ球のマイトゲン誘発によって産生されていた。ヒ
トガンマインターフェロンは、白血球インターフェロン
及び線維芽細胞インターフェロンとは抗原的に明らかに
異なっている。Ｇray,Ｇoeddel等は組換えガンマインタ
ーフェロンの発現を最初に報告しており(６)、これによ
ってヒトガンマインターフェロンに特有な性質即ちpＨ
２での不安定性と共に抗ウィルス活性及び抗細胞増殖活
性を示すことが確かめられた。大腸菌(Ｅ．coli)中で産
生されたＧray及びＧoeddelの組換えガンマインターフ
ェロンは１４６個のアミノ酸から成り、この分子のＮ末
端部は配列ＣＹＳ−ＴＹＲ−ＣＹＳ−で始まっていた。
続いて、Ｄerynck等が、同じＮ末端を有し且つ１個のア
ミノ酸が置換されている別の組換えガンマインターフェ
ロンを報告した(７)が、おそらくこのポリペプチドはそ
れより前に参考文献(６)に報告されたインターフェロン
の対立変異型(allelic variant)であろう。更に、他の
研究者等によって別の組換えガンマインターフェロンの
産生についての報告がなされており、彼らによって産生
された組換えガンマインターフェロンでは、Ｇray及び
Ｇoeddelが最初に開示したアミノ酸配列(６)のうち１個
又はそれ以上のアミノ酸が置換されていると報告されて
いる。 【０００６】例えば、Ａlton等は、Ｇray等のガンマイ
ンターフェロン(６)の８１番目のアミノ酸を１つ置換し
た一連のＩＦＮ−γを報告している(１７)が、得られた
ＩＦＮ−γは７０％(相対基準)の活性しか有しておら
ず、さらにこのＩＦＮ−γの１,２,３番目のＣＹＳ−Ｔ
ＹＲ−ＣＹＳを欠失させると、相対活性が更に低下し、
Ｇray等のガンマインターフェロン(６)の４９％の活性
しか有していないＩＦＮ−γとなる。 【０００７】本発明者等の研究によって、Ｎ末端アミノ
酸配列にシステイン残基を含む組換えガンマインターフ
ェロンは、１個又はそれ以上のシステイン残基のスルフ
ヒドリル基がジスルフィド結合形成に関与するオリゴマ
ー化という見地から問題を醸し出すことが確認された。
本発明者等の研究に於いてこれらの推定ジスルフィド結
合を完全に還元することができなかったことから、問題
はより複雑であり、おそらくはシステインと結合したチ
ロシン残基のヒドロキシル官能基を介する反応が含まれ
ると思われる。又、これらの組換えインターフェロンは
多少不安定であり、不安定性のためかその他の原因によ
るかは明らかでないが、最適な効果が得られないことが
判明した。 【０００８】発明の概要 本発明は、安定性及び活性が優れた組換えガンマインタ
ーフェロンに係る。最も好ましい態様では、Ｎ末端から
伸延して続く下記アミノ酸配列(以下、「完全配列」とい
う)を有する組換えガンマインターフェロン、及び前記
配列のカルボキシ末端の特定部位を欠く種々のインター
フェロンアナログ(類似体)が提供される。 【化１３】【０００９】［ここで、Ｘがメチオニン残基であると
き、Ｙはグルタミン残基であり、Ｘが水素であるとき、
Ｙはグルタミン残基若しくはピログルタミン酸残基であ
る］。本発明はまた、対応するクローン化遺伝子、これ
らを含む発現ベクター及び本発明のインターフェロンの
組換えＤＮＡ技術による産生に有用な形質転換体を提供
する。本発明の好ましい組換えガンマインターフェロン
は、(文献中に既に記載されているインターフェロンと
比較して)天然ガンマインターフェロンの真のアミノ酸
配列に最も近似していると思われる。この天然ガンマイ
ンターフェロンは本発明者等が天然起源から精製し充分
に特性を明らかにしたものである。本発明の好ましい態
様のインターフェロンは、文献中に既に記載されている
インターフェロンに比べて大幅に改良された安定性と活
性を示す。 【００１０】本発明の前記及び他の目的を達成する様相
は、以下の詳細な説明及び添付の図面の記載から明らか
になるであろう。 【００１１】図１および図２は、本発明の組換えガンマ
インターフェロンのアミノ酸１〜１４３、並びにシグナ
ル配列が先行している該アミノ酸配列をコードしており
且つ非翻訳ＤＮＡからなる５'−及び３'−フランキング
領域を有するＤＮＡ配列を示す。 【００１２】図３は、Ｅ．coliによる本発明の組換えガ
ンマインターフェロンの直接合成のための情報をコード
しているプラスミド及びその調製法を示す模式図であ
る。 【００１３】図４は、本発明によって調製されたガンマ
インターフェロンの優れた安定性を示すデータである。 【００１４】詳細な説明 本発明者等は、天然ヒトガンマインターフェロン(即
ち、ヒト末梢血リンパ球のマイトゲン誘発によって産生
されて精製されたもの)が、Ｇray等が組換えガンマイン
ターフェロンと指称し参考文献(６)に示した配列を有す
るポリペプチドのＮ末端ＣＹＳ−ＴＹＲ−ＣＹＳを欠く
ポリペプチドであることを解明した。本発明者等の研究
に係る高度に精製した天然ガンマインターフェロンをト
リプシン消化して得られる物質中には、Ｇray等の組換
えガンマインターフェロン(６)のＮ末端部にほぼ相当す
るアミノ酸組成を有するが、但しＣＹＳ−ＴＹＲ−ＣＹ
Ｓを欠く配列が含有されていた。天然ガンマインターフ
ェロンのアミノ酸配列解析をＮ末端から行なうことはで
きなかったので、この分子のＮ末端のα−アミノ酸は保
護されていると推定された。Ｇray等(６)によるとcＤＮ
Ａがコードしている２つ目のシステインの次の第１アミ
ノ酸はＧＬＮ(グルタミン)であるので、ＧＬＮ残基が環
化してピログルタミン酸に代りその結果Ｎ末端がブロッ
クされていると推測された。ピログルタミン酸アミノペ
プチダーゼによってピログルタミン酸を除去すると、次
にコードされているアミノ酸すなわちＡＳＰのα−アミ
ノ基が遊離し、配列解析が続行できるようになり、その
結果天然のヒトガンマインターフェロンの最初に報告さ
れたものと同じ結果が得られた。 【００１５】ＣＹＳ−ＴＹＲ−ＣＹＳを含有する組換え
ヒトガンマインターフェロンのcＤＮＡを適当に改造す
ることにより、上記の完全配列(但し、ＸはＭＥＴであ
り、ＹはＧＬＮである)を有するタンパクをコードして
いるcＤＮＡから新規な組換えガンマインターフェロン
をＥ．coli中で直接発現させることが可能になった。Ｎ
末端のメチオニンはmＲＮＡの翻訳“開始"シグナルＡＵ
Ｇによってコードされている人為構造であり、例示した
Ｅ．coliによる発現という特定の場合には宿主系により
除去処理されない。他の微生物系、例えばシュードモナ
ス(pseudomonas)では、メチオニンが除去され得る。い
ずれにせよ活性に必要であるとは思われない。メチオニ
ンが除去されると、使用する系に応じて、ＧＬＮ残基が
ピログルタミン酸の形態に環化し得るがこの場合も活性
が損われることはない。 【００１６】本発明者等の研究によると、Ｇray等によ
り以前に報告されたＣＹＳ−ＴＹＲ−ＣＹＳを含有する
組換えガンマインターフェロンは、ヒト血清アルブミン
を用いて処方することで安定化し得た。しかしながら、
最終凍結乾燥産物中に血清アルブミンが存在する場合
は、最終産物に対してではなく凍結乾燥に先立って或る
種の品質調整処理を行なう必要がある。一方、本発明の
新規な組換えガンマインターフェロンの場合には、凍結
乾燥状態の物質は、血清アルブミンを含有しなくとも充
分に安定であることが判明した。しかしながら、所望で
あれば、本発明のガンマインターフェロンを薬剤上許容
される程度のヒト血清アルブミンと調合してもよい。 【００１７】更に、本発明のＣＹＳ−ＴＹＲ−ＣＹＳを
欠く組換えヒトガンマインターフェロンは、細胞変性阻
害試験に於いて、抗ウィルス剤としてＣＹＳ−ＴＹＲ−
ＣＹＳ含有アナログよりも顕著な活性を示すように思わ
れる。活性は通常、マイクロタイタープレート上でヒト
肺癌由来の細胞株Ａ５４９に対する脳心筋炎ウィルスの
細胞変性効果(ＣＰＥ)の阻害によりアッセイされる(１
２)。 【００１８】本発明の組換えガンマインターフェロン
は、前記完全配列のアミノ酸１〜約１２６を含有するイ
ンターフェロンを全て包含する。完全配列に対してカル
ボキシ末端部を種々切り取ったガンマインターフェロン
は、アミノ酸１〜約１２６が存在する限り、或る場合に
多少レベルが低下するとしても、依然としてヒトガンマ
インターフェロンに特有の性質を示す。実際、(７)に報
告されたＣＹＳ−ＴＹＲ−ＣＹＳ含有アナログを用いた
実験で、アミノ酸１３２(本発明の番号付けによる)に続
くアミノ酸配列を、活性を損失することなく他の配列(e
xtraneous sequences)で置換された例が示された(例え
ば、(８)参照)。本発明者等の予備的データは、アミノ
酸１から１２６(ＴＨＲ)付近までの配列は比較的強固に
結合して活性と関連すると思われる三次元立体配置をと
っているが、完全配列の残りのアミノ酸は比較的構造上
の制限が緩くタンパク分解に比較的敏感であるという仮
説を支持している。制限条件下でのトリプシン消化によ
って、アミノ酸１２６より下流の配列は種々の部分が除
去されるがこれより上流は除去されない。本発明者等が
研究した天然ガンマインターフェロンは、アミノ酸１２
７,１２８,１２９,１３０,１３２及び１３４にわたる種
々の分子を含む。本発明者等は、メチオニンに続くアミ
ノ酸配列が(ＭＥＴの後の)アミノ酸１〜約１３９及び１
〜約１３１の種々のものから成る完全に活性な組換えガ
ンマインターフェロンを発見した。後者のアミノ酸１〜
約１３１は、組換えガンマインターフェロンをトリプシ
ンで制限消化しその後配列確認することによって得られ
た。(ＭＥＴより先の)アミノ酸約１２８及び１２９に末
端を有する同様のトリプシン消化断片は、実質的に低下
しているとはいっても活性を保持していた。一方、１２
６番目のスレオニンとそれに続くアミノ酸を消化して除
去した(Ｎ末端メチオニンに加えて)１２５個のアミノ酸
を有する物質は、ＣＰＥ阻害アッセイに於いて未消化物
の活性の１％未満の活性しか示さなかった。 【００１９】組換えによって誘導されたガンマインター
フェロンはメチオニンが細胞内では開裂されないような
宿主内で産生された場合に先頭メチオニンを有するのに
加えて、１３９個のアミノ酸(図１および図２の番号付
による)を有するものが多量で１４３個のアミノ酸を有
するものが少量であると考えられる。この２種の組成は
アミノ酸１３９個の種が約９５％より多く、最も好まし
くは約９７％より多い。制限条件下のトリプシン消化は
また、アミノ酸１２６付近から下流の種々の部分の配列
を除去する。本発明者等の研究に係る組換えガンマイン
ターフェロンのこのような制限トリプシン消化物は、ア
ミノ酸１２５(先頭メチオニンを含めると１２６),１２
９,１３１及び１３４にわたる種々の種を含む。これら
の種は、アミノ酸１２５付近から１２９付近に伸びる場
合、実質的に低下するとしても活性を保持している。少
なくともほぼ１２９個のアミノ酸、特に少なくとも１３
１個のアミノ酸を有する種、すなわち約１２９〜１４３
個のアミノ酸を有する種が本質的、又機能的に完全な活
性を保持している。 【００２０】以上のことから明らかなように、本発明
は、上記の完全配列を有する組換えガンマインターフェ
ロンだけでなく、アミノ酸１４３を欠くか又はＺ→アミ
ノ酸１４３のアミノ酸配列(但し、Ｚはアミノ酸１２７,
１２８,１２９,１３０,１３１,１３２,１３３,１３４,
１３５,１３６,１３７,１３８,１３９,１４０,１４１又
は１４２である)を欠く種々の組換えガンマインターフ
ェロン及びこれらの混合物をも含む。本発明の組換えガ
ンマインターフェロンをコードしている二本鎖ＤＮＡ配
列が、上記の完全配列をコードしているＤＮＡ配列だけ
でなく、上記した種々のカルボキシ末端を切り取ったア
ナログのみをコードしている配列をも含むことも同様に
明らかであろう。この種々のカルボキシ末端を切断した
場合には次に続くコドンが翻訳終了シグナルをコードす
る。 【００２１】本明細書中、「組換えガンマインターフェ
ロン」とは、組換えＤＮＡ技術によって得られる複製可
能な発現ベヒクルから形質転換細胞中で発現されるポリ
ペプチド(これを産生する細胞によってグリコシル化さ
れているかいないかにかかわらず)を意味する。本発明
のポリペプチドは、天然ヒトガンマインターフェロンに
特有の性質即ち、程度の差はあれ多少ともヒトに於ける
抗ウィルス活性及び抗細胞増殖活性並びにpＨ２に於け
る不安定性を示す。 【００２２】本明細書に記載した組換えガンマインター
フェロンは、本発明の目的として少なくても１〜約１２
６のアミノ酸を各々有する前記の如きポリペプチドの２
個の組合せ(各ポリペプチドは同数又は異なる数のアミ
ノ酸を有し得る)として定義される「二量体」を形成する
と考えられる。化学結合形成機構に関する性質は充分に
は解明されていないが、共有結合以外の結合であると思
われる。二量体を生ずる結合は自然に起こるようであ
り、本明細書に記載する系では不可避であると思われ
る。従って、本発明の組換えガンマインターフェロンを
投与するときには、通常二量体の形態であろう。 【００２３】更に、別に特徴づけられた組換えガンマイ
ンターフェロンに関する文献(８,９)の開示と同様に、
本明細書中に開示した組換えガンマインターフェロン
中、アミノ酸１２６付近の上流若しくは下流又はＣ末端
部分で、保有するインターフェロン活性を損うことがな
ければ、アミノ酸の置換又は付加、特に１個のアミノ酸
の置換及び複数のアミノ酸の付加又は置換が可能である
と理解すべきである。本発明の範囲を超えることなく、
前記の如き置換もしくは付加をなし得ることは当業者に
は明らかであると思われる。さらに本発明の組換えガン
マインターフェロンは完全配列(図１および図２参照)の
改変種及び対立変異種であって完全配列のものと同等、
あるいはそれ以上の生物学的活性を持つ種を包含する。 【００２４】本発明の特徴として、精製した組換えガン
マインターフェロンは実質的にヒト由来の他のタンパク
を含まないであろうし、この特徴によって、今まで入手
可能であった天然のヒトガンマインターフェロン組成物
とは区別されるであろう。 【００２５】本発明は、(処方前に)約９５％より高純
度、好ましくは約９８％より高純度の組換えガンマイン
ターフェロン組成物を包含し、このため、該組成物は今
までに入手可能であった天然のガンマインターフェロン
と区別される。 【００２６】同様に、Ｎ末端アミノ酸残基がメチオニン
である本発明の具体例の１つの組換えガンマインターフ
ェロンはヒトの体内で産生されるガンマインターフェロ
ンと区別され、ＣＹＳ−ＴＹＲ−ＣＹＳの欠失以外にも
同様な理由で、Ｇray等(６)が報告した配列を有するイ
ンターフェロンとは区別されるであろう。 【００２７】本明細書中、複製可能な発現ベヒクルと
は、二本鎖ＤＮＡ、好ましくはプラスミドを意味し、こ
れは、複製開始領域、プロモーター又はプロモーター−
オペレーター、リボソーム結合部位をコードする配列、
翻訳開始シグナルコドン及びこれらと適切な解読相にあ
り所望の組換えガンマインターフェロンをコードしてい
る遺伝子、更にこれに続く翻訳終了コドンから成る。現
在では、組換えＤＮＡ技術の一般的技術及び用語は当業
者には充分理解されており、いずれにせよ当業者は、本
発明の全ての具体例及び合法的に均等であると認識され
る例の実施に関するバックグラウンド情報として必要な
変更を加えて(１１)を参照できるであろう。 【００２８】 【実施例】 Ａ．クローニング 参考文献(６)及び特開昭５８−９０５１４号公報の記載
に従い、誘発ヒト末梢血リンパ球から得たメッセンジャ
ーＲＮＡを用いて、ガンマインターフェロンcＤＮＡ配
列を有する組換えＤＮＡクローンを調製した。クローン
p６７のＤＮＡ配列を図１および図２に示す。５'−非翻
訳領域に続いて、２３個のアミノ酸から成る前駆体即ち
シグナルペプチドをコードしている６９個のヌクレオチ
ド,１４３個のアミノ酸から成る成熟インターフェロン
ポリペプチドをコードしている４２９個のヌクレオチド
及び３'−非翻訳配列を形成する５８７個のヌクレオチ
ドがある。 【００２９】Ｂ．発 現 １．Ｅ．coliによる例 Ｅ ．coli中で組換えＩＦＮ−γを高レベルで発現させる
ためには、シグナルペプチドのＡＴＧ(アミノ酸Ｓ１)で
はなく、成熟ポリペプチドのグルタミンコドン(アミノ
酸１)の直前のＡＴＧコドンからタンパク合成を開始す
べきである(図１および図２参照)。Ｅ．coli中で直接に
p６７のcＤＮＡインサートを発現させるためにとった手
順の概略を図３に示す。Ｇray等(６)のcＤＮＡインサー
トをＥ．coli中で発現するために使用したアプローチと
同様のアプローチをとった。 【００３０】シグナルペプチドコード領域を除去するた
めに、推定成熟コード配列のコドン２に位置するＡvaＩ
Ｉ制限部位を用いた。２種の合成デオキシオリゴヌクレ
オチドを、アミノ酸１及び２のコドンを再生し、ＡＴＧ
翻訳開始コドンを組み込み且つＸbaＩ粘着性末端を作成
するようにデザインした。これらの２種のオリゴマー
を、cＤＮＡインサートの残りに結合して、１４４個の
アミノ酸から成るポリペプチドをコードし且つ両端にＸ
baＩ及びＰstＩ部位を有する１０６３塩基対の合成−天
然ハイブリッド遺伝子を組み立てた。この遺伝子をプラ
スミドpＬeＩＦＡ２５(１０)のＸbaＩ及びＰstＩ部位の
間に挿入して、発現プラスミドpγ−ＣＹＣ５を作製し
た。このプラスミドでＥ．coli Ｗ３１１０株(Ｆ-,
λ-,原栄養株protrophic)(ＡＴＣＣ Ｎo．２７３２５)
を形質転換して、宿主−ベクター系Ｅ．coli Ｗ３１１
０／pγ−ＣＹＣ５を得た。 【００３１】２．培養細胞の例 図１および図２に示したようなＮ末端アミノ酸を含む成
熟ガンマインターフェロン遺伝子からの産物であること
を確認するために、図１および図２に示したようなシグ
ナルペプチド及びガンマインターフェロンの双方をコー
ドしている遺伝子を、放射活性標識システイン及びメチ
オニンの存在下でＣＯＳ−７細胞(１６)中で発現させた
(Ｅ．coliによる発現の場合と異り、ここに例示したよ
うな哺乳動物細胞系の発現産物はＮ末端メチオニンを欠
いている)。 【００３２】６０mmペトリ皿中のＣＯＳ−７細胞の集密
単層(confluent monolayer)に、改良ＤＥＡＥ−デキス
トラン法を使用してＤＮＡをトランスフェクトしたもの
を２組調製した。ＤＮＡ添加の３日後、培地を除去し
た。各プレートに、１００μＣiＳ35−メチオニン又は
Ｓ35−システインを添加したＤＭＥＭ２mlを加えた。放
射活性標識アミノ酸の存在下で１６時間インキュベート
した後、培地を除去し、抗ガンマインターフェロンモノ
クローナル抗体又は抗ＨＢsＡgモノクローナル抗体を第
１抗体としウサギ抗マウスＩgＧ抗体(Ｃappell Ｉn
c．)を第２抗体として５００μlの免疫沈降を実施し
た。前記抗体との反応及びその後のスタフィロコッカス
(Ｓtaphlycoccus)Ａ細胞(Ｃalbiochem)への結合は、
Ｐ．Ｂerman等によって記述されている(１８)。サンプ
ルをＳＤＳ−メルカプトエタノール中に再懸濁し、１０
％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動にかけた。ゲルを
エタノール中７％酢酸で固定し、Ｅnhance(Ｎew Ｅngl
and Ｎuclear)蛍光溶液に浸し、乾燥し、Ｋodak ＡＲ
５フィルム及び増感スクリーン(Ｄupont)を使用して２
週間露光させた。 【００３３】本研究に使用したプラスミドはpＳＶγ６
９(１１)、pＤＬＲＩ(１９)(Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原
発現ベクター,pＳＶγ６９の前駆体)及びpＤＬ ＲＩγ
Ｓau(pＳＶγ６９(１１)の８３０bp Ｓau３Ａ断片を
含有するポリシストロンプラスミドであり、pＤＬ Ｒ
ＩのＥcoＲＩ部位に挿入されたガンマインターフェロン
をコードしている全配列を含むもの)であった。後者の
プラスミドはガンマインターフェロン及びＨＢsＡg双方
のコード領域を含む転写産物を産生する。 【００３４】抗ガンマインターフェロン抗体(Ａ)又は抗
ＨＢsＡg抗体(Ｂ)と反応するＳ35−システイン及びＳ35
−メチオニン標識タンパクを比較すると、pＤＬ ＲＩ
−γＳauでトランスフェクトしＳ35−システインで標識
した細胞では、抗ガンマインターフェロン抗体を使用し
て特異的に免疫沈降する物質は、グリコシル化物(ＭＷ
２９,０００)の位置に移動するものもモノグリコシル化
物(ＭＷ１８,０００)の位置に移動するものもないのに
対し、これとは対照的に、Ｓ35−メチオニン標識細胞で
はガンマインターフェロンの免疫沈降が生じた。 【００３５】Ｃ．発酵生産 Ｅ ．coli Ｗ３１１０／pγ−ＣＹＣ５を用いる組換え
ヒトインターフェロン−ガンマ(rＩＦＮ−γ)の産生
は、容量１０乃至１０００lの範囲のバッチで実施す
る。発酵後、インターフェロンを含有するＥ．coli細胞
をブロスから回収し、rＩＦＮ−γを単離精製する。以
下に発酵及び細胞回収方法を記載する。 【００３６】１)ストックカルチャーの調製及び維持 次の組成; バクトトリプトン １０g／Ｌ 酵母抽出物 ５g／Ｌ 塩化ナトリウム ５〜１０mg／Ｌ を有する無菌培地１５０〜５００mＬを含有する無菌の
バッフル板付培養フラスコ中で、ストックカルチャーを
調製する。 【００３７】次に、Ｅ．coli Ｗ３１１０／pγ−ＣＹ
Ｃ５の一次培養物を培地に接種する。次いで、５５０nm
に於ける吸光度が約１．０になるまで、接種したフラス
コを振盪器上２５〜３７℃でインキュベートする。３０
％(Ｖ／Ｖ)のジメチルスルホキサイド約５０％(Ｖ／Ｖ)
をブロスに添加する。直ちに１mＬのアリコートを無菌
バイアルに分与し、ふたを閉める。バイアルは−６０℃
以下で保存する。各々の発酵は、接種用複製ストックカ
ルチャーを用いて開始する。 【００３８】２)接種物の調製 接種物を振盪フラスコ又は小形ファーメンター内で前記
の培地(ＬＢブロス)を用いて調製する。約３７℃で約８
時間インキュベートした後、接種物をファーメンターに
移す。接種物の容量は、発酵容量の２乃至１０％であ
る。 【００３９】３)発 酵 組換えインターフェロン−ガンマの産生は、約１０乃至
１０００lの作用容積を有するファーメンター内で行な
う。発酵培地は、１l当り次の組成を有する。 グルコース(＊) ５０ − １００g 硫酸アンモニウム ４．０ − ８．０g 一塩基性リン酸カリウム ３．０ − ５．０g 二塩基性リン酸カリウム ５．０ − ８．０g 硫酸マグネシウム七水塩 ０．５ − ５．１g クエン酸ナトリウム二水塩 ０．５ − ２．０g ＵＣＯＮ ＬＢ−６２５ ０．５ − ２．０mＬ 塩化第二鉄六水塩 ０．００５ − ０．１５g 硫酸亜鉛七水塩 ０．００１ − ０．１５g 塩化コバルト六水塩 ０．００１− ０．００５g モリブデン酸ナトリウム二水塩 ０．００１ − ０．００５g 硫酸第二銅五水塩 ０．００１ − ０．００５g ホウ酸 ０．００１ − ０．００５g 硫酸マンガン一水塩 ０．００１ − ０．００５g 塩酸 ０．０ − １．０mＬ チアミン−ＨＣl ０．０ − ０．１g テトラサイクリン−ＨＣl ０．００１ − ０．０１g Ｌ−トリプトファン(＊) ０．１ − ０．５g 酵母抽出物 ２．０ − ８．０g ３−β−インドールアクリル酸 ０．０２ − ０．１０g (＊)グルコース及びトリプトファンは一部を最初にファーメンターに入れ、残部 は発酵中に供給する。 培地中の成分は、発酵に使用する前に、熱処理又は濾過
により殺菌する。発酵は２５〜４０℃で行う。他の操作
条件は次の通りである; 撹拌( rpm) １００〜１０００ 通気( vvm) ０．５〜１．５ (必要なときには酸素を補充) pＨ ６．５〜７．５ (水酸化アンモニウムの添加により調節) 【００４０】４)精 製 a)組換えガンマインターフェロンの抽出 塩及びpＨ６乃至９、好ましくは約９の適当な緩衝液を
含有する培地中にＥ．coli細胞を懸濁させる。ガウリン
(Ｇaulin)ミルの如き高圧コロイドミル中で細胞懸濁液
をホモゲナイズして組換えガンマインターフェロンを抽
出する。充分なポリエチレンイミンを前記溶液に添加し
て、０．１乃至１％(Ｗ／Ｖ)の溶液に調製する。上清に
ガンマインターフェロンが含まれている。 【００４１】b)組換えガンマインターフェロンのシリカ
をベースとする吸着剤上での部分精製 pＨ６乃至９の範囲の適当な塩溶液で洗浄して不純物を
除去したシリカをベースとする吸着剤に上記(a)の上清
を吸着させる。０．５乃至１．０Ｍの塩化テトラメチル
アンモニウムを含有する溶液を用いて組換えガンマイン
ターフェロンを溶出する。本工程の全操作はpＨ７乃至
９で行なう。 【００４２】c)アニオン交換クロマトグラフィーによる
組換えガンマインターフェロンの部分精製 上記(b)の溶出液を透析し、アニオン交換クロマトグラ
フィー媒体に吸着させ、次いで洗浄して不純物を除去す
る。増大する塩勾配で組換えガンマインターフェロンを
溶出する。本工程で使用できる典型的アニオン交換樹脂
には、カルボキシメチルセルロース及びスルホエチルセ
ルロースがある。全操作はpＨ７乃至９で行なう。 【００４３】d)リン酸カルシウムゲルクロマトグラフィ
ーによる組換えガンマインターフェロンの部分精製 上記(c)の溶出物をリン酸カルシウム媒体に吸着させ、
次いで洗浄して不純物を除去する。リン酸塩濃度勾配中
で塩濃度を増加させて組換えガンマインターフェロンを
溶出する。本工程の全操作は、pＨ７乃至９で実施す
る。 【００４４】e)アニオン交換クロマトグラフィーによる
組換えガンマインターフェロンの部分精製 上記(d)の溶出物を透析し、アニオン交換クロマトグラ
フィー媒体に吸着させ、次いで洗浄して不純物を除去す
る。アニオン交換媒体から塩濃度を増大する勾配で組換
えガンマインターフェロンを溶出する。典型的なアニオ
ン交換クロマトグラフィー媒体は、カルボキシメチルセ
ルロース及びスルホエチルセルロースである。本工程の
全操作はpＨ７乃至９で実施する。 【００４５】f)ゲルパーミエーションクロマトグラフィ
ーによる組換えガンマインターフェロンの部分精製 上記(e)の溶出物をゲルパーミエーション媒体に適用
し、カラムを塩含有溶媒で展開する。組換えガンマイン
ターフェロンを含有する適当な画分をプールして、精製
バルクを得る。本工程の全操作はpＨ７乃至９で行な
う。 【００４６】g)Ｃ末端アミノ酸配列 Ｃ末端配列を決定するために、サンプルを７０％蟻酸中
に透析し、臭化シアンで開裂し、得られたペプチドをＡ
ltex Ｕltrasphere Ｃ８逆相ＨＰＬＣカラムで分離し
た。ピークを集め、アミノ酸及びその配列解析を行っ
た。検知されたＣ末端ペプチドは、−ＬＥＵ−ＰＨＥ−
ＡＲＧ−ＧＬＹ−ＡＲＧ(残基１３５〜１３９、図１お
よび図２)であり、ある場合には他のペプチドが追加さ
れており、その配列は−ＬＥＵ−ＰＨＥ−ＡＲＧ−ＧＬ
Ｙ−ＡＲＧ−ＡＲＧ−ＡＬＡ−ＳＥＲ−ＧＬＮ(残基１
３５〜１４３、図１および図２)であった。これらの２
種のペプチドの割合を決定するために、(アミノ酸分析
により)既知の量を逆相ＨＰＬＣカラムにかけ、それぞ
れのピークの高さを測定した。３回の産生において長鎖
のペプチド(１３５〜１４３、図１および図２)の含有量
はそれぞれ約２％未満であり、残りは５量体(アミノ酸
５個のもの)であった。このデータは、Ｅ．coliによる
１３９個のアミノ酸含有量及び１４３個のアミノ酸含有
のガンマインターフェロン(いずれの場合も存在するＮ
末端メチオニンを含まない)の混合物の産生と一致する
ものであり、それぞれの相対比率は約９８:２％であ
る。 【００４７】５)製剤化 前記工程に従い製造した組換えガンマインターフェロン
を、表１の好ましい非経口投与用の製剤にする。 【００４８】 【表１】表１ バイアル１本当りの量 成 分 0.5mgバイアル(1) 2.0mgバイアル(2) 組換えヒトインターフェロン−γ ０．５ ２．０ マンニトール １００ ８０ コハク酸二ナトリウム六水塩 １２．４ ９．９ グリシン ５．６ ４．５ 塩化ナトリウム ４．４ ３．５ ポリソルベート２０ ０．８ ０．６ コハク酸 ０．５ ０．４ (1) 注射用にはバイアルを２．５mlの無菌水で再構成する。 (2) 注射用にはバイアルを２．０mlの無菌水で再構成する。 【００４９】本発明のインターフェロンは、医学的に適
切な投与量範囲、例えば体表面積１Ｍ2当り１．０mgで
使用し得る。 【００５０】Ｄ．トリプシン消化を経た種々のガンマイ
ンターフェロンの活性測定 カルボキシ末端の違った種々のガンマインターフェロン
の活性を決定するために、上記のＥ．coliの例に記述し
たように調製したガンマインターフェロンを種々の程度
にトリプシン消化し、前述のＡ５４９細胞を用いるＣＰ
Ｅアッセイによって試験した。 【００５１】前述のように調製した組換えガンマインタ
ーフェロン(r−Ｈu ＩＦＮ−γ)の試料(６．５mg)をＳ
ephadex Ｇ−２５モレキュラーシーブ小カラム(ＰＤ−
１０,Ｐharmacia)によりpＨ８．５の０．１０Ｍ重炭酸
アンモニウム緩衝液中に脱塩し、最終タンパク濃度２．
１mg／mlとした。希釈トリプシン溶液(ＷorthingtonＴ
ＰＣＫ トリプシン,０．００１Ｍ ＨＣl中１０μg／m
l,１６μl)をr−ＨuＩＦＮ−γ溶液の１．９ml(４．０m
g)に加え、混合して室温でインキュベートした(トリプ
シン:タンパク質＝１:２５,０００)。インキュベート混
合物から、１時間後、３．５時間後、５．７５時間後、
８時間後及び１０．２５時間後にそれぞれ試料を取り出
した。８時間目に１５μl(１５０ng)の希釈トリプシン
溶液を再度加えて１０．２５時間後の最終試料採取のた
めの反応を促進した。 【００５２】各時点の試料の各成分への分画化はＢio
Ｒad Ｂiogel ＨＰＨＴカラムを使用するＷaters Ｈ
ＰＬＣシステムで行なった。重炭酸緩衝液中の各時点で
のアリコートは試料採取時にカラムに直接(手操作によ
る注入により)入れた。０．０１Ｍリン酸ナトリウム,p
Ｈ８．０,３０μＭ塩化カルシウムによりカラムを平衡
化し、平衡化緩衝液の直線勾配及び０．５Ｍリン酸ナト
リウム緩衝液,pＨ８．０,０．６μＭ塩化カルシウムを
使用してタンパクをカラムから溶出した。 【００５３】２１４nm及び２８０nmにおける吸光度によ
り検出したタンパクのピークを分取し、分析に使用する
まで４℃で密閉保存した。選択されたピークに対する典
型的な分析は以下のものを含む。 １．ヒト肺癌由来の細胞Ａ５４９／ＥＭＣウィルスアッ
セイシステムにおける抗ウィルス活性(１３)。 ２．Ｌaemmliゲルシステムを使用する標準法によるＳＤ
Ｓ／ＰＡＧＥ分画化(１４)。 ３．市販の色素(Ｐierce Ｃhemical Ｃo．,Ｒockfoe
d, ＩＬ．)結合法によるタンパク濃度決定。 ４．臭化シアンによるタンパク開裂とそれに続くペプチ
ド同定のためのＨＰＬＣ分析(１５)。 【００５４】タンパクの試料は７０％蟻酸に対して一晩
透析(１２,０００−１４,０００ＭＷカットオフ)し、ロ
ータリーエバポレーションにより乾燥し、５００μlの
７０％蟻酸に再度懸濁した。１２×７５mmガラス管中の
各サンプルに固体臭化シアンを加え、密封して溶解する
まで混合し、アルミホイルをかけ、通気のよい場所で室
温において一晩インキュベートした。 【００５５】開裂の後、試料をロータリーエバポレーシ
ョンにより乾燥し、０．５mlの水に再懸濁し、再度乾燥
した。ＨＰＬＣによる分画化に先立ち、試料を５０％蟻
酸中に再溶解してタンパク濃度約１mg／mlとした。 【００５６】Ａltex Ｕltrasphere Ｏctylカラム及び
トリフルオロ酢酸／水−トリフルオロ酢酸／アセトニト
リル直線溶出勾配を使用するＷaters ＨＰＬＣシステ
ムにより、ペプチドを分画化した。可能な場合はアミノ
酸分析によりペプチドを同定した。短縮された形態のr
−Ｈu ＩＦＮ−γの比較データを表２に示した(aaはア
ミノ酸を表わす)。 【００５７】 【表２】表 ２ r−ＨuＩＦＮ−γ(形態*) Ｃ末端** 比活性(％) 139aa:143aa＝98:2 ＬＦＲＧＲ 100 (比較用) 131aa ＡＡＫＴＧＫＲＫＲ 40−50 129aa ＡＡＫＴＧＫＲ 6−9 125aa ＡＡＫ 約 1 ＊ 図１および図２の番号付けによるが、それぞれ
において存在するＮ末端メチオニンは除く。 ** 一文字の略記号はアミノ酸残基の常用の略記号であ
る。 Ａ＝アラニン Ｆ＝フェニルアラニン Ｇ＝グリシン Ｋ＝リジン Ｌ＝ロイシン Ｒ＝アルギニン Ｔ＝スレオニン 【００５８】１２６aa〜１４３aaの範囲(Ｎ末端メチオ
ニンは含まない)の任意の長さのガンマインターフェロ
ンは適切に末端調整された遺伝子から発現されることが
わかるであろう。例えば図１および図２に示された遺伝
子は、 【化１４】 にＦnu４Ｈ制限部位を有する。Ｆnu４Ｈによる制限の後
に、“終了"コドンの付いた所望の配列をコードする合
成オリゴヌクレオチド及び発現プラスミド中で使用可能
な制限部位に適合するリンカーをガンマインターフェロ
ン遺伝子の前部に結合することができる。例えば、配
列: (Ｘは１個以上のアミノ酸をコードする)はＦnu４ＨとＢ
glＩＩでプラスミドを消化した後に前記例示のＥ．coli
発現ベヒクルに結合でき、結合の結果の終了コドンは下
記のようになる。 【化１５】 【００５９】Ｅ．アッセイ,細胞変性阻害 １．テスト方法 Ｅagle's ＭＥＭ中に４×１０5細胞／mlの含有量に調
整したヒト肺癌由来(Ａ５４９)細胞(ＡＴＣＣ Ｎo．Ｃ
ＣＬ１８５)の懸濁液１００μlを各ウェルに加える。プ
レートを３７℃で約１８時間インキュベートする。１８
〜２４時間インキュベートした後、第１列目の各ウェル
に培地８０μlを追加する。インターフェロン活性を測
定する試料２０μlを第１列目のウェルに加える。第１
列の各ウェルの内容物１００μlをそれぞれの横の第２
列目のウェルに移す。ウェルの内容物１００μlを次列
へ移し、これを全部で１０回繰り返して、第１１列目ま
で移す。２４時間インキュベートした後、セルコントロ
ールを除き全てのウェルに脳心筋炎ウィルス５０μlを
感染させ、感染後２４時間後の細胞変性効果が１００％
となるよう感染を繰り返す。トレイをふたで覆い３７℃
で２４時間インキュベートする。全てのウェルから液体
を抜き、５〜１５分間０．５％クリスタルバイオレット
で染色する。細胞の生存能力を染色細胞を観察すること
により測定する。試料のタイターは、５０％生存可能細
胞が残存する希釈度の逆数である。 【００６０】２．計 算 全ての試料の活性を、下記により計算されるＲeference
Ｕnits Ｃonversion Ｆactorによって規格化する。 【数１】 【００６１】３．比活性 ＮＩＨによるＩＦＮ−γ基準物質により標準化されたＡ
５４９／ＥＭＣＶバイオアッセイシステムを使用する
と、組換えヒトＩＦＮ−γの抗ウィルス比活性は、Ｎ末
端に３つの付加アミノ酸(ＣＹＳ−ＴＹＲ−ＣＹＳ)のつ
いた改変rＩＦＮ−γ分子の活性より約３倍高い。 【００６２】４．安定性 上記の生物学的活性の測定(Ａ５４９／ＥＭＣＶ)による
と、調合後バイアル中に保存してあるrＩＦＮ−γは、
生産後３ケ月間(４℃で貯蔵)安定である(生物学的活性
の損失はない)。 【００６３】Ｆ．他のタイプのヒトインターフェロンと
比較したrＩＦＮ−γの抗細胞増殖活性 １．材料及び方法 rＩＦＮ−γ：溶液形態のＣＹＳ−ＴＹＲ−ＣＹＳ−欠
失組換えインターフェロン−γ(２０mＭコハク酸ナトリ
ウム,０．１５ＭＮaＣl,pＨ６)。前記のＥ．coliの例に
依る方法で調製した。比活性は２．７×１０7ＩＵ／mg
タンパクであった。 ＣＴＣ−rＩＦＮ−γ：溶液形態の、分子のＮ末端に
“ＣＹＳ−ＴＹＲ−ＣＹＳ"構造を有する組換えインタ
ーフェロン−γ(２０mＭコハク酸ナトリウム,０．１５
Ｍ ＮaＣl,pＨ６)。比活性は１．３×１０7ＩＵ／mgタ
ンパクであった。 ＨuＩＦＮ−β：ヒト二倍体包皮線維芽細胞内で産生さ
れたヒト線維芽細胞インターフェロンの凍結乾燥物で、
比活性は１×１０7ＩＵ／mgタンパクより高く、Ｔoray
Ｉnd．,Ｉnc．により調製されたもの。バイアル中にＨ
uＩＦＮ−β３×１０6ＩＵ及びヒト血清アルブミン３mg
を含む。 ＨuＩＦＮ−α：Ｄr．Ｋ．Ｃantell,Ｃentral Ｐublic
Ｈealth Ｌaboratory,Ｈelsinki,Ｆinlandより供与
された溶液形態のヒト天然白血球インターフェロンで、
比活性は４×１０6ＩＵ／mgタンパクである。 コントロール：ヒト血清アルブミン３mgを含有するプラ
シーボ。 培 養 培 地：ＨeＬa,ＫＢ,ＨＭＶ−１,ＦＬ及びＪ−１
１１細胞については、１０％熱不活化初乳前新生子牛血
清(ＰＮＣＳ)及び２mＭ Ｌ−グルタミンを添加したＥa
gle's最少必須培地を使用した。Ａ５４９細胞には１０
％熱不活化ＰＮＣＳ、１００μg／mlカナマイシン及び
２mＭ Ｌ−グルタミンを含有するＤulbecco'最少必須
培地を使用した。表３に挙げた残りのヒト細胞には熱不
活化ＰＮＣＳ及び１００μg／mlカナマイシンを添加し
たＲＰＭＩ１６４０培地を使用した。 【００６４】２．抗細胞増殖活性の評価 培養培地に懸濁した試験細胞をプラスチック組織培養プ
レートに５×１０3細胞／０．５ml／ウェルの濃度で接
種した。続いて対応する培地(０．５ml)に溶解した種々
の量のインターフェロンを添加した(０日)。培養は３７
℃において５％ＣＯ2,９５％空気の湿潤大気中で行っ
た。浮遊増殖型細胞については、６日目に培養培地を除
去し、懸濁培養液中の細胞をＣoulterカウンターでの細
胞計数のために直接Ｉ soton ＩＩ(Ｃoulter Ｅlectro
nics Ｉnc．)中に懸濁した。プラスチック容器中でシ
ートを形成する細胞は、測定に際し、Ｉ soton ＩＩ中
での単一細胞懸濁物を調製するために０．０５％トリプ
シン−０．０２％ＥＤＴＡで前処理した。インターフェ
ロンの抗細胞増殖活性は、コントロール培養物(インタ
ーフェロンなし)と比較して細胞数を５０％減少するの
に要する抗ウィルス単位数として表わした(ＩＣ50,ＩＵ
／ml)。 【００６５】 【表３】表３ 他種インターフェロンと比較したrＩＦＮ−γの抗細胞増殖活性 試験細胞の組織学的 IC50(IU/ml) 細胞 タイプ又は起源 rIFN-γ CTC-rIFN-γ HuIFN-β HuIFN-α KATO-III 胃癌Siglet-ring細胞 1.2 1.3 − − MKN-1 胃扁平上皮癌 37 330 − − MKN-28 高分化型胃腺癌 ＞103 ＞103 − − MKN-45 低分化型胃腺癌 ＞103 ＞103 − − MKN-74 高分化型胃腺癌 ＞103 ＞103 − − HeLa 子宮頸癌 22 132 446 ＞103 KB 鼻咽腔癌 54 330 ＞104 ＞104 HMV-1 無メラニン性悪性黒色腫 38 45 130 820 SEKI-F 悪性黒色腫 135 ＞103 137 663 FL 羊膜(非悪性腫瘍起源) 38 45 ＞103 ＞104 PC-8 低分化型肺腺癌 ＞103 ＞103 ＞104 ＞103 PC-12 肺腺癌 ＞103 ＞103 ＞104 ＞103 A549 肺胞癌 55 − − − QG-56 肺扁平上皮癌 5 − − − QG-90 未分化型肺小細胞癌 5.5 − − − Daudi Burkitt リンパ腫 ＞103 ＞103 47 7 Namalwa Burkitt リンパ腫 ＞103 ＞103 − − J-III 単球性白血球 25 84 204 ＞１０３ 【００６６】表３に示した通り、ｒＩＦＮ−γの抗細胞
増殖活性はヒト細胞種により著しく異っていた。この場
合、ＫＡＴＯ−ＩＩＩすなわち胃癌siglet−ring細胞は
高度に敏感で１．２ＩＵ／mlのＩＣ50を示すが、Ｄaudi
細胞すなわちＢurkittリンパ腫はＩ型インターフェロン
(ＨuＩＦＮ−α,ＨuＩＦＮ−β)に対しては高度に敏感
であるのに対して、rＩＦＮ−γを含むＩＩ型インター
フェロンに対しては非感受性であった。肺腺癌(ＰＣ−
８,ＰＣ−１２)は試験した全てのインターフェロンに対
して非感受性であった。rＩＦＮ−γとＣＴＣ−rＩＦＮ
−γ間の抗細胞スペクトルは殆んど同一であるが、一般
的にrＩＦＮ−γの抗細胞増殖効果はＣＴＣ−rＩＦＮ−
γのそれよりも優れているようである。４つのインター
フェロンを比較した場合、Ｄaudi細胞を除いてrＩＦＮ
−γにおいて最も高い効果が得られた。 【００６７】Ｇ．in vitroの種々の液中におけるrＩＦ
Ｎ−γとＣＴＣ−rＩＦＮ−γの安定 性の比較 １０mgヒト血清アルブミン,リン酸緩衝液及び等張量の
ＮaＣlをそれぞれ含有している、前記のＥ．coliの例に
従って調製したrＩＦＮ−γの凍結乾燥物１×１０6ＩＵ
／バイアル及びＮ末端に“ＣＹＳ−ＴＹＲ−ＣＹＳ"構
造を有するrＩＦＮ−γの凍結乾燥物１×１０6ＩＵ／バ
イアルを蒸留水で溶解し、濃度を４×１０4ＩＵ／mlに
調整した。 【００６８】インターフェロンのin vitroにおける安
定性は、種々の液体中における残存抗ウィルス活性を測
定することによって評価した。上記のインターフェロン
溶液を、３７℃又は４℃の水浴インキュベーターで１０
分間プレインキュベートした９倍容量のウサギ血清、ヒ
ト血清あるいはＥagle's ＭＥＭに加えることによって
インキュベートを開始した。０,０．２５,０．５,１,
４,８,２４,７２及び１４４時間後にアリコートを採取
し、９倍容量のＥagle's ＭＥＭと混合した。試料は、
インターフェロンタイターの測定まで、ディープフリー
ザー中において−８０℃で凍結保存した。インターフェ
ロンタイターは、Ｓindbisウィルスを感染させたヒト羊
膜細胞(ＦＬ細胞)を使用するＣＰＥ50法により測定し
た。結果は初期タイターに対する残存タイターのパーセ
ンテージとして図４に示した。 【００６９】Ｅ．coli及びＣＯＳ−７細胞中で発現させ
る好ましい具体例を参照して本発明を例示したが、本発
明の組換えガンマインターフェロンが他の細菌株,酵母
及び組織培養系の如き他の系内に於いても産生され得る
ことは明らかである。特開昭５８−９０５１４号公報及
び参考文献(６)参照。即ち、本発明は最も好ましい具体
例に限定されず、むしろ前記特許請求の範囲の全ての適
法範囲の均等物に亙る。 【００７０】参 考 文 献 １．Ｄ.Ｇoeddel et al.,Ｎature,287,411(1980) ２．Ｄ.Ｇoeddel et al.,Ｎature,290,20(1981) ３．Ｅ.Ｙelverton et al.,Ｎucleic Ａcids Ｒesearc
h,9,731(1981) ４．Ｇutterman et al.,Ａnnals of Ｉnt.Ｍed.93,399
(1980) ５．Ｄ.Ｇoeddel et al.,Ｎucleic Ａcids Ｒesearch,
8,4057(1980) ６．Ｐ.Ｇray et al.,Ｎature,295,503-508(1982) ７．Ｒ.Ｄerynck et al.,Ｎucleic Ａcids Ｒesearch,1
0,3605(1982) ８．Ｒ.Ｄerynck et al.,Ｉnterferon Ｓcientific Ｍe
moranda,Ａugust 1982,Ｍemo-Ｉ-Ａ1193/2 ９．Ｒ.Ｄerynck et al.,“Ｅxpression of Ｈuman Ｉn
terferon Ｇamma in Ｈeterologous Ｓystems" in Ｅxp
erimental Ｍanipulation of Ｇene Ｅxpression,Ａcad
emic Ｐress,Ｉnc.247(1983) 10．Ｄ.Ｇoeddel et al.,Ｎature,287,411-416(1980) 11．Ｄ.Ｇoeddel et al.,欧州特許出願公開第0,077,670
号 12．Ｗ.Ｅ.Ｓtewart ＩＩ,“Ｔhe Ｉnterferon Ｓyste
m",Ｓpringer Ｖerlag(Ｎew Ｙork)pp.13-26(1979) 13．Ｓtewart,“Ｉnterferon Ｓystems" 'Ｅd,:Ｓtewa
rt,p.13,Ｓpringer−Ｄerlag,Ｎew Ｙork(1979) 14．Ｌaemmli,Ｎature,227,680(1970) 15．Ｇross,et al.,Ｍethods in Ｅnzymology,ＸＩ,238 16．Ｇluzman,Ｃell,23,175(1981) 17．Ａlton et al.,“Ｐroduction,Ｃharacterization
and Ｂiological Ｅffects of Ｒecombinant ＤＮＡ Ｄ
erived Ｈuman ＩＦＮ−alpha and ＩＦＮ−gamma Ａna
logs",Ｔhe Ｂiology of the Ｉnterferon Ｓystem,Ｄe
Ｍaeyer and Ｓchellekens,Ｅds.,Ｅlselvier Ｓcienc
e Ｐubl.(1983)． 18．Ｂerman et al.,Ｓcience,222,524(1983) 19．Ｓimonsen et al.,Ｍol.Ｃell.Ｂiol 3,2250(1983)
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明の組換えガンマインターフェロン遺伝
子のヌクレオチド配列及びそれから推定されるアミノ酸
配列を示す図である。 【図２】 本発明の組換えガンマインターフェロン遺伝
子のヌクレオチド配列及びそれから推定されるアミノ酸
配列を示す図である。 【図３】 本発明によって直接合成される組換えガンマ
インターフェロンをコードしているプラスミドの調製法
を示す説明図である。 【図４】 本発明のガンマインターフェロンの優れた安
定性を示すグラフである。
子のヌクレオチド配列及びそれから推定されるアミノ酸
配列を示す図である。 【図２】 本発明の組換えガンマインターフェロン遺伝
子のヌクレオチド配列及びそれから推定されるアミノ酸
配列を示す図である。 【図３】 本発明によって直接合成される組換えガンマ
インターフェロンをコードしているプラスミドの調製法
を示す説明図である。 【図４】 本発明のガンマインターフェロンの優れた安
定性を示すグラフである。
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
Ｃ１２Ｎ 1/21 Ａ６１Ｋ 37/66 ＡＢＨＢ
(Ｃ１２Ｎ 1/21 ＡＢＨＦ
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(56)参考文献 特開 昭58−90514（ＪＰ，Ａ)
ＴＨＥ ＢＩＯＬＯＧＹ ＯＦ ＴＨ
Ｅ ＩＮＴＥＲＦＥＲＯＮ ＳＹＳＴＥ
Ｍ 1983 （1983） Ｐ．119−129
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．Ｎ末端から伸延する下記アミノ酸配列： 【化１】（式中、Ｘが水素であってＹはグルタミン残基又はピロ
グルタミン残基であるか、ＸがメチオニンであってＹは
グルタミン残基であり、Ｚは下記アミノ酸配列： 【化２】 の第１２６位ＴＨＲから始まる任意の長さのアミノ酸配
列を表す（但し、第１３９位ＡＲＧ又は第１４３位ＧＬ
Ｎまでのアミノ酸配列は除く）。］で示される天然のヒ
トガンマインターフェロンの特性を示すポリペプチドで
あって、該ポリペプチドは酸に感受性であり、免疫イン
ターフェロン抗血清によって中和され、単量体形でのア
ミノ酸分子量が約１７，０００である。 ２．Ｘがメチオニンである請求項１記載のポリペプチ
ド。 ３．Ｚが第１２６位から第１２９位ＡＲＧまでのアミノ
酸配列である請求項１記載のポリペプチド。 ４．Ｚが第１２６位から第１３１位ＡＲＧまでのアミノ
酸配列である請求項１記載のポリペプチド。 ５．Ｎ末端から伸延する下記アミノ酸配列： 【化３】（式中、Ｘが水素であってＹはグルタミン残基又はピロ
グルタミン残基であるか、ＸがメチオニンであってＹは
グルタミン残基であり、Ｚは下記アミノ酸配列： 【化４】 の第１２６位ＴＨＲから始まる任意の長さのアミノ酸配
列を表す］で示される天然のヒトガンマインターフェロ
ンの特性を示し、酸に感受性であり、免疫インターフェ
ロン抗血清によって中和され、単量体形でのアミノ酸分
子量 が約１７，０００であるポリペプチドを１またはそ
れ以上含有する、抗ウイルス及び抗細胞増殖物質として
有用な組成物（但し、Ｚが第１３９位ＡＲＧまでのアミ
ノ酸配列であるポリペプチドとＺが１４３位ＧＬＮまで
のアミノ酸配列であるポリペプチドを同時に含有する組
成物は除く）。 ６．Ｎ末端から伸延する下記アミノ酸配列： 【化５】（式中、Ｘが水素であってＹはグルタミン残基又はピロ
グルタミン残基であるか、ＸがメチオニンであってＹは
グルタミン残基であり、Ｚは下記アミノ酸配列： 【化６】 の第１２６位ＴＨＲから始まる任意の長さのアミノ酸配
列を表す（但し、第１３９位ＡＲＧまでのアミノ酸配列
は除く）。］で示される天然のヒトガンマインターフェ
ロンの特性を示し、酸に感受性であり、免疫インターフ
ェロン抗血清によって中和され、単量体形でのアミノ酸
分子量 が約１７，０００であるポリペプチドの製造方法
であって、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを含有す
る複製可能な発現ベヒクルで形質転換された細菌または
哺乳動物細胞を適当な培地で培養し生産されたポリペプ
チドを回収することからなる方法。
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| ZA846554B (en) * | 1983-09-20 | 1985-04-24 | Hoffmann La Roche | Immune interferon and method for its purification |
| US4855238A (en) | 1983-12-16 | 1989-08-08 | Genentech, Inc. | Recombinant gamma interferons having enhanced stability and methods therefor |
| MX9203641A (es) * | 1983-12-16 | 1992-07-01 | Genentech Inc | Interferones gamma recombinantes que poseen estabilidad mejorada y metodos biotecnologicos para su obtencion. |
| JPS60172999A (ja) * | 1983-12-20 | 1985-09-06 | Suntory Ltd | 新規な塩基性ポリペプチドおよびその製造法 |
| US4758656A (en) * | 1983-12-26 | 1988-07-19 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Novel human interferon-gamma polypeptide derivative |
| EP0174999B1 (en) * | 1984-03-16 | 1991-04-17 | Biogen, Inc. | Method for improving expression and method thereto |
| DE3414831A1 (de) * | 1984-04-19 | 1985-10-31 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Herstellung von polypeptiden mit human-gammainterferon-aktivitaet |
| IL75302A0 (en) * | 1984-06-06 | 1985-09-29 | Takeda Chemical Industries Ltd | Novel polypeptide and production thereof |
| CA1302320C (en) * | 1984-06-11 | 1992-06-02 | Hideo Niwa | Expression of human cromosomal interferon-_ in animal cells |
| JPS61108397A (ja) * | 1984-10-31 | 1986-05-27 | Green Cross Corp:The | インタ−フエロン−γ蛋白質の製造法 |
| JPS6156195A (ja) * | 1985-03-01 | 1986-03-20 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 新規生理活性ペプチド |
| US4873312A (en) * | 1985-04-25 | 1989-10-10 | Amgen | Method for purifying interferon and composition of matter produced thereby |
| ATE81675T1 (de) * | 1985-04-30 | 1992-11-15 | Takeda Chemical Industries Ltd | Produktion eines proteins. |
| DE3532134A1 (de) * | 1985-09-10 | 1987-03-12 | Basf Ag | Verfahren zur herstellung von proteinen bestimmter n-terminaler struktur mit hilfe von prokaryonten |
| DE3536939A1 (de) * | 1985-10-17 | 1987-04-23 | Hoechst Ag | Biologisch aktive derivate des human-(gamma)-interferons, ihre herstellung und arzneimittel, die solche derivate enthalten |
| EP0275300B1 (en) * | 1986-08-01 | 1996-01-03 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Recombinant vaccine |
| GB8619725D0 (en) * | 1986-08-13 | 1986-09-24 | Hoffmann La Roche | Homogenous interferon fragments |
| JP2653061B2 (ja) * | 1986-12-27 | 1997-09-10 | 武田薬品工業株式会社 | 新規ポリペプチドおよびその製造法 |
| US5157004A (en) * | 1986-12-27 | 1992-10-20 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Polypeptides and production thereof |
| DE3730331A1 (de) * | 1987-09-10 | 1989-03-30 | Basf Ag | Neue polypeptide, verfahren zur herstellung, die vektoren dafuer und arzneimittel daraus |
| AT393690B (de) * | 1987-10-08 | 1991-11-25 | Hoffmann La Roche | Homogene, rekombinante immun-interferonfragmente |
| US5151265A (en) * | 1987-11-03 | 1992-09-29 | Genentech, Inc. | Gamma interferon formulation |
| EP0355460B1 (en) * | 1988-08-24 | 2000-12-27 | American Cyanamid Company | Stabilization of somatotropins by modification of cysteine residues utilizing site directed mutagenesis or chemical derivatization |
| US5198212A (en) * | 1988-10-31 | 1993-03-30 | University Of Lousville Research Foundation Incorporated | Method and compositions for treatment of trauma-associated sepsis with gamma interferon |
| US6068994A (en) * | 1989-08-07 | 2000-05-30 | Chiron Corporation | Ubiquitin expression system |
| BG52073B2 (en) * | 1990-01-24 | 1996-04-30 | Inst Molekuljarna Biolog | Method for the preparation of recombinant human noncystein -interferon, free of n-end methionine |
| EP0546099B1 (en) * | 1990-08-31 | 1994-10-12 | Schering Corporation | Use of human Interferon gamma 4-134 |
| DE4036856C1 (ja) * | 1990-11-19 | 1992-05-27 | Fraunhofer-Gesellschaft Zur Foerderung Der Angewandten Forschung Ev, 8000 Muenchen, De | |
| US5227158A (en) * | 1991-06-10 | 1993-07-13 | Genentech, Inc. | Method of stimulating hepatocyte proliferation by administration of hepatocyte growth factor and gamma-interferon |
| US5328989A (en) * | 1993-03-05 | 1994-07-12 | Schering-Plough | Purification of human interleukin-10 from a cell culture medium |
| JPH08511952A (ja) * | 1993-07-01 | 1996-12-17 | メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド | 組換酵母増殖のための培地 |
| TW249202B (ja) * | 1993-08-13 | 1995-06-11 | Ciba Gerigy Corp | |
| US6977074B2 (en) | 1997-07-10 | 2005-12-20 | Mannkind Corporation | Method of inducing a CTL response |
| US20080076706A1 (en) | 1997-07-14 | 2008-03-27 | Bolder Biotechnology, Inc. | Derivatives of Growth Hormone and Related Proteins, and Methods of Use Thereof |
| US7495087B2 (en) | 1997-07-14 | 2009-02-24 | Bolder Biotechnology, Inc. | Cysteine muteins in the C-D loop of human interleukin-11 |
| EP1881005B1 (en) * | 1997-07-14 | 2013-04-03 | Bolder Biotechnology, Inc. | Derivatives of G-CSF and related proteins |
| US6753165B1 (en) * | 1999-01-14 | 2004-06-22 | Bolder Biotechnology, Inc. | Methods for making proteins containing free cysteine residues |
| US7153943B2 (en) * | 1997-07-14 | 2006-12-26 | Bolder Biotechnology, Inc. | Derivatives of growth hormone and related proteins, and methods of use thereof |
| ES2314786T3 (es) | 1998-04-02 | 2009-03-16 | Genentech, Inc. | Uso de interferon gamma para el tratamiento de la hipertrofia cardiaca. |
| US8288126B2 (en) | 1999-01-14 | 2012-10-16 | Bolder Biotechnology, Inc. | Methods for making proteins containing free cysteine residues |
| RU2140285C1 (ru) * | 1999-01-25 | 1999-10-27 | Гапонюк Петр Яковлевич | Противовирусное средство - капли в нос "гриппферон" |
| AU5023300A (en) * | 1999-05-20 | 2000-12-12 | Scios Inc. | Vascular endothelial growth factor variants |
| EP1183357A2 (en) * | 1999-05-20 | 2002-03-06 | Scios Inc. | Vascular endothelial growth factor dimers |
| CN1309423C (zh) | 1999-11-12 | 2007-04-11 | 马克西根控股公司 | 干扰素γ偶联物 |
| CA2390292A1 (en) | 1999-11-12 | 2001-05-25 | Maxygen Holdings Ltd. | Interferon gamma conjugates |
| CA2405709A1 (en) | 2000-04-12 | 2001-10-25 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| EP1284987B1 (en) * | 2000-05-16 | 2007-07-18 | Bolder Biotechnology, Inc. | Methods for refolding proteins containing free cysteine residues |
| CA2427194A1 (en) * | 2000-11-03 | 2002-05-10 | Biomedicines, Inc. | Method for short-term and long-term drug dosimetry |
| EP1351707B9 (en) * | 2001-01-09 | 2012-01-25 | Baylor Research Institute | Methods for treating autoimmune diseases in a subject and in vitro diagnostic assays |
| US6958388B2 (en) | 2001-04-06 | 2005-10-25 | Maxygen, Aps | Interferon gamma polypeptide variants |
| US7038015B2 (en) * | 2001-04-06 | 2006-05-02 | Maxygen Holdings, Ltd. | Interferon gamma polypeptide variants |
| IL161762A0 (en) * | 2001-11-06 | 2005-11-20 | Applied Research Systems | Estradiol inhibiting agents in breast cancer |
| US20050079156A1 (en) * | 2001-11-06 | 2005-04-14 | Grace Wong | Method of treating endometreosis |
| AU2002365436B8 (en) * | 2001-11-09 | 2008-04-03 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Method for treating diseases with omega interferon |
| US20050095224A1 (en) * | 2001-12-07 | 2005-05-05 | Ramachandran Radhakrishnan | Compositions and method for treating hepatitis virus infection |
| CA2471363C (en) | 2001-12-21 | 2014-02-11 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| AU2003239774A1 (en) * | 2002-07-03 | 2004-01-23 | Maxygen Holdings Ltd. | Full-length interferon gamma polypeptide variants |
| US7731947B2 (en) | 2003-11-17 | 2010-06-08 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Composition and dosage form comprising an interferon particle formulation and suspending vehicle |
| US20070172446A1 (en) | 2003-05-16 | 2007-07-26 | Intermune, Inc. | Synthetic chemokine receptor ligands and methods of use thereof |
| WO2004103296A2 (en) * | 2003-05-16 | 2004-12-02 | Intermune, Inc. | Methods of treating idiopathic pulmonary fibrosis |
| DK1680137T3 (da) | 2003-10-14 | 2013-02-18 | Hoffmann La Roche | Makrocyklisk carboxylsyre- og acylsulfonamidforbindelse som inhibitor af HCV-replikation |
| US7407973B2 (en) * | 2003-10-24 | 2008-08-05 | Intermune, Inc. | Use of pirfenidone in therapeutic regimens |
| AU2005211385B2 (en) * | 2004-02-02 | 2008-12-11 | Ambrx, Inc. | Modified human growth hormone polypeptides and their uses |
| US7597884B2 (en) | 2004-08-09 | 2009-10-06 | Alios Biopharma, Inc. | Hyperglycosylated polypeptide variants and methods of use |
| JP2006141263A (ja) * | 2004-11-18 | 2006-06-08 | Kyoto Univ | （ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの製造方法 |
| US11246913B2 (en) | 2005-02-03 | 2022-02-15 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Suspension formulation comprising an insulinotropic peptide |
| WO2006083761A2 (en) | 2005-02-03 | 2006-08-10 | Alza Corporation | Solvent/polymer solutions as suspension vehicles |
| CA2607806A1 (en) * | 2005-05-04 | 2006-11-16 | Nautilus Biotech, S.A. | Modified interferon-gamma polypeptides and methods for using modified interferon-gamma polypeptides |
| ES2351527T3 (es) | 2006-05-30 | 2011-02-07 | Intarcia Therapeutics, Inc | Modulador de flujo en dos piezas con conducto interno para un sistema osmótico de administración. |
| NZ574524A (en) | 2006-08-09 | 2011-07-29 | Intarcia Therapeutics Inc | Piston assembly for positioning lumen of a reservoir for an osmotic delivery having a columnar body and a spring |
| US20090181078A1 (en) * | 2006-09-26 | 2009-07-16 | Infectious Disease Research Institute | Vaccine composition containing synthetic adjuvant |
| PL2486938T3 (pl) | 2006-09-26 | 2018-08-31 | Infectious Disease Research Institute | Kompozycja szczepionki zawierająca syntetyczny adiuwant |
| WO2008076933A2 (en) | 2006-12-14 | 2008-06-26 | Bolder Biotechnology, Inc. | Long acting proteins and peptides and methods of making and using the same |
| EP2157967B1 (en) | 2007-04-23 | 2013-01-16 | Intarcia Therapeutics, Inc | Suspension formulations of insulinotropic peptides and uses thereof |
| CA2685596A1 (en) | 2007-05-02 | 2008-11-13 | Ambrx, Inc. | Modified interferon beta polypeptides and their uses |
| JP5702150B2 (ja) | 2008-02-08 | 2015-04-15 | アンブルックス, インコーポレイテッドAmbrx, Inc. | 修飾されているレプチンポリペプチドおよびそれらの使用 |
| WO2009102467A2 (en) | 2008-02-13 | 2009-08-20 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Devices, formulations, and methods for delivery of multiple beneficial agents |
| US8243103B2 (en) * | 2009-05-29 | 2012-08-14 | Exelis, Inc. | Laser aiming spot distinguishing methods and apparatus |
| ES2606563T3 (es) | 2009-06-05 | 2017-03-24 | Infectious Disease Research Institute | Adyuvantes lipídicos de glucopiranosilo sintéticos y composiciones de vacuna que contienen los mismos |
| LT2462246T (lt) | 2009-09-28 | 2017-11-27 | Intarcia Therapeutics, Inc | Esminio stacionaraus vaisto tiekimo greitas įgyvendinimas ir (arba) nutraukimas |
| KR101858598B1 (ko) * | 2010-02-01 | 2018-05-16 | 디그나 비오테크, 에스.엘. | 인터페론 알파 5의 제조방법 |
| US20120208755A1 (en) | 2011-02-16 | 2012-08-16 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Compositions, Devices and Methods of Use Thereof for the Treatment of Cancers |
| EP2694099B1 (en) | 2011-04-08 | 2019-10-16 | Immune Design Corp. | Immunogenic compositions and methods of using the compositions for inducing humoral and cellular immune responses |
| WO2013024158A1 (en) | 2011-08-17 | 2013-02-21 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Combinations of protein kinase inhibitors and interferons or of protein kinase inhibitors and direct acting antivirals for the treatment and the prevention of hcv infection |
| WO2013024156A2 (en) | 2011-08-17 | 2013-02-21 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Combinations of anti-hcv-entry factor antibodies and interferons for the treatment and the prevention of hcv infection |
| LT2811981T (lt) | 2012-02-07 | 2019-06-10 | Infectious Disease Research Institute | Pagerintos adjuvanto kompozicijos, apimančios tlr4 agonistus, ir jų panaudojimo būdai |
| PL2850431T3 (pl) | 2012-05-16 | 2018-09-28 | Immune Design Corp. | Szczepionki przeciwko HSV-2 |
| WO2014033266A1 (en) | 2012-08-31 | 2014-03-06 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Anti-sr-bi antibodies for the inhibition of hepatitis c virus infection |
| SG11201508092YA (en) | 2013-04-18 | 2015-10-29 | Immune Design Corp | Gla monotherapy for use in cancer treatment |
| US9463198B2 (en) | 2013-06-04 | 2016-10-11 | Infectious Disease Research Institute | Compositions and methods for reducing or preventing metastasis |
| US9889085B1 (en) | 2014-09-30 | 2018-02-13 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Therapeutic methods for the treatment of diabetes and related conditions for patients with high baseline HbA1c |
| JP6993235B2 (ja) | 2015-06-03 | 2022-01-13 | インターシア セラピューティクス，インコーポレイティド | インプラントの設置及び撤去システム |
| WO2017200852A1 (en) | 2016-05-16 | 2017-11-23 | Infectious Disease Research Institute | Formulation containing tlr agonist and methods of use |
| EP3458084B1 (en) | 2016-05-16 | 2020-04-01 | Intarcia Therapeutics, Inc | Glucagon-receptor selective polypeptides and methods of use thereof |
| MX2018014399A (es) | 2016-06-01 | 2019-06-06 | Infectious Disease Res Inst | Particulas de nanoalumbre que contienen un agente de dimensionamiento. |
| USD860451S1 (en) | 2016-06-02 | 2019-09-17 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Implant removal tool |
| USD840030S1 (en) | 2016-06-02 | 2019-02-05 | Intarcia Therapeutics, Inc. | Implant placement guide |
| ES2917000T3 (es) | 2016-10-24 | 2022-07-06 | Orionis Biosciences BV | Interferón-gamma mutante diana y usos del mismo |
| KR20190104039A (ko) | 2017-01-03 | 2019-09-05 | 인타르시아 세라퓨틱스 인코포레이티드 | Glp-1 수용체 효능제의 연속적인 투여 및 약물의 동시-투여를 포함하는 방법 |
| US11672877B2 (en) | 2017-08-23 | 2023-06-13 | Wayne State University | In vivo immunoimaging of interferon-gamma |
| JP7339942B2 (ja) | 2017-09-08 | 2023-09-06 | アクセス ツー アドバンスト ヘルス インスティチュート | サポニンを含むリポソーム製剤および使用方法 |
| CN115484985A (zh) | 2020-03-19 | 2022-12-16 | 崔泽尔有限公司 | 温度响应病毒储存系统 |
| IL296845A (en) | 2020-03-30 | 2022-11-01 | Trizell Ltd | Preparations and methods for the treatment of cancer |
Family Cites Families (49)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL7404590A (nl) * | 1974-04-03 | 1975-10-07 | Stichting Rega V Z W | Werkwijze voor het reactiveren van interferon. |
| NL7404589A (nl) * | 1974-04-03 | 1975-10-07 | Stichting Rega V Z W | Werkwijze voor het stabiliseren van interferon. |
| US4332892A (en) * | 1979-01-15 | 1982-06-01 | President And Fellows Of Harvard College | Protein synthesis |
| JPS5598118A (en) * | 1979-01-18 | 1980-07-25 | Hayashibara Takeshi | Preparation of type-2 interferon and drug containing the same |
| AU538665B2 (en) * | 1979-10-30 | 1984-08-23 | Juridical Foundation, Japanese Foundation For Cancer Research | Human interferon dna |
| IL58765A (en) * | 1979-11-21 | 1986-09-30 | Yeda Res & Dev | Process for the production of essentially pure messenger rna of human fibroblast interferon and process for the production of interferon beta |
| GB2068970B (en) * | 1980-02-06 | 1983-06-22 | Searle & Co | Recombinant dna technique for the preparation of a protein resembling human interferon |
| DE3005897A1 (de) * | 1980-02-16 | 1981-09-03 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | Genprodukt eines hoeheren organismus aus einem dieses gen enhtaltenden mikroorganismus |
| US4338397A (en) * | 1980-04-11 | 1982-07-06 | President And Fellows Of Harvard College | Mature protein synthesis |
| US4460685A (en) * | 1980-05-29 | 1984-07-17 | New York University | Method of enhancing the production of human γ Interferon |
| US4311639A (en) * | 1980-07-25 | 1982-01-19 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Immunogenic interferon peptides |
| US4341761A (en) * | 1980-07-25 | 1982-07-27 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Antibodies to immunogenic peptides and their use to purify human fibroblast interferon |
| FI64813C (fi) * | 1980-12-31 | 1984-01-10 | Ilkka Antero Palva | Foerfarande foer producering av ett utvalt aeggviteaemne och vid foerfarandet anvaenda rekombinantplasmidvektorer |
| US4382027A (en) * | 1981-08-18 | 1983-05-03 | Meloy Laboratories, Inc. | Purification of human immune interferon |
| IL65475A0 (en) * | 1981-04-17 | 1982-07-30 | Meloy Lab | Production of immune interferon and its mrna |
| US4404188A (en) * | 1981-07-29 | 1983-09-13 | Massachusetts General Hospital | Purified Mullerian Inhibiting Substance and method of purification |
| AU561343B2 (en) * | 1981-10-19 | 1987-05-07 | Genentech Inc. | Human immune interferon by recombinant dna |
| US5096705A (en) * | 1981-10-19 | 1992-03-17 | Genentech, Inc. | Human immune interferon |
| US5582824A (en) * | 1981-10-19 | 1996-12-10 | Genentech, Inc. | Recombinant DES-CYS-TYR-CYS human immune interferon |
| US4361509A (en) * | 1981-12-14 | 1982-11-30 | Scripps Clinic And Research Foundation | Ultrapurification of factor VIII using monoclonal antibodies |
| JPS58110548A (ja) | 1981-12-24 | 1983-07-01 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 新規な生理活性ペプチド |
| US4388234A (en) * | 1981-12-28 | 1983-06-14 | Hoffmann-La Roche Inc. | Peptide isolation |
| US5004689A (en) * | 1982-02-22 | 1991-04-02 | Biogen, Massachusetts | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human gamma interferon-like polypeptides in high yields |
| ZA831094B (en) * | 1982-02-22 | 1983-11-30 | Biogen Nv | Dna sequences,recombinant dna molecules and processes for producing human immune interferon-like polypeptides |
| ZA83768B (en) * | 1982-03-01 | 1983-10-26 | Hoffmann La Roche | Homogeneous human immune interferon and process therefor |
| IL68100A0 (en) * | 1982-03-24 | 1983-06-15 | Takeda Chemical Industries Ltd | Novel dna and use thereof |
| US6936694B1 (en) * | 1982-05-06 | 2005-08-30 | Intermune, Inc. | Manufacture and expression of large structural genes |
| JPH0787797B2 (ja) * | 1982-05-20 | 1995-09-27 | サントリー株式会社 | ヒト・ガンマ・インタ−フエロン様ポリペプチドの製造法 |
| US4681848A (en) * | 1982-09-22 | 1987-07-21 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Novel peptide and use thereof |
| IL69851A0 (en) * | 1982-09-30 | 1983-12-30 | Japan Found Cancer | Novel dna and recombinant plasmid containing the same |
| WO1984002129A1 (en) * | 1982-11-22 | 1984-06-07 | Takeda Chemical Industries Ltd | Human immune interferon protein and process for its preparation |
| US4432895A (en) * | 1982-11-24 | 1984-02-21 | Hoffmann-La Roche Inc. | Monomeric interferons |
| US4485017A (en) * | 1982-12-22 | 1984-11-27 | Cetus Corporation | Isolation of human interferon by immunosorbent and high performance liquid chromatography |
| JPH0740925B2 (ja) * | 1983-03-14 | 1995-05-10 | 協和醗酵工業株式会社 | 新規ヒトインタ−フエロン−γポリペプチド |
| JPS59169494A (ja) * | 1983-03-17 | 1984-09-25 | Takeda Chem Ind Ltd | 新規組み換えｄｎａおよびその用途 |
| US4599306A (en) * | 1983-04-15 | 1986-07-08 | Amgen | Monoclonal antibodies which specifically bind to human immune interferon |
| IL71951A0 (en) * | 1983-06-01 | 1984-09-30 | Hoffmann La Roche | Polypeptides having interferon activity,their preparation and pharmaceutical compositions containing them |
| IL72773A0 (en) * | 1983-08-29 | 1984-11-30 | Meloy Lab | Production of immune interferon and its mrna |
| US4681930A (en) * | 1983-09-20 | 1987-07-21 | Hoffmann-La Roche Inc. | Immune interferon and a method for its extraction and purification |
| US4476049A (en) * | 1983-09-20 | 1984-10-09 | Hoffmann-La Roche Inc. | Method for the extraction of immune interferon |
| US4604284A (en) * | 1983-09-20 | 1986-08-05 | Hoffmann-La Roche Inc. | Homogeneous immune interferon fragment |
| JPS6079000A (ja) * | 1983-10-04 | 1985-05-04 | Takeda Chem Ind Ltd | ヒトγ型インタ−フエロン単量体の製造法 |
| JPH0788398B2 (ja) * | 1983-10-17 | 1995-09-27 | サントリー株式会社 | 新規生理活性ポリペプチドおよびその製造法 |
| JPS60118196A (ja) * | 1983-11-30 | 1985-06-25 | Takeda Chem Ind Ltd | インタ−フェロンの製造法 |
| FR2556365B1 (fr) * | 1983-12-09 | 1987-07-31 | Transgene Sa | Vecteurs de clonage et d'expression de l'interferon-g, bacteries transformees et procede de preparation de l'interferon-g |
| US4855238A (en) * | 1983-12-16 | 1989-08-08 | Genentech, Inc. | Recombinant gamma interferons having enhanced stability and methods therefor |
| MX9203641A (es) * | 1983-12-16 | 1992-07-01 | Genentech Inc | Interferones gamma recombinantes que poseen estabilidad mejorada y metodos biotecnologicos para su obtencion. |
| IL75302A0 (en) * | 1984-06-06 | 1985-09-29 | Takeda Chemical Industries Ltd | Novel polypeptide and production thereof |
| JP2653061B2 (ja) | 1986-12-27 | 1997-09-10 | 武田薬品工業株式会社 | 新規ポリペプチドおよびその製造法 |
-
1984
- 1984-02-27 US US06/584,217 patent/US4855238A/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-12-11 IL IL73803A patent/IL73803A/xx not_active IP Right Cessation
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-
1987
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1990
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-
1994
- 1994-03-24 US US08/221,542 patent/US5595888A/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-07-13 JP JP6161166A patent/JP2580491B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-23 US US08/311,765 patent/US5574137A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
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- 1995-06-02 US US08/460,539 patent/US6497871B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-03-12 JP JP8054569A patent/JP2719128B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-17 LV LVP-96-250A patent/LV11633B/en unknown
- 1996-09-19 HK HK175996A patent/HK175996A/xx not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-08-04 JP JP9208916A patent/JP2886145B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ＴＨＥ ＢＩＯＬＯＧＹ ＯＦ ＴＨＥ ＩＮＴＥＲＦＥＲＯＮ ＳＹＳＴＥＭ １９８３ （１９８３） Ｐ．１１９−１２９ |
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