JPH05178756A - 肝疾患の予防・治療薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 インターロイキン６および／またはインター
ロイキン１１を有効成分とする肝疾患の予防・治療薬。 【効果】 インターロイキン６またはインターロイキン
１１は、各種の肝障害により上昇したＧＯＴ値およびＧ
ＰＴ値を低下させる作用が優れているため、肝機能保護
剤、肝疾患の予防・治療薬として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規な肝疾患の予防・治
療薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】生体がホメオスターシス（恒常性）を維
持する上で、肝臓の果す役割は極めて大きく、主に物質
代謝によりその目的が達成されている。肝の物質代謝に
は糖質代謝、脂質代謝、タンパク代謝、肝汁酸代謝、ビ
リルビン代謝、ビタミン代謝、ホルモン代謝、薬物代謝
などがあり、これらの過程に関与する酵素は判明してい
るものだけでも１０００以上に達する（肝疾患ハンドブ
ック、亀田治男著、メジカルフレンド社、１９８２）。
このように肝は生体における物質代謝の中心であり、そ
の機能低下や廃絶は重篤な、あるいは致死的結果をもた
らす。肝機能異常は様々な原因で誘発される。例えば、
ウイルス、細菌、寄生虫などによる感染、自己免疫疾患
によるもの、アルコール性のもの、薬物、毒物など化学
物質によるもの、悪性新生物の存在、増殖などに基づく
ものなど様々である。同様にその病態は原因および病勢
の進行状況などの臨床所見、診断により急性肝炎、慢性
肝炎、劇症肝炎、脂肪肝、肝硬変、肝癌などに分類され
る。

【０００３】肝疾患診断法としては肝シンチスキャニン
グ、腹部ＣＴ、腹腔動脈造影法、腹腔鏡検査、肝生検な
ど高価な機器、高度なテクニックが駆使されている。し
かしながら、第一次的に肝機能異常を検知する手段とし
ての臨床生化学的パラメーター測定の意義は極めて高
い。血清学的肝機能パラメーターには様々なものがあ
り、例えば、血清トランスアミナーゼ、血清アルカリホ
スファターゼ、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ、
ロイシンアミノペプチダーゼ、乳酸脱水素酵素、コリン
エステラーゼ活性などはその代表例である。とりわけＧ
ＯＴ（glutamic oxaloacetic transaminase ）とＧＰＴ
（glutamic pyruvic transaminase ）は肝細胞中に含有
されており、肝細胞の変性、壊死に伴なって血流中に遊
出し、他酵素に比べ鋭敏に変動するので肝疾患の発現、
回復のモニター酵素として臨床上広く利用されている
（肝疾患ハンドブック、亀田治男著、メジカルフレンド
社、１９８２）。

【０００４】肝疾患に対する薬物療法としては、例え
ば、糖質、総合アミノ酸、血清濃縮アルブミンなど栄養
素の輸液、メチオニン、コリンなどの脂向因子、グルク
ロン酸、ＳＨ化合物などの解毒薬、各種ビタミン類、オ
ロト酸、ＡＩＣＡ、ヌクレオチドなどの核酸前駆物質、
ＡＣＴＨ、副腎皮質ステロイドなどのホルモン、グルタ
ミン酸、アスパラギン酸などアンモニア代謝関連物質、
各種利胆薬、利尿薬などが古くから処方されている。こ
れらは肝疾患の原因、症状に応じ、単独あるいは併用し
て用いられているが、必ずしも満足のゆく成績が得られ
ている訳でない。近年、リンホカイン、サイトカインと
称せられるペプチド性ホルモンの肝疾患への応用が注目
されて来ており、例えば、慢性Ｂ型肝炎に対するインタ
ーフェロンの効果（Greenberg,H.B. et al., N. Engl.
J. Med., 295, 517-522,1976, Hess,G. et al., Immun
obiology, 172, 255-261, 1986 ）あるいはＣ型（非Ａ
非Ｂ型）慢性肝炎に対するインターフェロン適用の可能
性（Hoofnagle,J.H. et al.,N. Engl. J. Med., 315, 1
575-1578, 1986, Di Bisceglie,A.M. et al., N. Eng
l. J. Med., 321, 1506-1510, 1986 ）が報告され、ウ
イルス性肝炎治療薬としての期待が高まっている。同様
にin vitroで肝細胞の分裂増殖を促進させる分子量８４
ｋｄのＨＧＦ（Hepatocyte Growth Factor）と名付けら
れたタンパク質の発見と構造決定が試され（市原 明、
Biomedica., 6, 1151-1155, 1991）、肝再生促進を通じ
ての治療薬としての応用が期待されている。

【０００５】一方、インターロイキン６（以下、ＩＬ−
６と略す）は、インタ−フェロンβ₂ （Zilberstein,A.
et.at., EMBO J. 5,2529-2537,1986）、Ｂ細胞分化因子
（ＢＳＦ−２）:(Hirano,T. et.al.,Nature,324,73-76,
1986) 、２６−ＫＤａプロテイン（Hageman,G.et.al.,E
ur.J.Biochem., 159,625-632, 1986）、ハイブリド−マ
／プラズマサイト−マ増殖因子（VanDamme,J.et.al.,
J.Exp.Med., 165,914-919,1987 ）、肝細胞刺激因子
（ＨＳＦ）：（Andus,T.et.al.,FEBS Lett.,221,18-22,
1987；Gauldie,J.et.al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7
251-7255,1987 ）、など、別々に研究されてきた生理活
性物質が同一分子であることが分かり、その生理活性の
多様性からＩＬ−６と呼ぶことが提唱され、その名称が
定着している。ＩＬ−６は上記したように、その発見に
伴う生理作用の他に最近、in vitroにおいて巨核球の成
熟を促進し（例えば、Ishibashi, T. ら、Proc. Natl.
Acad.Sci. USA,86, 5953-57, 1989 ）、in vivo に投与
すると血小板が増加することが報告されている（例え
ば、Asano, S. ら、Blood, 75, 1602-1605, 1990）。

【０００６】ＩＬ−６の生物活性としては、このほかに
血中ＡＣＴＨ濃度の上昇（Naitoh,Y., Biochem. Biophy
s. Res. Commun., 155, 1459, 1988）、下垂体からの各
種ホルモン（ＰＲＬ、ＧＨ、ＬＨ、ＦＳＨ）産生の促進
（Spangeol,B., Endocrinology, 125, 575, 1989）、膵
臓からのインシュリン産生亢進（Sandler,S., Endocrin
ology, 126, 1228, 1990）、神経系細胞の分化促進、生
存維持作用（Satoh,T., Mol. Cell. Biol., 8, 3546, 1
988 ）など多岐に亘っているが、これらの知見が直ちに
ＩＬ−６に対し産業的に意義のある物質、すなわち医薬
としての地位を与えている訳ではなく、合理的、科学的
証明がそのためには必要である。

【０００７】同様にＩＬ−６の肝に対する作用の意義に
ついては不明確である。すなわちＩＬ−６は、肝細胞刺
激因子として（Andus,T., FEBS Letter, 221, 18, 198
7）、フィブリノーゲン、α₁ −アシドグリコプロテイ
ン、α₂ −マクログロブリンなど急性期タンパクの産生
促進因子として（Geiger,T., Eur. J.Immunol., 18, 71
7, 1988, Heinrich,P., Biochem. J., 265, 621, 1990
）、肝グルコース新生促進因子として（Ritchie,D., A
m. J. Physiol., 258, E57, 1990 ）の報告はあるもの
の、これらの作用は生体にとり有用な反応であるか、不
利な反応であるか不明確であり、一方で、心房内粘液腫
（Hirano,T., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 84, 228-
231, 1987 ）やキャッスルマン症候群（Yoshizaki,K.,
Blood, 74,1360-1367, 1989 ）に伴って大量の血中ＩＬ
−６が同定されるなど、マイナスのイメージが通念とし
て存在している。肝への作用も、細菌感染などと随伴す
る炎症時に発現するのと同様な急性期タンパク産生亢進
からマイナスイメージが強い。

【０００８】一方、インターロイキン１１（以下、ＩＬ
−１１と略す）は、当初ストローマ細胞や線維芽細胞が
産生する増血因子として発見されたサイトカインである
（Paul. S. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
87, 7512-7516, 1990)。ＩＬ−１１については、その生
理活性についてはまだ詳しく解明されていない面があ
る。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、本来
生体内で作用を有する生理活性物質から、優れた肝疾患
の予防・治療薬を提供することにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】前記目的は以下の本発明
により完成される。

【００１１】すなわち、本発明はＩＬ−６および／また
はＩＬ−１１を有効成分とする肝機能保護、改善、肝疾
患予防および肝疾患治療に関する。さらに詳しく述べれ
ば、本発明は各種肝機能不全、肝疾患の原因となる生物
学的、化学的、物理学的要因のうちから、代表として選
択した抗がん剤を投与し、誘発した肝疾患動物にＩＬ−
６および／またはＩＬ−１１を投与し、臨床生化学的に
肝疾患、肝機能異常状態の検知に確固たる地位を占めて
いるＧＯＴ、ＧＰＴ値を指標として、ＩＬ−６および／
またはＩＬ−１１の肝機能保護、改善、肝疾患予防、肝
疾患治療効果を証明し、初めて完成された。

【００１２】肝細胞のマーカー酵素であるＧＯＴ、ＧＰ
Ｔの血中への放出は直接的、間接的であることを問わ
ず、唯一肝細胞の変性、破壊によりもたらされる。本発
明では、肝障害モデル動物において異常レベルに達した
ＧＯＴ、ＧＰＴ値が、ＩＬ−６および／またはＩＬ−１
１の投与によって、正常レベル方向へとシフトあるいは
正常レベルにとどめる作用があることを示した。

【００１３】本発明では肝機能異常モデル作製方法とし
て、医療現場で現在問題視されている抗がん剤を用いた
理由は、本発明の完成が直ちに抗がん剤使用時のがん患
者の肝毒性軽減、あるいは目的、症状に応じて抗がん剤
増量という実用上の利便性が直ちに期待できるからであ
る。従って、本発明の適用は癌治療分野にのみに限定さ
れるものでないことは明らかであり、特に前述のＧＯ
Ｔ、ＧＰＴ酵素活性測定の臨床的意義からも明らかであ
り、肝細胞変性、破壊を伴いうる全ての肝機能不全、肝
疾患状態あるいはこれらのステージに達しうる状況に予
防的、治療的に応用できる。

【００１４】本発明で使用するＩＬ−６にはとくに制限
はなく、既知の方法で得られるＩＬ−６が好適に使用さ
れる。例えばＩＬ−６産生細胞を培養して得られたも
の、あるいは遺伝子組換え法により得られた組換え型Ｉ
Ｌ−６でも良い。より好ましくは、ＩＬ−６産生ヒト細
胞を培養して得られるものが使用される。

【００１５】培養ヒト細胞から取得したＩＬ−６は、ヒ
ト以外の種由来の不純物の混入を避けることができ、得
られるＩＬ−６は本来生体内で働くＩＬ−６に近いもの
となるため好ましい。すなわち糖鎖および微細修飾を含
んだ構造がヒト生体内ＩＬ−６に近いものとなるため
に、ヒトに医薬として投与したときに抗体産生を相対的
に排除することができるため好ましい。したがって、ヒ
ト培養細胞が産生するＩＬ−６は生体内でのより効率的
な有効性を期待することができる。

【００１６】本発明の培養ヒト細胞が産生するＩＬ−６
とは、ヒト由来の細胞を培養することによって得られる
ＩＬ−６を意味し、さらに特定すれば、正常細胞すなわ
ち、癌化（極端な形質転換）していない、あるいは癌細
胞由来でない付着性ヒト細胞を培養することによって得
られるＩＬ−６が好ましい。これらの条件によって得ら
れるＩＬ−６は通常糖鎖の付加した構造を有する。癌細
胞由来でない正常ヒト細胞としては、特に線維芽細胞、
内皮細胞、ストロ−マ細胞などが生体内でのＩＬ−６の
源の一つと考えられており、その一部は正常細胞に近い
形で培養できるので特に好適に用いられるが、特にこれ
らに限定されるものではない。

【００１７】上記の正常ヒト細胞のうち、特に好適な細
胞は付着性であるので、一般的な細胞培養条件にて培養
できる。一般的な培養フラスコ、ロ−ラ−ボトル、マイ
クロキャリア（微粒子）を用いる培養法などが好適に用
いられるがこれに限定されるものではない。こうしてヒ
ト細胞の培養によって得られた培養液から通常の精製法
により、ほぼ純粋なＩＬ−６を得ることができる。これ
ら培養および精製法については実施例でその一例を示す
が勿論これに限定されるものではない。

【００１８】一方、組換え型ＩＬ−６は、既知の方法に
より製造することができる。一例として、大腸菌を宿主
とした例を実施例として示したが、これ以外でも広く知
られた遺伝子操作法を用いることによって製造すること
ができる。たとえば、枯草菌などの原核細胞、酵母、ハ
ムスター細胞・マウス細胞・サル細胞・ヒト細胞などの
動物細胞、昆虫細胞、昆虫体に、ＩＬ−６遺伝子をその
宿主で機能するプロモーターなどの下流に連結してＤＮ
Ａもしくはウイルスなどの形態で導入することによって
も調製することができる。

【００１９】本発明で使用するＩＬ−１１にはとくに制
限はなく、既知の方法で得られるＩＬ−１１が好適に使
用される。例えばＩＬ−１１産生細胞を培養して得られ
たもの、あるいは遺伝子組換え法により得られた組換え
型ＩＬ−１１でも良い。

【００２０】組換え型ＩＬ−１１は、既知の方法により
製造することができる。一例として、大腸菌を宿主とし
た例を実施例として示したが、これ以外でも広く知られ
た遺伝子操作法を用いることによって製造することがで
きる。たとえば、枯草菌などの原核細胞、酵母、ハムス
ター細胞・マウス細胞・サル細胞・ヒト細胞などの動物
細胞、昆虫細胞、昆虫体に、ＩＬ−１１遺伝子をその宿
主で機能するプロモーターなどの下流に連結してＤＮＡ
もしくはウイルスなどの形態で導入することによっても
調製することができる。

【００２１】一方、培養ヒト細胞から取得したＩＬ−１
１は、ヒト以外の種由来の不純物の混入を避けることが
でき、得られるＩＬ−１１は本来生体内で働くＩＬ−１
１に近いものとなるため好ましい。すなわち糖鎖および
微細修飾を含んだ構造がヒト生体内ＩＬ−１１に近いも
のとなるために、ヒトに医薬として投与したときに抗体
産生を相対的に排除することができるため好ましい。し
たがって、ヒト培養細胞が産生するＩＬ−１１は生体内
でのより効率的な有効性を期待することができる。

【００２２】本発明の培養ヒト細胞が産生するＩＬ−１
１とは、ヒト由来の細胞を培養することによって得られ
るＩＬ−１１を意味し、さらに特定すれば、正常細胞す
なわち、癌化（極端な形質転換）していない、あるいは
癌細胞由来でない付着性ヒト細胞を培養することによっ
て得られるＩＬ−１１が好ましい。これらの条件によっ
て得られるＩＬ−１１は通常糖鎖の付加した構造を有す
る。癌細胞由来でない正常ヒト細胞としては、特に線維
芽細胞、内皮細胞、ストロ−マ細胞などが生体内でのＩ
Ｌ−１１の源の一つと考えられており、その一部は正常
細胞に近い形で培養できるので特に好適に用いられる
が、特にこれらに限定されるものではない。

【００２３】上記の正常ヒト細胞のうち、特に好適な細
胞は付着性であるので、一般的な細胞培養条件にて培養
できる。一般的な培養フラスコ、ロ−ラ−ボトル、マイ
クロキャリア（微粒子）を用いる培養法などが好適に用
いられるがこれに限定されるものではない。こうしてヒ
ト細胞の培養によって得られた培養液から通常の精製法
により、ほぼ純粋なＩＬ−１１を得ることができる。

【００２４】本発明の予防・治療薬は、前述した方法で
製造されるヒトＩＬ−６および／またはＩＬ−１１を主
成分として含有する。他の成分としては、一般的な医薬
品添加物が選ばれる。もちろん添加物が無くとも本発明
の目的は達成される。一般的には主として安定化のため
に添加物が加えられる。そのような医薬品添加物として
は、局法に記載された、医薬品添加物として使えるタン
パク質および／または糖類の中から選ばれる。特に好適
にはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ゼラチン、マンニ
ト−ル、ソルビト−ル、ラクト−ス、トレハロースなど
の中から適宜あるいは組み合わせて選ばれるが、もちろ
んこれらに限定するものではない。

【００２５】本発明の目的である肝機能保護、改善、肝
疾患予防、肝治療効果を具体的に達成するためには、こ
うして得られたＩＬ−６および／またはＩＬ−１１を主
成分とする組成物を生体に投与する。投与対象としては
特に限定するものではないが、癌化学療法に伴う肝障害
予防、軽減、治療を必要とする生体、その他肝障害を直
接的、間接的に誘発しうる疾病の存在あるいは治療の投
与を必要とする生体、肝障害を誘発するあるいはさせう
る各種外科的あるいは物理学的処置を必要とする生体、
アルコール、毒物など化学物質による肝障害誘発あるい
はその恐れのある生体、ウイルス、細菌等感染因子、自
己免疫疾患、悪性新生物など生物学的原因に基づく各種
肝障害を生起したあるいはその恐れのある生体を挙げる
ことができる。本発明が適用できるこのような肝疾患の
具体的形態としては、ウイルス性肝炎、細菌・寄生虫感
染性肝炎、自己免疫疾患による肝障害、アルコール性肝
障害、薬物、毒物による肝障害、肝癌、あるいは肝臓移
植、外科手術、心筋梗塞などに伴う虚血性の肝障害など
が挙げられる。しかし、もちろん、ここに記した病態に
限定されるものではなく、また余病の有無、併発状況に
も拘束されるものではない。

【００２６】これら病態に本発明を応用するに当たって
はここの病態に応じた本発明の化合物の投与方法が選択
されなければならないが、そのことが本発明の範囲を限
定するものではない。投与方法としては一般的な注射、
すなわち静脈注射、皮下注射、筋肉内注射、点滴静脈内
注入、局所注入などのうち適当な一つが選ばれれる。経
口、経皮、経肺、経腸などのような経粘膜投与法あるい
は経皮投与法も場合により好適に実施される。

【００２７】有効投与量としては、１日につき体重１Ｋ
ｇ当たり０．０００１から３００μｇの範囲で選ばれ
る。好適には体重１Ｋｇ当たり０．００１−１０μｇの
範囲で選ばれる。前述の投与量は症状によっても異な
り、これらの値に限定されるものでは勿論ない。

【００２８】投与回数としては通常１日１ないし２回、
もしくは２ないし数日に１回の範囲で選ばれるがこれに
限定されるものではない。投与する時期としては、本発
明の結果からも明らかなように生体がすでに肝障害状態
にあるとき、あるいはその恐れがあるときにそれぞれ独
自に、あるいはその両方の状態を通じて可能であるが、
特に限定されるものではない。すなわち、肝は沈黙の臓
器と称せされるがごとく、前障害状態を仲々検知し難い
現状と本発明の実施例が明確に示した事実より、ＩＬ−
６および／またはＩＬ−１１が治療的応用はもとより、
予防的に用いられることの意義は極めて大きい。

【００２９】

【実施例】以下に本発明を実施例によって、より詳細
に、より具体的に説明するが、もちろんこれによって本
発明が制限されるものではない。

【００３０】なお、ＩＬ−６の活性評価法は以下の方法
により行なった。生物活性の評価法： 株細胞７ＴＤ１（ＩＬ−６依存ハイ
ブリド−マ細胞（J. vanSnick et al., European J. Im
munol., 18, 193-197(1988)）を用いて、それに適当量
のＩＬ−６を添加することにより、７ＴＤ１の細胞増殖
をＭＴＴ法により測定し、別途標準ＩＬ−６の段階希釈
サンプルについての増殖活性との比較により、ＩＬ−６
の生物活性評価を行った。標準ＩＬ−６としては、下記
に示す東レ株式会社ヒトＩＬ−６ＥＬＩＳＡキットに添
付されているのと同じものを使用した。

【００３１】ＩＬ−１１の活性評価法は、前記文献（Pa
ul. S. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87,
7512-7516, 1990)に記載の方法に従い、Ｔ１１６５細胞
を用いて行なった。

【００３２】ＥＬＩＳＡ（酵素免疫評価法）法：抗ＩＬ
−６抗体(N.Ida et al.、Biochem.Biophys.Res.Commun.,
165,728-734,(1989)) を用いたＥＬＩＳＡ法で測定し
た。東レ株式会社製造、ト−レ・フジバイオニクス販
売、ヒトＩＬ−６ＥＬＩＳＡキットを用いてＩＬ−６の
評価を行なった。

【００３３】実施例１ 大腸菌由来ＩＬ−６の調製：既知文献（T. Hirano ら、
Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３２４，７３（１９８６））と
同じ遺伝子配列を持つＩＬ−６ｃＤＮＡを骨格とするＩ
Ｌ−６発現ベクタ−を下記の方法で作成した。

【００３４】甲状腺癌由来細胞株ＮＩＭ−１細胞（通山
薫ら、日本血液学会雑誌、５３巻、８０５（１９９０）
を培養して通常の方法で調製したｍＲＮＡから、逆転写
酵素で合成したｃＤＮＡ混合物から下記２本のＤＮＡオ
リゴマ− ＣＣＧＡＴＣＧＡＴＧＣＣＡＧＴＡＣＣＣＣＣＡＧＧＡ および ＧＣＣＡＣＧＧＡＴＣＣＴＡＣＡＴＴＴＧＣＣＧＡＡＧ をプライマ−としてＰＣＲ反応を行った。得られた増幅
ＤＮＡを制限酵素ＣｌａＩとＢａｍＨＩで消化した後、
得られたＤＮＡ断片を大腸菌発現ベクタ−ｐＫＭ６(Tan
aka et al., J. Interferon Res., 6,429-35(1986)) の
ＣｌａＩ部位とＢｇｌＩＩ部位の間に挿入して、発現Ｉ
Ｌ−６ベクタ−ｐＫＭＩＬ−６を得た。このｐＫＭＩＬ
−６を大腸菌ＨＢ１０１に導入し、組換え体を得た。こ
の組換え体を下記のように培養して大腸菌組換え型ＩＬ
−６を調製した。

【００３５】ヒトインターロイキン−６発現プラスミド
を保持する大腸菌ＨＢ１０１／ｐＫＭＩＬ−６を、３０
Ｌ容ジャーを用いて培養した。３０Ｌの増殖用培地（リ
ン酸１カリウム０．３％、リン酸２ナトリウム０．６
％、塩化ナトリウム０．５％、塩化アンモニウム０．１
％、グルコース０．５％、カザミノ酸０．５％、硫酸マ
グネシウム１ｍＭ、硫酸第１鉄３μＭ、ビタミンＢ1 ６
μｇ／ｍｌ、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ）を３０Ｌ容
ジャーに仕込み、上記組換え体を植菌した。ジャーは、
攪拌数３００ｒｐｍ、通気量１ＶＶＭ、２５℃の条件で
運転した。トリプトファンオペロンの誘導物質であるイ
ンドールアクリル酸を加え、グルコースとカザミノ酸を
添加しながら６０時間培養した。培養菌体を１０，００
０×ｇ２０分間の遠心分離操作により集めた。菌体は、
約８９５ｇ得られた。集めた菌体を１ｍＭＥＤＴＡ、１
００ｍＭＮａＣｌを含む５０ｍＭトリス塩酸バッファー
ｐＨ８．０にＯＤ550nm が２０となるように懸濁した。
菌体をマントンゴーリンにより破砕し、遠心分離を行
い、破砕抽出物を回収した。抽出液中の蛋白量は２３５
ｇ、インターロイキン−６は４９５ｍｇであった。ここ
でＩＬ−６の量は、前記のＥＬＩＳＡ法で測定した（以
下同じ）。

【００３６】抽出液をシリカカラム５．５Ｌに吸着さ
せ、酸性溶液で溶出した。ＩＬ−６は４６２ｍｇ回収し
た。溶出液に硫酸アンモニウムを終濃度１．３３Ｍ添加
して、遠心により、不溶性不純物を除去した。次にブチ
ルカラム（ブチルトヨパール東ソー社製）２００ｍｌに
吸着させ、低塩中性溶液で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
純度検定法により純度８４％のＩＬ−６を２３７ｍｇ得
た。溶出したＩＬ−６をそのままヘパリンカラム（ＡＦ
ヘパリントヨパール 東ソー社製）８０ｍｌに吸着させ
た。中性塩バッファーで溶出した。純度９１％のＩＬ−
６を１１４ｍｇ得た。溶出液をさらにブチルカラム（ブ
チルトヨパール 東ソー社製）２００ｍｌで再度精製し
て、ＩＬ−６を６６ｍｇ得た。上記で調製したＩＬ−６
の純度は逆相ＨＰＬＣ法で９５％以上であった。上記Ｉ
Ｌ−６は前述の評価法で活性を持ったＩＬ−６であるこ
とを確認した。

【００３７】実施例２ ヒト細胞由来ＩＬ−６の調製：本発明のＩＬ−６は一例
として次の方法で調整された。２Ｌのガラス製培養槽に
１Ｌの５％のＮＣＳを含むイーグルＭＥＭ培地中で、細
胞数が１０⁶ ／mlになるようにヒト線維芽細胞をビーズ
培養した（ビーズ：“サイトデックス１”、（ファルマ
シア社）、３７℃）。その後、培地を少量のカルボキシ
メチルセルロースを含む無血清イーグルＭＥＭ培地１Ｌ
に交換し、プライミングとして１０万単位／Ｌのヒト天
然型インターフェロンβを添加した。翌日さらにポリ
Ｉ：ポリＣ５０mg／Ｌ、シクロヘキシミド１０mg／Ｌ添
加した。その４時間後、アクチノマイシンＤを４mg／Ｌ
投入し、そして、さらに１時間後、産生培地として少量
のメチルセルロースを含むイーグルＭＥＭ培地に置換
し、スーパーインダクション処理を行なった。その後２
日間そのまま培養を続けた（３７℃）。

【００３８】撹拌を停止し、マイクロキャリアを沈降さ
せた後、上清および産生培地での洗液をろ過し、１Ｌを
別の撹拌装置付き容器に移した。この産生液に滅菌した
“ブル−セファロ−スＣＬ−６ＢＦＦ”（ファルマシア
社）を投入し、１５℃，４日間撹拌しながらバッチ吸着
させた。撹拌停止後、ブル−担体を沈降させ上清を別の
容器に移した。シリカ担体は、リン酸ナトリウム緩衝液
中で高圧蒸気滅菌（１２１℃、３０分）したのち、４ｍ
ｌずつ２本のカラムに充填して直列に接続させた。これ
に、ブル−担体の素通り上清を流速２０ｍｌ／ｈｒで流
した。全量流した後、２本のカラムを別々に精製した。
それぞれリン酸ナトリウム緩衝液２５ｍｌを流した後、
２０ｍＭ塩酸を流してインターロイキン−６含有画分１
０ｍｌを回収した。この塩酸回収液にさらに硫酸アンモ
ニウムを１．３３Ｍになるように添加し、４℃、１晩ゆ
るやかに撹拌した。沈殿物を３０００ｒｐｍ，３０分遠
心分離（４℃）、除去した。

【００３９】分離した上清を疎水性クロマトグラフィ−
用担体であるブチルトヨパ−ル６５０Ｍ”１ｍｌ（東ソ
−社）を充填したカラムに流し、吸着させた。このカラ
ムを１．３３Ｍの硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭ塩
酸、１．３３Ｍの硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン
酸ナトリウム緩衝液で洗浄した後、５０ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液で回収した。その後、逆相系のクロマトグ
ラフィ−であるＯＤＳカラム（Ｃ₁₈）（ＹＭＣ−Ｐａｃ
ｋ ＯＤＳ Ａ−３１２ Ｓ−５ １２０Ａ，ＹＭＣ
社）を装着した高速液体クロマトグラフィ−（島津ＬＣ
−４Ａ）を用いて、０．１％トリフロロ酢酸を含有する
水と０．１％トリフロロ酢酸を含有するアセトニトリル
でグラジエント溶出させヒト天然型インターロイキン−
６ピ−クを分取した。こうして得られたヒト天然型イン
ターロイキン−６を“セファデックスＧ−２５”（ファ
ルマシア社）で５ｍＭギ酸を溶媒としてゲルろ過しアセ
トニトリルを含まないインターロイキン−６溶液を得
た。

【００４０】上記で調製したＩＬ−６の純度は逆相ＨＰ
ＬＣ法で９５％以上であった。上記ＩＬ−６は前記に示
す評価法で活性を持ったＩＬ−６であることを確認し
た。

【００４１】実施例３ 一群６匹のＣ５７ＢＬ／６マウスにシスプラチン（以下
ＣＤＤＰと略する）９．７ｍｇ／ｋｇを腹腔内に１回投
与した後、翌日からＩＬ−６を２８０μｇ／ｋｇ／ｄａ
ｙを１日１回の割合で連日皮下投与した。対照群にはＩ
Ｌ−６の代りに生理食塩水を同容量投与した。１群６匹
として設定し、経時的に各群のマウスを屠殺して血漿を
採取した。血漿ＧＯＴを測定した結果を表１に示した。

【００４２】

【表１】

【００４３】ＣＤＤＰ投与による肝ＧＯＴ値の上昇は４
日目ですでに認められ、１５日目まで続いた。一方、Ｃ
ＤＤＰ投与のＩＬ−６投与を併用した群では、いずれの
測定日においてもＧＯＴ値は低く維持され、シスプラチ
ン非投与マウスに生理食塩水を単に投与し続けたマウス
群とほぼ同値を示し、シスプラチン誘発肝毒性軽減、肝
保護を示す予防効果は明確に認められた。表中の各値は
ｎ＝６の平均値±標準誤差を示し、有意差検定は、Ｓｔ
ｕｄｅｎｔ´ｓ Ｔ−ｔｅｓｔ法で行った。＊印は、ｐ
＜０．００５を表し、＊＊印は、ｐ＜０．０１を表す。
（以下、同じ）

【００４４】実施例４ 実施例３で示したように、ＣＤＤＰ誘発肝障害はＣＤＤ
Ｐ投与４日目にすでに発現している。ＩＬ−６に一旦上
昇したＧＯＴ値を低下させる作用があるか否かを検討し
たのが表２の成績である。すなわち、ＩＬ−６投与開始
はＣＤＤＰ投与後７日目から連日皮下投与（２８０μｇ
／ｋｇ／ｄａｙ）で行った。実験開始後９日目（ＩＬ−
６投与後２日目）、１５日目（同８日目）の血漿ＧＯＴ
値は対照群に対し明らかな低下を示し、ＩＬ−６には一
旦上昇したＧＯＴ値を下げる作用、すなわち治療効果が
あることが確認された。

【００４５】

【表２】

【００４６】実施例５ ＧＯＴ（glutamic oxaloacetic trans aminase）は肝障
害を検知する有用な血液生化学的マーカーであるが、肝
疾患以外、例えば新疾患などにおいてもその値が上昇す
ることが知られている。そこで、より肝特異性が高いＧ
ＰＴ（glutamicpyruvic transaminase）値を指標として
測定を行った。

【００４７】Ｃ５７ＢＬ／６マウス（一群６匹）にＣＤ
ＤＰ９．７ｍｇ／ｋｇを腹腔内に単回投与後、翌日から
ＩＬ−６ ２８０μｇ／ｋｇ／ｄａｙを連日皮下投与
し、経時的に血漿ＧＰＴ値を測定した。結果は表３に示
したとおり、ＣＤＤＰ投与４日後にはＧＰＴ値の上昇が
観察された。一方、ＣＤＤＰ投与に引続きＩＬ−６を投
与した群では４日目では差はないものの、９日目、１５
日目では明らかなＧＰＴ値の低下が認められた。

【００４８】

【表３】

【００４９】実施例６ ＣＤＤＰ投与（９．７ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、単回）後、
７日目からＩＬ−６投与（２８０μｇ／ｋｇ／ｄａｙ、
皮下、連日）を開始し、治療効果の有無を調べた。マウ
スはＣ５７ＢＬ／６で一群６匹構成とした。結果は表４
に示したごとく、９日目（ＩＬ−６投与後２日目）、１
５日目（同８日目）測定で明らかなＧＰＴ値減少作用が
見られ、治療効果が認められた。

【００５０】

【表４】

【００５１】実施例７ 一群６匹のＣ５７ＢＬ／６マウスにマイトマイシンＣ
（以下ＭＭＣと略する）２ｍｇ／ｋｇを単回腹腔内に投
与し、翌日から連日１日１回２８０μｇ／ｋｇ／ｄａｙ
のＩＬ−６を皮下投与し、７日目に採血した血漿のＧＰ
Ｔ値を測定した。実験開始前のＧＰＴ値は２４．８±
１．４units ／リットルであり、ＭＭＣ非投与で生理食
塩水のみ皮下投与した群の７日目のＧＰＴ値は２３．０
±１．５units ／リットルと全く同値であった。一方、
ＭＭＣ投与と生理食塩水投与を併用した群の７日目のＧ
ＰＴ値は３５．３±３．５units ／リットルと明らかな
高値を示し、ＭＭＣの肝障害作用が現われた。しかしな
がらＭＭＣ投与とＩＬ−６投与を併用した群の７日目の
ＧＰＴ値は２１．８±３．０units ／リットルと明らか
なＧＰＴ値正常化作用が観察された。

【００５２】実施例８ ＩＬ−１１の調製：ヒト甲状腺癌由来細胞株ＮＩＭ−１
（通山薫ら、日本血液学会誌、５３（５）、８０５（１
９９０））より調製したｍＲＮＡ １μｇから、ｃＤＮ
Ａ合成キットを（ベーリンガー社）を用いて、２本鎖ｃ
ＤＮＡを合成した。手法はｃＤＮＡ合成キット指定の方
法に従った。

【００５３】次に、ＩＬ−１１ｃＤＮＡを取得するため
に次のＤＮＡオリゴマー２本を合成した。 ＩＬ−１１Ｎ ＣＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＣＡＴＧＡＡＣＴＧＴＧＴＴ ＩＬ−１１Ｃ ＣＣＧＡＡＴＴＣＧＴＣＡＣＡＧＣＣＧＡＧＴＣＴＴ

【００５４】ＰＣＲは、ＤＮＡサーマルフイクラーPJ10
00（パーキンエルマー・シータス社）を用いて熱変性９
４℃１分間、アニーリング５０℃２分間、鎖伸長反応７
２℃３分間の条件で４０サイクル行った。サンプルは下
記のように調製したものを５本用い、実験のバラツキ
（ＰＣＲでの読み誤り）の影響を抑えた。 Ｈ₂ Ｏ ７８．５μリットル １０×反応バッファー １０ μリットル 10mM dNTP 混液 ２ μリットル プライマーＩＬ−１１Ｎ(50 μM) ２ μリットル プライマーＩＬ−１１Ｃ(50 μM) ２ μリットル ｃＤＮＡ ５ μリットル Amplitag^TM（宝酒造） ０．５μリットル （全量 １００ μリットル） （１０×反応バッファー：１００mMトリス・塩酸塩(pH
8.3) 、500mM kCl 15mM MgCl₂ 、0.1%ゼラチン）

【００５５】増幅したＤＮＡはフェノール／クロロホル
ム処理（２回）、クロロホルム処理し、エタノール沈殿
により回収した。ＤＮＡは制限酵素EcoRI で切断し、約
０．６ｋｂのフラグメントを１％低融点アガロース電気
泳動により分離し、精製した。このＤＮＡフラグメント
は、ベクターｐＳＲα（Y. Takebe ら、Mol. Cell. Bio
l., 8, 466-472(1988)）をEcoRI で切断後、ＢＡＰ(Bac
terial Alkaline Phosphatase)処理により脱リン酸化し
たものと、ライゲーションし（ライゲーションキット使
用、宝酒造）大腸菌HB101 コンピテントセル（宝酒造）
にトランスフォーメーションした。

【００５６】得られたクローン５個のＤＮＡを取得し、
接続部分の配列解析を行って、目的とするＩＬ−１１発
現プラスミドｐＳＲＩＬ−１１を得た。このＤＮＡ：ｐ
ＳＲＩＬ−１１をＤＥＡＥ−デキストラン法でＣＯＳ−
１細胞に導入して、ＦＣＳ血清５％入り培地で２日間培
養した後、無血清培地で細胞を洗い、無血清培地を加え
て２４時間培養した。この培養上清を０．２２μｍのフ
ィルターで濾過したものを、薬理実験に使用した。

【００５７】実施例９ 一群６匹のＣ５７ＢＬ／６マウスにＣＤＤＰ９０７ｍｇ
／ｋｇを腹腔内に一回投与し（第０日目）、翌日（第１
日目）からＩＬ−１１（実施例８で得た溶液）を１日１
回１匹当たり１００μｌの容量を連日皮下投与した（Ａ
群）。ＣＤＤＰ投与後の対照群には、ＩＬ−１１の代わ
りにベクターのみをＣＯＳ細胞にトランスフェクション
して得た溶液１００μｌを投与した（Ｂ群）。さらに、
別途ＣＤＤＰを投与しない群に対照溶液を連日１００μ
ｌ投与した群を設けた（Ｃ群）。各群については実施例
３にならって、９日目に屠殺して採血し、血漿ＧＯＴと
ＧＰＴを測定した。

【００５８】その結果、Ａ群のＧＯＴ値は、５７．０±
７．２、ＧＰＴ値は１９．５±２．１、Ｂ群のＧＯＴ値
は７８．１±９．５、ＧＰＴ値は２６．３±２．８、Ｃ
群のＧＯＴ値は５４．４±６．９、ＧＰＴ値は２０．１
±２．７であった。

【００５９】

【発明の効果】ＩＬ−６またはＩＬ−１１は、各種の肝
障害により上昇したＧＯＴ値およびＧＰＴ値を低下させ
る作用が優れているため、肝機能保護剤、肝疾患の予防
・治療薬として有用である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 佐藤 雄一郎 神奈川県鎌倉市手広1111番地 東レ株式会 社基礎研究所内 (72)発明者 成戸 昌信 神奈川県鎌倉市手広1111番地 東レ株式会 社基礎研究所内

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 インターロイキン６および／またはイン
   ターロイキン１１を有効成分とする肝疾患の予防・治療
   薬。