HU202278B - Process for producing recombinant gamma-interferonok of improved stability and pharmaceutical compositions comprising same - Google Patents

Process for producing recombinant gamma-interferonok of improved stability and pharmaceutical compositions comprising same Download PDF

Info

Publication number
HU202278B
HU202278B HU844669A HU466984A HU202278B HU 202278 B HU202278 B HU 202278B HU 844669 A HU844669 A HU 844669A HU 466984 A HU466984 A HU 466984A HU 202278 B HU202278 B HU 202278B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
lys
leu
ser
asn
asp
Prior art date
Application number
HU844669A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT36187A (en
Inventor
Patrick William Gray
Ernst Heinrich Rinderknecht
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27072811&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU202278(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of HUT36187A publication Critical patent/HUT36187A/hu
Publication of HU202278B publication Critical patent/HU202278B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/57—IFN-gamma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/811—Interferon
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
    • Y10S930/142—Interferon
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/30—Signal or leader sequence

Description

A találmány tárgya dezoxiribonukleinsav-rekombinációs technológia alkalmazása fokozott aktivitású rekombináns gamma-interferonok előállítására, kiterjed továbbá az ennek során képződő különféle termékek előállítására.
Az emberi eredetű interferonok három csoportba sorolhatók az eltérő antigén jelleg, valamint a biológiai és a biokémiai tulajdonságok alapján.
Az első csoportba leukocita interferonok tartoznak, amelyeket általában az emberi vérben jelenlevő sejtek termelnek vírusos indukció hatására. Ezeket az interferonokat mikroorganizmusokkal állítják elő, és biológiailag aktívaknak bizonyultak (Goeddel, D. és munkatársai, Natúré, 287, 411 (1980); Natúré, 290, 20 (1981); Yelverton, E. és munkatársai, Nucleic Acids Research, 9, 731 (1981)]. Biológiai tulajdonságaik a gyógyításban történő felhasználásra ösztönöznek vírusos fertőzések és rosszindulatú daganatok kezelésénél [Gutterman és munkatársai, Annals of Int. Med., 93, 399 (1980)).
A második csoportba az emberi eredetű fibroblaszt interferon tartozik, amelyeket fibroblasztok termelnek vírusos indukció hatására. Előállításuk szintén mikroorganizmusok felhasználásával történik, és sokféle biológiai hatással rendelkeznek [Goeddel, D. és munkatársai, Nucleic Acids Research, 8, 4057 (1980)]. A klinikai kipróbálások szintén jelzik a lehetséges gyógyászati értékét. A leukocita és a fibroblaszt interferonok igen közeli hasonlóságot mutatnak a biológiai tulajdonságaik tekintetében, annak ellenére, hogy viszonylag csekély mértékben homológok aminosavszinten. Mindkét fenti interferoncsoport körülbelül 165-166 aminosavat tartalmaz, és savval szemben ellenálló fehérjék.
Az emberi eredetű gamma-interferon (amelynek további elnevezése immun interferon, IIF vagy IFN-gamma, rendelkezik az interferonokra jellemző vírusellenes és sejtburjánzás-ellenes tulajdonságokkal, ellentétben azonban a leukocita és fibroblaszt interferonnal, érzékeny pH=2 értékű savas közeg behatására. A DNS-rekombinációs módszerrel történó termelés előtt a gamma-interferonokat elsősorban a limfociták mitogén indukciójával állították elő. Az emberi eredetű gamma-interferon az antigén jelleg szempontjából élesen megkülönböztethető a leukocita és a fibroblaszt interferontól. Gray, Goeddel és munkatársai számoltak be elsőként egy rekombináns gamma-interferon képződéséről [Gray, P. és munkatársai, Natúré, 295, 503-508 (1982)], amely az emberi eredetű gamma-interferon jellemző tulajdonságait mutatta, azaz vírusellenes és sejtburjánzás-ellenes hatású volt, s érzékeny volt pH=2 érték behatására. A Gray és Goeddel által előállított, Escherichia coli segitségével termelt rekombináns gamma-interferon 146 aminosavból állt, s a molekula N-terminális része CYS-TYR-CYSszekvenciával kezdődött.
Dérynék és más kutatók leírtak [Dérynék, R. és munkatársai, Nucleic Acids Research, 10, 3605 (1982)] egy további rekombináns gamma-interferont, amelynek ugyanolyan N-végcsoportja van és egyetlen aminosav szubsztitúciót tartalmaz, s a polipeptid valószínűleg a korábban megadottnak [Gray, P. és munkatársai, Natúré, 295, 503-508 (1982IJ egy alléi változata.
Más kutatók még további rekombináns gamma-interferonok termeléséről számoltak be. Ezeknél az interferonoknál feltehetőleg helyettesítve van egy vagy több olyan aminosav, amely szerepel Goeddel és Gray eredeti publikációjában [Gray, P. és munkatársai, Natúré, 295, 503-508 (1982)].
Például Alton és munkatársai [ .Production, Characterization and Biological Effects of Recombinant DNA Derived Humán IFN-alpha and IFN-gamma Analogs, The Biology of the Interferon System, DeMaeyer and Schellekens, Eds., Elsevier Science Publ. 1983] egy sor olyan gamma-interferonról számolnak be, amelynél a Gray és munkatársai által leírt gamma-interferon 81-es helyzetű egyetlen aminosavjának helyettesítése mindössze 70X-os aktivitású terméket eredményezett, s az 1-es, 2-es és 3-as helyzetű cys-tyr-cys szekvencia törlése tovább csökkentette az aktivitást, és így olyan gamma-interferont kaptak, amely a Gray és munkatársai által vizsgált gamma-interferon aktivitásának csak 49%-ával rendelkezett.
Kísérleteink során problematikusoknak bizonyultak azok a rekombináns gamma-interferonok, amelyek N-terminális aminosav-szekvinciája ciszteint tartalmaz, az oligomerizáció szempontjából, amelynél egy vagy több ciszteincsoport szulfhidrilcsoportjai részt vehetnek a diszulfidkötés kialakulásában. Az, hogy nem tudtuk tökéletesen redukálni ezeket a feltételezett diszulfidkőtéseket, arra mutat, hogy ez a probléma összetettebb lehet, s a ciszteinhez kapcsolódó tirozin hidroxilcsoportja is részt vehet a reakcióban. Ezek a rekombináns gamma-interferonok valamivel kevésbé voltak stabilak, és vagy ennek folytán, vagy más okokból kifolyólag kevéssé voltak előnyösek.
A találmány tárgyát fokozott stabilitású és aktivitású rekombináns gamma-interferonok előállítása képezi. Ezek közül különösen előnyös egy olyan rekombináns gamma-interferon, amely az N-végcsoporttól kezdve az alábbi aminosav-szekvenciát tartalmazza (a következők során ezt teljes szekvenciának nevezzük):
X-Y-ASP-PRO-TYR-VAL-LYS-GLU-ALA-GLU123456789
-ASN-LEU-LYS-LYS-TYR-PHE-ASN-ALA-GLY10 11 12 13 14 15 16 17 18
-H1S-SER-ASP-VAL-ALA-ASP-ASN-GLY-THR19 20 21 22 23 24 25 26 27
HU 202278 Β
-LEU-PHE-LEU-GLY-ILE-LEU-LYS-ASN-TRP28 29 30 31 32 33 34 35 36
-LYS-GLU-GLU-SER-ASP-ARG-LYS-ILE-MET37 38 39 40 41 42 43 44 45
-GLN-SER-GLN-ILE-VAL-SER-PHE-TYR-PHE46 47 48 49 50 51 52 53 54
-LYS-LEU-PHE-LYS-ASN-PHE-LYS-ASP-ASP55 56 57 58 59 60 61 62 63
-GLN-SER-ILE-GLN-LYS-SER-VAL-GLU-THR64 65 66 67 68 69 70 71 72
-ILE-LYS-GLU-ASP-MET-ASN-VAL-LYS-PHE73 74 75 76 77 78 79 80 81
-PHE-ASN-SER-ASN-LYS-LYS-LYS-ARG-ASP82 83 84 85 86 87 88 89 90
-ASP-PHE-GLU-LYS-LEU-THR-ASN-TYR-SER91 92 93 94 95 96 97 98 99
-VAL-THR-ASP-LEU-ASN-VAL-GLN-ARG-LYS100 101 102 103 104 105 106 107 108
-ALA-ILE-HIS-GLU-LEU-ILE-GLN-VAL-MET109 110 111 112 113 114 115 116 117
-ALA-GLU-LEU-SER-PRO-ALA-ALA-LYS-THR 118 119 120 121 122 123 124 125 126
-GLY-LYS-ARG-LYS-ARG-SER-GLN-MET-LEU127 128 129 130 131 132 133 134 135
-PHE-ARG-GLY-ARG-ARG-ALA-SER-GLN 136 137 138 139 140 141 142 143 ahol X jelentése metionin-maradék vagy hidrogénatom és Y jelentése glutamin-maradék, vagy ha X jelentése hidrogénatom, akkor vagy glutamin- vagy piroglutamát-maradék. A fenti aminosav-szekvenciájú gamma-interferonok azokat az analógokat is tartalmazzák, amelyekből hiányoznak a karboxil-végcsoportú megfelelő részek.
A találmány a megfelelő klónozott génekre, az azokat tartalmazó kifejező vektorokra és azokra a transzformált termékekre is kiterjed, amelyek felhasználhatók a találmány szerinti interferonok DNS-rekombinációval történő előállításához.
A találmány szerinti előnyös rekombináns gamma-interferonok (összehasonlítva a szakirodalomban korábban jellemzettekkel) közelítik meg a legjobban a természetes eredetű gamma-interferon igazi aminosav-szekvenciáját. A természetes eredetű gamma-interferont természetes forrásokból különítettük el és teljes mértékben azonosítottuk. A találmány szerinti előnyös gamma-interferonok stabilitása és aktivitása lényegesen kedvezőbb a szakirodalomban korábban leírtakénál.
A találmányt a következők során részletesen ismertetjük, felhasználva ehhez az ábrákat is.
Az 1. ábra egy találmány szerinti rekombináns gamma-interferon 1-143 arainosavját mulatja be, továbbá az egy jel szekvenciával összekapcsolt aminosav-szekvenciát kódoló DNS-szekvenciát, amely utóbbi az 5'és 3’- leforditatlan DNS-tartományokat is tartalmazza.
A 2. ábra vázlatosan ismertet egy olyan plazmidot, amely egy találmány szerinti rekombináns gamma-interferon Escherichia coli törzsben történő közvetlen szintézisét kódolja. Az ábráról a plazmid előállítása is leolvasható.
A 3. ábrán a találmány szerint előállított gamma-interferon fokozott stabilitását bizonyító adatok láthatók.
Ismeretes, hogy a természetben megtalálható, emberi eredetű gamma-interferon (azaz amely az emberi vérben lévő limfociták mitogén indukálásával, majd tisztítással nyerhető) olyan polipeptid, amelyből hiányzik a Gray és munkatársai által a rekombináns gamma-interferonnak tulajdonított CYS-TYR-CYS- N-végcsoport; ez utóbbi interferon szekvenciáját Gray és munkatársai a fentebb idézett közleményükben ismertették. A nagy mértékben tisztított, természetben megtalálható gamma-interferon tripszines emésztése esetén olyan szekvenciákat kaptunk, amelyek aminosav-összetétele lényegében megfelelt a Gray és munkatársai által leirt rekombináns gamma-interferon N-terminális részének, nem tartalmazta azonban a CYS-TYR-CYS szekvenciát. A természetben megtalálható (natív) gamma-interferon N-végcsoportjától végzett aminosavszekvencia-analizis eredménytelennek bizonyult, és ebből azt a következtetést lehetett levonni, hogy a molekula N-végcsoportjánál lévő alfa-aminosav védöcsoporttal volt ellátva. Mivel a Gray és munkatársai által megadott második cisztein után elhelyezkedő első aminosav, amelyet a komplementer DNS (cDNS) kódolt, GLN (glutamin) volt, úgy véltük, hogy a GLN-maradék ciklizálása inkább piroglutamétot eredményezett, így az N-végcsoport blokkolva volt. Amikor a piroglutamátot eltávolítottuk piroglutamát-aminopeptidáz enzim segítségével, a következő kódolt aminosav, az ASP szabad alfa-aminocsoportja maradt vissza, és végrehajthatóvá vált a szekvencia analízise. Ilyen módon először tudtuk jellemezni a természetben megtalálható, emberi eredetű gamma-interferont.
A CYS-TYR-CYS- szekvenciát tartalmazó, emberi eredetű rekombináns gamma-interferonra vonatkozó komplementer DNS megfelelő módosítása lehetővé tette egy új rekombináns gamma-interferon Escherichia coli törzsben történő közvetlen kifejezését egy olyan komplementer DNS (cDNS) felhasználásával, amely ezt a fehérjét kódolta. E fehérje teljes szekvenciája a fentebb ismertetett, X jelen-35
HU 202278 Β tése MET-, Y jelentése GLN-. Az N-végcsoportnál lévő metionint a genetikai információt közvetítő ribonukleinsav (mRNS) AUG transzlációs startjele kódolja, és például az Escherichia coli törzsben történő kifejezéskor a gazdasejtek nem távolitják el. Más mikrobiológiai rendszerek - például a Pseudomonas - eltávolíthatják a metionint, amelyre, úgy tűnik, nincs feltétlenül szükség az aktivitáshoz. Ha a metionin nincs jelen, az alkalmazott rendszertől függően, a GLN-maradék piroglutamáttá ciklizálódhat, ismét anélkül azonban, hogy az aktivitás csökkenne.
Azt tapasztaltuk, hogy a Gray és munkatársai által korábban leírt, a CYS-TYR-CYS- szekvenciát tartalmazó rekombináns gamma-interferon . stabilitása számára kedvező, ha emberi szérum albumint is teszünk az interferont tartalmazó gyógyászati készítménybe. Ahhoz azonban, hogy szérum albumin jelen lehessen a végső liofilizált termékben, szükség van arra, hogy bizonyos minőségellenőrző lépéseket végezzünk, inkább a liofilizálás előtt, mint a kész termékkel. A találmány szerinti új rekombináns gamma-interferon esetén viszont a liofilizált alakban jelenlevő anyag szérum albumin bevitele nélkül is eléggé stabilnak bizonyult. Kívánt esetben azonban a találmány szerinti gamma-interferonokhoz is adhatunk gyógyászatilag elfogadható mennyiségű emberi szérum albumint.
A fentieken túlmenően, a CYS-TYR-CYSszekvenciát nem tartalmazó, találmány szerinti, emberi eredetű rekombináns gamma-interferonok a citopatikus hatás gátlásával kapcsolatos vizsgálatoknál lényegesen nagyobb vírusellenes hatást mutattak, mint a CYS-TYR-CYS- szekvenciával rendelkező analógjaik. Az aktivitást a szokásos módon mikrotitráló lemezeken vizsgáltuk enkefalomiokarditisz vírus A549 emberi tűdőkarcinoma sejteken kifejtett citopatikus hatása gátlása alapján. [Lásd W.E. Stewart II, .The Interferon System', Springer Verlag, New York, 1979, 13-26. oldal].
A találmány szerinti rekombináns gamma-interferonok mindegyike tartalmazza a fenti teljes szekvencia első 126 aminosavját. A teljes szekvenciához képest a karboxil-végcsoportot tartalmazó végükön különbözőképpen megrövidített gamma-interferonok továbbra is mutatják az emberi eredetű gamma-interferon jellemző tulajdonságait, jóllehet egyes esetekben csökkentett mértékben, mindaddig, amíg tartalmazzák az 1-től 126-ig terjedő aminosavakat. Valóban, a Dérynék és munkatársai fentebb idézett munkájában leírt, a CYS-TYR-CYS- szekvenciát tartalmazó analóggal folytatott kísérletek azt mutatták, hogy idegen szekvenciákkal lehet helyettesíteni a jelen számozás szerinti 132. aminosav utáni részt anélkül, hogy az aktivitás megszűnne. [Lásd például Dérynék, R. és munkatársai, Interferon Scientific Memoranda, August 1982, Memo-l-A1193/2.].
A rendelkezésünkre álló kezdeti bizonyítékok alátámasztják azt a feltevést, hogy amíg az 1-ből 126-ig (THR) terjedő aminosavak viszonylag szorosan vannak kötve egy háromdimenziós konfigurációban, amelyet öszszefüggésbe hozunk az aktivitással, a teljes szekvenciában jelenlevő többi aminosav kevésbé van határok közé szorítva, és viszonylag érzékeny a proteolizisre. A korlátozó körülmények között végzett tripszines emésztés eltávolítja a szekvencia különböző részeit a 126. aminosav után, előtte azonban nem.
Az általunk előállított, természetben előforduló (natív) gamma-interferonok molekulája különféle módon nyúlik túl a 127., 128.,
129., 130., 132. és 134. számú aminosavon. Észleltünk olyan, teljesen aktív rekombináns gamma-interferont, amelynek az aminosav-szekvenciája a metionin után különféleképpen tartalmazta az 1-tól 139-ig és 1-től 131-ig terjedő aminosavakat. Ez utóbbit a rekombináns gamma-interferon korlátozott mértékű tripszines emésztésével nyertük, majd azonosítottuk a szekvenciákat. A tripszinnel feltárt hasonló töredékek, amelyek változó módon a 128. és 129. aminosav körül végződtek (a metionin után) megőrizték az aktivitásukat, jóllehet az jelentősen kisebb volt. Másrészt viszont az N-végcsoportú metioninon kívül 125 aminosavat tartalmazó anyag amelyet úgy kaptunk, hogy emésztéssel eltávolitottuk a 126-os helyzetű treonint és az utána következő aminosavakat - aktivitása a feltáratlan anyag aktivitásának még 1%-át sem tette ki a citopatikus hatás gátlásánál.
A re kombinálással előállított gamma-interferon - amellett, hogy tartalmaz a lánc elején egy metionint, feltéve, hogy az nem hasad le a gazdasejtekben a képződés során - nagyobb részarányban egy 139 aminosavat tartalmazó anyagból, kisebb részarányban pedig egy 143 aminosavat tartalmazó anyagból áll (az 1. ábrán feltüntetett számozási rendszer alapján). A két anyag összetétele körülbelül 95%-nál nagyobb mértékben, különösen előnyösen mintegy 97%-nól nagyobb mértékben felel meg a 139 aminosavból álló anyagénak. A korlátozó körülmények között végzett tripszines emésztés hasonló módon eltávolítja a különböző részeket a 126. aminosav után. Az ilyen korlátozó tripszines emésztés után a rekombináns gamma-interferon olyan anyagokból áll, amelyek 125 aminosavat (a lánc elején lévő metioninnal együtt 126 aminosavat), 129, 131 és 134 aminosavat tartalmaznak. Ezek az anyagok megőrizték az aktivitásukat, bár az jelentősen csökkent, mivel károsodott a 125. aminosav és a 129. aminosav közötti rész. Gyakorlatilag teljesen aktívak maradnak azok az anyagok, amelyek legalább 129 aminosavat, különösen pedig legalább mintegy 131 aminosavat tartalmaz5
HU 202278 Β nak, azaz amelyek mintegy 129-143 aminosavból állnak.
Tekintettel a fentiekre, nyilvánvaló, hogy a találmány nem csupán azokra a rekombináns gamma-interferonokra terjed ki, amelyek a fentebb vázolt teljes szekvenciával rendelkeznek, hanem azokra az anyagokra és keverékeikre, amelyekből hiányzik a 143. aminosav vagy a Z aminosavszekvencia és a 143. aminosav közötti rész, ahol Z jelentése
127., 128., 129., 130., 131., 132., 133., 134.,
135., 136., 137., 138., 139. 140., 141. vagy 142. számú aminosav.
Hasonló módon nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti rekombináns gamma-interferonokat kódoló kétszálas DNS-szekvenciák nem csupán azokat foglalják magukba, amelyek a fenti teljes szekvenciát kódolják, hanem azokat is, amelyek a különböző elhasitott, fentebb leírt analógokat kódolják.
.Rekombináns gamma-interferon'-on rekombináns DNS-technológiával kialakított replikálható expressziós vektor által egy transzformáns sejtben kifejezett (és a transzformáns sejt által akár glikozilezett, akár nem glikozilezett) polipeptidet értünk, amely kisebb vagy nagyobb mértékben rendelkezik vírusellenes és sejtburjánzás-ellenes hatással emberen, továbbá érzékeny pH=2 értékű savas közeg behatására, hasonlóan a természetben megtalálható (natív), emberi eredetű (humán) gamma-interferonhoz.
A találmány szerinti rekombináns gamma-interferonokat ügy tekintjük, hogy dimereket képeznek két polipeptid bői, amelyek mindegyike tartalmazza legalább az 1-től 126-ig terjedő aminosavakat (e polipeptidek azonos vagy eltérő számú aminosavból állhatnak). Nem ismerjük pontosan azt a kémiai mechanizmust, amellyel a két polipeptidből a dimer kialakul, feltételezzük azonban, hogy másról van szó, mint kovalens kötésről. Úgy tűnik, hogy a dimerek spontán módon jönnek létre, és elkerülhetetleneknek látszanak az itt leirt rendszerek esetén. Ennek következtében, ha a találmány szerinti rekombináns gamma-interferonokat gyógyításra felhasználjuk, azok rendszerint dimerizált alakban lesznek jelen.
Továbbá magától értetődik, hogy hasonló módon a különbözőképpen jellemzett rekombináns gamma-interferonokkal foglalkozó szakirodalmi publikciókhoz [Derynck, R. és munkatársai, Interferon Scientific Memoranda, August 1982, Memo-I-Al 193/2; Derynck, R. és munkatársai, .Expression of Humán Interferon Gamma in Heterologous Systems', Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, Inc., 1983, 247, oldal], az interferon aktivitásának megszűnése nélkül lehetőség van aminosavak kicserélésére vagy hozzáadáséra, különösen egyetlen aminosav kicserélésére vagy hozzáadására avagy aminosavak csoportjainak kicserélésére a 126. számú aminosav előtt vagy után. úgy véljük, (i hogy a szakember számára nem jelent nehézséget az aminosavak kicserélésének vagy hozzáadásának végrehajtása, és ennek során nem távolodik el a találmány oltalmi körétől. A találmány szerinti rekombináns gamma-interferonok a teljes szekvencia (lásd az 1. ábrát) módosításait és alléi változatait tartalmazó anyagokat is magukba foglalják, amelyek biológiai hatása egyenértékű vagy nagyobb, mint a teljes szekvenciát tartalmazó anyagé.
Jellemző módon a tisztított rekombináns gamnxa-inLerferonok gyakorlatilag mentesek más, emberi eredetű fehérjétől, és így megkülönböztethetők a mindeddig rendelkezésre álló, természetes, emberi eredetű gamma-interferon készítményektől.
A találmány olyan gyógyászati készítményekre is kiterjed, amelyekben a rekombináns gamma-interferon tisztasága - a készítménybe való bevitel előtt - nagyobb mint 95%, előnyösen nagyobb, mint 98%. így ezek a gyógyászati készítmények szintén megkülönböztethetők a natív gamma-interferonokat tartalmazó készítményektől, amelyek eddig hozzáférhetők voltak.
Azok a találmány szerinti termékek, amelyeknél az N-terminális aminosavmaradék metionilcsoport, szintén megkülönböztethetők az emberi testben képződő gamma-interferonoktól, és a CYS-TYR-CYS- szekvencia hiányán kívül ebben is eltérnek azoktól az interferonoktól, amelyek szekvenciáját Gray és munkatársai ismertették lNature, 295, 503-508 (1982)].
A leírásban szereplő reprodukálható expressziós vektorok kétszálas DNS-ből, előnyösen olyan plazmidokból állnak, amelyek a kővetkező részeket tartalmazzák; replikációs origó, promoter vagy promoter-operátor, egy, a riboszóma megkötésének helyét kódoló szekvencia, a transzlációs startjelre vonatkozó kodon és azzal megfelelő leolvasó fázisban egy gén, amely a kérdéses rekombináns gamma-interferont kódolja, majd a transzláció megállítására vonatkozó kodon(ok).
A szakember jól ismeri a DNS-rekombináció általános módszereit és szakkifejezéseit, utalunk azonban D. Goeddei és munkatársai 0077670 sz. publikált európai szabadalmi bejelentésére a gyakorlati ismeretekkel kapcsolatosan.
A találmányt az alábbi példa segítségével részletesen ismertetjük.
Példa
A. Klónozás
Gray és munkatársai fentebb idézett publikációjában leirt módon állítottunk eló gamma-interferon komplementer DNS szekvenciákat tartalmazó rekombináns DNS kiónokat indukált emberi eredetű perifériás vér
HU 202278 Β limfocitákból információt hordozó ribonukleinsavval (mRNS). A p67 klón DNS-szekvenciáját az 1. ábrán mutatjuk be. Az 5’ nem transzlálódó szakasz után 23 aminosav ból álló prekurzor- vagy jelpeptidet kódoló 69 nukleotid következik, majd 143 aminosav ból álló érett interferon polipeptidet kódoló 429 nukleotid és a 3' nem transzlálódó szekvenciájú S87 nukleotid következik.
B. Kifejezés
1. Escherichia coli alkalmazása
Ahhoz, hogy az Escherichia coli törzs jelentős mennyiségű rekombináns gamma-interferont termeljen, a fehérjeszintézisnek az érett polipeptid glutamin kodon ját (1. aminosavját) közvetlenül megelőző ATG kodonnál kell beindulnia, és nem a jelpeptidben lévő ATG-nél (SÍ aminosav) (1. ábra). A 2. ábrán mutatjuk be vázlatosan azt az eljárást, amellyel közvetlenül a p67 cDNS inszertumot (betoldást) termeltük Escherichia coli törzsben. Hasonló módon jártunk el, mint Gray és munkatársai a cDNS inszertum Escherichia coli törzsben történő termelésénél, lásd a fentebb idézett közleményüket.
A jelpeptidet kódoló tartomány eltávolításához egy Avall restrikciós helyet használtunk, amely a feltételezett érett kódoló szekvencia 2. kodonjánál helyezkedett el. Két szintetikus dezoxioligonukleotidot terveztünk, amelyek helyreállítják az 1. és 2. aminosavra vonatkozó kodonokat, magukba foglalnak egy ATG transzlációkiváltó kodont és létrehoznak egy XBal kohéziós végződést. Ezt a két oligomert hozzákapcsoltuk a cDNS inszertum fennmaradó részéhez, és így egy 1063 bázispárból álló szintetikus-természetes hibrid gént hoztunk létre, amely egy 144 aminosavból álló polipeptidet kódol és XBal és PstI helyekhez kapcsolódik. Ezt a gént beillesztettük a pLelF A25 plazmidba [Goeddel, D. és munkatársai, Natúré, 287, 411-416 (1980)], az XBal és PstI restrikciós helyek közé, s ezáltal megkaptuk a pga»«»-CYC5 termelő plazmidot. Az Escherichia coli W3110 törzset (F—, lambda-, protrof) (ATCC 27325, transzformáltuk ezzel a plazmiddal, és így az Escherichia coli W3110/pga.«.-CYC5 gazdasejt-vektor kombinációhoz jutottunk.
2. Sejttenyészet alkalmazása
Mind a jelpeptidet, mind pedig a gamma-interferont kódoló gént, amint az az 1. ábrán látható, COS-7 sejtekben fejeztük ki (Gluzman, Cell, 23, 175 (1981)] radioaktív izotóppal jelzett cisztein vagy metionin jelenlétében. Megállapítottuk, hogy a génből olyan érett gamma-interferon képződik, amelynek az N-terminális aminosavjai az 1. ábrán láthatók. (Eltérően attól az esettől, amikor az interferon termelését Escherichia coli törzsben végezzük, az emlősöktől származó sejtrendszerekben, például a fenti sejtekben képződő gamma-interferonból hiányzik az Nterminális metionin.) mm átmérőjű Petri-csészékben lévő COS-7 sejtek összefolyó monomolekuláris rétegeit átfertöztűk DNS-sel a módosított DEAE-dextrán eljárás alkalmazásával. Három nappal a DNS hozzáadása után eltávolítottuk a táptalajokat. Mindegyik lemezsorozathoz 100 uCi S35-metioninnal vagy S^-ciszteinnel kiegészített 2 ml DMEM-t adtunk. A táptalajokat 16 órán át inkubáltuk a radioaktív izotóppal jelzett aminosav jelenlétében, majd 500 ul mennyiségükből immunkicsapást végeztünk első antitestként anti-gamma-interferon monoklonális antitest vagy anti-HBsAg monoklonális antitest, második antitestként pedig nyúl anti-egér IgG antitest (Cappell Inc.) alkalmazásával. Az antitesttel való reakciót, majd utána Staphylococcus A sejtekhez (Calbiochem) történő kapcsolást Berman, P. és munkatársai ismertetik [Science, 222, 524 (1983)]. A mintákat újból szuszpendáltuk nátrium-dodecil-szulfát-merkaptoetanolban, és elektroforézisnek vetettük őket alá 10% nátrium-dodecil-szulfát/poliakrilamid géleken. A gélt etanolos 7% ecetsavval kezeltük, Enhance (New England Nuclear, fluor-oldattal átitattuk, szárítottuk, majd a kibocsájtott sugárzással két hétig világítottunk meg egy Kodak AR5 filmet, erősítő szűrő (Dupont, alkalmazásával.
Vizsgálataink sorén a következő plazmidokat használtuk: pSVgamma69 [0077670 sz. publikált európai szabadalmi bejelentés]; pDL Rí [Simonsen és munkatársai, Mól. Cell. Bioi., 3, 2250 (1983)] ez egy hepatitisz B vírus felületi antigén termelő vektor, amelyen a pSVgamma69 alapul; és pDL Rigámmá Sau, ez policisztron plazmid, amely a pSVgamma69 plazmid 830 bázispárból álló SAU3a töredékét tartalmazza, és átfogja a pDL Rl plazmid EcoRI helyére illesztett, az egész gamma-interferont kódoló szekvenciákat. Ez utóbbi plazmid átírást hoz létre, amely mind a gamma-interferont, mind pedig a HBsAg-t kódoló tartományokat tartalmazza.
Az S35-ciszteinnel és S35-metioninnal jelzett fehérjék - amelyek vagy anti-gamma-interferonnal (A, vagy anti-HBsAg (B, anti-611
HU 202278 Β
3. Fermentálás
A rekombináns gamma-interferont olyan fermentorokban termeljük, amelyek munkatérfogata 10-1000 liter. A fermentáláshoz használt táptalaj az alábbi összetételű:
testekkel reagálnak - összehasonlítása azt mutatta, hogy sem a glikozilezett (molekulatömeg 29000), sem a monoglikozilezett (molekulatömeg 18000) helyzethez vándorló anyagnál nem következett be specifikus immunkicsapás az S35-cÍ6Zteinnel jelzett pDL Rl- gamma Sau plazmiddal átfertózött sejtek esetén anti-gamma-interferon antitest alkalmazásakor, ellentétben az S35-metioninnal jelzett sejtekkel, amelyeknél tapasztalható volt a gamma-interferon immunkicsapása.
C. Fermentálásos termelés
Az emberi eredetű rekombináns gamma-interferont Escherichia coli W3110/pg»··»-CYC5 alkalmazásával termeltük 10-1000 liter közötti térfogatú sarzsokban. Fermentálás után az interferont tartalmazó Escherichia coli sejteket kinyertük a táptalajként alkalmazott húslevesből a rekombináns gamma-interferon elkülönítése és tisztítása céljából. A következőkben leírjuk a fermentálást és a sejtkinyerést.
1. Törzstenyészetek készítése és fenntartása
Steril lombikokban lévő 150-500 ml steril táptalajban törzstenyészetet készítettünk. A steril táptalaj összetétele az alábbi: Bactotryptone 10 g/liter élesztókivonat 5 g/liter nátrium-klorid 5-10 mg/liter
A táptalajt ezután beoltjuk Escherichia coli W3110/pga«M-CYC5 primer tenyészetével, A beoltott lombikot rázógépen inkubáljuk 25-37 ®C hőmérsékleten mindaddig, amíg az 550 nm-nél mért abszorbancia 1,0 nem lesz. 30 térfogat %-os dimetil-szulfoxidból 50 térfogat% mennyiséget adunk a húsleveshez. A tenyészet 1-1 ml térfogatú alikvot részeit azonnal steril fiolákba töltjük és azokat lezárjuk. A fiolákat -60 °C-on vagy ennél alacsonyabb hőmérsékleten tároljuk. Mindegyik fermentáláshoz törzstenyészetet viszünk be a táptalajba oltóanyagként.
2. Oltóanyag készítése
Az oltóanyagot a fentebb leirt táptalaj (L.B. Broth, alkalmazásával készítjük el rázólombikokban vagy kis fermentorokban. 37 °C hőmérsékleten 8 órán át végzett inkubálás után az oltóanyagot fermentorba visszük át. Az oltóanyag térfogata a fermentált térfogat 2-10 százalékét alkotja.
literenként
glükóz* 50-100 g
ammónium-szulfát 4,0-8,0 g
dikélium-hidrogén-foszfát 3,0-5,0 g
kálium-dihidrogén-foszfát 5,0-8,0 g
magnézium-szulfát-
-heptahidrát 0,5-5,1 g
nátrium-citrát-
-dihidrát 0,5-2,0 g
UCON LB-625 0,2-2,0 ml
vas(III)-klorid-
-hexahidrát 0,005-0,15 g
cink-szulfát-
-heptahidrát 0,001-0,15 g
kobalt-klorid-
-hexahidrát 0,001-0,005 g
nátrium-molibdát-
-dihidrát 0,001-0,005 g
réz(II)-szulfát-
-pentahidrét 0,001-0,005 g
bórsav 0,001-0,005 g
mangán-szulfát-
- monohidrát 0,001-0,005 g
sósav 0,0-1,0 ml
tiamin-hidroklorid 0,0-0,1 g
tetraciklin-hidroklorid 0,001-0,01 g
L-triptofanM 0,1-0,5 g
élesztőkivonat 2,0-8,0 g
3-béta-indolil-akrilsav 0,02-0,10 g
* A glükóz és a triptofán egy réezét már
kezdetben bemérjük a fermentorba, a fennmaradó részt pedig a fermentálás alatt adagoljuk.
A táptalaj alkotórészeit hőkezeléssel vagy szűréssel sterilizáljuk a fermentáláshoz történő felhasználás előtt.
A fermentálást 25-40 °C-on vitelezzük ki. A többi üzemi paraméter az alábbi:
Keverés: 100-1000 fordulat/perc
Levegőztetés: 0,5-1,5 tf./tf. (a levegőt oxigénnel kiegészítjük, ha szükséges) pH: 6,5-7,5 (ammónium-hidroxid hozzáadásával állítjuk be)
4. Tisztítás
a. A rekombináns gamma-interferon extrakciója
Az Escherichia coli sejteket olyan táptalajban szuszpendáljuk, amely sókat és alkalmas puffért tartalmaz, s pH-értéke 6-9 közötti, előnyösen 9-hez közeli. A rekombináns gamma-interferont oly módon extraháljuk, hogy a sejtszuszpenziót nagynyomású kolloid
-713
HU 202278 Β malomban, például Gaulin-malomban homogenizáljuk. Az oldathoz annyi polietilénimint adunk, hogy a koncentrációja 0,1-1 vegyesX legyen. A felülúszó folyadék tartalmazza a gamma-interferont.
b. A rekombináns gamma-interferon részleges tisztítása szilicium-dioxid-alapú adszorbensen
A fenti a) pont szerint kapott felülúszó folyadékot szilicium-dioxid-alapu adszorbensen adszorbeáljuk, az adszorbenst a szenynyező anyagok eltávolítására 6-9 közötti pH-értékü megfelelő sóoldatokkal mossuk. A rekombináns gamma-interferont 0,5-1,0 M tetrametil-ammónium-kloridot tartalmazó oldattal eluáljuk. A részleges tisztítás valamennyi lépését 7-9 közötti pH-tartományban hajtjuk végre.
c. A rekombináns gamma-interferon részleges tisztítása anioncserélő kromatográfia val
A fenti b) pont szerint kapott eluátumot dializáljuk és anioncserélő kromatografáló oszlopon adszorbeáljuk, amelyről mosással távolítjuk el a szennyező anyagokat. A rekombináns gamma-interferont növekvő sókoncentrációjú oldattal eluáljuk. Erre a célra alkalmazható jellemző anioncserélő gyanta például a karboxi-metil-cellulóz és a szulfo-etil-cellulöz. Valamennyi műveletet 7-9 közötti pH-tartományban vitelezzük ki.
d. A rekombináns gamma-interferon részleges tisztítása kalcium-foszfát gélen végzett kromatográfiával
A fenti c) pont szerint kapott eluátumot kalcium-foszfáton adszorbeáljuk, majd ez utóbbiról mosással eltávolítjuk a szennyező anyagokat. A rekombináns gamma-interferont növekvő sókoncentrációjú és növekvő foszfátkoncentrációjú oldatokkal eluáljuk. Az összes műveletet ennél a lépésnél 7-9 közötti pH-tartományban vitelezzük ki.
e. A rekombináns gamma-interferon részleges tisztítása anioncserélő kromatográfia val
A fenti d) pont szerint kapott eluátumot dializáljuk és anioncserélő kromatografáló oszlopon adszorbeáljuk, amelyről mosással távolítjuk el a szennyező anyagokat. A rekombináns gamma-interferont növekvő sókoncentrációjú oldattal eluáljuk. Erre a célra alkalmazható jellegzetes anioncserélő kromatografáló gyanta például a karboxi-metil-cellulóz és a szulfo-etil-cellulóz. Az összes műveletet ennél a lépésnél 7-9 közötti pH-tartományban vitelezzük ki.
f. A rekombináns gamma-interferon részleges tisztítása gélpermeaciós kromatográfiával
A fenti e) pont szerint kapott eluátumot visszük fel a gélpermeaciós oszlopra, amelyet sóoldattal eluálunk. A rekombináns gamma-interferont tartalmazó frakciókat egyesítjük a hatóanyag elkülönítése céljából. Az összes műveletet ennél a lépésnél 7-9 közötti pH-tartományban vitelezzük ki.
g. A C-terminális aminosav-szekvencia
A C-terminális szekvencia meghatározásához a mintákat 70%-os hangyasav alkalmazásával dializáltuk, a polipeptid láncot cianogénbromiddal elhasitottuk, majd a kapott peptideket Altex Ultraephere C8 fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás oszlopon választottuk szét. A maximumoknak megfelelő frakciókat összegyűjtöttük, majd aminosav- és szekvencia-analízisnek vetettük alá. Az egyik C-terminális peptid -leu-phe-arg-gly-arg volt (az 1. ábrán látható 135-139 számú rész). Némelyik esetben egy további peptidet is kimutattunk: -leu-phe-arg-gly-arg-arg-ala-ser-gln (az 1. ábrán látható 135-143 számú rész).
E két peptid egymáshoz viszonyított arányát úgy határoztuk meg, hogy az aminosav-analízis alapján ismert mennyiségeket vittünk a fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatografáló oszlopra, és meghatároztuk a peptidekhez tartozó maximumok magasságát. Három sarzsnál végeztük el ezeket a vizsgálatokat, és mindegyik esetben azt tapasztaltuk, hogy kevesebb mint 2% mennyiségben van jelen a hosszabb peptid, mig a rövidebb peptid mennyisége több mint 98%.
Ezek az adatok összhangban vannak azzal, hogy az Escherichia coli 139 aminosavból és 143 aminosavból álló interferonok elegyét termeli - nem számítva az N-terminális metionint, amely mindegyik esetben szintén jelen van -, s a mennyiségük körülbelül 98% illetve mintegy 2%.
5. Gyógyászati készítmény előállítása
A fentiek szerint előállított rekombináns gamma-interferont célszerűen parenterálisan beadható gyógyászati készítménnyé alakítjuk. Ennek összetétele az alábbi.
-815
HU 202278 Β
Mennyiség ampullánként, mg
Komponens 0,5 mg-os ampulla1 2,0 mg-os ampulla101
emberi eredetű rekombináns
gamma-interferon 0,5 2,0
mannit 100 80
borostyánkósav-dinátriumsó-
-hexahidrét 12,4 9,9
glicin 5,6 4,5
nátrium-klorid 4,4 3,5
poliszorbát 20 0,8 0,6
borostyánkősav 0,5 0,4
x Befecskendezéshez az ampulla tartalmát 2,5 ml steril vizben oldjuk. “ Befecskendezéshez az ampulla tartalmát 2,0 ml steril vízben oldjuk.
A találmány szerinti interferonokat gyógyászatilag megfelelő dózisban alkalmazhatjuk, például 1,0 mg/ro2 testfelület dózisban.
D. Különféle gamma-interferonok aktivitásénak meghatározása tripszinnel történő feltárás után
A karboxil-végcsoportú aminosavakban eltérő különböző gamma-interferonok aktivitásának meghatározáséra, a fenti, Escherichia coli törzs alkalmazásával kapcsolatos példában leírt módon előállított gamma-interferont tripszinnel különböző mértékben emésztettük, majd felhasználtuk a citopatikus hatás gátlására A549 sejtek alkalmazásával, a későbbiek során leirt módon.
6,5 mg mennyiségű, a fentiek szerint előállított rekombináns gamma-interferon (r-HuIFN-gamma) mintát sótalanítottunk kis méretű, Sephadex G-25 molekulaszitát tartalmazó oszlopon (PD-10, Pharmacia), és az interferont 0,10 M ammónium-hidrogén-karbonát pufferoldatba (pH=8,5) vittük át 2,1 mg/ml végső fehérjekoncentrációig. A kapott interferon-oldat 1,9 ml (4,0 mg interferon-tartalom) mennyiségéhez 16 pl mennyiségű hig tripszin-oldatot (Worthington TPCK tripszin, 10 pg/ml koncentráció 0,001 M sósav-oldatban) adtunk, összekevertük és szobahőmérsékleten inkubáltuk (a tripszin és a fehérje aránya 1:25000). Az inkubált elegyből mintát vettünk 1 óra, 3,5 óra, 5,75 óra, 8 óra és 10,25 óra elteltével. 8 óra múlva további 15 pl (150 ng) hig tripszin-oldatot adtunk hozzá, hogy meggyorsítsuk a reakciót a 10,25 óra elteltével vett utolsó minta számára.
Az egyes időpontokban vett mintákat a komponensek meghatározására frakcionélásnak vetettük alá Waters nagynyomású folyadékkromatográfiás rendszerben, BioRad Biogel HPHT oszlop alkalmazásával. Az ammónium-hidrogén-karbonát pufferoldatban lévő mintát kézi befecskendezéssel közvetlenül az oszb póa vittük be a mintavétel időpontjában. Hagytuk, hogy az oszlopban egyensúly alakuljon ki 0,01 M nátrium-foszfát-oldattal (pil=8,0), amely 30 pM kalcium-kloridot tartalmazott, majd a fehérjét a2 egyensúly kialakításához használt pufferoldattal (lineáris grádiens mellett) és 0,5 M nátrium-foszfát puf) feroldaltal (pH=8,0, 0,6 pM kalcium-klorid) eluáltuk.
A 214 nm-nél és 280 nm-nél jelentkező abszorbancia alapján határoztuk meg a fehérjéhez tartozó maximumokat. A megfelelő j frakciókat összegyűjtöttük és az analízis elvégzéséig 4 °C-on lefedve tároltuk. A kiválasztott maximumokhoz tartozó frakciókat az alábbi vizsgálatoknak vetettük alá:
1. Vírusellenes hatás meghatározása emj béri tüdökarcinoma A549/EMC vírussal szemben [Stewart, Interferon Systems, Ed.: Stewart, 13. oldal, Springer Verlag, New York,
19791.
2. Frakcionálás nátrium-dodecil-szulfát/5 poliakrilamid gélelektroforézissel a Laemmli gélrendszer alkalmazásával (Laemmli, Natúré, 227, 680 (1970)].
3. Fehérjekoncentráció meghatározása az ipari festékmegkötö eljárással (Pierce ChemiJ cal Co., Rockford, II.).
4. Fehérjehasitás cianogénbromiddal, majd nagynyomású folyadékkromatográfiás analízis a peptidek azonosításához (Gross és munkatársai, Methods in Enzymology, XI,
238].
A fehérjemintákat egy éjszakán át dializáltuk (12000-14000 mw megszakítás) 70%-os hangyasavval szemben, forgóbepárlóban szárazra pároltuk és ismét felszuszpendáltuk 0 500 pl 70%-os hangyasavban. Szilárd cianogénbromidot adtunk minden egyes mintához 12x75 mm méretű üvegcsőben, a csöveket leforrasztottuk, a szilárd anyag oldódásáig ráztuk, alumíniumfóliával beborítottuk és egy 5 éjszakán át inkubáltuk szobahőmérsékleten, jó szellőztetés közben.
Amikor a cianogénbromidos hasítás befejeződött, a mintákat forgóbepárlón szárazra pároltuk, a maradékot 0,5 ml vízben szusz0 pendáltuk és szárítottuk. Nagynyomású folyadékkromatográffal történő frakcionálás előtt a mintákat 50%-os hangyasavban oldottuk, s annyi hangyasavat alkalmaztunk, hogy a fehérjekoncentráció körülbelül 1 mg/ml le5 gyen.
-917
HU 202278 tí
A peptideket az aminosavak analízisével azonosítottuk. Az 1. táblázatban adjuk meg az emberi eredetű rekombináns gamma-interferon (r-HuIFN-gamma) rövidített formáira f, vonatkozó adatokat.
A peptideket Waters nagynyomású folyadékkromatografáló rendszerrel frakcionáltuk, Altex Ultrasphere Octyl oszlop alkalmazásával. Az elúciót trifluorecetsav/viz -trifluorecetsav/acetonitril lineáris elúciós gradiens alkalmazásával végeztük.
Z. táblázat r-HulFN-gamma C-láncvég** Fajlagos aktivitás, % formája*
139aa/143aa arány: 98:2 LFRGR 100
(összehasonlításul)
131aa AAKTGKRKR 40-50
129aa AAKTGKR 6-9
125aa AAK körülbelül 1
11 Az 1. ábrán bemutatott számozási rendszer alapján, figyelmen kívül hagyva azonban az N-terminális nietionint, amely mindegyik esetben szintén jelen van.
“ Az aminosav-maradékokra vonatkozó szokásos egybetüs rövidítések: A = alanin F = fenilalanin G = glicin K = lizin L = leucin R = arginin T = treonin
Feltételezésünk szerint a 126aa-143aa közötti bármilyen hosszúságú gamma-interferonok (nem számítva az N-terminális metionint) megfelelően kialakított génekből képződnek. így például az 1. ábrán vázolt gén egy Fnu4H restrikciós helyet tartalmaz:
123 124
Alá Alá
GCk GCT
CGT)CGA
Az Fnu4H-val végzett restrikció után a szintetikus oligonukleotidokat, amelyek bármilyen kivánt szekvenciát kódolnak, ahol egy .megállító kodon és az expressziós plazmidban rendelkezésre álló restrikciós hellyel összeférhető összekapcsoló helyezkedik el utána, hozzákapcsolhatjuk a gamma-interferon génjének elejéhez. Például az alábbi szekvenciát
A GCT AAA ACA TA
-(X)CGA TTT TGT ATCTAG ahol X egy vagy több aminosavat kódol, hozzákapcsolhatjuk a fentebb példaképpen leírt Escherichia coli expressziós vektorhoz miután feltártuk a plazmidot Fnu4H és BglII segítségével. így az alábbi megállító kodon jött létre:
stop
...(xi-taIgatc...
atctagI
BglII
E. A citopatikus hatás (CPE) gátlásának vizsgálata
1. A vizsgálat leírása
A lemezek mindegyik bemélyedésébe bemérünk 100 mikroliter mennyiségű emberi tüdókarcinoma (A549) sejt (ATCC száma CCL 185) szuszpenziót, amely milliliterenként
4xlO5 sejtet tartalmaz Eagles MÉM közegben. A lemezeket mintegy 18 órán ét inkubáljuk 37 “C-on. 18-24 órás inkubálás után az elsó oszlopban lévő valamennyi bemélyedésbe bemérünk 80 mikroliter további táptalajt.
Az első oszlop egyik bemélyedésébe mikroliter mennyiségű mintát mérünk be, amelynek az interferon-aktivitását meg kívánjuk határozni.
Ezután az első oszlopban lévő minden egyes bemélyedés tartalmából 100 mikroliter mennyiséget átviszünk a második oszlopban lévő szomszédos bemélyedésbe. Ezt az eljárást tovább folytatjuk, azaz mindig egy következő oszlopba átviszünk az egyes bemé55 lyedésekböl 100 mikroliter mennyiséget mindaddig, amíg a 11. oszlopot el nem érjük (öszszesen 10 átvitel).
órás inkubálás után a kontroll sejtet tartalmazó bemélyedések kivételével mind60 egyikbe bemérünk 50 mikroliter enkefalomiokarditisz vírust. Ez a fertőzés 100%-os citopatikus hatást eredményez 24 órával a megfertőzés után.
A lemezeket lefedjük és 24 órán át in65 kubálunk 37 “C hőmérsékleten. Az összes beli
-1019
HU 202278 Β mélyedésből kiőntjük a folyadékot és 5-15 perc alatt megfestjük 0,5%-os kristályibolya-oldattal. A sejtek életképességét a megfestett sejtek megfigyelésével határozzuk meg.
Valamely minta titere annak a hígításnak a reciproka, ahol a sejtek 50%-a életképes marad.
2. Az eredmény kiszámítása
Valamennyi minta aktivitásának normalizálására egy faktort alkalmazunk, amelyet úgy kapunk, hogy a standard interferon tényleges titerét elosztjuk a mért titerrel.
3. Fajlagos aktivitás
A National Institute of Health (NIH) által rendelkezésre bocsájtott vonatkoztatási gamma-interferonnal normalizált A549/EMCV biológiai vizsgáló rendszer alkalmazásával azt az eredményt kaptuk, hogy az emberi eredetű rekombináns gamma-interferon fajlagos vírusellenes aktivitása mintegy háromszorosa a módosított rekombináns gamma-interferonénak, amelynek moiekulásja három további aminosavat tartalmaz az N-végcsoportnál (cys-tyr-cys-).
4. Stabilitás
Ismét a fenti biológiai aktivitásmérés alapján azt tapasztaltuk, hogy a gyógyászati készítménnyé alakított és lezárt rekombináns gamma-interferon az előállításától számított három hónapig stabil marad 4 °C-on történő tárolás esetén (a biológiai aktivitása nem csökken).
F. A rekombináns gamma-interferon sejtburjánzás elleni hatása, összehasonlítva az emberi eredetű interferon más típusaival
1. Anyagok és módszerek
Rekombináns gamma-interferon:
Cys-Tyr-Cys szekvencia nélküli rekombináns gamma-interferon oldat alakjában (20 mM nátrium-szukcinát, 0,15 M nátrium-klorid, pH=6). Az anyagot az Escherichia coli törzset alkalmazó fenti példa szerint állítottuk elő. A fajlagos aktivitás 2,7xl07 NE/mg fehérje volt.
CTC-rekombináns gamma-interferon:
A molekula N-végcsoportjánál a CYS-TYR-CYS- szerkezetet tartalmazó rekombináns gamma-interferon oldat alakjában (20 mM nátrium-szukcinát, 0,15 M nátrium-klorid, pH=6). A fajlagos aktivitás l,3xl07 NE/mg feliérje volt.
:·
Emberi eredetű béta-interferon:
Emberi diploid elöbőr fibroblasztból előállított liofilizált emberi fibroblaszt interferon, amelynek a fajlagos aktivitása több mint lxlO7 NE/mg fehérje (gyártotta: Toray Ind., Inc.). Egy ampulla 3xl06 NE emberi eredetű béta-interferont és 3 mg emberi szérum albumint tartalmaz.
Emberi eredetű alfa-interferon:
Emberi eredetű természetes leukocita interferon, a fajlagos aktivitása 4x10·* NE/mg fehérje. Oldatban szállítja a Dr. K. Cantell, Central Public Health Laboratory, Helsinki.
Kontroll:
mg emberi szérum albumint tartalmazó placebo.
Táptalaj:
Eagle minimális esszenciális táptalajt, amelyet 10% mennyiségű, hővel inaktivált prekolosztrum újszülött borjú szérummal és 2 mM L-glutaminnal egészítettünk ki, használtunk a Hela, KB, HMV-1, FL és J-lll sejtekhez. Az A549 sejtekhez Dulbecco minimális esszenciális táptalajt használtunk, amely 10% mennyiségű, hővel inaktivált prekolosztrura újszülött borjú szérumot, 100 yg/ml kanamicint és 2 mM L-glutamint tartalmazott. A 2. táblázatban felsorolt többi sejthez RPMI 1640 táptalajt használtunk, amelyet hővel inaktivált prekolosztrum újszülött borjú szérummal és 100 ug/mi kanamicinnel egészítettük ki.
2. A sejtburjánzás elleni hatás kiértékelése
A vizsgálatokhoz használt, táptalajban szuszpendált sejteket műanyagból készült szövettenyészet lemezekre vittük át bemélyedésenként 5xl03 sejt/0,5 ml mennyiségben. 0,5 ml megfelelő táptalajban oldott, különböző mennyiségű interferont adtunk ezután hozzá (0. nap). A tenyésztést 37 °C hőmérsékleten végeztük, 5% szén-dioxidból és 95% levegőből álló, nedvesített atmoszférában. A 6. napon a táptalajokat eltávolítottuk, és a szuszpenziós tenyészetben lévő sejteket közvetlenül Isoton II-ben (Coulter Electronics Inc.) szuszpendáltuk Coulter-számlálóban történő sejtszámláláshoz. A lapot képező sejteket műanyag edényekben előkezeltük 0,05% tripszinnel és 0,02% etilén-diamin-tetraecetsavval, hogy egyedülálló sejteket tartalmazó szuszpenzióhoz jussunk Isoton Π-ben. Az interferon sejtburjánzás elleni hatását a sejtszám 50X-os csökkentéséhez szükséges vírusellenes egységekben (IC», NE/ml) fejezzük ki, az interferont nem tartalmazó kontroll tenyészethez viszonyítva.
Amint a 2. táblázatban látható, a rekombináns gamma-interferon sejtburjánzás elleni hatása jelentős mértékben eltérő volt a
-1121
HU 202278 Β
CTC- ganima-interferone. A négy vizsgált interferon összehasonlításából kiderül, hogy a legnagyobb hatékonyságot a rekombináns gamma-interferon biztosította az alkalmazott sejteknél, a Daudi sejtek kivételével.
A 2. táblázatban feltüntetett interferonok jevizsgált emberi sejtfajtáktól függően. KATÓ 111, a gyomorkarcinoma gyűrűs sejtje igen érzékenynek bizonyult, a sejtvonal ICso értéke 1,2 NE/ml volt, ugyanakkor a Daudi sejtek amelyek a Burkitt-féle nyirokszövet-da- 5 ganat sejtjei, s nagyon érzékenyek az emberi eredetű alfa- és béta-interferonra, érzéketlenek voltak a rekombináns gamma-interferonra. A tüdő adenokarcinoma sejtjei (PC-8, PC-12) az összes vizsgált interferonra 10 érzéketlen maradt. A rekombináns gamma-interferon és a CTC-rekombináns gamma-interferon sejtellenes spektruma majdnem azonos volt, és általánosságban megállapítható, hogy a rekombináns gamma-interferon sejtburján- 15 zés elleni hatékonysága jobb volt, mint a lölése:
rekombináns gamma-interferon:
rekombináns
CTC-gamma-interferon:
emberi eredetű béta-interferon:
emberi eredetű alfa-interferon:
rlFN-gamma
CTC-rIFN- gamma
HuIFN-béta
HuIFN-alfa
2. táblázat
A rekombináns gamma-interferon sejtburjánzás elleni hatása, összehasonlítva más interferonokéval
Sejt IC50, rlFN-gamma NE/ml CTC-rIFN-gamma HuIFN-béta HuIFN-alfa
ΚΑΤΟ-ΠΙ 1,2 1,3 - -
MKN-1 37 330 - -
MKN-28 >103 >103 - -
MKN-45 >103 >103 - -
MKN-74 >103 >103 - -
Hela 22 132 446 >10*
KB 54 330 >10* >10*
HMV-1 38 45 130 820
SEKI-F 135 >103 137 663
FL 38 45 >103 >10*
PC-8 >103 >103 >10* >103
PC-12 >103 >103 >10* >103
A549 55 - - -
QG56 5. - - -
QG90 5,5
Daudi >103 >103 47 7
Namaiwa >103 >103 - -
J-lll 25 84 204 >103
A 2. táblázatban szereplő sejtek hisztológiai típusa vagy eredete:
KATÓ-III - a gyomorkarcinoma gyűrűs sejtje
MKN-1 - mirigy pikkelyes gyomorkarcinoma
MKN-28 - jól elkülönült gyomor mirigykarcinoma
MKN-45 - rosszul elkülönült gyomor mirigykarcinoma
MKN-74 - jól elkülönült gyomor mirigykarcinoma
Hela - méhnyak karcinoma
KB - orr-garat karcinoma
HMV-1 - amelanotikus melanoma
SEKI-F - melanoma
FL - bárány hártya (nem-rosszindula-
50 tú eredetű)
PC-8 - rosszul elkülönült tüdő mirigykarcinoma
PC-12 - tudó mirigykarcinoma
A 549 - tüdő álveoláris karcinoma
55 QG56 - tüdő pikkelyes sejt karcinoma
QG90 - tüdő anaplasztikus kissejt karcinoma
Daudi - Burkitt-féle nyirokszővet-daganat
G0 Namaiwa - Burkitt-féle nyirokszövet-daganat
J-lll - monocitás leukémia
-1223
HU 202278 Β
G. A rekombináns gamma-interferon és a CTC- rekombináns gamma-interferon stabilitásának összehasonlítása különböző biológiai folyadékokban
Ampullánként 1x10® NE mennyiségű, az
Escherichia coli alkalmazásával kapcsolatos példa szerint előállított rekombinált gamma-interferont és ampullánként lxlO6 NE menynyiségü, az N-végcsoportnál Cys-Tyr-Cys ]0 szerkezetet tartalmazó, rekombinált gamma-interferont (mindkét típus liofilizált volt, s az ampullák még 10 mg emberi szérum albumint, foszfát puffért és izotóniás mennyiségű nátrium-klorídot is tartalmaztak) desztillált 15 vízben oldottunk, és a koncentrációt 4xl04 NE/ml értékre állítottuk be.
Az interferonok in vitro stabilitását a különböző biológiai folyadékokban visszamaradó vírusellenes hatás meghatározásával ér- 20 tékeltük ki. A fenti interferon-oldatokat kilencszeres térfogatú nyúl szérumhoz, emberi szérumhoz és Eagle-féle MÉM táptalajhoz adtuk, amelyeket előzetesen elóinkubáltuk 10 percig vízfürdős inkubátorban, 37 °C-on és 25 4 °C-on. A tényleges inkubálás során, 0, 0,25, 0,5, 1, 8, 24, 72 és 144 óra elteltével egy-egy alikvot részt gyűjtöttünk össze, és kilencszeres térfogatú Eagle-féle MÉM táptalajjal kevertük össze. A kapott mintákat 30 -80 °C-on megfagyasztva tároltuk az interferon titerének meghatározásáig. Az interferon titerét a CPE50 redukciós módszerrel határoztuk meg, Sindbis vírussal megfertőzött emberi bárányhártya sejtek (FL sejt) alkal- 35 mazásával. A kapott eredményeket a 3. ábra tartalmazza, amelyen százalékban kifejezve ábrázoltuk a megmaradt aktivitást.

Claims (6)

1. ábra (folyt.)
120 130 MET ALA GLU LEU SER PRO ALA ALA LYS THR GLY LYS ARG LYS ARG SER ATG GCT GAA CTG TCG CCA GCA GCT AAA 5?0 ACA GGG AAG CGA AAA AGG AGT 140 143 GLN MET LEU PHE ARG GLY ARG ARG ALA SER GLN CAG ATG CTG TTT CGA GGT CGA AGA GCA TCC CAG TAA TGGTTGT
CCTGCCTGCAATATTTGAATTTTAAATCTAAATCTATTTATTAATATTTAACATTATTTATATG
1. ábra
TGAAGATCAGCTATTAGAAGAGAAAGATCAGTTAAGTCCTTTGGACCTGATCAGCTTGATXCAAG
5o sl met lys tyr thr ser
AACTACTGATTTCAACTTCTTTGGCTTAATTCTCTCGGAAACG ATG AAA TAT ACA AGT lffO slO
tyr ile leu ala phe gin leu cys ile val leu giy ser leu TAT ATC TTG GCT TTT CAG CTC TGC ATC GTT TTG GGT TCT CTT l50 S23 1 10 gly cys tyr cys GLN ASP PRO TYR VAL LYS GLU ALA GLU ASN LEU LYS GGC TGT TAC TGC CAG GAC CCA TAT GTA AAA GAA GCA GAA AAC CTT AAG
LYS TYR PHE ASN ALA GLY HIS 20 SER ASP VAL ALA ASP ASN GLY AAA TAT TTT AAT GCA GGT CAT TCA GAT GTA GCG GAT AAT GGA THR LEU PHE 30 LEU GLY ILE LEU LYS ASN TRP LYS 2K0 GLU GLU 40 SER ASP ARG ACT CTT TTC TTA GGC ATT TTG AAG AAT TGG AAA GAG GAG AGT GAC AGA LYS ILE MET GLN-SER GLN ILE 50 VAL SER PHE TYR PHE LYS LEU 3?0 AAA ATA ATG CAG AGC CAA ATT GTC TCC TTT TAC TTC AAA CTT
60 70 PHE LYS ASN PHE LYS ASP ASP GLN SER ILE GLN LYS SERVAL GLU1 THR TTT AAA AAC TTT AAA GAT GAC CAG AGC ATC CAA AAG AGT GTG GAG ACC 350 80 - ILE LYS GLU ASP MET ASN VAL LYS PHE PHE ASN SER ASN LYS ATC AAG GAA GAC ATG AAT GTC AAG TTT TTC AAT AGC AAC AAA
4Ϊ0
90 110 LYS LYS ARG ASP ASP PHE GLU LYS LEU THR ASN TYR SER VAL THR ASP AAG AAA CGA GAT GAC TTC 450 GAA AAG CTG ACT AAT TAT TCG GTA ACT GAC 110 LEU ASN VAL GLN ARG LYS ALA ILE HIS GLU LEU ILE GLN VAL TTG AAT GTC CAA CGC AAA 5ff0 GCA ATA CAT GAA CTC ATC CAA GTG
-16HU 202278 Β
Int Cl5 C 12 N 15/23
C 12 P 21/02
A 61 K 37/02
1. igénypont szerinti DNS szakaszt megfelelő 40 vektorba iktatunk be.
(Elsőbbsége: 1984.02.27.)
1. Eljárás az
X-Y-ASP-PRO-TYR-VAL-LYS-GLU-ALA-GLU12 3 45 67 89
ASN-LEU-LYS-LYS-TYR-PHE-ASN-ALA-GLY10 11 12 13 14 15 16 17 18
HIS-SER-ASP-VAL-ALA-ASP-ASN-GLY-THR19 20 21 22 23 24 25 26 27
LEU-PHE-LEU-GLY-1LE-LEU-LYS-ASN-TRP28 29 30 31 32 33 34 35 36
LYS-GLU-GLU-SER-ASP-ARG-LYS-ILE-MET37 38 39 40 41 42 43 44 45
GLN-SER-GLN-1LE-VAL-SER-PHE-TYR-PHE46 47 48 49 50 51 52 53 54
LYS-LEU-PHE-LYS-ASN-PHE-LYS-ASP-ASP- ί
55 56 57 58 59 60 61 62 63 j
GLN-SER-ILE-GLN-LYS-SER-VAL-GLU-THR- ·
64 65 66 67 68 69 70 71 72 j
ILE-LYS-GLU-ASP-MET-ASN-VAL-LYS-PHE73 74 75 76 77 78 79 80 81
PHE-ASN-SER-ASN-LYS-LYS-LYS-ARG-ASP- {
82 83 84 85 86 87 88 89 90
ASP-PHE-GLU-LYS-LEU-THR-ASN-TYR-SER91 92 93 94 95 96 97 98 99
VAL-THR-ASP-LEU-ASN-VAL-GLN-ARG-LYS100 101 102 103 104 105 106 107 108 í
ALA-ILE-H1S-GLU-LEU-ILE-GLN-VAL-MET109 110 111 112 113 114 115 116 117 j j
ALA-GLU-LEU-SER-PRO-ALA-ALA-LYS-THR- j
118 119 120 121 122 123 123 126 126
GLY-LYS-ARG-LYS-ARG-SER-GLN-MET-LEU- j
127 128 129 130 131 132 133 134 135 5
PHE-ARG-GLY-ARG-ARG-ALA-SER-GLN j
136 137 138 139 140 141 142 143 j aminosav szekvenciájú - ahol X jelentése mej tionin csoport es Y jelentése glutaminsav csoporL, valamint bármely X.-126. és X.-142.
közti aminosavszekvenciájú rekombináns gamma-interferonokat kódoló DNS szakaszok előállítására azzal jellemezve, hogy
a) az X.-139. valamint az X.-143. aminosavszekvenciákat kódoló DNS szakaszok előállítása esetén természetes forrásból származó mRNS közvetítéssel az 1.-139. illetve 1.-143. aminosavszekvenciákat kódoló DNS kiónokat állítunk elő, vagy
-1325
HU 202278 Β
b) bármely 1.-126. és 1.-143. közti aminosavszekvenciának megfelelő DNS szekvenciát állítunk elő kémiai szintézissel, az így kapott DNS szekvenciát az N terminális első 5 aminosavat kódoló szakaszán belül 5 hasítjuk, és a hasitási helyre olyan szintetikus DNS szakaszt építünk be, hogy a helyreállt eredeti N-terminális végződésen tül egy metionint kódoló triplett épüljön be. (Elsőbbsége: 1984.02.27.) 10
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás X.-126. és X.-142. közti aminosavszekvenciáknak megfelelő bármely polipeptidet kódoló DNS szakasz előállítására azzal jellemezve, hogy 15
a) az X.-139. aminosavszekvenciát kódoló
DNS szakasz előállítása esetén természetes forrásból származó mRNS közvetítéssel az 1.-139. aminosavszekvenciát kódoló DNS kiónokat állítjuk elő, vagy 20
b) bármely 1.-126. és 1.-142. közti aminosavezekvenciának megfelelő DNS szekvenciát állítunk elő kémiai szintézissel, az igy kapott DNS szekvenciát az N-terminális első 5 aminosavat kódoló szaka- 25 szán belül hasítjuk, és a hasitási helyre olyan szintetikus DNS szakaszt építünk be, hogy a helyreállt eredeti N-terminélis végződésen túl egy metionint kódoló triplett épüljön be. 30 (Elsőbbsége: 1984.02.27.)
3. Eljárás az 1. igénypontban bemutatott aminosavszekvenciájú - ahol X jelentése metionin csoport és Y jelentése glutaminsav csoport -, valamint bármely X.-126. és X.- 35 -143. közti aminosavszekvenciájú rekombináns gamma-interferonokat kódoló DNS szakaszokat tartalmazó rekombináns vektorok előállítására azzal jellemezve, hogy valamely
4. A 3. igénypont szerinti eljárás X.-126. és X.-142. közti aminosavszekvenciáknak megfelelő bármely polipeptidet kódoló 45 DNS szakaszokat tartalmazó rekombináns vektorok előállítására azzal jellemezve, hogy valamely 2. igénypont szerinti DNS szakaszt megfelelő vektorba iktatunk be.
(Elsőbbsége: 1984.02.27.) 50
5. Eljárás az 1. igénypontban bemutatott aminosavszekvenciájú - ahol X jelentése metionin csoport és Y jelentése glutaminsavcsoport - valamint bármely X.-126. és X.-143. közti aminosavszekvenciájú rekombináns 55 gamma-interferonokat kódoló DNS szakaszokat tartalmazó E. coli vagy állati szövetsejt transzformánsok előállítására azzal jellemezve, hogy valamely, a 3. igénypont szerinti vektort valamely E. coli sejtbe vagy valamely 60 állati szövetsejtbe transzformálunk.
(Elsőbbsége: 1984.02.27.)
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás X.-126. és X.-142. közti aminosavszekvenciáknak megfelelő bármely polipeptidet kódoló 65
DNS szakaszokat tartalmazó E. coli vagy állati szövetsejt transzformánsok előállítására azzal jellemezve, hogy valamely, a 4. igénypont szerinti vektort valamely E. coli sejtbe vagy valamely állati szövetsejtbe transzformálunk.
(Elsőbbsége: 1984.02.27.)
7. Eljárás az 1. igénypontban bemutatott aminosavszekvenciájú - ahol X jelentése metionin csoport vagy hidrogénatom és Y jelentése glutaminsav csoport, vagy ha X jelentése hidrogénatom, akkor Y jelentése piroglutaminsav csoport is lehet - valamint bármely X.-126. és X.-142. közti aminosavszekvenciájú rekombináns gamma-interferonok előállítására azzal jellemezve, hogy valamely, az 5. igénypont szerinti transzformánst megfelelő tápközegben tenyésztünk, és a tenyészetből a tárgyi kör szerinti polipeptidek valamelyikét kinyerjük, és kivánt esetben a kinyert peptidet C-terminális végén enzimes emésztéssel legfeljebb X.-126. szekvenciáig lerövidítjük. (Elsőbbsége: 1984.02.27.)
8. A 7. igénypont szerinti eljárás X.-126. és X.-142. közti aminosavszekvenciáknak megfelelő rekombináns gamma-interferonok előállítására azzal jellemezve, hogy valamely, a 6. igénypont szerinti transzformánst megfelelő tápkőzeg ben tenyésztünk és a tenyészetből a tárgyi kör szerinti polipeptidek valamelyikét kinyerjük, és kivánt esetben a kinyert peptidet C-terminális végén enzimes emésztéssel legfeljebb X.-126. szekvenciáig lerövidítjük.
(Elsőbbsége: 1984.02.27.)
9. Eljárás az 1. igénypontban bemutatott aminosavszekvenciájú - ahol X jelentése metionin csoport vagy hidrogénatom és Y jelentése glutaminsav csoport, vagy ha X jelentése hidrogénatom, akkor Y jelentése piroglutaminsav csoport is lehet - valamint bármely X.-126. és X.-142. közti aminosavszekvenciájú rekombináns gamma-interferonokat tartalmazó, vírus- és sejtburjánzás ellenes hatású gyógyszerkészítmények előállítására azzal jellemezve, hogy valamely 7. vagy 8. igénypont szerinti előállított rekombináns gamma-interferont gyógyászatilag elfogadható segédanyagokkal összekeverve gyógyászati készítménnyé alakítunk.
(Elsőbbsége: 1984.02.27.)
10. Eljárás az
X-Y-ASP-PRO-TYR-VAL-LYS-GLU-ALA-GLU12 3 45678 9
ASN-LEU-LYS-LYS-TYR-THE-ASN-ALA-GLΥΙΟ 11 12 13 14 15 16 17 18
HIS-SER-ASP-VAL-ALA-ASP-ASN-GLY-THR19 20 21 22 23 24 25 26 27
LEU-PHE-LEU-GLY-1LE-LEU-LYS-ASN-TRP28 29 30 31 32 33 34 35 36 lő
-1427
HU 202278 Β
LYS-GLU-GLU-SER-ASP-ARG-LYS-ILE-MET37 38 39 40 41 42 43 44 45
GLN-SER-GLN-ILE-VAL-SER-PHE-TYR-PHE46 47 48 49 50 51 52 53 54 5
LYS-LEU-PHE-LYS-ASN-PHE-LYS-ASP-ASP55 56 57 58 59 60 61 62 63
GLN-SER-ILE-GLN-LYS-SER-VAL-GLU-THR- 10 64 65 66 67 68 69 70 71 72
ILE-LYS-GLU-ASP-MET-ASN-VAL-LYS-PHE73 74 75 76 77 78 79 80 81
P11E-ASN-SER-ASN-LYS-LYS-LYS-ARG-ASP82 83 84 85 86 87 88 89 90
ASP-PHE-GLU-LYS-LEU-THR-ASN-TYR-SER91 92 93 94 95 96 97 98 99 20
VAL-THR-ASP-LEU-ASN-VAL-GLN-ARG-LYS100 101 102 103 104 105 106 107 108
ALA-ILE-H1S-GLU-LEU-ILE-GLN-VAL-MET- 25 109 110 111 112 113 114 115 116 117
ALA-GLU-LEU-SER-PRO-ALA-ALA-LYS-THR118 119 120 121 122 123 123 126 126
GLY-LYS-ARG-LYS-ARG-SER-GLN-MET-LEU127 128 129 130 131 132 133 134 135
PHE-ARG-GLY-ARG-ARG-ALA-SER-GLN
136 137 138 139 140 141 142 143 35 aminosavszekvenciájú - ahol X jelentése metionin csoport és Y jelentése glutaminsav csoport, valamint X.-139. aminosavszekvenciájú rekombináns gamma-interferonokat kódoló 40 DNS szakaszok előállítására azzal jellemezve, hogy
a) vér limfocitákból az 1.-139. illetve 1.-143. aminosavszekvenciákat kódoló DNS kiónokat állítunk elő, vagy 45
b) az 1.-139. illetve 1.-143. aminosavszekvenciákat kódoló DNS szekvenciákat állítunk eló kémiai szintézissel, az így kapott DNS szekvenciát az N-terminális első 5 aminósavat kódoló szakaszon belül 50 hasítjuk, és a hasítási helyre olyan szintetikus DNS szakaszt építünk be, hogy a helyreállt eredeti N-terminális végződésen túl egy metionint kódoló triplett épüljön be.
(Elsőbbsége: 1983.12.16.)
11. Eljárás az 1. igénypontban bemutatott aminosavszekvenciájú - ahol X jelentése metionincsoport és Y jelentése glutaminsav csoport - valamint X.-139. aminosavszekvenciájú rekombináns gamma-interferonokat kódoló DNS szakaszokat tartalmazó rekombináns vektorok előállítására azzal jellemezve, hogy valamely 10. igénypont szerinti DNS szakaszt megfelelő vektorba iktatunk be.
(Elsőbbsége: 1983.12.16.)
12. Eljárás az 1. igénypontban bemutatott aminosavszekvenciájú - ahol X jelentése metionincsoport és Y jelentése glutaminsav csoport - valamint X.-139. aminosavszekvenciájú rekombináns gamma-interferonokat kódoló DNS szakaszokat tartalmazó E. coli vagy állati szövetsejt transzformánsok előállítására azzal jellemezve, hogy valamely, a 11. igénypont szerinti vektort valamely E. coli sejtbe | vagy valamely állati szövetsejtbe transzfor- ] maiunk. j (Elsőbbsége: 1983.12.16.) 5
13. Eljárás az 1. igénypontban bemutatott aminosavszekvenciájú - ahol X jelentése j metionin csoport vagy hidrogénatom és Y je- j lentése glutaminsavcsoport, vagy ha X jelen- j tése hidrogénatom, akkor Y jelentése piroglutaminsav csoport is lehet - valamint X.- i
-139. aminosavszekvenciájú rekombináns gamma-interferonok előállítására azzal jelle- I mezve, hogy valamely, a 12. igénypont sze- j rinti transzformánst megfelelő tápkózegben j tenyésztünk, és a tenyészetből a tárgyi kör j szerinti polipeptidek valamelyikét kinyerjük.
(Elsőbbsége: 1983.12.16.)
14. Eljárás az h igénypontban bemutatott aminosavszekvenciájú - ahol X jelentése j metionincsoport vagy hidrogénatom és Y je- t lentése glutamincsoport, vagy ha X jelentése } hidrogénatom, akkor Y jelentése pirogluta- j minsav csoport is lehet - valamint X.-139. j közti aminosavszekvenciájú rekombináns j gamma-interferonokat tartalmazó, vírus- és I sejtburjánzás ellenes hatású gyógyszerké- } szítmények előállítására azzal jellemezve, hogy valamely 13. igénypont szerint előállított rekombináns gamma-interferont gyógyászatilag elfogadható segédanyagokkal összekeverve gyógyászati készítménnyé alakítunk.
(Elsőbbsége: 1983.12.16.)
Kiadja az Országos Találmányi Hivatal, Budapest A kiadásért felel: dr. Szvoboda Gabriella osztályvezető R-4981 - KJK
91.3911.66-13-2 Alföldi Nyomda Debrecen - Felelős vezető: Szabó Viktor vezérigazgató
-15HU 202278 Β
Int Cl5 C 12 N 15/23
C 12 P 21/02
A 61 K 37/02
6?0
GGGAATATATTTTTAGACTCTCATCAATCAAATAAGTATTTATAATAGCAACTTT
7ff0
TGTGTAATCAAAATGAATATCTATTAATATATGTATTATTTATAATTCCTATATCCTGTGACTG
750
TCTCACTTAATCCTTTGTTTTCTGACTAATTAGGCAAGGCTATGTGATTACAAGG 8Ϊ0 p5o
CTTTATCTCAGGGGCCAACTAGGCAGCCAACCTAAGCAAGATCCCATGGTTGTGTGTTTATTTC
9Ő0
Ó
ACTTCATCTTRCAATGAACACTTATMAGTGAAGXGATACTATCCAGOTACTGCCC950
GTTTGAAAATATGCCTGCAATCTGAGCCAGTGCTTTAATGGCATGTCAGACAGAACTTGAATGT íoffo
GTCAGGTGACCCTGATGAAAACATAGCATCTCAGGAGATTTCATGCCTGGTGCTT
10K0
CCAAATATTGTTGACAACTGTGACTGTACCCAAATGGAAAGTAACTCATTTGTTAAAATTATCA lTOO ílso
ATATCTAATATATATGAATAAAGTGTAAGTTCACAACTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
1200
-17HU 202278 Β
Int Cl5 C 12 N 15/23
C 12 P 21/02
A 61 K 37/02 p'r-cYcs
-18HU 202278 B
Int Cl5 C 12 N 15/23
C 12 P 21/02
A 61 K 37/02
Maradék aktivitás (log^) Maradék aktivitási'10^1 Maradék aktivitás rIFN-γ
Inkubálás Ideje,; óra Eagle-Féle MÉM
Inkubálás ideje, óra emberi szárúm cö Inkubálás ideje, óra emberi szérum
Σ Inkubálás ideje, óra nyulszórum
HU844669A 1983-12-16 1984-12-14 Process for producing recombinant gamma-interferonok of improved stability and pharmaceutical compositions comprising same HU202278B (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US56200983A 1983-12-16 1983-12-16
US06/584,217 US4855238A (en) 1983-12-16 1984-02-27 Recombinant gamma interferons having enhanced stability and methods therefor

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT36187A HUT36187A (en) 1985-08-28
HU202278B true HU202278B (en) 1991-02-28

Family

ID=27072811

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU844669A HU202278B (en) 1983-12-16 1984-12-14 Process for producing recombinant gamma-interferonok of improved stability and pharmaceutical compositions comprising same

Country Status (23)

Country Link
US (4) US4855238A (hu)
EP (1) EP0146354B2 (hu)
JP (6) JPH0789935B2 (hu)
KR (1) KR940008978B1 (hu)
AT (1) ATE135405T1 (hu)
AU (1) AU597872B2 (hu)
CA (1) CA1341573C (hu)
CY (1) CY1945A (hu)
DE (1) DE3486424T3 (hu)
DK (1) DK166832B1 (hu)
ES (1) ES8801553A1 (hu)
FI (1) FI91884C (hu)
GR (1) GR82468B (hu)
HK (1) HK175996A (hu)
HU (1) HU202278B (hu)
IE (1) IE72494B1 (hu)
IL (1) IL73803A (hu)
LV (1) LV11633B (hu)
MY (1) MY102899A (hu)
NO (1) NO178789C (hu)
OA (1) OA07902A (hu)
PH (1) PH24790A (hu)
PT (1) PT79691A (hu)

Families Citing this family (106)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS58110548A (ja) * 1981-12-24 1983-07-01 Asahi Chem Ind Co Ltd 新規な生理活性ペプチド
GB8406910D0 (en) * 1984-03-16 1984-04-18 Biogen Nv Gamma interferon
US6936694B1 (en) 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
ZA846554B (en) * 1983-09-20 1985-04-24 Hoffmann La Roche Immune interferon and method for its purification
US4855238A (en) 1983-12-16 1989-08-08 Genentech, Inc. Recombinant gamma interferons having enhanced stability and methods therefor
MX9203641A (es) * 1983-12-16 1992-07-01 Genentech Inc Interferones gamma recombinantes que poseen estabilidad mejorada y metodos biotecnologicos para su obtencion.
JPS60172999A (ja) * 1983-12-20 1985-09-06 Suntory Ltd 新規な塩基性ポリペプチドおよびその製造法
US4758656A (en) * 1983-12-26 1988-07-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Novel human interferon-gamma polypeptide derivative
EP0174999B1 (en) * 1984-03-16 1991-04-17 Biogen, Inc. Method for improving expression and method thereto
DE3414831A1 (de) * 1984-04-19 1985-10-31 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Herstellung von polypeptiden mit human-gammainterferon-aktivitaet
IL75302A0 (en) * 1984-06-06 1985-09-29 Takeda Chemical Industries Ltd Novel polypeptide and production thereof
CA1302320C (en) * 1984-06-11 1992-06-02 Hideo Niwa Expression of human cromosomal interferon-_ in animal cells
JPS61108397A (ja) * 1984-10-31 1986-05-27 Green Cross Corp:The インタ−フエロン−γ蛋白質の製造法
JPS6156195A (ja) * 1985-03-01 1986-03-20 Asahi Chem Ind Co Ltd 新規生理活性ペプチド
US4873312A (en) * 1985-04-25 1989-10-10 Amgen Method for purifying interferon and composition of matter produced thereby
ATE81675T1 (de) * 1985-04-30 1992-11-15 Takeda Chemical Industries Ltd Produktion eines proteins.
DE3532134A1 (de) * 1985-09-10 1987-03-12 Basf Ag Verfahren zur herstellung von proteinen bestimmter n-terminaler struktur mit hilfe von prokaryonten
DE3536939A1 (de) * 1985-10-17 1987-04-23 Hoechst Ag Biologisch aktive derivate des human-(gamma)-interferons, ihre herstellung und arzneimittel, die solche derivate enthalten
EP0275300B1 (en) * 1986-08-01 1996-01-03 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Recombinant vaccine
GB8619725D0 (en) * 1986-08-13 1986-09-24 Hoffmann La Roche Homogenous interferon fragments
JP2653061B2 (ja) * 1986-12-27 1997-09-10 武田薬品工業株式会社 新規ポリペプチドおよびその製造法
US5157004A (en) * 1986-12-27 1992-10-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Polypeptides and production thereof
DE3730331A1 (de) * 1987-09-10 1989-03-30 Basf Ag Neue polypeptide, verfahren zur herstellung, die vektoren dafuer und arzneimittel daraus
AT393690B (de) * 1987-10-08 1991-11-25 Hoffmann La Roche Homogene, rekombinante immun-interferonfragmente
US5151265A (en) * 1987-11-03 1992-09-29 Genentech, Inc. Gamma interferon formulation
EP0355460B1 (en) * 1988-08-24 2000-12-27 American Cyanamid Company Stabilization of somatotropins by modification of cysteine residues utilizing site directed mutagenesis or chemical derivatization
US5198212A (en) * 1988-10-31 1993-03-30 University Of Lousville Research Foundation Incorporated Method and compositions for treatment of trauma-associated sepsis with gamma interferon
US6068994A (en) * 1989-08-07 2000-05-30 Chiron Corporation Ubiquitin expression system
BG52073B2 (en) * 1990-01-24 1996-04-30 Inst Molekuljarna Biolog Method for the preparation of recombinant human noncystein -interferon, free of n-end methionine
EP0546099B1 (en) * 1990-08-31 1994-10-12 Schering Corporation Use of human Interferon gamma 4-134
DE4036856C1 (hu) * 1990-11-19 1992-05-27 Fraunhofer-Gesellschaft Zur Foerderung Der Angewandten Forschung Ev, 8000 Muenchen, De
US5227158A (en) * 1991-06-10 1993-07-13 Genentech, Inc. Method of stimulating hepatocyte proliferation by administration of hepatocyte growth factor and gamma-interferon
US5328989A (en) * 1993-03-05 1994-07-12 Schering-Plough Purification of human interleukin-10 from a cell culture medium
JPH08511952A (ja) * 1993-07-01 1996-12-17 メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド 組換酵母増殖のための培地
TW249202B (hu) * 1993-08-13 1995-06-11 Ciba Gerigy Corp
US6977074B2 (en) 1997-07-10 2005-12-20 Mannkind Corporation Method of inducing a CTL response
US20080076706A1 (en) 1997-07-14 2008-03-27 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of Growth Hormone and Related Proteins, and Methods of Use Thereof
US7495087B2 (en) 1997-07-14 2009-02-24 Bolder Biotechnology, Inc. Cysteine muteins in the C-D loop of human interleukin-11
EP1881005B1 (en) * 1997-07-14 2013-04-03 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of G-CSF and related proteins
US6753165B1 (en) * 1999-01-14 2004-06-22 Bolder Biotechnology, Inc. Methods for making proteins containing free cysteine residues
US7153943B2 (en) * 1997-07-14 2006-12-26 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of growth hormone and related proteins, and methods of use thereof
ES2314786T3 (es) 1998-04-02 2009-03-16 Genentech, Inc. Uso de interferon gamma para el tratamiento de la hipertrofia cardiaca.
US8288126B2 (en) 1999-01-14 2012-10-16 Bolder Biotechnology, Inc. Methods for making proteins containing free cysteine residues
RU2140285C1 (ru) * 1999-01-25 1999-10-27 Гапонюк Петр Яковлевич Противовирусное средство - капли в нос "гриппферон"
AU5023300A (en) * 1999-05-20 2000-12-12 Scios Inc. Vascular endothelial growth factor variants
EP1183357A2 (en) * 1999-05-20 2002-03-06 Scios Inc. Vascular endothelial growth factor dimers
CN1309423C (zh) 1999-11-12 2007-04-11 马克西根控股公司 干扰素γ偶联物
CA2390292A1 (en) 1999-11-12 2001-05-25 Maxygen Holdings Ltd. Interferon gamma conjugates
CA2405709A1 (en) 2000-04-12 2001-10-25 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
EP1284987B1 (en) * 2000-05-16 2007-07-18 Bolder Biotechnology, Inc. Methods for refolding proteins containing free cysteine residues
CA2427194A1 (en) * 2000-11-03 2002-05-10 Biomedicines, Inc. Method for short-term and long-term drug dosimetry
EP1351707B9 (en) * 2001-01-09 2012-01-25 Baylor Research Institute Methods for treating autoimmune diseases in a subject and in vitro diagnostic assays
US6958388B2 (en) 2001-04-06 2005-10-25 Maxygen, Aps Interferon gamma polypeptide variants
US7038015B2 (en) * 2001-04-06 2006-05-02 Maxygen Holdings, Ltd. Interferon gamma polypeptide variants
IL161762A0 (en) * 2001-11-06 2005-11-20 Applied Research Systems Estradiol inhibiting agents in breast cancer
US20050079156A1 (en) * 2001-11-06 2005-04-14 Grace Wong Method of treating endometreosis
AU2002365436B8 (en) * 2001-11-09 2008-04-03 Intarcia Therapeutics, Inc. Method for treating diseases with omega interferon
US20050095224A1 (en) * 2001-12-07 2005-05-05 Ramachandran Radhakrishnan Compositions and method for treating hepatitis virus infection
CA2471363C (en) 2001-12-21 2014-02-11 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
AU2003239774A1 (en) * 2002-07-03 2004-01-23 Maxygen Holdings Ltd. Full-length interferon gamma polypeptide variants
US7731947B2 (en) 2003-11-17 2010-06-08 Intarcia Therapeutics, Inc. Composition and dosage form comprising an interferon particle formulation and suspending vehicle
US20070172446A1 (en) 2003-05-16 2007-07-26 Intermune, Inc. Synthetic chemokine receptor ligands and methods of use thereof
WO2004103296A2 (en) * 2003-05-16 2004-12-02 Intermune, Inc. Methods of treating idiopathic pulmonary fibrosis
DK1680137T3 (da) 2003-10-14 2013-02-18 Hoffmann La Roche Makrocyklisk carboxylsyre- og acylsulfonamidforbindelse som inhibitor af HCV-replikation
US7407973B2 (en) * 2003-10-24 2008-08-05 Intermune, Inc. Use of pirfenidone in therapeutic regimens
AU2005211385B2 (en) * 2004-02-02 2008-12-11 Ambrx, Inc. Modified human growth hormone polypeptides and their uses
US7597884B2 (en) 2004-08-09 2009-10-06 Alios Biopharma, Inc. Hyperglycosylated polypeptide variants and methods of use
JP2006141263A (ja) * 2004-11-18 2006-06-08 Kyoto Univ （ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの製造方法
US11246913B2 (en) 2005-02-03 2022-02-15 Intarcia Therapeutics, Inc. Suspension formulation comprising an insulinotropic peptide
WO2006083761A2 (en) 2005-02-03 2006-08-10 Alza Corporation Solvent/polymer solutions as suspension vehicles
CA2607806A1 (en) * 2005-05-04 2006-11-16 Nautilus Biotech, S.A. Modified interferon-gamma polypeptides and methods for using modified interferon-gamma polypeptides
ES2351527T3 (es) 2006-05-30 2011-02-07 Intarcia Therapeutics, Inc Modulador de flujo en dos piezas con conducto interno para un sistema osmótico de administración.
NZ574524A (en) 2006-08-09 2011-07-29 Intarcia Therapeutics Inc Piston assembly for positioning lumen of a reservoir for an osmotic delivery having a columnar body and a spring
US20090181078A1 (en) * 2006-09-26 2009-07-16 Infectious Disease Research Institute Vaccine composition containing synthetic adjuvant
PL2486938T3 (pl) 2006-09-26 2018-08-31 Infectious Disease Research Institute Kompozycja szczepionki zawierająca syntetyczny adiuwant
WO2008076933A2 (en) 2006-12-14 2008-06-26 Bolder Biotechnology, Inc. Long acting proteins and peptides and methods of making and using the same
EP2157967B1 (en) 2007-04-23 2013-01-16 Intarcia Therapeutics, Inc Suspension formulations of insulinotropic peptides and uses thereof
CA2685596A1 (en) 2007-05-02 2008-11-13 Ambrx, Inc. Modified interferon beta polypeptides and their uses
JP5702150B2 (ja) 2008-02-08 2015-04-15 アンブルックス, インコーポレイテッドAmbrx, Inc. 修飾されているレプチンポリペプチドおよびそれらの使用
WO2009102467A2 (en) 2008-02-13 2009-08-20 Intarcia Therapeutics, Inc. Devices, formulations, and methods for delivery of multiple beneficial agents
US8243103B2 (en) * 2009-05-29 2012-08-14 Exelis, Inc. Laser aiming spot distinguishing methods and apparatus
ES2606563T3 (es) 2009-06-05 2017-03-24 Infectious Disease Research Institute Adyuvantes lipídicos de glucopiranosilo sintéticos y composiciones de vacuna que contienen los mismos
LT2462246T (lt) 2009-09-28 2017-11-27 Intarcia Therapeutics, Inc Esminio stacionaraus vaisto tiekimo greitas įgyvendinimas ir (arba) nutraukimas
KR101858598B1 (ko) * 2010-02-01 2018-05-16 디그나 비오테크, 에스.엘. 인터페론 알파 5의 제조방법
US20120208755A1 (en) 2011-02-16 2012-08-16 Intarcia Therapeutics, Inc. Compositions, Devices and Methods of Use Thereof for the Treatment of Cancers
EP2694099B1 (en) 2011-04-08 2019-10-16 Immune Design Corp. Immunogenic compositions and methods of using the compositions for inducing humoral and cellular immune responses
WO2013024158A1 (en) 2011-08-17 2013-02-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Combinations of protein kinase inhibitors and interferons or of protein kinase inhibitors and direct acting antivirals for the treatment and the prevention of hcv infection
WO2013024156A2 (en) 2011-08-17 2013-02-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Combinations of anti-hcv-entry factor antibodies and interferons for the treatment and the prevention of hcv infection
LT2811981T (lt) 2012-02-07 2019-06-10 Infectious Disease Research Institute Pagerintos adjuvanto kompozicijos, apimančios tlr4 agonistus, ir jų panaudojimo būdai
PL2850431T3 (pl) 2012-05-16 2018-09-28 Immune Design Corp. Szczepionki przeciwko HSV-2
WO2014033266A1 (en) 2012-08-31 2014-03-06 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Anti-sr-bi antibodies for the inhibition of hepatitis c virus infection
SG11201508092YA (en) 2013-04-18 2015-10-29 Immune Design Corp Gla monotherapy for use in cancer treatment
US9463198B2 (en) 2013-06-04 2016-10-11 Infectious Disease Research Institute Compositions and methods for reducing or preventing metastasis
US9889085B1 (en) 2014-09-30 2018-02-13 Intarcia Therapeutics, Inc. Therapeutic methods for the treatment of diabetes and related conditions for patients with high baseline HbA1c
JP6993235B2 (ja) 2015-06-03 2022-01-13 インターシア セラピューティクス，インコーポレイティド インプラントの設置及び撤去システム
WO2017200852A1 (en) 2016-05-16 2017-11-23 Infectious Disease Research Institute Formulation containing tlr agonist and methods of use
EP3458084B1 (en) 2016-05-16 2020-04-01 Intarcia Therapeutics, Inc Glucagon-receptor selective polypeptides and methods of use thereof
MX2018014399A (es) 2016-06-01 2019-06-06 Infectious Disease Res Inst Particulas de nanoalumbre que contienen un agente de dimensionamiento.
USD860451S1 (en) 2016-06-02 2019-09-17 Intarcia Therapeutics, Inc. Implant removal tool
USD840030S1 (en) 2016-06-02 2019-02-05 Intarcia Therapeutics, Inc. Implant placement guide
ES2917000T3 (es) 2016-10-24 2022-07-06 Orionis Biosciences BV Interferón-gamma mutante diana y usos del mismo
KR20190104039A (ko) 2017-01-03 2019-09-05 인타르시아 세라퓨틱스 인코포레이티드 Glp-1 수용체 효능제의 연속적인 투여 및 약물의 동시-투여를 포함하는 방법
US11672877B2 (en) 2017-08-23 2023-06-13 Wayne State University In vivo immunoimaging of interferon-gamma
JP7339942B2 (ja) 2017-09-08 2023-09-06 アクセス ツー アドバンスト ヘルス インスティチュート サポニンを含むリポソーム製剤および使用方法
CN115484985A (zh) 2020-03-19 2022-12-16 崔泽尔有限公司 温度响应病毒储存系统
IL296845A (en) 2020-03-30 2022-11-01 Trizell Ltd Preparations and methods for the treatment of cancer

Family Cites Families (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL7404590A (nl) * 1974-04-03 1975-10-07 Stichting Rega V Z W Werkwijze voor het reactiveren van interferon.
NL7404589A (nl) * 1974-04-03 1975-10-07 Stichting Rega V Z W Werkwijze voor het stabiliseren van interferon.
US4332892A (en) * 1979-01-15 1982-06-01 President And Fellows Of Harvard College Protein synthesis
JPS5598118A (en) * 1979-01-18 1980-07-25 Hayashibara Takeshi Preparation of type-2 interferon and drug containing the same
AU538665B2 (en) * 1979-10-30 1984-08-23 Juridical Foundation, Japanese Foundation For Cancer Research Human interferon dna
IL58765A (en) * 1979-11-21 1986-09-30 Yeda Res & Dev Process for the production of essentially pure messenger rna of human fibroblast interferon and process for the production of interferon beta
GB2068970B (en) * 1980-02-06 1983-06-22 Searle & Co Recombinant dna technique for the preparation of a protein resembling human interferon
DE3005897A1 (de) * 1980-02-16 1981-09-03 Hoechst Ag, 6000 Frankfurt Genprodukt eines hoeheren organismus aus einem dieses gen enhtaltenden mikroorganismus
US4338397A (en) * 1980-04-11 1982-07-06 President And Fellows Of Harvard College Mature protein synthesis
US4460685A (en) * 1980-05-29 1984-07-17 New York University Method of enhancing the production of human γ Interferon
US4311639A (en) * 1980-07-25 1982-01-19 E. I. Du Pont De Nemours And Company Immunogenic interferon peptides
US4341761A (en) * 1980-07-25 1982-07-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company Antibodies to immunogenic peptides and their use to purify human fibroblast interferon
FI64813C (fi) * 1980-12-31 1984-01-10 Ilkka Antero Palva Foerfarande foer producering av ett utvalt aeggviteaemne och vid foerfarandet anvaenda rekombinantplasmidvektorer
US4382027A (en) * 1981-08-18 1983-05-03 Meloy Laboratories, Inc. Purification of human immune interferon
IL65475A0 (en) * 1981-04-17 1982-07-30 Meloy Lab Production of immune interferon and its mrna
US4404188A (en) * 1981-07-29 1983-09-13 Massachusetts General Hospital Purified Mullerian Inhibiting Substance and method of purification
AU561343B2 (en) * 1981-10-19 1987-05-07 Genentech Inc. Human immune interferon by recombinant dna
US5096705A (en) * 1981-10-19 1992-03-17 Genentech, Inc. Human immune interferon
US5582824A (en) * 1981-10-19 1996-12-10 Genentech, Inc. Recombinant DES-CYS-TYR-CYS human immune interferon
US4361509A (en) * 1981-12-14 1982-11-30 Scripps Clinic And Research Foundation Ultrapurification of factor VIII using monoclonal antibodies
JPS58110548A (ja) 1981-12-24 1983-07-01 Asahi Chem Ind Co Ltd 新規な生理活性ペプチド
US4388234A (en) * 1981-12-28 1983-06-14 Hoffmann-La Roche Inc. Peptide isolation
US5004689A (en) * 1982-02-22 1991-04-02 Biogen, Massachusetts DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human gamma interferon-like polypeptides in high yields
ZA831094B (en) * 1982-02-22 1983-11-30 Biogen Nv Dna sequences,recombinant dna molecules and processes for producing human immune interferon-like polypeptides
ZA83768B (en) * 1982-03-01 1983-10-26 Hoffmann La Roche Homogeneous human immune interferon and process therefor
IL68100A0 (en) * 1982-03-24 1983-06-15 Takeda Chemical Industries Ltd Novel dna and use thereof
US6936694B1 (en) * 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
JPH0787797B2 (ja) * 1982-05-20 1995-09-27 サントリー株式会社 ヒト・ガンマ・インタ−フエロン様ポリペプチドの製造法
US4681848A (en) * 1982-09-22 1987-07-21 Takeda Chemical Industries, Ltd. Novel peptide and use thereof
IL69851A0 (en) * 1982-09-30 1983-12-30 Japan Found Cancer Novel dna and recombinant plasmid containing the same
WO1984002129A1 (en) * 1982-11-22 1984-06-07 Takeda Chemical Industries Ltd Human immune interferon protein and process for its preparation
US4432895A (en) * 1982-11-24 1984-02-21 Hoffmann-La Roche Inc. Monomeric interferons
US4485017A (en) * 1982-12-22 1984-11-27 Cetus Corporation Isolation of human interferon by immunosorbent and high performance liquid chromatography
JPH0740925B2 (ja) * 1983-03-14 1995-05-10 協和醗酵工業株式会社 新規ヒトインタ−フエロン−γポリペプチド
JPS59169494A (ja) * 1983-03-17 1984-09-25 Takeda Chem Ind Ltd 新規組み換えｄｎａおよびその用途
US4599306A (en) * 1983-04-15 1986-07-08 Amgen Monoclonal antibodies which specifically bind to human immune interferon
IL71951A0 (en) * 1983-06-01 1984-09-30 Hoffmann La Roche Polypeptides having interferon activity,their preparation and pharmaceutical compositions containing them
IL72773A0 (en) * 1983-08-29 1984-11-30 Meloy Lab Production of immune interferon and its mrna
US4681930A (en) * 1983-09-20 1987-07-21 Hoffmann-La Roche Inc. Immune interferon and a method for its extraction and purification
US4476049A (en) * 1983-09-20 1984-10-09 Hoffmann-La Roche Inc. Method for the extraction of immune interferon
US4604284A (en) * 1983-09-20 1986-08-05 Hoffmann-La Roche Inc. Homogeneous immune interferon fragment
JPS6079000A (ja) * 1983-10-04 1985-05-04 Takeda Chem Ind Ltd ヒトγ型インタ−フエロン単量体の製造法
JPH0788398B2 (ja) * 1983-10-17 1995-09-27 サントリー株式会社 新規生理活性ポリペプチドおよびその製造法
JPS60118196A (ja) * 1983-11-30 1985-06-25 Takeda Chem Ind Ltd インタ−フェロンの製造法
FR2556365B1 (fr) * 1983-12-09 1987-07-31 Transgene Sa Vecteurs de clonage et d'expression de l'interferon-g, bacteries transformees et procede de preparation de l'interferon-g
US4855238A (en) * 1983-12-16 1989-08-08 Genentech, Inc. Recombinant gamma interferons having enhanced stability and methods therefor
MX9203641A (es) * 1983-12-16 1992-07-01 Genentech Inc Interferones gamma recombinantes que poseen estabilidad mejorada y metodos biotecnologicos para su obtencion.
IL75302A0 (en) * 1984-06-06 1985-09-29 Takeda Chemical Industries Ltd Novel polypeptide and production thereof
JP2653061B2 (ja) 1986-12-27 1997-09-10 武田薬品工業株式会社 新規ポリペプチドおよびその製造法

Also Published As

Publication number Publication date
JPH08151399A (ja) 1996-06-11
MY102899A (en) 1993-03-31
IE72494B1 (en) 1997-04-23
DK166832B1 (da) 1993-07-19
FI844934A0 (fi) 1984-12-13
OA07902A (en) 1986-11-20
JPH0789935B2 (ja) 1995-10-04
LV11633A (lv) 1996-12-20
PT79691A (en) 1985-01-01
PH24790A (en) 1990-10-30
EP0146354B2 (en) 2001-10-24
HUT36187A (en) 1985-08-28
FI91884C (fi) 1994-08-25
ATE135405T1 (de) 1996-03-15
AU3663584A (en) 1985-06-20
CY1945A (en) 1984-12-14
JPS60202899A (ja) 1985-10-14
JPH03201979A (ja) 1991-09-03
AU597872B2 (en) 1990-06-14
NO178789B (no) 1996-02-26
FI91884B (fi) 1994-05-13
DK600984D0 (da) 1984-12-14
ES8801553A1 (es) 1988-02-16
JP2580491B2 (ja) 1997-02-12
JPH07173196A (ja) 1995-07-11
JP2545206B2 (ja) 1996-10-16
US5574137A (en) 1996-11-12
IL73803A (en) 1997-09-30
JPH0794477B2 (ja) 1995-10-11
JPH0919295A (ja) 1997-01-21
JPH10210985A (ja) 1998-08-11
DE3486424T2 (de) 1996-09-12
US4855238A (en) 1989-08-08
CA1341573C (en) 2008-05-13
DE3486424D1 (de) 1996-04-18
DK600984A (da) 1985-08-22
NO845042L (no) 1985-06-17
KR940008978B1 (ko) 1994-09-28
HK175996A (en) 1996-09-27
LV11633B (en) 1997-08-20
FI844934L (fi) 1985-06-17
GR82468B (en) 1985-03-27
JP2719128B2 (ja) 1998-02-25
DE3486424T3 (de) 2002-06-06
EP0146354A2 (en) 1985-06-26
US5595888A (en) 1997-01-21
IE843203L (en) 1985-06-16
EP0146354A3 (en) 1986-03-19
EP0146354B1 (en) 1996-03-13
ES538620A0 (es) 1988-02-16
KR850004273A (ko) 1985-07-11
JP2886145B2 (ja) 1999-04-26
IL73803A0 (en) 1985-03-31
US6497871B1 (en) 2002-12-24
NO178789C (no) 1996-06-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU202278B (en) Process for producing recombinant gamma-interferonok of improved stability and pharmaceutical compositions comprising same
US5690925A (en) Recombinant gamma interferons having enhanced stability and methods therefor
US4917887A (en) Hybrid interferons, their use as pharmaceutical compositions and as intermediate products for the preparation of antibodies and the use thereof and processes for preparing them
EP0155549B1 (en) Dna encoding human tumor necrosis factor and human tumor necrosis factor polypeptide
Pestka The human interferon α species and receptors
JP2515308B2 (ja) ヒト免疫インタ−フエロン
US4758428A (en) Multiclass hybrid interferons
JP4637913B2 (ja) ヒトインターフェロンベータ変異体
FI99116C (fi) Menetelmä valmistaa hevosen -interferonia
HU193507B (en) Process for producing interferen-like pelypeptides
Pontzer et al. Structure/function studies with interferon tau: evidence for multiple active sites
US4980455A (en) Novel polypeptides and production thereof
US20030017550A1 (en) DNA sequences encoding fusion proteins comprising IFN-beta and TM-alpha1
US5157004A (en) Polypeptides and production thereof
JPS615096A (ja) 新規ポリペプチドおよびその製造法