JP2003500053A

JP2003500053A - 血管内皮増殖因子ダイマー

Info

Publication number: JP2003500053A
Application number: JP2000620093A
Authority: JP
Inventors: ロドニーアランジュ，; ウテシェレンベルガー，; ピーターエイ．ステイディス，; ピーターイザドアアドリアンセンズ，; ジュディスエイ．エイブラハム，; パトリシアアンバルドウィン，; エヌ．ステファンポリット，
Original assignee: サイオス，インコーポレーテッド
Priority date: 1999-05-20
Filing date: 2000-05-18
Publication date: 2003-01-07
Also published as: WO2000071716A3; WO2000071716A2; AU5026100A; US20050119165A1; EP1183357A2; CA2374050A1; US20040241800A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、新規の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ダイマー、このようなダイマーを含む組成物、このようなダイマーの製法、およびこのようなダイマーまたは組成物の投与によって種々の疾患を治療する方法に関するものである。本発明はさらに、Ｃｙｓ−１１６が他の外来性のシステインにジスルフィド結合しているＶＥＧＦ₁₂₁ダイマーが、高い安定性を有し、その一方で、ＶＥＧＦの生物学的活性は保有される、という認識に基づいている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の背景）（発明の分野）本発明は新規の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ダイマー、このようなダイマー
を含む組成物、このようなダイマーの製法、およびこのようなダイマーおよび組
成物の投与による血管病の治療に関係する。

【０００２】（関連技術の説明）血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（血管透過性因子（ＶＰＦ）とも言われる）は
ホモダイマーとして一般に存在する、複数の生物学的機能を有する分泌タンパク
質である。ネイティブのヒトＶＥＧＦモノマーは、シグナルペプチドの除去後、
長さ１２１、１４５、１４８、１６５、１８３、１８９、および２０６アミノ酸
残基の長さからなるの７種類の公知のアイソフォームの一つとして存在する。こ
れらのアイソフォームは、モノマー型であれホモダイマー型であれ、一般的に文
献ではそれぞれｈＶＥＧＦ₁₂₁、ｈＶＥＧＦ₁₄₅、ｈＶＥＧＦ₁₄₈、ｈＶＥＧＦ₁₆₅ 、ｈＶＥＧＦ₁₈₃、ｈＶＥＧＦ₁₈₉、およびｈＶＥＧＦ₂₀₆と呼ばれている。これ
らの公知のアイソフォームは、７つのイントロンによって分離された８つのエキ
ソンで組織化され、染色体６ｐ２１．３に指定される単一ヒトＶＥＧＦ遺伝子に
よってコードされたＲＮＡの、選択的スプライシングによって生成する（ビンセ
ンチ（Ｖｉｎｃｅｎｔｉ）ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ９３巻：１４９３−１
４９５ページ［１９９６］）。このためこれらのアイソフォームはＶＥＧＦスプ
ライス変異体とも呼ばれる。ＶＥＧＦｍＲＮＡのの選択的スプライシングによ
って生成するＶＥＧＦの各種の型の略図を図２に示す。ここではＶＥＧＦ遺伝子
の８エキソンの各々によってコードされるタンパク配列は、番号をつけたボック
スによってあらわされている。ｈＶＥＧＦ₁₆₅にはエキソン６によってコードさ
れる残基はなく、一方ｈＶＥＧＦ₁₂₁にはエキソン６および７によってコードさ
れる残基がない。ｈＶＥＧＦ₁₂₁はヘパリンに結合できないことが知られている
唯一のＶＥＧＦアイソフォームである。ｈＶＥＧＦ₁₂₁にヘパリン結合領域がな
いことは、その生化学的特性および薬物動態的特性に顕著な影響を有する。さら
に、ｈＶＥＧＦをプラスミドでタンパク分解的に切断すると、１１０−アミノ酸
からなるタンパク分解性断片（ｈＶＥＧＦ₁₁₀）が生成する（ケイト（Ｋｅｙｔ
）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：７７８８−７７９５［１９９６］）。

【０００３】上記７種類の公知のアイソフォームのなかではｈＶＥＧＦ₁₂₁およびｈＶＥＧ
Ｆ₁₆₅が最も豊富にある。ｈＶＥＧＦ₁₂₁およびｈＶＥＧＦ₁₆₅ダイマーは両方と
もリセプターＫＤＲ／Ｆｌｋ−１およびＦｌｔ−１に結合するが、ｈＶＥＧＦ₁₆ ₅ ダイマーはその他に最近発見されたリセプター（ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ）にも結合する
（ソカー（Ｓｏｋｅｒ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：５７６１−５７
６７［１９９６］）。ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒは最近ソカーらによってクローン化され、
そしてニューロピリンとして知られる既に明らかにされているタンパク質に一致
することが示された（Ｃｅｌｌ９２：７３５−７４５［１９９８］）。ｈＶＥ
ＧＦ₁₆₅ダイマーの後者リセプターへの結合は、ｈＶＥＧＦ₁₂₁には存在しないエ
キソン７−コーデッド（ｃｏｄｅｄ）−ドメインによって媒介される。

【０００４】ダイマーＶＥＧＦは、動脈、静脈、およびリンパ管に由来するミクロ−および
マクロ血管内皮細胞の強力なマイトジェンであるが、その他のほとんど全ての正
常細胞型に対しては顕著なマイトジェン作用は示さない。ＶＥＧＦという名称は
この狭い標的細胞に対する特異性を反映するものである。新脈管形成（新しい血
管の生成）および血管リモデリング（既存の血管の拡大）におけるその重要な役
割の結果として、ＶＥＧＦは心臓血管疾患および末梢血管疾患の治療の有望な候
補となる。種々の腫瘍型において腫瘍誘引性低酸素に反応して高レベルのＶＥＧ
Ｆがあらわれ（ドボラク（Ｄｖｏｒａｋ）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１
２７５−１２７８［１９９１］；プレート（Ｐｌａｔｅ）ら、Ｎａｔｕｒｅ３
５９：８４５−８４８［１９９２］）、腫瘍増殖が抗−ＶＥＧＦ抗体および溶解
性ＶＥＧＦリセプターによって阻止される（キム（Ｋｉｍ）ら、Ｎａｔｕｒｅ
３６２：８４１−８４４［１９９３］；ケンダル（Ｋｅｎｄａｌｌ）およびトー
マス（Ｔｈｏｍａｓ）、ＰＮＡＳＵＳＡ９０：１０７０５−１０７０９［１
９９３］）。

【０００５】生物学的活性を有するネイティブなｈＶＥＧＦ₁₂₁は、モノマー鎖１本につき
１個のＮ−結合グリコシル化部位をアミノ酸位置−７５（Ａｓｎ−７５）に含む
ホモダイマー（２本の鎖が反対平行（ａｎｔｉ−ｐａｒａｌｌｅｌ）方向にある
）である。このアミノ酸位置はｈＶＥＧＦ₁₆₅の位置７５にある同様なグリコシ
ル化部位に対応する。もしもＮ−結合グリコシル化構造が存在しなければ、生物
学的活性なｈＶＥＧＦ₁₂₁ホモダイマーは約２８ｋＤａの分子量を有し、理論的
ｐＩは６．５である。ｈＶＥＧＦ₁₂₁ホモダイマーの各モノマー鎖は全部で９個
のシステインを有し、そのうち６個はこのモノマー構造を安定化している３つの
鎖内ジスルフィドの形成に関係し、２個はダイマー構造を安定化している２つの
鎖間ジスルフィド結合に関係する；最近に至るまで、１個のシステイン（Ｃｙｓ
−１１６）は不対のままであると考えられている。ケック（Ｋｅｃｋ）ら（Ａｒ
ｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．３４４：１０３−１１３［１９９７］）
も、Ｃｙｓ（１１６）−Ｃｙｓ（１１６）鎖間ジスルフィド結合を有する大腸菌
（Ｅ．Ｃｏｌｉ）由来−組換えＶＥＧＦ₁₂₁ダイマー種を確認したが、これらの
著者は、ｈＶＥＧＦ₁₂₁の位置１１６のこの不対システインが生物学的に重要で
あるらしい−−例えばＶＥＧＦ₁₂₁をフィブロネクチンのような、不対システイ
ンを含む細胞外基質関連タンパク質に共有結合させるのに役立つ等−と述べてい
る（ワグナー（Ｗａｇｎｅｒ）およびハイネス（Ｈｙｎｅｓ）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２５４：６７４６−６７５４［１９７９］）。

【０００６】ｈＶＥＧＦ₁₂₁を大腸菌に発現させた（ケックら、同上；クリスチンガー（Ｃ
ｈｒｉｓｔｉｎｇｅｒ）ら、Ｐｒｏｔ．Ｓｔｒｕｃ．Ｆｕｎｃ．Ｇｅｎｅｔ．２
６：３５３−３５７［１９９６］；シーマイスター（Ｓｉｅｍｅｉｓｔｅｒ）ら
、Ｂｉｏｐｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２２２：２４９−２５
５［１９９６］；シーマイスターら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１１１
１５−１１１２０［１９９８］；およびケイトら、同上）；哺乳動物細胞系に安
定的および一過性に発現させた（ホウク（Ｈｏｕｃｋ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６７：２６０３１−２６０３７［１９９２］；ホウクら、Ｍｏｌ．Ｅｎ
ｄｏ．５：１８０６−１８１４［１９９１］：およびシーマイスターら、Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．同上［１９９８］）；Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（コンド（
Ｋｏｎｄｏ）ら、Ｂｉｏｐｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１２４３：１９
５−２０２［１９９５］）およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（モハラジュ（Ｍｏｈａ
ｎｒａｊ）ら、Ｂｉｏｐｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２１５：
７５０−７５６［１９９５］）等の酵母に発現させた；そしてバキュロウィルス
−ベースの発現系を感染させた昆虫細胞に発現させた（フィービヒ（Ｆｉｅｂｉ
ｃｈ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１１：１９−２６［１９９３］；コ
ーエン（Ｃｏｈｅｎ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１１３２２−１１
３２６［１９９５］；およびＧｉｔａｙ−Ｇｏｒｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２７１５５１９−５５２３［１９９６］）。シーマイスターら（Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．同上（１９９８））はｈＶＥＧＦ₁₂₁のアミノ酸配列のＨｉｓ
−１２とＡｓｐ−１９の間のドメインが、組換えＶＥＧＦ₁₂₁モノマーのインビ
トロ二量体化のために、および哺乳動物細胞におけるこの分子の機能的発現の両
方のために必須であることを確認した。ＶＥＧＦ₁₂₁のＣｙｓ−１１６の状態が
この分子の生物学的活性、安定性およびその他の特性に与えるかも知れない効果
に関する研究は報告されていない。

【０００７】（発明の要旨）本発明は、Ｃｙｓ−１１６がその他の外来システインにジスルフィド結合して
いるＶＥＧＦ₁₂₁ダイマーが高い安定性を有し、その一方でＶＥＧＦの生物学的
活性は保有する、という認識に基づいている。本発明はさらに、これが全長（１
２１アミノ酸長さ）のヒトＶＥＧＦ₁₂₁、およびその他の動物、例えば哺乳動物
種等におけるその相同体（ｈｏｍｏｌｏｇ）のみならず、ＶＥＧＦ₁₂₁誘導体、
特にネイティブのＶＥＧＦ₁₂₁分子のアミノ／および／またはカルボキシ末端で
種々様々に切断された改変体にもあてはまる（それらのモノマーサブユニトの各
々において、これらの改変体が全長ヒトＶＥＧＦ₁₂₁分子のＣｙｓ−１１６に対
応する位置にシステインを保持する限り）、という知見に基づいている。

【０００８】よって本発明は一面において、次のような第一および第二モノマーからなる血
管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ダイマーに関するものである；すなわち各第一およ
び第二モノマーは配列番号１の少なくともアミノ酸１１〜１１６を含み、または
配列番号１と、または配列番号１のアミノ酸１１〜１１６と、少なくとも約９０
％の配列同一性、好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約
９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号１の位置１１６（Ｃ
ｙｓ−１１６）に対応する位置にシステインを保持し、その際各モノマーのＣｙ
ｓ−１１６はその他の外来システイン（Ｃｙｓ）にジスルフィド結合している。
上記その他のＣｙｓは２ないし５、好ましくは２ないし３のアミノ酸、例えばグ
ルタチオンを含むペプチドの一部であってもよい。各モノマーは独立的にグリコ
シル化されていても、グリコシル化されていなくともよい。

【０００９】別の局面において、本発明は次のような第一および第二モノマーからなるＶＥ
ＧＦダイマーを、薬物学的に容認される賦形薬と混合して含む組成物にも関係す
る；その際各第一および第二モノマーは少なくとも配列番号１のアミノ酸１１〜
１１６、または配列番号１と、または配列番号１のアミノ酸１１〜１１６と少な
くとも約９０％、好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約
９８％の配列同一性を有し、配列番号１の位置１１６（Ｃｙｓ−１１６）に対応
する位置にシステイン（Ｃｙｓ）を保持し、その際各モノマーのＣｙｓ−１１６
はその他のＣｙｓにジスルフィド結合している。各モノマーは独立的にグリコシ
ル化されていても、グリコシル化されていなくともよい。好ましい実施形態にお
いて、上記組成物は、各モノマーの位置１１６のシステインが鎖間ジスルフィド
結合と連結しており、および／または各モノマーの位置１１６のシステインが不
対であるというＶＥＧＦダイマーを実質的に含まない。

【００１０】もう一つの面において、本発明は、第一および第二モノマーによって各々形成
され、下記からなる群から選択される少なくとも２種類の血管内皮増殖因子（Ｖ
ＥＧＦ）ダイマーを含む、問題の組成物に関係する：（ａ）各モノマーが配列番号１のアミノ酸１１〜１１６、または配列番号１と
または配列番号１のアミノ酸１１〜１１６と少なくとも約９０％、好ましくは少
なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性を有し、配
列番号１の位置１１６（Ｃｙｓ−１１６）に対応する位置にシステイン（Ｃｙｓ
）を保持するアミノ酸配列を含み、各モノマーの位置１１６のＣｙｓ、またはそ
の位置に対応するＣｙｓがその他のＣｙｓにジスルフィド結合しているダイマー
；ならびに（ｂ）各モノマーが配列番号１のアミノ酸１１〜１１６、または配列番号１と
、または配列番号１のアミノ酸１１〜１１６と少なくとも約９０％、好ましくは
少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性を有し、
配列番号１の位置１１６（Ｃｙｓ−１１６）に対応する位置にシステイン（Ｃｙ
ｓ）を保持するアミノ酸配列を含み、各モノマーの位置１１６のシステイン類ま
たはそれに対応するシステイン位置が鎖間ジスルフィド結合と連結しているダイ
マー（ｃ）各モノマーが配列番号１のアミノ酸１１〜１１６、またはまたは配列番
号１とまたは配列番号Ｎのアミノ酸１１〜１１６と少なくとも約９０％、好まし
くは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性を有
し、配列番号１の位置１１６（Ｃｙｓ−１１６）に対応する位置にシステイン（
Ｃｙｓ）を保持するアミノ酸配列を含み、一つまたは両方のモノマーの位置１１
６のＣｙｓ、またはその位置に対応するＣｙｓが不対であるダイマー；ここで前記ダイマー（ａ）−（ｃ）において、上記第一および第二モノマーは
独立的にグリコシル化されていてもグリコシル化されていなくともよい。好まし
い実施形態において、上記組成物は、その主要ＶＥＧＦタンパク成分として、各
モノマーが、配列番号１のアミノ酸１ないし１２０、または配列番号１のアミノ
酸１ないし１２０と少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９５％、より
好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性を有するアミノ酸を含み、配列番号
１の位置１１６（Ｃｙｓ−１１６）に対応する位置にシステイン（Ｃｙｓ）を保
持するアミノ酸配列を含み、各モノマーのＣｙｓ−１１６が付加的Ｃｙｓにジス
ルフィド結合しているダイマーを含んでなる。好ましくはこの主要成分は記載の
ＶＥＧＦダイマーの量の少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約６５
％、より好ましくは少なくとも約７０％、さらにより好ましくは少なくとも約７
５％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なく
とも約８５％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましく
は少なくとも約９５％を構成する。

【００１１】さらなる局面において、本発明はＶＥＧＦポリペプチドを含む問題の組成物を
提供する方法に関係する；その際上記ＶＥＧＦポリペプチドは実質的に、下記の
群から選択される少なくとも２種類の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ダイマー（
各ダイマーは第一および第二モノマーによって形成されている）から構成される
：（ａ）各モノマーが配列番号１のアミノ酸１１〜１１６、または配列番号１と
または配列番号１のアミノ酸１１〜１１６と少なくとも約９０％、好ましくは少
なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性を有し、配
列番号１の位置１１６（Ｃｙｓ−１１６）に対応する位置にシステイン（Ｃｙｓ
）を保持するアミノ酸配列を含み、各モノマーの位置１１６の、またはそれに対
応するＣｙｓが付加的Ｃｙｓにジスルフィド結合しているダイマー；（ｂ）各モノマーが配列番号１のアミノ酸１１〜１１６、または配列番号１ま
たは配列番号１のアミノ酸１１〜１１６と少なくとも約９０％、好ましくは少な
くとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性を有し、配列
番号１の位置１１６（Ｃｙｓ−１１６）に対応する位置にシステイン（Ｃｙｓ）
を保持するアミノ酸配列を含み、各モノマーの位置１１６のまたはそれに対応す
るシステイン類が鎖間ジスルフィド結合で結合しているダイマー（ｃ）各モノマーが配列番号１のアミノ酸１１〜１１６、または配列番号１ま
たは配列番号１のアミノ酸１１〜１１６と少なくとも約９０％、好ましくは少な
くとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性を有し、配列
番号１の位置１１６（Ｃｙｓ−１１６）に対応する位置にシステイン（Ｃｙｓ）
を保持するアミノ酸配列を含み、一つのまたは両方のモノマーの位置１１６のＣ
ｙｓ、またはそれに対応するＣｙｓが不対であるダイマー；ここでダイマー（ａ）−（ｃ）の各々において、第一および第二モノマーは独立
的にグリコシル化されても、されていなくともよい。

【００１２】上記の方法は以下の工程を包含する：配列番号１のポリペプチドをコードし、またはアミノ酸配列が配列番号１と少
なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも
約９８％の配列同一性を有し、配列番号１の位置１１６（Ｃｙｓ−１１６）に対
応する位置にシステインを含むというポリペプチドをコードする、作動可能な発
現ベクターに存在する外因性付加ＤＮＡ種を含む形質転換された宿主細胞を作製
する工程、上記ＤＮＡの発現およびＶＥＧＦポリペプチドの合成のために適した条件下で
上記宿主細胞を培養する工程、ＶＥＧＦポリペプチドを回収する工程。

【００１３】上記方法（プロセス）は例えば精製および／またはリフォールディング（ｒｅ
ｆｏｌｄｉｎｇ）工程等のさらなる工程を含んでもよい。形質転換された宿主細
胞が大腸菌細胞等の細菌である場合は、上記ポリペプチドは代表的にリフォール
ディング（再折り畳み）される。好ましい実施形態において、リフォールディン
グ緩衝液は、システインおよびシスチンを、ＶＥＧＦダイマーの所望混合物を生
成するのに十分な量、および相互比で含む。

【００１４】上記宿主細胞が細菌細胞であるならば、アミノ末端（Ｎ−末端）でＭｅｔ（Ａ
Ａ）_n配列だけ延長した配列番号１のポリペプチドをコードするＤＮＡを用いる
のが好都合である；この際Ｍｅｔはメチオニン残基を意味し、ｎは１−７、ＡＡ
は同一かまたは異なるアミノ酸をあらわし、その際ＡＡアミノ酸の少なくとも１
つ、または２つ以上のＡＡアミノ酸の組み合わせは細菌細胞中のＶＥＧＦポリペ
プチドの成熟Ｎ−末端のタンパク分解性分解を遅らせることができる。好ましい
実施形態において、ｎは１−５、好ましくは１−３、より好ましくは１または２
、最も好ましくは１で、ＡＡはリジン（Ｌｙｓ）またはアルギニン（Ａｒｇ）残
基をあらわし、好ましくはＬｙｓ残基をあらわす。

【００１５】本発明はさらに、２種類のＶＥＧＦモノマーからなる血管内皮増殖因子（ＶＥ
ＧＦ）ダイマーにおいて、各モノマーが配列番号１のアミノ酸１１〜１１６、ま
たは配列番号１のアミノ酸１１〜１１６と少なくとも約９０％の配列同一性を有
し、配列番号１の位置１１６（Ｃｙｓ−１１６）に対応する位置にシステイン（
Ｃｙｓ）を保持するアミノ酸配列を含み、その際各モノマーのＣｙｓ−１１６は
付加的外因性Ｃｙｓにジスルフィド結合している上記ＶＥＧＦダイマーを生成す
る方法であって、以下の工程：（ａ）アミノ末端（Ｎ−末端）でＭｅｔ（ＡＡ）_n配列だけ延長した配列番号
１のポリペプチドをコードする外来ＤＮＡ種を含む形質転換された細菌宿主細胞
を提供し、ここでＭｅｔはメチオニン残基を意味し、ｎは１−７、ＡＡは同一か
または異なるアミノ酸をあらわし、その際ＡＡアミノ酸の少なくとも１つ、また
は２つ以上のＡＡアミノ酸の組み合わせが細菌宿主細胞によって形成されたＶＥ
ＧＦポリペプチドの成熟Ｎ−末端のタンパク分解性分解を遅らせることができ、
このＤＮＡが作動可能な発現ベクターに存在する工程、（ｂ）上記細菌宿主細胞を、前記ＤＮＡの発現および前記ＶＥＧＦモノマー類
の合成に適した条件下で培養する工程、（ｃ）ＶＥＧＦダイマーを回収する工程を包含する方法に関する。

【００１６】再び好ましい実施形態において、ｎは１−５、好ましくは１−３、より好まし
くは１または２、最も好ましくは１であり、ＡＡはリジン（Ｌｙｓ）またはアル
ギニン（Ａｒｇ）残基、好ましくはリジン残基をあらわす。

【００１７】一般的観点において、本発明は、Ｍｅｔ（ＡＡ）_n配列だけＮ末端が延長した
ポリペプチドをコードするＤＮＡによって細菌性宿主細胞を形質転換するという
やり方で、その細菌性宿主細胞中で産生中のポリペプチドの、成熟アミノ末端（
Ｎ−末端）配列からの１個以上のアミノ酸の分解（例えば除去等）を阻止する方
法に関係する。この際Ｍｅｔはメチオニンで、ｎは１−７であり、ＡＡは同一ま
たは異なるアミノ酸であり、ＡＡアミノ酸の少なくとも一つ、またはＡＡアミノ
酸の２つ以上の組み合わせは細菌宿主細胞によるポリペプチドの成熟Ｎ−末端の
タンパク分解性分解を遅らせることができる。上述のように、ｎは好ましくは１
ないし５、より好ましくは１ないし３、さらにより好ましくは１または２、最も
好ましくは１であり、そしてＡＡは好ましくはリジン（Ｌｙｓ）またはアルギニ
ン（Ａｒｇ）残基、好ましくはＬｙｓ残基を示す。ポリペプチドは好ましくは１
００より長いアミノ酸であり、好ましくは少なくとも約１２０のアミノ酸を有す
る。特に好ましい実施形態において、ポリペプチドはネイティブのまたは改変体
ＶＥＧＦポリペプチドであり、より好ましくはネイティブのＶＥＧＦポリペプチ
ド、最も好ましくはｈＶＥＧＦ₁₂₁またはｈＥＧＦ₁₆₅ポリペプチドである。

【００１８】なお別の局面において、本発明は新脈管形成または血管リモデリングを誘発す
る方法、末梢血管疾患、冠動脈疾患、本態性高血圧、微小血管障害、および多発
性嚢胞腎の治療法、および本発明のＶＥＧＦダイマーまたは組成物の投与によっ
て血管内皮細胞層を修復する方法に関する。

【００１９】本発明の全ての面において、特に好ましい実施形態では、各ＶＥＧＦモノマー
は実質的に配列番号１のアミノ酸１ないし１２１からなるアミノ酸配列を有し、
その際アミノ酸位置７５−７７におけるグリコシル化付加部位が任意に除去され
、またはグリコシル化が起きないように変えられる。

【００２０】（発明の詳細な説明）本発明の実施は、他に明示されない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、
微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技術を用い、これらは当該分
野の技術の範囲内である。このような技術は次のような文献に十分説明されてい
る：「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａ
ｎｕａｌ」，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌ
ｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｇａｉｔ編，１９８４）；「Ａｎｉｍａ
ｌＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ」（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，１９８７）；「Ｍｅｔ
ｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉ
ｎｃ．）；「ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎ
ｏｌｏｇｙ」（ＷｅｉｒおよびＢｌａｃｋｗｅｌｌ編）；「ＧｅｎｅＴｒａｎ
ｓｆｅｒＶｅｃｔｏｒｓｆｏｒＭａｍｍａｌｉａｎＣｅｌｌｓ」（Ｍｉ
ｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ編，１９８７）；「ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏ
ｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ」（Ａｕｓｕｂｅｌら編，１
９８７）；「ＰＣＲ：ＴｈｅＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔ
ｉｏｎ」（Ｍｕｌｌｉｓら編，１９９４）；および「ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔ
ｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｃｏｌｉｇａｎら編，１９９１）
。

【００２１】（定義）本明細書に用いる用語「血管内皮増殖因子」または「ＶＥＧＦ」は、ヒトおよ
び哺乳動物種（例えば、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ま
たはネコなど）を含む任意の動物種に由来する、モノマーまたはダイマー形態の
ＶＥＧＦポリペプチド（「血管透過因子」または「ＶＰＦ」としても知られる）
の任意の天然に存在する（ネイティブな）形態、およびその機能的誘導体をいう
。「ネイティブなＶＥＧＦ」は、２本のポリペプチド鎖からなり、一般的にホモ
ダイマーを示し、一般的には「ネイティブなヒトＶＥＧＦダイマー」といわれる
。各モノマーは、１２１、１４５、１４８、１６５、１８３、１８９、および２
０６というアミノ酸残基長からなる７種類の公知のアイソフォームのうちの一つ
として生じる。本明細書では以後、これらのアイソフォームをそれぞれｈＶＥＧ
Ｆ₁₂₁、ｈＶＥＧＦ₁₄₅、ｈＶＥＧＦ₁₄₈、ｈＶＥＧＦ₁₆₅、ｈＶＥＧＦ₁₈₃、ｈＶ
ＥＧＦ₁₈₉、およびｈＶＥＧＦ₂₀₆（再度、モノマー形態およびホモダイマー形態
を含む）という。ヒトＶＥＧＦと同様、「ネイティブマウスＶＥＧＦ」、「ネイ
ティブラットＶＥＧＦ」および「ネイティブヒツジＶＥＧＦ」も、通常ホモダイ
マーとして生じる、１２０、１６４および１８８というアミノ酸長の数種のアイ
ソフォームにおいて存在することが知られている。加えて、「ネイティブウシＶ
ＥＧＦ」は少なくとも２種類のアイソフォーム（１２０アミノ酸長および１６４
アミノ酸長）において存在することが知られており、通常はホモダイマーとして
生じる。ｈＶＥＧＦ₁₂₁ダイマーを除いて、全てのネイティブなヒトＶＥＧＦダ
イマーは、塩基性の、ヘパリン結合分子であることが公知であるかまたは考えら
れている。ｈＶＥＧＦ₁₂₁ダイマーはヘパリンとは結合しない弱酸性タンパク質
である。これらのおよび類似のネイティブな形態は、既知であろうと本明細書中
で以後発見されたものであろうと全てが、天然から単離されたか、合成されたか
、組換えＤＮＡ技術の方法によって生産されたか、またはこれらのおよび他の技
術の任意の組合わせによって生産されたかどうかという、それらの調製形態によ
らず、「ネイティブなＶＥＧＦ」または「ネイティブな配列のＶＥＧＦ」の定義
に含まれる。用語「血管内皮増殖因子」すなわち「ＶＥＧＦ」は、モノマー、ホ
モダイマーおよびヘテロダイマーの形態のＶＥＧＦポリペプチドを含む。「ＶＥ
ＧＦ」の定義はまた、１１０アミノ酸長のヒトＶＥＧＦのタンパク分解によるフ
ラグメント種（ｈＶＥＧＦ₁₁₀）、およびマウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、
ヒツジ、イヌ、またはネコのような他の哺乳動物種におけるその相同体、ならび
にそれらの機能的誘導体を含む。さらに、用語「ＶＥＧＦ」は、一次アミノ酸構
造の一部が血小板由来増殖因子のＡ鎖サブユニットまたはＢ鎖サブユニットのど
ちらかの一部に対応し、そして一次アミノ酸構造の一部が天然または変異体の血
管内皮増殖因子の一部に対応するキメラのダイマータンパク質を包含する。特定
の実施形態において、ＶＥＧＦ₁₂₁のようなネイティブまたは変異体のＶＥＧＦ
分子の少なくとも一部を含む第二の鎖にジスルフィド結合した、血小板由来増殖
因子の少なくともＡ鎖サブユニットまたはＢ鎖サブユニットの少なくとも一部を
含む一つの鎖からなるキメラ分子が提供される。このようなダイマーのさらなる
詳細は、例えば米国特許第５，１９４，５９６号および同第５，２１９，７３９
号、ならびに欧州特許ＥＰ−Ｂ０４８４４０１号に提供されている。これらの開
示は本明細書中に参考として明らかに援用される。ｈＶＥＧＦ₁₂₁およびウシＶ
ＥＧＦ₁₂₀のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、例えば米国特許第５，１９４
，５９６号および同第５，２１９，７３９号、ならびにＥＰ−Ｂ０４８４４０１
号に開示されている。ｈＶＥＧＦ₁₄₅は、米国特許第６，０１３，７８０号およ
びＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／１００７１に記載されている；ｈＶＥＧＦ₁₆₅は、
米国特許第５，３３２，６７１号に記載されている；ｈＶＥＧＦ₁₈₉は、米国特
許第５，２４０，８４８号に記載されている；そしてｈＶＥＧＦ₂₀₆は、Ｈｏｕ
ｃｋらのＭｏｌ．Ｅｎｄｏ．、前出（１９９１）に記載されている。種々のヒト
ＶＥＧＦアイソフォームのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の開示について
はまた、Ｌｅｕｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：１３０６−１３０９（１９８
９）；Ｋｅｃｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：１３０９−１３１２（１９８９）
；Ｔｉｓｃｈｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１１９４７−１１９５
４（１９９１）；ＥＰ０３７０９８９；およびＰＣＴ公開ＷＯ９８／１００
７１を参照のこと。ＶＥＧＦの形態は、図２に模式的に示される。

【００２２】「ヒトＶＥＧＦ₁₂₁モノマー」、すなわち「ｈＶＥＧＦ₁₂₁モノマー」は、本明
細書では配列番号１のポリペプチド（ネイティブまたは野生型のｈＶＥＧＦ₁₂₁
モノマー）またはその機能的誘導体と定義される。ｈＶＥＧＦ₁₂₁の非ヒト相同
体のモノマー（「ＶＥＧＦ₁₂₁モノマー」または「ＶＥＧＦ₁₂₀モノマー」）は類
似の様式で定義される。

【００２３】「ヒトＶＥＧＦ₁₂₁ダイマー」、すなわち「ｈＶＥＧＦ₁₂₁ダイマー」は本明細
書では、本明細書中上記で定義した２つの同一のｈＶＥＧＦ₁₂₁モノマーのダイ
マー（「ホモダイマー」）、または本明細書中上記で定義されたｈＶＥＧＦ₁₂₁
モノマーと、少なくとも１つの局面において異なる別のサブユニットとの間に形
成されるダイマー（「ヘテロダイマー」）と定義される。例えば、ヘテロダイマ
ーｈＶＥＧＦ₁₂₁分子中にある２つのサブユニット（モノマー）はグリコシル化
があるかないかで異なってもよい。従って、ホモダイマーはそれらのサブユニッ
トが両方共グリコシル化されていなくてもよく、または両方共グリコシル化され
ていてもよく、他方、ヘテロダイマーでは一方のサブユニットがグリコシル化さ
れ得、他方のサブユニットがグリコシル化されていないかもしれない。同様に、
Ｃｙｓ−１１６残基の状態、またはヒトＶＥＧＦ₁₂₁の機能的誘導体もしくは非
ヒトＶＥＧＦ₁₂₁相同体における対応する残基の状態は、ヘテロダイマーの２本
のモノマー鎖において異なってもよい。従って、用語「ｈＶＥＧＦ₁₂₁ヘテロダ
イマー」は詳細には、アミノ酸配列が異なる２本のモノマーからなるダイマーだ
けでなく、それらのグリコシル化状態もしくはグリコシル化パターン、またはＣ
ｙｓ−１１６残基の状態が異なる２つのモノマーからなるダイマーをも含む。「
ｈＶＥＧＦ₁₂₁ダイマー」は詳細には、一次アミノ酸構造の一部が血小板由来増
殖因子のＡ鎖サブユニットまたはＢ鎖サブユニットのどちらかの一部に対応し、
そして一次アミノ酸構造の一部がＶＥＧＦ₁₂₁の一部に対応する、キメラのダイ
マータンパク質を包含する。特定の実施形態において、ｈＶＥＧＦ₁₂₁分子の少
なくとも一部を含む第２鎖にジスルフィド結合した血小板由来増殖因子のＡ鎖サ
ブユニットまたはＢ鎖サブユニットの一部を含む一本の鎖からなるキメラ分子が
提供される。このようなダイマーのさらなる詳細は、例えば米国特許第５，１９
４，５９６号および同第５，２１９，７３９号、ならびに欧州特許ＥＰ−Ｂ０
４８４４０１号に提供されている。ｈＶＥＧＦ₁₂₁の非ヒト相同体のダイマー
は類似の様式で定義される。

【００２４】用語「ヒトＶＥＧＦ₁₂₁」、「ｈＶＥＧＦ₁₂₁」、「ネイティブのヒトＶＥＧＦ ₁₂₁ 」および「ネイティブのｈＶＥＧＦ₁₂₁」は、他に言及がなければ、本明細書
中上記で定義されたような、ｈＶＥＧＦ₁₂₁モノマーおよびｈＶＥＧＦ₁₂₁ダイマ
ー（ホモダイマーおよびヘテロダイマーを含む）の両方を含む。

【００２５】本明細書中で使用する「ＶＥＧＦ₁₂₁」は、本明細書中上記に定義したネイテ
ィブのヒトＶＥＧＦ₁₂₁、他の非ヒト動物（例えば、非ヒト哺乳動物種）におけ
るその相同体、およびそれらの機能的誘導体をいう。ここでも、他に言及がなけ
れば、この用語は、ＶＥＧＦ₁₂₁モノマー類およびＶＥＧＦ₁₂₁ダイマー類の両方
を含む。

【００２６】ＶＥＧＦについて本明細書中で用いるアミノ酸配列番号付け系は、タンパク質
の成熟形態、すなわち翻訳後にプロセシングされた形態に基づく。従って、ヒト
タンパク質において１の番号がつけられる残基はアラニンである。アラニンは、
これらのタンパク質の単離された成熟形態の最初の残基である（Ｃｏｎｎｏｌｌ
ｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：２００１７−２００２４［１９８９］
）。

【００２７】タンパク質の「機能的誘導体」とは、基準の（例えば、ネイティブの）タンパ
ク質と共通の質的生物学的活性を有する化合物である。ＶＥＧＦ₁₂₁の機能的誘
導体は、天然ＶＥＧＦ₁₂₁の少なくとも一つの生物学的活性を保持し、ヘパリン
結合を欠き、少なくとも１つのＶＥＧＦモノマーにおいては天然ヒトＶＥＧＦ₁₂ ₁ 分子のアミノ酸１１６位に対応する位置にシステインを有する、モノマーまた
はダイマーのＶＥＧＦ分子である。さらに、ＶＥＧＦモノマーの「機能的誘導体
」としては、ダイマー構造に組み込まれて、機能的ダイマー（すなわち、ネイテ
ィブのＶＥＧＦ分子の少なくとも一つの生物学的活性を有するホモダイマーまた
はヘテロダイマー）を作製し得るモノマー誘導体が挙げられる。「機能的誘導体
」としては、任意の動物種（ヒトを含む）からのネイティブのポリペプチドのフ
ラグメント、およびネイティブの（ヒトおよび非ヒト）ポリペプチドの誘導体、
ならびにそれらのフラグメントが挙げられるがこれらに限定されない。

【００２８】本発明のＶＥＧＦ₁₂₁ダイマーと関連した用語「生物学的活性」および「活性
」には、内皮細胞増殖の任意のインビトロアッセイにおいて決定されるようなマ
イトジェン活性が含まれる。この活性は好ましくは、例えば以下の刊行物のいず
れかに記載されているようなヒト臍静脈内皮（ＨＵＶＥ）細胞ベースのアッセイ
において決定される：Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚら、ＰＮＡＳＵＳＡ８６
：７３１１−７３１５（１９８９）；ＦｅｒｒａｒａおよびＨｅｎｚｅｌ、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６１：８５１−８５
８（１９８９）；Ｃｏｎｎら、ＰＮＡＳＵＳＡ８７：１３２３−１３２７（
１９９０）；Ｓｏｋｅｒら、Ｃｅｌｌ、前出（１９９８）；Ｗａｌｔｅｎｂｅｒ
ｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２６９８８−２６９９５（１９９
４）；Ｓｉｅｍｅｉｓｔｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃ
ｏｍｍｕｎ．前出（１９９６）；Ｆｉｅｂｉｃｈら、前出；Ｃｏｈｅｎら、Ｇｒ
ｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｓ７：１３１−１３８（１９９３）。さらなる生物学
的活性は、血管形成および／または血管再造形に関する活性であり、この活性は
例えば、ラット角膜嚢血管形成アッセイ（Ｃｏｎｎｏｌｌｙら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．
Ｉｎｖｅｓｔ．８４：１４７０−１４７８（１９８９）に記載される）；内皮細
胞管形成アッセイ（例えば、Ｐｅｐｐｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ
．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８９：８２４−８３１（１９９２）、Ｇｏｔｏら、
Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６９：５０８−５１７（１９９３）またはＫｏｏｌｗｉ
ｊｋら、Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１３２：１１７７−１１８８（１９９６）に
記載される）；またはニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）血管形成アッセイ（例えば、
Ｐｌｏｕｅｕｔら、ＥＭＢＯＪ．８：３８０１−３８０６（１９８９）に記載
される）で試験され得る。他の好ましい生物学的活性としては、Ｍｉｌｅｓアッ
セイ（Ｃｏｎｎｏｌｌｙら、Ｊ．ＢｉｏｌＣｈｅｍ．前出［１９８９］）で決
定したときの血管透過性の増強；およびＹａｎｇら（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．
ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ２８４：１０３−１１
０（１９９８））に記載される降圧アッセイで決定したときの降圧活性が挙げら
れるがこれらに限定されない。

【００２９】「フラグメント」は、成熟したネイティブのヒトＶＥＧＦ₁₂₁または非ヒト動
物（例えば、非ヒト哺乳動物種）における相同体の配列内の領域を含む。

【００３０】用語「誘導体」は、ネイティブのポリペプチドのアミノ酸配列およびグリコシ
ル化改変体、フラグメントおよび共有結合の改変を定義するために用いられ、他
方、用語「改変体」は、この定義内のアミノ酸配列およびグリコシル化改変体を
いう。

【００３１】「アミノ酸配列改変体」は、Ｎ末端もしくはＣ末端で、または対応するネイテ
ィブの配列内のどこかで１個以上のアミノ酸が付加され、そして／または置換さ
れ、そして／または欠失され、そして／または挿入されており、しかも対応する
ネイティブのタンパク質の少なくとも一つの活性を保持するポリペプチド（ポリ
ペプチドのダイマーを含む）である。種々の実施形態において、「改変体」ポリ
ペプチドは通常、対応するネイティブな配列のポリペプチドのアミノ酸配列との
、少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも約８０％のアミ
ノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、さらに
より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、そして最も好ましく
は少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する。

【００３２】「配列同一性」とは、必要ならばギャップを導入して配列を整列させて、最大
パーセントの配列同一性を達成した後の、ネイティブのポリペプチド配列におけ
る対応する位置のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の百分
率（その際、保存的置換は配列同一性の一部とはみなさない）と定義される。配
列同一性の％値は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，「ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴａｎｄ
ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａｎｅｗｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅ
ｉｎｄａｔａｂａｓｅｐｒｏｇｒａｍｓ」、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．、２５：３３８９−３４０２（１９９７）に定義される通りのＮＣＢＩ
ＢＬＡＳＴ２．０ソフトウエアによって得られる。ミスマッチに対するペナル
ティーを−１に設定する場合を除いて、上記パラメーターは、デフォールト値に
設定される。

【００３３】本発明の状況における用語「外因性システイン」または「さらなるシステイン
」または「さらなる外因性システイン」は、配列番号１のｈＶＥＧＦ₁₂₁、その
機能的誘導体、または他の動物（例えば、非ヒト哺乳動物種）におけるその相同
体をコードする核酸配列によっては直接コードされないシステインをいうために
用いられる。少なくとも１つのＶＥＧＦモノマーにおいて、ネイティブのヒトＶ
ＥＧＦ₁₂₁分子の１１６位に対応する位置のシステインが外因性システインにジ
スルフィド結合している構造はまた、「混合ジスルフィド」構造といわれる。い
くつかの例では、外因性システインは、グルタチオン分子のようなペプチドの一
部でもよい。

【００３４】天然ヒトＶＥＧＦ₁₂₁分子の１１６位に対応する位置のシステインに関連した
用語「不対（ｕｎｐａｉｒｅｄ）」は。遊離スルフヒドリル基を含むシステイン
を示す。

【００３５】用語「ベクター」は、本明細書では最も広い意味で用いられ、そしてＲＮＡ、
ＤＮＡ、アデノウイルスコートに封入されたＤＮＡ、他のウイルスまたはウイル
ス様形態（単純ヘルペス、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ））にパッケージ
ングされたＤＮＡ、リポソームに封入されたＤＮＡ、およびポリリジンと複合体
化したＤＮＡ、合成ポリカチオン分子と複合体化したＤＮＡ、トランスフェリン
と結合体化したＤＮＡ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような化合物と複
合体形成し、その分子を免疫学的に「マスキング」し、および／または半減期を
延長するＤＮＡ、または非ウイルス性タンパク質に結合体化したＤＮＡを含むが
これらに限定されない。好ましくは、ベクターはＤＮＡベクターである。

【００３６】本明細書中で用いられる場合、「ＤＮＡ」は、塩基Ａ、Ｔ、ＣおよびＧだけで
なく、これらのアナログまたは改変形態（例えば、メチル化ヌクレオチド）、ヌ
クレオチド間改変（例えば、非荷電結合およびチオエート）、糖アナログの使用
、ならびに改変されたかおよび／または選択的な骨格構造（例えば、ポリアミド
）をも含む。

【００３７】「宿主細胞」は、本発明の任意のベクターのレシピエントとなり得るかまたは
レシピエントとなった個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞としては、
単一宿主細胞の子孫が挙げられ、その子孫は、自然の、偶発的または意図的な変
異および／または変更に起因して、元々の親細胞に（形態がまたは総ＤＮＡ相補
体が）必ずしも完全に同一というわけではないかもしれない。宿主細胞としては
、ＶＥＧＦをコードするポリヌクレオチドを含むベクターをインビボでトランス
フェクトまたは感染させた細胞が挙げられる。

【００３８】「個体」とは、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。
哺乳動物としては、飼育動物、競技動物およびペットが挙げられるが、これらに
制限されない。

【００３９】「有効量」とは、有益なまたは所望の臨床的結果をもたらすのに十分な量であ
る。有効量は、１回以上の投与で投与され得る。本発明の目的では、ＶＥＧＦダ
イマーまたは組成物の有効量は、標的化された疾患状態の進行を軽減し、改善さ
せ、安定化し、逆転させ、緩徐にし、または遅延させるのに十分な量である。

【００４０】処置目的での「哺乳動物」とは、ヒト、家畜および飼育動物、ならびに動物園
の動物、競技動物またはペット動物（例えば、ウマ、ヒツジ、ウシ、ブタ、イヌ
、ネコ）を含めて、哺乳動物として分類される任意の動物をいう。好ましくは、
哺乳動物はヒトである。

【００４１】本明細書中で用いる場合、「キャリア」としては、使用される投薬量および濃
度で細胞または哺乳動物に曝露した際にそれらに対して非中毒性である、薬学的
に受容可能なキャリア、賦形剤、または安定剤が挙げられる。しばしば、生理学
的に受容可能なキャリアは、ｐＨ緩衝化水溶液である。生理学的に受容可能なキ
ャリアの例としては、以下が挙げられる：緩衝剤（ホスフェート、シトレートお
よび他の有機酸）；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満
の）ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免
疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸
（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；
単糖、二糖、および他の炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、マンノー
ス、トレハロース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、エチレ
ンジアミン四酢酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｏｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ
ａｃｉｄ）（ＥＤＴＡ））；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビ
トール）；塩形成対イオン(例えば、ナトリウム)；ならびに／または非イオン性
界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標））が挙げられる。

【００４２】「血管形成」は、既存の血管系からの新しい毛細血管の増殖の促進と定義され
、一方、「治療的血管形成」は、例えば虚血領域への血液供給を増やすための、
新しい血管の増殖および／または既存の血管の再造形の促進と定義される。

【００４３】「末梢血管疾患」としても知られる「末梢動脈疾患」という用語は、四肢に供
給する血管の狭窄または閉塞と定義される。末梢動脈疾患は、アテローム性動脈
硬化症の一般的症状発現であり、下肢の血管を冒すことが最も多い。主要な二つ
の型の末梢動脈疾患は、間欠性跛行および重症下肢虚血である：間欠性跛行では
、痙攣性の痛みの急速な発達を伴わずに運動を持続できないほど１以上の四肢へ
の血液供給が減少しており、重症下肢虚血では、たとえ安静にしている四肢であ
っても代謝的必要性を完全に維持するには血液供給が最早十分でない。

【００４４】「冠状動脈疾患」は、心臓の筋肉組織に血液を供給する１本以上の動脈の狭窄
または閉塞と定義される。この疾患はまた、アテローム性動脈硬化症の一般的症
状発現である。

【００４５】用語「微小血管血管障害」は、より小さい血管に対する急性損傷およびこの損
傷血管が存在する組織にその後に起きる機能不全を記載するために用いられる。
微小血管血管障害は、種々の器官（例えば、腎臓、心臓および肺）の種々の疾患
の病理に共通の特徴である。損傷はしばしば、内皮細胞の損傷または死、および
凝固産物または血栓の存在と関連する。損傷要因は、例えばトキシン、免疫因子
、感染性因子、代謝的もしくは生理学的ストレス、または体液性もしくは細胞性
免疫系の構成要素であり得るか、またはまだ同定されていないかもしれない。こ
のような疾患の一つのサブグループは血栓性微小血管症（ＴＭＡ）の存在によっ
て一本化され、臨床的に非免疫性溶血性貧血、血小板減少症、および／または腎
不全によって特徴づけられる。ＴＭＡの最も一般的な原因は、溶血性尿毒症症候
群（ＨＵＳ）である。溶血性尿毒症症候群は、小児期に特に頻繁である疾患であ
り、ここでは、急性腎不全の最も一般的な原因である。これらの場合の大多数は
、ベロトキシン産生株であるＥ．ｃｏｌｉＯ１５７による腸内感染と関係があ
る。何人かのＨＵＳ患者（特に、成人）では、腎臓の関与の相対的欠如を有し、
そして時々、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）として分類されることがある
。しかしＴＭＡはまた、妊娠の合併症（子癇）として、腎臓への照射後の悪性高
血圧と共に、移植後に（しばしば、シクロスポリン処置またはＦＫ５０６処置に
対して二次的に）、癌化学療法（特にマイトマイシンＣ）と共に、特定の感染（
例えば、ＳｈｉｇｅｌｌａまたはＨＩＶ）と共に、全身性狼瘡もしくは抗リン脂
質症候群と関連して生じ得るか、または特発性もしくは家族性であり得る。実験
データは、内皮細胞損傷がＨＵＳ／ＴＴＰの病因の共通の特徴であることを示唆
している。

【００４６】「慢性」投与とは、薬剤を急性の形態とは対照的に連続形態で投与して、その
結果、最初の治療効果（活性）を長期間維持することをいう。

【００４７】「間欠的」投与は、中断せずに連続的に行なうことなく、むしろ周期的な性質
で行われる処置である。

【００４８】用語「本質的に含まない」は、所望しない成分（組成物中にはその成分が本質
的に含まれない）が組成物の約２％未満、好ましくは約１％未満、より好ましく
は約０．５％未満、さらにより好ましくは約０．１％未満、最も好ましくは約０
．０５％未満に相当することを意味するために用いられる。

【００４９】用語「成熟Ｎ末端のタンパク分解的分解を遅延させ得る」および文法的にこれ
と等価な用語は、ポリペプチド（例えば、ＶＥＧＦポリペプチド）についての一
次翻訳産物（前駆体）において、このポリペプチドの開始（Ｎ末端）メチオニン
（Ｍｅｔ）と成熟Ｎ末端との間に付加したときに、組換え宿主細胞においてプロ
テアーゼによる所望の成熟ポリペプチドのアミノ末端短縮化を遅延させる、アミ
ノ酸の能力を記載するために用いる。この延長はポリペプチド産物のアミノ末端
の完全な成熟を遅らせまたはブロックし、その結果、上記ポリペプチドおよび／
またはその前駆体形態をその宿主細胞から取り出して、この延長がなければ成熟
ポリペプチドのＮ末端に相当する残基を時間が経つにつれて切断する、宿主細胞
に存在するプロテアーゼから精製し得る。この延長部は次のように選択される；
発酵中に開始Ｍｅｔが産物の一部から除去され、それによって延長部内の残りの
アミノ酸をタンパク分解的切断に曝露するとはいえ、前駆体の得られるＮ末端短
縮物は、このポリペプチドのインタクトな成熟Ｎ末端を残すように、選択される
。次いで、開始Ｍｅｔまたは延長部の残りを含む付加されたＮ末端延長部（Ｍｅ
ｔ−ＡＡ_n）は、制御された精製酵素反応においてＶＥＧＦタンパク質の回収物
の一部として取り出し得る。

【００５０】（好ましい実施形態の詳細な説明）ネイティブのヒトＶＥＧＦ₁₂₁（ｈＶＥＧＦ₁₂₁）は、ネイティブのヒトＶＥＧ
Ｆタンパク質の他のアイソフォームとは多くの重要な点で異なるＶＥＧＦアイソ
フォームである。ＶＥＧＦの全てのネイティブのヒトアイソフォームは、本明細
書中に定義されるように、エキソン２から５までによってコードされる残基１〜
１１４からなる共通のアミノ末端ドメインを有する。しかしｈＶＥＧＦ₁₂₁は、
それに加えてリジン残基（エキソン５の末端にあるスプライスジャンクションに
またがるコドンによってコードされる）、次いでカルボキシ末端エキソン８によ
ってコードされるほんの６個までのアミノ酸［ＣＤＫＰＲＲ］を含み、従って、
エキソン６および７によってコードされるヘパリン結合ドメインが欠けている。
従って、ｈＶＥＧＦ₁₂₁はヘパリンに結合しないことが知られている唯一のヒト
ＶＥＧＦアイソフォームである。さらに、ｈＶＥＧＦ₁₂₁ダイマーおよびｈＶＥ
ＧＦ₁₆₅ダイマーが両方ともレセプターＫＤＲ／Ｆｌｋ−１およびＦｌｔ−１に
結合するとはいえ、ｈＶＥＧＦ₁₆₅ダイマーはさらに、より最近発見されたレセ
プター（ＶＥＧＦ₁₆₅Ｒ）にも結合する（Ｓｏｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．前出［１９９６］）。ｈＶＥＧＦ₁₆₅の後者レセプターへの結合は、ｈＶＥ
ＧＦ₁₂₁には存在しないエキソン７によってコードされるドメインによって媒介
されるので、ｈＶＥＧＦ₁₂₁ダイマーはＶＥＧＦ₁₆₅Ｒには結合しない。ｈＶＥＧ
Ｆ₁₂₁とそれより長いＶＥＧＦアイソフォームとの間のさらなる顕著な差は、こ
れらの分子のジスルフィド構造にある。全てのネイティブのＶＥＧＦ分子の生物
学的に活性な形態はジスルフィド結合したダイマー、主としてホモダイマーであ
る。ネイティブのｈＶＥＧＦの卓越して大きい形態であるｈＶＥＧＦ₁₆₅は、各
モノマーに合計１６個のシステインを有する；このアイソフォームのダイマーに
おいて、これらシステインの２個は２つの鎖間ジスルフィド結合に関係し、残り
のシステインは鎖内ジスルフィド結合に関係している。ｈＶＥＧＦ₁₂₁ホモダイ
マーの各モノマー鎖は合計９個のシステインを有し、そのうち６個はモノマー構
造を安定化する３個の鎖内ジスルフィドの形成に関係し、２個はダイマー構造を
安定化する２個の鎖間ジスルフィド結合に関係しており、一方、１個のシステイ
ン（Ｃｙｓ−１１６）は不対であると記載されている。

【００５１】本発明者らは、Ｃｙｓ−１１６の状態がｈＶＥＧＦ₁₂₁分子の安定性に顕著な
影響を有することを見いだした。Ｃｙｓ−１１６は図３に示すように外因性「Ｒ
」部分にジスルフィド結合し（Ｒはシステインまたはシステイン含有ペプチドで
ある）「混合ジスルフィド」構造を形成し得、または鎖間ジスルフィド結合に関
与し得（図４）、「不対」のままとどまり得る（図５）。モノマーの少なくとも
一つ（好ましくは両方）のＣｙｓ−１１６に「混合ジスルフィド」を含む形の、
ｈＶＥＧＦ₁₂₁ダイマーを産生することによって、ｈＶＥＧＦ₁₂₁ダイマーの安定
性は、１１６位置のシステインが「不対」である形のダイマーに比較して、その
生物学的活性を損なうことなく顕著に高めることが出来ることを本発明らは、確
認した。これは、１１６の位置の不対システインの存在が生物学的意味を有し得
るという以前の示唆を考えると非常に驚くべきことである（ケックら、Ａｒｃｈ
．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．同上［１９９７］）。よって本発明の目的
は、組換えＤＮＡ法によって、モノマーの１１６位置の少なくとも一つの、より
好ましくは両方のシステインが外因性システインにジスルフィド結合しているｈ
ＶＥＧＦ₁₂₁ダイマーを産生することである。

【００５２】本発明者らは、さらに、組換えｈＶＥＧＦ₁₂₁ダイマーの安定性および生物学
的活性がｈＶＥＧＦ₁₂₁分子のアミノおよび／またはカルボキシ末端におけるア
ミノ酸欠失、置換または挿入によって損なわれないことを見いだした。

【００５３】特に、実施例に説明する手順に実質的にしたがう哺乳動物細胞におけるヒトＶ
ＥＧＦ₁₂₁の組換え生産によって、ネイティブのヒトＶＥＧＦ₁₂₁分子のカルボキ
シ−および／またはアミノ末端において１個以上のアミノ酸が欠失した改変体を
含むＶＥＧＦ種の混合物が得られることを本発明らは、見いだした。例えば、チ
ャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に発現させると、正しいアミノ末端を
有するが野生型ヒトＶＥＧＦ₁₂₁の最後のアミノ酸が欠けている１２０アミノ酸
の主要種と、１０までのＮ末端アミノ酸が欠けている種々の短縮変異体を含む若
干のマイナー種との混合物、および１２１アミノ酸種が得られるのが普通である
。一般的には、１２０アミノ酸長さのＶＥＧＦ種は、最終産物の少なくとも約６
０％、好ましくは少なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも約７０％、さ
らにより好ましくは少なくとも約７５％、さらにより好ましくは少なくとも約８
０％、さらにより好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約
９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％を構成する。哺乳動物細胞に
おける発現は、各モノマーにおけるＣｙｓ−１１６が主としてジスルフィド結合
によって外因性システインに結合したダイマーを産生するように行われる。生成
したダイマーのより小さいフラクションでは、２本のモノマーにおけるシステイ
ン−１１６が鎖間ジスルフィド結合によって結合する。特別の実施形態において
、この発現はグルタチオンの存在のもとで行われる。その結果、ｈＶＥＧＦ₁₂₁
ダイマーのモノマーサブユニットの位置１１６の一つまたは両方のシステインが
グルタチオン（γＧｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ）分子にジスルフィド結合することが
できる。グルタチオンの他にも、その他のメルカプト含有化合物がＣｙｓ−１１
６にジスルフィド結合し得る。このような化合物には、非制限的に、シスタミン
および補酵素Ａがある。カルボキシおよびアミノ末端短縮は分子の生物学的活性
に何ら悪影響をもたないと考えられる。

【００５４】本発明者らは、さらに、実施例に説明したものと類似の手順による、酵母にお
けるｈＶＥＧＦ₁₂₁の組換え生産も生成物の混合物を産生することを見いだした
。例えばＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発
現では、全長ネイティブ配列に比較して４アミノ末端および１カルボキシ末端残
基だけ短縮した種が主要コンポーネントとして得られる。よって、Ｐ．ｐａｓｔ
ｏｒｉｓにおける主たる生成物はネイティブの全長ｈＶＥＧＦ₁₂₁分子のアミノ
酸５−１２０からなる。残基６、７、８、１１、１２および１８で開始する種も
、少量（０．１−０．６％）が時々検出される。この生成物は、２本のＶＥＧＦ
モノマーのアミノ酸位置１１６のシステインが外因性システイン（ペプチド（例
えば、グルタチオン）の一部として存在する）に結合するか、または第三の鎖間
ジスルフィド結合の形成に関与しているＶＥＧＦ種の混合物でもある。その上、
実施例に記載のように、（１）位置１１６のシステイン類を選択的に還元するこ
とによって、そして（２）生成物を遊離システイン、シスチン、またはＣｙｓ含
有ペプチドと反応させることによって、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて生成する
ＶＥＧＦ種の混合物を、圧倒的に主要な型が各モノマーサブユニットの位置１１
６に混合ジスルフィドを含んでいるという遥かに単純な混合物に変換することが
できる。

【００５５】本発明者らは、本質的に実施例に記載されるＥ．ｃｏｌｉにおけるｈＶＥＧＦ ₁₂₁ の組換え生産が、主要コンポーネントとして全長型を含む生成物混合物を与
えることも見いだした。成熟全長型が最終産物の少なくとも約８５％、好ましく
は少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、さらにより好まし
くは少なくとも約９８％を構成するのが普通である。この生成物はＮ−末端に外
因性アミノ酸を有する若干の（一般的には約１−２％）比較的長いＶＥＧＦ種、
および／または、４個までの、例えば１または４個の、Ｎ−末端アミノ酸を欠失
した若干の（一般的には約１−３％）比較的短い型も含むことができる。Ｅ．ｃ
ｏｌｉ由来ダイマー生成物はアミノ酸位置１１６に「混合ジスルフィド」構造を
有するのが一般的だが、より小さいパーセントの生成物では、２つのシステイン
−１１６が結合して第三の鎖間ジスルフィド結合を形成する。その製法は、位置
１１６の遊離（不対）スルフヒドリルの存在を最小にし、少なくとも約９０％の
混合ジスルフィドを生成するように好ましくは設計される。その際各モノマーの
Ｃｙｓ−１１６は外因性システイン（それはペプチド分子（例えば、グルタチオ
ン）の一部であってもよい）にジスルフィド結合する。

【００５６】代表的には、所望ＶＥＧＦ₁₂₁ダイマーのモノマー鎖をコードするｃＤＮＡを
複製可能の発現ベクターにクローニングおよび発現のために挿入される。適切な
ベクター類は組換えＤＮＡ法の標準技術によって作製され、例えば上記の教科書
に列挙されている。単離されたプラスミドおよびＤＮＡフラグメントを切断し、
仕立て（Ｔａｉｌｏｒｅｄ）、特定の順序で連結して所望ベクターを作製する。
連結後、発現すべき遺伝子を含むベクターを適切な宿主細胞に形質転換する。

【００５７】前記のように、本発明のＶＥＧＦ₁₂₁の生産のために使用する宿主細胞は異種
タンパク質の発現のために知られているいかなる真核−または原核生物宿主細胞
でもよい。例えば真核微生物（酵母）、または多細胞生物から分離した細胞（哺
乳動物細胞培養物、植物細胞、および昆虫細胞培養物）、原核宿主では細菌（例
えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）等である。

【００５８】適切な酵母宿主にはＳａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（一般
的パン焼き用の酵母）がある。これは下等真核宿主のなかでは最も一般的に用い
られる。しかしＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓを含む多くのその他の属、種お
よび株も本明細書中で利用でき、有用である。本発明のＶＥＧＦ₁₂₁ダイマーの
Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓにおける発現は、以下の実施例に詳細に説明さ
れる。ＶＥＧＦ発現に適したその他の酵母類には、非制限的に、Ｋｌｕｙｖｅｒ
ｏｍｙｃｅｓ宿主（米国特許第４，９４３，５２９号）、例えばＫｌｕｙｖｅｒ
ｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ；Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍ
ｂｅ（ビーチ（Ｂｅａｃｈ）およびナース（Ｎｕｒｓｅ）、Ｎａｔｕｒｅ２９
０：１４０（１９８１）；Ａｓｐｒｕｇｉｌｌｕｓ宿主、例えばＡ．ｎｉｇｅｒ
（ケリー（Ｋｅｌｌｙ）およびハイネス（Ｈｙｎｅｓ）、ＥＭＢＯＪ．４；４
７５−４７９（１９８５））およびＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ（バランス（Ｂａｌｌ
ａｎｃｅ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１１
２：２８４−２８９（１９８３））、およびＨａｎｓｅｎｕｌａ宿主、例えばＨ
ａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａが挙げられる。

【００５９】本発明のＶＥＧＦ₁₂₁ダイマーを産生するためにメチロトローフィック酵母を
用いるのが好ましい。適切なメチロトローフィック酵母には、非制限的に、Ｐｉ
ｃｈｉａ属およびＨａｎｓｅｎｕｌａ属からなる群から選択される、メタノール
で増殖できる酵母がある。この酵母群の典型例である特殊な種のリストは、例え
ば、アンソニー（Ｃ．Ａｎｔｈｏｎｙ）の「メチロトローフの生化学」２６９ペ
ージ（１９８２）に見いだすことができる。目下のところ、栄養要求性Ｐｉｃｈ
ｉａｐａｓｔｏｒｉｓＧＳ１１５（ＮＲＲＬＹ−１５８５１）；米国特許
第４，８１８，７００号に開示されているＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＧ
Ｓ１９０（ＮＲＲＬＹ−１８０１４）；および米国特許第４，８１２，４０５
号に開示されているＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＰＰＦ１（ＮＲＲＬＹ
−１８０１７）のような、Ｐｉｃｈｉａ属のメチロトロフィック酵母が好ましい
。栄養要求性Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ株も本発明の実施には好都合であ
り、ＶＥＧＦ₁₂₁発現ベクターを含む形質転換した子孫の選択を容易にする。野
生型Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ株（ＮＲＲＬＹ−１１４３０およびＮＲ
ＲＬＹ−１１４３１等）は、適切な形質転換マーカー遺伝子を選択するならば
（例えばＳＵＣ２を使用してＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓをスクロースで増
殖し得る株に形質転換する等）、またはＧ４１８に対する耐性のような、抗生物
質耐性マーカーを使用するならば、等しく上首尾に用いられ得る。Ｐｉｃｈｉａ
ｐａｓｔｏｒｉｓの線状プラスミドは、例えば米国特許第５，６６５，６００
号に開示されている。

【００６０】酵母ベクターに用いられる適切なプロモーターには、３−ホスホグリセレート
キナーゼのためのプロモーター類（ヒッツェマン（Ｈｉｔｚｅｍａｎ）ら、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３（１９８０））；およびその他の糖分解
酵素（ヘス（Ｈｅｓｓ）ら、Ｊ．Ａｄｖ．ＥｎｚｙｍｅＲｅｓ．７：１４９（
１９６８）；ホランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｙｓｔｒｙ１７
：４９００（１９７８））、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン
酸脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルク
トキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートム
ターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコー
スイソメラーゼおよびグルコキナーゼのプロモーター類がある。適切な発現プ
ラスミドの作製において、これらの遺伝子と関係する終止配列をまた、発現ベク
ターの発現が所望される配列の３’に連結し、ｍＲＮＡのアデニル化および終結
がもたらされる。増殖条件によって調節される転写の付加的利点を有するその他
のプロモーターは、アルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１、Ｐｉｃｈｉａにおけ
る発現のために特に好ましい）、アルコール脱水素酵素２、イソチトクロームＣ
、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解性酵素、前記のグリセルアルデ
ヒド−３−リン酸脱水素酵素、およびマルトースおよびガラクトース利用に応答
する酵素類のためのプロモーター領域である。酵母適合性プロモーターおよび終
止配列を含むプラスミドベクターは複製開始点があってもなくても、適する。酵
母発現系は例えばクローンテック・ラボラトリーズ社（パロアルト、カリフォル
ニア、例：Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのためのベクターのｐＹＥＸファミリー）
、インビトロゲン（カールスバート、カリフォルニア、例：ｐＰＩＣＺシリーズ
ＥａｓｙＳｅｌｅｃｔＰｉｃｈｉａ発現キット）およびストラタジーン（
ＬａＪｏｌｌａ、カリフォルニア、例：Ｓ．ＰｏｍｂｅのためのＥＳＰ（商標
）酵母タンパク質発現および精製システムおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの
ためのｐＥＳＣベクター）から商業的に入手できる。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにお
けるｈＶＥＧＦ₁₂₁Ｎ７５０の産生は下記の実施例に詳細に記載される。野生型
ｈＶＥＧＦ₁₂₁およびその他の改変体も同様にして発現することができる。

【００６１】多細胞生物に由来する細胞培養物も本発明を実施するための宿主として使用で
きる。無脊椎動物および脊椎動物細胞培養物両方とも使用できるが、脊椎動物細
胞培養物、特に哺乳動物細胞が好ましい。適切な細胞株の例はＳＶ４０（ＣＯＳ
−７、ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）によって形質転換されたサル腎臓細胞株Ｃ
Ｖ１；ヒト胚腎臓細胞株２９３Ｓ（グラハムら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｔｒｏｌ．３
６巻：５９ページ［１９７７］）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣ
ＣＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ウルラウプ
（Ｕｒｌａｕｂ）およびチャシン（Ｃｈａｓｉｎ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４２１６［１９８０］）；サル腎臓細胞（ＣＶ１
−７６、ＡＴＣＣＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル（ＶＥＲＯ−７０、Ａ
ＴＣＣＣＲＬ−１５８７）；ヒト頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣＣＣＬ２
）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ３４）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８
、ＡＴＣＣＣＣＬ７５）；およびヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５
）等である。本発明のＶＥＧＦ₁₂₁ダイマーのＣＨＯ細胞における発現が実施例
に詳細に説明されている。

【００６２】哺乳動物発現ベクターに用いる適切なプロモーター類はウィルス性のものが多
い。これらのウィルスプロモーター類は一般にサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）
、ポリオーマウィルス、アデノウィルス２、およびシミアンウィルス４０（ＳＶ
４０）から誘導される。ＳＶ４０ウィルスは初期および後期プロモーターと呼ば
れる２つのプロモーターを含む。それらは両方ともウィルスから一つのＤＮＡフ
ラグメント（これもウィルス複製開始点を含む）として容易に得られる（ファイ
アース（Ｆｉｅｒｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、２７３：１１３［１９７８］）。より
小さいまたはより大きいＳＶ４０ＤＮＡフラグメントもまた、それらがＨｉｎ
ｄＩＩＩ部位からウィルス複製開始点に位置するＢｇｌＩ部位の方に向かって延
びる約２５０−ｂｐ配列を含む場合、使用できる。複製開始点はＳＶ４０または
その他のウィルス等の外因性供給源から得られ得、クローニングベクターに挿入
され得る。あるいは、宿主細胞染色体メカニズムが複製開始点を提供することも
可能である。外来遺伝子を含むベクターがこの宿主細胞染色体に統合されるなら
ば、後者で十分であることが多い。

【００６３】原核生物細胞も本発明のＶＥＧＦ₁₂₁ダイマーを産生する宿主細胞として使用
できる。適切なＥ．ｃｏｌｉ宿主株にはＢＬ２１；ＡＤ４９４（ＤＥ３）；ＥＢ
１０５；およびＣＢ（Ｅ．ｃｏｌｉＢ、ＡＴＣＣ２３８４８）およびそれらの
誘導体類；Ｋ１２株２１４（ＡＴＣＣ３１，４４６）；Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ
２７，３２５）；Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）；ＨＢ１０１（ＡＴ
ＣＣ３３，６９４）；ＪＭ１０１（ＡＴＣＣ３３，８７６）；ＮＭ５２２（
ＡＴＣＣ４７，０００）；ＮＭ５３８（ＡＴＣＣ３５，６３８）；ＮＭ５３
９（ＡＴＣＣ３５，６３９）等がある。原核生物細胞のその他の多くの種およ
び属も使用できる。Ｅ．ｃｏｌｉのような原核生物は非グリコシル化ＶＥＧＦを
産生する。

【００６４】原核宿主細胞の形質転換に用いられるベクター類は、複製部位、形質転換され
た細胞において表現型選択を可能にするマーカー遺伝子、宿主細胞に適合する一
つ以上のプロモーター、および外来ＤＮＡの挿入のための幾つかの制限部位を含
むポリリンカー領域を有するのが普通である。Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換のために
一般的に用いるプラスミドには、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵ
Ｃ１１８、ｐＵＣ１１９、およびＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＭ１３があり、これらは
全て商業的に供給されており、サムブルックら（同上）の１．１２−１．２０章
に記載されている。原核生物の形質転換のためのベクターに一般的に用いられる
プロモーターはＴ７プロモーター（例えば米国特許第４，９５２，４９６号およ
び第５，６９３，４８９号（スタディール（Ｓｔｕｄｉｅｒ）ら）を参照のこと
）；トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター（ゲーデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）ら、
Ｎａｔｕｒｅ２８１：５４４［１９７９］）；アルカリ性ホスファターゼプロ
モーター（ｐｈｏＡ）；β−ラクタマーゼおよびラクトース（ｌａｃ）プロモー
ター；およびバクテリオファージλｐ_Lプロモーター系である。

【００６５】Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、ＶＥＧＦ₁₂₁モノマーは一般的には封入体の形で蓄積
し、可溶化、リフォールド、二量体化および精製する必要がある。Ｅ．ｃｏｌｉ
からＶＥＧＦイソ型を回収しリフォールディングする方法は当業者には公知であ
る。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉで組換え発現後の、特定のＶＥＧＦイソ型のリフォー
ルディングはクリスチンガー（Ｃｈｒｉｓｔｉｎｇｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｓｔｒ
ｕｃ．Ｆｕｎｃ．Ｇｅｎｅｔ．同上（１９９６）；カイトら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２７１：３１５４−３１６２（１９９６）；シーマイスター（Ｓｉｅｍ
ｅｉｓｔｅｒ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．
２２２：２４９−２５５（１９９６）；およびＰＣＴ公開ＷＯ９６／０６６４１
に記載されている。本発明の特に好ましい実施形態において、リフォールディン
グはリフォールディング緩衝液中でシステインおよびシスチンの同時存在のもと
で行われる。システインおよびシスチンの量および相互割合を調節することによ
って、ＶＥＧＦダイマーの所望ミックスを生成することができる。後者の実施形
態は下記の実施例に詳細に説明されている。好ましい実施形態において、リフォ
ールディング段階に用いられる遊離システインを、ＶＥＧＦポリペプチドに存在
するシステインの約４倍から約４０倍まで（モルで）過剰に加える。より好まし
くは遊離システインをＶＥＧＦポリペプチドに存在するシステインの約４倍ない
し約２０倍、さらによく好ましくは約４倍ないし約１０倍、最も好ましくは約１
０倍モル過剰に用いる。システイン対シスチンのモル比は概して約２：１と２０
：１の間、好ましくは約２：１と１０：１との間、より好ましくは約２：１と５
：１との間、最も好ましくは約４：１と５：１との間である。

【００６６】原核生物（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、一次翻訳生成物からＮ−末端（開始）メチオニ
ン（Ｍｅｔ）を除去することが知られている。その結果、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞
に存在するプロテアーゼ（類）（アミノペプチダーゼ）が成熟ＶＥＧＦタンパク
質のＮ−末端から複数の残基を切り離すかも知れない。これを避けるために、好
ましい実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて開始ＭｅｔとＶＥＧＦポリペプチド
の成熟Ｎ末端との間のＮ−末端延長部をもったＶＥＧＦを発現させる。この延長
部は１−７の同一または異なるアミノ酸を含み、その少なくとも一つは成熟Ｎ末
端のタンパク分解的分解を遅らすことができる。特に好ましい実施形態において
、発酵中、この延長部は開始Ｍｅｔを完全無傷に保つ。その他の実施形態におい
て、Ｍｅｔおよび任意にＮ末端延長部の一部は発酵プロセス中に除去されるが、
延長部の少なくとも一部、したがって成熟Ｎ−末端は完全無傷のままである。Ｅ
．ｃｏｌｉ宿主細胞からＶＥＧＦを回収した後、例えばアミノペプチダーゼ処理
によってこの延長部は除去できる：アミノペプチダーゼはＶＥＧＦ分子のＮ−末
端の切断を阻止する特異性を有する。Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現中にその他のタ
ンパク質の成熟Ｎ−末端の保存が問題である場合は、実質的にこれと同じアプロ
ーチを適用することができる。

【００６７】多くの真核タンパク質（ＶＥＧＦを含む）は一次翻訳生成物の一部として内因
性シグナル配列を含む。この配列は、小胞体およびゴルジ体を経て細胞から運び
出されるタンパク質を標的とする。このシグナル配列は一般的にはこのタンパク
質のアミノ末端に位置し、約１３から約３６アミノ酸の範囲の長さである。実際
の配列はタンパク質の間で変動するが、全ての公知の真核シグナル配列は少なく
とも一つのプラスに帯電した残基と、シグナル配列の中心近くに高度に疎水性の
１０−１５アミノ酸の広がり（普通はアミノ酸：ロイシン、イソロイシン、バリ
ンおよびフェニルアラニンに富む）を含む。このシグナル配列はこのタンパク質
の分泌型には存在しないのが普通である、なぜならばそれはこのタンパク質が小
胞体に移動する最中に小胞体上にあるシグナルペプチドによって切断されるから
である。まだ付着しているシグナル配列を有するタンパク質は、シグナル配列が
すでに切り離されたタンパク質に対して、プレタンパク質、または未成熟型タン
パク質と呼ばれることが多い。これは通常、成熟タンパク質の形成に必要な段階
の一つである。タンパク質は、異種シグナル配列をこのタンパク質に結合するこ
とによって、分泌のために標的化されることもある。これはシグナル配列をコー
ドするＤＮＡをこのタンパク質をコードするＤＮＡの５’末端に連結し、融合タ
ンパク質を適切な宿主細胞において発現することによって容易に実現する。原核
生物および真核生物（酵母および哺乳動物）シグナル配列を宿主細胞の型に依存
して用いることができる。通常、シグナル配列をコードするＤＮＡを、シグナル
配列を有するタンパク質をコードする遺伝子から切り取り、分泌すべきタンパク
質、例えばＶＥＧＦをコードするＤＮＡに連結する。あるいは、このシグナル配
列をコードするＤＮＡを化学的に合成することができる。このシグナルは機能的
でなければならない、すなわちこのシグナルは宿主細胞シグナルペプチダーゼお
よび分泌経路によって識別され、このシグナル配列が切り離され、このタンパク
質が分泌されるようになっていなければならない。真核生物および原核生物シグ
ナル配列の大きい変動は当業者には公知であり、本発明のプロセスの実施に用い
ることができる。例えば酵母シグナル配列は酸性ホスファターゼ、アルファ因子
、アルカリ性ホスファターゼ、エキソ−１，３−β−グルカナーゼおよびインベ
ルターゼシグナル配列を含む。原核シグナル配列は例えばＬａｍＢ、ＯｍｐＡ、
ＯｍｐＢおよびＯｍｐＦ、ＭａｌＥ、ＰｈｏＡ、およびβラクタマーゼを含む。

【００６８】哺乳動物細胞は通常、カルシウムリン酸法の変法を用いて（グラハム（Ｇｒａ
ｈａｍ）ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２：５４６［１９７８］；サムブルックら、
同上、章１６．３２−１６．３７）、またはより最近にはリポフェクチンを用い
て、適切な発現ベクターで形質転換される。しかしその他の方法、例えばプロト
プラスト融合、エレクトロポレーション、直接マイクロインジェクション等も適
する。

【００６９】酵母宿主は概してポリエチレングリコール法によって形質転換される（ヒネン
（Ｈｉｎｎｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７５：
１９２９−１９３３［１９７８］）。Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ等の酵母
はその他の方法、例えば実施例に記載されるエレクトロポレーションによっても
形質転換される。

【００７０】原核宿主細胞は例えば塩化カルシウム法（サムブルックら、同上、１．８２章
）またはエレクトロポレーションを用いて形質転換することができる。

【００７１】宿主がＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓである場合、形質転換された細胞を次
のような適切な方法（これらに制限するものではない）を用いて選択することが
できる：すなわち、必要な生化学的生成物（細胞が栄養要求性であるため）の非
在下で形質転換した後の栄養要求性細胞の培養；新しい表現型の選択および検出
；またはトランスフォーマントに含まれる耐性遺伝子がない場合は酵母に対して
有毒である抗生物質の存在下で培養する。分離された形質転換されたＰｉｃｈｉ
ａｐａｓｔｏｒｉｓ細胞を適切な発酵技術、例えば振盪フラスコ発酵、高密度
発酵、またはＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ５：４７９−４８５（１９８７
）のクレッグ（Ｃｒｅｇｇ）ら著「メチロトロフィック酵母、Ｐｉｃｈｉａｐ
ａｓｔｏｒｉｓ」中の「Ｂ型肝炎表面抗原の高レベル発現および効率的アセンブ
リー」に開示された技術等によって培養する。ＶＥＧＦ₁₂₁産生のアッセイを行
うことによって分離物をスクリーニングし、最高産生レベルを有する分離物を確
認し得る。

【００７２】所望表現型および遺伝子型の形質転換された株を発酵槽中で増殖させる。メチ
ロトロフィック酵母における組換えＤＮＡをベースとする生成物の大規模生産で
は、通常、三段階の高細胞密度供給回分発酵システムが、使用される好ましい発
酵プロトコルである。第一段階、または増殖段階では、発現宿主を、規定最小培
地中で過剰の非誘導性（ｎｏｎ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ）炭素供給源（例：グリセロ
ール）と共に培養する。もしもその発現ベクターが、所望生成物の発現が適切な
炭素供給源の条件によってコントロールされる或るプロモーターによって駆動さ
れるように構成されている場合、この宿主が適切な抑制的炭素供給源で増殖する
場合に異種遺伝子発現は完全に抑制され、それは異種タンパク質発現を起こさず
に細胞集団を生成させる。この増殖段階中には、培地のｐＨは約４．５−５に維
持されるのが好ましい。次に、短期間の非誘導性炭素供給源−制限−増殖は細胞
集団をさらに増殖させ、この炭素供給源に応答するプロモーターを脱抑制して活
性化する。制限条件下の増殖期間に続いて、誘導性炭素供給源、例えばメタノー
ル単独（例：「制限メタノール供給回分法」）、または限定量の非誘導性炭素供
給源＋誘導性炭素供給源（本明細書では「混合供給回分法」という）を発酵槽に
加え、メタノール応答性プロモーター等の炭素供給源応答性プロモーターによっ
て駆動される異種遺伝子の発現を誘導する。この第三段階はいわゆる生産段階で
ある。この生産期中の培地のｐＨは約ｐＨ５と約ｐＨ６の間、好ましくは約ｐＨ
５．０または約ｐＨ６．０に調節される。ＶＥＧＦの発現は、振盪フラスコでも
行うことができる。例えばシステイン、シスチンおよび／またはグルタチオンを
培地に含める等、生産段階中の条件を変化させることによって、生成するＶＥＧ
Ｆ₁₂₁ダイマーの型を、生成物の大部分が各モノマーサブユニットのＣｙｓ−１
１６において混合ジスルフィドを含む形になるように調節することができる。

【００７３】本発明者が本発明のＶＥＧＦ₁₂₁ダイマーが完璧に活性であることを見いだし
たからには、本発明のダイマー類または生成物混合物を含む医薬組成物は本発明
の範囲内にある。適切な形は、例えば経口、経皮、吸入、移植、または注入また
は注射等、用途および摂取経路によって一部左右される。このような形は標的細
胞が多細胞宿主または培養物中に存在するか否かにかかわらず、薬剤または組成
物を標的細胞に到達せしめる。例えば血流に注射する医薬剤または組成物は可溶
性でなければならない。その他の要因は当業者には公知であり、毒性や、特定の
条件下で上記薬剤または組成物の効果の発現を阻止する型等の考察が含まれる。

【００７４】本発明のＶＥＧＦ₁₂₁ダイマーまたは生成物混合物を含んでなる組成物は薬物
学的に容認できる塩類（例えば酸付加塩）および／またはその複合体化合物とし
て処方することもできる。薬学的に受容可能な塩は、それらを投与する濃度では
無毒性である。薬学的に受容可能な塩類には硫酸塩、塩酸塩、燐酸塩、スルホン
酸塩、スルファミン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、メタンスル
ホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン
酸塩、シクロヘキシルスルホン酸塩、シクロヘキシルスルファミン酸塩およびキ
ナ酸塩を含むもののような酸付加塩がある。薬学的に受容可能な塩類は塩化水素
酸、硫酸、燐酸、スルホン酸、スルファミン酸、酢酸、クエン酸、乳酸、酒石酸
、マロン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−
トルエンスルホン酸、シクロヘキシルスルホン酸、シクロヘキシルスルファミン
酸、およびキナ酸等の酸から得ることができる。このような塩類は、例えば遊離
の酸−または塩基型の生成物と、１等量以上の適した塩基または酸とを、その塩
が不溶性である溶媒または媒質中で、または水等の溶媒中で（その溶媒はその後
真空で、または凍結乾燥によって除去される）反応させることによって、または
存在する塩のイオンを適切なイオン交換樹脂で別のイオンに交換することによっ
て調製され得る。

【００７５】上記ダイマーまたは生成物混合物の投与を容易にするために、キャリアまたは
賦形薬も使用できる。キャリアおよび賦形薬の例としては、炭酸カルシウム、燐
酸カルシウム、ラクトース、グルコース、スクロースまたはトレハロース等の糖
類、または澱粉の種類、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレング
リコール類および生理的に適合する溶媒類がある。組成物は静脈内、動脈内、腹
腔内、心膜内、冠動脈内、皮下、筋肉内、経口、局所、または経粘膜等（ただし
これらの制限されるものではない）の種々の経路によって投与できる。

【００７６】上記組成物の所望の等張性は塩化ナトリウムや、その他のデキストロース、硼
酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコール、ポリオール類（マンニトールお
よびソルビトール等）等の薬学的に受容可能な試薬、またはその他の無機または
有機溶質を用いて実現できる。

【００７７】本発明のＶＥＧＦ₁₂₁ダイマーまたは生成物混合物を含む医薬組成物は全身性
および局所性または局部的投与を含む種々の投与法のために処方され得る。技術
および処方は一般に「レミントンの医薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ）」１８版、マック・パブリッシン
グ社、イーストン、ＰＡ、１９９０に見いだされる。ワング（Ｗａｎｇ）および
ハンソン（Ｈａｎｓｏｎ）の「タンパク質およびペプチドの非経口処方：安定性
および安定剤（ＰａｒｅｎｔｅｒａｌＦｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓｏｆＰｒ
ｏｔｅｉｎｓａｎｄＰｅｐｔｉｄｅｓ：ＳｔａｂｉｌｉｔｙａｎｄＳｔ
ａｂｉｌｉｚｅｒｓ）」、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰａｒｅｎｔｅｒａｌＳｃ
ｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、技術レポートＮｏ．１０、付録４
２−２Ｓ（１９８８）も参照されたい。適切な投与形態は、医者が各患者に個々
に決めることが最善である。

【００７８】タンパク質の全身投与のためには注射、例えば筋肉内、静脈内、動脈内、冠動
脈内、心膜内、腹腔内、皮下、クモ膜下出腔、または脳血管内等が最も一般的に
用いられる。注射では本発明の化合物は液体溶液に処方され、好ましくは生理的
に適合する緩衝液、例えばハンク溶液またはリンゲル溶液等に処方される。或い
は、本発明の化合物は米国薬局方基準によって安全として一般的に容認されてい
る１種類以上の賦形薬（例えばプロピレングリコール）に処方される。それらは
例えば不活性オイル、適切にはセサミ、ピーナツ、オリーブオイル等の植物性油
、またはその他の容認できるキャリアに懸濁できる。それらを水性キャリア、例
えばｐＨ約５．０〜７．４の等張性緩衝溶液に懸濁するのが好ましい。これらの
組成物は従来の滅菌法によって滅菌することができ、または滅菌濾過することが
できる。上記組成物は生理的条件に近づけるために必要な薬学的に受容可能な補
助物質、例えばｐＨ緩衝剤等を含むことができる。有用な緩衝剤には、例えば酢
酸ナトリウム／酢酸緩衝剤およびクエン酸ナトリウム／クエン酸緩衝剤等がある
。代わりに、貯蔵または「デポ（ｄｅｐｏｔ）」徐放性の形の製剤を用いて、移
植後、注射後または経皮的デリバリー後に、長時間または何日にもわたってその
製剤の治療的有効量を血流に供給することができる。その他に、上記化合物類を
固体形に処方し、使用直前に再溶解または懸濁することができる。凍結乾燥形態
も含まれる。

【００７９】本発明のＶＥＧＦ₁₂₁ダイマーまたは生成物混合物は、例えば米国特許第５，
２４４，４６０号に記載されるように、冠動脈に直接挿入したカテーテルを用い
て、またはＶＥＧＦ₁₂₁ダイマーまたは生成物混合物を直接心臓壁に注入させる
ために心室に挿入したカテーテルを用いて、直接心臓に導入することもできる。

【００８０】或る条件のもとでは、本発明のダイマーおよび生成物混合物は経口投与のため
にも使用できる。経口投与では、ダイマーまたは生成物混合物はカプセル、錠剤
およびトニック等の従来の経口投与型に処方される。

【００８１】全身性投与は経粘膜または経皮的デリバリーによっても可能である。経粘膜的
または経皮的投与では、透過すべき障壁に適した浸透剤を製剤中に使用する。こ
のような浸透剤は当業者には一般的に公知であり、例えば経粘膜投与のためには
胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体等がある。加えて、界面活性剤を用いて浸透を
容易にすることができる。経膜的投与は例えば鼻スプレーにより、または坐薬を
用いて行うことができる。

【００８２】吸入による投与の場合は、通常、吸入可能の乾燥粉末組成物またはエアゾール
組成物が用いられる、その際粒子または小滴の大きさは、活性成分が呼吸気道の
所望部分、例えば喉、上気道または肺等に沈着するように選択される。吸入性組
成物およびそれらを投与するためのデバイスは当業者には周知である。例えば、
吸い込むためのエアゾール医薬品のデリバリーデバイスは公知である。このよう
なデバイスの一つは、そのデバイスの各操作ごとに患者に同量の薬物を供給する
定量吸入器である。定量吸入器は一般には医薬品の貯蔵器と加圧下の噴射剤とを
含むキャニスター、および一定容量の定量投与チェンバーとを含む。そのキャニ
スターを、患者に医薬品を供給するための口金またはノーズ−ピースを有するボ
ディーまたはベースの容器に挿入する。患者がそのデバイスを使用する際には、
キャニスターを手で容器のボディーに圧し込み、充填バルブを閉じ、一定量の薬
剤を投与量チェンバー内に取り込み、リリースバルブを開ける。すると定量チェ
ンバー内に取り込まれた一定量の薬剤が大気中にエアゾールミストとして放出さ
れる。同時に患者はマウスピースを通して息を吸い、そのミストを気道に取り込
む。患者はその後キャニスターを離し、リリーズバルブを閉め、充填バルブを開
けて次の投与のために投与量チェンバーを再充填する。例えば米国特許第４，８
９６，８３２号、およびＡｅｒｏｓｏｌＳｈｅａｔｈｅｄＡｃｔｕａｔｏｒ
ａｎｄＣａｐとして知られる、３Ｍヘルスケアから市販される製品を参照さ
れたい。

【００８３】別のデバイスは、患者の吸入作用に応えて自動的に一定量を与えるように作動
する呼吸作動性（ｂｒｅａｔｈａｃｔｕａｔｅｄ）定量吸入器である。或る様
式の呼吸作動性デバイスは、呼吸作用力が機械的レバーを動かしてリリーズバル
ブをトリガーしたときに、或る投与量を放出する。もう一つの様式は、検出され
る流速が、ホットワイヤー流体速度計によって検出されるあらかじめ設定された
閾値を超えて上昇するとき、上記投与量を放出する。例えば米国特許第３，１８
７，７４８号；同第３，５６５，０７０号；同第３，８１４，２９７号；同第３
，８２６，４１３号：同第４，５９２，３４８号；同第４，６４８，３９３号；
同第４，８０３，９７８号を参照のこと。

【００８４】乾燥粉末化薬剤を患者の気道に供給するデバイス（例：米国特許第４，５２７
，７６９号参照）および固体エアゾール前駆体物質を加熱することによってエア
ゾールを供給するデバイス（例：米国特許第４，９２２，９０１号）も存在する
。これらのデバイスは一般的に、薬剤を貯蔵器から気道に引き出す患者の吸気流
、または固体エアゾール前駆体を蒸発させるために加熱要素を作動させる患者の
吸気流によって、患者の吸気の初期段階に薬剤を供給するするように作動する。

【００８５】エアゾールの粒子サイズを調節するためのデバイスも公知であり、例えば米国
特許第４，７９０，３０５号；同第４，９２６，８５２号；同第４，６７７，９
７５号；同第３，６５８，０５９号を参照のこと。

【００８６】局所的投与については、本発明の化合物は当業者には一般に公知のように、軟
膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリームに処方さ
れる。

【００８７】所望ならば、上記組成物の溶液はメチルセルロース等の濃化剤で濃化すること
ができる。それらは油中水か水中油かどちらかの乳化型に調製することができる
。下記のような非常の種々様々の薬学的に受容可能な乳化剤が用いられる：例え
ばアカシア粉末、非イオン性界面活性剤（例えばツイーン等）、またはイオン性
界面活性剤等（アルカリポリエーテルアルコールスルフェートまたはスルホルネ
ート、例えばトリトン等）。

【００８８】本発明に有用な組成物は、諸成分を一般に容認される方法にしたがって混合す
ることによって調製される。例えば選択されたコンポーネントを単にブレンダー
またはその他の標準デバイス中で混合し、濃縮混合物を作り、その後水または濃
化剤、および可能であればｐＨを調節する緩衝剤、または張力を調節する追加的
溶質をそれに加えることによって最終濃度および粘度を調節することができる。

【００８９】本発明によって使用するための種々のダイマーまたは生成物混合物の量は標準
的方法によって決めることができる。一般に治療的有効量は、患者の年齢および
身長、および患者と関連する疾病または障害に依って、約１００ｍｇ／ｋｇから
１０^-12ｍｇ／ｋｇまでの間である。一般に治療的有効量は、治療すべき患者の
体重１ｋｇあたり、約０．０１〜５０ｍｇ、好ましくは０．０５〜２０ｍｇ、最
も好ましくは０．０５〜２ｍｇの間の量である。

【００９０】医者が使用する場合、上記組成物はここに記したＶＥＧＦ₁₂₁ダイマーまたは
混合物の量を含む単位投与型として提供される。

【００９１】本発明のＶＥＧＦ₁₂₁ダイマーおよび混合物はその他の型のＶＥＧＦと同じ適
応症に対して有望な候補である。よって、本発明のＶＥＧＦ₁₂₁ダイマーおよび
生成物混合物を使用して血管形成および／または血管リモデリングを誘発するこ
とができ、したがって冠動脈疾患および／または末梢動脈疾患の治療に用途を見
出し得る。本発明のＶＥＧＦ₁₂₁ダイマーおよび生成物混合物を使用して例えば
心筋血管の成長を促進し、心臓へ行く血流を改善することができる（例：米国特
許第５，２４４，４６０号を参照のこと）。末梢動脈疾患および冠動脈疾患は両
方とも、しばしば血管形成術／動脈内膜切除術アプローチ（アテローム硬化性プ
ラーク増大によって生じた閉鎖を開通させるため）または外科的バイパス（上記
閉鎖周囲に導管を作る）のいずれかで首尾良く処置され得る。しかし多数の症例
において、患者はこれらのどちらのタイプの方法によっても救われないリスクが
あるようにみえる（例：マクハージー（Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｃ
ａｒｄｉｏｌ．８４：５９８−６００［１９９１］を参照のこと）。本発明によ
って得られる治療の第一の利益を期待されるのがこのいわゆる「ｎｏｏｐｔｉ
ｏｎ」患者群である。本発明のＶＥＧＦ₁₂₁ダイマーまたは生成物混合物による
治療に応答して形成された新しい血管または新たに増長した血管は重大な副作用
なしに閉鎖血管周囲に自然のバイパスを作り出すと考えられる。その結果、この
治療は、長い目で見て冠動脈疾患および末梢動脈疾患患者群に全般的に、または
少なくともその一部において、血管形成術／血管内膜切除術／外科的バイパスに
代わって用いられるという希望が生まれる。

【００９２】本発明はさらに、内皮細胞損傷が、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）、中毒性シ
ョック症候群、毒液被曝、または化学的または薬物毒素被曝において発生するよ
うな既知または未知毒素によって仲介される状態、並びに内皮細胞損傷が高血圧
によって仲介される状態において、血管損傷の治療（予防も含める）およびこの
ような血管を含む組織の損傷の治療（予防も含める）に関する。

【００９３】本発明はさらに、糸球体および間質の血管系の損傷または前記血管系の萎縮と
関連する腎臓疾患の治療（予防も含める）にも関係する。

【００９４】本発明は、凝固性亢進状態、血小板の活性化または凝集、血栓症、または凝固
カスケードにおけるタンパク質類の活性化、子癇前症、血栓性血小板減少性紫斑
病（ＴＴＰ）、播種性血管内凝固、敗血症および膵炎に関連する疾患において、
血管の内皮損傷の治療（予防も含める）およびこのような損傷血管を含む組織の
損傷の治療（予防も含める）にも関係する。

【００９５】本発明は血圧低下による血流減少の結果として発生する血管損傷または損傷血
管に隣接する周囲組織の損傷、または動脈硬化症、血栓症、機械的外傷、血管壁
剥離、外科的切開またはその他のあらゆる正常血流もしくは正常血圧の妨害に起
因する完全または部分的血管閉鎖の治療（予防も含める）方法も提供する。特に
本発明は急性腎不全、血栓溶解治療を伴うまたは伴わない心筋梗塞、虚血性腸疾
患、一過性虚血性発作および脳卒中の治療（予防も含める）方法を提供する。

【００９６】本発明は、損傷性免疫刺激、毒素被曝、感染症、または虚血（非制限的に急性
呼吸窮迫症候群、喫煙中に起きるような中毒性肺胞損傷を含む）、肺炎（ウィル
ス性および細菌性感染症等を含む）、および肺塞栓によって引き起こされる肺の
内皮損傷に起因する低酸素症または高炭酸症または高血圧の治療（予防も含める
）方法も提供する。

【００９７】本発明はさらに、早産、および肺高血圧症の一次および二次原因に起因する障
害等の、肺内皮損傷から起きる肺機能異常の治療（予防も含める）の方法および
手段も提供する。

【００９８】ここに開示される方法は血管損傷と関連した皮膚障害に起因する傷の治療にも
用いることができる。

【００９９】本発明は内皮および血管の損傷の治療（予防も含める）方法、および免疫サイ
トカイン、免疫コンプレックス、および補体カスケードのタンパク質類等の損傷
性免疫刺激による損傷血管を含む組織の損傷（非制限的にあらゆるタイプの血管
炎、アレルギー反応、即時型および遅延型過敏症、並びに自己免疫病等の疾患を
含む）の治療（予防も含める）方法も提供する。

【０１００】本発明の方法を使用して治療できる特異な腎臓病にはＨＵＳ、巣状糸球体腎炎
、アミロイドーシス、糸球体腎炎、糖尿病、ＳＬＥ、および慢性低酸素症／萎縮
がある。

【０１０１】本発明のＶＥＧＦ₁₂₁ダイマーおよび生成物混合物は高血圧の治療または予防
にも使用できる。この治療の有効性は、特に塩負荷に反応した血圧の低下によっ
て確認される。

【０１０２】本発明のＶＥＧＦ₁₂₁ダイマーおよび生成物混合物は内皮細胞を通過する溶質
の異常輸送に関する疾患の治療にも有用である。このような疾患には（１）溶質
の濾過または排出障害と関連する腎臓病；（２）脳脊髄液の合成、組成または循
環の変化と関係する中枢神経系の疾患、例えば脳卒中、髄膜炎、腫瘍、感染症、
および脊椎骨成長異常等；（３）低酸素症または高炭酸症あるいは、液分泌物の
肺への蓄積またはそれらの除去障害に起因する線維症、例えば非制限的に、急性
呼吸窮迫症候群、喫煙によって起きるような中毒性肺胞損傷、ウィルス性および
細菌性感染症等の肺炎、外科的インターベンション、嚢胞性線維症、およびその
他の、肺の空気スペースへの液貯留と関連する先天性および後天性肺疾患等；（
４）早産、および肺性高血圧の一次および二次的原因に起因する疾患を含む、肺
内皮損傷に起因する肺機能異常；（５）間質性内皮を通過する液および溶質の運
搬障害に起因する疾患、例えば非制限的に、炎症性腸疾患、感染症性下痢、およ
び外科的インターベンション等；並びに（６）心不全、肝不全または腎不全、あ
るいは感染状態または腫瘍状態に起きるような腹膜内腹水貯留。その他の用途と
しては（１）腎不全の治療における腹膜透析のために、または治療剤または栄養
の腹膜への供給のために必要なような、溶質フラックスの効率上昇；（２）腎臓
、心臓、肝臓、肺、膵臓、皮膚、骨、腸等（これらに制限するものではない）の
同種移植器官、および異種移植片の機能の保存または向上；および（３）心臓弁
異常の治療等がある。

【０１０３】本発明のこれ以上の詳細は下記の非制限的実施例から明らかになる。実施例を
含むこの明細書全体に記載される全ての参考文献は参考として本明細書に明白に
組み込まれるものとする。

【０１０４】（実施例）（実施例１）（哺乳動物宿主細胞におけるｈＶＥＧＦ₁₂₁の産生）（Ａ．ｈＶＥＧＦ₁₂₁を産生する細胞系の生成）ベクター：ｈＶＥＧＦ₁₂₁前駆体（分泌シグナル＋成熟１２１残基モノマー鎖
）をコードするｃＤＮＡが、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）ｍｉｄｄｌｅｌ
ａｔｅｒプロモーターから誘導された高活性プロモーターに操作可能に結合して
いるプラスミド発現ベクター（図７）を作製した。ウシ成長ホルモン遺伝子から
の転写終止／ポリアデニル化領域をＶＥＧＦｃＤＮＡの下流に置いた。上記発
現プラスミドは、ひとたび哺乳動物細胞に導入されると、プラスミドの選択並び
に増幅のために使用できるタンパク質もコードする。適切な選択マーカーには、
ジヒドロフォレート還元酵素（ＤＨＦＲ）およびグルタミン合成酵素があるが、
その他の一般的選択マーカーも同様に適する。選択可能マーカーの発現はＳＶ４
０初期プロモーターによって促進され、ＳＶ４０転写終止／ポリアデニル化シグ
ナルはこのマーカーの下流に位置する。細菌細胞内で増殖させるために、上記ベ
クターは細菌性（ＣｏｌＥＩ）複製開始点も含み、アンピシリン耐性を与えるβ
−ラクタマーゼをコードする。

【０１０５】ＶＥＧＦ₁₂₁を発現するＣＨＯ細胞系の選択：ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（
ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を用いてＶＥＧＦ発現ベクターを７０％融合チャイニーズ
ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＣＨＯ−Ｋ１、ＡＴＣＣから入手；またはＤＨ
ＦＲが選択可能マーカーである場合は、ＬａｕｒｅｎｃｅＣｈａｓｉｎ（コロ
ンビア大学、ニューヨーク、ＮＹ）から得たＣＨＯＤＧ４４（ｄｈｆｒ）細胞
）に導入した。ＤＭＥＭ（高グルコース）とクーンのＦ１２培地との５０：５０
（ｖ／ｖ）ミックス中で回収した２４時間後に、これら細胞をトリプシナイズし
、遠心分離し、その後選択培地に再懸濁し、培養基で培養した。ＤＨＦＲ選択の
場合、選択培地は２％透析化ウシ胎児血清（ＪＲＨＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
および１×ＳＩＴＥ（セレナイト、インスリン、トランスフェリン、およびエタ
ノールアミン；シグマ社）を補充したＩＭＤＭであった。グルタミン合成酵素を
選択マーカーとした場合、選択培地は、１×ＧＳサプリメント（ＪＲＦＢｉｏ
ｓｃｉｅｎｃｅｓ、レネックス、ＫＳ）、１０％透析化ウシ胎児血清、および２
５μＭメチオニンスルフォキシミンを含むグルタミン−フリーＤＭＥＭ（高グル
コース）であった。選択培地で生き残った細胞集団をトリプシナイゼーションに
よって集め、重複９６ウェルプレートに再培養した。次いで、細胞の個々のプレ
ートを（時間にわたって）増加する濃度のメトトレキセート（ＤＨＦＲが選択マ
ーカーであった場合）か、種々濃度のメチオニンスルフォキシミン選択剤（２０
０μＭ、４００μＭ、または６００μＭ）（グルタミン合成酵素がマーカーであ
った場合）かどちらかを含む選択培地で処理した。１１日間の選択／増幅後、ウ
ェルから採取した条件培地のサンプルを集め、ＶＥＧＦ発現レベルを、ＶＥＧＦ
ペプチドに対するウサギポリクローナル抗体、またはサンドウィッチＥＬＩＳＡ
キット（Ｒ＆ＤＳｉｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ＭＩ）を用いて、ウェスタン
・ブロット法で試験した。与えられた選択マーカーで最高レベルの発現を示す一
つのクローンを選び、組換えｈＶＥＧＦ₁₂₁産生に用いた。

【０１０６】（Ｂ．組換えｈＶＥＧＦ₁₂₁の産生）ＶＥＧＦ₁₂₁を発現するＣＨＯ細胞系から条件培地の生成：ＣＨＯ細胞クロー
ンを２種類の培地の一つで増殖させた。単層培養の細胞の場合、１０％透析化ウ
シ胎児血清と、８０ｎＭメトトレキセートと４ｍＭグルタミン（ＤＨＦＲ選択可
能マーカーを含むクローンの場合）か、または１００μＭメチオニンスルフォキ
シミン（グルタミン合成酵素がマーカーである場合）のどちらかとを補充したＤ
ＭＥＭ−２１とクーンのＦ１２（両方ともグルタミン−フリー）の５０：５０ミ
ックスを用いた。或いは、細胞が懸濁培養液中にある場合、培地は、４ｍＭグル
タミンと８０ｎＭメトトレキセート（ＤＨＦＲ系クローンの場合）または１００
μＭヒポキサンチンと、１６μＭチミジンと、１００μＭメチオニンスルフォ
キシミン（グルタミン合成系クローンの場合）とを補充したＢｉｏｈｉｔｉ
ｋａｒ社（ウォルカーズヴィル、ＭＤ）のＰｒｏＣＨＯ４ＣＤ４であった。単
層培養の場合、融合Ｔ２２５フラスコ培養物をトリプシナイズし、遠心分離によ
って集め、１７００ｃｍ²ローラーボトルに入れた。各ローラーボトルに１また
は２Ｔ２２５フラスコ量に匹敵する細胞を入れた。ローラーボトル中の細胞を融
合するまで増殖させた。この段階における増殖培地には１５−２０ｍＭＨＥＰ
ＥＳ（ｐＨ７．２−７．５）を補充した。細胞が融合に達した際、培地を除去し
、付着した細胞を燐酸生理緩衝食塩液で洗った。それから無血清培地（１５−２
０ｍＭＨＥＰＥＳを補充したＪＲＦＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＥｘ−Ｃｅ
ｌｌＰＦ−３２５培地、ｐＨ７．２−７．５）を各ローラーボトルに加えた。
培地をローラーボトルから２−３日ごとに集め、新鮮培地に置き換えた。集めた
培地は０．２２ｍフィルターを通して濾過し、０．１ｍＭフッ化フェニルメチル
スルホニルを補充し、凍結した。

【０１０７】（Ｃ．ローラーボトル馴化培地からｈＶＥＧＦ₁₂₁の精製）いくつかの場合、融解した馴化培地を分画化の前に濃縮し；別の場合において
、融解した培地を濃縮せずに用いた。いずれか場合、１０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ
７．５、で平衡化したＤＥＡＥセファロースカラムにその培地を適用した。結合
タンパク質を１０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．５中のＮａＣｌ勾配（０〜３００ｍ
Ｍ）で溶出した。ｈＶＥＧＦ₁₂₁を含む画分をプールし、１０ｍＭＴｒｉｓ、
ｐＨ７．５、０．５ＭＮａＣｌ、０．５ｍＭイミダゾールで平衡化したＺｎ−
セファロースカラムに適用した。カラムを平衡緩衝液、または合計２０ｍＭイミ
ダゾールを含むように補充した平衡緩衝液で洗浄した。次いで、結合タンパク質
を１０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、０．５ＭＮａＣｌ中のイミダゾール勾配
（０〜６０ｍＭ、または２０〜６０ｍＭのいずれか）で溶出した。一般的に、Ｖ
ＥＧＦを含む物質のピークが２つ得られた。これらの各ピークを限外濾過によっ
て濃縮し、２５％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸中で平衡化した逆
相ＨＰＬＣカラム（Ｃ４またはＣ１８のいずれか）を用いてさらに分画化した。
各タンパク質サンプルをそのカラムに担持させた後、カラムを平衡緩衝液で洗浄
し、そして結合タンパク質を０．１％トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル勾配
（２５〜４５％）で溶出した。Ｃ４カラムを用いてｈＶＥＧＦ₁₂₁を精製すると
、カラムに担持させた各Ｚｎ−セファロースピークからＶＥＧＦの一つのピーク
が得られた。Ｃ１８カラムを用いる場合、一般に２つのＶＥＧＦピークが各Ｚｎ
−セファロースサンプルから得られた。

【０１０８】（Ｄ．組換えｈＶＥＧＦ₁₂₁の特徴づけ）ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４９４Ｐｒｏｃｉｓｅタンパク
質シーケンサーを用いるアミノ末端配列決定。Ｎ末端配列決定は、ＣＨＯ細胞に
よって産生されるＶＥＧＦ₁₂₁の９０〜９５％が、ネイティブなヒトＶＥＧＦ₁₂₁ の正しい配列（Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｇｌｕ．．．）で始まること
を示した。残基３（Ｍｅｔ）、４（Ａｌａ）または１１（Ｈｉｓ）で開始する分
子もまた検出された。代表的な場合において、Ｎ末端は約９０％が残基１、約８
％が残基４、そして約２％が残基１１であった。一般的には、ＣＨＯ細胞で産生
される産物は、代表的に残基１で開始する（ネイティブな分子の正しいＮ末端）
産物約９０〜９５％、残基４で開始する産物約３〜１０％、そしてネイティブな
分子の残基１１で始まる産物約０．２％を含む混合物である。

【０１０９】ＬＣ２質量分析計（Ｆｉｎｎｅｇａｎ）を用いる質量分析と液体クロマトグラ
フィーとの組み合わせ（ＬＣ−ＭＳ）。ＬＣ−ＭＳはＲＰ−ＨＰＬＣ画分に含ま
れる分子の質量に関する情報を提供する。この情報から、（１）分子のＣ末端が
インタクトであるか否か、および（２）ＶＥＧＦ分子が共有結合によって、すな
わちグリコシル化、または他の分子（例えばシステイン）とのジスルフィド結合
によって改変されているか否か、を結論づけ得る。グリコシル化の構造に関する
情報もまた入手し得る。ＬＣ−ＭＳ結果によると、ＣＨＯ細胞で産生される本質
的に全てのｈＶＥＧＦ₁₂₁が残基１２０で終わり、ネイティブなヒト配列の最後
のＡｒｇ残基が欠けているが、この欠失は条件によって若干変化することが見出
された。特定の調製物において、ｈＶＥＧＦ₁₂₁分子の約６５〜７０％までがネ
イティブなタンパク質の残基１２１を保有していた。ＬＣ−ＭＳデータはまた、
ＶＥＧＦ₁₂₁ダイマー内のＶＥＧＦモノマーがときどきグリコシル化され、そし
てときどきグリコシル化されていないことも示した。モノマーがグリコシル化さ
れる場合、Ｎ結合糖は１または２個のいずれかのシアル酸部分を有することが見
出された。最後に、ＬＣ−ＭＳデータは、いくつかの場合には、２つの外来（外
因性）システイン分子がＶＥＧＦダイマーに結合するようになることを示唆した
（すなわち分子量が、２個のシステインの付加と一致する、２４０原子量単位［
ａｍｕ］だけ増加した）。

【０１１０】（Ｅ．Ｇｌｕ−Ｃを用いるＣ末端およびＣｙｓ−１１６の状態の確認）（消化）Ｇｌｕ−Ｃはタンパク質をグルタミン酸（Ｇｌｕ）残基の後で切断する。ｈＶ
ＥＧＦ₁₂₁ダイマーの場合、分子の真中が結合して「システイン結節」になって
おり、これがプロテアーゼにアクセスできないようにするため、Ｇｌｕ−Ｃがで
きる切断は残基５、残基１３、および残基１１４後のみである。ＣＨＯ由来ｈＶ
ＥＧＦ₁₂₁の残基１１４における切断は、残基１１５〜１２０（または、分子が
完全な長さである場合は１１５〜１２１）を表すＣ末端フラグメントを遊離する
。このフラグメントはＮ末端配列決定によって完全に配列が決定され、実質上全
ての分子が残基１２０で終わるか、または残基１２１を含む分子があるか否かを
確認し得る。さらに、残基１１６におけるＣｙｓが別のシステインにジスルフィ
ド結合している場合、Ｎ末端配列決定は、サイクル２にシスチン（Ｃｙｓ−Ｓ−
Ｓ−Ｃｙｓ）残基を示す。Ｇｌｕ−Ｃ消化のＬＣ−ＭＳ分析は、Ｃ末端ペプチド
の質量を与える。この質量は残基１２１の決失を確認する。さらに、この質量は
Ｃｙｓ−１１６に関して多数の異なる状態の間を明白に区別する。Ｃｙｓ−１１
６がさらなる外因性システイン分子にジスルフィド結合する場合、Ｃ末端Ｇｌｕ
−Ｃペプチドの質量は１１５〜１２０残基および１２０ａｍｕをあらわす（総質
量８６５ａｍｕ）。他方、Ｃｙｓ−１１６がＶＥＧＦダイマー分子における他の
Ｃｙｓ−１１６とジスルフィド結合する場合、Ｃ末端Ｇｌｕ−Ｃフラグメントは
ＶＥＧＦダイマーの両方の鎖からの残基１１５〜１２０を含み、これら鎖はＣｙ
ｓ１１６〜Ｃｙｓ１１６ジスルフィド結合を介して連結される（総質量１４９０
）。１２１位にあるアルギニン残基が保持される場合、可能性のあるＣ末端フラ
グメントの質量はそれぞれ１０２１および１８０２である。

【０１１１】タンパク分解的断片化では、リン酸緩衝生理食塩水（クエン酸でｐＨ５．５に
調節）中のＶＥＧＦ（０．２〜１．５ｍｇ／ｍｌ）を、Ｇｌｕ−Ｃ（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）で、酵素対基質の比が１：２５で、３７℃で２
４時間消化した。次いで、Ｇｌｕ−Ｃの別のアリコートを酵素対基質の比１：２
５の割合で添加し、そして３７℃でさらに２４時間反応させた。次いで、消化産
物をタンパク質シーケンサーに適用するかまたはＬＣ／ＭＳに供すかのいずれか
を行った。この結果は、上記Ｂ節に記載したように生成したｈＶＥＧＦ₁₂₁ダイ
マーにおいて、位置１２１のＡｒｇが失われ、そしてＣｙｓ−１１６がときどき
外因性システインとジスルフィド結合し、そしてときどきダイマー内の他のＣｙ
ｓ−１１６に結合していることが確認された。

【０１１２】（実施例２）（Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞におけるｈＶＥＧＦ₁₂₁の産生）（Ａ．Ｅ．ｃｏｌｉ発現プラスミド）Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞におけるｈＶＥＧＦ₁₂₁の発現を発現ベクターｐＡＮ１
７９を用いて行った（図８）。このプラスミドを作製するために、最初にｈＶＥ
ＧＦ₁₂₁のための合成コード配列を作製した。この配列は高度に発現されたＥ．
ｃｏｌｉ遺伝子にみられるコドンバイアスを反映する。このコード配列はまた、
その５’末端に２つのさらなるインフレームコドン（メチオニンコドンおよびリ
ジンコドン）を組み込み、その結果コードされた産物は１２３アミノ酸長である
（「ＭＫ＋ＶＥＧＦ₁₂₁」）。Ｅ．ｃｏｌｉで機能する翻訳開始コドンを作るた
めにメチオニンコドンが付加された。この第二のコドンによってコードされるリ
ジンは、宿主細胞内で合成中のｈＶＥＧＦ₁₂₁産物のプロテアーゼ消化を遅らせ
るために、そして宿主細胞からの回収のために役立った。ＭＫ＋ＶＥＧＦ₁₂₁の
ためのコード配列をｐｈｏＡプロモーター／オペレーター（ＰＯ）領域に作動可
能に連結し、増殖培地のホスフェートの枯渇によって上記コード配列の転写が開
始し得るようにした。Ｅ．ｃｏｌｉｒｒｎＢ座のＴ１Ｔ２領域をこのコード配
列の下流に置き、転写終止を提供した。ｐＡＮ１７９のための複製開始点（ＯＲ
Ｉ）をｐＢＲ３２２から取り、ｒｏｐ遺伝子を保有した。テトラサイクリン耐性
遺伝子もこのベクターに挿入し、プラスミドの存在および安定性を選択可能にし
た。完全なｐＡＮ１７９プラスミドをＥ．ｃｏｌｉＢ細胞（ＡＴＣＣ２３８
４８）に形質転換し、そしてこのプラスミドを含む単細胞クローンを寒天プレー
ト上でテトラサイクリン選択によって単離した。

【０１１３】（Ｂ．Ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ発酵によるＥ．ｃｏｌｉにおける組換えＭＫ＋Ｖ
ＥＧＦ₁₂₁の産生）ｐＡＮ１７９を含むＥ．ｃｏｌｉＢクローンを用い、１％（ｗ／ｖ）グリセ
ロールおよび１％（ｗ／ｖ）カサミノ酸を補充したＥ．ｃｏｌｉタンク培地（表
１）２５ｍｌに接種した。３０℃で一晩振とうしながらインキュベーションした
後、得られた培養物５ｍｌを用いて、Ｆｅｒｎｂａｃｈフラスコ中の補充された
Ｅ．ｃｏｌｉタンク培地５００ｍｌに接種した。そのフラスコを３０℃で振とう
下、一晩インキュベートし、次いで全培養物をＥ．ｃｏｌｉタンク培地（表１）
８Ｌを含む１０−Ｌ発酵槽に加えた。発酵温度を３０℃に調節した。インペラー
回転速度１０００ｒｐｍを用いて培養物を撹拌し、１０．０Ｌ／ｍｉｎで通気し
た。培養物のｐＨは２Ｎ塩酸および１４．８Ｍ水酸化アンモニウムの添加によっ
て６．７に維持した。必要に応じて消泡剤を加えた。約３．５〜５．５時間のバ
ッチ増殖後、培地中のグリセロールが使い尽くされた。これは発酵培養物中の溶
解酸素（ＤＯ）濃度の急激な上昇によって明らかになる。溶解酸素レベルの上昇
はグリセロール供給の開始をトリガーし、グリセロールは制御された速度で加え
られ、ＤＯレベルを飽和の２５％に維持する（供給速度は１２０ｍＬ／ｈｒを超
えないように制限される）。グリセロール供給物は１０２１ｇ／Ｌグリセロール
、２０ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム六水加物、および１０ｍＬ／ＬのＫｏｒｚＦｅ
ｅｄ微量ミネラル（Ｋｏｒｚツら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３９：５９−６５
［１９９５］）からなる。約９〜１１時間後、リン酸二水素カリウム（３２．５
ｇ／Ｌ溶液）を約６ｇ／ｈｒの速度で培養物に供給し、リン酸枯渇の悪影響を阻
止した。このリン酸塩の供給を発酵が終わるまで続けた。約７２時間後、細胞を
遠心分離および凍結によって回収した。

【０１１４】

【表１】（Ｃ．Ｅ．ｃｏｌｉ由来ｈＶＥＧＦ₁₂₁ダイマーの精製）（１．ＭＫ＋ＶＥＧＦ₁₂₁モノマーの単離）発酵中、ＭＫ＋ＶＥＧＦ₁₂₁産物は細胞によって不溶性封入体に貯蔵された。
これらの封入体を回収するために、発酵槽からの細胞ペーストを最初に解凍し、
脱イオン水に再懸濁した。この懸濁液を遠心分離し、上清を棄て、ペレットをリ
ジン緩衝液（５０ｍＭエチレンジアミン、１５０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＥＤ
ＴＡ、ｐＨ６．５）に密度１５〜２０％（湿重量／容量）で懸濁した。次いで細
胞を１０．０００ｐｓｉに設定したＡＰＶガウリン（Ｇａｕｌｉｎ）３０ＣＤ高
圧ホモジナイザーを通過させて溶解した。５回連続容量通過を行い、細胞をほぼ
完全に溶解して封入体を遊離させた。溶解物の温度は、その溶解物を冷却コイル
を通過させ、そして細胞および溶解物の入った容器を氷上に保存することによっ
て１５℃未満に維持した。封入体を細胞細片および溶解性から遠心分離（４００
０×ｇ、３０分間）によって分離した。封入体ペレットを溶解緩衝液に再懸濁し
、その後２〜８℃で１６時間撹拌することによって洗浄した。封入体を再び遠心
分離によって集め、次いで溶解緩衝液に３０％固体（湿重量／容積）となるよう
に再懸濁した。封入体懸濁液を、アリコートで−７０℃で冷凍保存した。

【０１１５】溶解するために、この冷凍封入体を最初に解凍し、溶解緩衝液で１：５に希釈
し、次いで遠心分離によって集めた。封入体ペレットを７Ｍ尿素、２０ｍＭＴｒ
ｉｓ、１００ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ｐＨ７．８に溶解した。この
混合物を窒素下で室温（周囲温度）（１８−２２℃）で３時間撹拌した。次いで
、溶解した材料を２５ｍＭ酢酸（最終濃度）に調節し、そして溶液のｐＨが４に
なるまでＨＣｌを加えた。次いで、調節した混合物をその後デプスフィルター（
ｄｅｐｔｈｆｉｌｔｅｒ）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅ
ｒｍａｎｙ）を通して濾過し、１．２μｍにした。

【０１１６】濾過した溶液をＳＰ−１平衡緩衝液（６Ｍ尿素、２５ｍＭ酢酸ナトリウム、５
ｍＭＤＴＴ、ｐＨ４）で１：５に希釈し、次いでＳＰセファロース速流（Ｆａ
ｓｔＦｌｏｗ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ−ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ，
Ｕｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）クロマトグラフィーカラムにロードした。カラム
溶出物のＵＶ吸光度を２８０ｎｍでモニターした。ロードしたカラムを６Ｍ尿素
、２５ｍＭ酢酸ナトリウム、５ｍＭシステイン、１００ｍＭＮａＣｌを含む緩
衝液、ｐＨ４、で洗浄した。還元ＭＫ＋ＶＥＧＦ₁₂₁モノマーを、５５０ｍＭ
ＮａＣｌを含むように補充した洗浄緩衝液でカラムから溶出した。ＭＫ＋ＶＥＧ
Ｆ₁₂₁モノマーを含む画分をプールした。

【０１１７】（２．ｈＶＥＧＦ₁₂₁ダイマーの形成および精製）ＳＰセファロース速流カラムからの画分のプール（ＳＰ−１プール）を、０．
５ｍｇ／ｍＬ還元ＭＫ＋ＶＥＧＦ₁₂₁に希釈し、そして２Ｍ尿素、２５ｍＭジエ
タノールアミン、４００ｍＭＮａＣｌ、２．５ｍＭシステイン、０．５５ｍＭ
シスチン、ｐＨ８．８、に調節した。得られた混合物をステンレス鋼タンクに移
し、そして周囲条件下で４１時間撹拌して、タンパク質中のシステイン残基をジ
スルフィド結合形成によって酸化させた。リフォールディング反応中の種々の時
点に採取したサンプルを逆相ＨＰＬＣ分画化に供し、その後質量分析を行った。
これらの分析は、ＭＫ＋ＶＥＧＦ₁₂₁リフォールディングおよび二量体化の経過
が、ある工程に従うことを示した：早期時点ではこの２種類の優性なダイマー型
の分子質量は（１）ジスルフィド結合がダイマーの２つのＣｙｓ−１１６残基の
間に存在するダイマー、および（２）Ｃｙｓ−１１６の位置に遊離メルカプト基
を有するダイマーに一致した。後期の時点では（例えば４１時間の撹拌の終わり
）、第１のダイマー型は主な早期時点のダイマーより約２４０ａｍｕだけ大きい
分子質量を有し、これは２つのＣｙｓ−１１６位置の各々にジスルフィド結合し
たさらなるシステイン部分が存在することと一致した。中間時点では、付加的シ
ステインを一つだけ含む型（すなわち１２０ａｍｕだけ増加した質量）の実質的
な量が検出された。それ故に、反応が進行する時間を操作することによってリフ
ォールディング反応中に存在するダイマー型の割合を操作することができた。パ
イロット実験は、特定のダイマー型の混合物もまた、最初のリフォールディング
混合物に存在する還元対酸化システインの比を変えることによって操作し得るこ
とを示した。

【０１１８】鋼性タンク中で４１時間撹拌後、リフォールディング混合物を２０ｍＭリン酸
ナトリウムおよびｐＨ７．７に調節し、次いで濾過して０．２μｍにした（Ｍｉ
ｌｌｅｘＧＰ−５０フィルター，Ｍｉｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）
。リフォールディングされたＭＫ＋ＶＥＧＦ₁₂₁ダイマーを亜鉛担持キレート化
セファロース速流（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムで捕獲した
。このカラムからの溶出液のＵＶ吸光度を２８０ｎｍでモニターした。担持カラ
ムを２０ｍＭリン酸ナトリウム、２００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．７緩衝液で洗
浄し、未結合タンパク質を除去した。結合ＭＫ＋ＶＥＧＦ₁₂₁ダイマーをカラム
から５０ｍＭ酢酸ナトリウム、２００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ４で溶出した。ＭＫ
＋ＶＥＧＦ₁₂₁ダイマーを含む単一画分をプ集めた。この画分を１ｍＭＥＤＴ
ＡおよびｐＨ５．０に調節し、ジアミノペプチダーゼ−１（活性化ＨＴ−ＤＡＰ
−１酵素、Ｕｎｉｚｙｍｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を１：２０００の重量比（ＨＴ−
ＤＡＰ−１：総タンパク質）で添加した。この混合物を窒素下で周囲温度で５時
間撹拌した。ＭＫ＋ＶＥＧＦ₁₂₁ダイマーがｈＶＥＧＦ₁₂₁ダイマーに変換する過
程をイオン交換ＨＰＬＣで辿った。この変換効率およびＮ末端配列を自動エドマ
ン分解ペプチド配列決定によって確認した。

【０１１９】ＨＴ−ＤＡＰ−１切断反応から生成する反応混合物を１ｍｇ／ｍＬタンパク質
になるように希釈し、そして０．９Ｍ硫酸アンモニウム、２５ｍＭ酢酸ナトリウ
ム、ｐＨ４に調節した。０．２μｍに濾過した後（ＭｉｌｌｅｘＧＰ−５０フ
ィルター、Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）、混合物をＴｏｙｏｐｅａｒｌブチル−６５０Ｍ
（ＴｏｓｏＨａａｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｅ，ＰＡ）のカラムに適用し
た。カラムに結合したタンパク質を２５ｍＭ酢酸ナトリウム、１．０Ｍ硫酸アン
モニウム、ｐＨ４で洗浄し、次いで０．７Ｍ、０．３Ｍおよび０．１５Ｍ硫酸ア
ンモニウムを含む２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４の緩衝液で段階的に溶出した
。カラム溶出液のＵＶ吸光度を２８０ｎｍでモニターした。各段階から画分を集
め、逆相ＨＰＬＣによって、２つのさらなるシステイン部分を含む所望のｈＶＥ
ＧＦ₁₂₁ダイマー型の存在についてアッセイした。高比率のこの所望のｈＶＥＧ
Ｆ₁₂₁ダイマーを含む画分をプールした。ＰｅｌｌｉｃｏｎＸＬＢｉｏｍａ
ｘ−５メンブレンカセット（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）を用いて限外濾過を行い、プー
ルした画分を濃縮した。得られた溶液を酢酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ
４）で希釈して、その溶液の導電率を最後のカラムの精製段階（ＳＰ−５ＰＷイ
オン交換クロマトグラフィー）に結合するｈＶＥＧＦ₁₂₁ダイマータンパク質に
適合性のレベルまで低下させた。

【０１２０】Ｔｏｙｏｐｅａｒｌブチルカラムクロマトグラフィーからの希釈プールを、３
０ｍＭ酢酸ナトリウム、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ５．０中で平衡化したＳＰ
−５ＰＷ３０μｍ樹脂（ＴｏｓｏＨａａｓ）カラムに適用した。カラム溶出液の
ＵＶ吸光度を２８０ｎｍでモニターした。担持後、カラムを平衡緩衝液で洗浄し
、次いで結合タンパク質を５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０中の、１００
〜３００ｍＭＮａＣｌの直線勾配で溶出した。画分を、ｈＶＥＧＦ₁₂₁ダイマ
ーの含有量および純度について、イオン交換ＨＰＬＣでアッセイした。所望の純
度でｈＶＥＧＦ₁₂₁ダイマー（２つのさらなるシステインが付加した形態）を含
む画分をプールし、そしてこの緩衝液を、ＰｅｌｌｉｃｏｎＸＬＢｉｏｍａ
ｘ−５限外濾過デバイスおよびＬａｂｓｃａｌｅＴＦＦシステム（Ｍｉｌｉｐ
ｏｒｅ）を使用する限外濾過／透析濾過によって、２０ｍＭクエン酸ナトリウム
、１ｍＭＥＤＴＡ、９％（ｗ／ｖ）スクロース、ｐＨ５．０に交換した。この
溶液を０．２μｍに濾過し（Ｓｔｅｒｉｖｅｘ−ＧＰ−フィルター，Ｍｉｌｉｐ
ｏｒｅ）、次いで−７０℃で凍結した。

【０１２１】（Ｄ．Ｅ．ｃｏｌｉ由来ｈＶＥＧＦ₁₂₁ダイマー産物の分析）最終産物の質量をＬＣ−ＭＳ分析によって決定した。この分析ではさらに、他
の形態のｈＶＥＧＦ₁₂₁ダイマーが最終混合物に存在するか否かも検査した。Ｌ
Ｃ−ＭＳデータは、以下の二つの型の分子がこの産物中に存在することを示した
：質量２８，３６５ａｍｕを有する主要型（アミノ酸１〜１２１および２個の付
加的システイン部分を含むｈＶＥＧＦ₁₂₁ダイマーの予想質量）；ならびに２８
，１３４ａｍｕの質量を有するマイナー型（アミノ酸１〜１２１を含み、付加的
システインは含まないｈＶＥＧＦ₁₂₁ダイマーの予想質量と一致する）。逆相Ｈ
ＰＬＣ分析もまた、産物中のこれら二つの型の存在を示し、そしてそれらの型が
約９３％の高質量型および７％の低質量型の相対的濃度で存在することを示した
。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、産物が主にダイマーの形態で存在することを確認した。
アミノ末端アミノ酸配列決定は、産物の９６〜９７％が予想配列（Ａｌａ−Ｐｒ
ｏ−．．．）で開始することを実証した。この産物の残りは残基−２（Ｍｅｔ−
Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−．．．；０．８〜１％）、残基−１（Ｌｙｓ−Ａｌａ
−Ｐｒｏ−．．．；０．４〜０．７％）、または残基５（Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｙ−Ｇｌｙ．．．；１．６〜１．７％）で開始した。サーモリシン消化とそれに
続くＬＣ−ＭＳは、大部分のｈＶＥＧＦ₁₂₁産物において、位置１１６のシステ
イン残基に結合した付加的システイン部分の存在を確認した。

【０１２２】（実施例３）（ＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓにおけるｈＶＥＧＦ₁₂₁の産生）（Ａ．ｈＶＥＧＦ₁₂₁Ｎ７５Ｑを産生するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞株の生成
）ベクター：ｈＶＥＧＦ₁₂₁をＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓに直接発現するために作ら
れたプラスミド発現ベクター（ｐＡＮ１０３）を図９に示す。成熟ｈＶＥＧＦ₁₂ ₁ モノマー一次構造の１２１アミノ酸をコードするｃＤＮＡを、コドン７５にお
いて、この位置でコードされるアミノ酸がアスパラギンからグルタミンに変化す
るように改変した。従って、得られたｃＤＮＡは、ＶＥＧＦ₁₂₁のＮ７５０改変
体形態をコードした。この変化を行い、野生型ＶＥＧＦモノマー配列の残基７５
に見いだされるＮ−結合グリコシル化部位を除去した。変化したｃＤＮＡ配列を
、次いでＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｅｘｏ−１，３
−β−グルカナーゼタンパク質の分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ配列（「
ＥＸＧ１ｓｓ」）の５’末端にインフレームで融合した。パイロット実験にお
いて、このシグナル配列はＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主細胞から組換えｈＶＥＧＦ ₁₂₁ 産物の分泌を起こすことに関して、ネイティブなヒトＶＥＧＦシグナル配列
より効率的であることが見出された。これらのパイロット実験はさらに、Ｓ．ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅα因子遺伝子によってコードされるシグナル配列を用いて、
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓからのｈＶＥＧＦ₁₂₁の分泌も促進し得ることを示した。
ｐＡＮ１０３において、ハイブリッドｃＤＮＡ（ＶＥＧＦ₁₂₁モノマー配列にＥ
ＸＧ１シグナル配列を結合する融合タンパク質をコードする）を、Ｐ．ｐａｓｔ
ｏｒｉｓアルコールオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）遺伝子のためのプロモーター（
「５’ＡＯＸ１ｐ」）に作動可能に連結した。ＡＯＸ１プロモーターから開始す
る転写は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓがグルコースまたはグリセロール上に増殖する
場合には検出できない程低いが、それらの細胞にメタノールを炭素源として与え
た場合には、劇的に上方制御される。ＡＯＸ１遺伝子の３’末端（「３’ＡＯＸ
Ｔｅｒｍ」）を、転写終止シグナルを提供するために上記ハイブリッドｃＤＮ
Ａの下流に置いた。このベクターはまた、ヒスチジノール脱水素酵素（ＨＩＳ４
）をコードする野生型Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ遺伝子を保持し、ｈｉｓ４宿主細胞
中のプラスミドの選択を可能にした。さらに、このベクターはアンピシリン耐性
をコードし、そしてＣｏｌＥ１複製開始点を保持し、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ宿主
細胞に導入する前のＥ．ｃｏｌｉにおける操作を可能にした。

【０１２３】ｈＶＥＧＦ₁₂₁Ｎ７５Ｑを発現するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞株の選択：プラ
スミドｐＡＮ１０３をＳａｌＩで消化し、これはこのプラスミドをＨＩＳ４配列
内で１回切断した。得られた線状ＤＮＡを、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓｍｕｔ＋（
メタノール利用が効率的）株ＧＳ１１５へのエレクトロポレーションによって形
質転換した。ヒスチジン欠乏固体寒天培地（ＲＤＢプレート［１８．６％（ｗ／
ｖ）ソルビトール、２％（ｗ／ｖ）グルコース、１．３４％（ｗ／ｖ）酵母窒素
塩基、０．４ｇ／ｍｌビオチン、２％（ｗ／ｖ）寒天］）上にプレーティングし
、そして３０℃でインキュベートすることによってヒスチジン原栄養性（ｐｒｏ
ｔｏｔｒｏｐｈｙ）の獲得に関して細胞を選択した。ＡＯＸ１のゲノムコピーが
崩壊しないことを確認するために、それらのコロニーを、３０℃での最小メタノ
ールプレート上で増殖する能力も検査した。分泌ｈＶＥＧＦ₁₂₁の発現を検査す
るために、ＲＤＢプレートから得られた単一コロニーを最初に２ｍｌ緩衝最小グ
リセロールＹＥ／ペプトン（ＢＭＧＹ）培地に接種し、３０℃で振盪しながら一
晩増殖させた。各培養物中の細胞を遠心分離によって集め、緩衝最小メタノール
ＹＥ／ペプトン（ＢＭＭＹ）培地に再懸濁し、次いで３０℃のシェーカー中で４
８時間インキュベートしてｈＶＥＧＦ₁₂₁を発現させた。産生したｈＶＥＧＦ₁₂₁ レベルを測定するために、細胞培養物の上清のアリコートをドット−ブロット、
酵素結合イムノアッセイ法（ＥＬＩＳＡ）、ならびに／またはドデシル硫酸ナト
リウムポリアクリルゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびそれに続くタン
パク質染色またはウェスタン・ブロット法で分析した。抗ヒトＶＥＧＦ抗体（Ｒ
＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を製造者の使用説明書
にしたがって用い、ドット−ブロットおよびウェスタン分析によって産物を検出
した。使用したＥＬＩＳＡキットもまた、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓから入手した
。これらの分析に基づき、一つのクローン（ＡＢＬ１８９）がｈＶＥＧＦ₁₂₁の
大規模生産に使用するために選択された。

【０１２４】（Ｂ．Ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ発酵法による組換えｈＶＥＧＦ₁₂₁Ｎ７５Ｑの産生
）ｈＶＥＧＦ₁₂₁Ｎ７５Ｑの酵素バッチの製造プロセスを、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉ
ｓ菌株ＡＢＬ１８９の画線（ｓｔｒｅａｋ）プレートから得た単一コロニーか、
またはＡＢＬ１８９細胞の解凍された保存バイアルからの２５μＬかのいずれか
を、ＹＹＧリン酸培地の２５〜５０ｍＬ培地に接種することによって開始した。
このＹＹＧリン酸培地は、１％（ｗ／ｖ）酵母抽出物、１．３４％（ｗ／ｖ）酵
母窒素塩基、０．４μｇ／ｍＬビオチン、２％（ｖ／ｖ）グリセロール、および
０．１２５Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．０からなる。この培地をバッフル付き２５
０または５００ｍＬ振動フラスコ中で３０℃で振動しながら一晩インキュベート
した。次いで培養物のアリコートを用いて、３．８Ｌバッフル付きＦｅｒｎｂａ
ｃｈフラスコ中のＹＹＧリン酸培地２５０ｍＬに接種した。消泡剤約５滴を加え
て起泡を抑制した。Ｆｅｒｎｂａｃｈフラスコを３０℃で一晩振とうし、約４０
〜６０の光学密度（ＯＤ_590nm）にした。この培養物を用いて、Ｐｉｃｈｉａ発
酵タンク培地８．０Ｌを含む１０−Ｌ発酵槽に接種した（表２を参照のこと）。
発酵タンクの最初のＯＤ_590nmが約０．２５になるように十分な量の接種物を接
種した。発酵温度を３０℃に制御した。インペラー回転速度１０００ｒｐｍを用
いて培養物を撹拌し、１６．７Ｌ／ｍｉｎの通気を行った。発酵培養物のｐＨを
、２Ｍ燐酸および１４．８Ｍ水酸化アンモニウムの添加によって維持した。発酵
の最初のバッチ期の間に、培養物のｐＨを４．５に維持した。必要に応じて消泡
剤を加えた。

【０１２５】約１５〜１９時間のバッチ増殖後、培地のグリセロールは枯渇した。これは発
酵培養物中の溶解酸素（ＤＯ）レベルの急激な上昇によって明らかになった。溶
解酸素レベルの上昇は、培養の前誘導期の開始をトリガーし、その際グリセロー
ル供給物が制御された速度で加えられ（供給速度が１２０ｍＬ／ｈｒを超えない
ように制限されて）、飽和の２５％のＤＯレベルを維持した。５０％グリセロー
ルならびに１．２％ＰＴＭ１微量ミネラルおよびビオチンからなるグリセロール
供給（表３）は３〜６時間続けられた。

【０１２６】発酵の誘導期の開始には、グリセロール供給の停止、メタノール供給の開始、
および培養物のｐＨ６．０への調節が必要であった。１４．８Ｍ水酸化アンモニ
ウムを１〜２時間にわたって添加することによって、ｐＨの変化を達成した。メ
タノール供給は、ビオチンを含む１．２％ＰＴＭ１微量ミネラルを補充したメタ
ノールからなる。最大メタノール供給速度は最初は２０ｍｌ／ｈｒであった。３
時間後にはそれは６０ｍｌ／ｈｒに増加し、さらに１時間後には１００ｍｌ／ｈ
ｒに増加した。最大メタノール供給速度は回収するまで１００ｍｌ／ｈｒのまま
であった。ＤＯレベルが２５％より低くなった場合には、最大速度未満で供給す
るように供給調節をプログラムした。

【０１２７】発酵槽から定期的にサンプルを取り、分析した。誘導期中のサンプリングの一
部として、メタノール供給を短期間止め、ＤＯが１０％増加する時間を測定した
。このＤＯ応答時間を用いて、メタノールが発酵槽に蓄積しつつあるか否かを判
断した。１分より長い時間は、細胞に対して有毒となり得る程度にまでメタノー
ルが供給過剰になっていることを示した。このような場合はメタノール供給速度
を減らした。

【０１２８】接種後約９０時間目で発酵槽から回収した。回収する際には発酵槽含有物を冷
却し、２Ｍ燐酸を添加して培養物のｐＨを４．０に調節した。発酵ブロスを遠心
分離によって澄明にし、上清を濾過し、そしてｈＶＥＧＦ₁₂₁ダイマー産物の精
製を開始するまで冷凍保存した。

【０１２９】

【表２】

【０１３０】

【表３】（Ｃ．Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ由来ｈＶＥＧＦ₁₂₁Ｎ７５Ｑダイマーの精製）発酵槽からの濾過上清を最初に、ｐＨ３またはｐＨ４のいずれかで５０ｍＭリ
ン酸ナトリウム中で平衡化したＳＰ−セファロース（ＳＰ−Ｓｔｒｅａｍｌｉｎ
ｅ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）上でｐＨ４．０でクロ
マトグラフィーにかけた。上記上澄液をカラムに担持させた後、そのカラムを０
．２ＭＮａＣｌを含む平衡緩衝液で洗浄した。カラムに結合したＶＥＧＦ₁₂₁
Ｎ７５Ｑ産物を、１．０ＭＮａＣｌを含む平衡緩衝液で溶出した。あるいは、
ＶＥＧＦ₁₂₁溶出のために平衡緩衝液中０．４Ｍ〜１ＭＮａＣｌの勾配を用い
た。溶出液を１．２Ｍ硫酸アンモニウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．
０に調節し、そして５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、１．２Ｍ硫酸アン
モニウムで平衡化したオクチル−セファロース速流カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
）に担持させた。カラム平衡緩衝液で洗浄後、そのカラムに結合したタンパク質
を、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、中の１．２Ｍ〜０Ｍ硫酸アンモニ
ウムの勾配で溶出した。カラム溶出液からの画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、
その後クーマシー染色によって分析し、ＶＥＧＦ₁₂₁産物を含む画分を同定した
。所望の画分をプールし、そして２０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、０．３ＭＮ
ａＣｌに調節し、次いで２０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、０．３ＭＮａＣｌで
平衡化した［Ｚｎ²⁺］−キレート化セファロース速流カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）にロードした。カラムをカラム平衡緩衝液で洗浄し、結合タンパク質を２０
ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、０．３ＭＮａＣｌ中のイミダゾール勾配（０〜６
０ｍＭ）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってＶＥＧＦ₁₂₁を含むことが判明
した画分をプールし、ＹＭ５膜を用いて撹拌セル中で濃縮し、次いで２３．５％
アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸中で平衡化したＶｙｄａｃＣ４分
取スケール逆相ＨＰＬＣカラム（ＴｈｅＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓＧｒｏｕｐ
，Ｈｅｓｐｅｒｉａ，ＣＡ）上にロードした。結合タンパク質を０．１％トリフ
ルオロ酢酸中のアセトニトリル勾配（２３．５〜３３．４％）で溶出した。溶出
プロフィールにおいて主要なタンパク質ピークを手動で集め、凍結乾燥し、リン
酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に再懸濁し、０．２２μｍフィルターを通して
濾過することによって滅菌し、そして冷凍保存した。溶出液の他のタンパク質ピ
ークもまた、いくつかの場合、集めて分析した。

【０１３１】（Ｄ．ｈＶＥＧＦ₁₂₁Ｎ７５Ｑ産物の分析）アミノ末端配列決定は、産物の９３〜９７％がネイティブなＶＥＧＦ₁₂₁配列
の位置５のグルタミン酸残基で始まることを示した；すなわち産物の大部分は予
想産物の最初の４アミノ酸が欠けていた。少量（０．３〜２．１％）の産物は残
基６（グリシン）、残基７（グリシン）、残基８（グリシン）、残基１１（ヒス
チジン）、残基１２（ヒスチジン）または残基１８（メチオニン）で始まった。
質量分析の結果、産物はダイマーであるが、残基１２１（アルギニン）も欠けて
いることが判明した。こうしてＰ．ｐａｓｔｏｒｉａ由来の最終産物の大部分は
、１１６残基の長さのモノマーからなるダイマーからなる。

【０１３２】質量分析データは、精製第一段階から集めたマイナーなピークのいくつかは２
つの付加的システイン部分か、または一つの付加的システイン部分およびグルタ
チオン部分（多分ＶＥＧＦ₁₂₁モノマーサブユニットの位置１１６のシステイン
にジスルフィド結合している）のいずれかを含んでいることも示した。しかしそ
のような付加的システインまたはシステイン含有ペプチドは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒ
ｉａから得られた主要なＶＥＧＦ₁₂₁産物には見られなかった。これらの結論は
、種々の産物のＧｌｕ−Ｃ消化、およびその後の質量分析および／または産物の
配列決定によって確認された。これらの分析は、主要産物のピークにおいて、各
モノマーサブユニットにおける位置１１６システインが、ＶＥＧＦダイマーの他
のＣｙｓ−１１６と対になって、第三の鎖内ジスルフィド結合を形成しているこ
とを確認した。

【０１３３】（実施例４）（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉａ由来のｈＶＥＧＦ₁₂₁Ｎ７５ＱダイマーのＣｙｓ−１
１６の選択的還元および得られる産物の不安定性の実証）（Ａ．残基位置１１６のシステインのジチオトレイトール（ＤＴＴ）による還
元）約８８０μｇのｈＶＥＧＦ₁₂₁Ｎ７５Ｑ（実施例３に記載のように調製された
主要産物ピーク物質）を０．４ｍＬリン酸緩衝生理食塩水中で１．６ｍＭＤＴ
Ｔと共に室温で６０分間インキュベートした。従って、この混合物中のＤＴＴ：
ＶＥＧＦモノマーのモル比は１０対１であった。０．１％トリフルオロ酢酸を最
終濃度０．０５％（ｖ／ｖ）になるまで加えることによって還元反応を停止した
。この反応物を、４０℃に加熱し、０．１％トリフルオロ酢酸中３０％アセトニ
トリルで平衡化した５μ Ｃ４２５０ｎｍ×４．６ｍｍ逆相ＨＰＬＣカラム（
ＹＭＣＣｏ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）にこの反応物をロードした。次いで、
結合した物質を０．１％トリフルオロ酢酸中アセトニトリル勾配（３０％〜３５
％）で、１ｍＬ／分の流速で溶出した。これらの条件下で、出発（非還元）Ｐ．
ｐａｓｔｏｒｉａ由来ｈＶＥＧＦ₁₂₁Ｎ７５Ｑ物質は約２４分で溶出した。ＤＴ
Ｔとのインキュベーションは、数種の生成物を生成し、そのなかにはこの勾配で
約１０分間で溶出する生成物（カラムから溶出した全物質の約４０％に相当する
）が含まれていた。このピークを集め、凍結乾燥した。

【０１３４】この１０分ピーク物質が、Ｃｙｓ−１１６の位置が選択的に還元されたＶＥＧ
Ｆダイマー生成物を表すことを確認するために、３度の分析を行った。第一に、
物質のアリコートを液体クロマトグラフィーと質量分析との組み合わせ分析（Ｌ
Ｃ−ＭＳ）に供した。これは２７，１１１の質量を示した−これは部分的に還元
された５−１２０ｈＶＥＧＦ₁₂₁Ｎ７５Ｑダイマーの予想質量と一致する。第二
に、新たに再懸濁した１０分ピーク物質を５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ
安息香酸）（ＤＴＮＢ）で滴定すると、２つの遊離メルカプトル基が各ダイマー
分子に存在することを示した。第三に、凍結乾燥した物質のさらなるサンプルを
０．１５ｍＬの脱気した５０ｍＭＴｒｉｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭ
ＥＤＴＡ、１０ｍＭヨード酢酸、ｐＨ８．５に再懸濁した。混合物を遮光して室
温で２時間インキュベートした。これらの条件下でヨード酢酸は遊離メルカプト
基と反応するが、タンパク質に既に存在するジスルフィド結合は破壊しない。平
衡化し、リン酸緩衝生理食塩水で溶出したＮＡＰ−５ゲル濾過カラム（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ）にこの混合物を適用することによって、カルボキシメチル化反応を
停止した。得られたタンパク質のアリコートのＬＣ−ＭＳ分析は２７，２２８．
８の質量を示した。これはダイマー１つあたり２つのカルボキシメチル化が存在
することと一致する。次いで、残りのヨードアセトアミド処理物質をエンドペプ
チダーゼＧｌｕ−Ｃで消化し、そして消化産物をアミノ末端配列決定に供した。
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉａ由来５−１２０ＶＥＧＦ₁₂₁ダイマー産物において、Ｇｌ
ｕ−Ｃは、ＶＥＧＦ₁₂₁の残基位置１１３および１１４のグルタミン酸残基の後
で切断した。そこで切断産物が３つ生成した。その一つは残基１１５〜１２０で
あった。こうして位置１１６のシステインの状態が配列決定の第二サイクルで明
らかにされた。このサイクルにおいて、カルボキシメチル化システインの定量的
回復があり、システインまたは未改変システインは認められなかった。従って、
この結果は、カルボキシメチル化反応の前には、部分的還元ＶＥＧＦの本質的に
全てが、２つの遊離メルカプト基を各モノマー位置１１６に一つづつ含むことを
確認した。

【０１３５】（Ｂ．部分的に還元されたＶＥＧＦ₁₂₁ダイマーの安定性試験）部分的に還元されたＶＥＧＦ（ＹＭＣＣ４カラムから単離された凍結乾燥１
０分ピーク物質）を脱気したリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁し、このアリコート
を直ちにＹＭＣＣ４カラムに再注入した。再懸濁したタンパク質の本質的に１
００％が１０分時点のピークとして溶出した（図１０Ａ）。次いで、再懸濁した
物質を３７℃でインキュベートし、そしてさらなるアリコートを種々の時点に取
り、Ｃ４ＨＰＬＣ分析を行った。クロマトグラフィーは、部分的に還元された
ＶＥＧＦが急速に変化を受けることを示した。例えば、図１０Ｃに示したように
、３７℃で６．５時間インキュベーション後には、溶出勾配において１０分の位
置に溶出したのは反応中のタンパク質の約４５％に過ぎなかった。タンパク質の
さらなる４５％は約２４分に溶出し、ある程度の物質がまた約１７分に溶出した
。３７℃、６．５時間のインキュベーションの終わりには、反応は２日間室温に
セットされた。その時点に採取されたサンプルのＣ４逆相ＨＰＬＣ分析は、混合
物中には出発材料（１０分に溶出するもの）は本質的に残っておらず、実質的に
全てのタンパク質が約２４分に溶出することを示した（図１０Ｄ）。

【０１３６】同様な安定性実験をｈＶＥＧＦ₁₂₁ダイマータンパク質を用いて行う。このタ
ンパク質では２つのさらなるシステインが分子中に存在し、それらはダイマーの
２つのＣｙｓ−１１６残基にジスルフィド結合している。以前の段落に記載した
実験で使用したのと同じＣ４逆相ＨＰＬＣ条件下で、この物質は溶出勾配で約１
１．５分で溶出した（図１１Ａ）。図１１Ｂ〜１１Ｄに示すように、この物質を
リン酸緩衝生理食塩水中で３７℃で６．５時間インキュベーションし、その後室
温で２日間インキュベーションを行うと、少なくとも逆相ＨＰＬＣ分析によって
判断した場合、分子には顕著な変化はほとんどなかった（あったとしてもごくわ
ずかであった）。

【０１３７】（実施例５）（ＨＵＶＥ細胞増殖アッセイ−ＢｒｄＵＥＬＩＳＡ）（アッセイ）９６−ウェルプレートをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中のヒトフィブロネ
クチン（Ｓｉｇｍａ，１μｇ／１００μｌ／ウェル）でコーティングした。プレ
ートを室温で４５分間インキュベートし、フィブロネクチン溶液を吸引し、この
プレートを空気中で２０〜３０分間乾燥した。細胞（ＨＵＶＥＣ，Ｃｌｏｎｅｔ
ｉｃｓ）をヒト内皮細胞無血清培地（Ｇｉｂｃｏ）および２％ウシ胎仔血清（Ｆ
ＢＳ）中１０００細胞／１００μｌ／ウェルでプレートし、各９６−ウェルプレ
ートの最初のカラムを無細胞とし、ブランクとして用いた。細胞は５％ＣＯ₂中
で３７℃で一晩（１８〜２４時間）インキュベートした。培地を１００μｌ／ウ
ェルの無血清培地および１％ＦＢＳに変え、そしてこのプレートを５％ＣＯ₂、
３７℃で２４時間インキュベートして細胞の増殖を停止した。

【０１３８】ＶＥＧＦ₁₂₁標準物および試験されるサンプルを無血清培地および０．１％ヒ
ト血清アルブミン（ＨＳＡ，Ｓｉｇｍａ）で１：３に逓減希釈した。希釈物１０
μｌをウェルに加えた。それを３７℃、５％ＣＯ₂で２４時間インキュベートし
た。細胞増殖ＥＬＩＳＡキット（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）か
らのブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）溶液をＧｉｂｃｏ無血清培地で１：１
００に希釈し、この溶液１２μｌを各ウェルに加えた。次いでこのプレートを３
７℃、５％ＣＯ₂で４〜５時間インキュベートした。バックグラウンドコントロ
ールとして使用するウェルではＢｒｄＵを除外した。

【０１３９】４〜５時間のインキュベーション後、培地を吸引し、ＥＬＩＳＡからの２００
μｌＦｉｘＤｅＮａｔ溶液を各ウェルに加え、そしてこのプレートを室温で３０
分間インキュベートした。ＦｉｘＤｅＮａｔを徹底的に吸引し、キットからの１
００μｌ抗−ＢｒｄＵ−ＰＯＤ（抗−ＢｒｄＵ−ペルオキシダーゼ）抗体溶液を
そのキットから各ウェルに加え（抗−Ｂｒｄ−ＰＯＤをＰＢＳで１：１００に希
釈したものおよび０．０５％ツイーン２０および０．５％ＨＳＡ）、そしてこの
プレートを室温で９０分間インキュベートした。ウェルを３００μｌ／ウェルの
ＰＢＳおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄し、そして１００μｌＴＭＢ
基質を加えた。この後に２０〜３０分間インキュベートし、比色測定の読み取り
に十分なだけ発色させた。さらに５０μｌ硫酸（５Ｎ）を加え、吸光度４５０ｎ
ｍで比色測定値を読んだ。

【０１４０】（結果）これらの結果を図１２に示す。グラフはＰｉｃｈｉａ由来Ｎ７５ＱＶＥＧＦ ₁₂₁ （ＶＥＧＦ₁₂₁標準物；主に３個の鎖間ジスルフィド結合を含む分子からなる
）対Ｅ．ｃｏｌｉ由来ＶＥＧＦ₁₂₁（主に２個のみの鎖間ジスルフィド結合を有
する分子からなり、Ｃｙｓ−１１６残基にジスルフィド結合した付加的外因性シ
ステインを有する）の、逓減希釈に応答して刺激されたＤＮＡ合成量を示す。グ
ラフのＸ軸はアッセイウェルに加えた増殖因子の最終濃度をｎｇ／ｍｌで示す。
Ｙ軸はアッセイの終わりに組み込まれたブロモデオキシウリジンを検出するため
のＢｒｄＵキット（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）の使用後、各ウ
ェルで記録された光学密度を表す。

【０１４１】ＶＥＧＦ₁₂₁標準物のＥＤ₅₀（最大増殖応答の１／２に到達するのに必要な増
殖因子の有効用量）は６．２７ｎｇ／ｍｌであり、一方Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＶＥ
ＧＦ₁₂₁は５．４８ｎｇ／ｍｌのＥＤ₅₀を示した。従って、このアッセイではＥ
．ｃｏｌｉ由来ＶＥＧＦ₁₂₁がＶＥＧＦ₁₂₁標準と比べて（ＶＥＧＦ₁₂₁標準より
かなり強力とは言わないまでも）同様に強力にＤＮＡ合成を促進した。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、シグナルペプチドを含むネイティブのｈＥＧＦ₁₂₁のアミノ酸配列お
よびコードするヌクレオチド配列を示す。シグナルペプチドおよび、上記シグナ
ルペプチドをコードするヌクレオチド配列には下線が引かれている。Ｃｙｓ−１
１６は二重アンダーラインでマークした。配列番号１は成熟ｈＶＥＧＦ₁₂₁ポリ
ペプチド（図１のアミノ酸１〜１２１）を示し；配列番号ＮＯ：２はシグナルペ
プチド（図１のアミノ酸−２６〜アミノ酸−１）を含むｈＶＥＧＦ₁₂₁ポリペプ
チドを示し；そして配列番号ＮＯ：３はシグナルペプチドを含むｈＶＥＧＦ₁₂₁
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す。

【図２】図２はＶＥＧＦｍＲＮＡの選択的スプライシングによって生成する種々の形
態のＶＥＧＦの略図である。ここでＶＥＧＦ遺伝子の８つのエキソンの各々によ
ってコードされるタンパク配列が番号付きボックスによってあらわされる。エキ
ソン１によっておよびエキソン２の最初の部分によって（細いボックスとして示
される）コードされるタンパク質配列はＶＥＧＦの分泌シグナル配列をあらわす
。

【図３】図３は、Ｃｙｓ−１１６が「Ｒ」残基にジスルフィド結合しているＶＥＧＦ₁₂ ₁ ダイマーの構造を図式的に示す。ここでＲはシステイン、またはシステイン含
有ペプチドである。

【図４】図４は、各モノマーのＣｙｓ−１１６が鎖間ジスルフィド結合に関与している
ＶＥＧＦ₁₂₁ダイマーの構造を図式的に説明するものである。

【図５】図５は、各モノマーのＣｙｓ−１１６が不対であるＶＥＧＦ₁₂₁ダイマーの構
造を図式的に説明するものである。

【図６】図６は、ＶＥＧＦ（８−１０９）ダイマーの結晶構造を説明する（ムラー（Ｍ
ｕｌｌｅｒ）ら、ＰＮＡＳＵＳＡ９４：７１９２−７１９７［１９９７］）
。鎖内ジスルフィド結合がＶＥＧＦモノマーの１０４−６１、１０２−５７およ
び２６−６８残基間に示され、一方、鎖間ジスルフィド結合はＶＥＧＦダイマー
を形成する２本の鎖のアミノ酸残基５１−６０と６０−５１との間に示される。

【図７】図７は、実施例１に記載されるように、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ
）細胞におけるｈＶＥＧＦ₁₂₁の発現に用いられる発現プラスミドの構造を示す
。

【図８】図８は、大腸菌発現プラスミドｐＡＮ１７９の略図である。

【図９】図９は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発現プラスミドｐＡＮ１０３の略図である。

【図１０】図１０および図１１は、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーを用いて行われた、
部分的に還元されたＶＥＧＦ₁₂₁ダイマー（図１０）および、各モノマーのＣｙ
ｓ−１１６が付加的システインにジスルフィド結合しているＶＥＧＦ₁₂₁ダイマ
ー（図１１）の比較安定性試験の結果を示す。

【図１１】図１０および図１１は、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーを用いて行われた、
部分的に還元されたＶＥＧＦ₁₂₁ダイマー（図１０）および、各モノマーのＣｙ
ｓ−１１６が付加的システインにジスルフィド結合しているＶＥＧＦ₁₂₁ダイマ
ー（図１１）の比較安定性試験の結果を示す。

【図１２】図１２は、ＨＵＶＥ細胞増殖アッセイ（ＢｒｄＵＥＬＩＳＡ）の結果を示す
。このグラフはＰｉｃｈｉａ由来Ｎ７５０ＶＥＧＦ₁₂₁（ＶＥＧＦ標準；主と
して３つの鎖間ジスルフィド結合を含む分子からなる）対大腸菌由来ＶＥＧＦ₁₂ ₁ （主として、鎖間ジスルフィド結合を２つだけ含み、Ｃｙｓ−１１６残基にジ
スルフィド結合した付加的外因性システインを含む分子からなる）の階段希釈に
応答して刺激されたＤＮＡ合成の量を示す。グラフのＸ軸はアッセイ・ウェル中
に加えられた増殖因子の最終濃度をｎｇ／ｍｌであらわし、Ｙ軸はアッセイの終
わりにＢｒｄＵキット（ベーリンガー・マンハイム）を使用して、挿入されたブ
ロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を検出した後に各ウェルで記録された光学密
度をあらわす。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年１２月１１日（２００１．１２．１１）

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 13/12 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ０７Ｋ 14/485 Ｃ１２Ｒ 1:19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/24 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ステイディス，ピーターエイ．アメリカ合衆国カリフォルニア 94025，メンロパーク，アパートメントエフ，フローレンスレーン 975 (72)発明者アドリアンセンズ，ピーターイザドアアメリカ合衆国カリフォルニア 94040，モンテインビュー，エルモンテアベニュー 1109 (72)発明者エイブラハム，ジュディスエイ．アメリカ合衆国カリフォルニア 95129，サンノゼ，カントリーレーン 4901 (72)発明者バルドウィン，パトリシアアンアメリカ合衆国カリフォルニア 94022，ロスアルトス，トーウッドレーン 531 (72)発明者ポリット，エヌ．ステファンアメリカ合衆国カリフォルニア 94024，ロスアルトス，キャンベルアベニュー 1037 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 CA05 DA06 EA04 GA11 HA01 HA03 4B064 AG02 CA02 CA19 DA01 4C084 AA02 AA06 AA07 BA01 BA08 BA22 BA23 BA26 CA25 CA53 CA56 CA59 DB52 DB57 NA05 NA14 ZA362 ZA422 ZA442 ZA812 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA40 DA20 EA24 FA32 FA73 FA74 GA10 GA23 GA25 HA05

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】第１および第２のモノマーからなる血管内皮増殖因子（ＶＥ
ＧＦ）ダイマーであって、該モノマーの各々は、配列番号１の少なくとも１１〜
１１６のアミノ酸を含むか、または配列番号１のアミノ酸１１〜１１６と少なく
とも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、そして配列番号１の１
１６位またはそれに対応する位置（Ｃｙｓ−１１６）にシステイン（Ｃｙｓ）を
保持し、ここで、各モノマーのＣｙｓ−１１６は、さらなる外来性Ｃｙｓにジス
ルフィド結合する、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ダイマー。
【請求項２】前記第１および第２のモノマーの少なくとも１つにおいて、
前記さらなるＣｙｓが、２〜５アミノ酸のペプチドの一部である、請求項１に記
載のＶＥＧＦダイマー。
【請求項３】前記ペプチドがグルタチオンである、請求項２に記載のＶＥ
ＧＦダイマー。
【請求項４】各モノマーが、Ｃｙｓ残基を介してグルタチオン部分にジス
ルフィド結合される、請求項３に記載のＶＥＧＦダイマー。
【請求項５】前記第１および第２のモノマーが、配列番号１のアミノ酸４
〜１１６を含む、請求項１に記載のＶＥＧＦダイマー。
【請求項６】前記第１および第２のモノマーが、配列番号１のアミノ酸１
〜１２０を含む、請求項１に記載のＶＥＧＦダイマー。
【請求項７】前記第１および第２のモノマーが、配列番号１のアミノ酸１
〜１２１を含む、請求項１に記載のＶＥＧＦダイマー。
【請求項８】前記第１および第２のモノマーが、配列番号１のアミノ酸５
〜１２０を含む、請求項１に記載のＶＥＧＦダイマー。
【請求項９】前記第１および第２のモノマーの少なくとも一方のモノマー
の長さが１２１アミノ酸を超えない、請求項１に記載のＶＥＧＦダイマー。
【請求項１０】前記第１および第２のモノマーの各々の長さが１２１アミ
ノ酸を超えない、請求項９に記載のＶＥＧＦダイマー。
【請求項１１】前記第１および第２のモノマーの各々の長さが、１１０ア
ミノ酸と１２１アミノ酸との間である、請求項１０に記載のＶＥＧＦダイマー。
【請求項１２】前記第１および第２のモノマーの両方がグリコシル化され
ている、請求項１に記載のＶＥＧＦダイマー。
【請求項１３】前記第１および第２のモノマーの少なくとも一方がグリコ
シル化されていない、請求項１に記載のＶＥＧＦダイマー。
【請求項１４】第１および第２のモノマーからなる血管内皮増殖因子（Ｖ
ＥＧＦ）ダイマーを、薬学的に受容可能なビヒクルとの混合物において含む組成
物であって、該モノマーの各々は、配列番号１の少なくともアミノ酸１１〜１１
６を含むか、または配列番号１のアミノ酸１１〜１１６と少なくとも約９０％の
配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、そして配列番号１の１１６位またはそ
れに対応する位置（Ｃｙｓ−１１６）にシステイン（Ｃｙｓ）を保持し、ここで
各モノマーのＣｙｓ−１１６は、さらなる外来性Ｃｙｓにジスルフィド結合する
、組成物。
【請求項１５】前記第１および第２のモノマーの少なくとも一方において
、前記さらなるＣｙｓが２〜５アミノ酸のペプチドの一部である、請求項１４に
記載の組成物。
【請求項１６】前記ペプチドがグルタチオンである、請求項１５に記載の
組成物。
【請求項１７】各モノマーが、Ｃｙｓ残基を介してグルタチオン部分とジ
スルフィド結合される、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】前記第１および第２のモノマーが、配列番号１のアミノ酸
４〜１１６を含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１９】前記第１および第２のモノマーが、配列番号１のアミノ酸
１〜１２０を含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２０】前記第１および第２のモノマーが、配列番号１のアミノ酸
１〜１２１を含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２１】前記第１および第２のモノマーが、配列番号１のアミノ酸
５〜１２０を含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２２】前記第１および第２のモノマーの両方がグリコシル化され
ている、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２３】前記第１および第２のモノマーの少なくとも一方がグリコ
シル化されていない、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２４】前記第１および第２のモノマーの各々がグリコシル化され
ていない、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２５】前記第１および第２のモノマーが、さらにＮ末端メチオニ
ン基を含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】ＶＥＧＦダイマーを本質的に含まない請求項２４に記載の
組成物であって、各モノマーの１１６位またはそれに対応する位置のシステイン
が鎖間ジスルフィド結合で結合している、組成物。
【請求項２７】ＶＥＧＦダイマーを本質的に含まない請求項２４に記載の
組成物であって、各モノマーの１１６位またはそれに対応する位置のシステイン
が不対である、組成物。
【請求項２８】少なくとも２つの血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ダイマー
を含有する組成物であって、該ダイマーの各々は、以下：（ａ）各モノマーが、配列番号１のアミノ酸１１〜１１６を含むか、または配
列番号１のアミノ酸１１〜１１６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するア
ミノ酸配列を含み、そして配列番号１の１１６位、またはそれに対応する位置（
Ｃｙｓ−１１６）にシステイン（Ｃｙｓ）を保持し、そして各モノマーのＣｙｓ
−１１６が、さらなる外来性Ｃｙｓにジスルフィド結合されるダイマー；（ｂ）各モノマーが、配列番号１のアミノ酸１１〜１１６を含むか、または配
列番号１のアミノ酸１１〜１１６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するア
ミノ酸配列を含み、そして配列番号１の１１６位にまたはそれに対応する位置（
Ｃｙｓ−１１６）にシステイン（Ｃｙｓ）を保持し、そして該２つのモノマーの
該Ｃｙｓ−１１６が、鎖間ジスルフィド結合で結合されるダイマー；および（ｃ）各モノマーが、配列番号１のアミノ酸１１〜１１６を含むか、または配
列番号１のアミノ酸１１〜１１６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するア
ミノ酸配列を含み、そして配列番号１の１１６位、またはそれに対応する位置（
Ｃｙｓ−１１６）にシステイン（Ｃｙｓ）を保持し、そしてモノマーの１つまた
は両方のＣｙｓ−１１６が不対であるダイマー；からなる群から選択される第１および第２のモノマーによって形成され、ここで
、該ダイマー（ａ）〜（ｃ）の各々において、該第１および第２のモノマーが独
立してグリコシル化されているか、またはグリコシル化されていない、組成物。
【請求項２９】ダイマー（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つにおいて、各モ
ノマーが配列番号１のアミノ酸１〜１２０を含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】ダイマー（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つにおいて、各モ
ノマーが配列番号１のアミノ酸１〜１２１を含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３１】各モノマーが配列番号１のアミノ酸１〜１２０を含み、そ
して各モノマーのＣｙｓ−１１６がさらなるＣｙｓにジスルフィド結合している
ダイマーを、主要成分として含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３２】前記主要成分が、存在するＶＥＧＦダイマーの量の少なく
とも約７５％を構成する、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】前記主要成分が、存在するＶＥＧＦダイマーの量の少なく
とも約８５％を構成する、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】前記主要成分が、存在するＶＥＧＦダイマーの量の少なく
とも約９５％を構成する、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】ＶＥＧＦポリペプチドを含有する組成物を提供するプロセ
スであって、ここで該ＶＥＧＦポリペプチドは少なくとも２つの血管内皮増殖因
子（ＶＥＧＦ）ダイマーを含み、該ダイマーの各々は、以下：（ａ）各モノマーが、配列番号１のアミノ酸１１〜１１６を含むか、または配
列番号１のアミノ酸１１〜１１６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するア
ミノ酸配列を含み、そして配列番号１の１１６位に対応する位置（Ｃｙｓ−１１
６）にシステイン（Ｃｙｓ）を保持し、そして各モノマーのＣｙｓ−１１６が、
さらなる外来性Ｃｙｓにジスルフィド結合されるダイマー；（ｂ）各モノマーが、配列番号１のアミノ酸１１〜１１６を含むか、または配
列番号１のアミノ酸１１〜１１６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するア
ミノ酸配列を含み、そして配列番号１の１１６位に対応する位置（Ｃｙｓ−１１
６）にシステイン（Ｃｙｓ）を保持し、そして該２つのモノマーの該Ｃｙｓ−１
１６が、鎖間ジスルフィド結合で結合されるダイマー；および（ｃ）各モノマーが、配列番号１のアミノ酸１１〜１１６を含むか、または配
列番号１のアミノ酸１１〜１１６と少なくとも約９０％の配列同一性を有するア
ミノ酸配列を含み、そして配列番号１の１１６位に対応する位置（Ｃｙｓ−１１
６）にシステインを保持し、そしてモノマーの１つまたは両方のＣｙｓ−１１６
が不対であるダイマー；からなる群から選択される第１および第２のモノマーから形成され、ここで該ダイマー（ａ）〜（ｃ）の各々において、該第１および第２のモノマ
ーは独立してグリコシル化されても、またはグリコシル化されていなくてもよく
、該プロセスは、以下：配列番号１のポリペプチドをコードするか、またはそのアミノ酸配列が配列番
号１のアミノ酸１１〜１１６と少なくとも約９０％の配列同一性をを有するポリ
ペプチドをコードし、操作可能な発現ベクター中に存在する外因性に付加したＤ
ＮＡ種を含む形質転換された宿主細胞を提供する工程、該宿主細胞を、該ＤＮＡの発現および該ＶＥＧＦポリペプチドの合成に適切な
条件下で培養する工程、ならびに該ＶＥＧＦポリペプチドを回収する工程を包含する、プロセス。
【請求項３６】前記ダイマー（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つにおいて、
各モノマーが配列番号１のアミノ酸１〜１２０を含む、請求項３５に記載のプロ
セス。
【請求項３７】前記ダイマー（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つにおいて、
各モノマーが配列番号１のアミノ酸１〜１２１を含む、請求項３５に記載のプロ
セス。
【請求項３８】前記ＶＥＧＦポリペプチドの少なくとも約９５％がグリコ
シル化されていない、請求項３５に記載のプロセス。
【請求項３９】前記ＶＥＧＦポリペプチドの少なくとも約９５％がＮ末端
メチオニン残基を欠く、請求項３５に記載のプロセス。
【請求項４０】前記ダイマー（ａ）が、配列番号１のアミノ酸１〜１２１
を含む、請求項３５に記載のプロセス。
【請求項４１】前記ダイマー（ａ）が、前記ＶＥＧＦポリペプチドの少な
くとも約８５％を構成する、請求項４０に記載のプロセス。
【請求項４２】前記ポリペプチドを精製する段階をさらに包含する、請求
項３５に記載のプロセス。
【請求項４３】前記形質転換した宿主細胞が細菌細胞である、請求項３５
に記載のプロセス。
【請求項４４】前記細菌細胞がＥ．ｃｏｌｉ細胞である、請求項４３に記
載のプロセス。
【請求項４５】請求項４３に記載のプロセスであって、ここで前記外因的
に付加されたＤＮＡが、アミノ末端（Ｎ末端）でＭｅｔ−（ＡＡ）_n−配列だけ
伸長された配列番号１のポリペプチドをコードし、ここでＭｅｔはメチオニンを
意味し、ｎは１〜７であり、そしてＡＡは同一または異なるアミノ酸を表し、こ
こで該ＡＡアミノ酸の少なくとも１つ、または該ＡＡアミノ酸の２つ以上の組み
合わせが、前記細菌宿主細胞によるＶＥＧＦポリペプチドの成熟Ｎ末端のタンパ
ク分解性の分解を遅延し得る、プロセス。
【請求項４６】ｎが１である、請求項４５に記載のプロセス。
【請求項４７】ＡＡが、リジン（Ｌｙｓ）残基およびアルギニン（Ａｒｇ
）残基からなる群から選択されるアミノ酸を表す、請求項４６に記載のプロセス
。
【請求項４８】ＡＡがリジン（Ｌｙｓ）残基を表す、請求項４７に記載の
プロセス。
【請求項４９】前記ＶＥＧＦポリペプチドを精製する工程をさらに包含す
る、請求項４５に記載のプロセス。
【請求項５０】少なくとも部分的な精製の後に、Ｎ末端Ｍｅｔ（ＡＡ）_n
−配列を除去する工程をさらに含む、請求項４９に記載のプロセス。
【請求項５１】除去が酵素消化によって行われる、請求項５０に記載のプ
ロセス。
【請求項５２】前記ＶＥＧＦポリペプチドをリフォールディングする工程
をさらに包含する、請求項４３に記載のプロセス。
【請求項５３】システインおよびシスチンを、ＶＥＧＦダイマーの所望の
混合物を生成するのに十分な量および十分な相互比率で含むリフォールディング
緩衝液中でリフォールディングを行う、請求項５２に記載のプロセス。
【請求項５４】２つのＶＥＧＦモノマーからなる血管内皮増殖因子（ＶＥ
ＧＦ）ダイマーを産生するプロセスであって、各モノマーは、配列番号１のアミ
ノ酸１１〜１１６を含むか、または配列番号１のアミノ酸１１〜１１６と少なく
とも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、そして配列番号１の１
１６位に対応する位置（Ｃｙｓ−１１６）にシステイン（Ｃｙｓ）を保持し、こ
こで各モノマーのＣｙｓ−１１６は、さらなる外来性Ｃｙｓにジスルフィド結合
され、該プロセスは、以下の工程：（ａ）アミノ末端（Ｎ末端）でＭｅｔ−（ＡＡ）_n−配列だけ伸長している配
列番号１のポリペプチドをコードし、操作可能な発現ベクターに存在する、外因
的に付加したＤＮＡ種を含む形質転換された細菌宿主細胞を提供する工程であっ
て、ここでＭｅｔはメチオニンを表し、ｎは１〜７であり、そしてＡＡは同一ま
たは異なるアミノ酸を表し、そして該ＡＡアミノ酸の少なくとも１つ、または該
ＡＡアミノ酸の２つ以上の組み合わせが、該細菌宿主細胞による該ＶＥＧＦポリ
ペプチドの成熟Ｎ末端のタンパク分解性の分解の遅延をブロックし得る、工程、（ｂ）該細菌宿主細胞を、該ＤＮＡの発現および該Ｎ末端伸長ＶＥＧＦモノマ
ーの合成に適切な条件下で培養する工程、ならびに（ｃ）前記ＶＥＧＦダイマーを回収する工程、を包含する、プロセス。
【請求項５５】ｎが１である、請求項５４に記載のプロセス。
【請求項５６】ＡＡが、リジン（Ｌｙｓ）残基およびアルギニン（Ａｒｇ
）残基からなる群から選択されるアミノ酸を表す、請求項５５に記載のプロセス
。
【請求項５７】ＡＡがリジン（Ｌｙｓ）残基を表す、請求項５６に記載の
プロセス。
【請求項５８】前記ＶＥＧＦダイマーを精製する工程をさらに包含する、
請求項５４に記載のプロセス。
【請求項５９】少なくとも部分的な精製の後に、Ｎ末端Ｍｅｔ−（ＡＡ） _n −配列を除去することをさらに含む、請求項５８に記載のプロセス。
【請求項６０】除去が酵素消化によって行われる、請求項５９に記載のプ
ロセス。
【請求項６１】前記ＶＥＧＦダイマーをリフォールディングする工程をさ
らに包含する、請求項５４に記載のプロセス。
【請求項６２】前記ＶＥＧＦダイマーをリフォールディングする工程をさ
らに包含する、請求項５６に記載のプロセス。
【請求項６３】前記ＶＥＧＦダイマーをリフォールディングする工程をさ
らに包含する、請求項５９に記載のプロセス。
【請求項６４】リフォールディングが、システインおよびシスチンを含む
リフォールディング緩衝液中で行われる、請求項６３に記載のプロセス。
【請求項６５】細菌性宿主細胞中での産生の間に、ポリペプチドの成熟ア
ミノ末端（Ｎ末端）からの１つ以上のアミノ酸の除去をブロックするプロセスで
あって、該細菌性宿主細胞を、Ｎ末端でＭｅｔ−（ＡＡ）_n配列だけ伸長した該
ポリペプチドをコードするＤＮＡで形質転換する工程を包含し、ここでＭｅｔは
メチオニンをあらわし、ｎは１〜７であり、そしてＡＡは同一または異なるアミ
ノ酸を表し、ここで該ＡＡアミノ酸の少なくとも１つ、または該ＡＡアミノ酸の
２つ以上の組み合わせが、該細菌宿主細胞による該ポリペプチドの成熟Ｎ末端の
タンパク分解性の分解を遅延し得る、プロセス。
【請求項６６】前記ポリペプチドが１００アミノ酸より長い、請求項６５
に記載のプロセス。
【請求項６７】前記ポリペプチドがＶＥＧＦ分子である、請求項６６に記
載のプロセス。
【請求項６８】新脈管形成または管脈リモデリングを誘導する方法であっ
て、請求項３５に記載の組成物の有効量を、必要とする患者に投与する工程を包
含する、方法。
【請求項６９】末梢動脈疾患を処置する方法であって、請求項３５に記載
の組成物の有効量を、必要とする患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項７０】冠状動脈疾患を処置する方法であって、請求項３５に記載
の組成物の有効量を、必要とする患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項７１】本態性高血圧を処置する方法であって、請求項３５に記載
の組成物の有効量を、必要とする患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項７２】微小血管障害を処置する方法であって、請求項３５に記載
の組成物の有効量を、必要とする患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項７３】多発性嚢胞腎疾患を処置する方法であって、請求項３５に
記載の組成物の有効量を、必要とする患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項７４】血管内皮細胞層を修復する方法であって、請求項３５に記
載の組成物の有効量を、必要とする患者に投与する工程を包含する、方法。