JPH10309191A - 血管内皮細胞増殖因子の製造 - Google Patents

血管内皮細胞増殖因子の製造

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JPH10309191A
JPH10309191A JP10111201A JP11120198A JPH10309191A JP H10309191 A JPH10309191 A JP H10309191A JP 10111201 A JP10111201 A JP 10111201A JP 11120198 A JP11120198 A JP 11120198A JP H10309191 A JPH10309191 A JP H10309191A
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growth factor
vascular endothelial
sequence
cell growth
endothelial cell
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Edmund G Tischer
ジー． ティッシャー エドマンド
Judith A Abraham
エイ． アブラハム ジュディス
John C Fiddes
シー． フィデス ジョン
Richard L Mitchell
エル． ミッチェル リチャード
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Scios LLC
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 血管内皮細胞に対して分裂促進性があり、従
って新たな血管新生（脈管形成）および血管内表面の内
皮新生を促進するのに有用な創傷治癒剤の製造方法を提
供すること、ならびに、組換えＤＮＡ技術によって血管
内皮細胞増殖因子を製造する方法および手段を提供する
こと。 【解決手段】 哺乳動物の血管内皮細胞増殖因子をコー
ドする単離されたＤＮＡ配列。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、創傷治癒の分野に
関する。特に本発明は、血管内皮細胞に対して分裂促進
性があり、従って新たな血管新生（脈管形成）および血
管内表面の内皮新生を促進するのに有用な創傷治癒剤の
製造に関する。本発明は、組換えＤＮＡ技術によって血
管内皮細胞増殖因子を製造する方法および手段を提供す
る。
【０００２】
【従来の技術】発明の背景 脈管形成、すなわち新しい毛細血管の増殖は、多くの型
の創傷の適正な治癒に決定的に重要なプロセスである。
従って、脈管形成を促進し得る因子は、創傷治癒剤とし
て有用である。脈管形成は複数工程のプロセスであり、
毛細血管内皮細胞の増殖、移動、および組織浸透を含
む。塩基性および酸性の線維芽細胞増殖因子、形質転換
増殖因子α、および表皮増殖因子を含む、多くの公知の
増殖因子は、様々な細胞の型に対し広く分裂促進性であ
り、そして脈管形成性である。従って、このような因子
は、潜在的に組織の修復を促進するのに有用である。多
くの型の創傷治癒への適用では、広範囲の細胞分裂促進
性が望ましい。しかし、より細胞特異的な分裂促進活性
を有することが望ましい特異的な型の創傷治癒への適用
もある。例えば、血管移植手術、バルーン血管形成、あ
るいは心筋梗塞発症後の患者で側副血行を促進する場
合、血管内皮細胞に高度に特異的な分裂促進活性を有す
る、細胞分裂促進因子を導入した創傷治癒剤を用いるこ
とが望ましい。なぜならば内皮細胞の増殖と共に他の細
胞の型が増殖すると、血流のブロックおよび／あるいは
減少が引き起こされ得るからである。現在のところ、こ
の型の適用に広く利用できる非常に適切な細胞分裂促進
因子はない。
【０００３】最近、明らかに血管内皮細胞に特異的な分
裂促進物質が、ウシ濾胞星状細胞（bovine folliculo s
tellate cells）の馴化培地から単離された。そしてそ
の部分的なアミノ酸配列が決定された（Gospodarowicz
ら、PNAS(1989) 88(19):7311-7315:FerraraおよびHenze
l、BBRC(1989) 161(2):851-858）。この因子は、２つの
約23kDのサブユニットのホモダイマーのようである。Go
spodarowiczら、およびFerarraらが記載の、このウシタ
ンパク質に部分的に相同性のあるマウスの相同物因子
が、マウスAtT20細胞（ATCC CCL 89）の馴化培地から単
離されており、そのＮ末端側のアミノ酸配列が決定され
た（Plouёtら、EMBO J.(1989) 8(12):3801-3806）。両
方の因子は、血管内皮細胞に対する分裂促進活性を有し
ており、そして試験された他の細胞の型に対する分裂促
進活性は有さないことが示されている。従って、これら
の因子は、多くの型の創傷治癒への適用に有用である。
残念ながら、これらの因子をその天然原科からの精製に
よって商業的な量で得ることは、実用的および経済的で
ない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、血管
内皮細胞に対して分裂促進性があり、従って新たな血管
新生（脈管形成）および血管内表面の内皮新生を促進す
るのに有用な創傷治癒剤の製造方法を提供することであ
る。本発明の目的はまた、組換えＤＮＡ技術によって血
管内皮細胞増殖因子を製造する方法および手段を提供す
ることである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、哺乳動
物の血管内皮細胞増殖因子をコードする単離されたＤＮ
Ａ配列が提供される。
【０００６】１つの実施態様において、上記ＤＮＡ配列
は、図３ａのＤＮＡ配列と標準的なハイブリダイゼーシ
ョン条件下でハイブリダイズ可能である。
【０００７】１つの実施態様において、上記ＤＮＡ配列
は、ウシおよびヒトの血管内皮細胞増殖因子から選択さ
れる血管内皮細胞増殖因子をコードする。
【０００８】１つの実施態様において、上記ＤＮＡ配列
は、ウシ血管内皮細胞増殖因子をコードする。
【０００９】１つの実施態様において、上記ＤＮＡ配列
は、ｂＶＥＧＦ120およびｂＶＥＧＦ164から選択される
ウシ血管内皮細胞増殖因子をコードする。
【００１０】１つの実施態様において、上記ＤＮＡ配列
は、図６に示されるヌクレオチドの１位から492位を包
含する。
【００１１】１つの実施態様において、上記ＤＮＡ配列
は、図６に示されるヌクレオチドの１位から341位に続
いてヌクレオチド474位から492位を包含する。
【００１２】１つの実施態様において、上記ＤＮＡ配列
は、ヒト血管内皮細胞増殖因子をコードする。
【００１３】１つの実施態様において、上記ＤＮＡ配列
は、ｈＶＥＧＦ121およびｈＶＥＧＦ165から選択される
ヒト血管内皮細胞増殖因子をコードする。
【００１４】１つの実施態様において、上記ＤＮＡ配列
は、図７に示されるヌクレオチドの１位から495位の配
列を包含する。
【００１５】１つの実施態様において、上記ＤＮＡ配列
は、図７に示されるヌクレオチドの１位から344位に続
いてヌクレオチド477位から495位の配列を包含する。
【００１６】本発明によれば、哺乳動物の血管内皮細胞
増殖因子をコードするＤＮＡ配列が、宿主細胞中で直接
に該配列を発現することができる調節配列に作動可能に
連結されて包含される複製可能な発現ベクターが提供さ
れる。
【００１７】１つの実施態様では、本発明の発現ベクタ
ーにおいて、上記ＤＮＡコード配列は、図３ａのＤＮＡ
配列と標準的なハイブリダイゼーション条件下でハイブ
リダイズ可能な配列である。
【００１８】１つの実施態様では、本発明の発現ベクタ
ーにおいて、上記ＤＮＡコード配列は、ウシおよびヒト
の血管内皮細胞増殖因子から選択されるタンパク質をコ
ードする。
【００１９】１つの実施態様では、本発明の発現ベクタ
ーにおいて、上記ＤＮＡコード配列は、ｂＶＥＧＦ120
およびｂＶＥＧＦ164から選択されるタンパク質をコー
ドする。
【００２０】１つの実施態様では、本発明の発現ベクタ
ーにおいて、上記ＤＮＡコード配列は、図６に示される
ヌクレオチドの１位から492位の配列を包含する。
【００２１】１つの実施態様では、本発明の発現ベクタ
ーにおいて、上記ＤＮＡコード配列は、図６に示される
ヌクレオチドの１位から341位に続いてヌクレオチド474
位から492位を包含する。
【００２２】１つの実施態様では、本発明の発現ベクタ
ーにおいて、上記ＤＮＡコード配列は、ｈＶＥＧＦ121
およびｈＶＥＧＦ165から選択されるタンパク質をコー
ドする。
【００２３】１つの実施態様では、本発明の発現ベクタ
ーにおいて、上記ＤＮＡコード配列は、図７に示される
ヌクレオチドの１位から495位の配列を包含する。
【００２４】１つの実施態様では、本発明の発現ベクタ
ーにおいて、上記ＤＮＡコード配列は、図７に示される
ヌクレオチドの１位から344位に続いてヌクレオチド477
位から495位の配列を包含する。
【００２５】本発明によれば、上記の発現ベクターで形
質転換された宿主細胞が提供される。
【００２６】１つの実施態様では、本発明の形質転換さ
れた宿主細胞において、上記宿主細胞は、E．coliであ
る。
【００２７】１つの実施態様では、本発明の形質転換さ
れた宿主細胞において、上記宿主細胞は、真核細胞であ
る。
【００２８】１つの実施態様では、本発明の形質転換さ
れた宿主細胞において、上記宿主細胞は、CHO細胞であ
る。
【００２９】本発明によれば、血管内皮細胞増殖因子を
製造する方法が提供される。この方法は、（ａ）血管内
皮細胞増殖因子のポリペプチド鎖のアミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡ配列を包含する発現ベクターで形質転換さ
れた細胞を該ポリペプチドが発現される条件下で培養
し、（ｂ）発現された該ポリペプチドを回収し、および
（ｃ）該ポリペプチド鎖のジスルフィド結合を形成させ
る工程、を包含する。
【００３０】１つの実施態様では、本発明の製造方法に
おいて、上記ＤＮＡ配列は、ウシおよびヒトの血管内皮
細胞増殖因子から選択される血管内皮細胞増殖因子をコ
ードする。
【００３１】１つの実施態様では、本発明の製造方法に
おいて、上記ＤＮＡ配列は、ｂＶＥＧＦ120、ｂＶＥＧ
Ｆ164、ｈＶＥＧＦ121およびｈＶＥＧＦ165から選択さ
れるタンパク質をコードする。
【００３２】１つの実施態様では、本発明の製造方法に
おいて、上記宿主細胞は哺乳動物宿主細胞であり、そし
て生じる血管内皮細胞増殖因子はグリコシル化される。
【００３３】１つの実施態様では、本発明の製造方法に
おいて、上記細胞は哺乳動物細胞であり、そして前記Ｄ
ＮＡ配列は図８のエキソンＩ−ＶおよびVIIIによってコ
ードされる予測されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
配列である。
【００３４】１つの実施態様では、本発明の製造方法に
おいて、上記発現の結果、培養培地中に分泌された成熟
型ｈＶＥＧＦ121が得られる。
【００３５】本発明によれば、単離されたｂＶＥＧＦ
120が提供される。
【００３６】本発明によれば、単離されたｈＶＥＧＦ
121が提供される。
【００３７】１つの実施態様では、本発明の単離された
ｈＶＥＧＦ121は、７５位のアスパラギン（Asn）残基で
Ｎ-結合グリコシル化を包含する。
【００３８】１つの実施態様では、本発明の単離された
ｈＶＥＧＦ121は、約50％のｈＶＥＧＦ121がグリコシル
化されている。
【００３９】本発明によれば、単離されたｈＶＥＧＦ
165が提供される。
【００４０】本発明によれば、両方のサブユニットがど
ちらもグリコシル化されていないホモダイマーである単
離されたｈＶＥＧＦ121が提供される。
【００４１】本発明によれば、両方のサブユニットがグ
リコシル化されているホモダイマーである単離されたｈ
ＶＥＧＦ121が提供される。
【００４２】本発明によれば、サブユニットの一方がグ
リコシル化されており、他方のサブユニットがグリコシ
ル化されていないヘテロダイマーである単離されたｈＶ
ＥＧＦ121が提供される。
【００４３】本発明によれば、それぞれがｈＶＥＧＦ
121、ｈＶＥＧＦ165およびｈＶＰＦ189から選択され
る、２つの異なるサブユニット、からなるヘテロダイマ
ーを包含する、脈管形成の阻害に有用なタンパク質が提
供される。
【００４４】本発明によれば、血管内皮細胞増殖因子に
対する中和抗体の有効量を投与する治療を必要とする哺
乳動物に投与することを包含する、哺乳動物における脈
管形成を阻害する方法が提供される。
【００４５】１つの実施態様では、本発明の阻害方法に
おいて、上記哺乳動物はヒトであり、抗体は抗-ｈＶＥ
ＧＦ121である。
【００４６】本発明によれば、治療を必要とする個体
に、それぞれがｈＶＥＧＦ121、ｈＶＥＧＦ165およびｈ
ＶＰＦ189から選択される２つの異なるサブユニットか
らなるヘテロダイマーを包含するタンパク質の有効量を
投与することを包含する脈管形成を阻害する方法が提供
される。
【００４７】本発明によれば、116番目のシステイン残
基が異なるアミノ酸残基に置換されているｈＶＥＧＦ
121アナログが提供される。
【００４８】本発明によれば、160番目のシステイン残
基が異なるアミノ酸残基に置換されているｈＶＥＧＦ
165アナログが提供される。
【００４９】発明の要旨 本発明は、創傷治癒剤として用いるための血管内皮細胞
増殖因子を商業的規模の量得るための方法および手段を
提供する。特に本発明は、哺乳類動物の血管内皮細胞増
殖因子のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を提供す
る。これらのＤＮＡ配列は、発現ベクターの調節エレメ
ントの制御下に挿入される。このエレメントは、適切な
発現宿主の中で、コードされたアミノ酸配列の表現を行
わせる。このようにして発現させた血管内皮細胞増殖因
子は、回収され、そして脈管形成および／あるいは再内
皮新生が重要な役割を果たす、様々な創傷治癒への適用
に有用な薬学的組成物中に調合され得る。
【００５０】本明細書の血管内皮細胞増殖因子をコード
するＤＮＡ配列を提供する過程で、我々はこの因子に、
２つの異なった型のコーディング領域のmRNAが作られる
ことを発見した。これらの２つの型は、明らかに異なっ
たメッセージスプライシングから生じており、オープン
リーディングフレームの長さが異なっている。これは、
成熟タンパク質のコーディング領域の44個のコドンの挿
入の存在あるいは非存在による。予想される高い分子量
の方の因子は、ウシの場合164個のアミノ酸配列を含
み、そしてヒトの場合は165個のアミノ酸配列を含み、G
ospodarowiczら（前出）、およびFerraraおよびHenzel
（前出）によって単離された約23kDのサブユニットに相
当すると考えられる。挿入が欠如しているコーディング
領域から予想される新規な分子量の低い方の因子は、ウ
シの場合では120個のアミノ酸配列およびヒトの場合で
は121個のアミノ酸配列を含む。低分子量型は、アミノ
酸配列の長さが異なるだけでなく、高分子量の型には存
在しない、ウシタンパク質の114位のLys残基（ヒトタン
パク質では115位）の存在において異なっている。この
違いは、この位置に相当するコドン内で起こっているメ
ッセージスプライシングが異なるために起こる。便宜
上、これらの血管内皮細胞増殖因子の２つの型を、ウシ
因子ではそれぞれｂＶＥＧＦ164およびｂＶＥＧＦ
120（ヒト因子では、ｈＶＥＧＦ165およびｈＶＥＧＦ
121）と呼ぶ。
【００５１】121個のアミノ酸型のｈＶＥＧＦおよびこ
れに対応する120個のアミノ酸のウシタンパク質は、こ
のタンパク質の臨床上の使用に治療的な利点を提供する
という点で、ｈＶＥＧＦ165およびｂＶＥＧＦ164の性質
とは異なっている。特にｈＶＥＧＦ121およびｂＶＥＧ
Ｆ120はヘパリンに結合しないが、長い型の方は、強い
ヘパリン結合能によって特徴付けられる。ヘパリン結合
親和性がないことで、そのタンパク質がより血管内皮細
胞増殖因子のレセプターに結合しやすくなり、半減期お
よび循環系の中でのタンパク質の分布が増大される。
【００５２】驚くべきことに、Ｎ末端配列分析から推定
されるアミノ酸配列および単離されたＤＮＡ配列（図３
ａに示してある）は、ウシ血管内皮細胞増殖因子、およ
びヒト血小板由来増殖因子（PDGF）のサブユニットのＡ
鎖およびＢ鎖それぞれの、これに対応する配列との間に
有意なレベルの配列相同性があることを示す。このうち
８個のシステイン残基が、これら３つのすべての配列の
成熟型で完全に保存されている。従って、第一のポリペ
プチド鎖および第二のポリペプチド鎖を含むハイブリッ
ドのダイマータンパク質が調製され得る。ここで鎖のう
ちの１つは、血小板由来増殖因子のＡ鎖サブユニットあ
るいはＢ鎖サブユニットのアミノ酸配列の少なくとも一
部を含み、そしてもう一方の鎖は、血管内皮細胞増殖因
子のアミノ酸配列の少なくとも一部を含む。このような
ハイブリッドタンパク質の調製によって、このハイブリ
ッドが、血管内皮細胞増殖因子および血小板由来増殖因
子の細胞分裂促進活性の間のプロフィールを持つよう
に、分子の性質を「仕立てる」ことができるようにな
る。PDGF B-Bホモダイマーは、血管平滑筋細胞に対して
分裂促進性があり、血管内皮細胞に対してはない。逆
に、本発明の血管内皮細胞増殖因子は、逆の特異性を有
している。ハイブリッド因子は、両方のタイプの細胞を
刺激し得、従って、創傷治癒における、より広範囲の細
胞分裂促進剤として有用である。
【００５３】
【発明の実施の形態】本明細書の用語「血管内皮細胞増
殖因子」は、血管内皮細胞に対する分裂促進活性を有
し、そして以下の（ａ）、および（ｂ）である、哺乳類
動物のタンパク質を言う： （ａ）標準的なハイブリダイゼーションの条件下で、図
３ａに示したＤＮＡ配列にハイブリダイズし得るＤＮＡ
配列にコードされるアミノ酸配列を有するか、あるいは
（ｂ）図６および図７に示された、ｂＶＥＧＦ120、ｂ
ＶＥＧＦ164、ｈＶＥＧＦ121あるいはｈＶＥＧＦ165の
アミノ酸配列に実質的に相同である。
【００５４】本明細書では、関連のタンパク質と比較し
て、アミノ酸配列の相同性のレベルが少なくとも50％で
あり、そして好ましくは少なくとも80％であるとき、
「実質的に相同である」と考えられる。本明細書の用語
「標準的なハイブリダイゼーション条件」とは、プレハ
イブリダイゼーション／ハイブリダイゼーションバッフ
ァーとして40％のホルムアミドバッファーを用い（以下
に記載）、そして50℃で１×SSC、0.1％SDS中で洗浄す
ることを言う。
【００５５】本明細書で用いられている、血管内皮細胞
増殖因子のアミノ酸配列の番号付けシステムは、タンパ
ク質の成熟型、すなわち翻訳後のプロセシングがなされ
た型に基づいている。従って、ウシあるいはヒトタンパ
ク質中で１番とされる残基は、アラニンであり、これら
のタンパク質の単離された成熟型の第一番目の残基であ
る。
【００５６】血管内皮細胞に対する細胞分裂促進活性
は、標的細胞として、副腎皮質由来の毛細血管内皮細胞
（ACE細胞）を用いるアッセイによって測定され得る。
このアッセイは、実質的には、本明細書で参考として援
用されている、GospodarowiczらのJ. Cell Physiol.(19
86) 127:121-136)に記載されているように行われる。一
般的には、ACE細胞のストックの培養物を10％仔牛血清
を補充したダルベッコ変法イーグル培地（DMEM-21）の
存在下で維持する。抗生物質のペニシリン（50IU/m
l）、ストレプトマイシン（50μg/ml）、ゲンタマイシ
ン（50μｇ/ml）、およびファンジゾーン（0.25μg/m
l）および２mMのＬ-グルタミンもまた培地に添加し得
る。細胞を組織細胞ディッシュに分配比１：40および
１：200との間（好ましい分配比では、T75フラスコの15
mlの培地中に2.5×105の細胞が存在する）で毎週継代し
ていく。細胞分裂促進アッセイのために、Gospodarowic
zら、Europ. J. Cell. Biol. (1988) 46:144-151に記載
のように、12ウェルクラスタープレートに、１ウェルあ
たり10％仔牛血清および抗生物質を補充した１mlのダル
ベッコ変法イーグル培地中の５×103個の細胞密度の細
胞を蒔く。あるいは、GospodarowiczらJ. Cell. Physio
l.(1986) 127:121-136に記載のように、ACE細胞を、35m
mディッシュあるいは６ウェルクラスタープレートに、
１つのディッシュ当りあるいはウェル当り、２mlの培地
中の５〜10×103個の密度の細胞をプレートする。次に
それぞれのサンプルの適当な希釈物の10μlずつを、０
日目および２日目に２つあるいは３つのウェルに分注す
る。培養の４あるいは５日後にプレートをトリプシン処
理し、そしてコールターカウンターで細胞密度を測定す
る。本明細書で記載する目的では、このアッセイの最後
において、因子を添加しなかったコントロールウェルの
細胞密度の少なくとも1.5倍、および好ましくは少なく
とも３倍の細胞密度になる場合に、因子は血管内皮細胞
に対する分裂促進活性を有すると考えられる。
【００５７】図３ａに記載のＤＮＡ配列は、ウシ細胞ｃ
ＤＮＡライブラリーから得られ、従って、ウシタンパク
質をコードする配列を表すが、提供されているＤＮＡ配
列は、他の哺乳類の種から得られる相同物タンパク質を
コードする配列の回収も可能となる。従って、我々は示
されているウシの配列をプローブとして、対応するヒト
タンパク質をコードするＤＮＡ配列を回収するのに用い
た。
【００５８】さらに本明細書の「血管内皮細胞増殖因
子」の範囲には、それらの生物学的に活性なフラグメン
ト、およびそれらのＮ末端あるいはＣ末端を延長した
形、または１つ以上のアミノ酸残基を置換および／ある
いは欠失あるいは挿入した、質的に本明細書に記載のタ
ンパク質の活性を保持しているアナログも含む。好まし
いアナログには、生物学的な活性に必要ではない１つ以
上のシステイン残基を異なるアミノ酸残基、好ましくは
セリンで置き換えたものが含まれる。１つ以上のシステ
イン残基を置換することによって、分子内および分子間
のジスルフィド結合形成の機会が減少し、それによって
分子がより安定になる。ｈＶＥＧＦ121、ｂＶＥＧ
Ｆ120、ｈＶＥＧＦ165およびｂＶＥＧＦ164中には、９
個のシステイン残基が存在する。このうち８個はPDGFに
も保存されている。従って最も好ましいアナログは、９
番目のシステイン残基がセリンで置換されているもので
ある。このシステイン残基は、ｈＶＥＧＦ165の160位お
よびｈＶＥＧＦ121の116位およびウシ型の対応する位置
に存在する。アミノ酸置換は、公知の技術を用いて、本
明細書に記載のＤＮＡ配列の部位特異的変異導入によっ
て行われ得る（例えば、Zoller, M.J. およびSmith，
M., Nucleic Acids Research (1982)10:6487-6500）。
【００５９】本明細書のウシ血管内皮細胞増殖因子の天
然の型は、明らかに糖が付加されているが、現在のとこ
ろ生物学的活性に糖付加が必須であるという証拠はな
い。従って、本明細書に提供されている発現配列を使用
して原核細胞宿主あるいは真核細胞宿主によって産生さ
れる、生物学的に活性な糖が付加されていない型あるい
は部分的に糖が付加されている型は、「血管内皮細胞増
殖因子」の範囲に含まれる。
【００６０】血管内皮細胞増殖因子をコードするＤＮＡ
配列を、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養物中で本
明細書の条件下で発現させると、発現するＶＥＧＦの約
50％がＮ結合糖付加により修飾されている。ｈＶＥＧＦ
121の75位のAsn残基に１つのＮ結合糖付加部位がある
（ｈＶＥＧＦ165の75位およびｂＶＥＧＦ120およびｂＶ
ＥＧＦ164の74位に相当する）。さらに、ｈＶＥＧＦ121
の発現および細胞培養培地への分泌の後、我々はダイマ
ーのタンパク質の種を単離した。この種は、両方のサブ
ユニットが糖付加されているかあるいは糖付加されてい
ない、および一方のサブユニットが糖付加されておりも
う一方のサブユニットが糖付加されていない、血管内皮
細胞増殖因子のダイマーの分子量に相当する。
【００６１】血管内皮細胞増殖因子（Gospodarowiczら
（前出）、およびFerraraおよびHenzel（前出）によっ
て単離された）は、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳
動で測定すると、約45〜46kDのダイマーのタンパク質で
ある。ウシ血管内皮細胞増殖因子は、濾胞星状細胞の細
胞培養馴化培地から均一な型で得られた。このプロセス
には、硫酸アンモニウム沈澱；ヘパリン-セファロース
アフィニティークロマトグラフィー；サイズ排除ゲルク
ロマトグラフィー；カチオン交換クロマトグラフィー；
および逆相高速液体クロマトグラフィー、の工程が含ま
れる。血管内皮細胞増殖因子を産生することが知られて
いる、例えばマウスAtT20細胞の様な他の哺乳類動物種
由来の培養細胞の馴化培地から、対応するタンパク質を
精製する場合にも、同様の手順が用いられる。我々はま
た、ノーザンブロット分析によって、ヒト胎児血管平滑
筋細胞がヒト血管内皮細胞増殖因子およびこの因子をコ
ードするmRNAのよい供給源になるということも決定し
た。
【００６２】上述のようにして得られた、単離したウシ
血管内皮細胞増殖因子のアミノ酸配列を、自動気相プロ
テインシークエンサーでエドマン分解法によって決定し
た。単一の主要な24アミノ酸のＮ末端配列が得られ、タ
ンパク質がホモダイマーであることが判った。タンパク
質のトリプシン消化および様々なペプチドフラグメント
のアミノ酸配列決定の後、オーバーラップしたアミノ酸
配列からウシタンパク質が以下のＮ末端の41アミノ酸配
列*を有することが判った： ＡＰＭＡＥＧＧＱＫＰＨＥＶＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳＦＣ
ＲＰＩＥＴＬＶＤＩＦＱＥＹＰＤＥ （*アミノ酸を表す標準的な１文字略号を用いる）。
【００６３】上記のウシ血管内皮細胞増殖因子のＮ末端
のアミノ酸配列を用いて、このタンパク質の全長あるい
は部分的なｃＤＮＡを回収しようとする多くの不成功に
終わった試みがなされた。それはこのアミノ酸配列の部
分をコードする縮重させたオリゴヌクレオチドプローブ
の混合物を用いて、濾胞星状細胞のｃＤＮＡライブラリ
ーをプローブすることによってなされた。図３ａのＤＮ
Ａセグメントは、ポリメラーゼチェーンリアクションの
改変法によって、アミノ酸の15位から38位（およびアミ
ノ酸39位のコドンの３分の２）をコードするヌクレオチ
ド配列を増殖させて作ったプローブを用いて、ｃＤＮＡ
ライブラリーから最終的に回収されたものである。所望
のＤＮＡ配列を増幅させるためのポリメラーゼチェーン
リアクション法は、米国特許第4,683,202号および第4,6
83,195号の中に詳細が記載されている。これらは参考と
して本明細書に適用されている。この方法によって、多
くの配列が知られていない場合でも、増幅したい配列の
どちらかの端にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
プライマーさえあれば、所望のヌクレオチド配列の増幅
が可能となる。ポリメラーゼチェーンリアクションのプ
ロセスには、ｃＤＮＡの所望のセグメントを増幅するた
めに、プライマーとして縮重オリゴヌクレオチドが用い
られる（Leeら、Science(1988) 1288-1291）。
【００６４】図３ａのｃＤＮＡを回収するのに用いたＤ
ＮＡプローブは、図１に示す５つの類似の配列から選択
された。これらの配列は、図２に示す概略および以下に
実施例中で詳細に記載しているような手順で得られた。
示されている手順によれば、ウシ濾胞星状細胞由来のポ
リ（Ａ）+RNAを、血管内皮細胞増殖因子の35位から39位
のアミノ酸配列に基づいて作製した16倍縮重の合成オリ
ゴヌクレオチド混合物からなるアンチセンスプライマー
とハイブリダイズさせる。24塩基のオリゴヌクレオチド
プライマーは、５’末端に10塩基のEcoRIリンカーを有
しており、14塩基がアミノ酸配列を反映していた。ポリ
（Ａ）+RNAにハイブリダイズする混合物中のオリゴヌク
レオチドプライマー配列は、デオキシヌクレオチド三リ
ン酸（dNTPs））および逆転写酵素の存在下で、所望のm
RNAの部分に相補的なＤＮＡ鎖の合成を始めるのに用い
られた。次に第一の合成された鎖に相補的な第二のＤＮ
Ａ鎖を以下のようにして調製した。すなわちウシ血管内
皮細胞増殖因子の15位から19位のアミノ酸配列に基づい
て作製した、８倍縮重合成24塩基オリゴヌクレオチド混
合物からなるセンス鎖プライマーに第一の合成鎖をハイ
ブリダイズさせて作った。この第二の鎖のオリゴヌクレ
オチドプライマーは、５’末端に10塩基のHindIIIリン
カーを連結させており、アミノ酸配列を反映する14塩基
領域を含んでいた。第一の合成ＤＮＡ鎖にハイブリダイ
ズする、混合物中のオリゴヌクレオチドプライマー配列
は、dNTPおよびＤＮＡポリメラーゼＩ、すなわちクレノ
ウフラグメントの存在中で、第二のＤＮＡ鎖の合成を始
めるのに用いられた。プライマー中の10塩基リンカー配
列は、第一のＤＮＡ鎖にハイブリダイズし得ないため、
第二鎖の合成は、残りの14ヌクレオチドが第一のＤＮＡ
鎖にハイブリダイズしたまま残り得る28℃で行われた。
ＤＮＡポリメラーゼ、すなわちクレノウフラグメント
は、第二の合成に用いられる。なぜならば、通常ポリメ
ラーゼチェーンリアクションに用いられるThermus aqua
ticus(Taq) ＤＮＡポリメラーゼが、この温度でＤＮＡ
合成を触媒することができないからである。第二の鎖合
成によって、ウシ血管内皮細胞増殖因子の15位から38位
のアミノ酸の部分（および39位のアミノ酸のコドンの三
分の二）をコードするセンス鎖ができる。
【００６５】次に２つの合成ＤＮＡ鎖を分離し、そして
反応の連続的な繰り返しによって所望の配列を増幅させ
た。この反応では、センスおよびアンチセンスの両方の
オリゴヌクレオチドプライマー混合物およびThermus aq
uaticus(Taq) DNAポリメラーゼの存在中で、一本鎖ＤＮ
Ａを相補鎖の合成のための鋳型として用いた。相補鎖の
それぞれの合成の後、反応混合物を加熱して鎖を分離
し、そしてこの反応を操り返した。
【００６６】増幅の30サイクルの後、ポリメラーゼチェ
ーンリアクション混合物から得たＤＮＡを、６％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動にかけた。このゲル中のＤＮ
Ａを臭化エチジウムで染色し、15位から38位までのアミ
ノ酸に対するコード配列（およびアミノ酸39位のコドン
の三分の二）およびプライミングオリゴヌクレオチドの
HindIIIおよびEcoRIリンカーを含む大きさに相当するバ
ンドをゲルから切り出した。臭化エチジウム染色したゲ
ルを図５の写真に示す。ここで増幅された所望の配列を
表す主要なバンドは、視覚的にはっきりと見分け得る。
主要なバンドを含む切り出したゲル片から、ＤＮＡを電
気的に溶出し、HindIIIおよびEcoRIで消化し、HindIII-
およびEcoRI-カットしたM13mp19およびM13mp18ファージ
ベクター中にライゲーションして入れた。E. coli JM10
3宿主細胞にこのライゲーション混合物を入れて形質転
換した後単離した無色のプラークのＤＮＡ配列分析によ
って、血管内皮細胞増殖因子の15位から38位のアミノ酸
（および39位のアミノ酸のコドンの三分の二を含む）を
コードするｃＤＮＡが実際に得られたことが判った。こ
れらの組換えファージ（pET-19A）の１つに含まれてい
る増幅させたＤＮＡ配列を、ウシ濾胞星状細胞ｃＤＮＡ
ライブラリーからクローン化したｃＤＮＡ配列を回収す
るためのプローブとして用いた。単離したクローン化配
列は、ウシ血管内皮細胞増殖因子の成熟型のうちの１つ
のＮ末端アミノ酸の14個以外の全てをコードする797塩
基対挿入部からなっていた。単離されたクローン化挿入
物を、pUC8のEcoRI部位にライゲーションしていれ、pST
800と名付けられたプラスミドを作製した。この挿入物
は、図３ａ（図３ａでは、挿入物のそれぞれの端にある
EcoRIリンカーは示されていない；従って、配列には挿
入物の７位のヌクレオチドから番号をつけてある）に示
されるようなヌクレオチド配列を含んでいた。ｂＶＥＧ
Ｆ120の第15位から120位のアミノ酸のコード領域は、図
３ａの第９位から326位のヌクレオチドで表されてい
る。
【００６７】図３ａに示す、単離したＤＮＡ配列から推
定されるアミノ酸配列は、74位のアミノ酸であるアスパ
ラギン残基の位置（ヒト型の75位のアミノ酸に対応す
る）に１つのＮ結合糖付加の可能性のある部位を含む。
この部位での約３kDのＮ結合糖付加によって、コードさ
れるタンパク質は、約17kDの全分子量であることが予想
される。これはGospodarowiczら、そしてFerraraおよび
Henzelによって単離された血管内皮細胞増殖因子サブユ
ニットで見られた約23kDの見かけの分子量よりかなり小
さい。このため、単離されたｃＤＮＡが、以前に観察さ
れたものとは異なる型の血管内皮細胞増殖因子をコード
することは明らかである。ポリメラーゼチェーンリアク
ション実験によって、血管内皮細胞増殖因子コード領域
の別の型が存在することが判った。
【００６８】ポリメラーゼチェーンリアクションは、図
６の70位から126位の塩基に相当するセンスオリゴヌク
レオチドおよび513位から572位の塩基に相当するアンチ
センスを用いて、濾胞星状ポリ（Ａ）+RNAから始められ
た。できた産物をBstNI（それぞれのプライマーの中を
切断する）消化したのちにポリアクリルアミドゲル分析
したところ、約300bpおよび約450bpの２つの主要な種類
があることが判った。これらの産物の両方は、M13ベク
ター中にサブクローンされ、そして塩基配列の決定が行
われた。小さい方の産物（311bp）のＤＮＡ配列は、PCR
でpST800中のｃＤＮＡが増幅された場合に予想されるも
のに相当した。大きい方のフラグメントの配列は、132b
pの挿入物（図６の四角で囲んだ配列）以外は、311bpの
産物と同一であった。以下に示されるように得られた、
ヒト血管内皮細胞増殖因子のゲノムのクローンの分析に
よって、この挿入物がエクソンとイントロンのつなぎ目
にあることがわかった。これによって、２つのコード領
域の型は、別々のエクソンスプライシングによってでき
たことが示唆される。
【００６９】図１あるいは図３ａに示してあるＤＮＡ配
列は、全長のウシ血管内皮細胞増殖因子、あるいは対応
するヒトのタンパク質を含む、他の種の血管内皮細胞増
殖因子、あるいは血管内皮細胞増殖因子としての同じ遺
伝子ファミリー中の関連タンパク質、をコードするＤＮ
Ａを回収するのに有用である。
【００７０】pST800の配列の上流の配列情報を有する、
ウシ血管内皮細胞増殖因子のｃＤＮＡクローン（図３
ａ）を得るために、Frohman, M.A.ら、PNAS(USA)(1988)
85, 8998-9002に記載の"RACE"ポリメラーゼチェーン反
応法の変法を用いた。リンカーを血管内皮細胞増殖因子
のmRNAのプライマー伸長で得た２本鎖の５’末端にライ
ゲートした。その後、この元来のプライマー伸長オリゴ
ヌクレオチドおよびリンカーに相補的なオリゴヌクレオ
チドをプライマーとして用いてポリメラーゼチェーン反
応を行った。プライマーをHindIIIで消化し、M13ベクタ
ーにサブクローニング後、得られたポリメラーゼチェー
ン反応生成物の配列分折を行い、血管内皮細胞増殖因子
の成熟アミノ末端をコードする配列（図６）を得た。得
られた最も長いｃＤＮＡクローンは、成熟タンパク質の
コード領域（AGTGGTCCCAGGCTGCACCC...）の始まりから1
4bp、５’末端側に延長しており、血管内皮細胞増殖因
子の前駆体の４つの付加アミノ酸（WSQAAPMA...）を明
らかにした。
【００７１】ヒト型の血管内皮細胞増殖因子のＤＮＡ配
列を回収するために、図１、図３ａ、あるいは図６の配
列、好ましくは図３ａあるいは図６の配列、あるいはそ
れらのセグメントを、ｃＤＮＡライブラリーあるいはゲ
ノムライブラリーから所望の配列を回収するためのプロ
ーブとして用いた。ゲノムライブラリーは、公知の技術
によって調製され得るし、今では商業的に入手可能であ
る。ヒト血管内皮細胞増殖因子をコードするゲノムＤＮ
Ａ配列が単離され得る適切なゲノムＤＮＡライブラリー
は、ヒト腺維芽細胞のゲノムライブラリーである（Stra
tagene Inc. LaJolla, CA）。W138細胞株から得たこの
ライブラリーは、λ FIX(登録商標)ベクター中に＞15kb
のＤＮＡ挿入物を有する。あるいは、ゲノムライブラリ
ーは、Frischauf，A.M.の、Methods in Enzymology、Be
rger，S.L. およびKimmel，A.R.編，Vol. 152，pp.190-
199(1987) Academic Press，N.Y.に記載の方法によって
調製され得る。ｃＤＮＡライブラリーを調製する方法
は、また当業者にはよく知られている（例えば、Kimme
l，A.R.およびBerger，S.L.,同誌、pp、307-316を参
照）。好ましくは、ｃＤＮＡライブラリーは、活発に血
管内皮細胞増殖因子を生産している細胞株あるいは組織
から調製される。ヒトタンパク質をコードするcＤＮＡ
配列の単離のためには、胎児ヒト血管平滑筋細胞から調
製されたｃＤＮＡライブラリーを用いるのが好ましい。
前記のようにして得られた血管内皮細胞増殖因子をコー
ドするＤＮＡ配列は、所望の宿主中でＤＮＡ配列の発現
を指令し得る調節配列の制御下に、適切な発現ベクター
に挿入される。回収されるＤＮＡ配列がイントロンを含
むゲノム配列である場合には、次に、真核宿主に適した
発現ベクターにその配列を挿入することが望ましい。原
核宿主における血管内皮細胞増殖因子をコードするゲノ
ムＤＮＡの発現は、イントロン配列を除くためのコード
されたRNAの正確なスプライシングを伴う。このことに
よって所望のタンパク質をコードするmRNAの鋳型を生産
する。あるいは、合成ＤＮＡ配列が、ゲノム配列中のイ
ントロン配列を除去した後に得られるコード配列を提示
する合成オリゴヌクレオチドから構築され得る。血管内
皮細胞増殖因子をコードする、この合成配列あるいはｃ
ＤＮＡ配列を含有する発現ベクターは、原核あるいは真
核宿主でタンパク質を発現するために使用され得る。例
示的な制御配列のＤＮＡおよび宿主は下記の標準工程の
項に記載されている。
【００７２】生物学的に活性な血管内皮細胞増殖因子
は、本発明の方法に従って、ホモダイマー分子として生
産される。これに関連して、用語「ホモダイマーの」
は、２個のサブユニットが同じアミノ酸の一次構造を有
するダイマーである。前に示したように、サブユニット
の１個あるいは両方が、Ｎ-結合のグリコシル化によっ
て修飾され得るか、あるいはサブユニットの両方とも修
飾され得ない。完全に活性なタンパク質は、ダイマーを
形成するジスルフィド結合を形成させる条件下で、本発
明のＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチド配列
の発現および／または回収により産生される。
【００７３】本発明は、さらに、アミノ酸の一次構造の
一部が、血小板由来の増殖因子のＡ鎖サブユニットある
いはＢ鎖サブユニットのいずれかの部分、あるいは血管
内皮細胞増殖因子の部分に対応するアミノ酸の一次構造
の部分に対応する、キメラのダイマータンパク質の生産
法を提供する。特に、第１のポリペプチド鎖および第２
のポリペプチド鎖を有するキメラ増殖因子が提供されて
いて、該鎖間はジスルフィド結合されており、第１のポ
リペプチド鎖は、少なくとも血小板由来の増殖因子のＡ
鎖サブユニットあるいはＢ鎖サブユニットのいずれかの
アミノ酸配列の一部分を有し、そして第２の鎖は、少な
くとも血管内皮細胞増殖因子のアミノ酸配列の一部分を
有する。
【００７４】血小板由来の増殖因子は、約30kDのダイマ
ーであって、ホモダイマーおよびヘテロダイマー型で単
離されている。血小板由来の増殖因子のヘテロダイマー
は、Ａ鎖およびＢ鎖と呼ばれる２つのポリペプチド鎖を
有している。成熟Ａ鎖およびＢ鎖は、約40％のアミノ酸
配列の相同性を示し、８個のシステイン残基が完全に保
存されている。血小板由来の増殖因子は、インビボでＡ
-ＡあるいはＢ-Ｂホモダイマーのいずれか、あるいはＡ
-Ｂヘテロダイマーとして存在する。
【００７５】血小板由来の増殖因子のＡ鎖およびＢ鎖サ
ブユニットをコードするＤＮＡ配列は、単離され配列分
析されている（Ａ鎖ｃＤＮＡ（ヒト）は、Betsholtz，
C.ら、Nature(1986)320に記載されている；Ａ鎖ゲノム
ＤＮＡ（ヒト）は、Bonthron,D.T.ら、PNAS(1988)85:14
96に記載されている；Ｂ鎖ｃＤＮＡ（ヒト）は、Collin
s, T. ら、Nature(1985)316:748に記載されている；お
よびＢ鎖ゲノムＤＮＡ（ヒト）は、Chin，I. -M.ら、Ce
ll (1984) 37:123に記載されている）。図４は、ヒト血
小板由来の増殖因子の、５’末端にBamHIリンカー結合
のおよび３’末端にEcoRVリンカー結合の、それぞれの
Ａ鎖およびＢ鎖サブユニットの単離されたｃＤＮＡ配列
および推定される前駆体のアミノ酸配列を示している。
これらの配列のそれぞれは、適切な調節エレメントの制
御の下に、適当な発現ベクターに挿入し、適当な宿主、
例えば、E. coli あるいはチャイニーズハムスター卵巣
(CHO)細胞あるいは酵母などの原核宿主において発現さ
れ得る。
【００７６】本発明が意図するキメラ増殖因子タンパク
質の例には、ジスルフィド結合によって、血管内皮細胞
増殖因子のポリペプチド鎖の全長に結合された血小板由
来の増殖因子のＡ鎖サブユニットの全長を有するダイマ
ータンパク質；およびジスルフィド結合によって、血管
内皮細胞増殖因子のポリペプチド鎖の全長に結合された
血小板由来の増殖因子のＢ鎖サブユニットの全長を有す
るダイマータンパク質が含まれる。他の上記よりは望ま
しくない実施態様において、ダイマータンパク質は、ジ
スルフィド結合された２つのポリペプチド鎖で、片方の
鎖あるいは両方の鎖が、血小板由来の増殖因子あるいは
血管内皮細胞増殖因子のＡ鎖あるいはＢ鎖サブユニット
のいずれかのＮ末端部分に対応するアミノ酸配列を有す
るＮ末端セグメントであり、そして選択されなかった他
の２つの鎖の１つから選ばれたＣ末端配列に対応するＣ
末端セグメントからなり得る。例えば、血小板由来の増
殖因子のＡ鎖のＮ末端の１／２が、血管内皮細胞増殖因
子のＣ末端の１／２にペプチド結合された１つのポリペ
プチド鎖；および血管内皮細胞増殖因子の全アミノ酸配
列からなるもう一方のペプチド鎖であるダイマーが調製
され得る。逆に、１つのポリペプチド鎖は、血小板由来
の増殖因子のＡ鎖あるいはＢ鎖サブユニットのＣ末端セ
グメントに結合された血管内皮細胞増殖因子のＮ末端部
分からなり得、そして、もう一方のポリペプチド鎖は、
血管内皮細胞増殖因子のアミノ酸配列を有し得る。容易
に明らかになるように、多くの異なるハイブリッドの組
み合せが調製される。
【００７７】本発明のキメラ増殖因子を調製するため
に、各々の所望の鎖をコードするＤＮＡ配列は、プラス
ミドなどの適当な発現ベクター内に、宿主細胞でその発
現を指令し得る調節配列の制御下に挿入される。次に、
宿主細胞は発現ベクターによって形質転換される。所望
であれば、１つの宿主を、２つの鎖用の各発現ベクター
で同時形質転換し得る。あるいは、別の宿主細胞を、２
つのポリペプチド鎖を同時にコードするベクターで形質
転換し得る。次に、このポリペプチド鎖を、従来の方法
によって発現させ、そして回収する。そのペプチド鎖
が、宿主細胞から分泌されるように分泌シグナル配列と
共に発現されるときには、それらは、合成および分泌の
間に自然に正確なダイマー構造を形成し得る。次に、そ
のダイマーは、Gospodarowiczら、PNAS(1989)86(19):73
11-7316、およびFerraraおよびHenzel、BBRC(1989)161
(2):851-858に記載の方法を用いて精製し得る。この経
路で正確なダイマー構造が得られない場合には、あるい
は、キメラの２つの鎖が異なる宿主で合成される場合に
は、次に、鎖の再折り畳みおよびダイマー化の手段の１
つの例は、下記の実施例により詳細に記載されているよ
うに、グアニジン-HCl、Na2SO3およびNa2S4O6で部分的
に精製された鎖あるいは精製された鎖を処理することで
ある。次に、得られたS-スルホン化され、変性されたタ
ンパク質は、最終精製の前に、５mMのグルタチオン、0.
5mMのグルタチオンジスルフィド、および尿素の存在下
に再折り畳みおよびダイマー化の両方がなされる。
【００７８】組成物および使用 本発明によって提供される血管内皮細胞増殖因子（ｂＶ
ＥＧＦ120、ｂＶＥＧＦ164、ｈＶＥＧＦ121、あるいは
ｈＶＥＧＦ165）は、創傷治癒剤として有用であり、特
に、血管組織に内皮を再形成したい部位あるいは新しい
毛細血管床（脈管形成）の増殖が重要である場所に塗布
するのに有用である。
【００７９】従って、血管内皮細胞増殖因子は、床ず
れ、静脈潰瘍、および糖尿病性の潰瘍の種類を含む皮膚
潰瘍などの、十分に深い創傷の処置に用いられ得る。さ
らに、血管内皮細胞増殖因子は、火傷あるいは外傷の部
位に皮膚移植あるいは皮弁を調製するために脈管形成が
必要とされる十分に深い火傷あるいは外傷の処置に用い
られ得る。この場合には、血管内皮細胞増殖因子は、部
位に直接に塗布されるか、移植する前に移植される皮膚
あるいは皮弁を浸すのに用いられる。同様に、血管内皮
細胞増殖因子は、火傷、他の外傷後、あるいは化粧の目
的に、再成形が必要とされる成形外科に用いられ得る。
【００８０】脈管形成はさらに、傷を清潔に感染しない
ように保つのに重要である。従って、血管内皮細胞増殖
因子は、外科全般および切口および裂傷の修復に関して
使用し得る。特に、感染の危険性の高い腹の傷の処置に
有用である。さらに、新生血管の形成は、骨折の修復に
重要である。なぜなら、骨の損傷部位に血管が成長発達
するからである。従って、血管内皮細胞増殖因子の骨折
部位への投与は、もう一つの使用法である。
【００８１】血管内皮細胞増殖因子が、上記のように局
部の創傷治癒に用いられる場合には、脈管組織の内皮再
形成のために、下記に示すいずれかの経路、あるいは、
より好ましくは、局所的な方法によって投与され得る。
これらの場合には、溶液、スプレー、ゲル、クリーム、
軟膏あるいは乾燥粉末のいずれかとして直接に損傷部位
に投与される。血管内皮細胞増殖因子を損傷部分にゆっ
くりと放出するように制御する素子もまた用いられる。
局部塗布では、血管内皮細胞増殖因子は、１回投与、あ
るいは１週間から数週間の期間毎日あるいは数日毎の投
与処方のいずれかで、50から1000μg/mlの濃度範囲で塗
布される。一般的に、投与される局所調合の量は、創傷
の表面積に基づいて約0.1から100μg/cm2の血管内皮細
胞増殖因子の塗布で十分である。
【００８２】血管内皮細胞増殖因子は、その工程で血管
内皮細胞が除去あるいは破壊され、アテロームプラーク
の圧縮を伴うバルーン血管形成術後の創傷治癒剤として
使用され得る。血管内皮細胞増殖因子は、全身的にある
いは局所的に静脈内に、静脈内ボーラス注入あるいは点
滴のいずれかで、血管内部表面に塗布され得る。所望で
あれば、血管内皮細胞増殖因子は、長時間にわたり、マ
イクロメータリングポンプを用いて投与され得る。血管
内投与に適した組成物は、内皮細胞の増殖を促進するの
に効果的な量の血管内皮細胞増殖因子、および非経口用
のキャリアー物質を含有する。血管内皮細胞増殖因子
は、広い濃度範囲の組成物として存在し得る。例えば、
単回あるいは複数回の塗布処方で投与される、患者当り
３から10mlの注射を用いる場合には約50μg/mlから約1,
000μg/mlの濃度である。通常の生理食塩水あるいは５
から10％のデキストロースなどの、公知のあらゆる非経
口キャリアー溶液が使用され得る。
【００８３】血管内皮細胞増殖因子は、血管移植手術で
の内皮の形成を促進するために使用され得る。移植血管
あるいは合成物質のいずれかを用いる血管移植の場合
に、例えば、血管内皮細胞増殖因子は、血管内皮細胞の
増殖を促進するために、移植片の表面に塗布され得る
か、および／または、移植片およびそこにある血管との
つなぎ目に塗布され得る。このような塗布の場合、血管
内皮細胞増殖因子は、前記のバルーン脈管形成用のよう
に静脈内に、あるいは手術前あるいは手術中のいずれか
に、移植片および／またはそこのある血管の表面に直接
塗布され得る。このような場合には、病巣の表面に付着
され、肉厚のキャリアー物質中にいれた血管内皮細胞増
殖因子を塗布するのが望ましい。適切なキャリアー物質
には、例えば、１−５％のカルボポール（carbopol）が
含まれる。血管内皮細胞増殖因子は、キャリアー中には
広い濃度範囲、例えば約50μg/mgから約1,000μg/mgで
含まれ得る。あるいは、血管内皮細胞増殖因子は、非経
口溶液として、部位にマイクロメータリングポンブで送
られ得る。
【００８４】血管内皮細胞増殖因子は、さらに、側副循
環の血管の内皮細胞の増殖を促進することによって、心
筋梗塞形成後の血管破壊の修復のために、および冠状動
脈のバイパス手術用の包囲に使用され得る。血管内皮細
胞増殖因子はこの目的に、静脈内に個々の注射によっ
て、または前述のようにある期間マイクロメータリング
ポンプによって、あるいは直接注入によって、あるいは
心臓の損傷した筋肉の部位への注射によって投与され
る。
【００８５】血管内皮細胞増殖因子は、さらにインビト
ロでの血管細胞培養用の増殖因子として使用され得る。
このような使用には、血管内皮細胞増殖因子は、約10pg
/mlから約10ng/mlの濃度で細胞培養培地に添加され得
る。
【００８６】本発明のハイブリッド増殖因子分子は、血
小板由来の増殖因子と血管内皮細胞増殖因子との中間の
有糸分裂促進活性を示すと予想され、あるいは、ある場
合には、脈管形成のインヒビターとして用いられ得る。
２つの因子の活性の間の最も大きな違いは、血小板由来
の増殖因子は、実質的な有糸分裂活性を平滑筋細胞およ
び腺維芽細胞には示すが、内皮細胞には示さないことで
ある。一方、血管内皮細胞増殖因子は逆の特性を示す。
PDGF Ａ鎖および／またはＢ鎖の平滑筋細胞および腺維
芽細胞に対する有糸分裂活性は、創傷治癒のための張力
を与える。従って、血小板由来の増殖因子と血管内皮細
胞増殖因子とのハイブリッドであるその増殖因子は、新
生血管の形成の誘導、および治癒の間および治癒後に創
傷部分に張力を与えるために塗布され得る。このハイブ
リッド増殖因子は、前記の血管内皮細胞増殖因子と基本
的には同様の様式で、同様の投与量で付与される。
【００８７】種々の型の血管内皮細胞増殖因子をコード
するＤＮＡ配列、およびそれらの推定アミノ酸配列の解
明は、さらに血管内皮細胞増殖因子活性のインヒビター
を生産する方法を提供する。血管内皮細胞増殖因子の脈
管形成活性の阻害は、増殖中の癌に必要な血液供給を提
供するには新生血管の形成が必要とされるので、例えば
癌の増殖を遅らせたり阻むのに有用である。血管内皮細
胞増殖因子に対する抗体、あるいは血管内皮細胞増殖因
子のレセプターには結合し得るが、全長の血管内皮細胞
増殖因子の脈管形成活性は示さない血管内皮細胞増殖因
子のフラグメントが投与され得る。
【００８８】発現され単離された血管内皮細胞増殖因子
タンパク質に対する抗体は、公知の技術で生産され得
る。治療用抗体はポリクローナル抗体あるいはモノクロ
ーナル抗体であり得る。抗体は、ウサギ、マウスあるい
は他の適当な動物で、標準的な免疫のプロトコールを用
い、そして抗血清を回収することにより調製される。さ
らに、免疫された動物の抗体分泌細胞は、血管内皮細胞
増殖因子と免疫反応する抗体によりスクリーニングされ
得るハイブリドーマを生産する細胞融合法を用いて、株
化され得る（例えば、"Antibodies: A Laboratory Manu
al"，E. Harlow,およびD.Lane著、Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor，N.Y.を参照）。適切
な処置の処方（すなわち、投与量、投与頻度、全身的投
与あるいは局所的投与など）の決定は、当分野の技術範
囲内である。投与には、抗体は、薬学的に受容可能な非
経口溶液と共に、単位投与量の注射用形態（溶液、懸濁
液、乳液など）に調合される。このような溶液は、通常
無毒性および非治療性である。このような溶液には、
水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、お
よびハンク液がある。不揮発油およびエチルオレイン酸
などの非水溶液もまた使用され得る。好ましい溶媒は、
５％（w/w）のヒトアルブミン生理食塩水溶液である。
溶媒は、等張性および化学安定性を増大する物質のよう
な少量の添加剤、例えばバッファーおよび保存剤を含有
し得る。抗体は、このような溶媒中に、典型的には、約
20μg/mlから約20mg/mlの濃度に調合される。
【００８９】さらに、本明細書には、例えば、腫瘍の増
殖を遅らせるかあるいは阻むための脈管形成を阻害する
方法が提供される。この方法には、２つの異なるサブユ
ニットを有するヘテロダイマーのタンパク質の投与が含
まれ、この各々のサブユニットは、ｈＶＥＧＦ121、ｈ
ＶＥＧＦ165、およびｈＶＰＦ189の成熟アミノ酸配列か
ら選択される。用語ｈＶＰＦ189とは、図８に示されて
いる転写されたゲノムＤＮＡ配列の現在では分化メッセ
ージのスプライシングから生じることが見い出されてい
る、189個のアミノ酸のタンパク質である。ｈＶＰＦ189
のホモダイマー型は、血管透過性因子と呼ばれている。
ｈＶＰＦのアミノ酸配列は、ｈＶＥＧＦ121およびｈＶ
ＥＧＦ165の両者と、成熟タンパク質のＮ末端の114個の
アミノ酸およびＣ末端の５個のアミノ酸が相同である。
しかし、ｈＶＰＦ189は、ｈＶＥＧＦ121には存在しな
い、115位から始まる68個のアミノ酸の配列を有する。
ｈＶＰＦ189の全ｃＤＮＡコード配列および推定アミノ
酸配列は、Keck, P. ら、Science(1989)246:1309-1312
に記載されている。この記載は、本明細書に参考として
援用されている。特定の理論あるいは作用の機構に束縛
されることを望んではいないが、ダイマーPDGF様の増殖
因子は、そのダイマーの各々のサブユニットが、細胞表
面の別々のレセプターサブユニットに結合する機構、す
なわちレセプター活性を誘起するのに必要な２つの隣接
したレセプターサブユニットに結合して生物学的活性を
誘発すると考えられる。血管内皮細胞増殖因子ファミリ
ーの異なるサブユニットからなるヘテロダイマーの投与
によって、サブユニットの各々は、各々のサブユニット
は特定のレセプターのサブタイプに結合し得る。そのこ
とによって、結合レセプターを、外来のホモダイマー血
管内皮細胞増殖因子との相互作用から効果的に阻害す
る。しかし、投与されたホモダイマーの他のサブユニッ
トは、異なる血管内皮細胞増殖因子のサブタイプである
ので、そのダイマーは、同じサブタイプの第２のレセプ
ターサブユニットに結合してレセプターの生物学的活性
を誘発することができない。
【００９０】脈管形成を阻害するためにこのような方法
に用いられるヘテロダイマータンパク質は、ｈＶＥＧＦ
121、ｈＶＥＧＦ165あるいはｈＶＰＦ189の所望のアミ
ノ酸配列を、別々の宿主で発現させることによって、あ
るいは同じ宿主で同時発現させることによって生産し得
る。次に、ダイマー化を、本明細書の他のところに記載
した方法でなし得る。所望のヘテロダイマーは、タンパ
ク質のサイズ分離に都合のよい任意の方法によってホモ
ダイマー型と分け得る。ヘテロダイマーは、血管内皮細
胞増殖因子を脈管形成賦剤として投与する同じ様式で、
抗脈管形成処置が必要な宿主、例えば、癌にかかってい
る患者に投与される。正確な投与処方および投与量の決
定は、当分野の技術範囲内である。
【００９１】脈管形成を阻害する他の方法は、１つのサ
ブユニットが、ｈＶＥＧＦ121、ｈＶＥＧＦ165あるいは
ｈＶＰＦ189から選択され；他のサブユニットが生物学
的に不活性なフラグメント、あるいは、１つあるいはそ
れ以上のアミノ酸が、そのサブユニットを不活性にする
異なるアミノ酸で置換されている、ｈＶＥＧＦ121、ｈ
ＶＥＧＦ165あるいはｈＶＰＦ189のアナログである；ヘ
テロダイマーの投与である。
【００９２】血管内皮細胞増殖因子は癌細胞中では高い
レベルで産生されるので、従来の免疫アッセイで、抗血
管内皮細胞増殖因子抗体を用い、患者の腫瘍の存在を検
出するのに用いられ得る。血管内皮細胞増殖因子に対す
る抗体、好ましくはｈＶＥＧＦ121あるいはｈＶＥＧＦ
165などのヒト血管内皮細胞増殖因子に対する抗体は、
公知の技術によって生産し得る。抗体はポリクローナル
抗体あるいはモノクローナル抗体であり得る。血管内皮
細胞増殖因子のレベルは、液体サンプル、好ましくは、
腫瘍を有すると思われる患者の血清サンプル中で、測定
される物質に対する抗体を用いて、任意の従来の免疫ア
ッセイ法を用いて定量される。好ましいアッセイは、サ
ンドイッチタイプの酵素免疫アッセイあるいは放射免疫
アッセイなどの、サンドイッチタイプの免疫アッセイで
ある。血管内皮細胞増殖因子の循環レベルは、これらの
方法によって、１−1000pg/mlレベルが、よい信頼性測
定され得る。血管内皮細胞増殖因子の測定されたレベル
を、正常人、すなわち腫瘍を有さないヒトから得たコン
トロールレベルと比較する。血管内皮細胞増殖因子の増
加した循環レベルは、腫瘍と判断される。
【００９３】標準的な方法 細胞の形質転換、ベクターの構築、メッセンジャーRNA
の抽出、ｃＤＮＡライブラリーの調製などに用いられる
ほとんどの手順は、当分野では広く行われていて、ほと
んどの専門家には、特定の条件および手順が記載されて
いる標準的な資材はよく知られている。しかし、便宜
上、以下の項にガイドラインとして掲げた。
【００９４】宿主および制御配列 原核および真核系の両者が、血管内皮細胞増殖因子のコ
ード配列を発現するために使用され得る。もちろん原核
宿主は、クローニングの方法に最も都合がよい。最も頻
用される原核宿主は、種々のE. coli株に代表される；
しかし、他の微生物株もまた使用され得る。宿主微生物
に適した種由来の、複製部位、選択マーカーおよび制御
配列を有するプラスミドベクターが使用され得る；例え
ば、E. coliは、典型的には、Salmonellaから得た２
つ、およびBolivarら、Gene(1977)2:95に記載のE. coli
から単離された１つの、３つの天然に存在するプラスミ
ドの部分から構築されたプラスミドであるpBR322の誘導
体を用いて形質転換される。pBR322は、アンピシリンお
よびテトラサイクリン耐性の遺伝子を含有し、所望のベ
クターの構築で保存あるいは破壊し得る、複数の選択マ
ーカーを提供する。一般的に用いられる原核制御配列
（または、本明細書では「調節エレメント」とも呼ばれ
る）は、本明細書では転写開始プロモーター、必要に応
じてオペレーターを伴って、リボソーム結合部位配列を
含むと定義されていて、この制御配列には、β-ラクタ
マーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース（lac）プ
ロモーター系（Changら、Nature(1977)198:1056）、お
よびトリブトファン（trp）プロモーター系（Goeddel
ら、Nucleic Acids Res. (1980) 8:4057）およびλ由来
ＰLプロモーターおよびＮ-遺伝子リボソーム結合部位
（Shimatakeら、Nature (1981) 292:128）などの一般に
用いられているプロモーターが含まれる。
【００９５】細菌に加えて、酵母などの真核微生物も宿
主として用い得る。多くの他の菌株や種が一般に入手可
能であるが、Saccharomyces cerevisiae、パン酵母の研
究用菌株が最も用いられる。例えば、Broach, J.R., Me
th. Enz.(1983)101:307の２μの複製起点、あるいは酵
母適合の他の複製起点（例えば、Stinchcombら、Nature
(1979) 282:39，Tschumper, G. ら、Gene(1980) 10:15
7およびClarke, L.ら、Meth. Enz.(1983)101:300を参
照）を含んだベクターが使用し得る。酵母ベクターの制
御配列には、解糖系酵素の合成のプロモーターが含まれ
る（Hessら、J.Adv. Enzyme Reg.(1968)7:149:Holland
ら、Biochemistry(1978)17:4900）。当分野に公知の他
のプロモーターには、３-ホスホグリセレートキナーゼ
のプロモーターが含まれる（Hitzemanら、J. Biol. Che
m.(1980)255:2073）。さらに、増殖条件および／または
遺伝的背景によって制御される転写の利点を有する他の
プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソ
チトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝関連の
分解酵素、αファクター系、およびマルトースおよびガ
ラクトースの利用に関する酵素のプロモーター領域であ
る。ターミネーター配列は、コード配列の３’末端にあ
ることが望ましい。このようなターミネーターは、酵母
由来の遺伝子のコード配列の後の３’非翻訳領域に見い
出される。
【００９６】もちろん、多細胞生物由来の真核宿主細胞
培養物中のポリペプチドをコードする遺伝子を発現させ
ることもまた、可能である。例えば、Axelら、4,399,21
6を参照されたい。これらのシステムは、イントロンを
スプライスして除く能力という付加的な利点があるた
め、ゲノムフラグメントを直接発現させるのに用いられ
得る。これらのシステムにおいてはまた、ある種の天然
のタンパク質において生じるのと類似した翻訳後修飾が
行われ得る。有用な宿主細胞系にはVEROおよびHeLa細
胞、およびチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞が
包含される。そのような細胞の発現ベクターは、通常、
哺乳類細胞に適合するプロモーターおよび制御配列を有
する。それらには、例えば、一般に使用されているシミ
アンウイルス４０（SV40）由来の初期および後期プロモ
ーター（Fiersら、Nature(1978)273:113）あるいは例え
ばポリオーマ、アデノウイルス２、ウシパピローマウイ
ルス、またはトリ肉腫ウイルス由来の他のウイルスプロ
モーターがある。制御可能なプロモーターであるhMT-II
A（Karin, M. ら、Nature(1982) 299:797-802）もまた
使用され得る。哺乳類細胞宿主システムの形質転換の一
般的な状況はAxel（前出）に記載されている。「エンハ
ンサー」領域もまた、発現を最適化するのに重要である
ことは明らかである。これは一般に非コードＤＮＡ領域
においてプロモーター領域の上流または下流に見出され
る配列である。必要に応じて、ウイルス源から複製の起
点が得られうる。しかし、真核生物でのＤＮＡ複製にお
いては、染色体への組み込みは一般的なメカニズムであ
る。
【００９７】形質転換 使用する宿主細胞に依存して、そのような細胞に適切な
標準的手法を用い、形質転換が行われる。原核生物ある
いは実質的に細胞壁バリアーを有する他の細胞には、塩
化カルシウムを用いたカルシウム処理[Cohen, S. N., P
NAS (1972) 69:2110に記載]あるいはRbCl2法[Maniatis
ら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982)
Cold Spring Harbor Press，p. 254およびHanahan, D.,
J. Mol.Biol. (1983)166:577-580に記載]が使用され得
る。そのような細胞壁を持たない哺乳類細胞について
は、リン酸カルシクム沈澱法[Grahamおよびvan der Eb,
Virology (1978) 52:546;必要に応じてWigler，M.
ら、Cell(1979)16:777-785のように改変される]が用い
られ得る。酵母への形質転換は、Beggs, J. D., Nature
(1978) 275:104-109またはHinnen, A. ら、PNAS(1978)7
5:1929の方法により行われ得る。
【００９８】ベクターの構築 ここで提供されるＤＮＡ配列の発現のための所望のコー
ドエレメントおよび制御エレメントを含む適切なベクタ
ーの構築には、当該技術分野で充分に理解されている標
準的な連結および制御酵素による手法が採用される。単
離されたプラスミド、ＤＮＡ配列または合成されたオリ
ゴヌクレオチドを、開裂させ、整え、そして所望の形に
再連結させる。
【００９９】ベクターを形成するＤＮＡ配列は、多くの
ソースから入手可能である。バックボーンのベクターお
よび制御システムは、通常、構築における配列の大部分
として用いられる利用可能な「宿主」ベクターに見い出
される。典型的な配列は上記の宿主および制御配列に述
べられている。適切なコード配列については、構築の最
初の工程は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリー
から適切な配列を回収することであり得、通常そうであ
る。しかし、ひとたびその配列が開示されれば、遺伝子
配列の全体を、個々のヌクレオチド誘導体からインビト
ロで合成することが可能である。かなり長い遺伝子の全
体の配列、例えば500-1000bpは、オーバーラップする相
補的な個々のヌクレオチドを合成し、そして、デオキシ
リボヌクレオチド三リン酸の存在下でＤＮＡポリメラー
ゼを用いて一本鎖のオーバーラップしない部分を埋める
ことにより、調製され得る。このアプローチは、既知の
配列のいくつかの遺伝子の構築に成功裏に用いられてい
る。例えば、Edge, M.D.,Nature(1981) 292:756;Nambai
r, K.P.ら、Science(1984)223:1299;Jay, Ernest，J. B
iol. Chem.(1984)259:6311を参照されたい。
【０１００】合成オリゴヌクレオチドは、ホスホトリエ
ステル法[Edgeら、Nature（前出）およびDuckworthら、
Nucleic Acids Res.(1981) 9:1691に記載]またはホスホ
ルアミダイト法[Beaucage, S. L., およびCaruthers,
M.H. Tet. Letts. (1981)22:1859およびMatteucci, M.
D., およびCaruthers, M. H., J. Am. Chem. Soc.(198
1) 103:3185に記載]により調製され、そして、市販の自
動オリゴヌクレオチド合成装置により調製され得る。ア
ニーリングに先立つ一本鎖のリン酸化または標識のため
のリン酸化は、１ナノモルの基質に対して過剰量（例え
ば約10ユニット）のポリヌクレオチドキナーゼを用い、
50mM Tris、pH7.6、10mM MgCl2、5mMジチオスレイトー
ル、1-2mM ATP、1.7ピコモル γ-32Ｐ-ATP（2.9mCi/mmo
le）、0.1mMスペルミジン、0.1mM EDTAの存在下で達成
される。
【０１０１】所望のベクターの成分がひとたびこのよう
にして利用可能となれば、それらは、標準的な制限切断
および連結の方法を用いて切断および連結され得る。
【０１０２】部位特異的なＤＮＡの切断は、当該技術分
野で一般に理解されている条件下で、適当な制限酵素
（または酵素）で処理することにより達成され、そし
て、その詳細は、これらの市販の制限酵素の製造者によ
り規定されている。例えば、NewEngland Biolabsの製品
カタログを参照されたい。通常、約１μgのプラスミド
またはＤＮＡ配列は、バッファー溶液約20μ中の１ユニ
ットの酵素で切断される。ここでの実施例においては、
典型的には、ＤＮＡ基質の消化を完全にするために過剰
の制限酵素が用いられる。実施可能なインキュベートの
時間は約37℃において約１時間から２時間であるが、そ
れは変更され得る。インキュベートの後、タンパク質
は、フェノール／クロロホルムによる抽出によって除去
され、そしてその後にエーテル抽出し得、そして核酸
は、エタノール沈澱により水性フラクションから回収さ
れる。必要であれば、標準法を用いたポリアクリルアミ
ドゲルまたはアガロースゲル電気泳動による、切断され
たフラグメントのサイズ分離がなされ得る。サイズ分離
の一般的な記載は、Methods in Enzymology(1980) 65:4
99-560に見い出される。
【０１０３】制限切断フラグメントは、次の条件で平滑
末端とされ得る。つまり、４種のデオキシヌクレオチド
三リン酸（dNTP）の存在下でE. coli DNAポリメラーゼ
Ｉのラージフラグメント（クレノウ）で、50mM Tris pH
7.6, 50mM NaCl, 6mM MgCl2,6mM DTTおよび0.1-1.0mM d
NTP中において20から25℃で約15から25分間インキュベ
ートして処理することにより、平滑末端とされ得る。。
クレノウフラグメントは、５’の一本鎖のオーバーハン
グを埋めるが、４種のdNTPが存在しているときにも突出
している３’の一本鎖を削っていく。必要に応じて、オ
ーバーハングの性質により指示される制限の範囲内にお
いて、dNTPのうちのただ１種、または選択されたdNTPを
供給することにより、選択的修復がなされ得る。クレノ
ウ処理した後、混合物をフェノール／クロロホルムで抽
出し、エタノール沈澱させる。Ｓ１ヌクレアーゼまたは
BAL-31を用いた適当な条件での処理により、一本鎖部分
のいずれもが加水分解される。
【０１０４】連結は、次の標準条件および温度で、15-5
0μlの容量でなされ得る。例えば、60mM Tris-Cl pH7.
5、16mM MgCl2、10mM DTT、33μg/ml BSA、および０℃
にて40μM ATP 0.01-0.02(Weiss)ユニットのT4 DNAリガ
ーゼ（「粘着末端」の連結用）、または14℃にて１mM A
TP, 0.3-0.6(Weiss)ユニットのT4 DNAリガーゼ（「平滑
末端」の連結用）の条件および温度でなされ得る。分子
間の「粘着末端」の連結は、通常、ＤＮＡの総濃度が33
-100μg/ml（最終総濃度５-100nM）で、達成される。分
子間の平滑末端の連結は、最終総濃度１μMにて達成さ
れる。
【０１０５】「ベクターフラグメント」を用いるベクタ
ーの構築においては、該ベクターフラグメントは、５’
リン酸を除去し該ベクターの自己連結を阻止するために
通常、細菌アルカリホスファターゼ（BAP）または仔ウ
シ腸アルカリホスファターゼ（CIP）により処理され
る。消化は、１μｇのベクターあたり１ユニットのBAP
を用い、pH8で約10mM Tris-HCl, 1mM EDTA中、60℃にて
約１時間；あるいは、50mMTris-HCl (pH9.0)、1mM MgCl
2、0.1mM ZnCl2、１mMスペルミジン、１ユニットのCIP
中、37℃にて60分間（５’末端突出用）または、37℃に
て15分間、次いで56℃にて15分間（平滑末端または凹部
５’末端用）、なされる。核酸フラグメントを回収する
ために、調製物は、フェノール／クロロホルムで抽出さ
れ、エタノール沈澱がなされる。あるいは、２回消化さ
れたベクターにおいて、さらに制限酵素による消化を行
い、所望でないフラグメントを分離することにより、該
ベクターの再結合が阻止され得る。
【０１０６】配列の改変を必要とする、ベクターのｃＤ
ＮＡあるいはゲノムＤＮＡ由来の部分には、部位特異的
プライマー変異導入が用いられる（Zoller, M.J.および
Smith, M. のNucleic Acids Res. (1982) 10:6487-6500
およびAdelman, J.P.らのＤＮＡ(1983)2:183-193）。こ
れは、所望の変異を表す限局された変異以外は変異させ
る一本鎖ファージＤＮＡに相補的な、合成オリゴヌクレ
オチドプライマーを用いて行った。簡単に説明すると、
合成オリゴヌクレオチドはファージに相補的なＤＮＡ鎖
の合成を開始させるプライマーとして使用され、得られ
た部分的あるいは全長の二本鎖ＤＮＡでファージを養っ
ている宿主細菌を形質転換する。形質転換された細菌の
培養物を上部寒天に蒔き、ファージを有する単一の細胞
からプラークを形成させる。
【０１０７】理論的には、新しいプラークの50％は、変
異した一本鎖を有するファージを持ち、50％は元の配列
を有する。得られたプラークのニトロセルロース上のプ
ラークリフトを、キナーゼ処理した合成プライマーとハ
イブリダイズさせた後、正確にマッチするものは結合さ
せるが、元のストランドとマッチしないものは結合させ
ないのに充分な洗浄温度で洗浄する。次に、プローブと
ハイブリダイズするプラークを取り出し、培養し、そし
てＤＮＡを回収する。
【０１０８】構築の確認 以下に述べる構築では、プラスミド構築のためのライゲ
ーションが正しく行われていることを、M. Casadaban博
士より得たE. coli株MC1061(Casadaban, M.ら、J. Mol.
Biol.(1980)138:179-207)、あるいは他の適切な宿主を
先ずライゲーション反応混合物で形質転換することによ
って確認する。成功した形質転換体を、当該分野で知ら
れているように、プラスミド構築の形態によって、アン
ピシリン、テトラサイクリン、あるいは他の抗生物質へ
の耐性によって、あるいは他のマーカーを用いて選択す
る。次に、Clewell, D.B.ら、PNAS(1969)62:1159の方法
に準じて、必要に応じてクロラムフェニコールでの増幅
(Clewell, D.B., J.Bacterial.(1972)110:667)後、形質
転換体からプラスミドを調製する。通常、例えば、Holm
es, D.S.ら、Anal. Biochem. (1981)114:193-197および
Birnboim, H.C.ら、Nucleic Acids Res. (1979) 7:1513
-1523のようにいくつかのミニＤＮＡプレップが使用さ
れる。単離されたＤＮＡを制限酵素によって分析し、お
よび／あるいは、Sanger, F. ら、PNAS(1977) 74:5463
の方法であり、さらにMessingらのNucleic Acids Res.
(1981)9:309に記載のジデオキシヌクレオチド法、ある
いはMaxamらのMethods in Enzymology(1980)65:499の方
法により配列決定される。
【０１０９】実施例の宿主 本明細書中のクローニングおよび原核細胞での発現に使
用される宿主は次のものである：クローニングおよびシ
ーケンシング、およびほとんどの細菌のプロモーター制
御下での構築物の発現には、Ｂ、MC1061、DH1、RR1、C6
00hfl-、K803、HB101、JA221、JM101およびJM103のよう
なE. coliの株を使用した。
【０１１０】方法の説明 次の実施例は、本発明をより良く理解するために説明す
ることを目的とする。しかし、実施例は、本発明の範囲
をいかなる場合にも限定することを意図しない。血管内
皮細胞増殖因子をコードするＤＮＡは、濾胞星状細胞ポ
リ（Ａ）*RNAの調製物中の所望の配列を増幅して、重要
なプローブを先ず取ることから最初は得られる。しか
し、この方法を繰り返すことは必ずしも必要ではない。
なぜならば、重要なプローブの配列は、現在では知られ
ており、化学的にインビトロで構築し得るからである。
さらに、図３ａに示す配列を有するプラスミドが、アメ
リカンタイプカルチャーコレクション（American Type
Culture Collection）、Rockville, MDに寄託されてい
る。
【０１１１】次の実施例では、以下に記載のバッファー
は、示されている組成物を含有する：
【０１１２】
【表１】
【０１１３】
【実施例】実施例１ 濾胞星状細胞mRNAからのプローブの増幅 図２を参照して、ウシ濾胞星状細胞（細胞は、Ferrara,
N.らのMethods in Enzymology, Conn，P.M.編、 Vol.1
24, pp 245-253, Academic Press, N.Y.(1986):Ferrar
a, N.ら、(1987) PNAS, 84:5773-5777に記載のように単
離した）の５μgのポリ（Ａ）+RNAを、ウシ血管内皮細
胞増殖因子の既知のアミノ酸35位から39位の配列に基づ
く１μgのアンチセンスプライマーオリゴヌクレオチド
とともに、エタノール沈澱した。#4296と命名したこの
オリゴヌクレオチドは、16倍の縮重（degeneracy）を有
する24-merである。縮重は、アミノ酸35位から39位をコ
ードするアンチセンスストランドに相当する14塩基の領
域に限定された。14塩基の５’側末端に、EcoRI制限部
位を有する10塩基のリンカーを加えた。オリゴヌクレオ
チドプライマーの配列は以下の通りである：
【０１１４】
【化１】
【０１１５】mRNAおよびオリゴヌクレオチドを、55μl
の36mM KCl、９mM MgCl2、45mM Tris pH 7.5、12単位の
RNasinおよび各々0.5mMの４つのdNTPに溶解した。サン
プルを70℃まで２分間加熱し、次いで室温に戻した。プ
ライマーのハイブリダイゼーション部位に隣接するmRNA
の一部に相補的なＤＮＡアンチセンスストランドの合成
のために、60単位のトリ骨髄芽球症ウイルス（avian my
eloblastosis virus）の逆転写酵素を加え、次いで室温
で２分間反応させ、そして42℃に45分間置いた。次にサ
ンプルをフェノールおよびクロロホルムで抽出し、エタ
ノールで沈澱させて乾燥させた。
【０１１６】次に、最初に合成したストランドの全てを
鋳型として使用して、第二のＤＮＡストランドを合成し
た。第二のストランドの合成のために、乾燥したペレッ
トを50μlの50mM NaCl、７mM MgCl2、７mM Tris pH 7.5
および各々１mMの４つのdNTPに溶解した。さらに、ウシ
血管内皮細胞増殖因子の既知のアミノ酸の15位から19位
の配列に基づく、センスストランドオリゴヌクレオチド
プライマー１μｇを加えた。#4295と命名されたオリゴ
ヌクレオチドは、８倍の縮重を有する24-merであった。
縮重は、アミノ酸の15位から19位のコード領域のセンス
ストランドに相当する14塩基の領域に限定された。これ
らの14塩基の５’側末端に、HindIII制限部位を有する1
0塩基のリンカーを加えた。オリゴヌクレオチドプライ
マーの配列は以下の通りである：
【０１１７】
【化２】
【０１１８】サンプルを100℃に２分間加熱し、次いで2
8℃に戻した。第二ストランドの合成は、10単位のＤＮ
Ａポリメラーゼ、すなわちクレノウフラグメントを加え
て、28℃で10分間行われた。その後、ポリメラーゼ酵素
を100℃で２分間加熱して不活化した。
【０１１９】２つのプライマーのハイブリダイゼーショ
ン部位の間にわたるＤＮＡ配列を、自動サーマルサイク
ラー（Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler）での
酵素触媒による重合反応の一連の繰り返しにより増幅し
た。チェーン反応には、５μlの上述の反応物を、１×
の反応混合物に、10μlの10×Taq混合バッファー（Cetu
s Corp.のポリメラーゼチェーンリアクションキット中
に供給されている）、52μl dH2Oおよび４つのdNTPすべ
てを1.25mMずつ含有する16μlを加えて100μlとした。
さらに、10％（最終濃度）のDMSO、および上述の1μgの
各センスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドを、Cetus kitに入っているTaqポリメラー
ゼ２μlとともに加えた。反応混合物に200μlのミネラ
ルオイルを重層し、そしてサーマルサイクラーに入れ
た。サイクラーを次のサイクルを繰り返すようにプログ
ラムした： １．94℃で１分間、変性 ２．55℃で２分間、アニール ３．72℃で３．５分間、ＤＮＡ合成。
【０１２０】増幅反応は、30サイクル行った。
【０１２１】増幅反応物のＤＮＡの一部（20μl）を、H
aeIIIで消化したpUC8 DNAをサイズマーカーに用いて、
６％のポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。ゲル
を臭化エチジウムで染色した。染色したゲルを図５に示
す。主要なバンド（図５で、矢印で指す）は、80と100
塩基対との間の塩基対であり、２つのオリゴヌクレオチ
ドプライマーおよび２つのプライマーに囲まれたアミノ
酸コード領域のセグメントをコードするのに適切な長さ
のＤＮＡ（94塩基対）に相当した。このバンドをゲルか
ら切り出し、ゲル片からＤＮＡを、0.5×Tris-ホウ酸
EDTAバッファー（0.045M Tris base、0.045Mホウ酸、0.
001M EDTA）中で30ボルトで電気溶出した。得られたＤ
ＮＡをエタノールで沈澱させた。
【０１２２】実施例２ 増幅したプローブのサブクローニングおよび配列決定 実施例１に記載のようにゲルから電気溶出したＤＮＡ
を、バクテリオファージM13mp18およびM13mp19中にサブ
クローニングした。ゲルから得られたＤＮＡの半分を、
20μlの水に溶解し、HindIII消化の標準的バッファー中
で、HindIIIで90分間、37℃で消化した。反応液のTris-
HCl(pH 7.5)の濃度を85mMに上げてEcoRIを加え、反応液
をさらに37℃で90分間インキュベートした。別の反応で
は、次に反応当り約10分の１の消化した調製物を、T4 D
NAリガーゼの存在下で、HindIIIおよびEcoRIで消化した
M13mp18ファージおよびM13mp19ファージの２本鎖ＤＮＡ
（Yanisch-Perronら、Gene(1985) 33:103）とライゲー
トした。次に、標準の方法を用いて各々のライゲーショ
ン反応混合物でE. coli JM103をトランスフェクトし、
そして５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリル-β-Ｄ-ガラ
クトピラノシド（X-gal）およびイソプロピル-β-Ｄ-チ
オガラクトピラノシド（IPTG）を含有するＬプレート上
に蒔いた。M13mp19との反応の場合には、プレートにプ
ラークが形成された後、プラークの一部をニトロセルロ
ースフィルターペーパーに移し、標準の方法でNaOHで処
理して溶菌し、そして80℃で２時間、バキュームオーブ
ン中で焼き付けた。所望の挿入配列の存在をスクリーニ
ングするために、プラークリフトを放射標識したオリゴ
ヌクレオチドプライマー＃4296のサンプルでプローブし
た。プローブ＃4296は、プラークリフトの多くのプラー
クとハイブリダイズし、そのうちの４つをさらなる分析
のために選んだ。M13mp18との反応の場合には、白いプ
ラークが、挿入フラグメントがファージベクターのEcoR
IおよびHindIII部位との間にライゲートされたことを示
すことに基づいて、さらなる分析のために４つのプラー
クを拾い上げた。
【０１２３】M13mp18およびM13mp19で感染させたプレー
トの各々から拾い上げた４つのプラークをJM103に感染
させ、標準の方法を用いて感染した培養物から複製型
（RF）ＤＮＡを調製した。次に、各感染物からRF DNA
を、HaeIIIで切断し、ポリアクリルアミドゲルに流し
た。電気泳動は、サイズマーカーにHaeIIIで切断したpU
C8およびHaeIIIで切断したM13mp18 RFを用いて、行っ
た。臭化エチジウムで染色後、８つのサンプルのレーン
全てのＤＮＡは、ポリメラーゼチェーンリアクションで
用いるプライマーの設計に使用されたアミノ酸配列を含
む、その２つのアミノ酸配列の間にあるアミノ配列をコ
ードする正しいサイズの挿入物を有することが示され
た。
【０１２４】正しい長さの挿入配列を有することを示し
たM13mp19プラークの１つ、および４つのM13mp18プラー
クをさらなる分析のために、拾い上げた。次に一本鎖Ｄ
ＮＡを、配列決定のために、標準の方法（Messing, J.,
Methods in Enzymology (1983)101:20-78）で調製し
た。５つの単離したクローン中の挿入配列を図１に示
す。４つのM13mp18クローンのシーケンシングゲルの１
つの領域（図１のヌクレオチド32-35）は、明確に解読
し得なかった。M13mp18の配列の解読できない領域を除
いて、５つの配列決定したクローンのうちの４つは、ポ
リメラーゼチェーンリアクションで使用した２つのプラ
イマー配列がハイブリダイズする部位およびその間にあ
るmRNAの領域にコードされる、ウシ血管内皮細胞増殖因
子のその部分に相当する同じアミノ酸配列をコードして
いた。５つ目の配列決定したクローンは、コードするア
ミノ酸の１つが異なり、それは、ウシ血管内皮細胞増殖
因子のアミノ酸27位に相当し、Pro(CCC)ではなくHis(CA
C)をコードする。図１は、５つのクローンの挿入物のＤ
ＮＡ配列および、M13mp19クローン挿入物のコンセンサ
スＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を示す。５つの単
離された配列のほとんどの非相同ヌクレオチドは、ポリ
メラーゼチェーンリアクションに使用したプライマー配
列にあり、これは、場合によっては、ヌクレオチドミス
マッチを１つ有するプライマーの縮重オリゴヌクレオチ
ドが、血管内皮細胞mRNA中のタンパク質をコードする配
列にハイブリダイズして、そして増幅されたことを示す
ことがわかる。他の配列の違いは、たぶん、ポリメラー
ゼのエラーか、あるいは血管内皮細胞増殖因子mRNAの多
型性であろう。これらの配列は、天然のＤＮＡ配列に正
確には対応しないが、それにもかかわらず、５つのうち
の４つは血管内皮細胞増殖因子の正しいアミノ酸配列
（M13mp18クローンの解読できない領域を除いて）をコ
ードする。さらに、それらは、ウシ血管内皮細胞増殖因
子の全長ＤＮＡ配列の単離あるいはウシ以外の種のこれ
に相当するタンパク質をコードするＤＮＡの単離のため
のプローブとして使用し得る。増幅されたＤＮＡが、M1
3mp19にライゲートされている、拾い上げたファージ
を、pET-19Aと命名しなおした；以下の実施例３に述べ
るように、このファージに挿入されたフラグメントを、
濾胞星状細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングす
るプローブとして使用した。
【０１２５】実施例３ ウシ血管内皮細胞増殖因子（120個のアミノ酸の形態）
をコードするｃＤＮＡの回収 Huynhら、DNA Cloning, D.M. Glover編、Vol.I, p.49,
IRL Press, Washington, D.C.(1985)の方法の改変法で
ウシ濾胞星状細胞ｃＤＮＡライブラリーを、λgt10バク
テリオファージ中に調製した。ライブラリーのｃＤＮＡ
を作るのに使用するポリ（Ａ）+RNAは、公表されている
方法（Ferraraら、PNAS(1987) 84:5773-5777）によっ
て、Denis Gospodarowicz博士によりウシ下垂体から単
離され、増殖された濾胞星状細胞から得た。λgt10中の
ｃＤＮＡライブラリー（約1.5×106ファージ）をC600hf
l-細胞に蒔いた（プレート30枚、５×104ファージ／プ
レート）。各々のプレートのプラークリフトを２つ、ニ
トロセルロースフィルターペーパー上に取った。フィル
ターを変性溶液（0.2M NaOH、1.5M NaCl）に３分間浸し
た後、中和溶液（２×SSC、0.4Ｍ Tris pH 7.5）に３分
間浸し、そして洗浄溶液（２×SSC）に３分間浸した。
次にフィルターを風乾し、そしてバキュームオーブン中
80℃で２時間焼き付けた。１セットのフィルターを200m
lの40％ホルムアミドバッファー中42℃で、プレハイブ
リダイズさせた。
【０１２６】フィルターのスクリーニング用プローブを
調製するために、一本鎖調製物を、上述の実施例２に記
載のM13mp19由来のファージpET-19Aから、標準法（Mess
ing,J., Methods Enzymol. (1983) 101:20-78）を用い
て作製した。この調製物を、「ユニバーサル」プライマ
ー（Messing, J., Methods Enzymol. (1983) 101:20-7
8）とハイブリダイズさせ、そしてpET-19Aに相補的なス
トランドを、クレノウフラグメントポリメラーゼおよび
α32Ｐ-dNTPsを用いてプライマーを伸長させることによ
り、合成した。
【０１２７】プラークリフトの１セットを、この放射標
識したプローブでスクリーニングした。プローブを100
℃で２分間加熱して２本鎖ＤＮＡを融解させ、そして氷
上に放置した。次にこのプローブ（１ml;５×108cpm）
を、プレハイブリダイゼーションに使用した40％ホルム
アミドバッファー200mlに加え、完全に混合した。プレ
ハイブリダイズさせたフィルターを加え、そして42℃の
湯浴中揺らしながら一晩インキュベートした。次にフィ
ルターを、0.1％ SDSを含む１×SSC(20×SSCは、３Ｍ N
aCl、0.3Ｍ クエン酸ナトリウムに相当する）で、50℃
で数時間洗浄した。洗浄後、フィルターを-70℃から-80
℃でＸ線フィルムに一晩露出した。
【０１２８】約32個のポジティブと推定されるクローン
を、最初のpET-19A由来の、プライマーから伸長させた
プローブとのスクリーニングで同定した。1c-10cと同定
された10個のクローンをさらなるスクリーニングのため
に選んだ。
【０１２９】プラークリフトの２つ目のセットを、図１
に示すpET-19Aの増幅したＤＮＡ挿入物の配列に基づい
てデザインした、合成オリゴヌクレオチド放射標識プロ
ーブでスクリーニングした。プローブ#4340と同定され
たオリゴヌクレオチドは、アンチセンスストランドに相
当し、次のヌクレオチド配列： 5'-CAC CAG GGT CTC GAT GGG ACG GCA GAA GCT GCG CTG
GTA-3' を有する39-merのオリゴヌクレオチドであった。フィル
ターを、100mlのLong Oligoプレハイブリダイゼーショ
ンバッファーで約６時間、43℃でプレハイブリダイズさ
せた。次に、プレハイブリダイゼーションバッファー中
のフィルターを湯浴中65℃で10分間加熱した。γ-32Ｐ-
ATPおよびポリヌクレオチドキナーゼを用いて放射標識
したプローブ（５×108cpm）を65℃のバッファーに加
え、水浴の加熱を止めて温度をゆっくりと室温まで下げ
た。翌日、フィルターをハイブリダイゼーションバッフ
ァーから取り出し、45℃で２時間洗浄（３×SSC、0.1％
SDS中で６〜）した。洗浄液は１時間目で交換した。フ
ィルターを乾燥させ、そして-70℃から-80℃でＸ線フィ
ルムに一晩露出した。
【０１３０】プローブ＃4340にハイブリダイズするクロ
ーンのうち、１つのクローンのみが、pET-19Aにハイブ
リダイズした最初のセットのフィルターからの32クロー
ンのうちの１つに相当するようであった。このクローン
は、さらなる分析のために拾い上げた元の10個のうちの
１つではなかった。従って、このクローンを拾い上げ、
クローン11cと命名した。#4340にプロービングさせたフ
ィルターを、よりストリンジェントな条件（１×SSC、
0.1％ SDS、65℃）で再度洗浄した。それにより、ポジ
ティブと推定されるクローンの数は、pET-19Aにハイブ
リダイズしたクローン11cを含めて約６個に減った。
【０１３１】拾い上げたクローン2c-11cを第二ラウンド
のスクリーニング用に平板培養した。クローンを「捨い
上げる」ために、寒天プレートの適当な部分から各々の
クローン寒天片を取り出した。すなわちファルコンの12
×75mm滅菌チューブの口を、プレートから移されたフィ
ルター上のポジティブシグナルに相当する、プレートの
所望の部分に当てて、寒天をつきぬけるように押し下
げ、切り取られた寒天片を滅菌したへらで拾い上げて取
った。次に各々の寒天片を１mlのSMバッファー（100mM
NaCl;８mM MgSO4; 50mM Tris pH 7.5; 0.01％ ゼラチ
ン）中に入れ、ボルテックスで混ぜ、そして約20分間室
温において、ファージを寒天から浸出させた。拾い上げ
たクローンから得られた懸濁液各々の１μlを１mlのSM
バッファー（１：1000希釈）に懸濁させた。次に、ファ
ージの１：1000希釈物各々の10μlを、590-600μlの培
養用細胞（C600hfl-）が入っているファルコンの75×10
0mmチューブに移し、次いで、10μlをこのチューブか
ら、590-600μlの培養用細胞が入っている第二のチュー
ブに移し、さらに第二のチューブから第三のチューブに
移して段階希釈した。ファージを37℃で20分間吸着さ
せ、そして各チューブのファージ／C600hfl-混合物を、
150mmの平板寒天培地に約10mlの上層アガロースととも
に蒔いた。この平板培地を一晩、37℃でインキュベート
した。１平板培地当り約5000個のファージを有する平板
培地を、ニトロセルロースフィルターぺーパー上にプラ
ークリフトを取るのに使用した。次に、フィルター上の
ＤＮＡを、上述の最初のｃＤＮＡライブラリーの一次ス
クリーニングでのプラークリフトと同じ様式でフィルタ
ーをNaOHで処理することにより、変性させた。焼き付け
た後、フィルターを、42℃の湯浴中で揺らしながら２時
間、密封できるプラスチックバッグ（１つのバッグ当り
３個のフィルター）中の10mlの50％ホルムアミドバッフ
ァーに浸してプレハイブリダイズさせた。
【０１３２】これらのフィルターをスクリーニングする
ためのプローブを調製するために、二本鎖（複製型）の
調製物をM13mp19由来のファージpET-19Aから作製した。
この調製物をEcoRIおよびHindIIIで消化し、そして増幅
されたＤＮＡセグメントを示す82塩基対の挿入フラグメ
ントをゲル電気泳動により単離し、次いでクレノーフラ
グメントポリメラーゼおよびα32Ｐ-dNTPで一本鎖の末
端を満たすことにより標識した。このプローブを２分間
煮沸し、二本鎖ＤＮＡを融解し、氷上で冷却し、次いで
フィルターを浸漬するプレハイブリダイゼーションバッ
ファーに加えた。このフィルターを振盪水槽中で42℃で
一晩インキュベートし、そして50℃で１〜1/2時間、0.1
×SSC、0.1％ SDS洗浄バッファー中で２回バッファー交
換することにより洗浄した。このフィルターを−70℃か
ら−80℃で一晩、Ｘ線フィルムに曝した。
【０１３３】クローン11cの再プレートを示すプレート
上の３個のポジティブクローンは、pET-19A由来の82塩
基対の挿入フラグメントにハイブリダイズした。さら
に、クローン7cの再プレートを示すプレート上に１個の
問題となるポジティブクローンがあると考えられた。こ
れら４個のポジティブクローンをパスツールピペットの
広い方の末端部を用いて寒天プレートから切取り、プレ
ートする細胞中に希釈し、そして前記のものと同様の方
法で３回目のスクリーニングのために再びプレートし
た。２回目のスクリーニングにおいてクローン11cを示
すプレート上で３個のポジティブクローンの３回目のス
クリーニングのために製造された３個のプレートを11
A、11Bおよび11Cと名付けた。上記のように、２つのプ
ラークリフトをニトロセルロースフィルターぺーパー上
に各プレートから調製した。このフィルター上のＤＮＡ
を、上記と同様の方法を用いて、変性し、そして焼き付
けた。プラークリフトの第一のセットを放射標識された
プローブ#4340（前に記載された）でスクリーニング
し、そしてプラークリフトの第二のセットをpET-19Aの8
2塩基対挿入物から調製された前述のプローブでスクリ
ーニングした。
【０１３４】フィルターの第一のセットを、室温で、シ
ョートオリゴプレハイブリダイゼーションバッファー７
mlを含有するプラスチックバッグ中に浸漬することによ
りプレハイブリダイズした。放射標識されたプローブ#4
340をこれらのフィルターを含有するプレハイブリダイ
ゼーションバッファーに加えた。このバッグを数分間65
℃の振盪水槽セット中に据えることにより温度を65℃に
した。次いで、この水浴の加熱を止め、温度を緩やかに
室温まで戻した。インキュベーションを室温で約２〜1/
2日間続けた。
【０１３５】このフィルターの第二のセットを50％ホル
ムアミドバッファー10mlを含有するプラスチックバッグ
中に浸漬し、そして42℃でインキュベーションして、プ
レハイブリダイズした。pET-19Aの82塩基対挿入物から
調製されたプローブを煮沸し、そしてフィルターの第二
のセットを含有するプレハイブリダイゼーションバッフ
ァーに直接加えた。このハイブリダイゼーション反応液
を約２〜1/2日間42℃で振盪水槽中でインキュベートし
た。
【０１３６】プローブ#4340とハイブリダイズしたフィ
ルターのセットを55℃で１×SSC、0.1％ SDS中で洗浄し
た。pET-19A由来のプローブでハイブリダイズされたフ
ィルターのセットを55℃で0.1×SSC、0.1％ SDS中で洗
浄した。フィルターの両セットを３〜1/2時間Ｘ線フィ
ルムに曝した。プレート11A、11Bおよび11C上の数個の
プラークは、プローブ#4340およびpET-19A由来の塩基対
挿入物の両方に強くハイブリダイズした。いずれかのプ
ローブとハイブリダイズする２回目のスクリーニングの
プレート7cから取り出して希釈したものは、このプレー
ト上でプラークを表さなかった。プレート11Aからの２
個の強くハイブリダイズしたプラークをパスツールピペ
ットの細い方の末端を用いて取り出した。11A'および11
B'と名付けられたこれらのクローンをプレート細胞中で
希釈し、前記のように、４回目のスクリーニングとして
再プレートした。
【０１３７】ポジティブクローン11A'および11B'から調
製されたプレートのそれぞれから２個のプラークリフト
をニトロセルロースフィルターぺーパー上に調製した。
このフィルター上のＤＮＡを上記のものと同様の方法を
用いて変性し、そして焼き付けた。フィルターの各セッ
トをショートオリゴプレハイブリダイゼーションバッフ
ァー10mlを含有するプラスチックバッグ中に浸漬するこ
とによりプレハイブリダイズし、そして室温でインキュ
ベートした。プレート11A'および11B'のそれぞれ由来の
第一のプラークリフトを放射標識したプローブ#4340
（前で記載された）でスクリーニングした。このプロー
ブをこのフィルターおよびプレハイブリダイゼーション
バッファーを含有するプラスチックバッグに加え、初め
に65℃でインキュベートし、次いで、上記のように緩や
かに冷却した。プレート11A'および11B'のそれぞれ由来
の第二のプラークリフトを、放射標識が48倍に縮重され
た混合オリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングし
た。プローブはプローブ#4255と名付けたが、それはウ
シの血管内皮細胞増殖因子の内因性のトリプシン消化フ
ラグメント由来のアミノ酸に基づいており、そしてそれ
は以下の配列を有する：
【０１３８】
【化３】
【０１３９】このハイブリダイゼーションの条件は、プ
ローブ#4340に対して記載されたものと同一であった。
プレート11A'および11B'由来のプラークリフトをｌ×SS
C、0.1％ SDSで55℃で（#4340）または３×SSC、0.1％
SDSで30℃で、次いで３Ｍテトラメチルアンモニウムク
ロライド（TMACl）、0.05Ｍ トリス-塩酸、pH8.0、0.1
％SDS、0.002Ｍ EDTAで45℃で（#4255）洗浄し、そして
フィルムに曝した。両プレート由来のプラークは、プロ
ーブ#4340およびプローブ#4255の両方にハイブリダイズ
するとともに、それぞれのフィルター上の全てのプラー
クとハイブリダイズすることを見い出した。それによ
り、クローン11A'および11B'が一本鎖の、純粋なクロー
ンを構成するという結論が下された。
【０１４０】クローン11B'のＤＮＡ挿入物の配列決定
は、まずEcoRIでファージＤＮＡを消化し、６％ポリア
クリルアミドゲル上でその消化物を分画し、約800塩基
対の挿入フラグメントを電気溶出し、そしてEcoRI切断
のM13mp18中にこのフラグメントを連結することによっ
て行い、次いで、標準的な方法を用いて、ジデオシヌク
レオチド法によってこの挿入物の配列を決定した。この
ヌクレオチド配列、およびコードされたアミノ酸配列は
図３ａにおいて示されている（この図には、797個のヌ
クレオチド挿入物の配列のうちの７番目から795番目の
ヌクレオチドのみが示されており；各末端のEcoRIリン
カー配列は、省略している）。797個のヌクレオチドか
らなる挿入配列は、ウシ血管内皮細胞増殖因子の既知の
タンパク質配列のアミノ酸番号15から始まる、既知のア
ミノ酸配列をコードする。オープンリーディングフレー
ムはヌクレオチド327位のフレーム内の転写終止コドン
まで伸びる。クローン11B'の挿入配列をプラスミドpUC8
のEcoRI部位に連結した。得られたpST800と呼ばれるプ
ラスミドは、E．coli JM83宿主に入れてAmerican Type
Culture Collection, Rockville, MDに受託番号68060で
寄託されている。
【０１４１】成熟型のウシ血管内皮細胞増殖因子をコー
ドする全長コード配列を、図３ｂの配列と共に図３ａに
示す。図３ｂの二本鎖ＤＮＡ配列は、５’末端近くに転
写開始コドンATGを有し、ヒト細胞の遺伝子発現で好ま
しく選択されるコドンに基づき選ばれる配列を表してお
り、ウシタンパク質のＮ末端表示部（開始メチオニン残
基で先行される）をコードし、図３ａに示されたコード
配列と重複している。成熟型のウシ血管内皮細胞増殖因
子をコードする全長コード配列を作るために、図３ｂの
ＤＮＡ配列はオリゴヌクレオチド合成の周知の方法を用
いて合成し得、そしてATCCに寄託されたプラスミドから
好都合に得られる図３ａの配列の部分に、酵素的に結合
し得る。図３ａおよび３ｂの配列を結合する前に、図３
ａの配列をEcoRIを用いてプラスミドpST800から切り出
し、単離した挿入物をNlaIVで消化する。NlaIVはこの挿
入物を５回、全て３'非翻訳領域内において切断する。
次に、好都合な制限部位、例えばHindIIIをコードする
リンカーを、ブラントエンド連結を介して最も５’末端
側のNlaIV部位に結合させる。得られたライゲーション
反応混合物を、次にAccIおよびリンカー酵素（例えばHi
ndIII）で消化し、３’末端（NlaIV部位に）連結された
リンカーの消化物の付いた、pST800挿入物の325塩基対
フラグメント（AccI-NlaIV）を遊離させる。フラグメン
トを精製し、図３ｂに示す合成フラグメントに連結す
る。ライゲーション混合物をNcoIおよびリンカー切断制
限酵素（例えばHindIIIリンカーを用いた場合にはHindI
II）で消化すると、５’側には消化されたNcoI部位が隣
接し、また３’側にはフラグメントの発現ベクターへの
挿入に有用な、消化された制限酵素部位が隣接した、成
熟型のウシ血管内皮細胞増殖因子をコードする所望のコ
ード配列が得られる。
【０１４２】この混成配列は適切な発現ベクターの、原
核または真核宿主内で発現を指示し得る調節エレメント
の制御下に挿入される。E．coliでの発現に好適なベク
ターには、pKK233-2（AmmanおよびBrosius, Gene (198
5) 40:183-190）があり、これはPharmacia, Inc.から市
販されている。このベクターのNcoIとHindIII部位の間
に混成配列を挿入すると、コード配列はtrcプロモータ
ーの制御下に置かれる。次に発現ベクターはE．coliの
ような好適な宿主の形質転換に用いられ、形質転換体は
コードされたＤＮＡが発現される条件下で培養される。
次に、発現されたタンパク質を当該分野に慣例の方法で
回収する。
【０１４３】もちろん、他の配列が図３ａの配列に結合
可能である。例えば、図３ｂの配列は、５’末端がNcoI
部位ではなくNdeI部位を表すように改変し得る。哺乳動
物での発現に対しては、図３ｂのコード配列を５’方向
に延ばして、随意に分泌シグナル配列、例えばヒト成長
ホルモンのシグナル配列に結合した、ウシ血管内皮細胞
増殖因子のアミノ末端配列をコードするようにし得る。
【０１４４】あるいは、図３ａに示されたコード配列
は、ＤＮＡハイブリダイゼーションの標準的条件下でプ
ローブとして使用し、ウシ血管内皮細胞増殖因子または
ヒトを含む他の哺乳動物種の相当するタンパク質をコー
ドする、天然の全長ＤＮＡ配列を回収することができ
る。図３ａの配列はｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブ
ラリーから所望の配列を回収するためのプローブとして
使用し得る。
【０１４５】ウシ血管内皮細胞増殖因子mRNAの５’末端
方向に伸長されたクローンは、アンチセンスオリゴヌク
レオチド4338（5'-GCCAAGCTTGCACCAGGGTCTCGATGGGACGGC
AGAA-3'）をプライマーとして用いて、実施例１に記載
のように第一鎖ｃＤＮＡ合成をプライムし、次に得られ
た二重鎖の５’末端に、オリゴヌクレオチド4537および
4514（それぞれ5'-GATCGCGG-3'および5'-CCGCGATCAAGCT
TCCCGGGAATTCGGC-3'）からなる部分二本鎖リンカー分子
を連結して作製した。最後に、生成物をオリゴヌクレオ
チド4338および4315（5'-GCCGAATTCCCGGGAAGCTTGATCGCG
G;4514に相補的）をプライマーとして用いてポリメラー
ゼ連鎖反応で増幅した。ジデオキシヌクレオチド法で配
列決定したところ、得られたクローンから図５に示す
５’配列を得た。
【０１４６】実施例４ ウシ血管内皮細胞増殖因子(ｂＶＥＧＦ164)をコードす
るｃＤＮＡの回収 ｂＶＥＧＦ120（図３ａ）以外のVEGF型を単離するため
に、卵胞星状体（foliculo stellate）ポリ（A）+RNAを
鋳型として用い、アンチセンスオリゴヌクレオチド4456
（5'-GTAGTTCTGTGTCAGTCTTTCCTGGTGAGACGTCTGGTTCCCGAA
ACCCTGAGGGAGGCT-3'）をプライマーとして用いて、第一
鎖ｃＤＮＡ合成を行った。得られた生成物を次に、アン
チセンスオリゴヌクレオチド4456およびセンスオリゴヌ
クレオチド4414（5'-TTCTGCCGTCCCATCGAGACCCTGGTGGACA
TCTTCCAGGAGTACCCAGATGAGATT-3'）をプライマーとして
用いてポリメラーゼ連鎖反応で30回増幅した。生成物の
ポリアクリルアミドゲル分析およびＤＮＡ配列決定によ
り、図６に示すように２種類の血管内皮細胞増殖因子を
コードするｃＤＮＡが明らかになった。図６に示され
た、四角く囲った132bpの挿入を含むオープンリーディ
ングフレームは、ｂＶＥＧＦ164をコードする。
【０１４７】実施例５ ヒト血管内皮細胞増殖因子をコードするゲノムＤＮＡの
回収 血管内皮細胞増殖因子のアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａを含有する、ヒトゲノムのクローンは、市販のヒト肺
線維芽細胞ゲノムライブラリー（Stratagene Inc., La
Jolla, CA）から単離した。１μlのストックファージ
（約３×1010ファージ／ml）を１ml SMバッファーに希
釈し、20μlのCHCl3を加えた。LE392細胞（hsdR514(r-,
m-）、supE44、supF58、lacY1またはΔ(lacIZY)6、galK
2、galT22、metB1、trpR55、λ-)はNZYM培地でO.D.600
が0.5になるまで増殖させ、細胞を回収し、10mM MgSO4
に再懸濁した。30個の試験管の各々の中で、２μlの希
釈したファージストックを0.6mlの細胞に混合し、37℃
で15分間インキュベートした。10mlのNZYMトップアガー
を各試験管に加え、各試験管の内容物を150mm NZXYMプ
レートに撒き、37℃で16時間インキュベートした後温度
を４℃に下げた。30個のプレートの各々から、ニトロセ
ルロースフィルター上に２枚のプラークリフトを移し
た。フィルター上のＤＮＡを変性させ、実施例３に記載
のように焼き付けた。次にフィルターを、37℃で６時
間、40％ホルムアミド緩衝液中でプレハイブリダイズさ
せた。
【０１４８】フィルターは、前述の実施例３で作製した
プラスミドであるプラスミドpST800からのゲル精製され
たEcoRI挿入フラグメントをニックトランスレーション
して調製した、放射標識プローブでプロービングした。
pST800の797塩基対のEcoRI挿入は、ウシ血管内皮細胞増
殖因子の一部分をコードするｃＤＮＡフラグメントを含
有する。プローブは100℃で２分間煮沸して二本鎖ＤＮ
Ａを融解した後、氷冷した。プローブはフィルターを含
むプレハイブリダイゼーション用バッファーに直接、10
6cpm／mlとなるように加え、フィルターを37℃で一晩、
ハイブリダイズさせた。フィルターを50℃にて１×SS
C、0.1％ SDSで、洗浄バッファーを３回替えて洗浄し、
次に吸い取りにより乾燥させ、Ｘ線フィルムに−70℃か
ら−80℃で一晩さらした。曝されたフィルムはプレート
当り約200個の陽性クローンを示し、そのうち19個のク
ローンは強い陽性であることを特徴とした。
【０１４９】19個の強い陽性クローンのうち、12個を釣
り上げ、前述の実施例３に記載のように希釈し、再度プ
レートに撒いて第二回目のスクリーニングを行った。再
プレートしたファージから、前述のように各々２枚のプ
ラークリフトを調製した。フィルターを37℃で６時間、
40％ホルムアミドバッファーでプレハイブリダイズさせ
た。このフィルターの１枚を第一回目のスクリーニング
に用いたのと同じプローブを用いて37℃で一晩、ハイブ
リダイズさせた。もう一枚のフィルターは、第一回目の
釣り上げた陽性クローンがプローブ配列のサブクローニ
ングに用いたベクター由来の配列とはハイブリダイズし
ないことを確実にするために、ニックトランスレーショ
ン放射標識pUC8とハイブリダイズさせた。フィルターを
50℃にて１×SSC、0.1％ SDSで洗浄し、フィルムにさら
した。この第二回目のスクリーニングで、12個の再プレ
ートしたクローンのうち６個が、pST800由来のプローブ
に対してまだ陽性であり、pUC8プローブに対しては陽性
ではなかった。
【０１５０】第二回目のスクリーニングで陽性の６個の
クローンの各々から、陽性プラークを釣り上げた。６個
の釣り上げたプラークを前述のように希釈し、再プレー
トして第三回目のスクリーニングを行った。さらに、第
一回目のスクリーニングで強い陽性であったが再スクリ
ーニングしなかった、７個のクローンを釣り上げ、再プ
レートして第二回目のスクリーニングを行った。再プレ
ートしたクローンの各々から、前述のように２枚のプラ
ークリフトを調製した。これらのフィルターを40％ホル
ムアミドバッファー中で、37℃にて５時間、プレハイブ
リダイズさせた。
【０１５１】第二回目のスクリーニングからの６個の陽
性クローンのうちの一枚のプラークリフトには、前述の
pST800由来の797塩基対挿入をニックトランスレーショ
ンした106cpm/mlを加えた。フィルターおよびプローブ
はプレハイブリダイゼーション用バッファー中で37℃で
一晩、ハイブリダイズさせた。この６個の陽性クローン
のうちのもう１枚のプラークリフトには、前述のpST800
の797塩基対挿入のEcoRI-HpaII断片をニックトランスレ
ーション法で調製したプローブを加えた。EcoRI-HpaII
断片は797塩基対の挿入の５’末端の331塩基対からなっ
ており、従ってＡおよびＴのヌクレオチドに富んだ挿入
の３’末端を失っていて、これが初期の回のスクリーニ
ングでの間違ったハイブリダイズ陽性の原因であったか
もしれない。
【０１５２】第一回目の陽性クローンからの７個の再プ
レートされたプラークリフトの２枚には、797塩基対の
プローブをニックトランスレーションした106cpm/mlを
加えた。プローブはプレハイブリダイゼーション用バッ
ファー中で37℃で一晩ハイブリダイズさせた。
【０１５３】全てのフィルターは50℃にて２時間、１×
SSC、0.1％ SDSで、バッファーを２回替えて洗浄した。
フィルターを乾燥させ、Ｘ線フィルムに−70℃から−80
℃で３時間さらした。第一回目の７個の陽性クローンの
うち、第二回目のスクリーニングで797塩基対プローブ
を用いて、４個の陽性シグナルを得た。第二回目の６個
の陽性クローンのうち、第三回目のスクリーニングで79
7塩基対プローブおよび331塩基対プローブを用いて、４
個の陽性シグナルを得た。
【０１５４】４個の第二回目の陽性クローンを釣り上げ
て、第三回目のスクリーニングを行った。プラークリフ
トの一つは放射標識した797塩基対のプローブでスクリ
ーニングし、もう一つのプラークリフトは前述のように
放射標識された331塩基対のプローブにハイブリダイズ
させた。４個の全てが両方のプローブにハイブリダイズ
することが見出された。
【０１５５】第三回目のスクリーニングで797塩基対お
よび331塩基対のプローブの両方にハイブリダイズした
８個のクローンを全て、単一のプラークとして釣り上げ
た。ファージＤＮＡ沈澱を標準法に従い調製した。次
に、ファージのゲノムＤＮＡの挿入フラグメントを、配
列決定のためにM13mp18およびM13mp19ファージに移入
し、これらがヒト血管内皮細胞増殖因子をコードしてい
ることを確かめた。ヒト血管内皮細胞増殖因子をコード
しているゲノムクローンを含有する、バクテリオファー
ジの一つは、American Type Culture CollectionにATCC
番号40636で寄託されている。
【０１５６】このクローンの配列解析から、成熟型のヒ
ト血管内皮細胞増殖因子をコードする配列、および成熟
型タンパク質の最初のアミノ酸からすぐ上流のシグナル
配列のうち４個のアミノ酸をコードする配列が判明し
た。このクローンに５’末端で重複する第二のゲノムク
ローンは、ヒト血管内皮細胞増殖因子の残りの26個のア
ミノ酸のシグナル配列をコードする、さらに上流の配列
を与えた。シグナル配列および５’非翻訳領域を含有す
る、第二のゲノムクローンを得るために、オリゴヌクレ
オチド5'-CTCTCTTGGGTACATTGGAGCCTTGCCTTGCTGCTCTACCT
TCACCATGCCAAGを用いてゲノムライブラリー（前述に同
じ）をスクリーニングした。このオリゴヌクレオチド配
列は、PCRにより生じたウシｃＤＮＡに由来する。約1.2
×106個のファージをスクリーニングした。各２枚のニ
トロセルロースフィルター上のプラークリフトをNaOH、
中和、および６×SSCバッファーでそれぞれ４分間処理
した。空気乾燥の後、バキュームオーブンで２時間、80
℃で焼き付けた。プレハイブリダイゼーションは短いオ
リゴのプレハイブリダイゼーション用バッファーを用い
て、室温で６時間行った。[32Ｐ]-標識したオリゴヌク
レオチドの２×106cpm/mlをフィルターに添加し、同じ
バッファー中で一晩、室温でハイブリダイズさせた。フ
ィルターを１×SSC、0.1％ SDSで、バッファーを２回替
えて、50℃で２時間、洗浄した。第一回目のスクリーニ
ングで陽性クローンについて、プラーク精製および再ス
クリーニングを行った。１つの陽性クローンが得られ
た。
【０１５７】これらの２個のクローンから得られた混成
ゲノム配列を図８に示す。図は８個のエキソン（ローマ
数字で示す）を表し、これらは本来のシグナル配列と、
異なるメッセージのスプライシングの結果生じ得るヒト
血管内皮細胞増殖因子の全ての型とをコードする。完全
なイントロン配列は示されておらず、各々のエキソンに
隣接する「結合部の」配列のみが呈示されている。エキ
ソンが図８に描かれているように、成熟型ｈＶＥＧＦ
121はエキソンII-VおよびVIIIにコードされ；成熟型ｈ
ＶＥＧＦ165はエキソンI-V、VIIおよびVIIIにコードさ
れ；成熟型ｈＶＥＧＦ189はエキソンII-VIIIにコードさ
れている。
【０１５８】実施例６ ヒト血管内皮細胞増殖因子をコードするｃＤＮＡの回収 血管内皮細胞増殖因子mRNAの細胞源 血管平滑筋細胞は、血管内皮細胞増殖因子タンパク質を
コードするmRNAを高レベルで産生し、そのために、血管
内皮細胞増殖因子配列に富んだｃＤＮＡライブラリー用
のmRNAの良い調製源である。ヒト胎児血管平滑筋（fhVS
M）細胞を、10％（v/v）ウシ胎児血清（HYCLONE）、２m
MのL-グルタミン、ml当り各100Uのペニシリンおよびス
トレプトマイシン、および組換え血管内皮細胞増殖因子
（1ng/mlの濃度で48時間毎に加える）、を補った、低グ
ルコースのダルベッコ改変イーグルス培地（DMEM-16、G
IBCO）中で培養した。細胞をコンフルエンスまで継代
し、典型的には25％コンフルエンスで蒔き、再培養し
た。
【０１５９】ポリ（Ａ）+RNAの単離 血管平滑筋細胞mRNAを単離するために、典型的には、細
胞をコンフルエンスまで生育させ、次いで血管内皮細胞
増殖因子mRNAの合成をさらに刺激するための、フォルボ
ールミリステートアセテート（PMA）処理を、行う、あ
るいは行わなかった。細胞のモノレイヤーを、５から20
mlのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（D-PBS）で２
回洗浄し、残存する培地を除去し、次いで、RNAをChirg
winらの、Biochemistry (1979) 18:5294-5299の方法で
単離した。この方法では、溶解バッファー（4.0Ｍのグ
アニジンチオシアネート、0.1％のアンチフォームＡ、2
5mMのクエン酸ナトリウム、0.5％のＮ-ラウロイルサル
コシン、および100mMのβ-メルカプトエタノール）の直
接添加により、モノレイヤー中の細胞を溶解する。注射
針を通過させＤＮＡを切断した後、酢酸およびエタノー
ルの添加により、RNAを直接沈澱させる。沈澱したRNA
を、次にジエチルピロカーボネート（DEP）-処理した脱
イオン水（D-H2O、典型的には約400μl）に再懸濁し、
2.6mlのグアニジン-HClバッファー（7.5Ｍのグアニジ
ン、25mMのクエン酸ナトリウム、５mMのジチオスレイト
ール）を添加し、そして酢酸およびエタノールの添加に
より、RNAを沈澱させる。沈澱させたRNAを、再び400μl
のDEP-処理したｄ-H2Oに再懸濁し、そして酢酸ナトリウ
ムおよびエタノールの添加によりRNAを沈澱させた。
【０１６０】グアニジン-チオシアネート法（上述）で
単離した全細胞RNAを、さらに、確立した方法（Edmond
s, M. らの、PNAS（1971）68：1336、Aviv, H.およびLe
der, P.のPNAS（1972）69:1408）によりオリゴｄ（Ｔ）
-セルロースクロマトグラフィーで分画し、ポリ（Ａ）+
RNAを単離した。
【０１６１】ｃＤＮＡ合成、および血管内皮細胞増殖因
子ｃＤＮＡのλZAPIIへのクローニング ｃＤＮＡ合成を、GublerおよびHoffmannの、方法（Gen
e, 25:263-269）に従い、Boehringer-Mannheim Biochem
icalsから購入したｃＤＮＡ合成キットを用い行った。
この方法を簡単に記載すると以下のようになる：第一鎖
ｃＤＮＡ合成を先ず、オリゴｄ（Ｔ）15をプライマーと
して、５から20μｇのfhVSMポリ（Ａ）+RNAの３’末端
から逆転写酵素による合成を開始した。得られたRNA-DN
AハイブリッドをRNase Hで制限消化し、E．coli ＤＮＡ
ポリメラーゼIを用いた第二鎖ＤＮＡの合成用の３’-OH
プライマーを得た。次にＴ4 DNAポリメラーゼを用い
て、残っている全ての突出3'-末端を除去し、平滑末端
ｃＤＮＡ生成物を得た。
【０１６２】λZAPII（Stratagene, Inc., La Jolla, C
A）のような、λクローニングベクターに挿入する前
に、標準的な方法で平滑末端化したｃＤＮＡをメチル化
し（例えば、EcoRIメチラーゼで）、ｃＤＮＡ中に存在
する特定のサブセットの制限酵素部位の開裂をブロック
する（即ち、EcoRIメチラーゼでメチル化するとEcoRIに
よるｃＤＮＡの開裂がブロックされる）。次にこのｃＤ
ＮＡをオリゴヌクレオチドリンカーにライゲーションし
（例えば、EcoRIリンカーGGAATTCC）、リンカーを適切
な制限エンドヌクレアーゼで開裂し（例えば、EcoR
I）、そして過剰のリンカーを除去した後に、ｃＤＮＡ
をλベクターの適切なクローニング部位に最終的にライ
ゲーションする（例えば、λZAPIIのEcoRI部位）。ｃＤ
ＮＡをベクターの腕にライゲーションした後に、クロー
ニングしたｃＤＮＡをGigapack II Gold（Stratagene,
Inc., La Jolla, CA）のような、λパッケージング抽出
物と「パッケージング」する。
【０１６３】パッケージングの後、λファージを適切な
宿主株（例えばλZAPIIベクターに対してはXL1-Blue、S
tratagene, Inc., La Jolla, CA）にタイターした後、1
0,000と50,000pfu/プレートの間のタイターで、NZYMア
ガーの150mmプレートに撒いた。37℃で６-８時間生育さ
せた後、プレートを４℃まで冷やし、ニトロセルロース
膜（BA85, SCHLEICHER AND SCHUELL）またはハイボンド
-Ｎ膜（AMERSHAM）上にプラークリフトを、標準法（Ben
ton, W.D.およびDavis, R.W., Science(1977) 196:18
0）に従い調製した。血管内皮細胞増殖因子の配列に相
同であるか、または一部相同な配列を含むクローンは、
pST800（前述の実施例３）のｃＤＮＡ挿入に由来するウ
シ血管内皮細胞増殖因子の、32Ｐ-標識体、または図３
ａの配列に基づいた、血管内皮細胞増殖因子の配列に特
異的なオリゴヌクレオチドに対して、ハイブリダイゼー
ションを行って検出する。ハイブリダイゼーションは、
20％と50％との間のホルムアミドおよび０％と10％との
間の硫酸デキストランを含有する標準的なハイブリダイ
ゼーション用バッファー中で、37℃と42℃との間で行
う。血管内皮細胞増殖因子プローブにハイブリダイズす
るクローンについて、続いて単一プラークに精製し、Ｄ
ＮＡ配列解析のために、関連の配列をバクテリオファー
ジM13ベクター、例えばM13mp18およびM13mp19にサブク
ローンした。
【０１６４】血管内皮細胞増殖因子のヒトのｃＤＮＡ配
列は、ヒト血管内皮細胞増殖因子の遺伝子産物の、対応
するアミノ酸配列の予測に用い得る。ｃＤＮＡはまた、
E．coliのような細菌、またはイーストまたは哺乳類細
胞でヒト血管内皮細胞増殖因子のタンパク質産物を発現
するように設計された構築物の、転写制御エレメントに
連結し得る。
【０１６５】実施例７ ヒト血管内皮細胞増殖因子（ｈＶＥＧＦ121およびｈＶ
ＥＧＦ165）のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列 実施例６に記載した方法に従い、ヒト血管内皮細胞増殖
因子をコードするｃＤＮＡクローンを調製および単離し
た。多数のクローンの配列決定により、多様性情報スプ
ライシングがウシの場合と同様に起こることが確認され
た。従って、ｂＶＥＧＦ120およびｂＶＥＧＦ164に相当
するヒトタンパク質の発現型が存在する（しかし、ヒト
タンパク質にはウシ型の血管内皮細胞増殖因子にない付
加されたアミノ酸を７位に含有するため、ヒト型の血管
内皮細胞増殖因子は各々、121および165残基を含有す
る）。λH３と命名した、ｈＶＥＧＦ121のコード領域の
一部を含有するｃＤＮＡクローンは、寄託番号40728と
してAmerican Type CultureCollectionに寄託されてい
る。λH2と命名した、ｈＶＥＧＦ165のコード領域の一
部を含有するｃＤＮＡクローンも、寄託番号40727とし
て寄託されている。さらに、ｈＶＥＧＦ121およびｈＶ
ＥＧＦ165の一次翻訳物全体をコードする別のクローン
も、類似の方法によって得られ得る。
【０１６６】実施例５の寄託ヒトゲノムクローンから、
および実施例６に記載の方法によって得られた多数のｃ
ＤＮＡクローンの配列情報に基づき、ｈＶＥＧＦ121お
よびｈＶＥＧＦ165をコードする天然ＤＮＡ配列を決定
した。そのＤＮＡ配列を図７に示す。囲まれた132ヌク
レオチド配列は、情報により多様性にスプライシングさ
れる部分に相当するＤＮＡ配列を包含する。翻訳された
情報の中にこの配列が存在している時、コードされたタ
ンパク貿はｈＶＥＧＦ165であり、そのアミノ酸配列は
図７のオリゴヌクレオチド配列の上に直接示されてい
る。この配列が翻訳された情報に存在しない時、コード
されたタンパク質はｈＶＥＧＦ121である。この型のタ
ンパク質は、114位のアミノ酸までｈＶＥＧＦ165と同じ
アミノ酸配列を有する。112位から始まるｈＶＥＧＦ121
のカルボキシル末端配列は、図７のヌクレオチド配列の
下にイタリック体で表されている。ｈＶＥＧＦ121およ
びｈＶＥＧＦ165をコードする連続のｃＤＮＡ配列は、
合成オリゴヌクレオチドから、あるいは実施例４に記載
の方法に類似した方法を用い、ヒト胎児血管平滑筋のpo
ly（A）+RNAからポリメラーゼチェーンリアクションを
用いて、作製し得る。
【０１６７】実施例８ ヒト型の血管内皮細胞増殖因子のアミノ酸配列を有する
ポリペプチドの発現 上記の標準的な方法に従って、ヒト血管内皮細胞増殖因
子（ｈＶＥＧＦ121あるいはｈＶＥＧＦ165）の一次翻訳
物をコードする全領域を含有するｃＤＮＡクローンは、
完全型あるいは切断（改変）型が最も便利に、種々の宿
主内で組換えタンパク質を生産するのに使用される。し
かし、哺乳類系での発現が好ましい。なぜなら、宿主が
天然で作られるタンパク質に見られるような翻訳後のプ
ロセッシングが可能であり、そして宿主がイントロンの
プロセッシングも可能であるために、ｃＤＮＡあるいは
ゲノム配列のいずれかを使用し得るためである。
【０１６８】従って、宿主ベクターへの挿入のために、
ヒト血管内皮細胞増殖因子のいずれかの型をコードする
全領域を含有するｃＤＮＡあるいはゲノムクローンは、
以下に説明される通り調製される、しかしこれに限定さ
れない。
【０１６９】ベクターを構築するために、クローン化さ
れたｃＤＮＡあるいはゲノム挿入物を、それが単離され
るクローニングベクターから切り出す。この挿入物を、
NcoI、BamHI、EcoRIあるいは必要ならば他の適切なリン
カーにより得られ、そして次にpHS1あるいはその誘導体
のような適切な宿主ベクター中に、以下の通りに挿入す
る。あるいは、挿入物の切断および適切なベクターへの
挿入の前に、都合のよい制限酵素部位あるいは別のコー
ド配列をクローン化される挿入部に導入するために、イ
ンビトロ変異誘発を用い得る。
【０１７０】宿主ベクターの構築 pHS1 プラスミドpHS1は、哺乳類宿主中で挿入ＤＮＡを発現さ
せるのに適する。このプラスミドは、p84H（Karin, M.
ら、Nature(1982) 299:797-802）由来のヒトメタロチオ
ネイン-IIA（hMT-IIA）配列の、hMT-IIA遺伝子の-765位
のHindIII部位から+70位塩基のBamHI開裂部位に至る約8
40塩基対を含有する。pHS1を構築するために、プラスミ
ドp84HをBamHIで完全消化し、エキソヌクレアーゼBAL-3
1で処理して末端ヌクレオチドを除去し、そして次にHin
dIIIで消化した。所望の約840塩基対のフラグメントをH
indIIIおよびHindII消化で開環したpUC8(Vieira, J.
ら、Gene(1982) 19:259-268)に連結した。このライゲー
ション反応混合物をE．coli HB101をAmpRとするように
形質転換するために用いて、そしてpHS1と命名した、一
つの候補プラスミドを単離し、そしてジデオキシシーケ
ンシングにより配列決定した。pHS1はhMT-IIA制御配列
を、都合のよい制限部位（BamHI、SmaI、およびEcoRI）
を含有するポリリンカーの上流に含有する。
【０１７１】機能する宿主プラスミドpHS1を、メタロチ
オネインプロモーター以外の別の制御因子を含有させる
ように、さらに改変し得る。特に、SV40のようなウイル
ス系のエンハンサーエレメント、およびヒト成長ホルモ
ン（hGH）のような他のタンパク質の３’非翻訳領域に
関連する終止シグナルを加え得る。
【０１７２】ウイルスのエンハンサー 1118塩基対のSV40のＤＮＡフラグメントをpHS1のMT-IIA
プロモーター配列の前のHindIII部位に挿入して、MT-II
Aプロモーターに作動可能に連結させたSV40エンハンサ
ーを含有する、一対の宿主発現ベクターを構築した。SV
40のＤＮＡフラグメントは、SV40の複製起点を含み、ヌ
クレオチド5172位からヌクレオチド5243位（起点の部
位）に至る配列、ヌクレオチド107-250由来の重複した7
2塩基対の反復を含有し、後期ウイルス遺伝子の５’末
端を含有する起点の横のヌクレオチド1046位を含めて続
く。このHindIIIの1118塩基対フラグメントは、SV40 DN
A(Buchman, A.R.ら、DNA Tumor Viruses, 2nd ed (J. T
ooze編), Cold Spring Harbor Laboratory, New York
(1981), pp. 799-841)のHindIII消化によって得られ、
そして増幅のためにpBR322にクローン化される。このSV
40フラグメントを含有するpBR322べクターをHindIIIで
切断して、そして1118塩基対のSV40 DNAフラグメントを
ゲル電気泳動により単離して、そしてHindIII消化し、C
IP処理したpHS1に連結した。pHS1-SV(9)およびpHS1-SV
(10)と命名した、得られたベクターは、MT-IIAプロモー
ターの前にSV40フラグメントを逆方向で含有する。pHS1
-SV(9)において、エンハンサーは、MT-IIAプロモーター
の５’mRNA開始部位からの約1600塩基対であり、逆方向
ではこれは５’mRNA開始部位からの約980塩基対であ
る。両方の方向が作動可能であるが、エンハンサー配列
が開始部位に近い方の方向がより高い発現レベルを与え
る。転写開始部位の250から400塩基対上流にエンハンサ
ーを位置させるような削除が最適であると考えられてい
る。
【０１７３】SV40エンハンサーの３’末端の190塩基
対、250塩基対、および360塩基対のそれぞれをMT-IIAプ
ロモーターTATAボックスの５’末端の上流に位置させた
ベクターをさらに構築した。これらの構築物は、Karin,
M.ら、Nature (1984) 308:513-519に記載されているヒ
トMT-IIAプロモーターの上流調節領域のマッピングに基
づいている。全ての構築物は、重金属による調節のため
の重複部位を含有する配列を保持しているが、190塩基
対および250塩基対分離物からの構築物は、これらの重
金属調節部位のさらに上流にあるグルココルチコイド調
節配列を保持していない。
【０１７４】pHS'-SV190、pHS'-SV250、およびpHS'-SV3
60と命名した、これらのベクターは以下の概略に従って
調製した。メタロチオネインプロモーターを含有する配
列の長さおよびpHS1から切り出されたフラグメントとし
て供給される上流領域の長さ以外は、全ての構築物は同
じである。
【０１７５】pHS'-SV190の場合、pHS1をSacIIで消化し
て、末端を平滑化し、そしてKpnIリンカーに連結する。
次に、このＤＮＡをEcoRIおよびKpnIで消化し、MT-IIA
制御配列の適切な部分を切り出す。同様に、pHS'-SV250
の場合、pHS1をHgaIで消化して、末端を平滑化し、KpnI
リンカーに連結し、そしてEcoRIおよびKpnIで消化す
る；pHS'-SV360では、最初の消化にDdeIを用いる。
【０１７６】SV40エンハンサーを含有する中間体ベクタ
ーを以下のように調製する。SV40のHindIII/KpnIフラグ
メント（5172位から298位までに伸長し、KpnI部位から5
0塩基対のところにエンハンサーエレメントを含有す
る）を、KpnI/HindIIIで消化したpUC19に挿入してpUC-S
Vを得る（pUC19はポリリンカー領域に３つの都合のよい
制限部位を、HindIII、KpnIおよびEcoRIの順で含有す
る）。上記の記載通りに調製したKpnI/EcoRIフラグメン
トを、KnpI/EcoRIで消化したpUC-SVに挿入して、完成ベ
クターを得る。
【０１７７】従って、全ての前述の改変ベクターは、SV
40エンハンサーエレメントの利点を有する。他のウイル
スのエンハンサーも、当然類似の方法で用いられ得る。
【０１７８】転写終止配列 転写終止制御配列を得るために、コード配列を有するＤ
ＮＡおよびヒト増殖ホルモンの３’非翻訳領域を、pHS1
につないだ。hGHコード領域の換わりに、hGH３’非翻訳
領域からコード配列までを順にベクター中につないだ中
間的なベクターを得た。
【０１７９】hGHをコードするゲノム配列は、p2.6-3（D
eNotoら、Nucleic Acids Res.（1981）19:3719）から、
最初のエキソンの５’末端で切断するBamHI、および機
能遺伝子の３’を切断するEcoRIで消化し、次いでポリ
アクリルアミドゲル精製を行い、単離した。単離したフ
ラグメントをBamHI/EcoRI消化したpHS1にライゲーショ
ンし、そしてこのライゲーション反応混合物をE．coli
MC1061中に形質転換し、AmpRとした。成功した形質転換
体を制限酵素分析でスクリーニングし、目的のプラスミ
ドを含んだ株pMT-hGHgを、大量のプラスミドＤＮＡを調
製するためにさらに増殖した。
【０１８０】上述のpHS1-SV（９）あるいはpHS1-SV（1
0）の構築で記載した方法と類似の、ただしpHS1をpMT-h
GHgに変えた方法で、MT-IIAプロモーターの制御下に、
そしてSV40エンハンサーに機能するように結合されたhG
H遺伝子を有する、各々phGHg-SV（９）およびphGHg-SV
（10）と名付けた、２つのベクターを得た。このライゲ
ーション反応混合物をE．coli MC1061をAmpRに形質転換
するのに用い、そして正しい構築物であることを確認し
た。
【０１８１】発現ベクターの構築 phGHg-SV(10)を、ヒト血管内皮細胞増殖因子の宿主ベク
ターとして用いた。phGHg-SV(10)を、BamHIおよびSmaI
で消化し、クレノウ断片で平滑末端とし、そしてCIPで
処理してhGHコード配列を切り出した。この開環したベ
クターを、血管内皮細胞増殖因子の全長をコードした、
ｃＤＮＡあるいはゲノムクローンからのフラグメントに
ライゲーションし、発現ベクターpVEGF-SV（10）を得
た。
【０１８２】図８に示すように、血管内皮細胞増殖因子
遺伝子の最初の全長翻訳産物は、26アミノ酸の分泌シグ
ナル配列を有している。この配列は、成熟血管内皮細胞
増殖因子の哺乳類細胞培養培地への分泌に効果を示し得
る。望むならば、合成オリゴヌクレオチドを、成熟血管
内皮細胞増殖因子のコード配列に加え得、（例えば、hG
Hからの）外来の分泌シグナル配列を、最初の全長翻訳
産物中に作製された血管内皮細胞増殖因子遺伝子に機能
するように結合させ得る。どちらの場合にも、産生物の
分泌が起こらねばならない。
【０１８３】加えて、血管内皮細胞増殖因子遺伝子ある
いはｃＤＮＡ配列を発現させるために、他の宿主ベクタ
ーも使用し得る。例えば、上述のようにSV40エンハンサ
ーの種々の立体構造を含むように改変した、pHS1および
pHS1が使用し得る。最後に、宿主ベクターは、血管内皮
細胞増殖因子遺伝子のみならず、ネオマイシン耐性遺伝
子（pSV2:NEOから得られる）および/あるいはヒトメタ
ロチオネイン-IIAタンパク質までも（pMT-VEGF-NEOある
いはpMT-VEGF-NEO-MTと呼ばれる）、コードするよう
に、さらに改変し得る。
【０１８４】これらのベクターは、以下の検討を目的に
pMT-VEGFと総称的に命名した。
【０１８５】哺乳類組換え体による血管内皮細胞増殖因
子の産生 チャイニーズハムスター卵巣（CHO）-K1細胞を、F12培
地および12％の仔ウシ胎児血清を加えたDMEの１：１の
混合培地中で生育した。構成細胞をpMT-VEGFおよびpSV
2:NEOと同時形質転換（Southern, P.らの、J. Mol. App
l. Genet.(1982)1:327-341）した；pSV2:NEOは、ネオマ
イシン類似体G418に対する耐性を付与する機能の遺伝子
を含んでいる。形質転換は、１μｇのpSV2：NEOおよび1
0μgのpMT-VEGFを、リン酸カルシウム-ＤＮＡ共沈澱物
中の細胞へ、Wigler, W.らの、Cell（1979）16:777-785
のプロトコールに従って加え、４時間ＤＮＡに曝した後
に、２分間15％のグリセリン”ショック”を与えた。あ
るいは細胞を、10μｇのpMT-VEGF-NEOあるいはpMT-VEGF
-NEO-MTと、同じリン酸カルシウムプロトコールを用い
て形質転換した。１日後、１mg/mlのG418に細胞を曝
し、G418-耐性コロニーのプールを得た。耐性コロニー
のプールが充分生育した後、このプールを、細胞付着型
あるいは分泌型の血管内皮細胞増殖因子の産生に関して
アッセイした。
【０１８６】安定なpMT-VEGFの形質も有する、成功した
G418-耐性形質転換体、あるいは他の血管内皮細胞増殖
因子発現プラスミドを、低密度で蒔き、株化単離体を精
製した。少量のこれらの単離体を、２×10-4Ｍの塩化亜
鉛に曝した後に、マルチウェルプレートに蒔き、血管内
皮細胞増殖因子の簡易アッセイとした。血管内皮細胞増
殖因子は、内皮細胞のマイトジェン活性を、細胞中で、
および／あるいは調整培地中で調べるマイトジェンアッ
セイで、あるいは標準的な方法を用いて、標準的なELIS
A、あるいは適切な血管内皮細胞増殖因子タンパク質あ
るいはペプチドに対して調製した抗血清に対してのラジ
オイムノアッセイ、を用いて確認した。大量の、好まし
くは分泌型の、目的の血管内皮細胞増殖因子を産生して
いる株化単離体を選択した。
【０１８７】この細胞を1/10コンフルエンシーで10％の
ウシ胎児血清を補った基本培地（F12およびDMEの１：１
混合物）中に蒔き、一晩インキュベートし、そして次
に、１×10-4Ｍから３×10-4Ｍの濃度範囲の塩化亜鉛の
添加により血管内皮細胞増殖因子の産生を誘起した。
【０１８８】血管内皮細胞増殖因子産生細胞を確立する
別の方法では、CHO細胞をpMT-VEGF、pSV:NEO、およびヒ
トMT-IIA挿入物を含んだpHS1(pHS1-MT)、あるいはpMT-V
EGF-NEO-MTと同時形質転換した。G418選択の後、プール
した耐性コロニーを100μMのZnCl2をインデューサーと
し、10μMのCdCl2の存在下で、カドミウム耐性に関して
選択した（MT-IIAタンパク質の発現に基づく）。次に耐
性コロニーのプールを、上述のようにアッセイし、血管
内皮細胞増殖因子の産生レベルを測定した。
【０１８９】天然の血管内皮細胞増殖因子シグナルある
いはhGH由来のシグナルの様な、血管内皮細胞増殖因子
用の機能する分泌シグナル配列を、発現ベクターの構築
に含めることにより、CHOあるいは他の哺乳類細胞宿主
を用いた正常な本質的経路を用いた分泌に効果がある。
分泌を変化させると、タンパク質精製工程がより単純に
なり、そしてタンパク質の折畳み構造がより自然の立体
構造に近づき、再折畳み工程の必要をなくすため、当然
いくつかの利点が生じる。次に、分泌された血管内皮細
胞増殖因子の精製を、実施例９に記載の方法に従い、あ
るいは、イオン交換クロマトグラフィー、分子量排除型
クロマトグラフィー、および、例えば、逆相HPLCおよび
既知の方法に従い製造した抗血管内皮細胞増殖因子抗体
を用いた抗体親和性クロマトグラフィーのような、疎水
性による分離のような工程を含み得る、当分野で既知の
標準的な他の方法に従って、行う。
【０１９０】実施例９ ポリペプチドの回収および血管内皮細胞増殖因子ダイマ
ーの形成 上述のように哺乳類発現ベクター中で発現させ、産生さ
れた増殖因子の分泌型を得たならば、この増殖因子ｈＶ
ＥＧＦ165は、Gospodarowiczらの、PNAS(1989)86(19):7
311-7315の方法で精製し得る。増殖因子を発現している
宿主細胞で調整された培地を、10000ｇで15分から30分
間遠心分離する。１N HClで上清溶液をpH５から６に調
整し、１Ｌに付き少なくとも500ｇの硫酸アンモニウム
を加える。この溶液を４℃で２時間から６時間攪拌し、
そして次に30分から60分間10000ｇで遠心分離した。こ
の上清を捨て、そしてペレットをさらに精製するために
残した。
【０１９１】このペレットを、25から100mMのNaClを含
んだ５から25mMのTris、pH6.5から8.0に再溶解した。こ
の溶液を、同じバッファーで一晩透析した。沈澱した物
質全てを遠心分離で溶液から析出させ、そして捨てた
（10000ｇで、30分から60分間）。この溶液を、透析に
用いたのと同じバッファーで平衡化しておいたヘパリン
-セファロースのカラムにかけた。タンパク質溶液の全
てをかけた後、カラムを、溶出物の吸光度がべースライ
ンレベルに戻るまで平衡化バッファーで洗浄した。タン
パク質を、0.1Ｍから2.5Ｍの間のNaClを含んだ平衡化バ
ッファーでカラムから段階溶出した。活性フラクション
を集め、Amicon stirred cell中で10,000MWのカットオ
フメンブレンで濃縮した。
【０１９２】ヘパリン-セファロースのカラムから集め
られたこの濃縮した生理活性物質を、リン酸緩衝食塩水
で平衡化したBio-Gel P-60カラムにかけた。カラムを同
じバッファーで溶出し、そして生理活性のあるフラクシ
ョンを集めた。この物質を３倍容量の20mMのHEPES、pH
8.3で希釈し、Mono-Sカラムにかけた。このカラムを、
同じバッファー中の0.0Ｍから1.0ＭのNaCl濃度勾配で溶
出した。構造調査用には、最終の精製を、0.1％のトリ
フルオロ酢酸を含んだ水中の10％から60％へのアセトニ
トリルの濃度勾配を用い、Vydac C4逆相カラム（RP-HPL
C）で行った。
【０１９３】封入体中にタンパク質を産生させるために
細菌発現システムを用いた場合、Hoppeらの、Biochemis
try (1989) 28:2956-2960に類似の方法で産生物を精製
し得る。細胞を、５から25mMのTris、pH 6.5から8.0、
１mMのEDTAに懸濁し、microfluidizerを通して破砕し
た。この溶液を10000ｇで15分から30分間、遠心分離
し、そしてペレットを５から25mMのTris、pH 6.5から8.
0、１mMのEDTAおよび１％から２％のTriton X-100で洗
浄した。
【０１９４】ペレットを、20mMのTris、pH7.5、１mMのE
DTA、６Ｍのグアニジン-HCl、0.1ＭのNa2SO3、および0.
01mMのNa2S4O6中に再懸濁し、そしてこの溶液を室温で
４時間から12時間放置した。この工程で、分子がモノマ
ー型に変換される。不溶性の物質は遠心分離で除去し
た。
【０１９５】得られたＳ-スルフォン酸化タンパク質
を、10から50mMのTris、pH6.5から8.0、１mMのEDTA、３
から６Mのグアニジン-HCl、で平衡化したセファクリル
Ｓ-200のクロマトグラフィーにかけた。タンパク質を含
んだ画分をプールし、水で透析した。Ｓ-スルフォン酸
化タンパク質の最終精製は、RP-HPLC C4クロマトグラフ
ィーで行った。タンパク質を、アセトニトリルの０％か
ら100％の直線的な濃度勾配で溶出した（濃度勾配を作
るためのチャンバーＡは、0.1％のトリフルオロ酢酸を
含んだ水で、そしてチャンバーＢは、0.1％のトリフル
オロ酢酸を含んだアセトニトリルである）。
【０１９６】このタンパク質を最終濃度が0.1から0.5mg
/mlとなるように、50mMのTris、pH8.0、１mMのEDTA、５
mMのグルタチオン、およびタンパク質の溶解性を保つの
に充分な尿素を含んだ0.5mMのグルタチオンジスルフィ
ド中に溶解した。この工程で、タンパク質は天然のホモ
ダイマー構造の血管内皮細胞増殖因子の型に折畳まれ
る。２日後、このタンパク質を、上述の同じRP-HPLCシ
ステムで、あるいは、ヘパリン-セファロースあるいはM
ono-Sのようなアフィニティークロマトグラフィー工程
で精製した。モノマーのダイマーからの分離は、20mMの
Tris-HCl、pH7.5中でＳ-セファロースのクロマトグラフ
ィーで行った；ダイマーは、0.7ＭのNaClを含んだ20mM
のTris、pH7.5でカラムから溶出した。ｈＶＥＧＦ
121（ｂＶＥＧＦ120に相当する）は、ｈＶＥＧＦ165お
よびｈＶＰＦ189のヘパリン結合特性を欠いていること
を見いだしたので、ｈＶＥＧＦ121およびｂＶＥＧＦ120
の精製は、ヘパリン-セファロースクロマトグラフィー
以外の方法で行った。
【０１９７】実施例１０ 血管内皮細胞増殖因子を含んだ創傷治癒調合物 カテーテル経由で創傷部位に静脈投与するのに適した非
経口的溶液は、血管内皮細胞増殖因子（例えば、ｂＶＥ
ＧＦ120、ｂＶＥＧＦ164、ｈＶＥＧＦ121、あるいはｈ
ＶＥＧＦ165）を、5.0から7.0の範囲の安定なpHに保つ
ための適切な量のバッファー、および等張の浸透圧にす
るための適切な量の塩化ナトリウムと共に注射用の水に
溶解することで調製し得る。典型的な組成を以下に示
す：
【０１９８】
【表２】
【０１９９】上記の溶液は、機械的なスプレーポンプの
補助で、創傷部位に局所的に塗布もし得る。
【０２００】創傷部位に局所的に塗布するために好適な
水性のゲルは、肥厚剤ヒドロキシエチルセルロース（25
0Hグレード）を、バッファー、防腐剤、浸透圧調節剤を
含んだ水性溶液に懸濁させることで調製できる。肥厚剤
が完全に溶解したら、血管内皮細胞増殖因子の濃厚溶液
を加え、そして生成物が均一になるまで混合する。以下
の薬学的組成物は、このようなゲルの典型例である：
【０２０１】
【表３】
【０２０２】創傷部位に振りかけるのに適した乾燥粉末
は、血管内皮細胞増殖因子を水溶性のキャリアーと共に
凍結乾燥し、そして凍結乾燥物を細かく砕き、均一な大
きさの粉末を得ることで調製し得る。この粉末は創傷部
位に、直接あるいはエアロゾル発生用ガスを用いて塗布
し得る。典型的な粉末組成物は以下のように調製され
る：
【０２０３】
【表４】
【０２０４】この溶液は凍結乾燥し、そして得られる乾
燥物をボールミルで約75μmの中程度の粒子径に砕く。
この粉末はシェイカーにより塗布し得る。大きな表面面
積を被覆する必要がある場合には、フルオロカーボン
（Freon(登録商標)）、炭化水素（イソブタン）、ある
いは圧縮ガス（二酸化炭素）を発生用ガスとして含んだ
エアロゾル発生容器により、この粉末を塗布し得る。
【０２０５】実施例１１ キメラ増殖因子の調製 血管内皮細胞増殖因子の鎖を一本と血小板由来の増殖因
子のＡ鎖を一本とを含むキメラ分子は、まずこれら２分
子の組換え発現用ベクターを構築することにより調製さ
れる。ヒト血管内皮細胞増殖因子を哺乳動物で合成させ
る発現ベクターは実施例８に記載している。好ましいベ
クターは、合成血管内皮細胞増殖因子が宿主細胞から分
泌されるように構築されているものである（たとえば、
天然の血管内皮細胞増殖因子の分泌シグナルを含む、血
管内皮細胞増殖因子の全長の一次翻訳産物をコードする
領域が、親のベクターのBamHI部位とSmaI部位との間に
作動可能なように挿入されるように変更されているphGH
g-SV(10)）。同様のベクターが血小板由来増殖因子の発
現用に構成され、それは図４ａ（Ａ鎖の一次翻訳産物の
全長をコードする）に示される配列を有する合成または
部分的に合成された配列をとり、BamHIおよびEcoRVで消
化し、得られたコード領域フラグメントphGHg-SV(10)の
BamHI部位とSmaI部位との間に挿入して構築される。
【０２０６】増殖因子鎖の産生には発現プラスミドを哺
乳動物宿主細胞、たとえばCHO細胞に、実施例８で記載
したリン酸カルシウム沈澱法で導入する。CHO細胞へは
２つの異なった方法が使用される。一つの形質転換は、
細胞に導入されるＤＮＡは同時形質転換で行われ、血管
内皮細胞増殖因子発現プラスミドとpSV2:NEOとを10：１
重量比で行う；他の形質転換は血小板由来増殖因子Ａ鎖
の発現ベクターとpSV2:NEOとを10:1重量比で行う。それ
ぞれの形質転換体から形質転換体のG418耐性プールを選
択し、個々の増殖因子産生クローンは、高レベルの増殖
因子産生についてスクリーニングされ、アッセイは馴化
培地の（血管内皮細胞増殖因子産生細胞の場合は）血管
内皮細胞に対する、あるいは（血小板由来増殖因子Ａ鎖
産生細胞の場合は）ATCCから入手可能なマウスNIH 3T3
細胞（#ATCC CRL 1658）に対する分裂誘起活性、あるい
は当該分野に標準的な方法で作製された、この２つの増
殖因子のELISAまたはラジオイムノアッセイで行った。
【０２０７】別のアプローチとして、形質転換は３つの
プラスミドを細胞上にリン酸カルシウムで共沈澱させる
方法である；血管内皮細胞増殖因子発現ベクター、血小
板由来増殖因子Ａ鎖発現ベクターおよびpSV2:NEOで（重
量比で10：10：１）行う。クローンのG418耐性プールは
形質転換細胞から選択され、次にそれぞれのクローンに
ついて両方の増殖因子鎖を同時に分泌するクローンをEL
ISAあるいは他の抗体を基本とするアッセイで選択す
る。
【０２０８】馴化培地からの血管内皮細胞増殖因子鎖の
精製は実施例９に記載された方法で行う。血小板由来増
殖因子Ａ鎖の精製は以下の当該分野に公知のプロトコー
ル、たとえば、ヘルディン（Heldin）らのプロトコー
ル、Nature(1986) 319:511-514に従って行われる。
【０２０９】この後者のプロトコールでは、分泌された
増殖因子を含有する馴化培地はスルファデックス（Sulp
hadex）ビーズヘの吸着により分画され、次に血小板由
来増殖因子Ａ鎖物質は1.5M NaClを含有する0.01Ｍリン
酸バッファー、pH7.4で溶出する。硫酸アンモニウム沈
澱法で溶出した蛋白を濃縮した後、サンプルは１M NaC
l、0.01Ｍリン酸バッファー、pH7.4に再懸濁し、このバ
ッファーに対して透析した。サンプルは、次に、セファ
クリルＳ-200カラムで分画（1M NaCl、0.01Mリン酸バッ
ファー、pH7.4で溶出）し、１Ｍ酢酸で透析し、凍結乾
燥して、１Ｍ酢酸に溶解後、バイオゲル（BioGel）Ｐ-1
50カラムにかけた（ｌＭ酢酸で溶出）。Ａ鎖物質を含有
する画分を凍結乾燥した後、サンプルは１Ｍ酢酸に再溶
解し、逆相HPLCで分画した（１Ｍ酢酸、２Ｍグアニジン
-塩酸中、０-50％プロパノールの濃度勾配で溶出）。
【０２１０】血管内皮細胞増殖因子鎖の一本と血小板由
来の増殖因子Ａ鎖の一本とを含むキメラダイマーは、上
述のように調製したこれらのタンパク質の２つの精製サ
ンプルを混合することにより製造される。混合物は次
に、実施例９記載のように変性し再構成した。簡単に述
べると、まず、混合物は変性され、20mMトリス、pH7.5、
1mM EDTA、６Ｍグアニジン-塩酸、0.1Ｍ Na2SO3、0.01m
M Na2S4O6で４から12時間室温で処理してＳ-スルホン化
した。セファクリルＳ-200で分画し、逆相HPLCで精製し
た後（実施例９参照）、Ｓ-スルホン化された鎖を凍結
乾燥し、次にタンパク質鎖が溶解性を維持できるように
充分な量の尿素を含む50mMトリス-塩酸、pH8.0、１mM E
DTA、５mMグルタチオン、0.5mMグルタチオンジサルファ
イドの溶液に最終濃度0.1から0.5mg/mlとなるように溶
解した。モノマーはＳ-セファロースのクロマトグラフ
ィーを用いてダイマーから20mMトリス-塩酸、pH 7.5中
で、NaClの濃度を増加させながら分離した。キメラダイ
マーは、次に、個々のホモダイマーを精製するステップ
を組み合わせてホモダイマーから分離した後、変性と再
度折り畳みとを行った。さらに、キメラ分子は抗血管内
皮細胞増殖因子抗体カラムを通過させ、次に抗血小板由
来増殖因子Ａ鎖抗体カラムを通過させ、精製され得、後
の手順は公知である。
【０２１１】実施例１２ ヒト血管内皮細胞増殖因子（ｈＶＥＧＦ121）をコード
する全長ｃＤＮＡ配列の回収 血管内皮細胞増殖因子mRNAの細胞源 ヒトU937前単球白血病細胞は血管内皮細胞増殖因子タン
パク質をコードするmRNAを高レベルで生産する。それ
故、ヒト血管内皮細胞増殖因子ｃＤＮＡの調製に良好な
mRNAの供給源である。American Type Culture Collecti
onから入手したU937細胞はRPMI-1640培地（GIBCO）に10
％ウシ胎児血清（FBS）、１％Ｌ-グルタミン酸、それぞ
れ100ユニット/mlのペニシリンとストレプトマイシンと
を加えた培地で維持した。細胞は典型的には３から４日
ごとに継代培養し、典型的には培地１mlあたり５×105
細胞の濃度で移植した。
【０２１２】ポリ（Ａ）+RNAの単離 U937細胞のmRNAの単離のために、細胞を１mlあたり約５
×106細胞の濃度まで増殖した。細胞は500×gで５分の
緩やかな遠心分離を行いペレットを集めた。細胞ペレッ
トは、チャーグイン（Chirgwin）の方法、Biochemistry
（1979）18:5294-5299、に従って、mRNA単離の前に50ml
の氷冷したダルベッコのリン酸緩衝化した生理食塩水
（D-PBS）で一回洗浄し、残余の培地を洗浄した。この
方法で、洗浄した細胞ペレットは溶解バッファー（4.0
Ｍ グアニジンチオシアネート、0.1％アンチフォーム
Ａ、25mMクエン酸ナトリウム、0.5％ Ｎ-ラウロイルサ
ルコシン、100mM β-メルカプトエタノール）を直接加
えて溶解した。ＤＮＡを注射針で通して切断した後、RN
Aは酢酸とエタノールの添加により直接沈澱させた。沈
澱したRNAは、次に、ジエチルピロカーボネート（DEP）
処理した脱イオン水（D-H2O、典型的には約400μl）に
溶解し、2.6mlのグアニジン-塩酸バッファー（7.5Ｍグ
アニジン塩酸、25mMクエン酸ナトリウム、５mMジチオス
レイトール）を加えた。酢酸とエタノールを添加してRN
Aを沈澱させた。沈澱したRNAは再びDEP-H2Oに溶解し、
酢酸ナトリウムとエタノールで沈澱させた。
【０２１３】グアニジンチオシアネート法（上記）で単
離した全細胞のRNAは、以下の確立された方法によって
（Edmonds, M., et al., PNAS (1971)68:1336;Aviv. H.
andLeder, P., PNAS(1972)69:1408）、オリゴｄ（Ｔ）
セルロースクロマトグラフィーでさらに分画し、ポリ
（Ａ）+RNAを単離した。
【０２１４】逆転写酵素とポリメラーゼチェーン反応
（PCR）増幅とによる血管内皮細胞増殖 因子ｃＤＮＡの合成と増幅 ｈＶＥＧＦ121発現カセットを作製するため、U937ポリ
（Ａ）+RNA（上記参照）から得られたオリゴヌクレオチ
ドプライマー（図９）がPCRの開始に用いられ、それぞ
れの末端にBamHIのクローニング部位を有し、３’末端
のすべてのリーディングフレームに終止コドンを有する
血管内皮細胞増殖因子フラグメントが生じた。第一鎖の
ｃＤＮＡの合成は１μｇのアンチセンスオリゴヌクレオ
チド（プライマー4738、図９）を５μｇのU937ポリ
（Ａ）+RNAとアニールさせた後、ｃＤＮＡ合成キット
（ベーリンガーマンハイム）を用いてAMV逆転写酵素で4
2℃、２時間反応させて行った。第一鎖のｃＤＮＡの合
成の後、反応液をフェノールとクロロホルムで処理して
エタノールで沈澱させた。次に、１／10のｃＤＮＡをパ
ーキンエルマーシータスＤＮＡサーマルサイクラーを用
いて、アンチセンスオリゴヌクレオチド4738とセンス鎖
オリゴヌクレオチド（プライマー4741、図９）をプライ
マーとして、30ラウンドのPCR（Saiki, P.K.et al., Sc
ience(1988)239:487-491）で増幅した。PCR反応の生成
物は、次に５％のポリアクリルアミドゲルで分画し、ｈ
ＶＥＧＦ121発現カセットに対応するバンドが溶出さ
れ、BamHIで消化し、M13mp18につなぎ入れた。配列はサ
ンガーらの方法、J. Mol. Biol.(1980)143:161-178で確
認した。
【０２１５】実施例１３ CHO細胞でのｈＶＥＧＦ121の発現と分泌 配列確認の後、血管内皮細胞増殖因子発現カセットを含
有するBamHIフラグメントは、哺乳動物の発現プラスミ
ドpLENのBamHI部位にセンスおよびアンチセンスの両方
向に連結した（図１０ａ）。同様に、pMTNベクターにセ
ンス方向に連結した（図１０ｂ）。ベクターpLENの構築
のために、上記phGHg-SV（10）をSmaIで消化し、BamHI
リンカーをSmaI部位に連結した。ベクターは次にBamHI
で消化し（これは成長ホルモン遺伝子を除去する）、再
結合して、pLENを生じた。pLENはSV40エンハンサー、MT
-IIプロモーターおよびポリアデニル化部位を含む約600
bpの成長ホルモンの３’非翻訳領域を包含する。このベ
クターの構築とヒトエストロゲン受容体をコードするｃ
ＤＮＡの発現への使用はグリーン（Greene）ら、Scienc
e(1986)231:1150に詳しく記載されている。
【０２１６】pMTNはpLENプラスミド（pMTNSV40 polyA B
am）の誘導体であり、ネオマイシン耐性マーカーとSV40
初期プロモーター配列をプラスミドpSV2neoから取り込
んだものである。ネオマイシン耐性マーカーはアミノグ
リコシドホスホトランスフェラーゼをコードし、この酵
素はそのマーカーを有する細胞にG418耐性を賦与する。
pMTNを構築するために、ネオマイシン耐性マーカー（図
１０ｂでneoR）はpSV2neoをBamHIとHindIIIで消化してp
SV2neoから切り離された。pSV2neoのSV40初期プロモー
ター配列は、pSV2neoをpvuIIとHindIIIで消化して切り
離され、neoRマーカーを有するHindIII-BamHIフラグメ
ントにつないだ。このカセットは、neoRマーカーに接続
したSV40初期プロモーターを包含し、SV40エンハンサー
とpLENのpUC8配列の間にあるHindIII部位に挿入した。
【０２１７】pLEN121とpMTN121の構築では、ｈＶＥＧＦ
121発現カセットをプラスミドベクターpLENおよびpMTN
の、ヒトメタロチオネインプロモーターとヒト成長ホル
モンの３’非翻訳配列との間にあるBamHI部位に挿入し
た。
【０２１８】pLEN121とpMTN121発現プラスミドのCHO細
胞への形質転換 CHO-K1細胞はATCCから入手し（ロックビル、MD）、10％
FBS、１％L-グルタミン酸、それぞれ100ユニット／mlの
ペニシリンおよびストレプトマイシンを追加したダルベ
ッコの変法イーグル培地（DMEM）21：クーンのF-12培地
の１：１混合物（vol/vol）で維持した。
【０２１９】CHO-K1細胞はリン酸カルシウム沈澱法（Gr
aham and van der Eb, Virology(1973)52:456およびWig
ler et al., Cell(1979)16:777）によりプラスミドＤＮ
Ａで形質転換した。血管内皮細胞増殖因子-pLEN121プラ
スミドは、選択マーカーを有する２つのプラスミド；完
全なメタロチオネインを有するpUC9MT18およびネオマイ
シン耐性の主な選択マーカーを有するpSVneo、と同時形
質転換した。３つのプラスミドは、重量比でそれぞれ1
0：５：１で混合した。pMTNプラスミドはアミノグリコ
シドホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ネ
オマイシンとG418の耐性マーカー）を包含する。従っ
て、pMTNプラスミドは単独で直接CHO-K1細胞を形質転換
した。形質転換から24時間経過後、pSV2neo（pLENで同
時形質転換した場合）あるいはpMTNが有するG418耐性マ
ーカーを発現する細胞は、ネオマイシンアナログである
ゲネテシン（Geneticin）（G418）を培地中に600μg/ml
の濃度で含む培地での生育で選択した。G418選択で生存
したpLEN構築物で形質転換された細胞のコロニーは継代
培養され、５μMのCdCl2を含む培地でさらに選択を行っ
た。生存していたコロニーは増殖させて細胞のプールと
して、血管内皮細胞増殖因子の発現と解析に使用した。
【０２２０】CHO細胞からのｈＶＥＧＦ121の発現および
分泌を確認するための放射能ラベルとパルスチェイス pLEN121で形質転換したCHO-K1細胞によるｈＶＥＧＦ121
の発現と培地への分泌は、細胞タンパク質を代謝的にラ
ベルし、次に細胞溶解物あるいは馴化培地からの血管内
皮細胞増殖因子を免疫沈降で確認した。細胞溶解物ある
いは馴化培地サンプルは形質転換したCHO細胞を、放射
能ラベル期間が始まる前に、50μM ZnSO4を含む無血清
のDMEM-21/クーンのF12培地（誘導培地）で24時間培養
してメタロチオネインプロモーターの誘導を行って調製
した。[35Ｓ]-Ｌ-メチオニンの添加前に、細胞を洗浄
し、メチオニンを含まないDMEM-21/クーンのF12培地で3
0分間、37℃で前培養した。ラベル期間を始めるため
に、コンフルエントになった６cmの組織培養ディッシュ
に最終濃度100μCi/mlとなるように[35Ｓ]-Ｌ-メチオニ
ンを添加した。パルスチェイス解析においては、”チェ
イス”期間は30分のラベル期間の後に開始した。まず、
ラベル用培地を取り除き、細胞を一度、Ｌ-メチオニン
を含む無血清のDMEM-21／クーンのF12培地（”チェイス
培地”）で洗浄し、チェイス期間の間チェイス培地を再
度供給した。
【０２２１】細胞溶解物および馴化培地からの[35Ｓ]-
Ｌ-メチオニン-ラベルされたｈＶＥＧＦ121の免疫沈降
法による検出 すべての免疫沈降操作は、特にことわらない限り、４℃
で行い、１mlの培地を有する６cmの組織培養ディッシュ
でコンフルエントになるまで培養した細胞を用いた。培
地を集め、PMSFを１mMとし、細胞溶解物サンプルを調製
する間中、氷冷しておいた。細胞溶解物を調製するた
め、細胞を氷冷したリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で
一回洗い、次に、0.4mlの、100mMトリス-塩酸（pH8.
0）、100mM NaCl、0.5％ NP-40、１mM PMSF（細胞溶解
バッファー）で溶解した。馴化培地と細胞溶解物は４
℃、13,000×gで30分間の遠心分離で清澄にした。清澄
にした後、血管内皮細胞増殖因子に対する抗血清あるい
は免疫前のウサギ血清（ギブコ）を細胞溶解物あるいは
馴化培地に最終濃度２％（vol/vol）となるように加
え、４℃で一夜インキュベートした後、プロテインＡセ
ファロースCL-4Bのスラリー（100mg/ml）50μlを加え
た。４℃で１時間インキュベートした後、サンプルを１
mlの50mMトリス-塩酸（pH8.0）、0.5M NaCl、５mM EDT
A、0.5％ NP-40、１mg/ml卵白アルブミン（シグマ）で
順次４回；50mMトリス-塩酸（pH 7.5）、150mM NaCl、
５mM EDTA、0.5％ NP-40で２回；および10mM トリス-塩
酸（pH7.5）で１回洗浄した。サンプルは、次に、50μl
のサンプルバッファーに懸濁し、３分間沸騰して、13,0
00×ｇで１分間遠心分離した後、12.5％のSDS-ポリアク
リルアミドゲルに溶解した。放射能ラベルされたタンパ
ク質を可視化するために、電気泳動したゲルをEN 3HANC
E（NEN）に30分間、次にｄ-H2Oに30分間浸した後、乾燥
し、フルオログラフィーにかけた。
【０２２２】pLEN121で形質転換されたCHO細胞により合
成されたｈＶＥＧＦ121の免疫沈降とパルスチェイスの
解析結果は、免疫沈降法では、CHO細胞により合成され
たｈＶＥＧＦ121は、２-メルカプトエタノールでタンパ
ク質を還元すると、約15kDと約20kDの２つのサイズクラ
スとして検出された。未修飾の還元したｈＶＥＧＦ121
のサイズは約15kDと予測されている。グリコシル化で修
飾された場合、モノマータンパク質は分子量が18kD以上
に移動することが推定される。パルスチェイス解析は、
両方の形態とも60分よりも少ない分泌のハーフタイムで
分泌されることを示す。
【０２２３】CHO細胞により発現される血管内皮細胞増
殖因子のグリコシル化とダイマー化の程度の決定 血管内皮細胞増殖因子の20kD型がＮ-結合したグリコシ
ル化の結果によることを確認するために、pLEN21で形質
転換されたCHO細胞を、抗生物質ツニカマイシン（典型
的には１から10μｇ／ml）の非存在または存在下、無血
清培地で４時間生育した。ツニカマイシンを含有する培
地で４時間生育した後、メチオニンを含まないがツニカ
マイシンを前の４時間の培養に存在したと同量含むDMEM
-21／クーンのF12培地で、30分間細胞をメチオニン飢餓
の状態にした。次に形質転換されたCHO細胞はツニカマ
イシンを含有しないか含有するラベル用培地で４時間、
（上述のように）[35Ｓ]-Ｌ-メチオニンでラベルした。
ツニカマイシン存在下の生育ではｈＶＥＧＦ121の20kD
の還元型の合成が阻害され、血管内皮細胞増殖因子の20
kDのモノマー型はN-結合グリコシル化の修飾によること
を示した。
【０２２４】グリコシル化された、またはグリコシル化
されていないｈＶＥＧＦ121がダイマー形成できるかど
うかを決定するために、ツニカマイシン非存在あるいは
存在下生育したpLEN121-形質転換CHO細胞により馴化さ
れた培地から免疫沈降物を調製した。免疫沈降後、サン
プルは100mMのβ-メルカプトエタノールを含有するか含
有しないSDSサンプルバッファー中で沸騰することによ
りプロテインＡセファロースビーズから溶出した。ツニ
カマイシンが存在しない培地で生育した細胞から調製し
たサンプルは通常の型（15kDと20kD）の血管内皮細胞増
殖因子を有していたが、これはβ-メルカプトエタノー
ル存在下に沸騰してジスルフィド結合を還元した後、SD
S-PAGEにより分画したときである。しかし、サンプルを
β-メルカプトエタノール非存在下で調製したときは、S
DS-ポリアクリルアミドゲル上で、約15kD、20kD、28k
D、32kDおよび36kDの血管内皮細胞増殖因子種を含む５
本のバンドが検出され、ｈＶＥＧＦ121がジスルフィド
結合のダイマーを形成できることが示された。ツニカマ
イシンの存在下に生育した細胞から調製され、β-メル
カプトエタノール中で予め還元したあるいは還元してい
ないサンプルの解析の結果、ｈＶＥＧＦ121の32kDおよ
び36kD型は一方のサブユニットがグリコシル化されてお
り他方がそうでない（32kD型）ヘテロダイマーを形成す
るか、あるいは、両方のサブユニットがグリコシル化さ
れた（36kD型）ホモダイマーであることが明らかになっ
た。28kD型はｈＶＥＧＦ121の２つのグリコシル化され
ていないサブユニット間のホモダイマーの形成による。
上述の条件下、CHO細胞で生産されたｈＶＥＧＦ121の約
50％はN-結合グリコシル化されている。
【０２２５】ｈＶＥＧＦ121はヘパリン-セファロースに
結合しない ｈＶＥＧＦ121のヘパリン-セファロースに対する結合親
和力を決定するために、ヘパリン-セファロースの１ml
（ベッドボリューム）カラムを調製し、10mMトリス-塩
酸、pH 7.5、50mM NaCl（HS平衡バッファー）で、４℃
にて、0.4ml／分の流速で平衡化した。pLEN121-形質転
換CHO細胞により馴化された培地200mlを集め、硫酸アン
モニウム（最終濃度80％ w/v）で10倍に濃縮し、大量の
HS平衡バッファーに対して透析した。10倍に濃縮し、透
析した培地の20mlを（上述の）ラベル用培地で４時間生
育させた細胞から調製した２mlの培地と混合し、１mlの
ヘパリン-セファロースカラムに負荷した。結合せずに
通過した液を集め、SDS-PAGE解析にかけた。次にカラム
をカラム体積の７倍の平衡バッファーで洗浄し、順次、
カラム体積の14倍の10mM トリス-塩酸、pH 7.5、150mM
NaClで洗浄し、ついでカラム体積の６倍の10mM トリ
ス、pH7.5、２Ｍ NaClで洗浄しながら画分を集めた。カ
ラム画分をSDS-PAGEおよびフルオログラフィーで解析し
たところ、ｈＶＥＧＦ121はヘパリン-セファロースに結
合しないことが明らかになった。
【０２２６】ｈＶＥＧＦ121、ｈＶＥＧＦ165およびｈＶ
ＰＦ189の比較から、血管内皮細胞増殖因子の121アミノ
酸型のものはヘパリン結合能を欠くという独特なもので
あることが示された。
【０２２７】亜鉛-セファロースによるｈＶＥＧＦ121の
精製 亜鉛-セファロースクロマトグラフィーによってｈＶＥ
ＧＦ121が更に精製される。金属キレートセファロース
（ファルマシア）の２ml（ベッドボリューム）カラムを
調製し、脱イオン水で洗浄してから、24mlの塩化亜鉛
（ZnCl2）溶液（１mg/ml水溶液）を”チャージ”した。
カラムを再度脱イオン水で洗浄し、10mlの50mM NaH2P
O4、pH 7.0、0.5M NaCl、10mM イミダゾールで”活性
化”した。次にカラムを50mM NaH2PO4、pH 7.0、0.5M N
aCl、0.5mMイミダゾール（亜鉛平衡用バッファー）で再
び平衡化した。10mM トリス-塩酸、pH7.5、50mM NaCl中
にｈＶＥＧＦ121を含むサンプル（ヘパリン-セファロー
スクロマトグラフィーからの非結合物質）の24mlを亜鉛
-セファロースカラムにチャージした。カラムは次に亜
鉛平衡用バッファーで洗浄し、そして最終濃度が５mM、
10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、60mMおよび100mMとな
るようにイミダゾールを添加した亜鉛平衡用バッファー
で分画した。この分画の結果、ｈＶＥＧＦ121は亜鉛平
衡用バッファー中で亜鉛-セファロースに結合し、カラ
ムから最終濃度が15から25mMとなるようにイミダゾール
を添加した亜鉛平行用バッファーで溶出することを示
す。
【０２２８】分泌されたｈＶＥＧＦ121はシグナルペプ
チダーゼ開裂部位で正確に開裂される 亜鉛-セファロース（上述）によるクロマトグラフィー
で精製されたｈＶＥＧＦ121は100mMのβ-メルカプトエ
タノールを含む負荷用バッファーで還元し、SDS-ポリア
クリルアミドゲル電気泳動で分画し、ポリビニリデンジ
フルオライド（PVDF）膜に移し、自動気相蛋白質配列決
定機（アプライドバイオシステムズ）で連続エドマン分
解してＮ末端配列解析を行った。血管内皮細胞増殖因子
の15kDおよび20kD型の両方とも、それぞれの型の90％が
ＡＰＭＡＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶの配列から始まったが、
これに対し、それぞれの型の10％が１-３位欠損型でＡ
ＥＧＧＧＱＮＨＨＥＶであった。これらの結果はCHO細
胞で発現し、分泌されたｈＶＥＧＦ121の15kDと20kD型
の大部分は、天然に単離された型の血管内皮細胞増殖因
子のＮ末端に一致した、正確なＮ末端アミノ酸配列を有
することを確かにした。
【０２２９】モノ-ＱクロマトグラフィーによるｈＶＥ
ＧＦ121の精製 15から25mMのイミダゾールを含むバッファーで亜鉛-セ
ファロースから溶出したｈＶＥＧＦ121を脱塩し、平衡
用バッファー（10mMトリス-塩酸、pH7.5）中でモノ-Ｑ
（ファルマシア）カラムにかけた。結合したタンパク質
は、０mMから300mMの範囲のNaClを含む平衡用バッファ
ーで濃度勾配（カラム体積の30倍）にかけて溶出し、約
80mMから140mMの間のNaClで血管内皮細胞増殖因子が溶
出した。
【０２３０】
【発明の効果】本発明により、血管内皮細胞に対して分
裂促進性があり、従って新たな血管新生（脈管形成）お
よび血管内表面の内皮新生を促進するのに有用な創傷治
癒剤の製造方法が提供される。また、本発明により、組
換えＤＮＡ技術によって血管内皮細胞増殖因子を製造す
る方法および手段が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ポリメラーゼチェーンリアクション
のプロセスの改変によって作製した５つのＤＮＡ配列を
示している。５つの内の１つ（pET-19A；クローン番号
５）は、ウシ血管内皮細胞増殖因子の配列決定された成
熟型の第15位から第38位のアミノ酸をコードする。この
図にはまた、５つのＤＮＡ配列由来のＤＮＡコンセンサ
ス配列およびpET-19Aの翻訳が含まれている。それぞれ
の配列は、EcoRI制限部位およびHindIII制限部位を示す
ＤＮＡリンカーをどちらかの端に含む。
【図２】 図２は、ウシ濾胞星状細胞mRNAから、図１の
５つのＤＮＡが作製され、そして増殖される方法を示す
概略図である。
【図３ａ】 図３ａは、11B'と命名されたクローン由来
のＤＮＡ配列およびその推定アミノ酸配列を示してい
る。示された配列は、ウシ血管内皮細胞増殖因子（ｂＶ
ＥＧＦ120）の15位から120位までのアミノ酸をコードす
る。
【図３ｂ】 図３ｂは、ヒト細胞での好ましいコドンを
使用した場合に基づいた合成ＤＮＡ配列を表しており、
これはｂＶＥＧＦ120の１位から19位までのアミノ酸を
コードし、そして図３ａのＤＮＡ配列の５’末端と重複
する。この合成ＤＮＡは、図３ａのＤＮＡ配列を制限酵
素AccIで消化した後に図３ａの単離されたＤＮＡ配列と
酵素によって連結され、全長の成熟ｂＶＥＧＦ120タン
パク質をコードするＤＮＡ配列が製造される。
【図４】 図４は、ヒト血小板由来増殖因子のＡ鎖サブ
ユニットおよびＢ鎖サブユニットをコードする単離され
たＤＮＡ配列、およびＤＮＡ配列から推定されるこれら
２つのタンパク質の前駆体のアミノ酸配列を示す。
【図５】 図５は、ウシ血管内皮細胞増殖因子をコード
するmRNAの一部を増幅させて作ったＤＮＡを含む、臭化
エチジウムで染色したポリアクリルアミドゲルの写真で
ある。
【図６】 図６は、ｂＶＥＧＦ120およびｂＶＥＧＦ164
をコードする単離されたｃＤＮＡ配列を示す。四角で囲
んだ、塩基342位からのＤＮＡ配列は、ｂＶＥＧＦ164を
コードする、もう一方の様式でスプライスされたｃＤＮ
Ａ中に存在する挿入配列を示している。ヌクレオチド配
列のすぐ下に示すアミノ酸配列は、ｂＶＥＧＦ164の推
定アミノ酸を示している。ｂＶＥＧＦ120の推定アミノ
酸は、113位（Glu）までｂＶＥＧＦ164と一致してい
る。図６では、111位（Arg）から始まるｂＶＥＧＦ120
のカルボキシル末端の配列をイタリックでｂＶＥＧＦ
164の配列の下に示している。
【図７】 図７は、ヒト血管内皮細胞増殖因子の成熟し
た型（ｈＶＥＧＦ121およびｈＶＥＧＦ165）をコードす
る天然のヒトＤＮＡ配列を示している。この示されてい
るＤＮＡ配列は、ヒトゲノムおよびヒトｃＤＮＡクロー
ンから得られた配列の構成を示している。コドン７にコ
ードされる括弧内のアミノ酸（Gly）は、ｂＶＥＧＦ120
およびｂＶＥＧＦ164の配列と比較したときの挿入アミ
ノ酸を示す。
【図８】 図８は、２つのバクテリオファージのオーバ
ーラップしたゲノム挿入物のＤＮＡ配列の一部を示す。
これらは共に、ｈＶＥＧＦの様々な型をコードする８つ
のエクソンおよび隣接するスプライスジャンクションを
含む。
【図９】 図９は、U937細胞のmRNAからのｈＶＥＧＦ
121の全長のｃＤＮＡ配列を増幅するために用いる２つ
のオリゴヌクレオチドプライマーを示している。
【図１０ａ】 図１０ａは、チャイニーズハムスター卵
巣細胞培養物中でｈＶＥＧＦ121を発現するのに用いら
れる発現ベクター、pLENの概略を示している。
【図１０ｂ】 図１０ｂは、チャイニーズハムスター卵
巣細胞培養物中でｈＶＥＧＦ121を発現するのに用いら
れる他の発現ベクター、pMTNの概略を示している。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１０年５月１９日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (71)出願人 593215117 2450 ＢＡＹＳＨＯＲＥ ＰＡＲＫＷＡ Ｙ，ＭＯＵＮＴＡＩＮ ＶＩＥＷ，ＣＡＬ ＩＦＯＲＮＩＡ 94043，Ｕ．Ｓ．Ａ. (72)発明者 ジュディス エイ． アブラハム アメリカ合衆国 カリフォルニア 94086 サニーベイル， ＃アイ−207， エス. フェアオークスアベニュー 655 (72)発明者 ジョン シー． フィデス アメリカ合衆国 カリフォルニア 94301 パロ アルト， ブライアント ストリ ート 2320 (72)発明者 リチャード エル． ミッチェル アメリカ合衆国 カリフォルニア 94086 サニーベイル， ユリーカ コート 283

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 哺乳動物の血管内皮細胞増殖因子をコー
    ドする単離されたＤＮＡ配列。
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