JP3523645B2 - 血管内皮細胞増殖因子の製造 - Google Patents

血管内皮細胞増殖因子の製造

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、創傷治癒の分野に関する。特に本発明は、
血管内皮細胞に対して分裂促進性があり、従って新たな
血管新生（脈管形成）および血管内表面の内皮新生を促
進するのに有用な創傷治癒剤の製造に関する。本発明
は、組換えDNA技術によって血管内皮細胞増殖因子を製
造する方法および手段を提供する。
脈管形成、すなわち新しい毛細血管の増殖は、多くの
型の創傷の適正な治癒に決定的に重要なプロセスであ
る。従って、脈管形成を促進し得る因子は、創傷治癒剤
として有用である。脈管形成は複数工程のプロセスであ
り、毛細血管内皮細胞の増殖、移動、および組織浸透を
含む。塩基性および酸性の線維芽細胞増殖因子、形質転
換増殖因子α、および表皮増殖因子を含む、多くの公知
の増殖因子は、様々な細胞の型に対し広く分裂促進性で
あり、そして脈管形成性である。従って、このような因
子は、潜在的に組織の修復を促進するのに有用である。
多くの型の創傷治癒への適用では、広範囲の細胞分裂促
進性が望ましい。しかし、より細胞特異的な分裂促進活
性を有することが望ましい特異的な型の創傷治癒への適
用もある。例えば、血管移植手術、バルーン血管形成、
あるいは心筋梗塞発症後の患者で側副血行を促進する場
合、血管内皮細胞に高度に特異的な分裂促進活性を有す
る、細胞分裂促進因子を導入した創傷治癒剤を用いるこ
とが望ましい。なぜならば内皮細胞の増殖と共に他の細
胞の型が増殖すると、血流のブロックおよび／あるいは
減少が引き起こされ得るからである。現在のところ、こ
の型の適用に広く利用できる非常に適切な細胞分裂促進
因子はない。
最近、明かに血管内皮細胞に特異的な分裂促進物質
が、ウシ濾胞星状細胞（bovine folliculo stellate ce
lls）の馴化培地から単離された。そしてその部分的な
アミノ酸配列が決定された（Gospodarowiczら、PNAS（1
989）86（19）:7311−7315;FerraraおよびHenzel,BBRC
（1989）161（２）:851−858）。この因子は、２つの約
23kDのサブユニットのホモダイマーのようである。Gosp
odarowiczら、およびFerarraらが記載の、このウシタン
パク質に部分的に相同性のあるマウスの相同物因子が、
マウスAtT20細胞（ATCC CCL 89）の馴化培地から単離さ
れており、そのＮ末端側のアミノ酸配列が決定された
（Plouｔら、EMBO J.（1989）８（12）:3801−380
6）。両方の因子は、血管内皮細胞に対する分裂促進活
性を有しており、そして試験された他の細胞の型に対す
る分裂促進活性は有さないことが示されている。従っ
て、これらの因子は、多くの型の創傷治癒への適用に有
用である。残念ながら、これらの因子をその天然原料か
らの精製によって商業的な量で得ることは、実用的およ
び経済的でない。
発明の要旨 本発明は、創傷治癒剤として用いるための血管内皮細
胞増殖因子を商業的規模の量得るための方法および手段
を提供する。特に本発明は、哺乳類動物の血管内皮細胞
増殖因子のアミノ酸配列をコードするDNA配列を提供す
る。これらのDNA配列は、発現ベクターの調節エレメン
トの制御下に挿入される。このエレメントは、適切な発
現宿主の中で、コードされたアミノ酸配列の発現を行わ
せる。このようにして発現させた血管内皮細胞増殖因子
は、回収され、そして脈管形成および／あるいは再内皮
新生が重要な役割を果たす、様々な創傷治癒への適用に
有用な薬学的組成物中に調合され得る。
本明細書の血管内皮細胞増殖因子をコードするDNA配
列を提供する過程で、我々はこの因子に、２つの異なっ
た型のコーディング領域のmRNAが作られることを発見し
た。これらの２つの型は、明かに異なったメッセージス
プライシングから生じており、オープンリーディングフ
レームの長さが異なっている。これは、成熟タンパク質
のコーディング領域の44個のコドンの挿入の存在あるい
は非存在による。予想される高い分子量の方の因子は、
ウシの場合164個のアミノ酸配列を含み、そしてヒトの
場合は165個のアミノ酸配列を含み、Gospodarowiczら
（前出）、およびFerraraおよびHenzel（前出）によっ
て単離された約23kDのサブユニットに相当すると考えら
れる。挿入が欠如しているコーディング領域から予想さ
れる新規な分子量の低い方の因子は、ウシの場合では12
0個のアミノ酸配列およびヒトの場合では121個のアミノ
酸配列を含む。低分子量型は、アミノ酸配列の長さが異
なるだけでなく、高分子量の型には存在しない、ウシタ
ンパク質の114位のLys残基（ヒトタンパク質では115
位）の存在において異なっている。この違いは、この位
置に相当するコドン内で起こっているメッセージスプラ
イシングが異なるために起こる。便宜上、これらの血管
内皮細胞増殖因子の２つの型を、ウシ因子ではそれぞれ
bVEGF164およびbVEGF120（ヒト因子では、hVEGF165およ
びhVEGF121）と呼ぶ。
121個のアミノ酸型のhVEGFおよびこれに対応する120
個のアミノ酸のウシタンパク質は、このタンパク質の臨
床上の使用に治療的な利点を提供するという点で、hVEG
F165およびbVEGF164の性質とは異なっている。特にhVEG
F121およびbVEGF120はヘパリンに結合しないが、長い型
の方は、強いヘパリン結合能によって特徴付けられる。
ヘパリン結合親和性がないことで、そのタンパク質がよ
り血管内皮細胞増殖因子のレセプターに結合しやすくな
り、半減期および循環系の中でのタンパク質の分布が増
大される。
驚くべきことに、Ｎ末端配列分析から推定されるアミ
ノ酸配列および単離されたDNA配列（図3aに示してあ
る）は、ウシ血管内皮細胞増殖因子、およびヒト血小板
由来増殖因子（PDGF）のサブユニットのＡ鎖およびＢ鎖
それぞれの、これに対応する配列との間に有意なレベル
の配列相同性があることを示す。このうち８個のシステ
イン残基が、これら３つのすべての配列の成熟型で完全
に保存されている。従って、第一のポリペプチド鎖およ
び第二のポリペプチド鎖を含むハイブリッドのダイマー
タンパク質が調製され得る。ここで鎖のうちの１つは、
血小板由来増殖因子のＡ鎖サブユニットあるいはＢ鎖サ
ブユニットのアミノ酸配列の少なくとも一部を含み、そ
してもう一方の鎖は、血管内皮細胞増殖因子のアミノ酸
配列の少なくとも一部を含む。このようなハイブリッド
タンパク質の調製によって、このハイブリッドが、血管
内皮細胞増殖因子および血小板由来増殖因子の細胞分裂
促進活性の間のプロフィールを持つように、分子の性質
を「仕立てる」ことができるようになる。PDGF B−Ｂホ
モダイマーは、血管平滑筋細胞に対して分裂促進性があ
り、血管内皮細胞に対してはない。逆に、本発明の血管
内皮細胞増殖因子は、逆の特異性を有している。ハイブ
リッド因子は、両方のタイプの細胞を刺激し得、従っ
て、創傷治癒におけるより広範囲の細胞分裂促進剤とし
て有用である。
図面の簡単な説明 図１は、ポリメラーゼチェーンリアクションのプロセ
スの改変によって作成した５つのDNA配列を示してい
る。５つの内の１つ（pET−19A;クローン番号５）は、
ウシ血管内皮細胞増殖因子の配列決定された成熟型の第
15位から第38位のアミノ酸をコードする。この図にはま
た、５つのDNA配列由来のDNAコンセンサス配列およびpE
T−19Aの翻訳が含まれている。それぞれの配列は、EcoR
I制限部位およびHind III制限部位を示すDNAリンカー
をどちらかの端に含む。
図２は、ウシ濾胞星状細胞mRNAから、図１の５つのDN
Aが作成され、そして増幅される方法を示す概略図であ
る。
図3aは、11B'と命名されたクローン由来のDNA配列お
よびその推定アミノ酸配列を示している。示された配列
は、ウシ血管内皮細胞増殖因子（bVEGF120）の15位から
120位までのアミノ酸をコードする。図3bは、ヒト細胞
での好ましいコドンを使用した場合に基づいた合成DNA
配列を表しており、これはbVEGF120の１位から19位まで
のアミノ酸をコードし、そして図3aのDNA配列の5'末端
と重複する。この合成DNAは、図3aのDNA配列を制限酵素
Acc Iで消化した後に図3aの単離されたDNA配列と酵素に
よって連結され、全長の成熟dVEGF120タンパク質をコー
ドするDNA配列が製造される。
図４は、ヒト血小板由来増殖因子のＡ鎖サブユニット
およびＢ鎖サブユニットをコードする単離されたDNA配
列、およびDNA配列から推定されるこれら２つのタンパ
ク質の前駆体のアミノ酸配列を示す。
図５は、ウシ血管内皮細胞増殖因子をコードするmRNA
の一部を増幅させて作ったDNAを含む、臭化エチジウム
で染色したポリアクリルアミドゲルの写真である。
図６は、bVEGF120およびbVEGF164をコードする単離さ
れたcDNA配列を示す。四角で囲んだ、塩基342位からのD
NA配列は、bVEGE164をコードする、もう一方の様式でス
プライスされたcDNA中に存在する挿入配列を示してい
る。ヌクレオチド配列のすぐ下に示すアミノ酸配列は、
bVEGF164の推定アミノ酸を示している。bVEGF120の推定
アミノ酸は、113位（Glu）までbVEGF164と一致してい
る。図６では、111位（Arg）から始まるbVEGF120のカル
ボキシル末端の配列をイタリックでbVEGF164の配列の下
に示している。
図７は、ヒト血管内皮細胞増殖因子の成熟した型（bV
EGF121およびbVEGF165）をコードする天然のヒトDNA配
列を示している。この示されているDNA配列は、ヒトゲ
ノムおよびヒトcDNAクローンから得られた配列の構成を
示している。コドン７にコードされる括弧内のアミノ酸
（Gly）は、bVEGF120およびbVEGF164の配列と比較した
ときの挿入アミノ酸を示す。
図８は、２つのバクテリオファージのオーバーラップ
したゲノム挿入物のDNA配列の一部を示す。これらは共
に、hVEGFの様々な型をコードする８つのエクソンおよ
び隣接するスプライスジャンクションを含む。
図９は、U937細胞のmRNAからのhVEGF121の全長のcDNA
配列を増幅するために用いる２つのオリゴヌクレオチド
プライマーを示している。
図10aは、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養物中
でhVEGF121を発現するのに用いられる発現ベクター、pL
ENの概略を示している。図10bは、チャイニーズハムス
ター卵巣細胞培養物中でhVEGF121を発現するのに用いら
れる他の発現ベクター、pMTNの概略を示している。
発明の詳細な説明 本明細書の用語「血管内皮細胞増殖因子」は、血管内
皮細胞に対する分裂促進活性を有し、そして以下の
（ａ）、および（ｂ）である、哺乳類動物のタンパク質
を言う： （ａ）標準的なハイブリダイゼーションの条件下で、図
3aに示したDNA配列にハイブリダイズし得るDNA配列にコ
ードされるアミノ酸配列を有するか、あるいは （ｂ）図６および図７に示された、bVEGF120、bVEG
F164、hVEGF121あるいはhVEGF165のアミノ酸配列に実質
的に相同である。
本明細書では、関連のタンパク質と比較して、アミノ
酸配列の相同性のレベルが少なくとも50％であり、そし
て好ましくは少なくとも80％であるとき、「実質的に相
同である」と考えられる。本明細書の用語「標準的なハ
イブリダイゼーション条件」とは、プレハイブリダイゼ
ーション／ハイブリダイゼーシバッファーとして40％の
ホルムアミドバッファーを用い（以下に記載）、そして
50℃で1xSSC、0.1％SDS中で洗浄することを言う。
本明細書で用いられている、血管内皮細胞増殖因子の
アミノ酸配列の番号付けシステムは、タンパク質の成熟
型、すなわち翻訳後のプロセシングがなされた型に基づ
いている。従って、ウシあるいはヒトタンパク質中で１
番とされる残基は、アラニンであり、これらのタンパク
質の単離された成熟型の第一番目の残基である。
血管内皮細胞に対する細胞分裂促進活性は、標的細胞
として、副腎皮質由来の毛細血管内皮細胞（ACE細胞）
を用いるアッセイによって測定され得る。このアッセイ
は、実質的には、本明細書で参考として援用されてい
る、GospodarowiczらのJ.Cell Physiol.（1986）127:12
1−136）に記載されているように行われる。一般的に
は、ACE細胞のストックの培養物を10％仔牛血清を補充
したダルベッコ変法イーグル培地（DMEM−21）の存在下
で維持する。抗生物質のペニシリン（50IU/ml）、スト
レプトマイシン（50μg/ml）、ゲンタマイシン（50μg/
ml）、およびファンジゾーン（0.25μg/ml）および2mM
のＬ−グルタミンもまた培地に添加し得る。細胞を組織
細胞ディッシュに分配比1:40および1:200との間（好ま
しい分配比では、T75フラスコの15mlの培地中に2.5x105
個の細胞が存在する）で毎週継代していく。細胞分裂促
進アッセイのために、Gospodarowiczら、Europ.J.Cell.
Biol.（1988）46:144−151に記載のように、12ウェルク
ラスタープレートに、１ウェルあたり10％仔牛血清およ
び抗生物質を補充した1mlのダンベッコ変法イーグル培
地中の5x103個の細胞密度の細胞を蒔く。あるいは、Gos
podarowiczらJ.Cell Physiol.（1986）127:121−136に
記載のように、ACE細胞を、35mmディッシュあるいは６
ウェルクラスタープレートに、１つのディッシュ当りあ
るいはウェル当り、2mlの培地中の５〜10x103個の密度
の細胞をプレートする。次にそれぞれのサンプルの適当
な希釈物の10μｌずつを、０日目および２日目に２つあ
るいは３つのウェルに分注する。培養の４あるいは５日
後にプレートをトリプシン処理し、そしてコールターカ
ウンターで細胞密度を測定する。本明細書で記載する目
的では、このアッセイの最後において、因子を添加しな
かったコントロールウェルの細胞密度の少なくとも1.5
倍、および好ましくは少なくとも３倍の細胞密度になる
場合に、因子は血管内皮細胞に対する分裂促進活性を有
すると考えられる。
図3aに記載のDNA配列は、ウシ細胞cDNAライブラリー
から得られ、従って、ウシタンパク質をコードする配列
を表すが、提供されているDNA配列は、他の哺乳類の種
から得られる相同物タンパク質をコードする配列の回収
も可能となる。従って、我々は示されているウシの配列
をプローブとして、対応するヒトタンパク質をコードす
るDNA配列を回収するのに用いた。
さらに本明細書の「血管内皮細胞増殖因子」の範囲に
は、それらの生物学的に活性なフラグメント、およびそ
れらのＮ末端あるいはＣ末端を延長した形、または１つ
以上のアミノ酸残基を置換および／あるいは欠失あるい
は挿入した、質的に本明細書に記載のタンパク質の活性
を保持しているアナログも含む。好ましいアナログに
は、生物学的な活性に必要ではない１つ以上のシステイ
ン残基を異なるアミノ酸残基、好ましくはセリンで置き
換えたものが含まれる。１つ以上のシステイン残基を置
換することによって、分子内および分子間のジスルフィ
ド結合形成の機会が減少し、それによって分子がより安
定になる。hVEGF121、bVEGF120、hVEGF165、およびbVEG
F164中には、９個のシステイン残基が存在する。このう
ち８個はPDGFにも保存されている。従って最も好ましい
アナログは、９番目のシステイン残基がセリンで置換さ
れているものである。このシステイン残基は、hVEGF165
の160位およびhVEGF121の116位およびウシ型の対応する
位置に存在する。アミノ酸置換は、公知の技術を用い
て、本明細書に記載のDNA配列の部位特異的変異導入に
よって行われ得る（例えば、Zoller,M.J.およびSmith,
M.,Nucleic Acids Research（1982）10:6487−6500）。
本明細書のウシ血管内皮細胞増殖因子の天然の型は、
明かに糖が付加されているが、現在のところ生物学的活
性に糖付加が必須であるという証拠はない。従って、本
明細書に提供されている発現配列を使用して原核細胞宿
主あるいは真核細胞宿主によって産生される、生物学的
に活性な糖が付加されていない型あるいは部分的に糖が
付加されている型は、「血管内皮細胞増殖因子」の範囲
に含まれる。
血管内皮細胞増殖因子をコードするDNA配列を、チャ
イニーズハムスター卵巣細胞培養物中で本明細書の条件
下で発現させると、発現するVEGFの約50％がＮ結合糖付
加により修飾されている。hVEGF121の75位のAsn残基に
１つのＮ結合糖付加部位がある（hVEGF165の75位および
bVEGF120およびbVEGF164の74位に相当する）。さらに、
hVEGF121の発現および細胞培養培地への分泌の後、我々
はダイマーのタンパク質の種を単離した。この種は、両
方のサブユニットが糖付加されているかあるいは糖付加
されていない、および一方のサブユニットが糖付加され
ておりもう一方のサブユニットが糖付加されていない、
血管内皮細胞増殖因子のダイマーの分子量に相当する。
血管内皮細胞増殖因子（Gospodarowiczら（前出）、
およびFerraraおよびHenzel（前出）によって単離され
た）は、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定す
ると、約45〜46kDのダイマーのタンパク質である。ウシ
血管内皮細胞増殖因子は、濾胞星状細胞の細胞培養馴化
培地から均一な型で得られた。このプロセスには、硫酸
アンモニウム沈澱；ヘパリン−セファロースアフィニテ
ィークロマトグラフィー；サイズ排除ゲルクロマトグラ
フィー；カチオン交換クロマトグラフィー；および逆相
高速液体クロマトグラフィー、の工程が含まれる。血管
内皮細胞増殖因子を産生することが知られている、例え
ばマウスAtT20細胞の様な他の哺乳類動物種由来の培養
細胞の馴化培地から、対応するタンパク質を精製する場
合にも、同様の手順が用いられる。我々はまた、ノーザ
ンブロット分析によって、ヒト胎児血管平滑筋細胞がヒ
ト血管内皮細胞増殖因子およびこの因子をコードするmR
NAのより供給源になるということも決定した。
上述のようにして得られた、単離したウシ血管内皮細
胞増殖因子のアミノ酸配列を、自動気相プロテインシー
クエンサーでエドマン分解法によって決定した。単一の
主要な24アミノ酸のＮ末端配列が得られ、タンパク質が
ホモダイマーであることが判った。タンパク質のトリプ
シン消化および様々なペプチドフラグメントのアミノ酸
配列決定の後、オーバーラップしたアミノ酸配列からウ
シタンパク質が以下のＮ末端の41アミノ酸配列＊を有す
ることが判った： （＊アミノ酸を表す標準的な１文字略号を用いる） 上記のウシ血管内皮細胞増殖因子のＮ末端のアミノ酸配
列を用いて、このタンパク質の全長あるいは部分的なcD
NAを回収しようとする多くの不成功に終わった試みがな
された。それはこのアミノ酸配列の部分をコードする縮
重させたオリゴヌクレオチドプローブの混合物を用い
て、濾胞星状細胞のcDNAライブラリーをプローブするこ
とによってなされた。図3aのDNAセグメントは、ポリメ
ラーゼチェーンリアクションの改変法によって、アミノ
酸の15位から38位（およびアミノ酸39位のコドンの３分
の２）をコードするヌクレオチド配列を増幅させて作っ
たプローブを用いて、cDNAライブラリーから最終的に回
収されたものである。所望のDNA配列を増幅させるため
のポリメラーゼチェーンリアクション法は、米国特許第
４、683、202号および第４、683、195号の中に詳細が記
載されている。これらは参考として本明細書に援用され
ている。この方法によって、多くの配列が知られていな
い場合でも、増幅したい配列のどちらかの端にハイブリ
ダイズするオリゴヌクレオチドプライマーさえあれば、
所望のヌクレオチド配列の増幅が可能となる。ポリメラ
ーゼチェーンリアクションのプロセスには、cDNAの所望
のセグメントを増幅するために、プライマーとして縮重
オリゴヌクレオチドが用いられる（Leeら、Science（19
88）1288−1291）。
図3aのcDNAを回収するのに用いたDNAプローブは、図
１に示す５つの類似の配列から選択された。これらの配
列は、図２に示す概略および以下に実施例中で詳細に記
載しているような手順で得られた。示されている手順に
よれば、ウシ濾胞星状細胞由来のポリ（Ａ）+RNAを、血
管内皮細胞増殖因子の35位から39位のアミノ酸配列に基
づいて作成した16倍縮重の合成オリゴヌクレオチド混合
物からなるアンチセンスプライマーとハイブリダイズさ
せる。24塩基のオリゴヌクレオチドプライマーは、5'末
端に10塩基のEcoR Iリンカーを有しており、14塩基がア
ミノ酸配列を反映していた。ポリ（Ａ）+RNAにハイブリ
ダイズする混合物中のオリゴヌクレオチドプライマー配
列は、デオキシヌクレオチド三リン酸（dNTPs））およ
び逆転写酵素の存在下で、所望のmRNAの部分に相補的な
DNA鎖の合成を始めるのに用いられた。次に第一の合成
された鎖に相補的な第二のDNA鎖を以下のようにして調
製した。すなわちウシ血管内皮細胞増殖因子の15位から
19位のアミノ酸配列に基づいて作成した、８倍縮重合成
24塩基オリゴヌクレオチド混合物からなるセンス鎖プラ
イマーに第一の合成鎖をハイブリダイズさせて作った。
この第二の鎖のオリゴヌクレオチドプライマーは、5'末
端に10塩基のHind IIIリンカーを連結させており、アミ
ノ酸配列を反映する14塩基領域を含んでいた。第一の合
成DNA鎖にハイブリダイズする、混合物中のオリゴヌク
レオチドプライマー配列は、dNTPおよびDNAポリメラー
ゼＩ、すなわちクレノウフラグメントの存在中で、第二
のDNA鎖の合成を始めるのに用いられた。プライマー中
の10塩基リンカー配列は、第一のDNA鎖にハイブリダイ
ズし得ないため、第二鎖の合成は、残りの14ヌクレオチ
ドが第一のDNA鎖にハイブリダイズしたまま残り得る28
℃で行われた。DNAポリメラーゼＩ、すなわちクレノウ
フラグメントは、第二の合成に用いられる。なぜなら
ば、通常ポリメラーゼチェーンリアクションに用いられ
るThermus aquaticus（Taq）DNAポリメラーゼが、この
温度でDNA合成を触媒することができないからである。
第二の鎖合成によって、ウシ血管内皮細胞増殖因子の15
位から38位のアミノ酸の部分（および39位のアミノ酸の
コドンの三分の二）をコードするセンス鎖ができる。
次に２つの合成DNA鎖を分離し、そして反応の連続的
な繰り返しによって所望の配列を増幅させた。この反応
では、センスおよびアンチセンスの両方のオリゴヌクレ
オチドプライマー混合物およびThermus aquaticus（Ta
q）DNAポリメラーゼの存在中で、一本鎖DNAを相補鎖の
合成のための鋳型として用いた。相補鎖のそれぞれの合
成の後、反応混合物を加熱して鎖を分離し、そしてこの
反応を繰り返した。
増幅の30サイクルの後、ポリメラーゼチェーンリアク
ション混合物から得たDNAを、６％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動にかけた。このゲル中のDNAを臭化エチジ
ウムで染色し、15位から38位までのアミノ酸に対するコ
ード配列（およびアミノ酸39位のコドンの三分の二）お
よびプライミングオリゴヌクレオチドのHind IIIおよび
EcoR Iリンカーを含む大きさに相当するバンドをゲルか
ら切り出した。臭化エチジウム染色したゲルを図５の写
真に示す。ここで増幅された所望の配列を表す主要なバ
ンドは、視覚的にはっきりと見分け得る。主要なバンド
を含む切り出したゲル片から、DNAを電気的に溶出し、H
ind IIIおよびEcoR Iで消化し、Hind III−およびEcoR
I−カットしたM13mp19およびM13mp18ファージベクター
中にライゲーションして入れた。E.coli JM103宿主細胞
にこのライゲーション混合物を入れて形質転換した後単
離した無色のプラークのDNA配列分析によって、血管内
皮細胞増殖因子の15位から38位のアミノ酸（および39位
のアミノ酸のコドンの三分の二を含む）をコードするcD
NAが実際に得られたことが判った。これらの組換えファ
ージ（pET−19A）の１つに含まれている増幅させたDNA
配列を、ウシ濾胞星状細胞cDNAライブラリーからクロー
ン化したcDNA配列を回収するためのプローブとして用い
た。単離したクローン化配列は、ウシ血管内皮細胞増殖
因子の成熟型のうちの１つのＮ末端アミノ酸の14個以外
の全てをコードする797塩基対挿入部からなっていた。
単離されたクローン化挿入物を、pUC8のEcoR I部位にラ
イゲーションしていれ、pST800と名付けられたプラスミ
ドを作成した。この挿入物は、図3a（図3aでは、挿入物
のそれぞれの端にあるEcoR Iリンカーは示されていな
い；従って、配列には挿入物の７位のヌクレオチドから
番号をつけてある）に示されるようなヌクレオチド配列
を含んでいた。bVEGF120の第15位から120位のアミノ酸
のコード領域は、図3aの第９位から326位のヌクレオチ
ドで表されている。
図3aに示す、単離したDNA配列から推定されるアミノ
酸配列は、74位のアミノ酸であるアスパラギン残基の位
置（ヒト型の75位のアミノ酸に対応する）に１つのＮ結
合糖付加の可能性のある部位を含む。この部位での約3k
DのＮ結合糖付加によって、コードされるタンパク質
は、約17kDの全分子量であることが予想される。これは
Gospodarowiczら、そしてFerraraおよびHenzelによって
単離された血管内皮細胞増殖因子サブユニットで見られ
た約23kDの見かけの分子量よりかな小さい。このため、
単離されたcDNAが、以前に観察されたものとは異なる型
の血管内皮細胞増殖因子をコードすることは明かであ
る。ポリメラーゼチェーンリアクション実験によって、
血管内皮細胞増殖因子コード領域の別の型が存在するこ
とが判った。
ポリメラーゼチェーンリアクションは、図６の70位か
ら126位の塩基に相当するセンスオリゴヌクレオチドお
よび513位から572位の塩基に相当するアンチセンスを用
いて、濾胞星状ポリ（Ａ）+RNAから始められた。できた
産物をBstN I（それぞれのプライマーの中を切断する）
消化したのちにポリアクリルアミドゲル分析したとこ
ろ、約300bpおよび約450bpの２つの主要な種類があるこ
とが判った。これらの産物の両方は、M13ベクター中に
サブクローンされ、そして塩基配列の決定が行われた。
小さい方の産物（311bp）のDNA配列は、PCRでpST800中
のcDNAが増幅された場合に予想されるものに相当した。
大きい方のフラグメントの配列は、132bpの挿入物（図
６の四角で囲んだ配列）以外は、311bpの産物と同一で
あった。以下に示されるように得られた、ヒト血管内皮
細胞増殖因子のゲノムのクローンの分析によって、この
挿入物がエクソンとイントロンのつなぎ目にあることが
わかった。これによって、２つのコード領域の型は、別
々のエクソンスプライシングによってできたことが示唆
される。
図１あるいは図3aに示してあるDNA配列は、全長のウ
シ血管内皮細胞増殖因子、あるいは対応するヒトのタン
パク質を含む、他の種の血管内皮細胞増殖因子、あるい
は血管内皮細胞増殖因子としての同じ遺伝子ファミリー
中の関連タンパク質、をコードするDNAを回収するのに
有用である。
pST800の配列の上流の配列情報を有する、ウシ血管内
皮細胞増殖因子のcDNAクローン（図3a）を得るために、
Frohman,M.A.ら、PNAS（USA）（1988）85,8998−9002に
記載の"RACE"ポリメラーゼチェーン反応法の変法を用い
た。リンカーを血管内皮細胞増殖因子のmRNAのプライマ
ー伸長で得た２本鎖の5'末端にライゲートした。その
後、この元来のプライマー伸長オリゴヌクレオチドおよ
びリンカーに相補的なオリゴヌクレオチドをプライマー
として用いてポリメラーゼチェーン反応を行った。プラ
イマーをHind IIIで消化し、M13ベクターにサブクロー
ニング後、得られたポリメラーゼチェーン反応生成物の
配列分析を行い、血管内皮細胞増殖因子の成熟アミノ末
端をコードする配列（図６）を得た。得られた最も長い
cDNAクローンは、成熟タンパク質のコード領域（AGTGGT
CCCAGGCTGCACCC...）の始まりから14bp、5'末端側に延
長しており、血管内皮細胞増殖因子の前駆体の４つの付
加アミノ酸（WSQAAPMA...）を明かにした。
ヒト型の血管内皮細胞増殖因子のDNA配列を回収する
ために、図１、図3a、あるいは図６の配列、好ましくは
図3aあるいは図６の配列、あるいはそれらのセグメント
を、cDNAライブラリーあるいはゲノムライブラリーから
所望の配列を回収するためのプローブとして用いた。ゲ
ノムライブラリーは、公知の技術によって調製され得る
し、今では商業的に入手可能である。ヒト血管内皮細胞
増殖因子をコードするゲノムDNA配列が単離され得る適
切なゲノムDNAライブアリーは、ヒト腺維芽細胞のゲノ
ムライブラリーである（Stratagene Inc.,La Jolla,C
A）。W138細胞株から得たこのライブラリーは、λ FIX
TMベクター中に＞15kbのDNA挿入物を有する。あるい
は、ゲノムライブラリーは、Frischauf,A.M.の、Method
s in Enzymology、Berger,S.L.およびKimmel,A.R.編,Vo
l.152,pp.190−199（1987）Academic Press,N.Y.に記載
の方法によって調製され得る。cDNAライブラリーを調製
する方法は、また当業者にはよく知られている（例え
ば、Kimmel,A.R.およびBerger,S.L.,同誌、pp.307−316
を参照）。好ましくは、cDNAライブラリーは、活発に血
管内皮細胞増殖因子を生産している細胞株あるいは組織
から調製される。ヒトタンパク質をコードするcDNA配列
の単離のためには、胎児ヒト血管平滑筋細胞から調製さ
れたcDNAライブラリーを用いるのが好ましい。前記のよ
うにして得られた血管内皮細胞増殖因子をコードするDN
A配列は、所望の宿主中でDNA配列の発現を指令し得る調
節配列の制御下に、適切な発現ベクターに挿入される。
回収されるDNA配列がイントロンを含むゲノム配列であ
る場合には、次に、真核宿主に適した発現ベクターにそ
の配列を挿入することが望ましい。原核宿主における血
管内皮細胞増殖因子をコードするゲノムDNAの発現は、
イントロン配列を除くためのコードされたRNAの正確な
スプライシングを伴う。このことによって所望のタンパ
ク質をコードするmRNAの鋳型を生産する。あるいは、合
成DNA配列が、ゲノム配列中のイントロン配列を除去し
た後に得られるコード配列を提示する合成オリゴヌクレ
オチドから構築され得る。血管内皮細胞増殖因子をコー
ドする、この合成配列あるいはcDNA配列を含有する発現
ベクターは、原核あるいは真核宿主でタンパク質を発現
するために使用され得る。例示的な制御配列のDNAおよ
び宿主は下記の標準工程の項に記載されている。
生物学的に活性な血管内皮細胞増殖因子は、本発明の
方法に従って、ホモダイマー分子として生産される。こ
れに関連して、用語「ホモダイマーの」は、２個のサブ
ユニットが同じアミノ酸の一次構造を有するダイマーで
ある。前に示したように、サブユニットの１個あるいは
両方が、Ｎ−結合のグリコシル化によって修飾され得る
か、あるいはサブユニットの両方とも修飾され得ない。
完全に活性なタンパク質は、ダイマーを形成するジスル
フィド結合を形成させる条件下で、本発明のDNA配列に
よってコードされるポリペプチド配列の発現および／ま
たは回収により産生される。
本発明は、さらに、アミノ酸の一次構造の一部が、血
小板由来の増殖因子のＡ鎖サブユニットあるいはＢ鎖サ
ブユニットのいずれかの部分、あるいは血管内皮細胞増
殖因子の部分に対応するアミノ酸の一次構造の部分に対
応する、キメラのダイマータンパク質の生産法を提供す
る。特に、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプ
チド鎖を有するキメラ増殖因子が提供されていて、該鎖
間はジスルフィド結合されており、第１のポリペプチド
鎖は、少なくとも血小板由来の増殖因子のＡ鎖サブユニ
ットあるいはＢ鎖サブユニットのいずれかのアミノ酸配
列の一部分を有し、そして第２の鎖は、少なくとも血管
内皮細胞増殖因子のアミノ酸配列の一部分を有する。
血小板由来の増殖因子は、約30kDのダイマーであっ
て、ホモダイマーおよびヘテロダイマー型で単離されて
いる。血小板由来の増殖因子のヘテロダイマーは、Ａ鎖
およびＢ鎖と呼ばれる２つのポリペプチド鎖を有してい
る。成熟Ａ鎖およびＢ鎖は、約40％のアミノ酸配列の相
同性を示し、８個のシステイ残基が完全に保存されてい
る。血小板由来の増殖因子は、インビボでＡ−Ａあるい
はＢ−Ｂホモダイマーのいずれか、あるいはＡ−Ｂヘテ
ロダイマーとして存在する。
血小板由来の増殖因子のＡ鎖およびＢ鎖サブユニット
をコードするDNA配列は、単離され配列分析されている
（Ａ鎖cDNA（ヒト）は、Betsholtz,C.ら、Nature（198
6）320に記載されている;A鎖ゲノムDNA（ヒト）は、Bon
thron,D.T.ら、PNAS（1988）85:1496に記載されている;
B鎖のcDNA（ヒト）は、Collins,T.ら、Nature（1985）3
16:748に記載されている；およびＢ鎖ゲノムDNA（ヒ
ト）は、Chin,I.−M.ら、Cell（1984）37:123に記載さ
れている。）。図４は、ヒト血小板由来の増殖因子の、
5'末端にBamH Iリンカー結合のおよよび3'末端にEcoR V
リンカー結合の、それぞれのＡ鎖およびＢ鎖サブユニッ
トの単離されたcDNA配列および推定される前駆体のアミ
ノ酸配列を示している。これらの配列のそれぞれは、適
切な調節エレメントの制御の下に、適当な発現ベクター
に挿入し、適当な宿主、例えば、E.coliあるいはチャイ
ニーズハムスター卵巣（CHO）細胞あるいは酵母などの
原核宿主において発現され得る。
本発明が意図するキメラ増殖因子タンパク質の例に
は、ジスルフィド結合によって、血管内皮細胞増殖因子
のポリペプチド鎖の全長に結合された血小板由来の増殖
因子のＡ鎖サブユニットの全長を有するダイマータンパ
ク質；およびジスルフィド結合によって、血管内皮細胞
増殖因子のポリペプチド鎖の全長に結合された血小板由
来の増殖因子のＢ鎖サブユニットの全長を有するダイマ
ータンパク質が含まれる。他の上記よりは望ましくない
実施態様において、ダイマータンパク質は、ジスルフィ
ド結合された２つのポリペプチド鎖で、片方の鎖あるい
は両方の鎖が、血小板由来の増殖因子あるいは血管内皮
細胞増殖因子のＡ鎖あるいはＢ鎖サブユニットのいずれ
かのＮ末端部分に対応するアミノ酸配列を有するＮ末端
セグメントであり、そして選択されなかった他の２つの
鎖の１つから選ばれたＣ末端配列に対応するＣ末端セグ
メントからなり得る。例えば、血小板由来の増殖因子の
Ａ鎖のＮ末端の1/2が、血管内皮細胞増殖因子のＣ末端
の1/2にペプチド結合された１つのポリペプチド鎖；お
よび血管内皮細胞増殖因子の全アミノ酸配列からなるも
う一方のペプチド鎖であるダイマーが調製され得る。逆
に、１つのポリペプチド鎖は、血小板由来の増殖因子の
Ａ鎖あるいはＢ鎖サブユニットのＣ末端セグメントに結
合された血管内皮細胞増殖因子のＮ末端部分からなり
得、そして、もう一方のポリペプチド鎖は、血管内皮細
胞増殖因子のアミノ酸配列を有し得る。容易に明らかに
なるように、多くの異なるハイブリッドの組み合せが調
製される。
本発明のキメラ増殖因子を調製するために、各々の所
望の鎖をコードするDNA配列は、プラスミドなどの適当
な発現ベクター内に、宿主細胞でその発現を指令し得る
調節配列の制御下に挿入される。次に、宿主細胞は発現
ベクターによって形質転換される。所望であれば、１つ
の宿主を、２つの鎖用の各発現ベクターで同時形質転換
し得る。あるいは、別の宿主細胞を、２つのポリペプチ
ド鎖を同時にコードするベクターで形質転換し得る。次
に、このポリペプチド鎖を、従来の方法によって発現さ
せ、そして回収する。そのペプチド鎖が、宿主細胞から
分泌されるように分泌シグナル配列と共に発現されると
きには、それらは、合成および分泌の間に自然に正確な
ダイマー構造を形成し得る。次に、そのダイマーは、Go
spodarowiczら、PNAS（1989）86（19）:7311−7316、お
よびFerraraおよびHenzel、BBRC（1989）161（２）:851
−858に記載の方法を用いて精製し得る。この経路で正
確なダイマー構造が得られない場合には、あるいは、キ
メラの２つの鎖が異なる宿主で合成される場合には、次
に、鎖の再折り畳みおよびダイマー化の手段の１つの例
は、下記の実施例により詳細に記載されているように、
グアニジン−HCl、Na2SO3およびNa2S4O6で部分的に精製
された鎖あるいは精製された鎖を処理することである。
次に、得られたＳ−スルホン化され、変性されたタンパ
ク質は、最終精製の前に、5mMのグルタチオン、0.5mMの
グルタチオンジスルフィド、および尿素の存在下に再折
り畳みおおよびダイマー化の両方がなされる。
組成物および使用 本発明によって提供される血管内皮細胞増殖因子（bV
EGF120、bVEGF164、hVEGF121、あるいはhVEGF165）は、
創傷治癒剤として有用であり、特に、血管組織に内皮を
再形成したい部位あるいは新しい毛細血管床（脈管形
成）の増殖が重要である場所に塗布するのに有用であ
る。
従って、血管内皮細胞増殖因子は、床ずれ、静脈潰
瘍、および糖尿病性の潰瘍の種類を含む皮膚潰瘍など
の、十分に深い創傷の処置に用いられ得る。さらに、血
管内皮細胞増殖因子は、火傷あるいは外傷の部位に皮膚
移植あるいは皮弁を調製するために脈管形成が必要とさ
れる十分に深い火傷あるいは外傷の処置に用いられ得
る。この場合には、血管内皮細胞増殖因子は、部位に直
接に塗布されるか、移植する前に移植される皮膚あるい
は皮弁を浸すのに用いられる。同様に、血管内皮細胞増
殖因子は、火傷、他の外傷後、あるいは化粧の目的に、
再成形が必要とされる成形外科に用いられ得る。
脈管形成はさらに、傷を清潔に感染しないように保つ
のに重要である。従って、血管内皮細胞増殖因子は、外
科全般および切口および裂傷の修復に関して使用し得
る。特に、感染の危険性の高い腹の傷の処置に有用であ
る。さらに、新生血管の形成は、骨折の修復に重要であ
る。なぜなら、骨の損傷部位に血管が成長発達するから
である。従って、血管内皮細胞増殖因子の骨折部位への
投与は、もう一つの使用法である。
血管内皮細胞増殖因子が、上記のように局部の創傷治
癒に用いられる場合には、脈管組織の内皮再形成のため
に、下記に示すいずれかの経路、あるいは、より好まし
くは、局所的な方法によって投与され得る。これらの場
合には、溶液、スプレー、ゲル、クリーム、軟膏あるい
は乾燥粉末のいずれかとして直接に損傷部位に投与され
る。血管内皮細胞増殖因子を損傷部分にゆっくりと放出
するように制御する素子もまた用いられる。局部塗布で
は、血管内皮細胞増殖因子は、１回投与、あるいは１週
間から数週間の期間毎日あるいは数日毎の投与処方のい
ずれかで、50から1000μg/mlの濃度範囲で塗布される。
一般的に、投与される局所調合の量は、創傷の表面積に
基づいて約0.1から100μg/cm2の血管内皮細胞増殖因子
の塗布で十分である。
血管内皮細胞増殖因子は、その工程で血管内皮細胞が
除去あるいは破壊され、アテロームプラークの圧縮を伴
うバルーン血管形成術後の創傷治癒剤として使用され得
る。血管内皮細胞増殖因子は、全身的にあるいは局所的
に静脈内に、静脈内ボーラス注入あるいは点滴のいずれ
かで、血管内部表面に塗布され得る。所望であれば、血
管内皮細胞増殖因子は、長時間にわたり、マイクロメー
タリングポンプを用いて投与され得る。血管内投与に適
した組成物は、内皮細胞の増殖を促進するのに効果的な
量の血管内皮細胞増殖因子、および非経口用のキャリア
ー物質を含有する。血管内皮細胞増殖因子は、広い濃度
範囲の組成物として存在し得る。例えば、単回あるいは
複数回の塗布処方で投与される、患者当り３から10mlの
注射を用いる場合には約50μg/mlから約1,000μg/mlの
濃度である。通常の生理食塩水あるいは５から10％のデ
キストロースなどの、公知のあらゆる非経口キャリアー
溶液が使用され得る。
血管内皮細胞増殖因子は、血管移植手術での内皮の形
成を促進するために使用され得る。移植血管あるいは合
成物質のいずれかを用いる血管移植の場合に、例えば、
血管内皮細胞増殖因子は、血管内皮細胞の増殖を促進す
るために、移植片の表面に塗布され得るか、および／ま
たは、移植片およびそこにある血管とのつなぎ目に塗布
され得る。このような塗布の場合、血管内皮細胞増殖因
子は、前記のバルーン脈管形成用のように静脈内に、あ
るいは手術前あるいは手術中のいずれかに、移植片およ
び／またはそこのある血管の表面に直接塗布され得る。
このような場合には、病巣の表面に付着され、肉厚のキ
ャリアー物質中にいれた血管内皮細胞増殖因子を塗布す
るのが望ましい。適切なキャリアー物質には、例えば１
−５％のカルボポール（carbopol）が含まれる。血管内
皮細胞増殖因子は、キャリアー中には広い濃度範囲、例
えば約50μg/mgから約1,000μg/mgで含まれ得る。ある
いは、血管内皮細胞増殖因子は、非経口溶液として、部
位にマイクロメータリングポンプで送られ得る。
血管内皮細胞増殖因子は、さらに、側副循環の血管の
内皮細胞の増殖を促進することによって、心筋梗塞形成
後の血管破壊の修復のために、および冠状動脈のバイパ
ス手術用の包囲に使用され得る。血管内皮細胞増殖因子
はこの目的に、静脈内に個々の注射によって、または前
述のようにある期間マイクロメータリングポンプによっ
て、あるいは直接注入によって、あるいは心臓の損傷し
た筋肉の部位への注射によって投与される。
血管内皮細胞増殖因子は、さらにインビトロでの血管
細胞培養用の増殖因子として使用され得る。このような
使用には、血管内皮細胞増殖因子は、約10pg/mlから約1
0ng/mlの濃度で細胞培養培地に添加され得る。
本発明のハイブリッド増殖因子分子は、血小板由来の
増殖因子と血管内皮細胞増殖因子との中間の有糸分裂促
進活性を示すと予想され、あるいは、ある場合には、脈
管形成のインヒビターとして用いられ得る。２つの因子
の活性の間の最も大きな違いは、血小板由来の増殖因子
は、実質的な有糸分裂活性を平滑筋細胞および腺維芽細
胞には示すが、内皮細胞には示さないことである。一
方、血管内皮細胞増殖因子は逆の特性を示す。PDGF A鎖
および／またはＢ鎖の平滑筋細胞および腺維芽細胞に対
する有糸分裂活性は、創傷治癒のための張力を与える。
従って、血小板由来の増殖因子と血管内皮細胞増殖因子
とのハイブリイドであるその増殖因子は、新生血管の形
成の誘導、および治癒の間および治癒後に創傷部分に張
力を与えるために塗布され得る。このハイブリッド増殖
因子は、前記の血管内皮細胞増殖因子と基本的には同様
の様式で、同様の投与量で付与される。
種々の型の血管内皮細胞増殖因子をコードするDNA配
列、およびそれらの推定アミノ酸配列の解明は、さらに
血管内皮細胞増殖因子活性のインヒビターを生産する方
法を提供する。血管内皮細胞増殖因子の脈管形成活性の
阻害は、増殖中の癌に必要な血液供給を提供するには新
生血管の形成が必要とされるので、例えば癌の増殖を遅
らせたり阻むのに有用である。血管内皮細胞増殖因子に
対する抗体、あるいは血管内皮細胞増殖因子のレセプタ
ーには結合し得るが、全長の血管内皮細胞増殖因子の脈
管形成活性は示さない血管内皮細胞増殖因子のフラグメ
ントが投与され得る。
発現され単離された血管内皮細胞増殖因子タンパク質
に対する抗体は、公知の技術で生産され得る。治療用抗
体はポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体で
あり得る。抗体は、ウサギ、マウスあるいは他の適当な
動物で、標準的な免疫のプロトコールを用い、そして抗
血清を回収することにより調製される。さらに、免疫さ
れた動物の抗体分泌細胞は、血管内皮細胞増殖因子と免
疫反応する抗体によりスクリーニングされ得るハイブリ
ドーマを生産する細胞融合法を用いて、株化され得る
（例えば、"Antibodies:A Laboratory Manual",E.Harlo
w,およびD.Lane著、Cold Spring Harbor Laboratoty,Co
ld Spring Harbor,N.Y.を参照）。適切な処置の処方
（すなわち、投与量、投与頻度、全身的投与あるいは局
所的投与など）の決定は、当分野の技術範囲内である。
投与には、抗体は、薬学的に受容可能な非経口溶液と共
に、単位投与量の注射用形態（溶液、懸濁液、乳液な
ど）に調合される。このような溶液は、通常無毒性およ
び非治療性である。このような溶液には、水、生理食塩
水、リンゲル液、デキストロース溶液、およびハンク液
がある。不揮発油およびエチルオレイン酸などの非水溶
液もまた使用され得る。好ましい溶媒は、５％（w/w）
のヒトアルブミン生理食塩水溶液である。溶媒は、等張
性および化学安定性を増大する物質のような少量の添加
剤、例えばバッファーおよび保存剤を含有し得る。抗体
は、このような溶媒中に、典型的には、約20μg/mlから
約20mg/mlの濃度に調合される。
さらに、本明細書には、例えば腫瘍の増殖を遅らせる
かあるいは阻むための脈管形成を阻害する方法が提供さ
れる。この方法には、２つの異なるサブユニットを有す
るヘテロダイマーのタンパク質の投与が含まれ、この各
々のサブユニットは、hVEGF121、hVEGF165、およびhVPF
189の成熟アミノ酸配列から選択される。用語hVPF189と
は、図８に示されている転写されたゲノムDNA配列の現
在では分化メッセージのスプライシングから生じること
が見い出されている、189個のアミノ酸のタンパク質で
ある。hVPF189のホモダイマー型は、血管透過性因子と
呼ばれている。hVPFのアミノ酸配列は、hVEGF121および
hVEGF165の両者と、成熟タンパク質のＮ末端の114個の
アミノ酸およびＣ末端の６個のアミノ酸が相同である。
しかし、hVPF189は、hVEGF121には存在しない、115位か
ら始まる68個のアミノ酸の配列を有する。hVPF189の全c
DNAコード配列および推定アミノ酸配列は、Keck,P.ら、
Science（1989）246:1309−1312に記載されている。こ
の記載は、本明細書に参考として援用されている。特定
の理論あるいは作用の機構に束縛されることを望んでは
いないが、ダイマーPDGF様の増殖因子は、そのダイマー
の各々のサブユニットが、細胞表面の別々のレセプター
サブユニットに結合する機構、すなわちレセプター活性
を誘起するのに必要な２つの隣接したレセプターサブユ
ニットに結合して生物学的活性を誘発すると考えられ
る。血管内皮細胞増殖因子ファミリーの異なるサブユニ
ットからなるヘテロダイマーの投与によって、サブユニ
ットの各々は、各々のサブユニトは特定のレセプターの
サブタイプに結合し得る。そのことによって、結合レセ
プターを、外来のホモダイマー血管内皮細胞増殖因子と
の相互作用から効果的に阻害する。しかし、投与された
ホモダイマーの他のサブユニットは、異なる血管内皮細
胞増殖因子のサブタイプであるので、そのダイマーは、
同じサブタイプの第２のレセプターサブユニットに結合
してレセプターの生物学的活性を誘発することができな
い。
脈管形成を阻害するためにこのような方法に用いられ
るヘテロダイマータンパク質は、hVEGF121、hVEGF165あ
るいはhVPF189の所望のアミノ酸配列を、別々の宿主で
発現させることのよって、あるいは同じ宿主で同時発現
させることによって生産し得る。次に、ダイマー化を、
本明細書の他のところに記載した方法でなし得る。所望
のヘテロダイマーは、タンパク質のサイズ分離に都合の
よい任意の方法によってホモダイマー型と分け得る。ヘ
テロダイマーは、血管内皮細胞増殖因子を脈管形成賦剤
として投与する同じ様式で、抗脈管形成処置が必要な宿
主、例えば、癌にかかっている患者に投与される。正確
な投与処方および投与量の決定は、当分野の技術範囲内
である。
脈管形成を阻害する他の方法は、１つのサブユニット
が、hVEGF121、hVEGF165あるいはhVPF189から選択さ
れ；他のサブユニットが生物学的に不活性なフラグメン
ト、あるいは、１つあるいはそれ以上のアミノ酸が、そ
のサブユニットを不活性にする異なるアミノ酸で置換さ
れている、hVEGF121、hVEGF165あるいはhVPF189のアナ
ログである；ヘテロダイマーの投与である。
血管内皮細胞増殖因子は癌細胞中では高いレベルで生
産されるので、従来の免疫アッセイで、抗血管内皮細胞
増殖因子抗体を用い、患者の腫瘍の存在を検出するのに
用いられ得る。血管内皮細胞増殖因子に対する抗体、好
ましくはhVEGF121あるいはhVEGF165などのヒト血管内皮
細胞増殖因子に対する抗体は、公知の技術によって生産
し得る。抗体はポリクローナル抗体あるいはモノクロー
ナル抗体であり得る。血管内皮細胞増殖因子のレベル
は、液体サンプル、好ましくは、腫瘍を有すると思われ
る患者の血清サンプル中で、測定される物質に対する抗
体を用いて、任意の従来の免疫アッセイ法を用いて定量
される。好ましいアッセイは、サンドイッチタイプの酵
素免疫アッセイあるいは放射免疫アッセイなどの、サン
ドイッチタイプの免疫アッセイである。血管内皮細胞増
殖因子の循環レベルは、これらの方法によって、１−10
00pg/mlレベルが、よい信頼性測定され得る。血管内皮
細胞増殖因子の測定されたレベルを、正常人、すなわち
腫瘍を有さないヒトから得たコントロールレベルと比較
する。血管内皮細胞増殖因子の増加した循環レベルは、
腫瘍と判断される。
標準的な方法 細胞の形質転換、ベクターの構築、メッセンジャーRN
Aの抽出、cDNAライブラリーの調製などに用いられるほ
とんどの手順は、当分野では広く行われていて、ほとん
どの専門家には、特定の条件および手順が記載されてい
る標準的な資材はよく知られている。しかし、便宜上、
以下の項にガイドラインとして掲げた。
宿主および制御配列 原核および真核系の両者が、血管内皮細胞増殖因子の
コード配列を発現するために使用され得る。もちろん原
核宿主は、クローニングの方法に最も都合がよい。最も
頻用される原核宿主は、種々のE.coli株に代表される；
しかし、他の微生物株もまた使用され得る。宿主微生物
に適した種由来の、複製部位、選択マーカーおよび制御
配列を有するプラスミドベクターが使用され得る；例え
ば、E.coliは、典型的には、Salmonellaから得た２つ、
およびBolivarら、Gene（1977）２:95に記載のE.coliか
ら単離された１つの、３つの天然に存在するプラスミド
の部分から構築されたプラスミドであるpBR322の誘導体
を用いて形質転換される。pBR322は、アンピシリンおよ
びテトラサイクリン耐性の遺伝子を含有し、所望のベク
ターの構築で保存あるいは破壊し得る、複数の選択マー
カーを提供する。一般的に用いられる原核制御配列（ま
たは、本明細書では「調節エレメント」とも呼ばれる）
は、本明細書では転写開始プロモーター、必要に応じて
オペレーターを伴って、リボソーム結合部位配列を含む
と定義されていて、この制御配列には、β−ラクタマー
ゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース（lac）プロモ
ーター系（Changら、Nature（1977）198:1056）、およ
びトリプトファン（trp）プロモーター系（Goeddelら、
Nucleic Acids Res.（1980）８:4057）およびλ由来PL
プロモーターおよびＮ−遺伝子リボソーム結合部位（Sh
imatakeら、Nature（1981）292:128）などの一般に用い
られているプロモーターが含まれる。
細菌に加えて、酵母などの真核微生物も宿主として用
い得る。多くの菌株や種が一般に入手可能であるが、Sa
ccharomyces cerevisiae、パン酵母の研究用菌株が最も
用いられる。例えば、Broach,J.R.,Meth.Enz.（1983）1
01:307の２μの複製起点、あるいは酵母適合の他の複製
起点（例えば、Stinchcombら、Nature（1979）282:39、
Tschumper,G.ら、Gene（1980）10:157およびClarke,L.
ら、Meth.Enz.（1983）101:300を参照）を含んだベクタ
ーが使用し得る。酵母ベクターの制御配列には、解糖系
酵素の合成のプロモーターが含まれる（Hessら、J.Adv.
Enzyme Req.（1968）７:149;Holl andら、Biochemistry
（1978）17:4900）。当分野に公知の他のプロモーター
には、３−ホスホグリセレートキナーゼのプロモーター
が含まれる（Hitzemanら、J.Biol Chem.（1980）255:20
73）。さらに、増殖条件および／または遺伝的背景によ
って制御される転写の利点を有する他のプロモーター
は、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクローム
Ｃ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝関連の分解酵素、α
ファクター系、およびマルトースおよびガラクトースの
利用に関する酵素のプロモーター領域である。ターミネ
ーター配列は、コード配列の3'末端にあることが望まし
い。このようなターミネーターは、酵母由来の遺伝子の
コード配列の後の3'非翻訳領域に見い出される。
もちろん、多細胞生物由来の真核宿主細胞培養物中の
ポリペプチドをコードする遺伝子を発現させることもま
た、可能である。例えば、Axelら、4,399,216を参照さ
れたい。これらのシステムは、イントロンをスプライス
して除く能力という付加的な利点があるため、ゲノムフ
ラグメントを直接発現させるのに用いられ得る。これら
のシステムにおいてはまた、ある種の天然のタンパク質
において生じるのと類似した翻訳後修飾が行われ得る。
有用な宿主細胞系にはVEROおよびHeLa細胞、およびチャ
イニーズハムスター卵巣（CHO）細胞が包含される。そ
のような細胞の発現ベクターは、通常、哺乳類細胞に適
合するプロモーターおよび制御配列を有する。それらに
は、例えば、一般に使用されているシミアンウイルス40
（SV40）由来の初期および後期プロモーター（Fiersら,
Nature（1978）273:113）あるいは例えばポリオーマ、
アデノウイルス２、ウシパピローマウイルス、またはト
リ肉腫ウイルス由来の他のウイルスプロモーターがあ
る。制御可能なプロモーターであるhMT−II A（Karin,
M.ら,Nature（1982）299:797−802）もまた使用され得
る。哺乳類細胞宿主システムの形質転換の一般的な状況
はAxel（前出）に記載されている。「エンハンサー」領
域もまた、発現を最適化するのに重要であることは明か
である。これは一般に非コードDNA領域においてプロモ
ーター領域の上流または下流に見出される配列である。
必要に応じて、ウイルス源から複製の起点が得られう
る。しかし、真核生物でのDNA複製においては、染色体
への組み込みは一般的なメカニズムである。
形質転換 使用する宿主細胞に依存して、そのような細胞に適切
な標準的手法を用い、形質転換が行われる。原核生物あ
るいは実質的に細胞壁バリアーを有する他の細胞には、
塩化カルシウムを用いたカルシウム処理［Cohen,S.N.PN
AS（1972）69:2110に記載］あるいはRbCl2法［Maniatis
ら,Molecular Cloning:A Laboratory Manual（1982）Co
ld Spring Harbor Press,p.254およびHanahan,D.,J.Mo
l.Biol.（1983）166:577−580に記載］が使用され得
る。そのような細胞壁を持たない哺乳類細胞について
は、リン酸カルシウム沈澱法［Grahamおよびvan der E
b,Virology（1978）52:546;必要に応じてWigler,M.ら,C
ell（1979）16:777−785のように改変される］が用いら
れ得る。酵母への形質転換は、Beggs,J.D.,Nature（197
8）275:104−109またはHinnen,A.ら.,PNAS（1978）75:1
929の方法により行われ得る。
ベクターの構築 ここで提供されるDNA配列の発現のための所望のコー
ドエレメントおよび制御エレメントを含む適切なベクタ
ーの構築には、当該技術分野で充分に理解されている標
準的な連結および制御酵素による手法が採用される。単
離されたプラスミド、DNA配列または合成されたオリゴ
ヌクレオチドを、開裂させ、整え、そして所望の形に再
連結させる。
ベクターを形成するDNA配列は、多くのソースから入
手可能である。バックボーンのベクターおよび制御シス
テムは、通常、構築における配列の大部分として用いら
れる利用可能な「宿主」ベクターに見い出される。典型
的な配列は上記のHosts and Control Sequencesに述べ
られている。適切なコード配列については、構築の最初
の工程は、cDNAまたはゲノムDNAライブラリーから適切
な配列を回収することであり得、通常そうである。しか
し、ひとたびその配列が開示されれば、遺伝子配列の全
体を、個々のヌクレオチド誘導体からインビトロで合成
することが可能である。かなり長い遺伝子の全体の配
列、例えば500−1000bpは、オーバーラップする相補的
な個々のヌクレオチドを合成し、そして、デオキシリボ
ヌクレオチド三リン酸の存在下でDNAポリメラーゼを用
いて一本鎖のオーバーラップしない部分を埋めることに
より、調製され得る。このアプローチは、既知の配列の
いくつかの遺伝子の構築に成功裏に用いられている。例
えば、Edge,M.D.,Nature（1981）292:756;Nambair,K.P.
ら,Science（1984）223:1299;Jay,Ernest,J.Biol.Chem.
（1984）259:6311を参照されたい。
合成オリゴヌクレオチドは、ホスホトリエステル法
［Edgeら,Nature（前出）およびDuckworthら,Nucleic A
cids Res.（1981）９:1691に記載］またはホスホルアミ
ダイト法［Beaucage,S.L.,およびCaruthers,M.H.Tet.Le
tts.（1981）22:1859およびMatteucci,M.D.,およびCaru
thers,M.H.,J.Am.Chem.Soc.（1981）103:3185に記載］
により調製され、そして、市販の自動オリゴヌクレオチ
ド合成装置により調製され得る。アニーリングに先立つ
一本鎖のリン酸化または標識のためのリン酸化は、１ナ
ノモルの基質に対して過剰量（例えば約10ユニット）の
ポリヌクレオチドキナーゼを用い、50mM Tris,pH7.6,10
mM MgCl2,5mMジチオスレイトール,1−2mM ATP,1.7ピコ
モル γ−32P−ATP（2.9mCi/mmole）,0.1mMスペルミジ
ン,0.1mM EDTAの存在下で達成される。
所望のベクターの成分がひとたびこのようにして利用
可能となれば、それらは、標準的な制限切断および連結
の方法を用いて切断および連結され得る。
部位特異的なDNAの切断は、当該技術分野で一般に理
解されている条件下で、適当な制限酵素（または酵素）
で処理することにより達成され、そして、その詳細は、
これらの市販の制限酵素の製造者により規定されてい
る。例えば、New England Biolabsの製品カタログを参
照されたい。通常、約１μｇのプラスミドまたはDNA配
列は、バッファー溶液約20μ中の１ユニットの酵素で切
断される。ここでの実施例においては、典型的には、DN
A基質の消化を完全にするために過剰の制限酵素が用い
られる。実施可能なインキュベートの時間は約37℃にお
いて約１時間から２時間であるが、それは変更され得
る。インキュベートの後、タンパク質は、フェノール／
クロロホルムによる抽出によって除去され、そしてその
後にエーテル抽出し得、そして核酸は、エタノール沈澱
により水性フラクションから回収される。必要であれ
ば、標準法を用いたポリアクリルアミドゲルまたはアガ
ロースゲル電気泳動による、切断されたフラグメントの
サイズ分離がなされ得る。サイズ分離の一般的な記載
は、Methods in Enzymology（1980）65:499−560に見い
出される。
制限切断フラグメントは、次の条件で平滑末端とされ
得る。つまり、４種のデオキシヌクレオチド三リン酸
（dNTP）の存在下でE.coli DNAポリメラーゼＩのラージ
フラグメント（クレノウ）で、50mM Tris pH7.6,50mM N
aCl,6mM MgCl2,6mM DTTおよび0.1−1.0mM dNTP中におい
て20から25℃で約15から25分間インキュベートして処理
することにより、平滑末端とされ得る。クレノウフラグ
メントは、5'の一本鎖のオーバーハングを埋めるが、４
種のdTNPが存在しているときにも突出している3'の一本
鎖を削っていく。必要に応じて、オーバーハングの性質
により指示される制限の範囲内において、dNTPのうちの
ただ１種、または選択されたdNTPを供給することによ
り、選択的修復がなされ得る。クレノウ処理した後、混
合物をフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノール
沈澱させる。S1ヌクレアーゼまたはBAL−31を用いた適
当な条件での処理により、一本鎖部分のいずれもが加水
分解される。
連結は、次の標準条件および温度で、15−50μｌの容
量でなされ得る。例えば、60mM Tris−Cl pH7.5,16mM M
gCl2,10mM DTT,33μg/ml BSA、および０℃にて40μM AT
P 0.01−0.02（Weiss）ユニットのT4DNAリガーゼ（「粘
着末端」の連結用）、または14℃にて1mM ATP,0.3−0.6
（Weiss）ユニットのT4 DNAレガーゼ（「平滑末端」の
連結用）の条件および温度でなされ得る。分子間の「粘
着末端」の連結は、通常、DNAの総濃度が33−100μg/ml
（最終総濃度５−100nM）で、達成される。分子間の平
滑末端の連結は、最終総濃度１μＭにて達成される。
「ベクターフラグメント」を用いるベクターの構築に
おいては、該ベクターフラグメントは、5'リン酸を除去
し該ベクターの自己連結を阻止するために通常、細菌ア
ルカリホスファターゼ（BAP）または仔ウシ腸アルカリ
ホスファターゼ（CIP）により処理される。消化は、１
μｇのベクターあたり１ユニットのBAPを用い、pH8で約
10mM Tris−HCl,1mM EDTA中、60℃にて約１時間；ある
いは、50mM Tris−HCl（pH9.0）,1mM MgCl2,0.1mM ZnCl
2,1mMスペルミジン、１ユニットのCIP中、37℃にて60分
間（5'末端突出用）または、37℃にて15分間、次いで56
℃にて15分間（平滑末端または凹部5'末端用）、なされ
る。核酸フラグメントを回収するために、調製物は、フ
ェノール／クロロホルムで抽出され、エタノール沈澱が
なされる。あるいは、２回消化されたベクターにおい
て、さらに制限酵素による消化を行い、所望でないフラ
グメントを分離することにより、該ベクターの再結合が
阻止され得る。
配列の改変を必要とする、ベクターのcDNAあるいはゲ
ノムDNA由来の部分には、部位特異的プライマー変異導
入が用いられる（Zoller,M.J.およびSmith,M.のNucleic
Acids Res.（1982）10:6487−6500およびAdelman,J.P.
らのDNA（1983）２:183−193）。これは、所望の変異を
表す限局された変異以外は変異させる一本鎖ファージDN
Aに相補的な、合成オリゴヌクレオチドプライマーを用
いて行った。簡単に説明すると、合成オリゴヌクレオチ
ドはファージに相補的なDNA鎖の合成を開始させるプラ
イマーとして使用され、得られた部分的あるいは全長の
二本鎖DNAでファージを養っている宿主細菌を形質転換
する。形質転換された細菌の培養物を上部寒天に蒔き、
ファージを有する単一の細胞からプラークを形成させ
る。
理論的には、新しいプラークの50％は、変異した一本
鎖を有するファージを持ち、50％は元の配列を有する。
得られたプラークのニトロセルロース上のプラークリフ
トを、キナーゼ処理した合成プライマーとハイブリダイ
ズさせた後、正確にマッチするものは結合させるが、元
のストランドとマッチしないものは結合させないのに充
分な洗浄温度で洗浄する。次に、プローブとハイブリダ
イズするプラークを取り出し、培養し、そしてDNAを回
収する。
構築の確認 以下に述べる構築では、プラスミド構築のためのライ
ゲーションが正しく行われていることを、M.Casadaban
博士より得たE.coli株MC1061（Casadaban,M.ら、J.Mol.
Biol.（1980）138:179−207）、あるいは他の適切な宿
主を先ずライゲーション反応混合物で形質転換すること
によって確認する。成功した形質転換体を、当該分野で
知られているように、プラスミド構築の形態によって、
アンピシリン、テトラサイクリン、あるいは他の抗生物
質への耐性によって、あるいは他のマーカーを用いて選
択する。次に、Clewell,D.B.ら、PNAS（1969）62:1159
の方法に準じて、必要に応じてクロラムフェニコールで
の増幅（Clewell,D.B.、J.Bacterial.（1972）110:66
7）後、形質転換体からプラスミドを調製する。通常、
例えば、Holmes,D.S.ら、Anal.Biochem.（1981）114:19
3−197およびBirnboim,H.C.ら、Nucleic Acids Res.（1
979）７:1513−1523のようにいくつかのミニDNAプレッ
プが使用される。単離されたDNAを制限酵素によって分
析し、および／あるいは、Sanger,F.ら、PNAS（1977）7
4:5463の方法であり、さらにMessingらのNucleic Acids
Res.（1981）９:309に記載のジデオキシヌクレオチド
法、あるいはMaxamらのMethods in Enzymology（1980）
65:499の方法により配列決定される。
実施例の宿主 本明細書中のクローニングおよび原核細胞での発現に
使用される宿主は次のものである： クローニングおよびシーケンシング、およびほとんど
の細菌のプロモーター制御下での構築物の発現には、
Ｂ、MC1061、DH1、RR1、C600hfl-、K803、HB101、JA22
1、JM101およびJM103のようなE.coliの株を使用した。
方法の説明 次の実施例は、本発明をより良く理解するために説明
することを目的とする。しかし、実施例は、本発明の範
囲をいかなる場合にも限定することを意図しない。血管
内皮細胞増殖因子をコードするDNAは、濾胞星状細胞ポ
リ（Ａ）+RNAの調製物中の所望の配列を増幅して、重要
なプローブを先ず取ることから最初は得られる。しか
し、この方法を繰り返すことは必ずしも必要ではない。
なぜならば、重要なプローブの配列は、現在では知られ
ており、化学的にインビトロで構築し得るからである。
さらに、図3aに示す配列を有するプラスミドが、アメリ
カンタイプカルチャーコレクション（American Type Cu
lture Collection）、Rockville,MDに寄託されている。
次の実施例では、以下に記載のバッファーは、示され
ている組成物を含有する： 実施例１ 濾胞星状細胞mRNAからのプローブの増幅 図２を参照して、ウシ濾胞星状細胞（細胞は、Ferrar
a,N.らのMethods in Enzymoloby,Conn,P.M.編、Vol.12
4,pp 245−253,Academic Press,N.Y.（1986）;Ferrara,
N.ら、（1987）PNAS,84:5773−5777に記載のように単離
した）の５μｇのポリ（Ａ）+RNAを、ウシ血管内皮細胞
増殖因子の既知のアミノ酸35位から39位の配列に基づく
１μｇのアンチセンスプライマーオリゴヌクレオチドと
ともに、エタノール沈澱した。＃4296と命名したこのオ
リゴヌクレオチドは、16倍の縮重（degeneracy）を有す
る24−merである。縮重は、アミノ酸35位から39位をコ
ードするアンチセンスストランドに相当する14塩基の領
域に限定された。14塩基の5'側末端に、EcoR I制限部位
を有する10塩基のリンカーを加えた。オリゴヌクレオチ
ドプライマーの配列は以下の通りである： mRNAおよびオリゴヌクレオチドを、55μｌの36mM KCl、
9mM MgCl2、45mM Tris pH7.5、12単位のRNasinおよび各
々0.5mMの４つのdNTPに溶解した。サンプルを70℃まで
２分間加熱し、次いで室温に戻した。プライマーのハイ
ブリダイゼーション部位に隣接するmRNAの一部に相補的
なDNAアンチセンスストランドの合成のために、60単位
のトリ骨髄芽球症ウイルス（avian myeloblastosis vir
us）の逆転写酵素を加え、次いで室温で２分間反応さ
せ、そして42℃に45分間置いた。次にサンプルをフェノ
ールおよびクロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱さ
せて乾燥させた。
次に、最初に合成したストランドの全てを鋳型として
使用して、第二のDNAストランドを合成した。第二のス
トランドの合成のために、乾燥したペレットを50μｌの
50mM NaCl、7mM MgCl2、7mM Tris pH7.5および各々1mM
の４つのdNTPに溶解した。さらに、ウシ血管内皮細胞増
殖因子の既知のアミノ酸の15位から19位の配列に基づ
く、センスストランドオリゴヌクレオチドプライマー１
μｇを加えた。＃4295と命名されたオリゴヌクレオチド
は、８倍の縮重を有する24−merであった。縮重は、ア
ミノ酸の15位から19位のコード領域のセンスストランド
に相当する14塩基の領域に限定された。これらの14塩基
の5'側末端に、Hind III制限部位を有する10塩基のリン
カーを加えた。オリゴヌクレオチドプライマーの配列は
以下の通りである： サンプルを100℃に２分間加熱し、次いで28℃に戻し
た。第二ストランドの合成は、10単位のDNAポリメラー
ゼ、すなわちクレノウフラグメントを加えて、28℃で10
分間行われた。その後、ポリメラーゼ酵素を100℃で２
分間加熱して不活化した。
２つのプライマーのハイブリダイゼーション部位の間
にわたるDNA配列を、自動サーマルサイクラー（Perkin
Elmer Cetus DNA Thermal Cycler）での酵素触媒による
重合反応の一連の繰り返しにより増幅した。チェーン反
応には、５μｌの上述の反応物を、1xの反応混合物に、
10μｌの10x Taq混合バッファー（Cetus Corp.のポリメ
ラーゼチェーンリアクションキット中に供給されてい
る）、52μl dH2Oおよび４つのdNTPすべてを1.25mMずつ
含有する16μｌを加えて100μｌとした。さらに、10％
（最終濃度）のDMSO、および上述の１μｇの各センスオ
リゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドを、Cetus Kitに入っているTaqポリメラーゼ２μｌと
ともに加えた。反応混合物に200μｌのミネラルオイル
を重層し、そしてサーマルサイクラーに入れた。サイク
ラーを次のサイクルを繰り返すようにプログラムした： 1. 94℃で１分間、変性 2. 55℃で２分間、アニール 3. 72℃で3.5分間、DNA合成 増幅反応は、30サイクル行った。
増幅反応物のDNAの一部（20μｌ）を、Hae IIIで消化
したpUC8 DNAをサイズマーカーに用いて、６％のポリア
クリルアミドゲル電気泳動にかけた。ゲルを臭化エチジ
ウムで染色した。染色したゲルを図５に示す。主要なバ
ンド（図５で、矢印で指す）は、80と100塩基対との間
の塩基対であり、２つのオリゴヌクレオチドプライマー
および２つのプライマーに囲まれたアミノ酸コード領域
のセグメントをコードするのに適切な長さのDNA（94塩
基対）に相当した。このバンドをゲルから切り出し、ゲ
ル片からDNAを、0.5x Tris−ホウ酸EDTAバッファー（0.
045M Tris base、0.045Mホウ酸、0.001M EDTA）中で30
ボルトで電気溶出した。得られたDNAをエタノールで沈
澱させた。
実施例２ 増幅したプローブのサブクローニングおよび配列決定 実施例１に記載のようにゲルから電気溶出したDNA
を、バクテリオファージM13mp18およびM13mp19中にサブ
クローニングした。ゲルから得られたDNAの半分を、20
μｌの水に溶解し、Hind III消化の標準的バッファー中
で、Hind IIIで90分間、37℃で消化した。反応液のTris
−HCl（pH7.5）の濃度を85mMに上げてEcoR Iを加え、反
応液をさらに37℃で90分間インキュベートした。別の反
応では、次に反応当り約10分の１の消化した調製物を、
T4 DNAリガーゼの存在下で、Hind IIIおよびEcoR Iで消
化したM13mp18ファージおよびM13mp19ファージの２本鎖
DNA（Yanisch−Perronら、Gene（1985）33:103）とライ
ゲートした。次に、標準の方法を用いて各々のライゲー
ション反応混合物でE.coli JM103をトランスフェクト
し、そして５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−
β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−gal）およびイソプ
ロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（IPTG）を含
有するＬプレート上に蒔いた。M13mp19との反応の場合
には、プレートにプラークが形成された後、プラークの
一部をニトロセルロースフィルターペーパーに移し、標
準の方法でNaOHで処理して溶菌し、そして80℃で２時
間、バキュームオーブン中で焼き付けた。所望の挿入配
列の存在をスクリーニングするために、プラークリフト
を放射標識したオリゴヌクレオチドプライマー＃4296の
サンプルでプローブした。プローブ＃4296は、プラーク
リフトの多くのプラークとハイブリダイズし、そのうち
の４つをさらなる分析のために選んだ。M13mp18との反
応の場合には、白いプラークが、挿入フラグメントがフ
ァージベクターのEcoR IおよびHind III部位との間にラ
イゲートされたことを示すことに基づいて、さらなる分
析のために４つのプラークを拾い上げた。
M13mp18およびM13mp19で感染させたプレートの各々か
ら拾い上げた４つのプラークをJM103に感染させ、標準
の方法を用いて感染した培養物から複製型（RF）DNAを
調製した。次に、各感染物からのRF DNAを、Hae IIIで
切断し、ポリアクリルアミドゲルに流した。電気泳動
は、サイズマーカーにHae IIIで切断したpUC8およびHae
IIIで切断したM13mp18 RFを用いて、行った。臭化エチ
ジウムで染色後、８つのサンプルのレーン全てのDNA
は、ポリメラーゼチェーンリアクションで用いるプライ
マーの設計に使用されたアミノ酸配列を含む、その２つ
のアミノ酸配列の間にあるアミノ酸配列をコードする正
しいサイズの挿入物を有することが示された。
正しい長さの挿入配列を有することを示したM13mp19
プラークの１つ、および４つのM13mp18プラークをさら
なる分析のために、拾い上げた。次に一本鎖DNAを、配
列決定のために、標準の方法（Messing,J.,Methods in
Enzymology（1983）101:20−78）で調製した。５つの単
離したクローン中の挿入配列を図１に示す。４つのM13m
p18クローンのシーケンシングゲルの１つの領域（図１
のヌクレオチド32−35）は、明確に解読し得なかった。
M13mp18の配列の解読できない領域を除いて、５つの配
列決定したクローンのうちの４つは、ポリメラーゼチェ
ーンリアクションで使用した２つのプライマー配列がハ
イブリダイズする部位およびその間にあるmRNAの領域に
コードされる、ウシ血管内皮細胞増殖因子のその部分に
相当する同じアミノ酸配列をコードしていた。５つ目の
配列決定したクローンは、コードするアミノ酸の１つが
異なり、それは、ウシ血管内皮細胞増殖因子のアミノ酸
27位に相当し、Pro（CCC）ではなくHis（CAC）をコード
する。図１は、５つのクローンの挿入物のDNA配列およ
び、M13mp19クローン挿入物のコンセンサスDNA配列およ
び推定アミノ酸配列を示す。５つの単離された配列のほ
とんどの非相同ヌクレオチドは、ポリメラーゼチェーン
リアクションに使用したプライマー配列にあり、これ
は、場合によっては、ヌクレオチドミスマッチを１つ有
するプライマーの縮重オリゴヌクレオチドが、血管内皮
細胞mRNA中のタンパク質をコードする配列にハイブリダ
イズして、そして増幅されたことを示すことがわかる。
他の配列の違いは、たぶん、ポリメラーゼのエラーか、
あるいは血管内皮細胞増殖因子mRNAの多型性であろう。
これらの配列は、天然のDNA配列に正確には対応しない
が、それにもかかわらず、５つのうちの４つは血管内皮
細胞増殖因子の正しいアミノ酸配列（M13mp18クローン
の解読できない領域を除いて）をコードする。さらに、
それらは、ウシ血管内皮細胞増殖因子の全長DNA配列の
単離あるいはウシ以外の種のこれに相当するタンパク質
をコードするDNAの単離のためのプローブとして使用し
得る。増幅されたDNAが、M13mp19にライゲートされてい
る、拾い上げたファージを、pET−19Aと命名しなおし
た；以下の実施例３に述べるように、このファージに挿
入されたフラグメントを、濾胞星状細胞cDNAライブラリ
ーをスクリーニングするプローブとして使用した。
実施例３ ウシ血管内皮細胞増殖因子（120個のアミノ酸の形態）
をコードするcDNAの回収 Huynhら、DNA Cloning,D.M.Glover編、Vol.I,p.49,IR
L Press,Washington,D.C.（1985）の方法の改変法でウ
シ濾胞星状細胞cDNAライブラリーを、λgt10バクテリオ
ファージ中に調製した。ライブラリーのcDNAを作るのに
使用するポリ（Ａ）+RNAは、公表されている方法（Ferr
araら、PNAS（1987）84:5773−5777）によって、Denis
Gospodarowicz博士によりウシ下垂体から単離され、増
殖された濾胞星状細胞から得た。λgt10中のcDNAライブ
ラリー（約1.5 x 106ファージ）をC600fhl-細胞に蒔い
た（プレート30枚、5 x 104ファージ／プレート）。各
々のプレートのプラークリフトを２つ、ニトロセルロー
スフィルターペーパー上に取った。フィルターを変性溶
液（0.2M NaOH,1.5M NaCl）に３分間浸した後、中和溶
液（2 x SSC,0.4M Tris pH7.5）に３分間浸し、そして
洗浄溶液（2 x SSC）に３分間浸した。次にフィルター
を風乾し、そしてバキュームオーブン中80℃で２時間焼
き付けた。１セットのフィルターを200mlの40％ホルム
アミドバッファー中42℃で、プレハイブリダイズさせ
た。
フィルターのスクリーニング用プローブを調製するた
めに、一本鎖調製物を、上述の実施例２に記載のM13mp1
9由来のファージpET−19Aから、標準法（Messing,J.,Me
thods Enzymol.（1983）101:20−78）を用いて作製し
た。この調製物を、「ユニバーサル」プライマー（Mess
ing,J.,Methods Enzymol.（1983）101:20−78）とハイ
ブリダイズさせ、そしてpET−19Aに相補的なストランド
を、クレノウフラグメントポリメラーゼおよびα32P−d
NTPsを用いてプライマーを伸長させることにより、合成
した。
プラークリフトの１セットを、この放射標識したプロ
ーブでスクリーニングした。プローブを100℃で２分間
加熱して２本鎖DNAを融解させ、そして氷上に放置し
た。次にこのプローブ（1ml;5 x 108cpm）を、プレハイ
ブリダイゼーションに使用した40％ホルムアミドバッフ
ァー200mlに加え、完全に混合した。プレハイブリダイ
ズさせたフィルターを加え、そして42℃の湯浴中揺らし
がら一晩インキュベートした。次にフィルターを、0.1
％SDSを含む1x SSC（20x SSCは、3M NaCl、0.3Mクエン
酸ナトリウムに相当する）で、50℃で数時間洗浄した。
洗浄後、フィルターを−70℃から−80℃でＸ線フィルム
に一晩露出した。
約32個のポジティブと推定されるクローンを、最初の
pET−19A由来の、プライマーから伸長させたプローブと
のスクリーニングで同定した。1c−10cと同定された10
個のクローンをさらなるスクリーニングのために選ん
だ。
プラークリフトの２つ目のセットを、図１に示すpET
−19Aの増幅したDNA挿入物の配列に基づいてデザインし
た、合成オリゴヌクレオチド放射標識プローブでスクリ
ーニングした。プローブ＃4340と同定されたオリゴヌク
レオチドは、アンチセンスストランドに相当し、次のヌ
クレオチド配列： を有する39−merのオリゴヌクレオチドであった。フィ
ルターを、100mlのLong Oligoプレハイブリダイゼーシ
ョンバッファーで約６時間、43℃でプレハイブリダイズ
させた。次に、プレハイブリダイゼーションバッファー
中のフィルターを湯浴中65℃で10分間加熱した。γ−32
P−ATPおよびポリヌクレオチドキナーゼを用いて放射標
識したプローブ（5 x 108cpm）を65℃のバッファーに加
え、水浴の加熱を止めて温度をゆっくりと室温まで下げ
た。翌日、フィルターをハイブリダイゼーションバッフ
ァーから取り出し、45℃で２時間洗浄（3 x SSC、0.1％
SDS中で６〜）した。洗浄液は１時間目で交換した。フ
ィルターを乾燥させ、そして−70℃から−80℃でＸ線フ
ィルムに一晩露出した。
プローブ＃4340にハイブリダイズするクローンのう
ち、１つのクローンのみが、pET−19Aにハイブリダイズ
した最初のセットのフィルターからの32クローンのうち
の１つに相当するようであった。このクローンは、さら
なる分析のために拾い上げた元の10個のうちの１つでは
なかった。従って、このクローンを拾い上げ、クローン
11cと命名した。＃4340にプロービングさせたフィルタ
ーを、よりストリンジェントな条件（1 x SSC,0.1％SD
S,65℃）で再度洗浄した。それにより、ポジティブと推
定されるクローンの数は、pET−19Aにハイブリダイズし
たクローン11cを含めて約６個に減った。
拾い上げたクローン2c−11cを第二ラウンドのスクリ
ーニング用に平板培養した。クローンを「拾い上げる」
ために、寒天プレートの適当な部分から各々のクローン
寒天片を取り出した。すなわちファルコンの12 x 75mm
滅菌チューブの口を、プレートから移されたフィルター
上のポジティブシグナルに相当する、プレートの所望の
部分に当てて、寒天をつきぬけるように押し下げ、切り
取られた寒天片を滅菌したへらで拾い上げて取った。次
に各々の寒天片を1mlのSMバッファー（100mM NaCl;8mM
MgSO4;50mM Tris pH7.5;0.01％ゼラチン）中に入れ、ボ
ルテックスで混ぜ、そして約20分間室温において、ファ
ージを寒天から浸出させた。拾い上げたクローンから得
られた懸濁液各々の１μｌを1mlのSMバッファー（1:100
0希釈）に懸濁させた。次に、ファージの1:1000希釈物
各々の10μｌを、590−600μｌの培養用細胞（C600hf
l-）が入っているファルコンの75 x 100mmチューブに移
し、次いで、10μｌをこのチューブから、590−600μｌ
の培養用細胞が入っている第二のチューブに移し、さら
に第二のチューブから第三のチューブに移して段階希釈
した。ファージを37℃で20分間吸着させ、そして各チュ
ーブのファージ/C600hfl-混合物を、150mmmの平板寒天
培地に約10mlの上層アガロースとともに蒔いた。この平
板培地を一晩、37℃でインキュベートした。１平板培地
当り約5000個のファージを有する平板培地を、ニトロセ
ルロースフィルターペーパー上にプラークリフトを取る
のに使用した。次に、フィルター上のDNAを、上述の最
初のcDNAライブラリーの一次スクリーニングでのプラー
クリフトと同じ様式でフィルターをNaOHで処理すること
により、変性させた。焼き付けた後、フィルターを、42
℃の湯浴中で揺らしながら２時間、密封できるプラスチ
ックバッグ（１つのバッグ当り３個のフィルター）中の
10mlの50％ホルムアミドバッファーに浸してプレハイブ
リダイズさせた。
これらのフィルターをスクリーニングするためのプロ
ーブを調製するために、二本鎖（複製型）の調製物をM1
3mp19由来のファージpET−19Aから作成した。この調製
物をEcoR IおよびHind IIIで消化し、そして増幅された
DNAセグメントを示す82塩基対の挿入フラグメントをゲ
ル電気泳動により単離し、次いでクレノーフラグメント
ポリメラーゼおよびα32P−dNTPで一本鎖の末端を満た
すことにより標識した。このプローブを２分間煮沸し、
二本鎖DNAを融解し、氷上で冷却し、次いでフィルター
を浸漬するプレハイブリダイゼーションバッファーに加
えた。このフィルターを振盪水槽中で42℃で一晩インキ
ュベートし、そして50℃で１〜1/2時間、0.1×SSC、0.1
％SDS洗浄バッファー中で２回バッファー交換すること
により洗浄した。このフィルターを−70℃から−80℃で
一晩、Ｘ線フィルムに曝した。
クローン11cの再プレートを示すプレート上の３個の
ポジティブクローンは、pET−19A由来の82塩基対の挿入
フラグメントにハイブリダイズした。さらに、クローン
7cの再プレートを示すプレート上に１個の問題となるポ
ジティブクローンがあると考えられた。これら４個のポ
ジティブクローンをパスツールピペットの広い方の末端
部を用いて寒天プレートから切取り、プレートする細胞
中に希釈し、そして前記のものと同様の方法で３回目の
スクリーニングのために再びプレートした。２回目のス
クリーニングにおいてクローン11cを示すプレート上で
３個のポジティブクローンの３回目のスクリーニングの
ために製造された３個のプレートを11A、11Bおよび11C
と名付けた。上記のように、２つのプラークリフトをニ
トロセルロースフィルターペーパー上に各プレートから
調製した。このフィルター上のDNAを、上記と同様の方
法を用いて、変性し、そして焼き付けた。プラークリフ
トの第一のセットを放射標識されたプローブ＃4340（前
に記載された）でスクリーニングし、そしてプラークリ
フトの第二のセットをpET−19Aの82塩基対挿入物から調
製された前述のプローブでスクリーニングした。
フィルターの第一のセットを、室温で、ショートオリ
ゴプレハイブリダイゼーションバッファー7mlを含有す
るプラスチックバッグ中に浸漬することによりプレハイ
ブリダイズした。放射標識されたプローブ＃4340をこれ
らのフィルターを含有するプレハイブリダイゼーション
バッファーに加えた。このバッグを数分間65℃の振盪水
槽セット中に据えることにより温度を65℃にした。次い
で、この水浴の加熱を止め、温度を緩やかに室温まで戻
した。インキュベーションを室温で約２〜1/2日間続け
た。
このフィルターの第二のセットを50％ホルムアミドバ
ッファー10mlを含有するプラスチックバッグ中に浸漬
し、そして42℃でインキュベーションして、プレハイブ
リダイズした。pET−19Aの82塩基対挿入物から調製され
たプローブを煮沸し、そしてフィルターの第二のセット
を含有するプレハイブリダイゼーションバッファーに直
接加えた。このハイブリダイゼーション反応液を約２〜
1/2日間42℃で振盪水槽中でインキュベートした。
プローブ＃4340とハイブリダイズしたフィルターのセ
ットを55℃で１×SSC、0.1％SDS中で洗浄した。pET−19
A由来のプローブでハイブリダイズされたフィルターの
セットを55℃で0.1×SSC、0.1％SDS中で洗浄した。フィ
ルターの両セットを３〜1/2時間Ｘ線フィルムに曝し
た。プレート11A、11Bおよび11C上の数個のプラーク
は、プローブ＃4340およびpET−19A由来の82塩基対挿入
物の両方に強くハイブリダイズした。いずれかのプロー
ブとハイブリダイズする２回目のスクリーニングのプレ
ート7cから取り出して希釈したものは、このプレート上
でプラークを表さなかった。プレート11Aからの２個の
強くハイブリダイズしたプラークをパスツールピペット
の細い方の末端を用いて取り出した。11A'および11B'と
名付けられたこれらのクローンをプレート細胞中で希釈
し、前記のように、４回目のスクリーニングとして再プ
レートした。
ポジティブクローン11A'および11B'から調製されたプ
レートのそれぞれから２個のプラークリフトをニトロセ
ルロースフィルターペーパー上に調製した。このフィル
ター上のDNAを上記のものと同様の方法を用いて変性
し、そして焼き付けた。フィルターの各セットをショー
トオリゴプレハイブリダイゼーションバッファー10mlを
含有するプラスチックバッグ中に浸漬することによりプ
レハイブリダイズし、そして室温でインキュベートし
た。プレート11A'および11B'のそれぞれ由来の第一のプ
ラークリフトを放射標識したプローブ＃4340（前で記載
された）でスクリーニングした。このプローブをこのフ
ィルターおよびプレハイブリダイゼーションバッファー
を含有するプラスチックバッグに加え、初めに65℃でイ
ンキュベートし、次いで、上記のように緩やかに冷却し
た。プレート11A'および11B'のそれぞれ由来の第二のプ
ラークリフトを、放射標識が48倍に縮重された混合オリ
ゴヌクレオチドプローブでスクリーニングした。プロー
ブはプローブ＃4255と名付けたが、それはウシの血管内
皮細胞増殖因子の内因性のトリプシン消化フラグメント
由来のアミノ酸に基づいており、そしてそれは以下の配
列を有する： このハイブリダイゼーションの条件は、プローブ＃4340
に対して記載されたものと同一であった。プレート11A'
および11B'由来のプラークリフトを１×SSC、0.1％SDS
で55℃で（＃4340）または３×SSC、0.1％SDSで30℃
で、次いで3Mテトラメチルアンモニウムクロライド（TM
AC1）、0.05Mトリス−塩酸、pH8.0、0.1％SDS、0.002M
EDTAで45℃で（＃4255）洗浄し、そしてフィルムに曝し
た。両プレート由来のプラークは、プローブ＃4340およ
びプローブ＃4255の両方にハイブリダイズするととも
に、それぞれのフィルター上の全てのプラークとハイブ
リダイズすることを見い出した。それにより、クローン
11A'および11B'が一本鎖の、純粋なクローンを構成する
という結論が下された。
クローン11B'のDNA挿入物の配列決定は、まずEcoR I
でファージDNAを消化し、６％ポリアクリルアミドゲル
上でその消化物を分画し、約800塩基対の挿入フラグメ
ントを電気溶出し、そしてEcoR I切断のM13mp18中にこ
のフラグメントを連結することによって行い、次いで、
標準的な方法を用いて、ジデオキシヌクレオチド法によ
ってこの挿入物の配列を決定した。このヌクレオチド配
列、およびコードされたアミノ酸配列は図3aにおいて示
されている（この図には、797個のヌクレオチド挿入物
の配列のうちの７番目から795番目のヌクレオチドのみ
が示されており；各末端のEcoR Iリンカー配列は、省略
している）。797個のヌクレオチドからなる挿入配列
は、ウシ血管内皮細胞増殖因子の既知のタンパク質配列
のアミノ酸番号15から始まる、既知のアミノ酸配列をコ
ードする。オープンリーディングフレームはヌクレオチ
ド327位のフレーム内の転写終止コドンまで伸びる。ク
ローン11B'の挿入配列をプラスミドpUC8のEcoR I部位に
連結した。得られたpST800と呼ばれるプラスミドは、E.
coli JM83宿主に入れてAmerican Type Culture Collect
ion,Rockville,MDに受託番号68060で寄託されている。
成熟型のウシ血管内皮細胞増殖因子をコードする全長
コード配列を、図3bの配列と共に図3aに示す。図3bの二
本鎖DNA配列は、5'末端近くに転写開始コドンATGを有
し、ヒト細胞の遺伝子発現で好ましく選択されるコドン
に基づき選ばれる配列を表しており、ウシタンパク質の
Ｎ末端表示部（開始メチオニン残基で先行される）をコ
ードし、図3aに示されたコード配列と重複している。成
熟型のウシ血管内皮細胞増殖因子をコードする全長コー
ド配列を作るために、図3bのDNA配列はオリゴヌクレオ
チド合成の周知の方法を用いて合成し得、そしてATCCに
寄託されたプラスミドから好都合に得られる図3aの配列
の部分に、酵素的に結合し得る。図3aおよび3bの配列を
結合する前に、図3aの配列をEcoR Iを用いてプラスミド
pST800から切り出し、単離した挿入物をNla I Vで消化
する。Nla I Vはこの挿入物を５回、全て3'非翻訳領域
内において切断する。次に、好都合な制限部位、例えば
Hind IIIをコードするリンカーを、ブラントエンド連結
を介して最も5'末端側のNla I V部位に結合させる。得
られたライゲーション反応混合物を、次にAcc Iおよび
リンカー酵素（例えばHind III）で消化し、3'末端（Nl
a I V部位に）連結されたリンカーの消化物の付いた、p
ST800挿入物の325塩基対フラグメント（Acc I−Nla I
V）を遊離させる。フラグメントを精製し、図3bに示す
合成フラグメントに連結する。ライゲーション混合物を
Nco Iおよびリンカー切断制限酵素（例えばHind IIIリ
ンカーを用いた場合にはHind III）で消化すると、5'側
には消化されたNco I部位が隣接し、また3'側にはフラ
グメントの発現ベクターへの挿入に有用な、消化された
制限酵素部位が隣接した、成熟型のウシ血管内皮細胞増
殖因子をコードする所望のコード配列が得られる。
この混成配列は適切な発現ベクターの、原核または真
核宿主内で発現を指示し得る調節エレメントの制御下に
挿入される。E.coliで発現に好適なベクターには、pKK2
33−２（AmmanおよびBrosius,Gene（1985）40:183−19
0）があり、これはPharmacia,Inc.から市販されてい
る。このベクターのNco IとHind III部位の間に混成配
列を挿入すると、コード配列はtrcプロモーターの制御
下に置かれる。次に発現ベクターはE.coliのような好適
な宿主の形質転換に用いられ、形質転換体はコードされ
たDNAが発現される条件下で培養される。次に、発現さ
れたタンパク質を当該分野に慣例の方法で回収する。
もちろん、他の配列が図3aの配列に結合可能である。
例えば、図3bの配列は、5'末端がNco I部位ではなくNde
I部位を表すように改変し得る。哺乳動物での発現に対
しては、図3bのコード配列を5'方向に延ばして、随意に
分泌シグナル配列、例えばヒト成長ホルモンのシグナル
配列に結合した、ウシ血管内皮細胞増殖因子のアミノ末
端配列をコードするようにし得る。
あるいは、図3aに示されたコード配列は、DNAハイブ
リダイゼーションの標準的条件下でプローブとして使用
し、ウシ血管内皮細胞増殖因子またはヒトを含む他の哺
乳動物種の相当するタンパク質をコードする、天然の全
長DNA配列を回収することができる。図3aの配列はcDNA
またはゲノムDNAライブラリーから所望の配列を回収す
るためのプローブとして使用し得る。
ウシ血管内皮細胞増殖因子mRNAの5'末端方向に伸長さ
れたクローンは、アンチセンスオリゴヌクレオチド4338
（5'−GCCAAGCTTGCACCAGGGTCTCGATGGGACGGCAGAA−3'）
をプライマーとして用いて、実施例１に記載のように第
一鎖cDNA合成をプライムし、次に得られた二重鎖の5'末
端に、オリゴヌクレオチド4537および4514（それぞれ5'
−GATCGCGG−3'および5'−CCGCGATCAAGCTTCCCGGGAATTCG
GC−3'）からなる部分二本鎖リンカー分子を連結して作
成した。最後に、生成物をオリゴヌクレオチド4338およ
び4315（5'−GCCGAATTCCCGGGAAGCTTGATCGCGG;4514に相
補的）をプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応
で増幅した。ジデオキシヌクレオチド法で配列決定した
ところ、得られたクローンから図６に示す5'配列を得
た。
実施例４ ウシ血管内皮細胞増殖因子（bVEGF164）をコードするcD
NAの回収 bVEGF120（図3a）以外のVEGF型を単離するために、卵
胞星状体（foliculo stellate）ポリ（Ａ）+RNAを鋳型
として用い、アンチセンスオリゴヌクレオチド4456（5'
−GTAGTTCTGTGTCAGTCTTTCCTGGTGAGACGTCTGGTTCCCGAAACC
CTGAGGGAGGCT−3'）をプライマーとして用いて、第一鎖
cDNA合成を行った。得られた生成物を次に、アンチセン
スオリゴヌクレオチド4456およびセンスオリゴヌクレオ
チド4414（5'−TTCTGCCGTCCCATCGAGACCCTGGTGGACATCTTC
CAGGAGTACCCAGATGAGATT−3'）をプライマーとして用い
てポリメラーゼ連鎖反応で30回増幅した。生成物のポリ
アクリルアミドゲル分析およびDNA配列決定により、図
６に示すように２種類の血管内皮細胞増殖因子をコード
するcDNAが明きらかになった。図６に示された、四角く
囲った132bpの挿入を含むオープンリーディングフレー
ムは、bVEGF164をコードする。
実施例５ ヒト血管内皮細胞増殖因子をコードするゲノムDNAの回
収 血管内皮細胞増殖因子のアミノ酸配列をコードするDN
Aを含有する、ヒトゲノムのクローンは、市販のヒト肺
線維芽細胞ゲノムライブラリー（Stratagene Inc.,La J
olla,CA）から単離した。１μｌのストックファージ
（約３×1010ファージ/ml）を1ml SMバッファーに希釈
し、20μｌのCHCl3を加えた。LE392細胞（hsdR514（r-,
m-）、supE44、supF58、lacY1またはΔ（lacIZY）６、g
alK2、galT22、metB1、trpR55、λ−）はNZYM培地でO.
D.600が0.5になるまで増殖させ、細胞を回収し、10mM M
gSO4に再懸濁した。30個の試験管の各々の中で、２μｌ
の希釈したファージストックを0.6mlの細胞に混合し、3
7℃で15分間インキュベートした。10mlのNZYMトップア
ガーを各試験管に加え、各試験管の内容物を150mm NZXY
Mプレートに撒き、37℃で16時間インキュベートした後
温度を４℃に下げた。30個のプレートの各々から、ニト
ロセルロースフィルター上に２枚のプラークリフトを移
した。フィルター上のDNAを変性させ、実施例３に記載
のように焼き付けた。次にフィルターを、37℃で６時
間、40％ホルムアミド緩衝液中でプレハイブリダイズさ
せた。
フィルターは、前述の実施例３で作成したプラスミド
であるプラスミドpST800からのゲル精製されたEcoR I挿
入フラグメントをニックトランスレーションして調製し
た、放射標識プローブでプロービングした。pST800の79
7塩基対のEcoR I挿入は、ウシ血管内皮細胞増殖因子の
一部分をコードするcDNAフラグメントを含有する。プロ
ーブは100℃で２分間煮沸して二本鎖DNAを融解した後、
氷冷した。プローブはフィルターを含むプレハイブリダ
イゼーション用バッファーに直接、106cpm/mlとなるよ
うに加え、フィルターを37℃で一晩、ハイブリダイズさ
せた。フィルターを50℃にて１×SSC、0.1％SDSで、洗
浄バッファーを３回替えて洗浄し、次に吸い取りにより
乾燥させ、Ｘ−線フィルムに−70℃から−80℃で一晩さ
らした。曝されたフィルムはプレート当り約200個の陽
性クローンを示し、そのうち19個のクローンは強い陽性
であることを特徴とした。
19個の強い陽性クローンのうち、12個を釣り上げ、前
述の実施例３に記載のように希釈し、再度プレートに撒
いて第二回目のスクリーニングを行った。再プレートし
たファージから、前述のように各々２枚のプラークリフ
トを調製した。フィルターを37℃で６時間、40％ホルム
アミドバッファーでプレハイブリダイズさせた。このフ
ィルターの１枚を第一回目のスクリーニングに用いたの
と同じプローブを用いて37℃で一晩、ハイブリダイズさ
せた。もう一枚のフィルターは、第一回目の釣り上げた
陽性クローンがプローブ配列のサブクローニングに用い
たベクター由来の配列とはハイブリダイズしないことを
確実にするために、ニックトランスレーション放射標識
pUC8とハイブリダイズさせた。フィルターを50℃にて１
×SSC、0.1％SDSで洗浄し、フィルムにさらした。この
第二回目のスクリーニングで、12個の再プレートしたク
ローンのうち６個が、pST800由来のプローブに対してま
だ陽性であり、pUC8プローブに対しては陽性ではなかっ
た。
第二回目のスクリーニングで陽性の６個のクローンの
各々から、陽性プラークを釣り上げた。６個の釣り上げ
たプラークを前述のように希釈し、再プレートとして第
三回目のスクリーニングを行った。さらに、第一回目の
スクリーニングで強い陽性であったが再スクリーニング
しなかった、７個のクローンを釣り上げ、再プレートし
て第二回目のスクリーニングを行った。再プレートした
クローンの各々から、前述のように２枚のプラークリフ
トを調製した。これらのフィルターを40％ホルムアミド
バッファー中で、37℃にて５時間、プレハイブリダイズ
させた。
第二回目のスクリーニングからの６個の陽性クローン
のうちの一枚のプラークリフトには、前述のpST800由来
の797−塩基対挿入をニックトランスレーションした106
cpm/mlを加えた。フィルターおよびプローブはプレハイ
ブリダイゼーション用バッファー中で37℃で一晩、ハイ
ブリダイズさせた。この６個の陽性クローンのうちのも
う１枚のプラークリフトには、前述のpST800の797塩基
対挿入のEcoR I−Hpa II断片をニックトランスレーショ
ン法で調製したプローブを加えた。EcoR I−Hpa II断片
は797塩基対の挿入の5'末端の331塩基対からなってお
り、従ってＡおよびＴのヌクレオチドに富んだ挿入の3'
末端を失っていて、これが初期の回のスクリーニングで
の間違ったハイブリダイズ陽性の原因であったかもしれ
ない。
第一回目の陽性クローンからの７個の再プレートされ
たプラークリフトの２枚には、797塩基対のプローブを
ニックトランスレーションした106cpm/mlを加えた。プ
ローブはプレハイブリダイゼーション用バッファー中で
37℃で一晩ハイブリダイズさせた。
全てのフィルターは50℃にて２時間、１×SSC、0.1％
SDSで、バッファーを２回替えて洗浄した。フィルター
を乾燥させ、Ｘ−線フィルムに−70℃から−80℃で３時
間さらした。第一回目の７個の陽性クローンのうち、第
二回目のスクリーニングで797塩基対プローブを用い
て、４個の陽性シグナルを得た。第二回目の６個の陽性
クローンのうち、第三回目のスクリーニングで797塩基
対プローブおよび331塩基対プローブを用いて、４個の
陽性シグナルを得た。
４個の第二回目の陽性クローンを釣り上げて、第三回
目のスクリーニングを行った。プラークリフトの一つは
放射標識した797塩基対のプローブでスクリーニング
し、もう一つのプラークリフトは前述のように放射標識
された331塩基対のプローブにハイブリダイズさせた。
４個の全てが両方のプローブにハイブリダイズすること
が見出された。
第三回目のスクリーニングで797塩基対および331塩基
対のプローブの両方にハイブリダイズした８個のクロー
ンを全て、単一のプラークとして釣り上げた。ファージ
DNA沈澱を標準法に従い調製した。次に、ファージのゲ
ノムDNAの挿入フラグメントを、配列決定のためにM13mp
18およびM13mp19ファージに移入し、これらがヒト血管
内皮細胞増殖因子をコードしていることを確かめた。ヒ
ト血管内皮細胞増殖因子をコードしているゲノムクロー
ンを含有する、バクテリオファージの一つは、American
Type Culture CollectionにATCC番号40636で寄託され
ている。
このクローンの配列解析から、成熟型のヒト血管内皮
細胞増殖因子をコードする配列、および成熟型タンパク
質の最初のアミノ酸からすぐ上流のシグナル配列のうち
４個のアミノ酸をコードする配列が判明した。このクロ
ーンに5'末端で重複する第二のゲノムクローンは、ヒト
血管内皮細胞増殖因子の残りの26個のアミノ酸のシグナ
ル配列をコードする、さらに上流の配列を与えた。シグ
ナル配列および5'非翻訳領域を含有する、第二のゲノム
クローンを得るために、オリゴヌクレオチド5'−CTCTCT
TGGGTACATTGGAGCCTTGCCTTGCTGCTCTACCTTCACCATGCCAAGを
用いてゲノムライブラリー（前述に同じ）をスクリーニ
ングした。このオリゴヌクレオチド配列は、PCRにより
生じたウシcDNAに由来する。約1.2×106個のファージを
スクリーニングした。各２枚のニトロセルロースフィル
ター上のプラークリフトをNaOH、中和、および６×SSC
バッファーでそれぞれ４分間処理した。空気乾燥の後、
バキュームオーブンで２時間、80℃で焼き付けた。プレ
ハイブリダイゼーションは短いオリゴのプレハイブリダ
イゼーション用バッファーを用いて、室温で６時間行っ
た。［32P］−標識したオリゴヌクレオチドの２×106cp
m/mlをフィルターに添加し、同じバッファー中で一晩、
室温でハイブリダイズさせた。フィルターを１×SSC、
0.1％SDSで、バッファーを２回替えて、50℃で２時間、
洗浄した。第一回目のスクリーニングで陽性クローンに
ついて、プラーク精製および再スクリーニングを行っ
た。１つの陽性クローンが得られた。
これらの２個のクローンから得られた混成ゲノム配列
を図８に示す。図は８個のエキソン（ローマ数字で示
す）を表し、これらは本来のシグナル配列と、異なるメ
ッセージのスプライシングの結果生じ得るヒト血管内皮
細胞増殖因子の全ての型とをコードする。完全なイント
ロン配列は示されておらず、各々のエキソンに隣接する
「接合部の」配列のみが呈示されている。エキソンが図
８に描かれているように、成熟型hVEGF121はエキソンII
−ＶおよびVIIIにコードされ；成熟型hVEGF165はエキソ
ンＩ−Ｖ、VIIおよびVIIIにコードされ；成熟型hVEGF
189はエキソンII−VIIIにコードされている。
実施例６ ヒト血管内皮細胞増殖因子をコードするcDNAの回収 血管内皮細胞増殖因子mRNAの細胞源 血管平滑筋細胞は、血管内皮細胞増殖因子タンパク質
をコードするmRNAを高レベルで産生し、そのために、血
管内皮細胞増殖因子配列に富んだcDNAライブラリー用の
mRNAの良い調製源である。ヒト胎児血管平滑筋（fhVS
M）細胞を、10％（v/v）ウシ胎児血清（HYCLONE）、2mM
のＬ−グルタミン、ml当り各100Uのペニシリンおよびス
トレプトマイシン、および組換え血管内皮細胞増殖因子
（1ng/mlの濃度で48時間毎に加える）、を補った、低グ
ルコースのダルベッコ改変イーグルス培地（DMEM−16、
GIBCO）中で培養した。細胞をコンフルエンスまで継代
し、典型的には25％コンフルーエンスで蒔き、再培養し
た。
ポリ（Ａ）+RNAの単離 血管平滑筋細胞mRNAを単離するために、典型的には、
細胞をコンフルーエンスまで生育させ、次いで血管内皮
細胞増殖因子mRNAの合成をさらに刺激するための、フォ
ルボールミリステートアセテート（PMA）処理を、行
う、あるいは行わなかった。細胞のモノレイヤーを、５
から20mlのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ−PB
S）で２回洗浄し、残存する培地を除去し、次いで、RNA
をChirgwinらの、Biochemistry（1979）18:5294−5299
の方法で単離した。この方法では、溶解バッファー（4.
0Mのグアニジンチオシアネート、0.1％のアンチフォー
ムＡ、25mMのクエン酸ナトリウム、0.5％のＮ−ラウロ
イルサルコシン、および100mMのβ−メルカプトエタノ
ール）の直接添加により、モノレイヤー中の細胞を溶解
する。注射針を通過させDNAを切断した後、酢酸および
エタノールの添加により、RNAを直接沈澱させる。沈澱
したRNAを、次にジエチルピロカーボネート（DEP）−処
理した脱イオン水（Ｄ−H2O、典型的には約400μｌ）に
再懸濁し、2.6mlのグアニジン−HClバッファー（7.5Mの
グアニジン、25mMのクエン酸ナトリウム、5mMのジチオ
スレイトール）を添加し、そして酢酸およびエタノール
の添加により、RNAを沈澱させる。沈澱させたRNAを、再
び400μｌのDEP−処理したｄ−H2Oに再懸濁し、そして
酢酸ナトリウムおよびエタノールの添加によりRNAを沈
澱させた。
グアニジン−チオシアネート法（上述）で単離した全
細胞RNAを、さらに、確立した方法（Edmonds,M.らの、P
NAS（1971）68:1336、Aviv,H.およびLeder,P.のPNAS（1
972）69:1408）によりオリゴｄ（Ｔ）−セルロースクロ
マトグラフィーで分画し、ポリ（Ａ）+RNAを単離した。
cDNA合成、および血管内皮細胞増殖因子cDNAのλZAPII
へのクローニング cDNA合成を、GublerおよびHoffmannの、方法（Gene,2
5:263−269）に従い、Boehringer−Mannheim Biochemic
alsから購入したcDNA合成キットを用い行った。この方
法を簡単に記載すると以下のようになる：第一鎖cDNA合
成を先ず、オリゴｄ（Ｔ）15をプライマーとして、５か
ら20μｇのfhVSMポリ（Ａ）+RNAの3'−末端から逆転写
酵素による合成を開始した。得られたRNA−DNAハイブリ
ッドをRNase Hで制限消化し、E.coli DNAポリメラーゼ
Ｉを用いた第二鎖DNAの合成用の3'−OHプライマーを得
た。次にT4DNAポリメラーゼを用いて、残っている全て
の突出3'−末端を除去し、平滑末端cDNA生成物を得た。
λZAPII（Stratagene Inc.,La Jolla,CA）のような、
λクローニングベクターに挿入する前に、標準的な方法
で平滑末端化したcDNAをメチル化し（例えば、EcoR Iメ
チラーゼで）、cDNA中に存在する特定のサブセットの制
限酵素部位の開裂をブロックする（即ち、EcoR Iメチラ
ーゼでメチル化するとEcoR IによるcDNAの開裂がブロッ
クされる）。次にこのcDNAをオリゴヌクレオチドリンカ
ーにライゲーションし（例えば、EcoR IリンカーGGAATT
CC）、リンカーを適切な制限エンドヌクレアーゼで開裂
し（例えば、EcoR I）、そして過剰のリンカーを除去し
た後に、cDNAをλベクターの適切なクローニング部位に
最終的にライゲーションする（例えば、λZAPIIのEcoR
I部位）。cDNAをベクターの腕にライゲーションした後
に、クローニングしたcDNAをGigapack II Gold（Strata
gene,Inc.,La Jolla,CA）のような、λパッケージング
抽出物と「パッケージング」する。
パッケージングの後、λファージを適切な宿主株（例
えばλZAPIIベクターに対してはXL1−Blue、Stratagen
e,Inc.,La Jolla,CA）にタイターした後、10,000と50,0
00pfu/プレートの間のタイターで、NZYMアガーの150mm
プレートに撒いた。37℃で６−８時間生育させた後、プ
レートを４℃まで冷やし、ニトロセルロース膜（BA85,S
CHLEICHER AND SCHUELL）またはハイボンド−Ｎ膜（AME
RSHAM）上にプラークリフトを、標準法（Benton,W.D.お
よびDavis,R.W.,Science（1977）196:180）に従い調製
した。血管内皮細胞増殖因子の配列に相同であるか、ま
たは一部相同な配列を含むクローンは、pST800（前述の
実施例３）のcDNA挿入に由来するウシ血管内皮細胞増殖
因子の、32P−標識体、または図3aの配列に基づいた、
血管内皮細胞増殖因子の配列に特異的なオリゴヌクレオ
チドに対して、ハイブリダイゼーションを行って検出す
る。ハイブリダイゼーションは、20％と50％との間のホ
ルムアミドおよび０％と10％との間の硫酸デキストラン
を含有する標準的なハイブリダイゼーション用バッファ
ー中で、37℃と42℃との間で行う。血管内皮細胞増殖因
子プローブにハイブリダイズするクローンについて、続
いて単一プラークに精製し、DNA配列解析のために、関
連の配列をバクテリオファージM13ベクター、例えばM13
mp18およびM13mp19にサブクローンした。
血管内皮細胞増殖因子のヒトのcDNA配列は、ヒト血管
内皮細胞増殖因子の遺伝子産物の、対応するアミノ酸配
列の予測に用い得る。cDNAはまた、E.coliのような細
菌、またはイーストまたは哺乳類細胞でヒト血管内皮細
胞増殖因子のタンパク質産物を発現するように設計され
た構築物の、転写制御エレメントに連結し得る。
実施例７ ヒト血管内皮細胞増殖因子（hVEGF121およびhVEGF165）
のDNA配列およびアミノ酸配列 実施例６に記載した方法に従い、ヒト血管内皮細胞増
殖因子をコードするcDNAクローンを調製および単離し
た。多数のクローンの配列決定により、多様性情報スプ
ライシングがウシの場合と同様に起こることが確認され
た。従って、bVEGF120およびbVEGF164に相当するヒトタ
ンパク質の発現型が存在する（しかし、ヒトタンパク質
にはウシ型の血管内皮細胞増殖因子にない付加されたア
ミノ酸を７位に含有するため、ヒト型の血管内皮細胞増
殖因子は各々、121および165残基を含有する）。λH3と
命名した、hVEGF121のコード領域の一部を含有するcDNA
クローンは、寄託番号40728としてAmerican Type Cultu
re Collectionに寄託されている。λH2と命名した、hVE
GF165のコード領域の一部を含有するcDNAクローンも、
寄託番号40727として寄託されている。さらに、hVEGF
121およびhVEGF165の一次翻訳物全体をコードする別の
クローンも、類似の方法によって得られ得る。
実施例５の寄託ヒトゲノムクローンから、および実施
例６に記載の方法によって得られた多数のcDNAクローン
の配列情報に基づき、hVEGF121およびhVEGF165をコード
する天然DNA配列を決定した。そのDNA配列を図７に示
す。囲まれた132ヌクレオチド配列は、情報により多様
性にスプライシングされる部分に相当するDNA配列を包
含する。翻訳された情報の中にこの配列が存在している
時、コードされたタンパク質はhVEGF165であり、そのア
ミノ酸配列は図７のオリゴヌクレオチド配列の上に直接
示されている。この配列が翻訳された情報に存在しない
時、コードされたタンパク質はhVEGF121である。この型
のタンパク質は、114位のアミノ酸までhVEGF165と同じ
アミノ酸配列を有する。112位から始まるhVEGF121のカ
ルボキシル末端配列は、図７のヌクレオチド配列の下に
イタリック体で表されている。hVEGF121およびhVEGF165
をコードする連続のcDNA配列は、合成オリゴヌクレオチ
ドから、あるいは実施例４に記載の方法に類似した方法
を用い、ヒト胎児血管平滑筋のpoly（Ａ）+RNAからポリ
メラーゼチェーンリアクションを用いて、作成し得る。
実施例８ ヒト型の血管内皮細胞増殖因子のアミノ酸配列を有する
ポリペプチドの発現 上記の標準方法に従って、ヒト血管内皮細胞増殖因子
（hVEGF121あるいはhVEGF165）の一次翻訳物をコードす
る全領域を含有するcDNAクローンは、完全型あるいは切
断（改変）型が最も便利に、種々の宿主内で組換えタン
パク質を生産するのに使用される。しかし、哺乳類系で
の発現が好ましい。なぜなら、宿主が天然で作られるタ
ンパク質に見られるような翻訳後のプロセッシング可能
であり、そして宿主がイントロンのプロセッシングも可
能であるために、cDNAあるいはゲノム配列のいずれかを
使用し得るためである。
従って、宿主ベクターへの挿入のために、ヒト血管内
皮細胞増殖因子のいずれかの型をコードする全領域を含
有するcDNAあるいはゲノムクローンは、以下に説明され
る通り調製される、しかしこれに制限されない。
ベクターを構築するために、クローン化されたcDNAあ
るいはゲノム挿入物を、それが単離されるクローニング
ベクターから切り出す。この挿入物を、Nco I、BamH
I、EcoR Iあるいは必要ならば他の適切なリンカーによ
り得られ、そして次にpHS1あるいはその誘導体のような
適切な宿主ベクター中に、以下の通りに挿入する。ある
いは、挿入物の切断および適切なベクターへの挿入の前
に、都合のよい制限酵素部位あるいは別のコード配列を
クローン化される挿入部に導入するために、インビトロ
変異誘発を用い得る。
宿主ベクターの構築 pHS1 プラスミドpHS1は、哺乳類宿主中で挿入DNAを発現さ
せるのに適する。このプラスミドは、p84H（Karin,M.
ら、Nature（1982）299:797−802）由来のヒトメタロチ
オネイン−IIA（hMT−IIA）配列の、hMT−IIA遺伝子の
−765位のHind III部位から＋70位塩基のBamH I開裂部
位に至る約840塩基対を含有する。pHS1を構築するため
に、プラスミドp84HをBamH Iで完全消化し、エキソヌク
レアーゼBAL−31で処理して末端ヌクレオチドを除去
し、そして次にHind IIIで消化した。所望の約840塩基
対のフラグメントをHind IIIおよびHind II消化で開環
したpUC8（Vieira,J.ら、Gene（1982）19:259−268）に
連結した。このライゲーション反応混合物をE.coli HB1
01をAmpRとするように形質転換するために用いて、そし
てpHS1と命名した、一つの候補プラスミドを単離し、そ
してジデオキシシーケンシングにより配列決定した。pH
S1はhMT−IIA制御配列を、都合のよい制限部位（BamH
I、Sma I、およびEcoR I）を含有するポリリンカーの上
流に含有する。
機能する宿主プラスミドpHS1を、メタロチオネインプ
ロモーター以外の別の制御因子を含有させるように、さ
らに改変し得る。特に、SV40のようなウイルス系のエン
ハンサーエレメント、およびヒト成長ホルモン（hGH）
のような他のタンパク質の3'非翻訳領域に関連する終止
シグラルが加え得る。
ウイルスのエンハンサー 1118塩基対のSV40のDNAフラグメントをpHS1のMT−IIA
プロモーター配列の前のHind III部位に挿入して、MT−
IIAプロモーターに作動可能に連結させたSV40エンハン
サーを含有する、一対の宿主発現ベクターを構築した。
SV40のDNAフラグメントは、SV40の複製起点を含み、ヌ
クレオチド5172位からヌクレオチド5243位（起点の部
位）に至る配列、ヌクレオチド107−250由来の重複した
72塩基対の反復を含有し、後期ウイルス遺伝子の5'末端
を含有する起点の横のヌクレオチド1046位を含めて続
く。このHind IIIの1118塩基対フラグメントは、SV40 D
NA（Buchman,A.R.ら、DNA Tumor Viruses,2nd ed（J.To
oze編）,Cold Spring Harbor Laboratory,New York（19
81）,pp.799−841）のHind III消化によって得られ、そ
して増幅のためにpBR322にクローン化される。このSV40
フラグメントを含有するpBR322ベクターをHind IIIで切
断して、そして1118塩基対のSV40 DNAフラグメントをゲ
ル電気泳動により単離して、そしてHind III−消化し、
CIP−処理したpHS1に連結した。pHS1−SV（９）およびp
HS1−SV（10）と命名した、得られたベクターは、MT−I
IAプロモーターの前にSV40フラグメントを逆方向で含有
する。pHS1−SV（９）において、エンハンサーは、MT−
IIAプロモーターの5'mRNA開始部位からの約1600塩基対
であり、逆方向ではこれは5'mRNA開始部位からの約980
塩基対である。両方の方向が作動可能であるが、エンハ
ンサー配列が開始部位に近い方の方向がより高い発現レ
ベルを与える。転写開始部位の250から400塩基対上流に
エンハンサーを位置させるような削除が最適であると考
えられている。
SV40エンハンサーの3'末端の190塩基対、250塩基対、
および360塩基対のそれぞれをMT−IIAプロモーターTATA
ボックスの5'末端の上流に位置させたベクターをさらに
構築した。これらの構築物は、Karin,M.ら、Nature（19
84）308:513−519に記載されているヒトMT−IIAプロモ
ーターの上流調節領域のマッピングに基づいている。全
ての構築物は、重金属による調節のための重複部位を含
有する配列を保持しているが、190塩基対および250塩基
対分離物からの構築物は、これらの重金属調節部位のさ
らの上流にあるグルココルチコイド調節配列を保持して
いない。
pHS'−SV190、pHS'−SV250、およびpHS'−SV360と命
名した、これらのベクターは以下の概略に従って調製し
た。メタロチオネインプロモーターを含有する配列の長
さおよびpHS1から切り出されたフラグメントとして供給
される上流領域の長さ以外は、全ての構築物は同じであ
る。
pHS'−SV190の場合、pHS1をSac IIで消化して、末端
を平滑化し、そしてKpn Iリンカーに連結する。次に、
このDNAをEcoR IおよびKpn Iで消化し、MT−IIA制御配
列の適切な部分を切り出す。同様に、pHS'−SV250の場
合、pHS1をHga Iで消化して、末端を平滑化し、Kpn Iリ
ンカーに連結し、そしてEoR IおよびKpn Iで消化する;p
HS'−SV360では、最初の消化にDde Iを用いる。
SV40エンハンサーを含有する中間体ベクターを以下の
ように調製する。SV40のHind III/Kpn Iフラグメント
（5172位から298位までに伸長し、Kpn I部位から50塩基
対のところにエンハンサーエレメントを含有する）を、
Kpn I/Hind IIIで消化したpCU19に挿入してpUC−SVを得
る（pUC19はポリリンカー領域に３つの都合のよい制限
部位を、Hind III、Kpn IおよびEcoR Iの順で含有す
る）。上記の記載通りに調製したKpn I/EcoR Iフラグメ
ントを、Kpn I/EcoR Iで消化したpUC−SVに挿入して、
完成ベクターを得る。
従って、全ての前述の改変ベクターは、SV40エンハン
サーエレメントの利点を有する。他のウイルスのエンハ
ンサーも、当然類似の方法で用いられ得る。
転写終止配列 転写終止制御配列を得るために、コード配列を有する
DNAおよびヒト増殖ホルモンの3'非翻訳領域を、pHS1に
つないだ。hGHコード領域の換わりに、hGH 3'非翻訳領
域からコード配列までを順にベクター中につないだ中間
的なベクターを得た。
hGHをコードするゲノム配列は、p2.6−３（DeNoto
ら、Nucleic Acids Res.（1981）19:3719）から、最初
のエキソンの5'末端で切断するBamH I、および機能遺伝
子の3'を切断するEcoR Iで消化し、次いでポリアクリル
アミドゲル精製を行い、単離した。単離したフラグメン
トをBamH I/EcoR I消化したpHS1にライゲーションし、
そしてこのライゲーション反応混合物をE.coli MC1061
中に形質転換し、AmpRとした。成功した形質転換体を制
限酵素分析でスクリーニングし、目的のプラスミドを含
んだ株pMT−hGHgを、大量のプラスミドDNAを調製するた
めにさらに増殖した。
上述のpHS1−SV（９）あるいはpHS1−SV（10）の構築
で記載した方法と類似の、ただしpHS1をpMT−hGHgに変
えた方法で、MT−IIAプロモーターの制御下に、そしてS
V40エンハンサーに機能するように結合されたhGH遺伝子
を有する、各々phGHg−SV（９）およびphGHg−SV（10）
と名付けた、２つのベクターを得た。このライゲーショ
ン反応混合物をE.coli MC1061をAmpRに形質転換するの
に用い、そして正しい構築物であることを確認した。
発現ベクターの構築 phGHg−SV（10）を、ヒト血管内皮細胞増殖因子の宿
主ベクターとして用いた。phGHg−SV（10）を、BamH I
およびSma Iで消化し、クレノウ断片で平滑末端とし、
そしてCIPと処理してhGHコード配列を切り出した。この
開環したベクターを、血管内皮細胞増殖因子の全長をコ
ードした、cDNAあるいはゲノムクローンからのフラグメ
ントにライゲーションし、発現ベクターpVEGF−SV（1
0）を得た。
図８に示すように、血管内皮細胞増殖因子遺伝子の最
初の全長翻訳産物は、26アミノ酸の分泌シグナル配列を
有している。この配列は、成熟血管内皮細胞増殖因子の
哺乳類細胞培養培地への分泌に効果を示し得る。望むな
らば、合成オリゴヌクレオチドを、成熟血管内皮細胞増
殖因子のコード配列に加え得、（例えば、hGHからの）
外来の分泌シグナル配列を、最初の全長翻訳産物中に作
成された血管内皮細胞増殖因子遺伝子に機能するように
結合させ得る。どちらの場合にも、産生物の分泌が起こ
らねばならない。
加えて、血管内皮細胞増殖因子遺伝子あるいはcDNA配
列を発現させるために、他の宿主ベクターも使用し得
る。例えば、上述のようにSV40エンハンサーの種々の立
体構造を含むように改変した、pHS1およびpHS1が使用し
得る。最後に、宿主ベクターは、血管内皮細胞増殖因子
遺伝子のみならず、ネオマイシン耐性遺伝子（pSV2:NEO
から得られる）および／あるいはヒトメタロチオネイン
−IIAタンパク質までも（pMT−VEGF−NEOあるいはpMT−
VEGF−NEO−MTと呼ばれる）、コードするように、さら
に改変し得る。
これらのベクターは、以下の検討を目的にpMT−VEGF
と総称的に命名した。
哺乳類組換え体による血管内皮細胞増殖因子の産生 チャイニーズハムスター卵巣（CHO）−K1細胞を、F12
培地および12％の仔ウシ胎児血清を加えたDMEの1:1の混
合培地中で生育した。構成細胞をpMT−VEGFおよびpSV2:
NEOと同時形質転換（Southern,P.らの、J.Mol.Appl.Gen
et.（1982）１:327−341）した;pSV2:NEOは、ネオマイ
シン類似体G418に対する耐性を付与する機能の遺伝子を
含んでいる。形質転換は、１μｇのpSV2:NEOおよび10μ
ｇのpMT−VEGFを、リン酸カルシウム−DNA共沈澱物中の
細胞へ、Wigler,M.らの、Cell（1979）16:777−785のプ
ロトコールに従って加え、４時間DNAに曝した後に、２
分間15％のグリセリン”ショック”を与えた。あるいは
細胞を、10μｇのpMT−VEGF−NEOあるいはpMT−VEGF−N
EO−MTと、同じリン酸カルシウムプロトコールを用いて
形質転換した。１日後、1mg/mlのG418に細胞を曝し、G4
18−耐性コロニーのプールを得た。耐性コロニーのプー
ルが充分生育した後、このプールを、細胞付着型あるい
は分泌型の血管内皮細胞増殖因子の産生に関してアッセ
イした。
安定なpMT−VEGFの形質も有する、成功したG418−耐
性形質転換体、あるいは他の血管内皮細胞増殖因子発現
プラスミドを、低密度で蒔き、株化単離体を精製した。
少量のこれらの単離体を、2 x 10-4Mの塩化亜鉛に曝し
た後に、マルチウエルプレートに蒔き、血管内皮細胞増
殖因子の簡易アッセイとした。血管内皮細胞増殖因子
は、内皮細胞のマイトジェン活性を、細胞中で、および
／あるいは調製培地中で調べるマイトジェンアッセイ
で、あるいは標準的な方法を用いて、標準的なELISA、
あるいは適切な血管内皮細胞増殖因子タンパク質あるい
はペプチドに対して調製した抗血清に対してのラジオイ
ムノアッセイ、を用いて確認した。大量の、好ましくは
分泌型の、目的の血管内皮細胞増殖因子を産生している
株化単離体を選択した。
この細胞を1/10コンフルーエンシーで10％のウシ胎児
血清を補った基本培地（F12およびDMEの1:1混合物）中
に蒔き、一晩インキュベートし、そして次に、1 x 10-4
Mから3 x 10-4Mの濃度範囲の塩化亜鉛の添加により血管
内皮細胞増殖因子の産生を誘起した。
血管内皮細胞増殖因子産生細胞を確立する別の方法で
は、CHO細胞をpMT−VEGF、pSV:NEO、およびヒトMT−IIA
挿入物を含んだpHS1（pHS1−MT）、あるいはpMT−VEGF
−NEO−MTと同時形質転換した。G418選択の後、プール
した耐性コロニーを100μＭのZnCl2をインデューサーと
し、10μＭのCdCl2の存在下で、カドミウム耐性に関し
て選択した（MT−IIAタンパク質の発現に基づく）。次
に耐性コロニーのプールを、上述のようにアッセイし、
血管内皮細胞増殖因子の産生レベルを測定した。
天然の血管内皮細胞増殖因子シグナルあるいはhGH由
来のシグナルの様な、血管内皮細胞増殖因子用の機能す
る分泌シグナル配列を、発現ベクターの構築に含めるこ
とにより、CHOあるいは他の哺乳類細胞宿主を用いた正
常な本質的経路を用いた分泌に効果がある。分泌を変化
させると、タンパク質精製工程がより単純になり、そし
てタンパク質の折畳み構造がより自然の立体構造に近づ
き、再折畳み工程の必要をなくすため、当然いくつかの
利点が生じる。次に、分泌された血管内皮細胞増殖因子
の精製を、実施例９に記載の方法に従い、あるいは、イ
オン交換クロマトグラフィー、分子量排除型クロマトグ
ラフィー、および、例えば、逆相HPLCおよび既知の方法
に従い製造した抗血管内皮細胞増殖因子抗体を用いた抗
体親和性クロマトグラフィーのような、疎水性による分
離のような工程を含み得る、当分野で既知の標準的な他
の方法に従って、行う。
実施例９ ポリペプチドの回収および血管内皮細胞増殖因子ダイマ
ーの形成 上述のように哺乳類発現ベクター中で発現させ、産生
された増殖因子の分泌型を得たならば、この増殖因子hV
EGF165は、Gospodarowiczらの、PNAS（1989）86（19）:
7311−7315の方法で精製し得る。増殖因子を発現してい
る宿主細胞で調整された培地を、10000gで15分から30分
間遠心分離する。1N HClで上清溶液をpH5から６に調整
し、1Lに付き少なくとも500gの硫酸アンモニウムを加え
る。この溶液を４℃で２時間から６時間攪拌し、そして
次に30分から60分間10000gで遠心分離した。この上清を
捨て、そしてペレットをさらに精製しするために残し
た。
このペレットを、25から100mMのNaClを含んだ５から2
5mMのTris、pH6.5から8.0に再溶解した。この溶液を、
同じバッファーで一晩透析した。沈澱した物質全てを遠
心分離で溶液から析出させ、そして捨てた（10000gで、
30分から60分間）。この溶液を、透析に用いたのと同じ
バッファーで平衡化しておいたヘパリン−セファロース
のカラムにかけた。タンパク質溶液の全てをかけた後、
カラムを、溶出物の吸光度がベースラインレベルに戻る
まで平衡化バッファーで洗浄した。タンパク質を、0.1M
から2.5Mの間のNaClを含んだ平衡化バッファーでカラム
から段階溶出した。活性フラクションを集め、Amicon s
tirred cell中で10,000MWのカットオフメンブレンで濃
縮した。
ヘパリン−セファロースのカラムから集められたこの
濃縮した生理活性物質を、リン酸緩衝食塩水で平衡化し
たBio−Gel P−60カラムにかけた。カラムを同じバッフ
ァーで溶出し、そして生理活性のあるフラクションを集
めた。この物質を３倍容量の20mMのHEPES、pH8.3で希釈
し、Mono−Ｓカラムにかけた。このカラムを、同じバッ
ファー中の0.0Mから1.0MのNaCl濃度勾配で溶出した。構
造調査用には、最終の精製を、0.1％のトリフルオロ酢
酸を含んだ水中の10％から60％へのアセトニトリルの濃
度勾配を用い、Vydac C4逆相カラム（RP−HPLC）で行っ
た。
封入体中にタンパク質を産生させるために細菌発現シ
ステムを用いた場合、Hoppeらの、Biochemistry（198
9）28:2956−2960に類似の方法で産生物を精製し得る。
細胞を、５から25mMのTris、pH6.5から8.0、1mMのEDTA
に懸濁し、microfluidizerを通して破砕した。この溶液
を10000gで15分から30分間、遠心分離し、そしてペレッ
トを５から25mMのTris、pH6.5から8.0、1mMのEDTAおよ
び１％から２％のTriton X−100で洗浄した。
ペレットを、20mMのTris、pH7.5、1mMのEDTA、6Mのグ
アニジン−HCl、0.1MのNa2SO3、および0.01mMのNa2S4O6
中に再懸濁し、そしてこの溶液を室温で４時間から12時
間放置した。この工程で、分子がモノマー型に変換され
る。不溶性の物質は遠心分離で除去した。
得られたＳ−スルフォン酸化タンパク質を、10から50
mMのTris、pH6.5から8.0、1mMのEDTA、３から6Mのグア
ニジン−HCl、で平衡化したセファクリルＳ−200のクロ
マトグラフィーにかけた。タンパク質を含んだ画分をプ
ールし、水で透析した。Ｓ−スルフォン酸化タンパク質
の最終精製は、RP−HPLC C4クロマトグラフィーで行っ
た。タンパク質を、アセトニトリルの０％から100％の
直線的な濃度勾配で溶出した（濃度勾配を作るためのチ
ャンバーＡは、0.1％のトリフルオロ酢酸を含んだ水
で、そしてチャンバーＢは、0.1％のトリフルオロ酢酸
を含んだアセトニトリルである）。
このタンパク質を最終濃度が0.1から0.5mg/mlとなる
ように、50mMのTris、pH8.0、1mMのEDTA、5mMのグルタ
チオン、およびタンパク質の溶解性を保つのに充分な尿
素を含んだ0.5mMのグルタチオンジスルフィド中に溶解
した。この工程で、タンパク質は天然のホモダイマー構
造の血管内皮細胞増殖因子の型に折畳まれる。２日後、
このタンパク質を、上述の同じRP−HPLCシステムで、あ
るいは、ヘパリン−セファロースあるいはMono−Ｓのよ
うなアフィニティークロマトグラフィー工程で精製し
た。モノマーのダイマーからの分離は、20mMのTris−HC
l、pH7.5中でＳ−セファロースのクロマトグラフィーで
行った；ダイマーは、0.7MのNaClを含んだ20mMのTris、
pH7.5でカラムから溶出した。hVEGF121（bVEGF120に相
当する）は、hVEGF165およびhVPF189のヘパリン結合特
性を欠いていることを見いだしたので、hVEGF121および
bVEGF120の精製は、ヘパリン−セファロースクロマトグ
ラフィー以外の方法で行った。
実施例10 血管内皮細胞増殖因子を含んだ創傷治癒調合物 カテーテル経由で創傷部位に静脈投与するのに適した
非経口的溶液は、血管内皮細胞増殖因子（例えば、bVEG
F120、bVEGF164、hVEGF121、あるいはhVEGF165）を、5.
0から7.0の範囲の安定なpHに保つための適切な量のバッ
ファー、および等張の浸透圧にするための適切な量の塩
化ナトリウムと共に注射用の水に溶解することで調製し
得る。典型的な組成を以下に示す： mg/ml 血管内皮細胞増殖因子 0.05−1.0 クエン酸 0.2 塩化ナトリウム 8.5 0.01Nの水酸化ナトリウムでpH6.0に調整 1.0mlの注入液を作成するのに充分な水 上記の溶液は、機械的なスプレーポンプの補助で、創
傷部位に局所的に塗布もし得る。
創傷部位に局所的に塗布するために好適な水性のゲル
は、肥厚剤ヒドロキシエチルセルロース（250Hグレー
ド）を、バッファー、防腐剤、浸透圧調節剤を含んだ水
性溶液に懸濁させることで調製できる。肥厚剤が完全に
溶解したら、血管内皮細胞増殖因子の濃厚溶液を加え、
そして生成物が均一になるまで混合する。以下の薬学的
組成物は、このようなゲルの典型例である： mg/ml 血管内皮細胞増殖因子 0.05−1.0 ヒドロキシエチルセスロール（250H） 20 クロルヘキシジングルコネート 2.5 クエン酸 0.5 グリセリン 20 0.01Nの水酸化ナトリウムでpH6.0に調整 1.0mlの注入液を作成するのに充分な水 創傷部位に振りかけるのに適した乾燥粉末は、血管内
皮細胞増殖因子を水溶性のキャリアーと共に凍結乾燥
し、そして凍結乾燥物を細かく砕き、均一な大きさの粉
末を得ることで調製し得る。この粉末は創傷部位に、直
接あるいはエアロゾル発生用ガスを用いて塗布し得る。
典型的な粉末組成物は以下のように調製される： mg/ml 血管内皮細胞増殖因子 0.05−1.0 デキストラン（分子量1000） 100 1.0mlの注入液を作成するのに充分な水 この溶液は凍結乾燥し、そして得られる乾燥物をボー
ルミルで約75μｍの中程度の粒子径に砕く。この粉末は
シェイカーにより塗布し得る。大きな表面面積を被覆す
る必要がある場合には、フルオロカーボン（FreonR）、
炭化水素（イソブタン）、あるいは圧縮ガス（二酸化炭
素）を発生用ガスとして含んだエアロゾル発生容器によ
り、この粉末を塗布し得る。
実施例11 キメラ増殖因子の調製 血管内皮細胞増殖因子の鎖を一本と血小板由来の増殖
因子のＡ鎖を一本とを含むキメラ分子は、まずこれら２
分子の組換え発現用ベクターを構築することにより調製
される。ヒト血管内皮細胞増殖因子を哺乳動物で合成さ
せる発現ベクターは実施例８に記載している。好ましい
ベクターは、合成血管内皮細胞増殖因子が宿主細胞から
分泌されるように構築されているものである（たとえ
ば、天然の血管内皮細胞増殖因子の分泌シグナルを含
む、血管内皮細胞増殖因子の全長の一次翻訳産物をコー
ドする領域が、親のベクターのBamH I部位とSma I部位
との間に作動可能なように挿入されるように変更されて
いるphGHg−SV（10））。同様のベクターが血小板由来
増殖因子の発現用に構成され、それは図4a（Ａ鎖の一次
翻訳産物の全長をコードする）に示される配列を有する
合成または部分的に合成された配列をとり、BamH Iおよ
びEcoR Vで消化し、得られたコード領域フラグメントを
phGHg−SV（10）のBamH I部位とSma I部位との間に挿入
して構築される。
増殖因子鎖の産生には発現プラスミドを哺乳動物宿主
細胞、たとえばCHO細胞に、実施例８で記載したリン酸
カルシウム沈澱法で導入する。CHO細胞へは２つの異な
った方法が使用される。一つの形質転換は、細胞に導入
されるDNAは同時形質転換で行われ、血管内皮細胞増殖
因子発現プラスミドとpSV2:NEOとを10:1重量比で行う；
他の形質転換は血小板由来増殖因子Ａ−鎖の発現ベクタ
ーとpSV2:NEOとを10:1重量比で行う。それぞれの形質転
換体から形質転換体のG418耐性プールを選択し、個々の
増殖因子産生クローンは、高レベルの増殖因子産生につ
いてスクリーニングされ、アッセイは馴化培地の（血管
内皮細胞増殖因子産生細胞の場合は）血管内皮細胞に対
する、あるいは（血小板由来増殖因子Ａ−鎖産生細胞の
場合は）ATCCから入手可能なマウスNIH 3T3細胞（＃ATC
C CRL 1658）に対する分裂誘起活性、あるいは当該分野
に標準的な方法で作成された、この２つの増殖因子のEL
ISAまたはラジオイムノアッセイで行った。
別のアプローチとして、形質転換は３つのプラスミド
を細胞上にリン酸カルシウムで共沈澱させる方法であ
る：血管内皮細胞増殖因子発現ベクター、血小板由来増
殖因子Ａ−鎖発現ベクターおよびpSV2:NEOで（重量比で
10:10:1）で行う。クローンのG418耐性プールは形質転
換細胞から選択され、次にそれぞれのクローンについて
両方の増殖因子鎖を同時に分泌するクローンをELISAあ
るいは他の抗体を基本とするアッセイで選択する。
馴化培地からの血管内皮細胞増殖因子鎖の精製は実施
例９に記載された方法で行う。血小板由来増殖因子Ａ−
鎖の精製は以下の当該分野に公知のプロトコール、たと
えば、ヘルディン（Heldin）らのプロトコール、Nature
（1986）319:511−514に従って行われる。
この後者のプロトコールでは、分泌された増殖因子を
含有する馴化培地はスルファデックス（Sulphadex）ビ
ーズへの吸着により分画され、次に血小板由来増殖因子
Ａ−鎖物質は1.5M NaClに含有する0.01Mリン酸バッファ
ー、pH7.4で溶出する。硫酸アンモニウム沈澱法で溶出
した蛋白を濃縮した後、サンプルは1M NaCl、0.01Mリン
酸バッファー、pH7.4に再懸濁し、このバッファーに対
して透析した。サンプルは、次に、セファクリルＳ−20
0カラムで分画（1M NaCl、0.01Mリン酸バッファー、pH
7.4で溶出）し、1M酢酸で透析し、凍結乾燥して、1M酢
酸に溶解後、バイオゲル（BioGel）Ｐ−150カラムにか
けた（1M酢酸で溶出）。Ａ−鎖物質を含有する画分を凍
結乾燥した後、サンプルは1M酢酸に再溶解し、逆相HPLC
で分画した（1M酢酸、2Mグアニジン−塩酸中、０−50％
プロパノールの濃度勾配で溶出）。
血管内皮細胞増殖因子鎖の一本と血小板由来の増殖因
子Ａ鎖の一本とを含むキメラダイマーは、上述のように
調製したこれらのタンパク質の２つの精製サンプルを混
合することにより製造される。混合物は次に、実施例９
記載のように変性し再構成した。簡単に述べると、ま
ず、混合物は変性され、20mMトリス、pH7.5、1mM EDT
A、6Mグアニジン−塩酸、0.1M Na2SO3,0.01mM Na2S4O6
で４から12時間室温で処理してＳ−スルホン化した。セ
ファクリルＳ−200で分画し、逆相HPLCで精製した後
（実施例９参照）、Ｓ−スルホン化された鎖を凍結乾燥
し、次にタンパク質鎖が溶解性を維持できるように充分
な量の尿素を含む50mMトリス−塩酸、pH8.0、1mM EDT
A、5mMグルタチオン、0.5mMグルタチオンジサルファイ
ドの溶液に最終濃度0.1から0.5mg/mlとなるように溶解
した。モノマーはＳ−セファロースのクロマトグラフを
用いてダイマーから20mMトリス−塩酸、pH7.5中で、NaC
lの濃度を増加させながら分離した。キメラダイマー
は、次に、個々のホモダイマーを精製するステップを組
み合わせてホモダイマーから分離した後、変性と再度折
り畳みとを行った。さらに、キメラ分子は抗血管内皮細
胞増殖因子抗体カラムを通過させ、次に抗血小板由来増
殖因子Ａ−鎖抗体カラムを通過させ、精製され得、後の
手順は公知である。
実施例12 ヒト血管内皮細胞増殖因子（hVEGF121）をコードする全
長cDNA配列の回収 血管内皮細胞増殖因子mRNAの細胞源 ヒトU937前単球白血病細胞は血管内皮細胞増殖因子タ
ンパク質をコードするmRNAを高レベルで生産する。それ
故、ヒト血管内皮細胞増殖因子cDNAの調製に良好なmRNA
の供給源である。American Type Culture Collectionか
ら入手したU937細胞はRPMI−1640培地（GIBCO）に10％
ウシ胎児血清（FBS）、１％Ｌ−グルタミン酸、それぞ
れ100ユニット/mlのペニシリンとストレプトマイシンと
を加えた培地で維持した。細胞は典型的には３から４日
ごとに継代培養し、典型的には培地1mlあたり5X105細胞
の濃度で移植した。
ポリ（Ａ）+RNAの単離 U937細胞のmRNAの単離のために、細胞を1mlあたり約5
X106細胞の濃度まで増殖した。細胞は500Xgで５分の緩
やかな遠心分離を行いペレットを集めた。細胞ペレット
は、チャーグイン（Chirgwin）の方法、Biochemistry
（1979）18:5294−5299、に従って、mRNA単離の前に50m
lの氷冷したダルベッコのリン酸緩衝化した生理食塩水
（Ｄ−PBS）で一回洗浄し、残余の培地を洗浄した。こ
の方法で、洗浄した細胞ペレットは溶解バッファー（4.
0Mグアニジンチオシアネート、0.1％アンチフォーム
Ａ、25mMクエン酸ナトリウム、0.5％Ｎ−ラウロイルサ
ルコシン、100mM β−メルカプトエタノール）を直接加
えて溶解した。DNAを注射針で通して切断した後、RNAは
酢酸とエタノールの添加により直接沈澱させた。沈澱し
たRNAは、次に、ジエチルピロカーボネート（DEP）処理
した脱イオン水（Ｄ−H2O、典型的には約400μｌ）に溶
解し、2.6mlのグアニジン−塩酸バッファー（7.5Mグア
ニジン塩酸、25mMクエン酸ナトリウム、5mMジチオスレ
イトール）を加えた。酢酸とエタノールを添加してRNA
を沈澱させた。沈澱したRNAは再びDEP−H2Oに溶解し、
酢酸ナトリウムとエタノールで沈澱させた。
グアニジンチオシアネート法（上記）で単離した全細
胞のRNAは、以下の確立された方法によって（Edmonds,
M.,et al.,PNAS（1971）68:1336;Aviv,H.and Leder,P.,
PNAS（1972）69:1408）、オリゴｄ（Ｔ）セルロースク
ロマトグラフィーでさらに分画し、ポリ（Ａ）+RNAを単
離した。
逆転写酵素とポリメラーゼチェーン反応（PCR）増幅と
による血管内皮細胞増殖因子cDNAの合成と増幅 hVEGF121発現カセットを作成するため、U937ポリ
（Ａ）+RNA（上記参照）から得られたオリゴヌクレオチ
ドプライマー（図９）がPCRの開始に用いられ、それぞ
れの末端にBamH Iのクローニング部位を有し、3'末端の
すべてのリーディングフレームに終止コドンを有する血
管内皮細胞増殖因子フラグメントが生じた。第一鎖のcD
NAの合成は１μｇのアンチセンスオリゴヌクレオチド
（プライマー4738、図９）を５μｇのU937ポリ（Ａ）+R
NAとアニールさせた後、cDNA合成キット（ベーリンガー
マンハイム）を用いてAMV逆転写酵素で42℃、２時間反
応させて行った。第一鎖のcDNAの合成の後、反応液をフ
ェノールとクロロホルムで処理してエタノールで沈澱さ
せた。次に、1/10のcDNAをパーキンエルマ−シータスDN
Aサーマルサイクラーを用いて、アンチセンスオリゴヌ
クレオチド4738とセンス鎖オリゴヌクレオチド（プライ
マー4741、図９）をプライマーとして、30ラウンドのPC
R（Saiki,P.K.et al.,Science（1988）239:487−491）
で増幅した。PCR反応の生成物は、次に５％のポリアク
リルアミドゲルで分画し、hVEGF121発現カセットに対応
するバンドが溶出され、BamH Iで消化し、M13mp18につ
なぎ入れた。配列はサンガーらの方法、J.Mol.Biol.（1
980）143:161−178で確認した。
実施例13 CHO細胞でのhVEGF121の発現と分泌 配列確認の後、血管内皮細胞増殖因子発現カセットを
含有するBamH Iフラグメントは、哺乳動物の発現プラス
ミドpLENのBamH I部位にセンスおよびアンチセンスの両
方向に連結した（図10a）。同様に、pMTNベクターにセ
ンス方向に連結した（図10b）。ベクターpLENの構築の
ために、上記phGHg−SV（10）をSma Iで消化し、BamH I
リンカーをSma I部位に連結した。ベクターは次にBamH
Iで消化し（これは成長ホルモン遺伝子を除去する）、
再結合して、pLENを生じた。pLENはSV40エンハンサー、
MT−IIプロモーターおよびポリアデニル化部位を含む約
600bpの成長ホルモンの3'非翻訳領域を包含する。この
ベクターの構築とヒトエストロゲン受容体をコードする
cDNAの発現への使用はグリーン（Greene）ら、Science
（1986）231:1150に詳しく記載されている。
pMTNはpLENプラスミド（pMTNSV40 polyA Bam）の誘導
体であり、ネオマイシン耐性マーカーとSV40初期プロモ
ーター配列をプラスミドpSV2neoから取り込んだもので
ある。ネオマイシン耐性マーカーはアミノグリコシドホ
スホトランスフェラーゼをコードし、この酵素はそのマ
ーカーを有する細胞にG418耐性を賦与する。pMTNを構築
するために、ネオマイシン耐性マーカー（図10bでne
oR）はpSV2neoをBamH IとHind IIIで消化してpSV2neoか
ら切り離された。pSV2neoのSV40初期プロモーター配列
は、pSV2neoをpvu IIとHind IIIで消化して切り離さ
れ、neoRマーカーを有するHind III−BamH Iフラグメン
トにつないだ。このカセットは、neoRマーカーに接続し
たSV40初期プロモーターを包含し、SV40エンハンサーと
pLENのpUC8配列の間にあるHind III部位に挿入した。
pLEN121とpMTN121の構築では、hVEGF121発現カセット
をプラスミドベクターpLENおよびpMTNの、ヒトメタロチ
オネインプロモーターとヒト成長ホルモンの3'非翻訳配
列との間にあるBamH I部位に挿入した。
pLEN121とpMTN121発現プラスミドのCHO細胞への形質転
換 CHO−K1細胞はATCCから入手し（ロックビル、MD）、1
0％FBS、１％Ｌ−グルタミン酸、それぞれ100ユニット/
mlのペニリシンおよびストレプトマイシンを追加したダ
ルベッコの変法イーグル培地（DMEM）21:クーンのＦ−1
2培地の1:1混合物（vol/vol）で維持した。
CHO−K1細胞はリン酸カルシウム沈澱法（Graham and
van der Eb,Virology（1973）52:456およびWigler et a
l.,Cell（1979）16:777）によりプラスミドDNAで形質転
換した。血管内皮細胞増殖因子−pLEN121プラスミド
は、選択マーカーを有する２つのプラスミド；完全なメ
タロチオネインを有するpUC9MT18およびネオマイシン耐
性の主な選択マーカーを有するpSVneo、と同時形質転換
した。３つのプラスミドは、重量比でそれぞれ10:5:1で
混合した。pMTNプラスミドはアミノグリコシドホスホト
ランスフェラーゼをコードする遺伝子（ネオマイシンと
G418の耐性マーカー）を包含する。従って、pMTNプラス
ミドは単独で直接CHO−K1細胞を形質転換した。形質転
換から24時間経過後、pSV2neo（pLENで同時形質転換し
た場合）あるいはpMTNが有するG418耐性マーカーを発現
する細胞は、ネオマイシンアナログであるゲネテシン
（Geneticin）（G418）を培地中に600μg/mlの濃度で含
む培地での生育で選択した。G418選択で生存したpLEN構
築物で形質転換された細胞のコロニーは継代培養され、
５μＭのCdCl2を含む培地でさらに選択を行った。生存
していたコロニーは増殖させて細胞のプールとして、血
管内皮細胞増殖因子の発現と解析に使用した。
CHO細胞からのhVEGF121の発現および分泌を確認するた
めの放射能ラベルとパルスチェイス pLEN121で形質転換したCHO−K1細胞によるhVEGF121の
発現と培地への分泌は、細胞タンパク質を代謝的にラベ
ルし、次に細胞溶解物あるいは馴化培地からの血管内皮
細胞増殖因子を免疫沈降で確認した。細胞溶解物あるい
は馴化培地サンプルは形質転換したCHO細胞を、放射能
ラベル期間が始まる前に、50μM ZnSO4を含む無血清のD
MEM−21/クーンのF12培地（誘導培地）で24時間培養し
てメタロチオネインプロモーターの誘導を行って調製し
た。［35S］−Ｌ−メチオニンの添加前に、細胞を洗浄
し、メチオニンを含まないDMEM−21/クーンのF12培地で
30分間、37℃で前培養した。ラベル期間を始めるため
に、コンフルエントになった6cmの組織培養ディッシュ
に最終濃度100μCi/mlとなるように［35S］−Ｌ−メチ
オニンを添加した。パルスチェイス解析においては、”
チェイス”期間は30分のラベル期間の後に開始した。ま
ず、ラベル用培地を取り除き、細胞を一度、Ｌ−メチオ
ニンを含む無血清のDMEM−21/クーンのF12培地（”チェ
イス培地”）で洗浄し、チェイス期間の間チェイス培地
を再度供給した。
細胞溶解物および馴化培地からの［35S］−Ｌ−メチオ
ニン−ラベルされたhVEGF121の免疫沈降法による検出 すべての免疫沈降操作は特に断わらない限り、４℃で
行い、1mlの培地を有する6cmの組織培養ディッシュでコ
ンフルエントになるまで培養した細胞を用いた。培地を
集め、PMSFを1mMとし、細胞溶解物サンプルを調製する
間中、氷冷しておいた。細胞溶解物を調製するため、細
胞を氷冷したリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で一回洗
い、次に、0.4mlの、100mMトリス−塩酸（pH8.0）、100
mM NaCl、0.5％ NP−40、1mM PMSF（細胞溶解バッファ
ー）で溶解した。馴化培地と細胞溶解物は４℃、13、00
0xgで30分間の遠心分離で清澄にした。清澄にした後、
血管内皮細胞増殖因子に対する抗血清あるいは免疫前の
ウサギ血清（ギブコ）を細胞溶解物あるいは馴化培地に
最終濃度２％（vol/vol）となるように加え、４℃で一
夜インキュベートした後、プロテインＡセファロースCL
−4Bのスラリー（100mg/ml）50μｌを加えた。４℃で１
時間インキュベートした後、サンプルを1mlの50mMトリ
ス−塩酸（pH8.0）、0.5M NaCl、5mM EDTA、0.5％ NP−
40、1mg/ml卵白アルブミン（シグマ）で順次４回;5mMト
リス−塩酸（pH7.5）、150mM NaCl、5mM EDTA、0.5％ N
P−40で２回；および10mMトリス−塩酸（pH7.5）で１回
洗浄した。サンプルは、次に、50μｌのサンプルバッフ
ァーに懸濁し、３分間沸騰して、13、000Xgで１分間遠
心分離した後、12.5％のSDS−ポリアクリルアミドゲル
に溶解した。放射能ラベルされたタンパク質を可視化す
るために、電気泳動したゲルをEN3HANCE（NEN）に30分
間、次にｄ−H2Oに30分間浸した後、乾燥し、フルオロ
グラフィーにかけた。
pLEN121で形質転換されたCHO細胞により合成されたhV
EGF121の免疫沈降とパルスチェイスの解析結果は、免疫
沈降法では、CHO細胞により合成されたhVEGF121は、２
−メルカプトエタノールでタンパク質を還元すると、約
15kDと約20kDの２つのサイズクラスとして検出された。
未修飾の還元したhVEGF121のサイズは約15kDと予測され
ている。グリコシル化で修飾された場合、モノマータン
パク質は分子量が18kD以上に移動することが推定され
る。パルスチェイス解析は、両方の形態とも60分よりも
少ない分泌のハーフタイムで分泌されることを示す。
CHO細胞により発現される血管内皮細胞増殖因子のグリ
コシル化とダイマー化の程度の決定 血管内皮細胞増殖因子の20kD型がＮ−結合したグリコ
シル化の結果によることを確認するために、pLEN121で
形質転換されたCHO細胞を、抗生物質ツニカマイシン
（典型的には１から10μg/ml）の非存在または存在下、
無血清培地で４時間生育した。ツニカマイシンを含有す
る培地で４時間生育した後、メチオニンを含まないがツ
ニカマイシンを前の４時間の培養に存在したと同量含む
DMEM−21/クーンのF12培地で、30分間細胞をメチオニン
飢餓の状態にした。次に形質転換されたCHO細胞はツニ
カマイシンを含有しないか含有するラベル用培地で４時
間、（上述のように）［35S］−Ｌ−メチオニンでラベ
ルした。ツニカマイシン存在下の生育ではhVEGF121の20
kDの還元型の合成が阻害され、血管内皮細胞増殖因子の
20kDのモノマー型はＮ−結合グリコシル化の修飾による
ことを示した。
グリコシル化された、またはグリコシル化されていな
いhVEGF121がダイマー形成できるかどうかを決定するた
めに、ツニカマイシン非存在あるいは存在下生育したpL
EN121−形質転換CHO細胞により馴化された培地から免疫
沈降物を調製した。免疫沈降後、サンプルは100mMのβ
−メルカプトエタノールを含有するか含有しないSDSサ
ンプルバッファー中で沸騰することによりプロテインＡ
セフェロースビーズから溶出した。ツニカマイシンが存
在しない培地で生育した細胞から調製したサンプルは通
常の型（15kDと20kD）の血管内皮細胞増殖因子を有して
いたが、これはβ−メルカプトエタノール存在下に沸騰
してジスルフィド結合を還元した後、SDS−PAGEにより
分画したときである。しかし、サンプルをβ−メルカプ
トエタノール非存在下で調製したときは、SDS−ポリア
クリルアミドゲル上で、約15kD、20kD、28kD、32kDおよ
び36kDの血管内皮細胞増殖因子種を含む５本のバンドが
検出され、hVEGF121がジスルフィド結合のダイマーを形
成できることが示された。ツニカマイシンの存在下に生
育した細胞から調製され、β−メルカプトエタノール中
で予め還元したあるいは還元していないサンプルの解析
の結果、hVEGF121の32kDおよび36kD型は一方のサブユニ
ットがグリコシル化されており他方がそうでない（32kD
型）ヘテロダイマーを形成するか、あるいは、両方のサ
ブユニットがグリコシル化された（36kD型）ホモダイマ
ーであることが明かになった。28kD型はhVEGF121の２つ
のグリコシル化されていないサブユニット間のホモダイ
マーの形成による。上述の条件下、CHO細胞で生産され
たhVEGF121の約50％はＮ−結合グリコシル化されてい
る。
hVEGF121はヘパリン−セファロースに結合しない hVEGF121のヘパリン−セファロースに対する結合親和
力を決定するために、ヘパリン−セファロースの1ml
（ベッドボリューム）カラムを調製し、10mMトリス−塩
酸、pH7.5、50mM NaCl（HS平衡バッファー）で、４℃に
て、0.4ml/分の流速で平衡化した。pLEN121−形質転換C
HO細胞により馴化された培地200mlを集め、硫酸アンモ
ニウム（最終濃度80％ w/v）で10倍に濃縮し、大量のHS
平衡バッファーに対して透析した。10倍に濃縮し、透析
した培地の20mlを（上述の）ラベル用培地で４時間生育
させた細胞から調製した2mlの培地と混合し、1mlのヘパ
リン−セファロースカラムに負荷した。結合せずに通過
した液を集め、SDS−PAGE解析にかけた。次にカラムを
カラム体積の７倍の平衡バッファーで洗浄し、順次、カ
ラム体積の14倍の10mMトリス−塩酸、pH7.5、150mM NaC
lで洗浄し、ついでカラム体積の６倍の10mMトリス、pH
7.5、2M NaClで洗浄しながら画分を集めた。カラム画分
をSDS−PAGEおよびフルオログラフィーで解析したとこ
ろ、hVEGF121はヘパリン−セファロースに結合しないこ
とが明かになった。
hVEGF121、hVEGF165およびhVPF189の比較から、血管
内皮細胞増殖因子の121アミノ酸型のものはヘパリン結
合能を欠くという独特なものであることが示された。
亜鉛−セファロースによるhVEGF121の精製 亜鉛−セファロースクロマトグラフィーによってhVEG
F121が更に精製される。金属キレートセファロース（フ
ァルマシア）の2ml（ベッドボリューム）カラムを調製
し、脱イオン水で洗浄してから、24mlの塩化亜鉛（ZnCl
2）溶液（1mg/ml水溶液）を”チャージ”した。カラム
を再度脱イオン水で洗浄し、10mlの50mM NaH2PO4、pH7.
0、0.5M NaCl、10mMイミダゾールで”活性化”した。次
にカラムを50mM NaH2PO4、pH7.0、0.5M NaCl、0.5mMイ
ミダゾール（亜鉛平衡用バッファー）で再び平衡化し
た。10mMトリス−塩酸、pH7.5、50mM NaCl中にhVEGF121
を含むサンプル（ヘパリン−セファロースクロマトグラ
フィーからの非結合物質）の24mlを亜鉛−セファロース
カラムにチャージした。カラムは次に亜鉛平衡用バッフ
ァーで洗浄し、そして最終濃度が5mM、10mM、15mM、20m
M、25mM、30mM、60mMおよび100mMとなるようにイミダゾ
ールを添加した亜鉛平衡用バッファーで分画した。この
分画の結果、hVEGF121は亜鉛平衡用バッファー中で亜鉛
−セファロースに結合し、カラムから最終濃度が15から
25mMとなるようにイミダゾールを添加した亜鉛平衡用バ
ッファーで溶出することを示す。
分泌されたhVEGF121はシグナルペプチダーゼ開裂部位で
正確に開裂される。
亜鉛−セファロース（上述）によるクロマトグラフィ
ーで精製されたhVEGF121は100mMのβ−メルカプトエタ
ノールを含む負荷用バッファーで還元し、SDS−ポリア
クリルアミドゲルで電気泳動で分画し、ポリビニリデン
ジフルオライド（PVDF）膜に移し、自動気相蛋白質配列
決定機（アプライドバイオシステムズ）で連続エドマン
分解してＮ−末端配列解析を行った。血管内皮細胞増殖
因子の15kDおよび20kD型の両方とも、それぞれの型の90
％がAPMAEGGGQNHHEVの配列から始まったが、これに対
し、それぞれの型の10％が１−３位欠損型でAEGGGQNHHE
Vであった。これらの結果はCHO細胞で発現し、分泌され
たhVEGF121の15kDと20kD型の大部分は、天然に単離され
た型の血管内皮細胞増殖因子のＮ−末端に一致した、正
確なＮ−末端アミノ酸配列を有することを確かにした。
モノ−ＱクロマトグラフィーによるhVEGF121の精製 15から25mMのイミダゾールを含むバッファーで亜鉛−
セファロースから溶出したhVEGF121を脱塩し、平衡用バ
ッファー（10mMトリス−塩酸、pH7.5）中でモノ−Ｑ
（ファルマシア）カラムにかけた。結合したタンパク質
は、0mMから300mMの範囲のNaClを含む平衡用バッファー
で濃度勾配（カラム体積の30倍）にかけて溶出し、約80
mMから140mMの間のNaClで血管内皮細胞増殖因子が溶出
した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/475 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 アブラハム，ジュディス エイ. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94086 サニーベイル，＃アイ―207，エ ス．フェアオークスアベニュー 655 (72)発明者 フィデス，ジョン シー. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94301 パロ アルト，ブライアント ストリート 2320 (72)発明者 ミッチェル，リチャード エル. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94086 サニーベイル，ユリーカ コー ト 283 (56)参考文献 Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．246（1989) ｐ．1306−1309 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，Ｖｏｌ．86（1989) ｐ．7311−7315 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ ｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．161, Ｎｏ．２（1989）ｐ．851−858 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，ｖｏｌ．84（1987) ｐ．5773−5777 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ ｌ．，Ｖｏｌ．152（1987）ｐ．190− 199 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ ｌ．，Ｖｏｌ．152（1987）ｐ．307− 316 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ ｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．165, Ｎｏ．３（1989）ｐ．1198−1206 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ

Claims (17)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】以下に示されるアミノ酸配列を有するウシ
    の血管内皮細胞増殖因子bVEGF120をコードする単離され
    たDNA分子：
  2. 【請求項２】以下に示されるヌクレオチドを包含する、
    請求項１記載のDNA分子：
  3. 【請求項３】以下に示されるアミノ酸配列を有するウシ
    の血管内皮細胞増殖因子bVEGF120をコードするDNA配列
    が、宿主細胞中で直接に該配列を表現することができる
    調節配列に作動可能に連結されて包含される、複製可能
    な発現ベクター：
  4. 【請求項４】前記DNAコード配列が、以下に示されるヌ
    クレオチド配列を包含する、請求項３記載の発現ベクタ
    ー：
  5. 【請求項５】請求項３の発現ベクターで形質転換された
    宿主細胞。
  6. 【請求項６】前記宿主細胞がE.coliである、請求項５記
    載の形質転換された宿主細胞。
  7. 【請求項７】前記宿主細胞が真核細胞である、請求項５
    記載の形質転換された宿主細胞。
  8. 【請求項８】前記宿主細胞がCHO細胞である、請求項７
    記載の形質転換された宿主細胞。
  9. 【請求項９】血管内皮細胞増殖因子bVEGF120を製造する
    方法であって、 （ａ）以下に示されるアミノ酸配列を有する血管内皮細
    胞増殖因子bVEGF120のポリペプチド鎖のアミノ酸配列を
    コードするDNA配列を包含する発現ベクターで形質転換
    された細胞を該ポリペプチドが発現される条件下で培養
    し： （ｂ）発現された該ポリペプチドを回収し、および （ｃ）該ポリペプチド鎖のジスルフィド結合したダイマ
    ーを形成させる工程を包含する、方法。
  10. 【請求項１０】前記宿主細胞が哺乳動物宿主細胞であ
    り、生じる血管内皮細胞増殖因子がグリコシル化される
    請求項９記載の方法。
  11. 【請求項１１】以下に示されるアミノ酸配列を有する単
    離されたbVEGF120:
  12. 【請求項１２】bVEGF120の74位のアスパラギン（Asn）
    残基でＮ−結合グリコシル化を包含する、請求項11記載
    の単離されたbFEGF120。
  13. 【請求項１３】前記bVEGF120の約50％がＮ結合型グリコ
    シル化された、請求項11記載の単離されたbVEGF120。
  14. 【請求項１４】両方のサブユニットがどちらもグリコシ
    ル化されていないホモダイマーである、以下に示される
    アミノ酸配列を有する、単離されたbVEGF120:
  15. 【請求項１５】両方のサブユニットがグリコシル化され
    ているホモダイマーである、以下に示されるアミノ酸配
    列を有する、単離されたbVEGF120:
  16. 【請求項１６】サブユニットの一方がグリコシル化され
    ており、他方のサブユニットがグリコシル化されていな
    いヘテロダイマーである、以下に示されるアミノ酸配列
    を有する、単離されたbVEGF120:
  17. 【請求項１７】第１のポリペプチド鎖および第２のポリ
    ペプチド鎖を含むキメラ増殖因子であって、該鎖はジス
    ルフィド結合され、ここで、該第１のポリペプチド鎖は
    血小板由来増殖因子のＡ鎖サブユニットまたはＢ鎖サブ
    ユニットのいずれかのアミノ酸配列の少なくとも一部を
    含み、そして該第２のポリペプチド鎖は以下に示される
    アミノ酸配列を有するbVEGF120である、キメラ増殖因
    子：
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