FI102844B - Menetelmä valmistaa parannettu terapeuttisesti aktiivinen kudosplasmin ogeenin aktivaattori - Google Patents

Description

102844

Menetelmä valmistaa parannettu terapeuttisesti aktiivinen kudosplasminogeenin aktivaattori - Förfarande för framställ-ning av en förbättrad terapeutiskt aktiv aktivator för vävnad-splasminogen

Esillä olevan keksinnön kohteena on menetelmä valmistaa uusi entistä parempi kudosplasminogeenin aktivaattori (parannettu t-PA), jolla on pidempi biologinen puoliintumisikä ja lämmön ja happojen suhteen parempi stabiilisuus ja jolla voidaan odottaa olevan tulehdusta ehkäisevä vaikutus alueella, jossa veritulppa on muodostunut.

Ihmisen kudosplasminogeenin aktivaattorilla (t-PA) tiedetään olevan hyödyllinen fibrinolyyttinen aktiivisuus. Se aktivoi erittäin tehokkaasti fibriiniin sitoutuneen plasminogeenin, samalla kun se ei tehokkaasti aktivoi plasminogeeniä kiertävässä kehon nestefaasissa päinvastoin kuin tavalliset trombo-lyyttiset aineet, so. sterptokinaasi (SK) ja urokinaasi (UK). Aminohapposekvenssi, joka muodostaa ihmisen t-PA:n, ja ihmisen t-PA:a koodaavan cDNA:n nukleotidisekvenssi ovat tunnettuja [Pennica, d., et ai., Nature, 301. 214-221 (1983)]. Lisäksi tiedetään, että ihmisen t-PA liuottaa laskimo- ja valtimoveren hyytymiä. Suurimittaisissa kliinisissä testeissä on raportoitu, että intravenöösisti annettu ihmisen t-PA aukaisee tuk-kiintuneen sydänvaltimon uudelleen tehokkaasti potilaassa, jolla on akuutti sydänlihaksen infarkti.

Tämän ihmisen t-PA:n käyttämisellä veritulppataudin hoidossa on kuitenkin haittana sen entsyymiaktiivisuuden erittäin lyhyt puoliintumisikä veressä [Rijken, d.C., et ai., Thromb ' Haemost., £4 (1) , ) 1985), Hubert, E.F., et ai., Blood, 65, 539 (1985)] . Kun ihmisen t-PA:a käytetään veritulppataudin hoidossa, sitä tulisi sen vuoksi antaa jatkuvasti intravenöösisti suurena annoksena.

2 102844

Sen täysin olettamalla johdetun sekundäärisen rakenteen perusteella tiedetään, että luonnossa esiintyvä ihmisen t-PA saa aluerakenteensa molekyylin N-päästä, sormenjälkialueesta, EGF (epidermal-kasvutekjä)-alueesta, kahdesta kringle 1 ja kringle 2-alueesta ja seriiniproteaasi-alueesta. Rijken et ai. (Rij-ken, D.C., et ai., Thromb, Haemost., 54 (1), 61 (1985)] on raportoinut, että ihmisen t-PA:n biologisen puoliintumisiän lyhyys johtuu ihmisen t-PA:n muista alueista kuin seriiniproteaasi-alueesta. Lisäksi Zonneveld et ai., [Zonneveld, A.J.V., et ai., Proc. Natl., Acad. Sei. U.S.A., £3, 4670 (1986)] on raportoinut, että rakenteella, joka muodostuu sormenjälkialueesta, EGF-alueesta ja kringle 2-alueesta, saattaa olla tärkeä osuus luonnossa esiintyvän ihmisen t-PA:n fibriiniä sitovassa aktiivisuudessa ja t-PA:n fibriinistä riippuvan aktivoitumisen säilyttämisessä. Kuitenkaan ei tunneta mitään konkreettista mittaa luonnossa esiintyvän ihmisen t-PA:n omaamalle fibriinin sitomisaktiivisuuden säilymiselle ja toivotulle fibriinistä riippuvalle aktiivisuudelle ja biologisen puoliintumisiän pidentämiselle.

Julkaistussa tutkimattomassa japanilaisessa patenttihakemuksessa, Laid Open No. 48378/1987 on kuvattu t-PA, joka on saatu deletoimalla luonnossa esiintyvän ihmisen t-PA:n, josta kringle 1 on deletoitu, aminohapot 87 - 175. Tälle t-PA:lie on v tunnusomaista myös se, että EGF-alueella on indusoitu paikka-mutaatio. Tässä japanilaisessa patenttihakemuksessa on ilmoitettu, että modifioitu t-PA kykenee sitoutumaan fibriiniin ja että vuorovaikutus kudosplasminogeenin aktivaattorin inhibiittorin kanssa on pienentynyt.

Patenttijulkaisussa EP No. 24208 on kuvattu t-PA, joka on saatu deletoimalla luonnossa esiintyvän ihmisen t-PA:n, jossa kringle 1 on deletoitu, aminohapot 92 - 179. Julkaisussa on vain yksinkertaisesti mainittu, että tällä t-PA:11a on fib-rinolyyttinen aktiivisuus.

3 102844

Lisäksi on patenttijulkaisussa EP No. 231624 esitetty, että modifioidulla t-PA:lla on pidempi puoliintumisikä. Modifioidusta t-PA:sta, jossa yhtenä sen sekvenssinä on F-EKF-K2-A, on deletoitu kringle 1, mutta sen valmistamiseksi ei ole annettu mitään spesifistä menetelmää. Erityisesti mainitun menetelmän valossa voidaan päätellä, että tämän keksinnön modifioitu t-PA eroaa luonnossa esiintyvästä aktivaattorista inter-domain-alueen aminohapposekvenssin osalta.

Laajojen tutkimusten tuloksena ovat esillä olevan keksinnön keksijät valmistaneet parannetun t-PA:n, joka sisältää sormen-jälkialueen, EGF-alueen, kringle 2-alueen ja seriiniproteaasi-alueen, mutta jossa ensimmäinen kringle l-alue on deletoitu spesifisessä aminohappokohdassa. Keksijät ovat edelleen valmistaneet parannetun t-PA:n, jossa on paikkaspesifinen mutaatio kringle 2-alueen ja seriiniproteaasin kytkeytymispaikassa. Keksijät ovat onnistuneet saamaan aikaan parannetun t-PA:n, jolla on erinomainen stabiilisuus lämmön ja happojen suhteen, jolla on selvästi pidentynyt biologinen puoliintumisikä ja jolla on myös tulehdusta estävä aktiivisuus samalla, kun on yllättäen säilytetty luonnossa esiintyvän ihmisen t-PA:n halutut ominaisuudet.

Esillä olevalla keksinnöllä saadun parannetun t-PA:n kemiallinen rakenne eroaa täysin luonnossa esiintyvästä ihmisen t-PA:sta, ja tällä parannetulla t-PA:lla on paremmat toiminta-ominaisuudet .

Esillä olevan keksinnön mukaan saatu parannettu t-PA on poly-peptidi, jolla on seuraavan yleiskaavan mukainen aminohap-* . posekvenssi: 4 102844 H2N-R-Ser Tyr Gin Val lie Cys Arg Asp Glu Lys

Thr Gin Met lie Tyr Gin Gin His Gin Ser

Trp Leu Arg Pro Val Leu Arg Ser Asn Arg

Val Glu Tyr Cys Trp Cys Asn Ser Gly Arg

Ala Gin Cys His Ser Val Pro Val Lys Ser

Cys Ser Glu Pro Arg Cys Phe Asn Gly Gly

Thr Cys Gin Gin Ala Leu Tyr Phe Ser Asp

Phe Val Cys Gin Cys Pro Glu Gly Phe Ala

Gly Lys Cys Cys Glu lie Asp Thr Arg Ala

Thr Ser Glu Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe

Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His

Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu

Pro Trp Asn Ser Met lie Leu lie Gly Lys

Val Tyr Thr Ala Gin Asn Pro Ser Ala Gin

Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys

Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys Pro Trp

Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr

Trp Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys Ser

Thr Cys Gly Leu Arg Gin Tyr Ser Gin Pro

Gin Phe - Y - Gly Gly Leu Phe Ala

Asp lie Ala Ser His Pro Trp Gin Ala Ala lie Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly

Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly lie Leu lie

Ser Ser Cys Trp lie Leu Ser Ala Ala His

Cys Phe Gin Glu Arg Phe Pro Pro His His

Leu Thr Val lie Leu Gly Arg Thr Tyr Arg

Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gin Lys Phe

Glu Val Glu Lys Tyr lie Val His Lys Glu

Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp lie

Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser Asp Ser Ser

Arg Cys Ala Gin Glu Ser Ser Val Val Arg

Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gin

Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser

Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro

Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His

Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr 5 102844

Ser Gin His Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr

Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg

Ser Gly Gly Pro Gin Ala Asn Leu His Asp

Ala Cys Gin Cly Asp Ser Gly Gly Pro Leu

Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu

Val Gly lie lie Ser Trp Gly Leu Gly Cys

Gin Gin Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr

Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp lie Arg

Asp Asn Met Arg Pro-COOH

jossa R on sidos tai

Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys

Val Leu Leu Leu Cys Gly Ala Val Phe Val

Ser Pro Ser Gin Glu lie His Ala Arg Phe

Arg Arg Gly Ala Arg,

Gly Ala Arg,

Met, tai

Met Gly Ala Arg; Y on Glu lie Lys; H2N- on aminopää; ja -COOH on karboksi-pää.

Esillä olevassa keksinnössä käytetään nimityksiä "parannettu t-PA [II], [V], [VI] ja [Vili] tarkoittamaan parannettua t-PA:a, jossa A ja B tarkoittavat vastaavasti seuraavia aminohappo j a.

A B

parannettu t-PA [II] Arg Lys parannettu t-PA [V] Arg Ile parannettu t-PA [VI] Glu Lys parannettu t-PA [VIII] Glu Ile 6 102844

Esillä olevan keksinnön keksijöiden löytämällä parannetulla t-PA:lla on erinomainen stabiilisuus lämmön ja happojen suhteen, selvästi pidentynyt biologinen puoliintumisikä ja lisäksi tulehdusta estävä aktiivisuus, kuten jäljempänä tullaan kuvaamaan samalla, kun on säilytetty luonnossa esiintyvän ihmisen t-PA:n halutut ominaisuudet.

Kuvio 1 esittää 16 oligodeoksinukleotidin emässekvenssiä, jota käytetään parannettua t-PA:a [II] koodaavan synteettisen geenipalan rakentamiseen.

Kuvio 2 esittää keksinnön mukaisen parannetun t-PA:n [II] rakentamiseen tarkoitettua synteettistä geenipalaa, joka sisältää kummassakin päässä restriktioentsyy-meille Bgl II ja Eco Rl saadut päät ja joka on rakennettu käyttämällä kuviossa 1 esitettyä 16 oligo-deoksinukleotidiä.

7 102844

Kuvio 3-1 esittää parannetun t-PA:n [II] rakentamistapaa.

Musta osa, vinoviivoitettu osa ja valkoinen mustalla-osa tarkoittavat kuviossa vastaavasti valmista t-PA-proteiinia koodaavaa aluetta, prepropetidiä koodaavaa aluetta ja ei-translaatioaluetta.

Kuvio 3-2 esittää menetelmää, jolla verifioidaan synteettisen geenin fragmentin blokki IV määrittämällä DNA-emäs-sekvenssi dideoksimenetelmäl1ä ja 7-DEAZA-menetelmäl1ä.

Kuvio 4 esittää menetelmää, jolla ekspressointivektori pVYi rakennetaan eläinsoluihin ja parannettu t-PA integroidaan pVYl-vektorin kanssa.

Kuviot 5-1 ja 5-2 esittävät DNA-emässekvenssejä, jotka vastaavasta! koodaavat parannettua t-PA:a [II] ja parannettua t-PA:a [V].

Kuviot 6-1 ja 6-2 esittävät aminohapposekvenssejä, jotka on saatu DNA-emässekvensseistä, jotka vastaavasti koodaavat parannettua t-PA:a [II] ja parannettua t-PA:a [V].

Kuvio 7 on restriktioentsyymi- ja funaktiokartta plasmidista pTPA2, jossa luonnossa esiintyvän t-PA-geenin Eco Rl-Xho-fragmentti (noin 1.000 emäsparia) on integroitu vektoriin pBR322 Eco Rl- ja Bam HI-katkaisukohtiin.

Kuvio 8 esittää plasmidia mp9 (parannettu t-PA [II], jossa parannetun t-PA:n [II] geenin Bgl II-Xho II-fragmentti (noin 1.500 emäsparia) on integroitu kaksisäikeiseen ml3mp9-DNA:aan Bam HI-katkaisukohdassa.

* 8 102844

Kuvio 9 esittää parannetun t-PA:n [VI] ja luonnossa esiintyvän t-PA:n t-PA-aktiivisuuden annos/vaste-käyrää S-2251-menetelmällä fibriinikorvikkeen läsnäollessa (+Fb) ja ilman sitä (-Fb).

Kuvio 10 esittää parannetun t-PA:n [VI] ja luonnossa esiintyvän t-PA:n aktiviisuuden muutosta kaniinin veressä ajan funktiona.

Kuvio 11 esittää parannetun t-PA:n [VI] jäännösaktiivisuuden muutosta lämpökäsittelyn jälkeen.

Kuvio 12 esittää parannetun t-PA:n [VI] inhibitiota LAF-aktiivisuuteen.

Kuvio 13 esittää parannetun t-PA:n [VI] aktivointia denaturoidulla proteiinilla.

Kuvio 14 esittää denaturoidun proteiiinin hajottamista parannetulla t-PA:lla [VI].

Jäljempänä kuvataan yksityiskohtaisesti valmistusmenetelmää, DNA-yhdisteitä ja transformoituja soluja, (parannetun t-PA:n valmistusmenetelmä).

t-PA-molekyyliä koodaava geeni, jota käytettiin esillä olevan keksinnön mukaisen parannetun t-PA-molekyylin valmistamiseeen, saatiin Bowes'in ihmismelanoomasoluista valmistetusta cDNA-pankista. PoIy(A)+ RNA eristettiin Bowes'in ihmismelanoomasoluista ja fraktioitiin sentrifugoimalla sakkaroosi-tiheys-gradientissa. Sen jälkeen otettiin pieni määrä fraktioitua ?oly(A)+ RNA:a ja t-PA-geeniä koodaava mRNA-jae tunnistettiin dot-hybridisointimenetelmällä käyttämällä oligonukleotidikoe-tinta, joka kykenee tunnistamaan t-PA-mRNA:n spesifisen sekvenssin. Käyttämällä lähtöaineena tätä t-PA mRNA-rikasta 9 102844 jaetta valmistettiin cDNA-pankki ja seulottiin koettimella, jota käytettiin edellä kuvatun t-PA-mRNA:n tunnistamiseen.

Koska ei eristetty yhtään kloonia, jolla oli täydellinen t-PA-geeni, parannetun t-PA-geenin rakentamiseen tarvittu loppuosa emässekvenssistä syntetisoitiin DNA-syntetisointi-laitteella halutun geenin rakentamiseksi. Sen jälkeen haluttu geeni rakennettiin paikkaspesifisellä mutatointi-indusointi-menetelmällä.

Luonnossa esiintyvän‘t-PA-geenin (noin 1.000 emäsparia), josta osa oli deletoitu N-päässä, Eco RI-Xho II-fragmentti vietiin plasmidin pTPA2 rakentamiseksi vektoriin pBR322 Eco Rl- ja Bam HI-katkaisukohtiin. Kanta (E. coli HB 101/pTPA2), joka on saatu transformoimalla E. coli tällä plasmidilla, on talennettu rekisteröintinumerolla P-9649 (FERMBP-2107) kokoelmaan: Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Science S Technology of Japan. Plasmiditn pTPA2 restriktio-entsyymi- ja toimintakartta on esitetty kuviossa 7.

Seuraavaksi tämä parannettu t-PA-geeni vietiin plasmidiin pVYl.

Plasmidi pVYl saadaan liittämällä plasmidin pKSVIO (valmistaja Pharmacia Fine Chemicals) noin 2.900 emäsparia pitkä Bam HI-Kpn I-fragmentti plasmidin pAdD26SV(A) n:o 3 (N) (plasmidin antoi . Dr. Hiroshi Handa, Tokion Yliopisto) Eco Rl :11a pilkottuun fragmenttiin molempien tasapäiden tekemisen jälkeen. Tämä vektori sisältää siten hiiren dihydrofolaattireduktaasi-cDNÄ-geenin adenovirusten (Ad2) suuren varhaispromoottorin transkription säätelyn alaisena, SV40-varhaispromoottorin ylävirtaan parannetun t-PA-geenin insertointikohdasta ja välisekvenssin eli intronin ja polyadenylointisekvenssin alavirtaan päin.

Esillä olevan keksinnön mukainen geeni sisältää parannetun t-PA:n tuottamiseen tarvittavan geneettisen informaation. Sen vuoksi geeni integroidaan sopivaan ekspressointivektoriin, 10 102844 integroitu ekspressointivektori viedään transformanttien valmistamiseksi sopivaan isäntäsoluun ja näin saadaan aikaan . ekspressoituminen. Parannettu t-PA voidaan näin tuottaa bio-teknologisesti. Isäntäsoluina voidaan käyttää prokaryoottisia soluja, kuten E. coli. Bacillus subti1is-bakteereita jne., eukaryoottisia mikro-organismeja, kuten hiivaa jne. ja korkeampien eläinten soluja. E. coli:na käytetään yleensä JM109-kantaa, W3110 Q-kantaa jne., jotka kuuluvat K12-kantaan; Bacillus subtilis-bakteerina käytetään BD170-kantaa, BR151-kantaa jne. Hiivana voidaan käyttää Saccharomyces cerevisiae-hiivan RH218-kantaa, SHYl-kantaa jne.

Isäntäsoluissa ekspressointia varten käytetään yleensä plas-midivektoria tai faagivektoria, joka sisältää isäntäsolujen kanssa yhteensopivista lajeista saadun replikonin ja säätely-sekvenssin. Kun sisäntäsoluna on E. coli. vektorista ovat esimerkkejä sellaiset plasmidit kuin pBR322, pUC18, pUC19 jne.; A-faagi, kuten Xgt, Charon 4A jne.; M13-faagi ja vastaavat. Bacillus subti1is-bakteeri11 e voidaan vektorina käyttää plasmideja pUBHO, pSA2100 jne., ja hiivalle tarkoitettu vektori voi olla YRp7, YEp61 jne.

Vektorissa on oltava promoottori, joka kykenee ekspressoimaan halutun proteiinin. E. coli-qeenille tai faagigeenille voidaan : promoottorina käyttää eismerkiksi seuraavai: lac. tro. tae.

tre. PL jne.

Siinä tapauksessa, että isäntä käytetään korkeampien eläinten vi1jelysoluja, käytetään rhesus-apinan munuaissoluja, moskiit-totoukan soluja, afrikkalaisen vihreän apinan munuaissoluja, hiirensikiön fibroblasteja, Kiinan hamsterin munasarjasoluja, ihmissikiön munuaissoluja, koin ovaaleja kudossoluja, ihmisen kaulan epiteelimäisiä soluja, ihmisen myeloomasoluja, hiiren fibroplasteja jne. Käytetty vektori voi olla SB40-varhais-promoottori, SV40-myöhäispromoottori, SV40:n sisältävä pro- 102844 moottori eukaryoottisesta geenistä (esimerkiksi estrogeeniä indusoiva linnun obalbumiinigeeni, interferonigeeni, glukokortikoidia indusoiva tyrosiini-aminotransferaanigeeni, tymidiinikinaasigeeni, adenoviruksen varhais- ja myöhäisgeenit, fosfoglyseraattikinaasigeeni, α-faktorigeeni jne.)/ naudan papi11oma-virus- tai sen johdannaisvektorit ja vastaava.

Lisäksi on tunnettua, että solujen erittämillä ja tuottamilla t-PA-molekyy1 ei 11ä on erilaisia N-päitä katkaisukohtien erosta johtuen-

Yleisesti tunnettuja N-terminaalisiä sekvenssejä ovat esillä olevan keksinnön mukainen aminohapposekvenssi, jossa symbolia R ei ole tai jossa symbolia R ei ole ja N-päästä on lisäksi lohkaistu 3 aminohappoa (Ser Tyr Gin) ja R-pää alkaa Val:iilla tai jossa R on Gly Ala Arg; ja vastaavat.

Siinä tapauksessa, että t-PA:a eritetään ja tuotetaan käyttämällä isäntänä viljelysoluja, katkaisutapa signaalipeptidaa-silla tai proteaasilla vaihtelee riippuen solujen laadusta, joten voi muodostua t-?Ä-moiekyyli1 ajeja, joilla on erilainen N-pää.

Tämä ilmiö ei koske vain erittämistä ja tuottamista viljely-soluilla vaan myös E. coli'n. Bacillus subtilis-bakteerin, hiivan ja muiden solujen tuottaman t-?A:n N-terminaalin uskotaan modifoituvan samalla tavalla.

S. coli'n tapauksessa voidaan isännän transformoimiseen, kun käytetään ekspressointivektoria, johon on integroitu parannettu t-PA-geeni, soveltaa Hanahan'in menetelmää [Hanahan, d., J.

Mol, biol, 166, 557 (1983)]; eläinsolujen tapauksessa voidaan soveltaa kalsiumfosfaatti-menetelmää [Van der Eb, A.J. ja Graham, F.L., Method in Enzymoiogy, 65., 326 (1980) Academic Press] jne.

« ,2 102844

Esillä olevassa keksinnössä selitetyllä DNA-sekvenssi Ilä ja plasmidilla voidaan tehdä erilaisia muunnelmia ja variaatioita. Geenin synonyymisyydestä johtuen on esimerkiksi mahdollista korvata nukleotidi polypeptidiä koodaavilia alueilla kauttaaltaan; samanaikaisesti on myös mahdollista korvata erityisesti TAA TAG' esimerkkinä annettu | | | tai | | 1 translaation terminaa-

A T T A T C

T G AN·

tiosignaali I I | translaation te'rminaatiosignaal i 1 la. Tä1 -ACT

lainen sekvenssi voidaan päätellä tällä hetkell tunnetusta ihmisen t-PA:n aminohappo- tai DNA-sekvenssistä ja se voidaan rakentaa tavanomaisella DNA-synteesimenetelmäl1ä. Esillä olevan keksinnön mukaisen geenin emässekvenssi ei siten missään mielessä rajoitu vain yhteen DNA-sekvenssiin.

Edellä on jo kuvattu, että parannettu t-PA on hyödyllinen hoidettaessa erilaisia hankittuja tauteja, joihin liittyy vasku-läarista koaguloitumista, mukaanlukien nk. deep vein-tautia, keuhkovaltimon veritulppaa, periieriavaltimon tromboosia, sydän- tai periieriavaltimo-peräistä emboliaa, akuuttia sydänlihaksen infarktia ja tromboottista kohtausta.

Luonnossa esiintyvän ihmisen t-?A:n lailla parannettu t-PA on erityisen hyödyllinen akuutin sydänlihaksen infarktin hoidossa. Kuten äskettäin on todistettu, luonnossa esiintyvä ihmisen t-PA liuottaa tehokkaasti sydänvaltimon tukkivan tukoksen, palauttaa virtauksen sydänlihaksessa ja parantaa useimmat osat iskeemi-sessä sydänlihaksen kerroksessa, kun sitä annetaan intravenöö-sisti 30 - 70 mg suuruisena annoksena 1-3 tunnin aikana.

: Parannetulla t-?A:lla on selvästi pidentynyt puoliintumisikä veressä, ja se on näin yhtä tehokas kuin luonnossa esiintyvä ihmisen t-PA. Parannetun t-?A:n odotetaan olevan kliinisesti' yhtä tehokas kuin luonnossa esiintyvän ihmisen t-PA:n annoksen 13 102844 ollessa noin 10 % luonnossa esiintyvälle ihmisen t-?A:lie suositellusta annoksesta, jopa yhtenä ainoana antokertana.

Esillä olevan keksinnön mukaisella parannetulla t-PA:lla on lisäksi seuraavat hyödylliset ominaisuudet, jotka ovat tähän mennessä tuntemattomia luonnossa esiintyvälle t-PA:lle tai modifioiduilie t-?A-molekyylei lie.

a) Tulehdusta estävä aktiivisuus

Trombin alueella voidaan havaita trombin muodostumisen lisäksi myös fibriinin hajoamistuotteiden muodostumista tai hiver.määriä kiniiniä jne. Näillä aineilla tiedetään olevan tulehdusta indusoiva aktiivisuus ja ne aiheuttavat siten tulehduksen trombin alueella. Tästä syystä on toivottavaa, että tromboosin hoitoon käytetyllä trombolyyttisellä aineella tulisi olla trombolyytti-sen aktiivisuuden lisäksi myös tulehdusta ehkäisevä aktiivisuus .

Laajojen tutkimustne tuloksena esillä olevan keksinnön keksijät ovat onnistuneet antamaan parannetulle t-?A:lle tulehdusta estävän aktiivisuuden, joka perustuu kahteen ominaisuuteen.

Toinen on se kokeellinen tosiasia, että parannettu t-PA estää interleukiini l:n (IL-1), joka on yksi tulehdusreaktion väli ttjäaineista, biologisen aktiivisuuden. Makrofaagissa muodostuneen IL-1:n uskotaan ottavan osaa tulehdusreaktioon kuumeen kautta, kiihdyttämällä fibroplastm kasvua, tuottamalla ko11ageneesia nivelvoidesolun membraamssa jne. tai nopeuttamalla prostasykliinin synteesiä verisuonen endo t ee11s o 1uis s a. Lisäksi on tunnettua, että IL-1 vaikuttaa maksasoluihm xnh-; dyttämällä proteiinien (seerumin amyloidiproteiini, fibnno- geeni jne.) tuottoa akuutissa faasissa, joka vahvistui tulehduksessa. Esillä olevan keksinnön keksijät ovat nyt havainneet, että parannettu t-?A inhiboi hiiren tymosyytm mytogee- • p 14 102844 nireaktiivisuutta lisäävää aktiivisuutta (LAF-aktrivisuus), joka on eräs inter!eukiini l:n biologisista ominaisuuksista.

Toinen ominaisuus on, että parannettu t-PÄ omaa affiniteetin denaturoidun proteiinin (denaturoitunut IgG, denaturoitunut albumiini jne.) suhteen, jota denaturoitumista tulehdus aiheuttaa trombin alueella, ja lisäksi parannetulla t-?A:lla on se ominaisuus, että denaturoitu proteiini aktivoi sen.

Tämän aktiivisuuden seurauksena parannettu t-PA ei vaikuta proteiiniin, joka ei ole denaturoitumassa, vaan se hajottaa tulehdusalueella vain denaturoitunutta proteiinia, ja tulehdus voi lievittyä. Esillä olevan keksinnön keksijät ovat SOS-geeli-elektroforeesianalyysin avulla vahvistaneet, että parannettu t-PA hajottaa vain denaturoitunutta proteiinia.

Kuten kuviossa 13 on esitetty, denaturoituneen proteiinin aiheuttama parannetun t-PA:n aktivoaimisaktiivisuus ja se-lektiivisyys ovat huomattavia. HCl-käsitel1yssä IgGrssa osoitettiin samanlainen aktiivisuus konsenträatiossa, joka oli yhden - useita kymmenesosia pienempi kuin 3rCN-käsitel 1yssä fibrinogeenissä. Toisaalta normaali IgG ei aiheuttanut parannetun t-?A:n aktivoitumista edes 500 ug/ml konsentraatiossa.

b) Uudel1eentukkeutumisen estäminen tukkeutuneen verisuonen avautumisen jälkeen

Tunnettua on, että kun tromboosi käsiteltiin luonnon-t-PA:1 la, tukkiintuneen verisuonen avautumisen jälkeen havaittiin suurella esiintymistaajuudella uudel1eentukkeutumista. Tästä syystä todellisessa tilanteessa on käytetty yhdistettyä hoitoa verihiutaleiden koaguloitumisinhibiittorilla tai antikoagulan-tilla. Yhdistelmähoidossa on kuitenkin ongelmina lääkeaineiden keskinäinen vaikutus, annostelun säätäminen, sivuvaikutukset jne. Toivottavampaa olisikin, että itse t-PA:11a olisi lisäksi 15 102844 aktiivisuus, joka estää uudel1eentukkeutumisen.

Esillä olevan keksinnön mukaisella parannetulla t-PA:lla on per se uudelleentukkeutumista estävä aktiivisuus, joka perustuu kahden tyyppiseen aktiviisuusmekanismiin.

Osa 1) Ensimmäinen mekanismi estää t-PA:n konsentraation nopean laskun parannetun t-PA:n antamisen jälkeen pidentyneestä säi-lymisajasta johtuen. Tällä tavoin päästään eroon uudelleensi-toutumisilmiöstä ja näin estetään uudel1eentukkeutumisen tapahtuminen.

Osa 2) Toinen mekanismi on, että estämällä interleukiini l:n aiheuttama verisuonten endoteelisolujen viottuminen, verihiutaleiden koaguloituminen estyy epäsuorasti ja näin estetään uudel1eentukkeutumisen tapahtuminen.

c) Lisääntynyt stabiilisuus

Proteiinivalmisteet ovat yleensä pysymättömiä valmisteet on siten säilytettävä pakkaskuivatussa tilassa tai alhaisissa lämpötiloissa liuoksena. Plasminogeeniaktivaattoria odotetaan annettavan akuutista sydänlihaksen infarktista kärsivälle potilaalle, ja tässä tapauksessa uskotaan olevan välttämätöntä, että kuolleisuuden alentamiseksi plasminogeeniaktivaattoria annetaan useita tunteja kohtauksen alkamisen jälkeen. Plas-minogeeniaktivaattori-valmisteita tulisi sen vuoksi säilyttää erilaisissa paikoissa. Paikasta riippuen voi olla, että alhaisessa lämpötilassa säilyttämiseen tarvittavat varusteet eivät ole käyttökelpoisia. Tällaisessa tapauksessa tarvitaan stabiileja valmisteita, jotka voidaan säilyttää huoneen lämpötilassa.

Kun stabiilisuus on parempi, on lisäksi mahdollista suorittaa lämpökäsittely, hapoilla käsittely jne. valmisteiden vaimistuk- 16 102844 sen aikana. Erityisesti, kun on kysymys esillä olevan keksinnön mukaisesta parannetusta t-PA:sta, joka on valmistettuni soluviljelyllä, tulee mahdolliseksi soluperäisten retrovirus-ten, joiden tiedetään kestävän heikosti kuumentamista, poistaminen.

Jäljempänä on esillä olevaa keksintöä kuvattu yksityiskohtaisemmin viitaten esimerkkeihin, mutta ei niihin rajoittuen. Rekombinantti-DNA valmistetaan jäljempänä olevan laboratorio-käsikirjan mukaisesti, ellei toisin ole mainittu.

Maniatis, t., et ai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Harbor, NY (1982)

Esimerkki 1. t-PA cDNA:n kloonaus

Bowes'in ihmismelanoomasoluja (solujen antaja Dr. R. Rblin, Natkonal Cancer Institute, USA) viljellään samalla tavoin kuin Opdenakker'in et ai. menetelmässä, [Opdenakker, g., et ai. Eur. J. Biochem., 131, 481-487 (1983)]. t-PA mRNA indusoimaan lisäämällä viljelmään TPA:a (12-O-tetradekanoyyliforboli 13-asetaatti) 100 mg/ml loppukonsentraatioon ja sen jälkeen viljelemällä 16 tuntia. Sen jälkeen solun kokonais-RNA poistetaan vi1jelysoluista modifioidulla Freeman'in et ai. menetelmällä [Okayama/Berg cDNA Manual, sivu 3 (1985), Pharmacia Fine Chemicals]. Poly(A)+ RNA erotetaan solun kokonais-RNA:sta käyttämällä oligo-dT seiluloosapylvästä (valmistaja Pharmacia Fine Chemicals). Tuloksena saadaan noin 400 μg poly(A)+ RNA:a noin 10® solusta.

: Tämä poly(A)+ RNA fraktioidaan tavalliseen tapaan sakkaroosi- tiheysgradientti-sentrifugoimalla. Osa fraktioidusta poly(A)+ RNA:sta dot-blot-hybridisoidaan [Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning, 410 (1984), John Wiley & sons, Inc.] käyttämällä t-PA mRNA-jakeen arvioimiseen t-PA mRNA:lie spe- 17 102844 sifistä oligonukleotidikoetinta. Tässä tapauksessa käytetyllä koettimella (koetin Y) on emässekvenssi 5'-GCTTGGCAAAGATGGCA-3', joka on kömpiementtinen mRNA-alueelle, joka koodaa Pennica'n et ai. suora raportoiman t-PA:n +291 -+297 aminohapposekvenssiä, ja joka on syntetisoitu fl.syanofosf-amidi-menetelmällä käyttämällä 380A DNA-syntetisointilaitetta (valmistaja Applied Biosystems). DNA-oligomeerin syntetisoiminen, suojaryhmän poistmainen, lohkaiseminen hartsista ja puhdistaminen suoritetaan Model 380A DNA-syntetisointilaitteen käsikirjan ohjeiden mukaisesti. Koetin Y leimataan radioaktiivisesta 5’-päässä laboratorio-ohjekirjan, sivu 122, mukaisesti käyttämällä T4 polynukleotidikinaasia (valmistaja Takara Shuzo Co., Ltd.) ja x-[32p] ATP:a.

Koetin Y hybridisoituu voimakkaasti pääasiallisesti 20 - 30S poly(A)* RNA:n kanssa (tätä jaetta kutsutaan M-jakeeksi).

Käyttämällä mallina 10 ug M-jakeesta saatua poly(A)’'' RNA:a syntetisoidaan 3 ug kaksisäikeistä cDNA:a käyttämällä kään-teistranskriptaasia (valmistaja Biochemical Industry Co., Ltd.) Gubler'in ja Hoffman'in menetelmällä (Gubler, U. ja Hoffman, b.J., Gene, 25., 263 (1983)]. Deoksi C-ketju lisätään kaksisäi-keiseen cDNA:aan sen 3'-päähän Deng'in ja Wu'n menetelmällä [Deng, G.R. ja Wu, R., Nucleic Acids Res., 9., 4173 (1981)]. Seuraavaksi kaksisäikeinen cDNA, johon deoksi C-ketju on lisätty, geelisuodatetaan CL4B Sepharose:1la (valmistaja Pharmacia Fine Chemicals), millä poistetaan pienimolekyyli-painoiset nukleiinihapot, joissa emäspareja on alle noin 500. Sen jälkeen cDNA liitetään plasmidiin pBR322 (valmistaja Bethesda Research), johon on tavalliseen tapaan lisätty deoksi G-ketju Pst I-kohtaan. Liittämisen jälkeen saatua seosta käyttämällä transformoidaan E. coli HB101 kompetenttisolut (valmistaja Takara Shuzo Co., Ltd.). Tuloksena saadaan cDNA-pankki, joka muodostuu noin 40.000:sta yksittäisestä trans-formantista.

18 102844 Tämä cDNA pesäkehybridisoidaan käyttämällä edellä kuvattua koetinta Y Woods'in menetelmällä [Woods, D. , Focus, 6.(3), 1 (1984); valmistaja Bethesda Research Lab.], jolloin saadaan Y-koettimen kanssa reagoineita klooneja. Näistä klooneista määritetään cDNA-alueen emässekvenssi kloonin, joka sisältää pisimmän t-PA cDNA:n, plasmidiin pTPAl nähden. Menetelmässä noudatettiin dideoksi-menetelmää [Carlson, J., et ai., J. Biotechnology, 1_, 253 (1984)] käyttämällä M13-faagivektoria ja 7-DEÄZA-menetelmää [Mizusawa, S., et ai., Nucleic Acids Res., 14. 1319 (1986)]. Tuloksena havaittiin, että plasmidi pTPAl sisälsi Pennica'n et ai. suora raportoiman t-PA-geenin emäs-sekvenssin kohdan +441:sta kohdan +2544:aan asti.

Esimerkki 2. Parannetun t-PA:n Tili rakentaminen

Esimerkissä 1 esitetyssä plasmidissa pTPAl on N-terminaalinen alue riittämätön t-PA:n (parannettu) [II] rakentamiseen, josta kringle 1-alue on deletoitu. Sen vuoksi tämä riittämätön DNA-sekvenssi syntetisoidaan edellä kuvatulla tavalla käyttämällä 380A DNA-syntetisointilaitetta (valmistaja Applied Biosystems). Syntetisoidun oligomeerin emässekvenssi ja koko syntetisoitu sekvenssi on esitetty vastaavasti kuvioissa 1 ja 2. Kuvioissa 3-1 ja 3-2 on lisäksi vastaavasti esitetty ne spesifiset menetelmät, joilla parannettu t-PA [II] rakennettiin näitä oligomeerejä käyttämällä.

2-1) Blokin IV rakentaminen (Bql II-Eco Rl-fraamentti. noin 380 emäsoaria)

Kuvion 3-1 blokki IV-fragmentti valmistetaan seuraavasti.

Ensin fosforyloidaan laboratoriokäsikirjän, sivu 122, mukaisesti 40 pikomoolia kutakin synteettistä oiigonukleotidiä 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ja 15, kuvio 1, 10 yksiköllä T4-polynukleotidikinaasia (valmistaja 19 102844

Takara Shuzo Co., Ltd.) 37°C;ssa tunnin aikana 50 ulissa kutakin reaktioliuosta. Reaktioliuos käsitellään fenolilla. Etanolilla saostamisen jälkeen sakat kuivataan alipaineessa ja liuotetaan steriiliin tislattuun veteen. 40 pikomoolia kutakin oligomeeriä annettiin seistä 150 ulissa liuosta, jonka koostumus olii 7 mM Tris-Hcl (pH 7,5), 20 mM NaCl, 7 mM MgCl2 ja 0,1 mM EDTA, 80°Cissa 5 minuuttia, 60°Cissa 5 minuuttia ja huoneen lämpötilassa 1 tunti vastaavissa blokeissa, blokki I (oligomeerit 1, 2, 3 ja 4), blokki II (oligomeerit 5,6, 7, 8, 9 ja 10) ja blokki III (oligomeerit 11, 12, 13, 14, 15 ja 16), minkä jälkeen saostetaan etanolilla ja kuivataan alipaineessa. Jäännös liuotetaan 40 pilaan steriiliä tislattua vettä. Reaktio suoritetaan 4°C:ssa 15 tunnin aikana 400 ulissa reaktioliuosta käyttämällä DNAin ligatointikittiä (valmistaja Takara Shuzo Co., Ltd.). Saostetaan etanolilla ja kuivataan alipaineessa, minkä jälkeen jäännös liuotetaan steriiliin tislattuun veteeni blokin I (1) tapauksessa geelielektroforee-si suoritetaan 5-prosenttisella polyakryyliamidilla (Laboratory Manual supra, sivu 173) ja erotetaan ja eristetään tavalliseen tapaan noin 100 emäsparia pitkä fragmentti (Laboratory Manual supra, sivu 178); ja blokin II (2) ja blokin III (3) tapauk-sessa geelielektroforeesi suoritetaan 3-prosenttisel1 a aga-roosigeelillä (LMP agaroosi, valmistaja BRL) (Laboratory Manual supra, sivu 150) ja erotetaan ja eristetään vastaavasti noin 190 emäsparin fragmentit elektroeluoimalla (Laboratory Manual supra, sivu 164).

Seuraavaksi ligatoidaan edellä mainittua DNAin ligatointikittiä käyttämällä vastaavasti 0,1 μΐ, 0,2 ug ja 0.2 ug blokin I, blokin II ja blokin III fragmenttia. Tämän jälkeen geelielek-troforeesi suoritetaan 1,5-prosenttisella agaroosilla, millä erotetaan noin 480 emäsparin Bgl II-Eco Rl-fragmentti (blokki ^ IV). Tämän jälkeen DNA eristtetään agaroosigeelistä elektro-eluoimalla. Tämä DNA fosforyloidaan edelleen 100 ulissa reaktioliuosta 37°Cissa 1 tunnin aikana käyttämällä 10 • 20 102844 yksikköä edellä mainittua T4-polynukleotidikinaasia ja tämän jälkeen käsitellään fenolilla, saostetaan etanolilla ja kuivataan alipaineessa.

Tämä synteettinen geenisegmentti ja blokin IV emässekvenssi varmistetaan määrittämällä emässekvenssidideoksimenetelmällä käyttämällä M13-faagivektoria ja 7-DEAZA-menetelmää. Spesifiset menetelmät on esitetty kuviossa 3-2. Sen jälkeen, kun edellä kuvattu blokin IV Bgl II-Eco Rl-fragmentti on ligatoitu M13mpl8 DNA:n kanssa (valmistaja Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.), pilkottu restriktioentsyymeillä Bam HI (valmistaja Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.) ja Eco Rl (valmistaja Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.) käyttämällä edellä kuvattua DNA:n ligataointikittiä, sen emässekvenssi määritetään käyttämällä M13 sekvenssikittiä (valmistaja Takara Shuzo Co., Ltd.) ja 7-DEAZA-sekvenssikittiä (valmistaja Takara Shuzo Co., Ltd.).

Restriktioentsyymien Bgl II katkaisukohta ja Bam HI-katkaisu-kohta liitetään isohitsomeeri-toisiintumisen kautta [Bam HI-

^Xho II G tGATCT

katkaisupää *.....- Bgl II :n katkaisukohta].

C CTAQA

Ligatoitu fragmentti voidaan katkaista restriktioentsyymillä Xho II, jolloin saadaan vastaavasti alkuperäinen Bgl II-katkaisupää ja Bam HI-katkaisupää.

Jotta emässekvenssi voitaisiin määrittää tarkemmin, M13mpl8 (mukaanlukien blokki IV-fragmentti)-faagi infektoidaan edelleen >. E. coli JM109-kantaan Messing'in menetelmällä [Messing, J.,

Methods in Enzymology, 101. 20-78 (1983)] ja valmistetaan sen jälkeen kaksisäikeinen DNA (replikointityyppi). Sen jälkeen, kun tämä DNA (50 ug valmistetusta DNA:sta) on katkaistu restriktioentsyymeil lä Cho II (valmistaja Boehringer-Mannheim- 21 102844

Yamanouchi Co., Ltd.) ja Eco RI, suoritetaan geel iel ektro-foreesi 1,5-prosenttisella agaroosilla noin 480 emäsparin framgentin (blokki IV) erottamiseksi. Tämä DNA otetaan talteen elektroeluoimalla. Sen jälkeen, kun talteenotettu DNA on ligatoitu M13mpl9-DNA:n (valmistaja Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.) kanssa, joka on katkaistu restriktiko-entsyymeillä Eco Rl ja Bam HI, edellä kuvatulla tavalla käyttämällä DNA:n ligatointikittiä, määritetään emässekvenssi. Edellä kuvatulla tavalla sen täsmällinen emässekvenssi voidaan osoittaa määrittämällä molemmat DNA-sekvenssit käyttämällä M13mpl8:a ja M13mpl9:a. Edellä kuvatulla menetelmällä valmistetaan lisäksi M13mpl9:n (mukaanlukien blokki IV) kaksisäi-keinen replikatiivinen DNA. Tämä DNA (50 ug valmistetusta tuotteesta) lohkaistaan restriktioentsyymillä Eco Rl ja Xho II, minkä jälkeen suoritetaan’geelielektroforeesi 1,5-prosenttisel la agaroosilla ja erotetaan noin 480 emäsparin fragmentti (blokki IV). DNA eristetään elektroeluoimalla.

2-2) Blokin V eristäminen (Eco RI-Bal I-fraomentti. noin 1250 emäsparia)

Esimerkissä 1 saadusta kloonista pTPAl valmistetaan suuria määriä plasmikdi-DNA-molekyylejä laboratoriokäsikirjassa, supra. sivu 86, kuvatulla menetelmällä, kuten on esitetty kuviossa 3-1. Tätä DNA:a pilkkotaan 70 ug restriktioentsyy-meillä Bal I (valmistaja TAkara Shuzo Co., Ltd.) ja Nar I (valmistaja Nippon Gene Co., Ltd.), minkä jälkeen suoritetaan geelielektroforeesi 0,8-prosenttisel1 a agaroosilla Nar I-Bal I-fragmentin (noin 1540 emäsparia) erottamiseksi. DNA eristetään elektroeluoimalla. Tämä DNA pilkotaan osittain restriktioent-syymillä Eco Rl, minkä jälkeen suodatetaan geelielektroforeesi : 0,8-prosenttisella agaroosilla Eco RI-Bal I-fragmentin (noin 1250 emäsparia) erottamiseksi. DNA eristetään elektroeluoimal la.

2-31 Parannettu t-PA:n Till geenin rakentaminen blokista V ia

blokista IV

22 1 0 2 8 4 4

Kuviossa 3-1 esitetyllä tavalla valmistetaan parannetun t-PA:n geeni seuraavalla tavalla.

Sen jälkeen, kun blokki IV (Bgl II-Eco Rl-fragmentti, noin 480 emäsparia), joka on saatu esimerkiss 2-1), on ligatoitu esimerkissä 2-2) saadun blokin V kanssa (Eco RI-Bal I-fragmentti, noin 1250 emäsparia) käyttämällä edellä kuvattua DNA:n liga-tointikittiä, ligatoitu tuote seostetaan etanolilla. Alipaineessa kuivaamisen jälkeen sakka pilkotaan tavalliseen tapaan restriktioentsyymillä Cho II. Sen jälkeen Bgl-Xho II-fragmentti (noin 1.500 emäsparia) sisältää parannetun t-PA:n geenin) suorittamalla geelielektroforeesi 0,8-prosenttisella agaroosi-geelillä. Tämän jälkeen DNA eristetään elektroeluoimalla. näin rakennetun parannetun t-PA:n [II] geenin koko emässekvenssi on esitetty kuviossa 5. Kuviossa 6 on esitetty myös johdettu aminohapposekvenssi.

Esimerkki 3. Parannettujen t-PA-molekyylien Γνΐ. TVI1 ia TVIIIl geenin rakentaminen

Parannettujen t-PA-molekyylien [V], [VI] ja [VIII] geenin rakentamiset suoritetaan parannetun t-PA:m [II] geeniin perustuen viittaaamalla seuraaviin julkaisuihin.

Haluttu geneettinen muuntaminen suoritetaan paikkaspesifisellä mutatointi-indusointimenetelmällä.

Julkaisut:

Zoller, M.J. ja Smith, M., Method in Enzymology, 100.

468-500 (1983); Zoller, M.J. ja Smith, M., DNA, 3_, 479-488 (1984); Morinaga, Y., et ai., Bio/technlogy 23 102844 636-639 (heinäkuu 1984); Adelman, J.P., et ai., DNA, 2., 183-193 (1983); M13/pDC Sequence Manual [Nippon Gene Science Room Co., Ltd.] 3-1) Parannetun t-PA:n ΓV1 geenin rakentaminen A) M13mp9:n (parannettu t-PA Tili) ioka kykenee indusoimaan mutaation, rakentaminen

Esimerkissä 2, 2-3) yksityiskohtaisesti kuvattu parannetun t-PA:n [II] geenitragmentti ligatoidaan restriktioentsyymillä bam HI ja alkalisella fosfataasilla (valmikstaja Takara Shuzo Co., Ltd.) käsitellyn kaksisäikeisen M13mp9 DNA:n kanssa käyttämällä edellä kuvattua DNA:n ligatointikittiä. Edellä kuvattu ligatointituote transfektoidaan E. coli JMl09-kompe-tentteihin soluihin (valmistaja Takara Shuzo Co., Ltd.). Saadun värittömän faagiplakin jokainen klooni infektoidaan E. coli JM109-kantaan. Yksisäikeinen DNA eristetään viljelysuperna-tantista ja kaksisäikeinen (repiikatiivinen) DNA eristetään E. coli-soluista Messing'in menetelmällä [Messing, J., Methods in Enzymology, 101. 20-78 (1983)]. Restriktioentsyymillä (Pst I) suoritetun pilkkomisen jälkeen kaksisäikeiset DNA:t analysoidaan agaroosigeelielektroforeesin avulla, jolloin saadaan klooni mp9 (parannettu t-PA [II]), jossa parannettu t-PA [II] on insertoitu mp9:n DNA:aan halutun suuntaisesti, kuten on esitetty kuviossa 8.

So. osa näistä DNA-molekyyleistä pilkotaan restriktioentsyy-millä Pst I, minkä jälkeen suoritetaan geelielektroforeesi 0,8-prosenttisella agaroosilla, jolloin saadaan klooni mp9 (parannettu t-PA [II]). Sillä on yksi ainoa vyöhyke vastaavasti noin 7.300 emäsparin kohdalla, noin 840 emäsparin kohdalla, noin 430 emäsparin kohdalla ja noin 80 emäsparin kohdalla. Tämän kloonin yksisäikeistä DNA:a käytetään myöhemmässä kokeessa indusoitaessa paikkaspesifinen mutaatio.

24 102844 B) Paikkaspesifisen mutaation indusoimaan kykenevän primeerin synteesi

Synteettinen oiigonukleotidi, jota käytetään parannetun t-PA:n [II] geenin paikkaspesifiseen mutatointiin, syntetisoidaan B.syanoetyylifosfoamidi-menetelmällä käyttämällä Model 380A DNA-syntetisointilaitetta (valmistaja Applied Biosystems). DNA-oligomeerin synteesi, suojaryhmän poistaminen, irrottaminen hartsista ja puhdistaminen suoritetaan Model 380A DNA Synthesizer-laitteen käsikirjan ohjeiden mukaisesti. Mutaation indusoimiseksi spesifisessä paikassa valmistetaan primeeri (l? , joka kykenee indusoimaan seuraavan paikkaspesifisen mutaation, ja primeeri (2) , jota käytetään sekvensoimaan dideoksi-mene- telmällä käyttämällä M13-faaagivektoria [Carlson, J., et ai., J. Biotechnology, 1., 253 (1984)].

Parannetun t-PA.n [II] Gin ρ^β LyS G^y G^y 1<eu aminohapposekvenssi: Phe

Parannetun t-PA:n [II] „ CA(, TTT CGC ATC GGA GGG

DNA-sekvenssi: CTC TTC GC

Mutaation indusointiin Ile

tarkoitetun primeerin© 5'T CAG TTT CGC ATC ATA GGA GGG

CTC TTC GC 3' DNa-sekvenssi:

Sekvensointiin tarkoitetun primeerin £2) 5. GCA GGC TGA CGT GGG AG 3 > DN-sekvenssi:

Parannetun t-PA:n [II] aminohapposekvenssi ja geenisekvenssi on kuvattu edellisellä kahdella rivillä. Mutatoinnin indusoimiseen kykenevä primeeri @ eroaa alleviivatun emäksen osalta parannetun t-PA:n [II] geenisekvenssistä.

25 102844 cl Paikkaspesifisen mutaation indusointi Jäljempänä on esitetty eräs tapa rakentaa klooni, joka sisältää mutatoinnin indusoimaan kykenevän primeerin Q emässekvens-sin, so. parannetun t-PA:n [V] geenin. Esimerkissä 3, 3-1), A) kuvatun mp9:n (parannettu t-PA [II]) yksisäikeisen DNA:n ja mutatoinnin indusoimaan kykenevän primeerin φ liittämisen jälkeen liitetty tuote muunnetaan kaksisäikeiseksi DNA:ksi, joka sen jälkeen transformoidaan E. coli JM109:ssa. Käyttämällä sekvensointiin tarkoitettua primeeriä seulotaan seu-raavaksi DNA-sekvenssoinnin avulla ja eristetään faagiklooni, joka sisältää mutatoidun parannetun t-PA:n [II] geenin, so. parannetun t-PA:n [V] geenin. Tästä kloonista valmistetaan kaksisäikeinen (repiikatiivinen) faagi-NA ja eristetään tämä parannetun t-PA:n [V] geeni.

Synteettisen oliaomeerin 51-terminäsiinen fosforyjaatio

Paikkaspesifisen mutatoinnin indusoimiseen tarkoitetun primeerin Φ fosforyloidaan esimerkissä 2, 2-1) kuvatulla menetelmällä.

Heterodupleksin DNA:n valmistaminen 0,5 ug yksisäikeistä M13mp9:n (parannettu t-PA [II]) DNA:a ja

1,5 ug kaksisäikeistä M13mp9:n DNA:a, joka on pilkottu res-triktioentsyymillä Bam HI, kuumennetaan 90°C:ssa (2 minuuttia), 50°C;ssa (5 minuuttia), 37°C;ssa (5 minuuttia) ja huoneen lämpötilassa (10 minuuttia) 30 ul:ssa laiuosta, joka sisältää 2 pikomoolia mutatoinnin indusoimiseen tarkoitettua fosforyloitua primeeriä (?) , 10 mM Tris-HCl:a (pH 7,5), 0,1 mM EDTA:a ja 50 mM NaCl:a. Liuokseen lisätään 36 μΐ 50 mM Tris-HCl (pH 8,0)-liuosta, jonka koostumus on 4 yksikköä Klenow’in entsyymiä, 7 yksiiikö T4 DNA ligaasia, 0,1 mM EDTA, 12 mM MgCl2, 10+ mM ditiotreitoli, 0,7 mM ATP, 0,07 mM dATP ja 0,2 mM

26 102844 kutakin dGTPrtä, dTTP:tä ja dCTP:tä, primeerin jatkamisen käynnistämiseksi. Reaktioseoksen annetaan reagoida 20°C:ssa 20 tuntia ja 4°C:ssa 15 tuntia.

Transformointi suoritettiin käyttämällä edellä kuvattua liuosta ja S. coli JM109-kompetenttisoluja (valmistaja Takara Shuo Co., Ltd.) plakin muodostamiseksi. Värittömän plakin poimimisen jälkeen faagi infektoidaan E. coli JM109-soluihin sen lisääntymistä varten. Sen jälkeen kunkin kloonin viljelysupernatan-tista muodostetaan yksisäikeinen DNA-malli. Näille yksisäi-keisille DNA-molekyyleille suoritetaan vain dideoksi-menetel-män reaktio "T" [Reaktiot "A" ja "T" esimerkissä 3-2] käyttämällä sekvensoitiin primeeriä ^2^ , minkä jälkeen ajetaan polyakryyliamidigeelielektroforeesi. Kuivaamisen jälkeen geeni analysoidaan autoradigrafiän avulla. Tulosten perusteella tunnistetaan klooni, jossa on haluttu mutaatio-sekvenssi. Tämän kloonin edellä kuvattu viljelysupernatantti infektoidaan E. coli JM109-kantaan ja siirrostetaan maljalle ja uudelleen eristetään yksi ainoa plakki. Tämän yhden ainoan plakin saadusta kloonista valmistetaan edellä kuvatulla tavalla yksisäikeinen DNA. Näitä DNA-molekyylejä käyttämällä määritetään ensin DNA:n emässekvenssi dideoksimenetelmäl1ä käyttämällä sekvenssointiin primeeriä (Q , jolloin saadaan klooni, jonka emässekvenssi on mutgatoitu halutunlaiseksi. Sen jälkeen, kun tämä faagiklooni on infektoitu E. coli JM109-kantaan käyttämällä esimerkissä 2 kuvattua Messing'in menetelmää valmistetaan kaksisäikeinen DNA. Tämä kaksisäikeinen DNA pilkotaan restriktioentsyymi1lä Xho II, minkä jälkeen suoritetaan geelielektroforeesi 0,8-prosenttisel1 a agaroosilla ja eris-: tetään noin 1.500 emäsparin fragmentti (parannettu t-PA [V] geeni), joka sisältää parannetun t-PA:n geenin. Sen jälkeen DNA otetaan talteen elektroeluoimalla.

Näin muodostetusta DNA:sta määritetään lisäksi koko emässekvenssi dideoksimenetelmällä, jolloin saadaan varmistettua, 27 102844 * että DNA on parannetun t-PA:n [V] geeni. Kuviossa 5-2 on esitetty näin rakennetun parannetun t-PA:n [V] geenin koko emässekvenssi (sisältäen kuitenkin signaalipeptidin -35 --1). Kuviossa 6-2 on myös esitetty tästä johdettu aminohappo-sekvenssi .

3-21 Parannettujen t-PA-molekvylies [Vll ja [Viili rakentaminen

Parannetun t-PA:n [ΓI] Gin Pro Gin Phe Arg Ile Lys Gly aminohapposekvenssi:

Parannetun t-PA:n [II] GC CAG CCT CAG TTT CGC ATC AAA

DNA-sekvenssi: GGA GGG C

Mutaation indusointiin 5'gC CAG CCT CAG TTT GAA ATC AAA

tarkoitetun primeerin GGA GGG C 3' DNa-sekvenssi: ....... Glu Ile

Sekvensointiin tarkoi- 5«GC CAQ CCT ttt ATC ATA

tetun primeerin (?) GGA GGG C 3' DN-sekvenssi:

Menetelmät ovat samat kuin mitä on kuvattu esimerkissä 3, 3-1). Ensin rakennetaan mutatoinnin indusoitiin tarkoitettu : M13mp9 (parannettu t-PA [II]) ja sen jälkeen syntetisoidaan paikkaspesifisen mutaation indusoimiseen tarkoitetut primeerit. Näiden primeerien emässekvenssi on kuvattu edellä, mutta parannetun t-PA:n [VI] geenin ja parannetun t-PA:n [VIII] geenin rakentamiseen käytetään vastaavasti 5'-päässä fosfory1oitua : primeeriä (S) mutaation indusointia varten ja 51-päässä fosforyloitua primeeriä parannetun t-P [VIII] geenin rakentamiseen, paikkaspesifisen mutaation indusoinnin jälkeen määritetään lisäksi koko emässekvenssi dideoksi-menetelmäl1ä ja saadaan vahvistetuksi, että niillä on halutut emässekvenssit. Näin on saatu valmistettua parannetut t-PA-molekyylit [VI] ja 28 102844 cVIOII].

Seuraavaksi nämä geenit integroidaan vektoriin pVYl esimerkeissä 4 ja 5 yksityiskohtaisesti kuvatuilla menetelmillä.

Esimerkki 4. Parannetun t-PA:n ΓΙΠ geenin integrointi vektoriin pVYl 4-1) Vektorin t>VY1 rakentaminen

Vektori pVYl rakennetaan kuviossa 4 esitetyllä tavalla.

A) PAd P26 SV f A) No. 3(N):n rakentaminen ia Eco RI-katkaisu-kohdan teko tasapäiseksi.

Ensin pilkotaan tavalliseen tapaan pAd D26 SV(A) no. 3:n [luovuttaja Dr. Hiroshi Hand, Tokion Yliopisto; esitetty väitöskirjassa, Mol. Cell. Biol., 2.(11), (1982)] DNA-res-triktioentsyymillä Bgl II (valmistaja Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.). Seuraavaksi DNA tehdään tasapäiseksi tavalliseen tapaan käyttämällä Klenow'in entsyymiä (valmistaja . Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.). Fenolilla käsittelyn, etanolilla saostamisen ja alipaineessa kuivaamisen jälkeen liuotetaan sakat tislattuun steriiliin veteen. Liga-tointi suoritetaan käyttämällä edellä kuvattua DNA:n liga-tointikittiä, minkä jälkeen E. coli HBlOl-kompetentit solut (valmistaja Takara Shuzo Co., Ltd.) transformoidaan. Plasmidi-DNA:t saadaan tavalliseen tapaan transformanteista, jotka on tetrasykliiniresistenttejä.

Osa näistä DNA-molekyyleistä pilkotaan restriktioentsyymi11ä Bgl II, minkä jälkeen suoritetaan geelielektroforeesi 0,7-prosenttisel1 a agaroosilla. Tuloksena saadaan klooni, jossa on Bgl II:11a pilkkomaton DNA. Tämän kloonin DNA [pAd D26 SV(A) 29 102844

No. 3(N)-plasmidi] restriktioentsyymi11ä Eco Rl suoritetun normaalin pilkkomisen jälkeen DNA tehdään tasapäiseksi Klenow’in entsyymillä tai mung-pavun nukleaasilla (Pharmacia) edellä kuvatulla tavalla. Fenolikäsittelyn, etanolilla saostamista ja alipaineessa kuivaamisen jälkeen liuotetaan sakat tislattuun veteen.

B) Kon Ι-Bam HI:n (noin 2.900 emäsparia) eristäminen pKSV 10:sta ia tasapäiseksi teko pKSV 10:n (valmistaja Pharmacia Fine Chemicals) DNA pilkotaan restriktioentsyymeillä Κρη I ja Bam HI tavalliseen tapaan, minkä jälkeen DNA tehdään tasapäiseksi käyttämällä T4 DNA-polymeraasia (valmistaja Takara Shuzo Co., Ltd.) ja Klenow'in entsyymiä (Laboratory Manual, sivut 114-121). Seuraavaksi erotetaan noin 2.900 emäsparin fragmentti suorittamalla geeli-elektroforeesi 0.7-prosenttisella agaroosilla. Sen jälkeen DNA otetaan fragmentista talteen elektroeluoimalla.

C) pVYl:n rakentaminen

Ligatoidaan kohdassa A) saatu DNA-fragmentti ja kohdassa B) saatu DNA-fragmentti käyttämällä DNA:n ligatointikittiä, minkä jälkeen E. coli HB101 kompetentit solut (kuvattu edellä) trans-: formoidaan ligatoidulla tuotteella.

Transformanteista, jotka ovat tetrasykliiniresistenttejä, valmistetaan tavalliseen tapaan plasmidi-DNA:t. Osa näistä plas-midi-DNA-molekyyleistä pilkotaan restriktioentsyymillä Pst I (valmistaja Boehringer Mannheim-Yamanouchi Co., Ltd.) tavalliseen tapaan, minkä jälkeen suoritetaan elektroforeesi 1,0-prosenttisella agaroosigeeli11ä. Tuloksena saadaan klooni (plasmidi pVYl), jolla on vyöhykkeet noin 3.400 emäsparia, noin 3.200 emäsparia ja noin 1.400 emäsparia. Tämä klooni E. coli HB101/pVYl on tallennettu rekisteröintinumerolla P-9625 (FERM BP 2106) kokoelmaan: Permentation Research Institute of the 30 102844

Agency of Industrial Science & Technology of Japan.

4-2) Parannetun t-PA;n fill geenin integrointivektoriin pVYl

Esimerkissä 4-1) valmistettu pVYl-plasmidin DNA pilkotaan tavalliseen tapaan restriktioentsy'ymi 11 ä Bgl II, minkä jälkeen defosforyloidaan alkalisella fosfataasilla (valmistaja Takara Shuzo Co., Ltd.). Tämän jälkeen käsitellään fenolilla kolme kertaa. Etanolilla saostamisen ja alipaineessa kuivaamisen jälkeen liuotetaan sakat tislattuun steriiliin veteen.

Tämä DNA ligatoidaan esimerkissä 3, 3-1) valmistetun Bgl II-Xho II-fragmentin (noin 1.500 emäsparia) kanssa käyttämällä DNA:n 1igatointikittiä, minkä jälkeen E. coli HB101 kompetentit solut transformoidaan ligatointituotteella edellä kuvatulla menetelmällä. Plasmidi-DNA:t saadaan tavalliseen tapaan transformanteista, jotka ovat tetrasykliiniresistent-tejä. Nämä DNA:t pilkotaan restriktioentsyymeillä (Bgl II, Pst I), minkä jälkeen valitaan agaroosigeelielektroforeesi-kuvion perusteella klooni, jossa parannetun t-PA:n [II] geeni on integroitunut vektoriin pVYl halutussa suunnassa. Ensiksi pilkotaan osa näistä DNA-molekyyleistä restriktioentsyymil1ä Bgl II ja sen jälkeen suoritetaan elektroforeesi 0,8-prosent-; tisella agaroosigeeli1lä ja näin saadaan klooni, jolla on noin 1.500 emäsparin fragmenttia vastaava vyöhyke. Kun Bgl II-Xho ΙΙ-fragmentti ligatoidaan pBYl:n Bgl II-fragmentin kanssa, voidaan restriktioentsyymillä Bgl li pilkkoa pois Xho II:n ja Bgl II:n ligatoitu osa.

Osa näiden kloonien plasmidi-DNA:sta pilkotaan edelleen restriktioentsyymil lä Pst I ja DNA:t käsitellään elektroforeesilla 0,8-prosenttisella agaroosigeelillä, jolloin saadaan klooni, jolla on yksi vyöhyke noin 3.400 emäsparin kohdalla, kaksi vyöhykettä noin 2.300 emäsparin kohdalla, yksi vyöhyke noin 1.400 emäsparin kodhalla ja yksi vyöhyke noin 80 emäs- 31 102844 parin kohdalla. Tätä kloonia käyttämällä (plasmidi pVYl-t-PA [II]) massavalmistetaan plasmidi-DNA-molekyylejä edellä kuvatun laboratoriokäsikirjän, sivu 86, mukaisesti.

Esimerkki 5. Parannetun t-PA:n fVl. Γνΐΐ ia [Villi geenien integrointi vektoriin pVYI

Esimerkissä 4-1) valmistettu pVYl-plasmidin DNA pilkotaan restriktioentsyymillä Bgl II tavalliseen tapaan, minkä jälkeen defosforyloidaan alkalisella fosfataasi1 la (valmistaja TAkara Shuzo Co., Ltd.), käsitellään 3 kertaa fenolilla, saostetaan etanolilla ja kuivataan alipaineessa. Tämän jälkeen jäännös liuotetaan tislattuun veteen.

Tämän jälkeen tämä DNA ligatoidaan esimerkeissä 2, 2-3) valmistetun Bgl II-Xho II-fragmentin (noin 1.500 emäsparia) kanssa kätytämällä DNA:n 1igatointikittiä ja ligatointituote transformoidaan edellä mainittuihin E. coli HBlOl-kompetenttisolui-hin. Plasmidi-DNA:t saadaan tavalliseen tapaan transforman-teista, jotka ovat etrasykliiniresistenttejä. Nämä DNA:t pilkotaan restriktioentsyymeillä (Bgl II, Pst I), minkä jälkeen suoritetaan agaroosigeelieiektroforeesi. Agaroosigeelielektro-foreesin kuvioanalyysin perusteella valitaan ne kloonit, joissa parannetun t-PA:n [V] geeni on liittynyt halutussa suunnassa vektoriin pVYI. Osa näistä DNA-molekyyleistä pilkotaan restriktioentsyymil lä Bgl II, minkä jälkeen suoritetaan elektroforeesi 0,8-prosenttisel1 a agaroosigeelillä, jolloin saadaan klooneja, joissa on noin 1.500 emäsparin fragmenttia vastaava vyöhyke. Kun Bgl II-Xho ΙΙ-fragmentti on sitoutunut pVYl:n Bgl : II-fragmenttiin, sitoutunut Xho II ja Bgl II-osa voidaan lohkaista restriktioentsyymillä Bgl II edellä mainitusta isoshitsomeeri-konfiguraatiosta johtuen.

Osa näiden kloonien plasmidi-DNA-molekyyleistä pilkotaan vielä restriktioentsyymillä Pst I, minkä jälkeen elektroforesoidaan 32 102844 O.8-prosenttisella agaroosigeelillä. Näin saadaan klooni, jolla on yksi vyöhyke vastaten noin 3.400 emäsparia, yksi vyöhyke vastaten noin 2.300 emäsparia, kaksi vyöhykettä noin 1.400 emäsparin kohdalla, yksi vyöhyke noin 800 emäsparin kohdalla ja yksi vyöhyke noin 80 emäsparin kohdalla. Kloonia käyttämällä (plasmidi pVYl-t-PA [V]) valmistetaan suuria määriä plasmidi-DNA:a edellä mainitun laboratoriokäsikirjän, sivu 86, mukaisesti.

Samalla tavoin integroidaan parannetun t-PA:n [VI] ja [VIII] geenit vektoriin pVYl.

Esimerkki 6. Parnnetun t-PA:n eksoressointi CHO-soluissa

Plasmidin pVYl parannetun t-PA:n [VI] geeni (t-PA [II], t-PA [V], t-PA [VI] tai t-PA [VIII]) trans fektoidaan DHFR-vajäisiin CHO-soluihin (Urlabu, et ai., Proc. natl Acad. Sei. USA, 77(7). 4216-4220 (1080)] kalsiumfosfaattimenetelmällä [Graham et ai., Virology, 52., 456 (1973)]. Transformantti-kloonin, joka on saatu seiektointialustasta [MEM ALPHA (-), GIBCO] metotreksaatin (MTX) läsnäollessa, havaitaan tuottavan 50 - 100 U/ml t-PA-aktiivisuuden (määritettiin fibriini/ agaroosi-maljamenetelmällä, kuvattu jäljempänä). Tätä kloonia käytetään myöhempiin tutkimuksiin. Tuotantoalustana käytetään GIT-alustaa (valmistaja Wako Pure Chemical Industry Co., Ltd.) täydennettynä 20 KIU/ml [SIGMA] aprotiniini11 a.

Esimerkki 7. Parannetun t-PA:n puhdistaminen CHO-soluien vilielvsupernatantista

Esimerkissä 6 saatu viljelysupernatantti puhdistetaan osittain anti-t-PA monoklonaalinen vasta-aine-affiniteettipylväässä. Monoklonaalista vasta-ainetta tuottava hybridoma tuotetaan tavalliseen tapaan ihmismelanoomasoluista saadulle t-PA:lie. Vasta-ainetta tuottava hybridoma siirrostetaan hiiriin ja 102844 askiiteissa kehittynyt monoklonaalinen vasta-aine (alaluokka: IgGl) otetaan talteen ja puhdistetaan käyttämällä Protein A Cellulofine:a (valmistaja Biochemical Industry Co., Ltd.) ja Biorad Laboratoryos-yhtiön valmistamaa, monoklonaalisen vasta-aineen puhdistamiseen tarkoitettua MAPS-puskurisysteemiä. Vasta-aine kytketään tavalliseen tapaan CNBr-aktivoituun Sepharose:een (valmistaja Pharmacia Fine Chemicals) suhteessa 4 mg/1 ml geeliä.

24 ml vasta-ainegeeliä sekoitetaan 4 litran kanssa viljely- supernatanttia. Ravistellaan varovasti yön yli 4°C:ssa, minkä jälkeen geeli pakataan pylvääseen (halkaisija 1,5 cm x 20 cm). Sen jälkeen geeli pestään peräkkäin kulloinkin 125 ml :11a seuraavia: 1 Tris-HCl-puskuri, pH 7,4 (puskuri A), jossa on 25 KIU/ml approtiniinia (valmistaja SIGMA) ja 0,01 % (paino/ tialvuus Tween 80:a, 2 puskuri A, jossa on 0,5 M NaCl:a, 3 puskuri A, jossa on 4 M ureaa ja 4 puskuri A. Geeliin sitoutunut parannettu t-PA eluoidaan 0,2 M glysiini-HCl-puskurilla, pH 2,5 (jossa 25 KIU/ml approtiniinia ja 0,01 % (paino/tila-vuus) Tween 80:a). Aktiiviset jakeet otetaan talteen ja yhdistetään. Dialysoidaan 10 mM Tris-HCl-puskuriin, pH 7,4 (jossa 25 KIU/ml approtiinia ja 0,01 % (paino/tilavuus) Tween 80:a) yön yli, minkä jälkeen dialysaatti väkevöidään 20- - 30-kertai-seksi sentrifugoimalla tyhjöväkevöintilaitteessa (Speed VAC, • valmistaja SAVANT Inc.). Konsentraatti dialysoidaan uudelleen 10 mM Tris-HCl-puskuriin, pH 7,4 (jossa 0,15 M NaCl:a, 25 KIU/ml approtiniinia ja 0,01 % (paino/tilavuus) Tween 80:a) yön yli ja käytetään myöhempään arviointiin in vitro ja in vivo. Spesifinen aktiivisuus on lopulta kasvanut 3.700 - 3.000-kertaiseksi. t-PA-aktiivisuudesta saadaan talteen 36 - 42 % (määritettynä fibriini/agaroosi-maljamenetelmällä).

Tämä aktiivinen jae analysoidaan SDS-elektroforeesin ja hopea-värjäyksen avulla. Pelkistävissä olosuhteissa havaitaan erittäin voimakas vyöhyke noin 54 kilodaltönin kohdalla sekä useita 34 102844 muita vyöhykkeitä. Elektroforeesin jälkeen geli käsitellään lisäksi 2,5 % (paino/tilavuus) Triton X-100:lla ja sen jälkeen se viedään fibrino/agaroosimaljal1 e ja suoritetaan fibriini-autografia 37°C:ssa, jolloin liuennut vyöhyke havaitaan noin 50 kilodaltonin kohdalla. Luonnossa esiintyvä t-PA on samalla maljalla noin 60 kilodaltonin kohdalla. Tulokset viittaavat voimakkaasti siihen, että vasta-aineaffiniteettipylvääseen adsorboitunut ja tällä menetelmällä eluoitu t-PA on parannettu t-PA, jonka molekyylipaino on teoreettisesti 10.000 pienempi kuin luonnossa esiintyvän tyypin.

Esimerkki 8. Parannetun t-PA:n spesifisen aktiivisuuden mittaaminen

Osittain puhdistetun parannetun t-PA:n proteiinimäärä määritetään mittaamalla kokonaisproteiini Bradford'in menetelmällä [Bradford, Anal. Biochem., 72. 248 (1976)] käyttämällä stan-dardiproteiinina naudanseerumialbumiinia. t-PA:n antigeenin määrä mitataan ELISA:11a. ELISA on ssadwich-tyyppinen menetelmä, jossa käytetään edellä kuvattua vasta-ainepylvästä varten käytettyä monoklonaalista vasta-ainetta ja biotinoitua kaniinin anti-t-PA-vasta-ainetta (valmistaja American Diagnostica Inc.). Väri muodostetaan käyttämällä biotinoitua piparjuuren peroksidaasi-streptavidiinikompleksia (valmistaja : Amersham Co., Ltd.) ja sen substraattia (3,31,5,5'-tetrametyy- libentidiini). Standardi t-PA:n käytetään ihmismelanoomaso-luista saatua yksisäikeistä t-PA:a (valmistaja American Diagnostica Incc.).

Fibrinolyyttinen aktiivisuus määritetään fibriini/agaroosi-maljamenetelmällä ja i25I-:lla leimatun fibriinikalvon liukenemisemenetelmällä. Fibriini/agaroosimalja valmistetaan lisäämällä agaria 95-prosenttisesti koaguloituun fibrinogee-niin. 125I:lla leimatun fibriinikalvon liukenemismenetelmä suoritetaan Hoyraerts'in et ai. menetelmällä [J. Biol. Chem., 35 102844 257. 2912 (1982)]. Siinä lisätään sopiva määrä i25I-leimattua fibrinogeeniä (valmistaja ICN Biomedical Co., Ltd.) 1,8 μΜ fibrinogeeniin ja seos laitetaan 96-kaivoiselle mikrotiitteri-levylle (valmistaja Limbro Co., Ltd.) 50 μΐ kuhunkin kaivoon ja sen jälkeen kuivataan 40°C:ssa yön yli. Sen jälkeen lisätään kuhunkin 100 μΐ 1,6 U/ml trombiinia (valmistaja Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.). Seoksen annetaan seistä 4 tuntia 37°C:ssa fibriinin muodostamiseksi. Pestään kaksi kertaa 10 mM fosfaattipuskurilla, joka sisältää 0,2 % vasikanseerumialbu-miinia ja 0,9 % natriumkloridia, minkä jälkeen levyä käytetään aktiivisuuden määrittämiseen. Jokaiseen kaivoon lisätään 50 μΐ 200 nM plasminogeeniä ja lisäksi sihen lisätään 50 μΐ t-PA-standardia tai parannettua t-PA:a. Sekoittamisen jälkeen seoksen annetaan reagoida 2 tuntia 37°C:ssa. Jokaisesta kaivosta otetaan 50 μΐ ja liuennut 125I-fibriini mitataan Aloka Inc.-yhtiön valmistamalla Auto Well Gamma Counter-laskimella. Parnnetun t-PA:n fibrinolyyttinen aktiivisuus lasketaan standardikäyrään, joka on valmistettu käyttämällä t-PA-standardia. Käytetty t-PA-standardi on ihmismyeloomasoluista saatu t-PA, jonka on valmistanut Bioscott Inc. ja joka on standardisoitu kansainvälisen t-PA-standardin mukaisesti [Gaffuey ja Curtis, Thromb. Haemostas., 53. 134 (1985)].

Spesifinen aktiivisuus, joka on laskettu i25l-fibriinikalvo-menetelmällä määritetystä aktiviisuusarvosta ja ELISA:lla määritetystä antigeenin määrästä, on 300,000 - 420.000 U/mg antigeeniä.

Esimerkki 9. Parannetun t-PA:n affiniteetti fibriiniin ia : fibriinin aiheuttama aktivointi

Parannetun t-PA:n affiniteetti fibriiniin tutkitaan Verheijen'in et ai. menetelmällä [[EMMBO J., 5_, 3525 (1986)]. Eri konsentraatioissa olevaan fibrinogeeniin lisätään parannettua tai luonnonmukaista t-PA:a (1.000 U/ml) ja tähän lisä- 36 102844 tään vielä 1 U trombiinia, minkä jälkeen annetaan reagoida huoneen lämpötilassa 3 minuuttia. Muodostunut fibriinihyytymä -saostetaan sentrifugoimalla 8 minuuttia 16.000 k/min. ja määritetään se t-PA-määrä supernatantissa, joka ei ole sitoutunut fibriiniin, mittaamalla aktiivisuus fibriini/agaroosi-maljamenetelmällä. Saatu tulos on, että parannetulla t-PA:lla [VI] on yhtä suuri affiniteetti fibriiniin kuin luonnontyyp-pisellä t-PA:lla. Suorittamalla seuraava ajo tutkitaan parannetun t-PA:n plasminogeeniä aktivoiva vaikutus fibriinin läsnäollessa tai ilman sitä. 96-kaivoisella mikrotiitteri-levyllä lisätään luonnossa esiintyvää tai parannettua t-PA:a 0,1 M Tris-HCl-puskuriin, pH 7,5, joka sisältää 0,3 mM synteettistä p-nitranilidi-tripeptidi-substraattia S-2251 (H-D-Val-Leu-Lys-pNA.HCl, valmistaja Kabi Inc.), 0,13 μΜ plasmiinitonta plasminogeeniä, 120 ug/ml DESAFI3™:a (valmistaja American Diagnostica Inc.) ja 0,1 % Tween 80:a niin, että koko tilavuudeksi saadaan 200 μΐ. Systeemi pidetään 37°C:ssa. Määrätyn ajan jälkeen mitataan absorbanssi (A 405 nm) aallonpituudella 405 nm Titertech Multiscan Model 310-mitta-ri11 a.

Kuviossa 9 on esitetty parannetun t-PA:n [VI] ja luonnossa esiintyvän t-PA:n amidolyyttisen aktiivisuuden annos/vaste-: käyrä. Kun aktivoitumista verrataan DESAFI3™-lisäyksestä johtuvana annos/vaste-käyrän siirtymänä, luonnossa esiintyvä t-PA on 158-kertainen, kun taas pparannettu t-PA [VI] nousee tuhatkertaiseksi. Tämä johtuu siitä seikasta, että parannetun t-?A:n [VI] aktiivisuus ilman DESAFI3™:a on noin 1/20 alempi kuin luonnon t-PA:n.

Esimerkki 10. Parannetun t-PA:n vaikutus fibrinolyyttiseen aktiivisuuteen kaniinin verivirrassa

Luonnossa esiintyvän t-PA:n (n-t-PA) ja esillä olevan keksinnön mukaisen parannetun t-PA:n aktiivisuuksien farmakogeneettinen 37 102844 käyttäytyminen tutkitaan kaniinilla. Kuten kuviosta 10 käy ilmi, parannetun t-PA:n aktiivisuuden puoliintumisikä on kasvanut huomattavasti. Tarkemmin sanoen luonnonmukaisen t-PA:n puoliintumisikä on 1 - 2 minuuttia, kun taas parannetulla t-PA:lla se on 8 - 15 minuuttia. Lisäksi on huomattava, että jopa 60 minuutin kuluttua antamisesta parannetun t-PA:n aktiviisuudesta on jäljellä yhä 5 % (30 sekunnin jälkeen antamisesta arvo on 100 %). Toisaalta luonnon t-PA:lla aktiivisuus on 0,1 % 60 minuutin jälkeen.

Tämä koe suoritetaan seuraavasti.

Kokeeseen käytetään 2,4 kg painavaa japanilaista valkoista kaniinia. t-PA annetaan pentobarbitaalianestetian alla korvan periferialaskimon läpi. Parannetun t-PA:n annos on 15.400 U/0,8 ml/kanniini ja n-t-PA:n annos on 5.400 U/0,8 ml/kaniini (arvot määritettiin fibriinimalja-menetelmällä). Tämän jälkeen reisi-valtimosta otetaan kummassakin tapauksessa 2,5 ml verta katetrin avulla eri aikoina (0,5 - 60 minuuttia) natriumsitraattiin (3,8 %), 1/9 voi. 30 minuutin sisällä veren keräämisestä plasma erotetaan sentrifugoimal1 a pienellä nopeudella. Veren t-PA-aktiviisuus mitataan erotetusta plasmasta.

(1) t-PA-aktiviisuuden mittaaminen 0,2 ml plasmaa laimennetaan 3 mM jääetikalla 16-kertaisesti ja sen jälkeen laimennusta sentrifugoidaan alhaisella nopeudella. Saatu sakka liuotetaan 20 mM Tris-HCl, pH 7,4-140 mM NaCL-puskuriin, jonka tilavuus on yhtä suuri kuin plasman. Näin saadaanm euglobuliinijae. t-PA-aktiivisuus määritetään lisäämällä tämä euglobuliinijae fibriini/agaroosi-maljal1 e. Maljaa inkuboidaan 37°C:ssa 16 tuntia, minkä jälkeen t-PA-aktiivisuus havaitaan plakkina. Fibriini/agaroosi-malja valmistetaan seuraavasti .

38 102844

Fibriini/agaroosi-maljän valmistamiseen käytetään kaupallisesti saatavissa olevaa fibrinogeeniä (maissin fraktio I) runsaasti plasminogeeniä sisältävänä fibrinogeeninä. Plasminogeenirikkaan fibrinogeenin 1oppukonsentraatio on 1,5 mg/ml 20 mM Tris-HCl-puskurissa, pH 7,4, joka sisältää 130 mM natriumkloridia ja 10-4M kalsiumkloridia. Agaroosin loppukonsentraatio on 0,75 % samassa puskurissa. Maljan valmistamista varten lisätään ΙΟΟμΙ trombiinia (40 NIH yksikkö/ml) 10 ml:aan fibrinogeeni-agaroosi-liuosta. Fibriini/agaroosi-maljamenetelmälle saadaan standardi-käyrä laimentamalla eläimelle antamiseen käytetty t-PÄ kosen-traatioihin 0,1 - 10.000 U/ml. Näin määritetty t-PA-aktiivisuus veressä ilmoitetaan prosentteina käyttämällä 100 %:na t-PA-aktiivisuutta, joka on saatu 30 sekuntia antamisen jälkeen kerätystä verestä.

Esimerkki 11. Parannetun t-PA:n ΓνΠ stabiilisuus lämmön ia happojen suhteen

Tutkitaan parannetun t-PA:n [VI] stabiilisuus. Lämpöstabii-lisuuden tutkimista varten parannettu t-PA [VI] ja luonnon t-PA laimennetaan 50 mM Tris-puskuri11 a (joka sisältää 100 mM NaCl:a ja 0,01 % Tween 80:a), pH 7,4, vastaavasti 100 ug/ml konsentraatioon. Kummankin liuoksen annetaan seistä kiehuvassa vedessä (98 %) 2 - 60 minuuttia. Jäähdyttämisen jälkeen jäljelle jäänyt aktiivisuus määritetään fibriini/malja-menetel-mällä. Kuviosta 11 voidaan havaita, että parannetun t-PA:n [VI] aktiivisuuden aleneminen on hyvin vähäistä verrattuna luonnon t-PA:n aktiviisuuden laskuun. Esimerkiksi 2 minuutin lämpökäsittelyn jälkeen luonnon t-PA:n aktiivisuus on alentunut 25 %:iin, kun taas parannetun t-PA:n [VI] aktiivisuudesta on yhä jäljellä 71 %.

Parannettu t-PA [VI] ja luonnon t-PA liuotetaan 0,5 N suolahappoon 100 ug/mi konsentraatiossa, minkä jälkeen annetaan seistä huoneen lämpötilassa 30 minuuttia. Neutraloinnin jäi- „ 102844 39 keen aktiivisuus määritetään fibriinimaljamenetelmällä. Parannetussa t-PA:ssa ei ole tapahtunut mitään aktiivisuusmuutoksia, kun taas luonnon t-PA:n aktiivisuus on alentunut 50 %.

Esimerkki 12. Parannetun t-PA:n fvil LAF-aktiivisuutta inhiboiva vaikutus

Parannettu t-PA [VI] ja luonnon t-PA laimennetaan sopivalla tavalla kudosviljelyalustalla RPMI 1640, joka sisältää 7 % vasikansikiöseerumia ja 58 μΜ 2-merkaptoetanolia. 100 μΐ tätä laimennosta laitetaan 96-kaivoisel1 e tasapohjaiselle levylle ja lisätään 50 μΐ kuhunkin kaivoon solususpensiota, joka sisältää 4-6 viikon vanhoja C3H/HeJ-uroshiiriltä saatuja tymosyyttejä (2 x 107 solua/ml) ja konkanavaliini A:a (1,2 ug/ml) ja 50 μΐ interleukiini 1 (4 yksikköä/ml, Genzyme Inc.)/ minkä jälkeen viljellään 48 tuntia 37°C:ssa inkubaattorissa, joka sisältää 5 % hiilidioksidia. Sen jälkeen lisätään 3H-tymidiiniä 0,5 uCi/20 μΐ/kaivo. Viljellään vielä 18 tuntia, minkä jälkeen solut kerätään lasikuitusuodattimel1 e käyttämällä solujen keräyslaitetta ja mitataan soluihin mennyt 3H-tymidiinimäärä nestetuikelaskimella. Tämän avulla voidaan LAF-aktiivisuus määrittää.

. Kuten on esitetty kuviossa 12, luonnon t-PA ei lainkaan inhiboi LAF-aktiivisuutta, mutta parannettu t-PA inhiboi merkittävästi IL-l:n aiheuttaman LAF-aktiivisuuden. Pelkästään liuottimella testattaessa ei mitään valutusta havaittu.

Esimerkki 13. Denaturoituun proteiiniin kohdistuvaan vaikutukseen perustuva anti-infaiammatorinen aktiivisuus 1) Denaturoidun proteiinin valmistaminen

Proteiiniliuosta (5 mg/ml) inkuboidaan 0,1 N suolahapossa tai 0,1 N natriumhydroksidissa 37°C:ssa 2-3 tuntia, minkä jälkeen 40 102844 denaturoitu proteiini valmistetaan neutraloimalla proteiini-liuos samalla määrällä natriumhydroksidia tai suolahappoa.

21 Parannetun t-PA:n ΓV11 affiniteetti denaturoituun proteiiniin

Menetelmä:

Denaturoitu proteiini kiinnitetään nitroselluloosafilmin palaan jäljempänä esitetyllä tavalla. Sen jälkeen mitataan nitrosel-luloosafilmin palaan sitoutunut parannetun t-PA:n määrä, minkä avulla voidaan määrittää parannetun t-PA:n affiniteetti denaturoituun proteiiniin.

Pala nitrosel1 uioosafilmiä laitetaan 20 mM Tris-HCl-puskuriin, pH 7,5 (TBS-puskuri), joka sisältää 140 mM NaCl:a kuivaus *>/

Nitroseiluloosafilmin palan päälle tiputetaan denaturoitua proteiinia (50 ug/10 μΐ) kuivaus B1okataan 3-prosenttisella gelatiiniliuoksella pesu

Nitrosel1 uioosafiImin palalle laitetaan 1 ug parannettua t-PA/ml 41 102844 pesu vs

Lisätään plasminogeeniä ja synteettistä substraattia S-2251 ja tämän jälkeen inkuboidaan 37°C:ssa (adsorboituneen parannetun t-PA:n kvantitatiivinen määritys) OD 405:n mittaaminen

Tulokset:

Seuraavasta taulukosta käy ilmi, että parannetulla t-PA:lla on affiniteetti HCl:lla käsiteltyyn IgG:aan ja HCl:lla käsiteltyyn albumiiniin ja NaOHrlla käsiteltyyn albumiiniin. Sen sijaan parannetulla t-PÄ:lla ei ole affiniteettia käsittelemättömään IgG:aan ja käsittelemättömään albumiiniin.

Seiluloosafilmiin Parannetun t-PA:n sitoutunut kiinnittynyt proteiini määrä (nq/selluloosafilmin pala)

Puskuri 0

IgG 0,2 HCl:lla käsitelty IgG 1,35

Albumiini 0

NaOH:lla käsitelty albumiini 0,9 3) Parannetun t-PA:n ΓV11 aktivointi denaturoidulla proteiinilla

Menetelmä: 0,0078 CU/10 μΐ plasminogeeniä (Kabi Inc.), 100 μΐ 3 mM synteettistä S-2251-substraattia ja eri määriä TBS-puskuria lisätään konsentraatioltaan erilaisiin parannetun t-PA-akti-vaattorin (denaturoitu proteiini tai BrCN-käsitelty fibrino- 42 102844 geeni tai vastaava) reaktiolluokseen niin, että reaktioliuoksen määräksi saadaan 0,275 ml. Reaktio käynnistetään lisäämällä reaktiolluokseen 2,5 ng/25 μΐ parannettua t-PA:a. Annetaan reagoida määrätyn ajan, minkä jälkeen reaktio keskeytetään lisäämällä reaktioliuokseen yhtä suuri moolimäärä 2-prosenttista SDS-liuosta. Parannetun t-PA:n aktiivisuus määritetään mittaamalla OD 405.

Tulokset:

Kuten kuviossa 13 on esitetty, NaOH.’lla käsitelty albumiini ja HCl:lla käsitelty IgG aktivoivat tehokkaasti parannetun t-PA:n. Aktivoituminen on erityisen voimakasta HCl:lla käsitellyllä IgG:lla, ja HCl-käsitellyn IgG:n aktiivisuus on oleellisesti sama kuin BrcN-käsitellyn fibrinogeenin aktiivisuus, kun konsentraatio on 1 - useita kymmenesosia pienempi kuin BrCNrlla käsitellyssä fibrinogeenissä. Käsittelemättömillä albumiinilla ja IgG:11a ei kuitenkaan esiinny mitään aktivoitumista.

4) Denaturoidun proteiinin hajottaminen parannetulla t-PA:lla rvn

Menetelmä:

Denaturoitu proteiini saatetaan reagoimaan parannetun t-PA:n kanssa samoissa olosuhteissa kuin mitä on kuvattu menetelmässä "3) parannetun t-PA:n aktivointi denaturoidulla proteiinilla" paitsi, että reaktiosysteemiin ei lisätä mitään synteettistä S-2251-alustaa ja että denaturoidun proteiinin määräksi on lyöty lukkoon 133 μΐ/ml, minkä jälkeen SDS-geelielektroforeesi suoritetaan β-merkaptoetanolin läsnäollessa.

Tulokset:

Kuten kuviossa 14 on esitetty, NaOH-käsitellyllä tai HCl- 43 1 0 2 8 4 4 käsittelyllä denaturoitu proteiini saa vyöhykkeet häviämään ja johtaa hajoamistuotteiden muodostumiseen, mikä osoittaa denaturoidun proteiinin hajoavan. Käsittelemättömällä albumiinilla ei toisaalta havaita mitään muutosta vyöhykkeessä edes parannetun t-PA:n kanssa reagoimisen jälkeen eikä sen vuoksi havaita mitään denaturoidun proteiinin hajoamista.

Claims (2)

102844

1. Menetelmä valmistaa parannettu terapeuttisesti aktiivinen kudosplasminogeenin aktivaattori, jolla on seuraava aminohapposekvenssi, josta verrattuna ihmis-t-PA:hän, kringle 1 on poistettu ja Arg 275 on korvattu Glu:lla H2N-R-Ser Tyr Gin Vai Ile Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gin Met Ile Tyr Gin Gin His Gin Ser Trp Leu Arg Pro Vai Leu Arg Ser Asn Arg Vai Glu Tyr Cys Trp Cys Asn Ser Gly Arg Ala Gin Cys His Ser Vai Pro Vai Lys Ser Cys Ser Glu Pro Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Gin Gin Ala Leu Tyr Phe Ser Asp Phe Vai Cys Gin Cys Pro Glu Gly Phe Ala Gly Lys Cys Cys Glu Ile Asp Thr Arg Ala Thr Ser Glu Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile Leu Ile Gly Lys Vai Tyr Thr Ala Gin Asn Pro Ser Ala Gin Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Vai Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys Asp Vai Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gin Tyr Ser Gin Pro Gin Phe - Y - Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp Gin Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile « Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gin Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Vai Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Vai Vai Pro Gly Glu Glu Glu Gin Lys Phe Glu Vai Glu Lys Tyr Ile Vai His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser Asp Ser Ser 102844 Arg Cys Ala Gin Glu Ser Ser Vai Val Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gin Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gin His Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gin Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gin Cly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly lie lie Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gin Gin Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp lie Arg Asp Asn Met Arg Pro-COOH jossa Y on Glu Ile Lys, ja H2N- tarkoittaa aminopäätettä ja -COOH karboksipäätettä, R on sidos tai Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Vai Leu Leu Leu Cys Gly Ala Vai Phe Vai Ser Pro Ser Gin Glu Ile His Ala Arg Phe Arg Arg Gly Ala Arg, Gly Ala Arg, Met, tai Met Gly Ala Arg; jolla plasminogeeniaktivaattorilla on seuraavat ominaisuudet: a) fibrinolyyttinen aktiivisuus määrättynä 125I-f ibriinikalvo-menetelmällä; b) tarkoitettu aktivoitavaksi fibriinillä ja sillä on parannetun t-PA:n aktiivisuus fibriinin poissaollessa, joka on alhaisempi kuin luonnollisen t-PA:n aktiivisuus; c) luonnolliseen muotoon verrattuna kohonnut puoliintumisaika; 102844 d) verrattuna luonnollisen t-PA:han parannettu vastustuskyky happoja ja kuumennusta vastaan; e) tarkoitettu inhiboimaan lymfosyyttiaktivointitekijän; f) tarkoitettu aktivoitavaksi denaturoidulla proteiinilla; tunnettu siitä, että geeni, joka koodaa mainittua parannettua t-PA:ta, viedään vektoriin yhdessä transkriptoin-tia ja translaatiota säätävien sekvenssien kanssa, vektori viedään sopivaan isäntäsoluun, jossa geeni ekspressoidaan, ja saatu parannettu t-PA otetaan talteen ja/tai eristetään.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntänä käytetään CHO-soluja. 47 1 0 2 8 4 4