JPH02121934A - 組合せ医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、プラスミノーゲン活性化因子とスロンビン阻
害剤との組合せを含んで成る医薬組成物、及び凝固障害
の予防又は治療のための該組成物の使用に関する。

〔従来の技術〕

哺乳類の血漿は動的平衡状態で共存する２つの酵素系、
すなわち血餅を形成することができる凝固系、及び血餅
を溶解することができる線溶系を含有する。この動的平
衡が、損傷された血管からの血液の喪失を防止するため
に必要な時及び所においてのみ血餅が正常に形成される
こと、及び該損傷の自然の回復の後に過剰の血餅が溶解
することを保証する０例えば血栓塞栓症又は術後合併前
に罹っている患者において血管内血餅（血栓）を除去す
るために体の線溶能力が不十分な場合、外部から投与さ
れる線溶剤（血栓溶解剤）を使用することが不可避であ
る。

線溶系の１つの成分はプラスミノーゲン活性化因子と呼
ばれる一群の酵素であり、これらはチモーゲンであるプ
ラスミノーゲンを蛋白質分解酵素プラスミンに転換する
。次に、プラスミンは血餅のフィブリンネットワークを
分解して可溶性生成物を生成せしめる。

２つのタイプのプラスミノーゲン活性化因子（以後、「
ＰＡ」と称する場合がある）、すなわち、例えば尿及び
腎臓細胞中に存在するセリンプロテアーゼであるウロキ
ナーゼ又はウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子
（以後ｒ　Ｌｌ−ＰＡ　Ｊと称する場合がある）、及び
内皮細胞により生産されそして多数の内分泌組織中に見
出される組織型プラスミノーゲン活性化因子（以後、ｒ
ｔ−ＰＡｊと称する場合がある）をヒトの体液から単離
することができる。ｔ−ＰＡ及びｕ−ＰＡはいずれも２
つの分子形、すなわち単鎖形（しばしば、それぞれｒｓ
ｃｔＰＡＪ及びｒｓｃｕ−ＰＡ」と称される）及び２本
鎖（’ｔｃ」）形として存在する。単鎖形又はブロー酵
素形は蛋白質分解酵素によりポリペプチド配列中のよく
定義された位置において２本鎖形に転換される。この加
工されたＰＡ蛋白質の２本鎖は硫黄−硫黄橋を介して相
互に結合したままである。

カルボキシ末端断片又はＢ−鎖はＰＡの酵素活性を司り
、他方アミノ末端Ａ−鎖はフィブリン結合部位のごとき
制御ユニットを含有する。

ｔ−ＰＡ及びｕ−ＰＡ（特にｓｃｕ−ＰＡ）は血栓溶解
療法において最も有用であると考えられるが、しかしな
がらこれらの薬剤はいずれも単独では閉塞した血管を永
久的に開通させるためには十分でない。閉塞速度が異常
に高いので、病気の経過に好都合な影響を与える追加の
療法的手段が採られるべきである。

最近、スロンビン阻害剤、例えばヘパリン、ヘパリンの
低分子部分又はアルギニン誘導体（例えばアルギビジン
）が抗血栓療法においてプラスミノーゲン活性化因子と
組み合わせて使用されている（Ｙ、Ｔａｍａｏ　ら、Ｔ
ｈｒｏｓｂ、ｔｌａｅｍｏｓｔ、　５６　、２８−３４
（１９８６）　；　Ｊ、Ｍ、５ｔａｓｓｅｎら、前記、
５８　、９４７−９５０（１９８７）　；ヨーロッパ特
許出願Ｎａ　１８１，２６７）　、スロンビンの阻害は
凝固系に対して次の効果を有する。

（１）フィブリノーゲンのモノマーフィブリンへの転換
が阻害され；　（２）可溶性フィブリンを不溶性フィブ
リンマトリクスに転換するファクターＸＩ［［ａへのフ
ァクターＸ■の成熟を防止し；可溶性フィブリンは不溶
性フィブリンに比べてプラスミンによる蛋白質分解的分
解に対して感受性であり；　（３）ファクターＶａ及び
Ｖｉｌｌａ（スロンビン形成のフィードバック促進物質
）の形成が阻害され；　（４）プラスミノーゲン活性化
因子インヒビター１　（ＦＡＩ−１）が蛋白質分解的に
分解され；他方（５）スロンボモジュリンースロンビン
複合体中の結合したスロンビンはスロンビン阻害剤によ
り阻害されず；従って前記複合体は、プロティンＳと一
緒になってファクターＶａ及びＶｉｌｌａ（前記）を蛋
白質分解的に分解するプロティンＣの活性化剤として作
用し続ける。プラスミノーゲン活性化因子ｔ−ＰＡ自体
の作用が、活性化された血小板により介在される局所的
過凝固性（ｈｙｐｅｒａｇｇｒｅｇ−ａｂｉｌｉｔｙ）
を導＜　　（Ｒ，Ｊ、５ｈｅｂｅｒｓｋｉ　ら、Ｔｈｒ
ｏｍｂ、Ｒｅｓ。

５２、３８１（１９８Ｂ）を参照のこと〕。従って、ス
ロンビン阻害物質はフィブリンの連続的形成及び新たに
生成したフィブリンの連続的沈着による血栓の成長を防
止すると信じられる。さらに、ｓｃｕ−ＰＡはスロンビ
ンにより７１　ｒ　ｇ　Ｉ　Ｓ　＆　−ｐ　ｉ　ｅ　Ｉ
　％　’１結合にお（＼で開裂されて不活性な２本鎖形
をもたらすから、スロンビン阻害物質の同時的投与がな
ければそれは不活性である。

さらに、溶解の間、有意■のフィブリンが循環中に生ず
る（０％ｌ１ｅｎら、Ｂｌｏｕｄ　７２　、６１６−６
２０（１９８８）　；Ｈ，Ｊ、Ｒａｐｏｌｄら、Ｃ１ｒ
ｃｕｌａｔｉｏｎ　７９　、９８０−９８８（１９８Ｂ
）　）これらが−緒になってプラスミノーゲン活性化因
子を介しての溶解が局所的及び全身的に血栓形成力と血
栓分解力との間の不均衡を導き、既存の血餅の不完全な
溶解、同じ部位での急速な再閉塞（ｒｅｏｃｃｌｕｓｉ
ｏｎ）及び他の素因のある部位での新たな血餅の形成を
もたらす。ヘパリンによる抗凝固は溶解のこれらの副作
用を予防しないであろう（Ｒａｐｏｌｄ　、前掲）。

〔発明が解決しようとする課題〕

得られる最初の結果により示されるように、プラスミノ
ーゲン活性化因子とスロンビン阻害物質との組合せ投与
は従来の線溶性プラスミノーゲン活性化因子療法におい
て生ずる再閉塞（ｒｅｏｃｃｌｕ−ｓｉｏｎ）問題を克
服するために役立つかもしれない。

しかしながら、ヘパリン又はアルギニン誘導体とプラス
ミノーゲン活性化因子との組合せ投与において観察され
る比較的小さい抗凝固効果の観点から、線溶療法におけ
る再閉塞問題を最少にする抗凝固カスケードに一層顕著
な阻害効果を有する強力なスロンビン阻害物質とプラス
ミノーゲン活性化因子との組合せの必要性が存在する。

強力なスロンビン阻害物質との組合せはまた、血餅を溶
解するために必要なプラスミノーゲン活性化因子の量を
減少せしめそしてさらに血餅を溶解するのに必要な時間
を短縮するであろう。これは特に、生命を脅かす状態を
管理すべき場合に重要である。

本発明の１つの目的は、凝固障害の抗凝固／線溶組合せ
療法において使用するための前記のごとき改良された組
合せを提供することである。

〔課題を解決するための手段〕

驚くべきことに、線溶性プラスミノーゲン活性化因子が
抗血栓剤であるヒルジンと組合せて適用された場合に、
血栓の溶解が有意に加速され、そして再閉塞の危険が顕
著に低下することが見出された。

従って本発明は、成分Ａとしてのプラスミノーゲン活性
化因子及び成分Ｂとしてのヒルジンを医薬として許容さ
れるキャリヤーと共に含んで成る。

医薬組成物に関する。

〔具体的な説明〕

適当なプラスミノーゲン活性化因子はヒトｔ−ＰＡ及び
ヒトｕ−ＰＡであり、これらは２本鎖形又は好ましくは
単鎖形であり、グリコシル化された形、部分的にグリコ
シル化された形又はグリコシル化されていない形であり
、そして天然源から得たもの、又は形質転換された哺乳
類細胞又は形質転換された微生物、例えば大腸菌（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）又はサツカロミセス・
セレビシェ−（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ）から組換えＤＮＡ技法により得たものであ
る。この様なプラスミノーゲン活性化因子の例には、Ｍ
、Ｗｉｎｋｌｅｒ　ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２
５　。

４０５１−４０４５（１９８６）　　；　Ｂ、Ｒｏｔｚ
ｋｉｎ　ら、Ｐｒｏｃ、ＮａＬｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７８　、３３１３−３３１
７（１９８１）　　；　Ｄ、Ｐｅｎｎ１ｃａら、Ｎａｔ
ｕｒｅ　３０１　、２１４−２２０１９８３）　　；並
びにヨーロッパ特許出願漱４１．７６６、阻９２，１８
２、陥、９３，６１９及びＮｔｌ１４２，０８１に記載
されているものがある。

「プラスミノーゲン活性化因子」なる語はさらにヒトｕ
−ＰＡ及びｔ−ＰＡの変異体、ｕ−ＰＡ／　ｔ−ＰＡハ
イブリドプラスミノーゲン活性化因子及び後者の変異体
、特に単鎖変異体及びバイブリド、さらには線溶活性を
維持しているそれらの断片を包含する。

変異体は特にＰＡをプロテアーゼ耐性にする変異体であ
る。この様な変異体は、スロンビン又はプラスミンのご
とき血中に存在するプロテアーゼによる蛋白質分解部位
において共有結合的に変形されており、その結果、これ
らはもはやそれらの位置でのプロテアーゼ加水分解に対
して感受性ではない。ｕ−ＰＡの標的部位には、１．．
３１３％−Ｌｙ３１３４（この部位での開裂がいわゆる
低分子形のｓｃｕ−ＰＡ又はｒＬＵＫ　Ｊを生じさせる
）　、Ａ、、１８６−ｐｈｅｌｓ”＋（スロンビンによ
る攻撃に対して感受性である）、及びＬｙＳ１５１１−
１ｙＳ１′９（プラスミンによるこの部位での開裂がｔ
ｃｕ−ＰＡを生じさせる）が含まれる。適当なｕ−ＰＡ
変異体は、これらの標的部位の１又は複数においてアミ
ノ酸残基の置換、挿入又は欠失を有する。標的部位を構
成する一方のアミノ酸残基又は両方のアミノ酸残基が除
去されているかあるいはこれらのアミノ酸残基の少なく
とも一方が他のアミノ酸残基により置き換えられており
、このために生ずる変異体がプロテアーゼの攻撃に対し
て耐性となっているような変異体が特に好ましい、ヨー
ロッパ特許出願阻２００，４５１．階２１０．２７９及
び階２Ｂ８．４３５を参照のこと。

ｕ−ＰＡの他の変異体においては、Ａｓｎ３６２に存在
するユニークＮ−グリコシル化部位（Ａｓｎ”−５ｅｔ
−Ｔｈｒ）が、この部位においてグリコシル化が起り得
ないように変更されている。

ｓｃｕ−ＰＡ及び好ましいｓｃｕ−ＰＡは次の式（Ｉ）
：Ｓｅｒ　　Ａｓｎ　　Ｇｌｕ Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ Ｓｅｒ　Ａｓｎ　　Ｌｙｓ Ｃｙｓ　　Ａｓｎ　Ｃｙｓ Ｈｉｓ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ Ｌｙｓ　Ａｌａ　５ｅｒ Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｒ。

Ｇｌｎ　　Ｇｌｎ　　Ｔｈｒ Ａｌａ　　Ｌｅｕ　　Ｇｉｎ Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　　Ａｒｇ Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｃｙｓ Ｐｒｏ　　Ｌｅｕ　　Ｖａｌ Ｃｙｓ　　Ａｌａ　　Ａｓｐ Ｐｒｏ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ Ｌｙｓ　　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ Ｇｌｙ　Ｇｆｙ　Ｇｌｕ Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｐｈｅ Ａｒｇ　Ｇｌｙ　　Ｇｌｙ Ｇｌｙ　　Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ Ｌｅｕ　　Ｈｉｓ　　Ｇｌｎ Ｌｅｕ　　Ａｓｎ　　Ｇｌｙ Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　５ｅｒ Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　　Ｌｙｓ １１ｅ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ Ｔｒｐ　Ａｓｎ　５ｅｒ Ｔｙｒ　Ｈｉｓ　Ａｌａ Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　　Ｌｅｕ Ａｓｎ　　Ｐｒｏ　Ａｓｐ Ｔｙｒ　　Ｖａｌ　　Ｇｌｎ Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ Ｇｌｙ　　Ｘ、　　Ｘ。

Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ　　Ｐｈｅ Ａｒｇ　　Ｐｒｏ　　Ｙ。

Ｐｈｅ　　Ｔｈｒ　　Ｔｈｒ Ａｌａ　　Ａｌａ　　鎖ｅ Ｓｅｒ　　Ｖａｌ　　Ｔｈｒ １１ｅ　　Ｓｅｒ　　Ｐｒ。

Ｖａｌ　　Ｐｒｏ　　５ｅｒ Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ Ａｓｎ、Ｉｌｅ　　ｌ鎖ｓ Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ Ａｌａ　　Ｔｈｒ　　Ｖａｌ １鎖ｓ　　Ａｒｇ　　５ｅｒ Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　１ｌｉｓ Ａｓｎ　　Ａｒｇ　　Ａｒｇ Ｖａｌ　　Ｇｌｙ　　Ｌｅｕ Ｍｅｔ　　Ｖａｔ　　Ｈｉｓ Ｐｒｏ　　Ｓｅｒ　　５ｅｒ Ｇｌｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ Ｙ、　　Ｖ、　　ｌ１ｅ １１６　　Ｇ１１ｌ　　Ａｓｎ Ｔｙｒ　　Ａｒｇ　　Ａｒｇ Ｔｙｒ　　Ｖａｌ　　Ｃｙｓ Ｃｙｓ　　Ｔｒｐ　　Ｖａｌ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ｇｉｎ Ｃｙｓ ｔｙ Ｐｒ。

Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ ｒｃ Ｃｙｓ 八５ｐ Ｐｒ。

Ｇｉｎ １ｅ Ｇｉｎ Ｈｉｓ ＩＳＩ １ｅ Ｓｅｒ　　Ａｌａ　　Ｔｈｒ Ｌｙｓ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｕ Ａｒｇ　　Ｓｅｒ　　Ａｒｇ Ｇｌｕ　　Ｍｅｔ　　Ｌｙｓ Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｌｙｓ Ａｌａ　Ｈｉ、ｓ　Ｈｉｓ １１ｅ　Ａｒｇ　　５ｅｒ Ｐｒｏ　　Ｓｅｒ　Ａｒｇ Ｐｒｏ　　Ｓｅｒ　　Ｍｅｔ ７１１ｒ　　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ Ｇｌｕ　　Ｚｌ　　５ｅｒ Ｇｉｎ　　Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　５ｅｒ Ｃｙｓ　　Ａｌａ　　Ａｌａ Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ Ｖａｔ　　Ｃｙｓ　　５ｅｒ Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　　Ｉｌｅ 八ｌａ　　Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ Ａｒｇ　　Ｖａｌ　　５ｅｒ １鎖ｓ　　Ｃｙｓ　　Ｐｈｅ Ａｓｐ　Ｔｙｒ’１ｌｅ Ｌｅｕ　　Ａｓｎ　　５ｅｒ Ｐｈｅ　　Ｇｌｕ　　Ｖａｌ Ａｓｐ　Ｔｙｒ　５ｅｒ Ａｓｎ　　Ａｓｐ　　ｌｌ５ Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ Ｔｈｒ　　ＩＩｓ　　Ｇｌｎ Ｔｙｒ　　Ａｓｎ　　Ａｓｐ Ｇｌｕ　　Ｉｌｅ　　Ｔｈｒ Ｚｔ　　Ａｓｐ　Ｔｙｒ Ｍｅｔ　　Ｔｈｒ　　Ｖａｔ Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　　Ｇｉｎ Ｇｌｕ　　Ｖａｔ　　Ｔｈｒ Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ Ｇｌｙ　　Ａｓｐ　５ｅｒ Ｌｅｕ　　Ｇｉｎ　　Ｇｌｙ Ｖａｔ　　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ Ａｓｐ　Ｌｙｓ　　Ｐｒ。

ｔｌｉｓ　　Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ ｌｉｅ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ Ｖａｌ　　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ Ａｓｎ　　Ｔｈｒ　　Ｇｌｎ Ｇｌｕ　　Ａｓｎ　　Ｌｅｕ Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ Ａｌａ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ Ａｒｇ　Ｃｙｓ　　Ａｌａ Ｔｈｒ　　Ｉｌｅ　Ｃｙｓ Ｐｒｏ　　Ｇｉｎ　　Ｐｈｅ Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｐｒ。

Ｖａｌ　　Ｌｙｓ　　Ｌｅｕ Ｇｉｎ　　Ｐｒｏ　　１ｌｉｓ Ｔｈｒ　　Ｌｙｓ　　Ｍｅｔ Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　　Ｐｒ。

Ａｒｇ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ Ｇｌｙ　　Ａｒｇ　Ｇｌｙ Ｇｌｙ　　Ｖａｌ　　Ｔｙｒ Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　　ｌ１ｅ Ｐｒ。

Ｇｌｙ １ｅ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｉｎ しｅｕ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ　１ｌｉｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　
Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｌａｅｕ （１式中、Ｘｌ及びｘ２は相互に独立にＬｙｓ　、塩基
性アミノ酸残基以外のアミノ酸残基又は化学結合を表わ
し、Ｙ、はＡｒｇ　、塩基性アミノ酸残基以外のアミノ
酸残基又は化学結合であり、Ｙ２はＰｈｅ、酸性アミノ
酸残基又は化学結合であり、Ｙ、はＬｙｓ　、塩基性ア
ミノ酸残基以外のアミノ酸残基又は化学結合であり、Ｚ
ｌは好ましくは酵母特異的にグリコシル化されている＾
ｓｎであるか又は他のアミノ酸残基であり、そしてＺ２
はＴｈｒであるか又はＳｅｔ以外の他のアミノ酸残基で
ある）により表わされる。

「アミノ酸残基」なる語は、すべての遺伝的にコードさ
れているアミノ酸の残基、例えば酸性アミノ酸残基、例
えばグルタミン酸及びアスパラギン酸の残基、塩基性ア
ミノ酸残基、例えばアルギニン、リジン及びヒスチジン
の残基、並びに中性アミノ酸残基、例えばアスパラギン
、グルタミン、メチオニン、グリシン、アラニン、ロイ
シン、イソロイシン、バリン、セリン、スレオニン、フ
ェニルアラニン、チロシン又はプロリンの残基を包含す
る。

Ｎ−グリコシル化部位におけるグリコシル化を回避する
ためには、Ｎ−グリコシル化のためのシグナルとして認
識されるトリペプチド配列−Ａｓｎ−Ｌ−Ｔｈｒ（又は
５ｅｔ）　（この配列中、Ａｓｎはアクセプターであり
、そしてＬはグリコシル化を妨害するプロリン又はアス
パラギン酸以外の２０種類の遺伝的にコードされたアミ
ノ酸のいずれであってもよい）が変更されなければなら
ない。前記のトリペプチド配列中のＡｓｎ（Ｚｔ）残基
及び／又はＴｈｒ（Ｚｚ）残基の他のアミノ酸による置
換がこの部位におけるグリコシド連結の形成を廃止する
であろう０便利には、Ｎ−グリコシル化部位の変更は蛋
白質レベルでは行われない、そうではなく、ｓｃｕ−Ｐ
Ａをコードする遺伝子を変更して、宿主による該変更さ
れた遺伝子の発現の際に、Ｎ−グリコシル化部位が変更
されていて該部位においてグリコシル化が起り得ないよ
うな変異体ｓｃｕ−ＰＡが生産されるようにするのが有
利である。置き換えのためには、置き換えられるべきア
ミノ酸に類似する大きさ及び極性を有するアミノ酸が好
ましい。可能性ある置換基の数は対応するＤＮＡ中の所
与のヌクレオチド配列及び可能なコドンによって制限さ
れる。特に、アスパラギンはバリン、ロイシン、イソロ
イシン、アラニン、セリン、スレオニン、又は特にグル
タミンにより置き換えられ、そしてスレオニンはバリン
、メチオニン、又は特にアラニンにより置き換えられる
。ヨーロッパ特許出願Ｎｉｌ　２Ｂ８．４３５を参照の
こと。

対応する好ましいｓｃｕ−ＰＡ変異体は、（Ｇｌｙ１１
’）−ｓｃｕ−ＰＡ、（Ｓｅｔ１１９〕　−ｓｃｕ−Ｐ
Ａ　、　　（Ａｓｐ１１９〕　−ｓｃｕＰＡ　、　　（
Ｓｅｒ１３Ｓ、　Ａｓｐ１ｓ’）−ｓｃｕ−ＰＡ及び（
に１ｙ１３ＳＡｓｐ１′’）−ｓｃｕ−ＰＡ（Ａｓｎ３
０１が酵母特異的にグリコシル化されている）、そして
さらに（Ｇｉｎ””］　−ｓｃｕＰＡ、（Ｇｌｙｌｉ’
、　ＡｓｐＩ′’　、　Ｇｉｎ””）−ｓｃｕ−ＰＡ及
び（Ｓｅｒ”’　、　ＡｓｐＩｓ’、　Ｇｌｎ””）−
ｓｃｕ−ＰＡである。

Ｙ−＃’Ｐｈｅ　、Ａｓｐス＋ｔ　Ｇｌｕで・あυ、Ｙ
３ｉ＼＋’Ｌｙ５て゛あり、ＺｔΔｙ’ｔ−ＰＡの標的
部位は配列ｐｈｅ２７４−Ａｒｇｔ？Ｓ−１１ｅＲ′ｋ
Ｌｙｓ２’７？である。好ましいｔ−ＰＡ変異体はこの
部位にアミノ酸残基の特定の置換、挿入又は欠失を有し
、このためこれらはプロテアーゼの攻撃に対して耐性で
ある（前記参照のこと）。ヨーロッパ特許出願Ｎａ　２
５５．２８６、Ｎｃｔ　２２７，４６２及びＮａ　２３
３，０１３を参照のこと。

ｔ−ＰＡ分子にはＮ−グリコシル連結のための３個の部
位・すなわち−Ａｓｎ”’−５ｅｒ−Ｓｅｒ−１−＾５
ｎ１１＋４Ｇｌｙ−５ｅｒ−及び−Ａｓｎ４４１−＾ｒ
ｇ−Ｔｈｒ−が存在する。

ｔ−ＰＡ及びｔ−ＰＡグリコシル化変異体は例えば次の
式（ＩＩ）： Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　ＣｙｓＡｒ
ｇ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　ＬｙｓＴｈｒ　Ｇｌｎ　Ｍｅｔ　
ｌｉｅ　Ｔｙｒ　Ｇｌｎ　Ｇｉｎ　Ｈｉｓ　Ｇｌｎ　５
ｅｒＴｒｐ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ
　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　ＡｒｇＶａｔ　Ｇｌｕ　Ｔ
ｙｒ　Ｃｙｓ　Ｔｒｐ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌ
ｙ　ＡｒｇＡｌａ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　
Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　５ｅｒＣｙｓ　Ｓｅ
ｒ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ
　Ｇｌｙ　ＧｌｙＴｈｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ｇｌｎ　Ａ
ｌａ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　ＡｓｐＰｈｅ
　Ｖａｌ　　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ
　ＧｌｙＧｌｙ　　Ｌｙｓ　　Ｃｙｓ　　Ｃｙｓ　　Ｇ
ｌｕ　　ｌｉｅ　　Ａｓｐ　　ＴｈｒＴｈｒ　Ｃｙｓ　
Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　　ｌｉｅＡ
ｒｇ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｌ
ａ　ＧｌｕＡｌａ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　
Ｔｒｐ　Ｘ、　　５ｅｒＬｅｕ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｌｙ
ｓ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　ＧｌｙＰｒｏ　Ａｓｐ　
Ａｌａ　　ｒｌｅ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　ＬｅｕＨ
ｉｓ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｐｒ
ｏ＾５ｐＳｅｒ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｃｙｓ　Ｔ
ｙｒ　Ｖａｌ　　ＰｈｅＧＬｙ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｓｅ
ｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　ＣｙｓＰｒｏ　Ａｌａ　
Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　５ｅｒＴｙ
ｒ　ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｘｚ　　Ｇｌｙ　Ｙｚ　　Ａｌａ
　ＴｙｒＴｈｒ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｇ
ｌｕ　Ｓｅｒ　ＧｌｙＣｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ
　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　　ｌ１ｅＧｌｙ　Ｌｙｓ　
Ｖａｔ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　ＡｓｎＡｌ
ａ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌ
ｙ　ＬｙｓＴｙｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　
ＡＳｐ　Ｇｌｙ　ＡｓｐＰｒｏ　Ｔｒｐ　Ｃｙｓ　Ｈｉ
ｓ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　ＡｓｎＬｅｕ　Ｔｈｒ　
Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　ＶａｌＣｙ
ｓ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ
　ＧｌｎＰｈｅ　　Ａｌａ Ａｒｇ　　Ａｌａ Ｓｅｒ　　Ｔｙｒ Ｓｅｒ　Ｇｌｙ Ｙｌ　　Ａｌａ Ａｒｇ　　Ａｒｇ Ｇｌｙ　　Ａｓｎ Ａｒｇ　　Ａｓｐ Ｌｙｓ　　Ａｌａ Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ Ａｓｐ　Ｃｙｓ Ａｒｇ　Ｇｌｙ Ａｌａ　　５ｅｒ Ｌｅｕ　　鎖ｅ Ｐｒｏ　　５ｅｒ Ｈｉｓ　Ａｓｎ Ａｌａ　　Ｌｙｓ Ａｒｇ　　Ａｒｇ Ｐｒｏ　　５ｅｒ Ｔｙｒ　　５ｅｒ Ｇｉｎ　　Ｐｒｏ　　Ｇｌｎ Ｐｈｅ　Ａｌａ　　Ａｓｐ Ａｌａ　　Ａｌａ　　鎖ｅ Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ Ｌｅｕ　　Ｉｌｅ　　Ｓｅｒ Ａｌａ　　１ｌｉｓ　　Ｃｙｓ Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ Ｔｙｒ　　Ａｒｇ　　Ｖａｌ Ｌｙｓ　　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ しｙｓ　　Ｇｌｕ　　Ｐｈｅ Ａｓｐ　　Ｉｌｅ　Ａｌａ Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ Ｖａｔ　　Ａｒｇ　Ｔｈｒ Ｌｅｕ　　Ｇｌｎ　　Ｌｅｕ しｅｕ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｙ Ｓｅｒ　　Ｐｒｏ　　Ｐｈｅ Ａｌａ旧ｓ　Ｖａｔ Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　５ｅｒ Ｖａｌ　　Ｔｈｒ　　Ａｓｐ Ｔｈｒ　　Ａｒｃ　５ｅｒ Ｐｈｅ　　Ａｒｇ　　ｌ１ｅ １１ｅ　　Ａｌａ　　５ｅｒ Ｐｈｅ　　Ａｌａ　　Ｌｙｓ Ａｒｇ　　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｔｒｐ Ｐｈｅ　　Ｇｉｎ　　Ｇｌｕ Ｔｈｒ　　Ｖａｔ　　鎖ｅ Ｖａｔ　　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ Ｖａｌ　　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ ＡＳｐ　Ａｓｐ　Ａｓｐ Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ｇｉｎ Ｃｙｓ　　Ａｌａ　　Ｇｌｎ Ｖａｌ　　Ｃｙｓ　ｊｅｕ Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ Ｔｙｒ　　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ Ｇｌｎ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ Ａｓｎ　　Ｍｅｔ　　Ｌｅｕ Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　　Ｐｒ。

Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ Ｉｌｉｓ　　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ Ｈｉｓ　　Ａｒｇ　　Ａｒｇ Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ １１ｅ　　Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ Ａｒｇ　　Ｐｈｅ　　Ｐｒ。

Ｌｅｕ　　Ｇｌｙ　　Ａｒｇ Ｇｌｕ　　ＧＩＬＩ　　Ｇｌｕ Ｔｙｒ　　ｌｉｅ　　Ｖａｌ Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　　ＡＳｐ Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ　　５ｅｒ Ｇｌｕ　　Ｓｅｒ　　５ｅｒ Ｐｒｏ　　Ｐｒｏ　　Ａｌａ Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ 旧ｓ　Ｇｌｕ　Ａｌａ Ａｒｇ　　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ Ｐｒｏ　　Ｓｅｒ　　５ｅｒ Ｌｅｕ　＞ｈ　　Ａｒｇ Ｃｙｓ　　Ａｌａ　　Ｇｌｙ Ｇｌｎ　　Ａｌａ　　Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｇｉｎ Ｓｅｒ １ｅ １ａ Ｐｒ。

Ｔｈｒ Ｇｉｎ 鎖ｓ Ａｓｎ ＡＳｐ Ｖａｌ ＡＳｐ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ ＡＳｐ ｅｕ Ｈｉｓ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ａ
ｓｐＰｒｏ　Ｌｅｕ　Ｖａｔ　　Ｃｙｓ　　Ｌｅｕ　　
Ａｓｎ　　Ａｓｐ↑ｈｒ　Ｌｅｕ　　Ｖａｌ　　Ｇｌｙ
　　Ｉｌｅ　　ＩＩｓ　５ｅｒＧｌｙ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ
　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　　Ａｓｐ　ＶａｌＴｙｒ　Ｔｈｒ　
Ｌｙｓ　　Ｖａｌ　　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｔｙｒｌｌｅ　
Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ｐｒ。

（Ｉｔ） Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ Ｇｌｙ　　Ａｒｇ　　Ｍｅｔ Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　　Ｌｅｕ Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ （式中、Ｘ、、Ｘ、及びＸ、はそれぞれＡｓｎ又は他の
遺伝的にコードされたアミノ酸であり、Ｙ。

及びＹ２はそれぞれＳｅｔであるか又はＴｈｒ以外の他
の遺伝的にコードされたアミノ酸であり、そしてＹ、は
Ｔｈｒであるか又はＳｅｔ以外の他の遺伝的にコードさ
れたアミノ酸である） で表わされる。

さらに具体的には、ｔ−ＰＡ蛋白質は、Ｘ、、Ｘ。

及びＸ、がそれぞれＡｓｎであり、そしてＹ、、Ｙｔ及
びＹ、が前記の部味を有する式（ＩＩ）により表わされ
る。

遺伝的にコードされたアミノ酸は前に記載したものであ
る。

位置Ｘ、、Ｘ、及び／又はｘ３におけるＡｓｎの置換の
ため、アミノ酸Ｇｉｎ、　Ｔｈｒ及びＳｅｒが好ましい
。５ｅｒＹ＋及び／又はＹ２の置換のため、並びにＴｈ
ｒＹ、の置換のため、アミノ酸Ａｌａ及びＡｓｎが好ま
しい。

特に、基Ｘ１及びＹ、の１個のみ、そして／又は基Ｘ！
及びＹ２の１個のみ、そして／又は基Ｘ、及びＹ、の１
個のみが他のアミノ酸により置換されている。

特に、ｔ−ＰＡ変異体は、基Ｘ、、Ｘ２及びＸ、の１個
、２個又は３個がＡｓｎでありそして他の基がＧｌｎ、
　Ｔｈｒ及びＳｅｒから選択されたアミノ酸残基であり
、Ｙ、及びＹ２がそれぞれＳｅｔであり、そしてＹ、が
Ｔｈｒであり；あるいはＸ、、Ｘ、及びＸ。

がそれぞれＡｓｎであり、１４　ｙ　＋及びＹ２の１個
又は２個がＳｅｔでありそして他の基がＡｌａ及びＡｓ
ｎから成る群から選択され、そしてＹ、がＴｈｒであり
；あるいはＸｔ、Ｘｉ及びＸ、がそれぞれＡｓｎであり
、Ｙｌ及びＹ２がそれぞれＳｅｔであり、そしてＹ、が
Ａｌａ及びＡｓｎから成る群から選択される式（ＩＩ）
により表わされる。

特に、ｔ−ＰＡ変異体は、Ｘ、、、Ｘ、及びＸ、がＡｓ
ｎであり、そして基Ｙ、、Ｙ、及びＹ、の少なくとも１
つがＡｌａ又はＡｓｎであり、そして他の基が５ｅｔ（
Ｙｌ及びＹ、）又はＴｈｒ（Ｙｚ）である式（ＩＩ）で
表わされる。

この様なｔ−ＰＡ変異体の例は、〔八ｓｎ１１９〕　−
ｔ−ＰＡ　。

（Ａｌａ””）　−ｔ−ＰＡ　、　　〔Ａｌａ１８６〕
　−ｔ−ＰＡ　、　　（Ａｓ　ｎ　Ｉ　ｌ　＊Ａｆａ１
１９〕　−ｔ−ＰＡ　、　　（Ａｓｎ””　、　Ａｌａ
””　、　Ａｓｎ４Ｓ’）　−ｔ−ＰＡ及び（Ａｓｎ目
’　、　Ａｌａ”’　ｒ　Ａｌａ１１９〕−ｔ−ＰＡで
ある。

ｕ−ＰＡ及びｔ−ＰＡの断片は特に、天然ｕ−ＰＡ又は
ｔ−ＰＡの線溶活性のために必須でないセグメント又は
ドメインが除去されたものである。この様な断片及びそ
の製造方法はそれ自体既知である。

ｕ−ＰＡ／　ｔ−ＰＡ／Ｘイブリドプラスミノーゲン活
性化因子は特に、ヒトｔ−ＰＡの触媒ドメインに直列に
連結された、ヒトｕ−ＰＡのすべてのもしくは個別のＡ
−鎖ドメイン又はヒトｕ−ＰＡ及びヒトｔ−ＰＡの個別
のＡ−鎖ドメインを含有するアミノ酸配列を含んで成る
単鎖ハイブリドプラスミノーゲン活性化因子、あるいは
ヒトｕ−ＰＡの触媒領域に直列に連結された、ヒトｔ−
ＰＡのすべてのもしくは個別のＡ−１Ｊｆドメイン又は
ヒトｔ−ＰＡ及びｕ−ＰＡの個別のＡ−鎖ドメインを含
有するアミノ酸配列を含んで成る単鎖ハイブリドプラス
ミノーゲン活性化因子（ヨーロッパ特許出願Ｎｏ、　２
７７．３１３に開示されている）；あるいはｕ−ＰＡク
リングルに続（ｕ−ＰＡ活性化部位までのアミノ酸セグ
メントがｔ−ＰＡクリングル２に続く　ｔ−ＰＡ活性化
部位までのアミノ酸セグメントにより置き換えられてい
る点においてｕ−ＰＡとは異る単鎖ハイブリドプラスミ
ノーゲン活性化因子である。

好ましいバイブリドＰＡはヒトｕ−ＰＡの触媒領域を含
有する。

特に、単鎖バイブリドＰＡは、ヒトｕ−ＰＡの触媒領域
に直列に連結された、ヒトｔ−ＰＡのＡ−鎖ドメインの
すべてを含有するアミノ酸配列、ヒｌ−ｔ−ＰＡの個別
のＡ−鎖ドメイン例えばヒトｔ−ＰＡのフィンガードメ
イン又はクリングルドメイン特にタリングル２ドメイン
を含有するアミノ酸配列、及びヒトｔ−ＰＡ及び／又は
ヒトｕ−ＰＡの２個、３個もしくは４個のＡ−鎖ドメイ
ン、特にヒトｔ−ＰＡの２個もしくは３個のドメイン又
はヒトｕ−ＰＡ及びヒトｔ−ＰＡの２個もしくは３個の
ドメイン、例えばヒトｔ−ＰＡのフィンガードメイン、
成長因子ドメイン及びクリングル２ドメイン、ヒトｔ−
ＰＡのフィンガードメイン及びクリングル２ドメイン、
又はｕ−ＰＡ成長因子ドメイン及びｔ−ＰＡクリングル
２ドメインを含有するアミノ酸配列、並びにヒト　ｔ−
ＰＡの触媒領域に直列に連結された、ｕ−ＰＡ成長因子
ドメイン及びｔ−ＰＡクリングル２ドメインを含有する
アミノ酸配列、から成る群から選択されたアミノ酸配列
を含んで成る単鎖ハイブリドプラスミノーゲン活性化因
子である。

好ましくは、バイブリドＰＡのアミノ酸配列は、ｔ−Ｐ
ＡのＮ−末端アミノ酸１〜５又はｕ−ＰＡのＮ−末端ア
ミノ酸１−１２から始まり、あるいはバイブリドＰＡの
第一ドメインにＮ−末端側に自然に連結している任意の
連結配列又はこの様な連結配列の好ましくは５個以上の
アミノ酸配列を有する断片から始まる。

バイブリドＰＡにおいて、複数のＡ−鎖ドメインは天然
連結配列、融合連結配列もしくはバイブリド連結配列又
はそれらの断片を介して連結されている。すなわち、第
一ドメインは第ニドメインに、該第−ドメインのＣ−末
端に自然に存在する連結配列により、該第ニドメインの
Ｎ−末端に自然に存在する連結配列により、これらの連
結配列から成る融合連結配列により、又はこれらの断片
により連結されている。

本発明のバイブリドＰＡのＡ−鎖ドメインはＢ−鎖セリ
ンプロテアーゼ領域に、ヒトｔ−ＰＡにおいてクリング
ル２ドメインをＢ−鎖に連結する連結配列、ヒトｕ−Ｐ
ＡにおいてクリングルドメインをＢ鎖に連結する連結配
列、又はこれらの連結配列のサブ配列から成るバイブリ
ド配列により連結されており、該連結配列はプラスミン
により開裂され得るプロセシング部位、及びこの部位に
対してＮ−末端側にあり、触媒Ｂ−鎖領領域の硫黄−硫
黄橋に関与し得るシスティン残基を含有し、そして該連
結配列は好ましくは４０個以上で６０個以下のアミノ酸
残基を有する。

対応するＤＮＡ上でのエクソン−イントロン連結により
定義される位置でのドメインの連結が最も好ましい。Ａ
−鎖とＢ−鎖との連結は活性化部位において最も好まし
い。

特に、単鎖ハイブリドプラスミノーゲン活性化因子は、
ｔ−ＰＡの触媒領域（Ｂ−鎖）に直列に連結された、ｕ
−ＰＡのＡ−鎖又はｕ−ＰＡ成長因子ドメインとＬ−Ｐ
Ａクリングル２ドメインとから本質的に成るＡ−鎖を含
んで成るハイブリドプラスミノーゲン活性化因子、及び
ｕ−ＰＡの触媒領域（Ｂ−鎖）に直列に連結された、ｔ
−ＰＡのＡ−鎖、ｔ−ＰＡのフィンガｇｌ域ドメインか
ら本質的に成るＡ−鎖、ｕ−ＰＡ成長因子ドメインとｔ
−ＰＡクリングル２ドメインとから本質的に成るＡ−鎖
、又はｔ−ＰＡのフィンガードメインと成長因子ドメイ
ンとクリングル２ドメインとから本質的に成るＡ−鎖を
含んで成るプラスミノーゲン活性化因子、から成る群か
ら選択された単鎖ハイブリドプラスミノーゲン活性化因
子（ここで、前記へ−鎖は前記Ｂ−鎖に連結配列を介し
て連結されており、該連結配列は活性化部位と、前記Ｂ
−鎖への硫黄−硫黄結合を形成することができるシステ
ィン残基とを含んで成る）、あるいは、ｕ−ＰＡの触媒
領域（Ｂ−鎖）に活性化部位において連結されたｔ−Ｐ
Ａクリングル２ドメインから本質的に成るＡ−鎖を含ん
で成る単鎖ハイブリドプラスミノーゲン活性化因子であ
る。

特に好ましい単鎖ハイブリドプラスミノーゲン活性化因
子は、ｔ−ＰＡの触媒領域（Ｂ−鎖）に直列に連結され
た、ｕ−ＰＡ成長因子ドメインとｔ−ＰＡクリングル２
ドメインとから本質主成るＡ鎖を含んで成る単鎖ハイブ
リドプラスミノーゲン活性化因子、又はｕ−ＰＡの触媒
領域（Ｂ−鎖）に直列に連結された、ｔ−ＰＡクリング
ル２ドメインから本質主成るか又はｔ−ＰＡフィンガー
ドメインとクリングル２ドメインとから本質主成るＡ−
鎖を含んで成る単鎖ハイブリドプラスミノーゲン活性化
因子であって、前記へ−鎖と前記Ｂ−鎖との連結が活性
化部位にあるもの、である。

本発明の好ましいバイブリドＰＡは、 〔ｕＰＡ（１−１５８）−ｔＰＡ（２７６−５２７）　
）、〔ｕＰＡ（１−１３１）−ｔＰＡ（２６３−５２７
）　　）　　、〔ｔＰＡ（１−２７５）−ｕＰＡ（１５
９−４１１）　）、〔ｔＰＡ（１−２６２）−ｕＰＡ（
１３２−４１１）　　）　　、〔ｕＰＡ（１−４４）−
ｔＰＡ（１７６−２６１）−ｕＰＡ（１３４−４１１）
　）、（ｔＰＡ（１−４９）−ｔＰＡ（２６２−２７５
）−ｕＰＡ（１５９−４１１）　）、〔ｔＰＡ（１−４
９）−ｕＰＡ（１３４−４１１）　）、〔ｔＰＡ（１−
４９）−ｔＰＡ（１７６−２７５）−ｕＰＡ（１５９−
４１１）　］、〔ｔＰＡ（１−４９）−ｔＰＡ（１７６
−２６２）−ｕＰＡ（１３２−４１１）　）、〔ｕＰＡ
　（１−４４）−ｔＰＡ　（１７６−５２７）〕　　、
〔ｕＰＡ（１−４４）−ｔＰＡ（１７６−２７５）−ｕ
ＰＡ（１５９−４１１）　）、〔ｕＰＡ（１−１３３）
−ｔＰＡ（２６２−２７５）−ｕＰＡ（１５９−４１１
）　）、（ｔＰＡ（１−３）−ｔＰＡ（１７６−２７５
）−ｕＰＡ（１５９−４１１）　）、〔ｔＰＡ（１−８
６）−ｔＰＡ（１７６−２７５）−ｕＰＡ（１５９−４
１１）　　）　　及び〔ｔＰＡ（１−８６）−ｔＰＡ（
１７６−２６２）−ｔＰＡ（１３２−４１１）　）であ
る。

ハイブリドプラスミノーゲン活性化因子〔ｕＰＡ　（１
−４４）　−ｔＰＡ　（１７６−５２７）、〔ｔＰＡ　
（１−４９）　−ｔＰＡ（１７６−２７５）−ｕＰＡ（
１５９−４１１）　）及び（ｔＰＡ（１−３）−ｔＰＡ
（１７６−２７５）−ｔＰＡ（１５９−４１１）　）が
特に好ましい。

バイブリドＰＡの変異体においては、少なくとも１個の
、そして好ましくはすべてのＮ−グリコシル化部位が、
これらの部位においてグリコシル化が起こり得ないよう
に変更されている。

特に、アスパラギンはバリン、ロイシン、イソロイシン
、アラニン、又は特にグルタミンにより置換されており
、そしてセリン又はスレオニンはバリン、メチオニン、
又は特にアラニンにより置換されている。

好ましい変形されたバイブリドＰＡは、〔ｔＰＡ（１−
４９）−ｔＰＡ（２６２−２７５）−ｕＰＡ（１５９−
３０１，Ｇｉｎ。

３０３−４１１）　）、 （ｔＰＡ（１−４９）−ｔＰＡ（１７６−１８５，Ａｌ
ａ、　　１８７−２７５）−ｕＰＡ（１５９−３０１，
Ｇｉｎ、　３０３−４１１）　）、〔ｕＰＡ（１−４４
）−ｔＰＡ（１７６−１８５，八Ｉａ、　　１８７−４
４９．　　Ａｌａ。

４５１−５２７）　）、 〔ｔＰＡ（１−３）−ｔＰＡ（１７６−１８５，Ａｌａ
、　１８７−２７５）−ｕＰＡ（１５９−３０１，Ｇｌ
ｎ、　３０３−４１１）　）、〔ｔＰＡ（１−８６）−
ｔＰＡ（１７６−１８５，Ａｌａ、　　１８７−２７５
）−ｕＰＡ（１５９−３０１，Ｇｉｎ、　　３０３−４
１１）　　）、〔ｔＰＡ（１−４９）−ｔＰＡ（１７６
−２７５）−ｕＰＡ（１５９−３０１，Ｇ１ｎ３０３−
４１１）　）、 〔ｔＰＡ（１−３）−ｔＰＡ（１７６−２７５）−ｕＰ
Ａ（１５９−３０１，Ｇｉｎ。

３０３−４１１）　）、 （ｔＰＡ（１−４４）−ｔＰＡ（１７６−４４９，Ａｌ
ａ、　４５１−５２７）〕、〔ｔＰＡ（１−８６）−ｔ
ＰＡ（１７６−２７５）−ｕＰＡ（１５９−３０１，Ｇ
ｌｎ。

３０３−４１１）　）、 〔ｕＰＡ（１−１３３）−ｔＰＡ（２６２−２７５）−
ｕＰＡ（１５９−３０１，Ｇｌｎ。

３０３−４１１）　）、 〔ｕＰＡ（１−１３３）−ｔＰＡ（２６２−２７５）−
ｕＰＡ（１５９−３０３，Ａｓｎ。

３０５−４１１）　）、 〔ｕＰＡ（１４４）−ｔＰＡ（１７６−１８５，Ａｌａ
、　　１Ｂ？−２７５）−ｕＰＡ（１５９−３０１，０
ｉｎ、　３０３−４１１）　）及び（ｔＰＡ（１−４４
）−ｔＰＡ（１７６−１８５，Ａｌａ、　　１Ｂ？−２
７５）−ｕＰＡ（１５９−３０３，Ａｓｎ、　３０５−
４１１）　）である。

「ヒルジン」なる語は、天然源、例えば蛭ヒルド・メデ
ィシナリス（Ｉｌｉｒｕｄｏ　ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ
）から得られるヒルジン、組換えＤＮＡ技法により得ら
れるヒルジン、並びに個有のスロンビン阻害活性を維持
している変異体及びその断片を包含する。

多数のこの様なヒルジンがり、Ｔｒｉｐｉｅｒ　（Ｆｏ
ｌｉａＨａｅｍａｔｏｌ、　１１５．３０（１９８８）
〕により公表されている。

本発明の組成物のヒルジン成分は、例えば、次の式（■
）： Ｖａｌ　Ｖａｔ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｔ
ｈｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　ＧｌｙＧｌｎ　　Ａｓｎ　　Ｌ
ｅｕ　　Ｃｙｓ　　Ｌｅｕ　　Ｃｙｓ　　Ｇｌｕ　　Ｇ
ｌｙ　　Ｓｅｒ　　ＡｓｎＶａｔ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇ
ｌｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　ｌｉｅ　Ｌｅ
ｕＧｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　
Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ｃｙｓ　ＶａｔＴｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌ
ｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ
　５ｅｒ１鎖ｓ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｐ
ｈｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｐｒ。

〔式中、ＷはＴｙｒのフェノール性ヒドロキシル基を表
わす（デスルファトヒルジンＨＶＩ）か、又は式−０−
ＳＯ２計の基を表わす（ヒルシフ１１ｖｌ　）　：ｌ　
テ表わされるヒルジン変形体ＨＶ　１　　（Ｄ、Ｂａｇ
ｄｙＭｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　Ｊ４　　、６
６９−６７８（１９７６）許漱４．７４５．１７７）　
　； 次の式（■）： １１ｅ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｔ
ｈｒ　Ｇｌｕ　５ｅｒＧｉｎ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ
　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　５ｅｒＶａｌ　　
Ｃｙｓ　　Ｇｌｙ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｙ　　Ａｓｎ　　
Ｌｙｓ　　Ｃｙｓ　　鎖ｅＧｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｇ
ｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　ＣｙｓＴｈｒ
　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　
Ｐｒｏ　ＧｌｕＨｉｓ　　Ａｓｎ　　Ａｓｎ　　Ｇｌｙ
　　Ａｓｐ　　Ｐｈｅ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ　　ｌ１ｅ
Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎら、 ；米国時 ｔｙ Ａｓｎ Ｌｅｕ ａｔ Ｓｅｒ Ｐｒ。

（ＴＶ） で表わされるヒルジン変形体ＨＶ　２　（Ｒ８Ｐ、Ｈａ
ｒｖｅｙら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、
ＵｓＡ　８３　、１０８４−１０８８（１９８６）〕　
； 次の式（■）： ｌｉｅ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｃｙａ　Ｔ
ｈｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　ＧｌｙＧｉｎ　　Ａｓｎ　　Ｌ
ｅｕ　　Ｃｙａ　　Ｌｅｕ　　Ｃｙｓ　　Ｇｌｕ　　Ｇ
ｌｙ　　Ｓｅｒ　　ＡｓｎＶａｌ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｌ
ｙａ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　ｌｉｅ　Ｌｅ
ｕＧｌｙ　　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　　Ｇｌｙ　　Ｌｙｓ　　
Ａｓｐ　　ＡｓｎＴｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔ
ｈｒ　Ｐｒｏ　ＬｙｓＨｉｓ　　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ｇｌ
ｙ　　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　ＧｌｕＧｌｕ　Ａｓｐ　Ａｌａ
　　Ｔｙｒ　　Ａｓｐ　Ｇｌｕ（Ｖ） Ｇｉｎ Ｃｙａ ａｔ Ｐｒｏ　　Ｇｉｎ　　５ｅｒ Ｐｒｏ　　Ｉｌｅ　　Ｐｒ。

で表わされるヒルジン変形体ＰＡ　（Ｊ、Ｄｏｄｔら、
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｓ＋、Ｈｏｐｐｅ−３ｅｙｌｅｒ　３
６７　、８０３−８１１（１９８６）　）　　；あるい
は前記ヒルジン変形体の断片又は変異体である。

デスルファトヒルジンＨＶＩが特に好ましい。

こレラのヒルジン変形体、特にヒルジン変形体ＨＶ　１
　、の適当な断片は、例えばＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　２
１１゜１０（１９Ｂ？）　；　Ｊ、Ｍｅｄ、Ｃｈｅｗ、
　３１　、１００９（１９８８）　；　Ｂｉｏ−ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ　２７　、８１７０（１９８８）　；　Ｊ
、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅａ＋、　２６４゜８６９２（１９８
９）　；及びＥＰ　２７６０１４から知られており、そ
して例えばヒルジンＨＶＩ又はＰＡの９〜３０個のＣ−
末端アミノ酸から成る。他の断片は、例えば、Ｃ−末端
アミノ酸Ｇｌｎ又はＣ−末端ジヘプチド残基Ｌｅｕ−Ｇ
ｉｎを欠くヒルジンＩＩＶＩである。

本発明のヒルジンの変異体には、Ｎ−末端に、コアー領
域中に又はＣ−末端に部位特異的変異を有するヒルジン
類特にヒルジンＨｖｌが含まれる。

ヒルジンＨＶＩのこの様なＮ−末端変異体は例えば（Ｉ
ｌｅ”）−デスルファトヒルジンＨＶＩ（Ｎ−末端のア
ミノ酸Ｖａｌ−Ｖａｌがｌ１ｅ−１１ｅにより置き換え
られている）、又は（Ｇｌｙ’）−デスルファトヒルジ
ンＨν１　（Ｎ−末端アミノ酸ＶａｌがＧｕｙにより置
き換えられている）である、ヒルジンＨＶＩの対応する
Ｃ−末端変異体には、例えば、（Ｇｌｎｓｆｆ’　％Ｌ
　ｈｈ６２〕−デスルファトヒルジン（アミノ酸５７　
、５８　。

６１及び６２がＧｌｎにより置き換えられている）、及
び（Ｐｒｏ’″〕−デスルファトヒルジン（Ｃ−末端に
追加のＰｒｏ残基を有する）が含まれる。デスルファト
ヒルジン！１ν１の対応するコアー変異体には、例えば
、（Ｇｌｎ”＋　Ａｒｇ”）−デスルファトヒルジン１
１ν１１これにさらにＮ−末端に追加のＮｅｔを有する
（Ｎｅｔ”、　Ｇｉｎ”、　Ａｒｇ”）−デスルファト
ヒルジン１（Ｖｌ、及び（Ｇｌｎ”、　Ｇｉｎ”、Ａｒ
　ｇ　４　ｔ　）−デスルファトヒルジンＨＶＩが含ま
れる。他の変異体は（ｄｅｓ−Ｖａｌ’、　Ｔｈｒ”）
−デスルファトヒルジンＨＶＩである。ヒルジンＨＶ１
、ヒルジンＨＶ２の変異体は、例えば（Ｌｙｓ”）−ヒ
ルジン）ｌＶ２である。これらの変異体のすべてが既知
であり、そして当業界において知られている方法により
、例えば対応する親ヒルジンをコードする遺伝子を部位
特異的変異誘発にかけ、そして変異したヒルジン遺伝子
を酵母のごとき適当な宿主中で発現せしめることにより
製造することができる。

前記ヒルジンの他の変異体は例えばヨーロッパ特許出願
ＮＯ，２７３，８００に開示されているものである。

特に、本発明は、成分Ａとしての、 （１）　ｓｃｕ−ＰＡ。

（２）ｔ−ＰＡ、 （３）Ｘ＋　　、Ｘ！及びＸ、がそれぞれ八ｓ１であり
、そして基ｙ　＋　　、　Ｙ　を及びＹ、の少なくとも
１つがｌ１ｅ又はＡｓｎでありそして他の基が５ｅｒ（
Ｙｔ及びＹｚ）又はＴｈｒ（Ｙｓ）である式（ＩＩ）の
５ｃＬ−ＰＡ変異体、及び （４）ｔ−ＰＡの触媒領域（Ｂ−鎖）に直列に連結され
たｕ−ＰＡ成長因子ドメインとから本質的になる八−鎖
を含んで成るバイブリドＰＡ及びｕ−ＰＡの触媒領域（
Ｂ−鎖）に直列に連結されたｔ−ＰＡクリングル２から
本質的に成るか又はＬ−ＰＡフィンガードメインとクリ
ングル２ドメインから本質的に成るバイブリドＰＡであ
って、該Ａ−鎖ドメインと該Ｂ鎖との間の連結が活性化
部位にあるもの、から成る群から選択された単鎖ｕ−Ｐ
Ａ／ｌ−ＰＡハイブリドプラスミノーゲン活性化因子、 から成る群から選択されたプラスミノーゲン活性化因子
、並びにＢ成分としてのデスルファトヒルジンＨＶＩを
、医薬として許容されるキャリヤーと共に含んで成る医
薬組成物に関する。

本発明の最も好ましい医薬組成物においては、成分Ａは
、ｓｃｕ−ＰＡＳｔ−ＰＡ、〔＾ｌａ１１９〕　−ｔ−
ＰＡ　。

〔＾５ｎ１１９　　、八１ａ１８”　　、Ａｌａ”０）
　　−ｔ−ＰＡ　　、　　　〔ｕＰＡ（１−４４）−ｔ
ＰＡ（１７６−ｓ２７）〕、（ｔｐＡ（１−４９）−ｔ
ＰＡ（１７６−２７５）ｕＰＡ（１５９−４１１）　）
及び〔ｔＰＡ（１−３）−ｔＰＡ（１７６−２７５）−
ｕＰＡ（１５９−４１１）　）から成る群から選択され
、そして成分ＢはデスルファトヒルジンＨＶＩである。

本発明のプラスミノーゲン活性化因子及びヒルジンは既
知化合物である。例えばヨーロッパ特許出願Ｎ［１１４
３，０８１，隘２２５　、２８６、Ｎα２００，６５５
、Ｎｕ　２２５，６３３及び魔２７７．３１３に記載さ
れているように、形質転換された哺乳類細胞又は酵母細
胞を用いる組換えＤＮＡ技法により製造されたヒルジン
が好ましい。

本発明の新規な組合せ組成物は哺乳類（ヒト又は動物）
において、血栓症又は血栓症により惹起される疾患、動
脈硬化症、心筋梗塞及び脳梗塞、静脈血栓症、血栓塞栓
症、術後血栓症、血栓性静脈炎等の予防又は治療のため
に使用することができる。

本発明の医薬組成物は前記の症状の治療のために使用す
ることができ、これらは非経口的に、例えば静脈内に、
又はヒルジンに関しては皮下に投与される。

注入溶液又は注射溶液が適当であり、水性等張溶液又は
懸濁液が好ましく、これらは使用前に、例えば凍結乾燥
品から調製することができ、この凍結乾燥品は、例えば
、活性成分を単独で、又は医薬として許容されるキャリ
ヤー、例えばマンニトール、ラクトース、デキストロー
ス、ヒト血清アルブミン等と共に含有する。医薬組成物
は無菌化され、そして所望により助剤、例えば防腐剤、
安定剤、乳化剤、溶解剤、緩衝液及び／又は浸透圧を調
整するための塩（例えば０．９％塩化ナトリウム）と混
合される。無菌化は小孔サイズ（直径０．４５１Ｍ以下
）のフィルターを通しての無菌濾過により達成すること
ができ、この後所望により組成物を凍結乾燥することが
できる。無菌性の維持を助けるために抗生物質を加える
ことができる。例えば、ＰＡの投与のために開発された
標準的製剤技法（ヨーロッパ特許出願に９３．６１９、
Ｎｔ１４１．７６６、Ｎα１１２，９４０等）、又は低
ｐＨに緩衝化された媒体中でＰＡに十分な溶解性を付与
する新規な組成物（ヨーロッパ特許出願Ｎｏ、　２１１
．５９２、並びに独国出願公開Ｎｏ、３，６１７，７５
２、陥、３．６１７，７５３、及びＮα３，６４２．９
６０に例が存在する）を用いることができる。ヒルジン
はそれ自体水溶液中に非常に熔解性であり、溶解を増強
するための添加物を必要としない、安定性の理由のため
、５％デキストロース、５％マンニトール又は０．９％
塩化ナトリウム等中の凍結乾燥サンプルを再溶解するの
が好ましい。

本発明の組合せ組成物においては、活性成分（プラスミ
ノーゲン活性化因子及びヒルジン）を同時に且つ同じ経
路で（すなわちカニユーレにより）投与する（例えば注
入する）ことができ、あるいはまずヒルジンを好ましく
はポルス（ｂｏｌｕｓ）注射により適用し、そして次に
その後５〜１０分間以内に第二成分、特にプラスミノー
ゲン活性化因子を注入により適用を開始し、あるいは特
に全投与量のヒルジンを、少量、例えば５〜２０％のプ
ラスミノーゲン活性化因子と共にポルス注射により適用
し、そして次にその後５〜１０分間以内に主たる量のプ
ラスミノーゲン活性化因子の注入による適用を開始する
。注入は３０分間〜３時間行われる。

疾患のタイプ並びに患者の年令及び状態に依存して、体
重約７０ｋｇの患者の治療のために１回投与すべき日用
量は１０〜２００■、特に２０〜１００　ｆｆ１ｇの範
囲のプラスミノーゲン活性化因子及び５〜１００■、特
に１０〜３０■のヒルジン（特に、活性化部分的スロン
ボプラスチン時間（ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｐａｒｔｉａ
ｌｔｈｒｏｍｂｏｐｌａｓｔｉｎ　ｔｉｍｅ　；　ａＰ
ＴＴ）の２倍の延長を導く投与りである。従って、組成
物中のプラスミノーゲン活性化因子とヒルジンとの重量
比は一般に２０＝１〜２：ｌの範囲で異ることができる
。５：１〜２：１の重量比を用いるのが好ましい。

本発明の医薬組成物は、単位投与形で、例えば療法的有
効量の両成分（プラスミノーゲン活性化因子及びヒルジ
ンを含んで成るアンプルとして、又は療法的有効量の成
分を別々に医薬として許容されるキャリヤーと共に含ん
で成る二連のアンプルとして提供される。

本発明の医薬組成物はそれ自体既知の方法により、常用
の凍結乾燥法又は溶解法を適用して、例えば、所望によ
り、プラスミノーゲン活性化因子及びヒルジン並びに場
合によっては医薬として許容されるキャリヤーを混合し
、そして凍結乾燥物の調製のためには得られた水溶液を
凍結乾燥することにより製造される０組成物は約０．１
％〜２０％、特に約１％〜ｌＯ％の、そして凍結乾燥物
の場合には１００％までの活性成分を含有する。

本発明はまた、本発明の組合せ組成物の、人体又は動物
体の予防的及び治療的処置のため、特に前記の臨床的症
状のため、特に人体又は動物体での血栓症又は血栓症に
より想起される疾患の予防及び治療のための使用に関す
る。

本発明の他の対象は、ヒルジンが、機械的手段（ＰＴＣ
Ａ）又は化学的手段（溶解）によりあらかじめ開通した
血管（静脈又は動脈）の閉塞（血栓の新たな形成）速度
を劇的に低下せしめ、そしてそれ故に凝固障害を確かに
治療するという期待を改善する。従って、本発明は、最
初に閉塞しそして機械的又は化学的に再開通した哺乳類
の血管の再閉塞を予防する方法に関し、この方法は該動
物に療法的有効量のヒルジンを投与することを含んで成
る。好ましくは、閉塞した血管が開通した直後に、例え
ば、場合によっては抗血栓剤と組合わせたプラスミノー
ゲン活性化因子を用いる血栓溶解療法の終了の後にヒル
ジンを投与する。疾患のタイプ並びに患者の年令及び状
態に依存して、約７０ｋｇの体重の患者の処置のために
注入により、又は好ましくは２回のポルス注射により投
与されるべきヒルジンの日用量は２０〜１００■、特に
約５０〜７０■の範囲である。ヒルジンを用いる抗−再
閉塞療法は、再閉塞の危険が最小になるまで、例えば１
〜３週間、特に約２週間にわたり続ける。

次に、例により本発明をさらに具体的に説明するが、こ
れにより本発明の範囲を限定するものではない。

肛　インビトロ　　？０” ヒトの血液を３．８％クエン酸ナトリウム溶液中に直接
吸い取る（血液／クエン酸塩溶液の比率９：ｌ）。この
混合物を１　、００Ｏｒｐｍにて１０分間遠心分離して
クエン酸塩添加血漿を得る。

１５０〃のクエン酸塩添加血漿 １２５ｍの０．９％塩化ナトリウム溶液１００ＪＩ！の
０．９％基塩化ナトリウム中スルファトヒルジン又はＭ
Ｃｌ−９０３８（後記参照のこと） から成る混合物を、３７°Ｃに平衡化されたｌｄのキュ
ベント中に直接調製する。この混合物を３７°Ｃにて１
５分間インキュベートする。次に、ｌｘ／−のｔ−ＰＡ
ストック溶液（アメリカン・ダイアグノスチ力、ニュー
ヨーク）２５１１１及び０．００２５Ｍ塩化カルシウム
溶液３００４を出発凝固物に加える。

光学濃度（凝４鎖）の変化を、速度プログラムを備えた
ユビコン（ＩＪｖｉｋｏｎ　８１０Ｐ）分光光度計にて
６０８０−で連続的に測定する。

ＣａＣｌ□溶液の添加から吸光度が０．０２５より多く
変化するまでの時間（分）を凝固時間として定義する。

血餅溶解時間（分）を、凝固の開始から吸光度が最大吸
光度の１０％に低下する時までの時間として定義する。

スロンビン阻害剤ＭＣｌ−９０３８（（２Ｒ、４Ｒ）　
−４−メチル−１−（Ｎ”　−（（３−メチル−１゜２
．３．４−テトラヒドロ−８−キノリル）−スルホニル
）−Ｌ−アルギニル〕−２−ピペリジンーカルボン酸は
Ｓ、Ｏｋａｍｏｔｏら、Ｂｉｏｃｈｅ＋＋、Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ。

Ｒｅｓ、Ｃｏｍｏ＋ｕｎ、　１０１．４４０−４４６（
１９８１）に記載されているようにして化学合成される
。これを次の最終濃度、すなわち０．０？　、　０．１
４　、０．２８　、０．５６及び１．１−において使用
する。使用したデスファトヒルジンは、ヨーロッパ特許
出願Ｎα２２５．６３３に記載されている方法に従って
形質転換された酵母を用いて組換えＤＮＡ技法により製
造されたものである。これは次の最終濃度、すなわち０
．８　、１．６　、３．２　。

８及び１８ｎＭにおいて使用する。ＭＣｌ−９０３８及
びデスルファトヒルジンの選択された濃度は血餅形成時
間（凝固）の延長に関して同じ効力（ｅｑｕｉｐｏｔｅ
ｎｔ）の濃度であり、例えば１．２　ｍ　ＭＣｌ−９０
３８及び１６ｎＭデスルファトヒルジンはａＰＴＴの同
一の延長を導く。

デスルファトヒルジンにおいて所与の濃度により示され
るのと同じ効果を達成するために２０倍濃度のＭＣｌ−
９０３８を用いなければならないことが明らかである。

貫久　ラビットの　　　　　　モー゛ル３０■／ｋｇの
ナトリウムベンドパルビクールの静脈（耳縁部静脈）内
注射により麻酔された二ニーシーラントホワイトラビッ
ト（体重２．３〜３．５ｋｇ）を用いて実験を行う。

首の二次的切開によって頚静脈及び右頚動脈を露出せし
める。血液サンプリングのため直径１．５胴のポリエチ
レンカニユーレを右頚動脈に挿入スる。２本の頚静脈を
分離し、２ｃｍの距離にわたって清浄にし、小側技を結
紮し、各頚静脈セグメントから血液を空にし、そして２
個の止血子により１、５　ａａ＃　して近位及び遠位の
両方で血流を一時的に閉止する。あらかじめコラーゲン
溶液に浸漬した１０ｃ＋ａの長さの３．　ＯＴｉＣｒｏ
ｎ編みポリスチレン縫合を分離された頚静脈の管腔に長
手方向に４Ｃ１１１の距離にわたって導入することによ
り、生成される血栓の塞栓を回避する。５バの１２５７
−フィブリノーゲン（約５００　、０００ｃｐｍ　）を
含有するクエン酸塩添加ラビット血１５０Ｉ！１を、５
０ｍ　（５１，Ｕ）のスロンビン及び１０ｍのＣａＣ１
ｘ　（０，２５Ｍ　）を含有する１−のラベルコリン（
ｔｕｂｅｒｃｏｌｉｎｅ）シリンジ中に吸引する。成分
を迅速に混合し、そして２５ゲージ針を介して頚静脈の
分離されたセグメントに注射する。

血栓を３０分間成熟せしめ、そして次に両血管クランプ
を取り外し、そして血流を再開する。

定速注入ポンプを用いて静脈内注入を行う。黒色腫細胞
培養物由来のｔ−ＰＡをバイオレスポンス（ＢｉｏＲｅ
ｓｐｏｎｓｅ）　、米国、から得る。合計投与量０．５
■のＬ−ＰＡを耳縁静脈を介して３時間にわたり注入す
る。ｔ−ＰＡと共に、食塩水、標準ヘパリン（カビビト
ラム、スエーデン、１４０ＵＳＰ／Ｒ１ｇ　；　０．７
５■／ｋｇ）又はヒルジン（１■／ｋｇ）を注入する。

対照実験においてａＰＴＴ　（活性化部分的スロンボブ
ラスチン時間）の延長、例えば２倍の延長をもたらすヘ
パリン及びヒルジンの投与量を用いる。

対照として、１つの動物群にｔ−ＰＡを添加しない食塩
水のみを注入する。注入の終りにおいて血管中に残留す
る血栓を取り出し、そして血栓中に残留する１２５１−
標識フィブリノーゲン量を測定しそしてその結果を食塩
水対照と比較することにより、残留血栓のサイズを決定
する。

実験結果を第１表にまとめる。

星−上−１ 組合せ 第一セットの実験 ｔ−ＰＡ十食塩水 ｔ−ＰＡ＋デスルファ 第二セットの実験 ｔ−ＰＡ十食塩水 ｔ−ＰＡ＋ヘパリン トヒルジン 溶解 （％） 動物数ｎ ｎ＝５ ｎ＝１２ ｎ＝１８ ｔ−ＰＡによる血栓溶解の間の血栓の拡大の回避におけ
る標準ヘパリン及び組換えデスルファトヒルジンの効果
を、ラビットの頚静脈中にあらかじめ形成された同源の
（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）非放射性血栓への１２５１−
フィブリノーゲンの蓄積を阻害するそれらの能力として
評価する。前記のようにして標準サイズの非放射性血栓
を生成せしめる。５分間後に標準ヘパリン又はデスルフ
ァトヒルジンと共にｔ−ＰＡの注入を開始する（濃度は
例２ａの通り）。

３時間の注入の終りに血栓を含む静脈セグメントを結び
、長手方向に切り開き、そして残留する血栓を取り出す
。全血液フィブリノーゲンの比活性を、注入期間にわた
って１時間の間隔で血液サンプルの平均から算定する。

血栓の放射能対循環フィブリノーゲンの放射能の比を用
いて血栓のサイズを定量し、そしてこれを血栓上に蓄積
したＭｇ又はＩｔＳｌ−フィブリノーゲンとして表わす
。

この結果を第１図及び第２図に要約する。

第１図が示すところによれば、血餅の溶解の間に、あら
かじめ形成された血餅の表面に新たな１″Ｓ１−フィブ
リノーゲン−フィブリンが沈着する（例えば、ｔ−ＰＡ
のみでは５２躍）。ヘパリンは明らかに有利な効果を有
さす（４９ｘ　：　５２Ｒｇ　；統系的有意差なし）、
他方デスルファトヒルジンは血栓蓄積の明瞭な低下を示
す（ＳＨ：標準ヘパリン；Ｓ、Ｄ：標準偏差；　ｒ−１
１Ｒ：　＆ＩＩ換えデスルファトヒルジン）。

第２図は、デスルファトヒルジンの濃度を高めるに従っ
てこの効果が増強され得ることを示している。

ｔ−ＰＡ以外のプラスミノーゲン活性化因子、例えばｓ
ｃｕ−ＰＡ又はｕ−ＰＡ／　ｔ−ＰＡハイフ゛リドプラ
スミノーゲン活性化因子、又は他のヒルジン化合物、例
えばデスルファトヒルジンＡ１あるいはヒルジン変異体
が組合せ療法に用いられる場合同じ効果が観察される。

対応するヒルジン変異体は例３に記載するようにして製
造することができる。

１０ａｇのプラスミドｐｌＮ−ＩＩＩ−ｏｎ＋ＰＡ−２
（Ｊ、Ｇｈｒａｙｅｂら、ＥＭＢＯ−Ｊ、　　３．２４
３７（１９８４）〕を２５Ｉｌ！の１００ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７、５）、　５抛ＭＮａ（、ｌ及び１
００ｘ／ｄゼラチンに溶解し、そして制限エンドヌクレ
アーゼＥｃｏＲｌ及びＢａｍＨＩにより消化する。この
溶液をＴＮＥに調整し、そしてフェノール／クロロホル
ムで抽出する。ＤＮＡをエタノールにより沈澱せしめる
。アガロースでの電気泳動の後、ゲル溶出によりベクタ
ーＤＮＡ　ｐｌＮ−１［１−ｏａｐＡ−２／　ＢｃｏＲ
Ｉ　／　ＢａｍＨ目を単離する。

ｂ）ブースミ　ＭＬ３０のＤＮＡの ２ＯｎのプラスミドｐＭｔ３ｔｏ　（ヨーロッパ特許出
願Ｎｏ、　１６８，３４２を参照のこと）を５０ｊ１！
のＩＱＯｍＭ　Ｔｒｉｓ−）ＩＣｊｌ！（ｐＨ７，５）
、　５０ａｉＭ　Ｎａ（Ｊ！及び１００Ｉ４／−ゼラチ
ン中で制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨ
Ｉにより消化する。この溶液をＴＮＨに調整し、そして
フェノール／クロロホルムにより抽出する。アガロース
でのゲル電気泳動の後ゲル溶出によりＦ＋−ｈ−ＤＮＡ
（ヒルジン遺伝子）を単離する。

ｌｊｔｇのＦ、−Ｆ！−ＤＮＡ（ヒルジン遺伝子）／Ｅ
ｃｏＲＩ／Ｂａ５ａｌ　ｌ及び３０ＩｔｇのベクターＤ
ＮＡ　ｐｌＮ−ｍ　−ｏａｐＡ−２／ＥｃｏＲＩ　／　
Ｂａ５ＨＩを５０Ｊｔ１の１００ｓ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−１
１ｃ１（ｐＨ７、５）、　５０ｍＭ　Ｎａｃｅ及び１０
０ｘ／ｄゼラチン中に溶解し、ＴＮＥに調整する。この
溶液をフェノール／クロロホルムで抽出し、そしてＤＮ
Ａをエタノールで沈澱せしめる。ＤＮＡ沈澱物を５０ｍ
Ｍ　ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７，８）、　　１０ｍＭ　Ｍ
ｇＣｆｇ、　　１０ｍＭ　ＤＴＴ　　Ｏ，５ｍＭＡＴＰ
及び１００ｎ／Ｉｎ１ゼラチンの溶液２０Ｊに溶解し、
そして２５ユニツト／ＩのＴ、　ＤＮＡリガーゼ（バイ
オラプス）により１５°Ｃにて３時間反応せしめる。こ
うして、挿入されたＦ、−Ｆ、−ＤＮＡ（ヒルジン遺伝
子）を含有する組換えプラスミドｐＭＬ３５０を生成せ
しめる。

カルシウムで前処理された大腸菌ＩＩ　８１０１細胞を
Ｍａｎｄｅｌら（Ｊ、Ｍｏｔ、８ｉｏ＋、　５３．１５
９（１９７０）　）により記載されているようにして調
製する。

組換えプラスミドｐＭＬ３５０を含有するＣ）で得た溶
液を６５°Ｃにて１０分間加熱してＴ４　ＤＮＡリガー
ゼを不活性化し、そして次に３７°Ｃに冷却する。１０
ｍの生ず不反応混合物を、１０ｍＭ　ＭｇＣｆ　を及び
１０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｊ！　（ｐＨ７，５）中力ルシ
ウム処理された大腸菌１１ＢＩＯＩ細胞１５０ｊＩＩに
加えて全容を２００１１Ｉとする。

次に、この混合物を水中で３０分間冷却し、４２°Ｃに
て２分間加熱し、そして次にｌｄのし−培地（バクトド
リプトン１０ｇ／ｌ、バクト酵母エキス５　ｇ　／　ｌ
、　Ｎａ（ｆ！　　５　ｇ／　１１グルコ一ス５ｇ／ｌ
、アンピシリン０．１ｇ／ｉり中に３７“Ｃにて５０分
間放置する。次に、この混合物を０．２　ｄずつ、６０
ｎ／−のアンピシリン（セルバ）を含有する５枚の寒天
培地（マツコンキー寒天、デイフコ）に拡げる。

次に、これらの寒天プレートを３７°Ｃにて１６〜１８
時間維持する。形質転換された大腸菌）ＩＢＩＯ１細胞
のアンピシリン耐性コロニー１８５個を得る。

ｅ　）　Ｆ　−Ｆ　−ＤＮＡ　　　　　　るコロニース
クリーニｌグ ６個の形質転換されたコロニーをニトロセルロースＢ８
５（Ｓｃｈｌｅｊｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕ口）上に押し
付ける。

Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ及びＨｏｇｎｅｓｓ　（Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７２、３９６１
　（１９７９）　）に従ってコロニーを溶解し、そして
それらの変性したＤＮＡをフィルターに固定する。次に
、フィルターのプレハイブリダイゼーションを２０−／
フィルターの４　Ｘ　ＳＥＴ　（３０ｍＭ　Ｔｒｉｓｌ
ｌｃｆｆｉ　（ｐＨ８）、　１５０ｍＭ　ＮａＣ１，１
ｍＭ　ＥＤＴＡの溶液〕、０．１Ｗ／Ｖ％フィコール４
００（ファルマシア）、０．５％ｓｏｓ、５０ｔｎｔ／
ｍｌ変性ウシ胸腺ＤＮＡ中で６４°Ｃにて４時間行う。

次に、このニトロセルロースフィルターを２０ｄ／フイ
ルター５　Ｘ　Ｓｔ！Ｔ（ｗ　／　ｖ　）、Ｑ、　ｌ　
ｗ　／　ｖ％フィコール４００．０．２％ＳＯＳ及び５
０ｄ／ｄ変性ウシ胸腺ＤＮＡ中で６４゛Ｃにて１６時間
、１２Ｐ−放射能標識されたプローブ（フィルター当り
約１０３〜１０’　Ｃｅｒｅｎｃｏｖ　ｃｐｍ）により
処理するφオリゴヌクレオチド４６／６４相補性、ｌ　
１５８　、９６／６７、及び１５４／６４相補性から成
る混合物（ヨーロッパ特許出願ｋ　１６Ｂ、３４２）を
プローブとして使用する。

次ニ、フィルターを２　Ｘ　ＳＥＴ、　０．２％ＳＤＳ
中で室温にて２回、次ニ２　Ｘ　ＳＥＴ、　　０．５％
ＳＯＳ中テロ０°Ｃにて２回（最初３０分間、次に６０
分間）洗浄する。

次にフィルターを３ＭＭペーパー（ワットマン）の間で
乾燥し、そして−８０’ＣにてＸ−線フイルム（フジ）
上に強化スクリーン（Ｉｌｆｏｒｄ）を用いて１〜２日
間置く。

得られるオートラジオグラムは５個の陽性コロニー（ク
ローン）を示し、これらはさらに処理するために使用す
ることができ、その内の１つをｐＭＬ３５０と命名する
。

Ｂ、ブースミ　８１１１０９の　１ プラスミドρＭＬ３５０はマルチ−クローニングリンカ
−（Ｆ、ｃｏＲ１、）ｌｉｎｄＩＩＩ　、　Ｄａｍ）１
１部位）を含有するプラスミドｐＩＮ−ｍ　−ｏｍｐＡ
−２に由来するので、成熟ヒルジン遺伝子の前にＡｌａ
、　Ｇｉｎ、　Ｐｈｅ及びＭｅｔをコードする追加の１
２塩基対を含有する。成熟デスルファトヒルジンを発現
せしめるため、２７マー・オリゴヌクレオチドを用いる
インビトロ変異誘発により前記の１２塩基対をプールア
ウトする。

ａ　）　ＭＬ３５０　Ｘｂａ　Ｉ　Ｂａｍ１ｌ　Ｉ　Ｓ
　Ｉの５鱈のプラスミドｐＭＬ３５０をエンドヌクレア
ーゼＸｂａ　［及びＢａｍＨｌにより消化する。２個の
Ｘｂａ　１−Ｂａｗ＋ｌＩ（断片の内大きい方（ＳＩ）
をアガロース上での電気泳動後の溶出により単離し、そ
して１ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ｆｌｃｆｆｉ　（ｐＨ７，５）
、　０．１ｍＭ　ＩＥＤＴＡに溶解する。

ｂ　）　応３５０　　Ｐｖｕ　Ｉ　　Ｓ　ＩＩ　　の量
　１５　ｐｇのプラスミドｐＭＬ３５０をエンドヌクレ
アーゼＰｖｕ　Ｉにより消化する０次に、線状化された
ＤＮＡｐＭＬ３５０　／　Ｐｖｕ　Ｉを３ユニツトの腸
アルカリ性ホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）に
より３７°Ｃにて３０分間消化する。この溶液を６５°
Ｃにて６０分間加熱することにより酵素を不活性化する
。線状ｐＭＬ３５０　／　Ｐｖｕ　１（３１）ＤＮＡを
アガロース上での電気泳動後のゲル溶出により単離し、
そして１ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１ｃ１（ｐｔ１７、５）、
　０．１ｍＭ　ＥＤＴＡに溶解する。

ｃ）ｔｌゴヌクレオチド（２７ａ＋ｅｒ）　Ｉ　２７の
ヨーロッパ特許出願Ｎ１１１６８，３４２に記載されて
いる方法と同様にして、次のＤＮＡ断片（１２７と称す
る）： ５　’　−ＧＴＡ　ＧＣＧ　ＣＡＧ　ＧＣＣＧＴＴ　Ｇ
ＴＴ　ＴＡＣＡＣＣＧＡＣ−３’、１釘 を合成する。５′−末端のリン酸化をＣｒ−”Ｐ）ＡＴ
Ｐ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ）を用いて、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ＋　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（Ｔ、Ｍ
ａｎｉａｔｉｓらｆｆ１）　、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
ｌｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、（１９８２）、　１２５頁、
に記載されているようにして行った。

ｄ）プｊゴ（支上１吐１０９１λ１製 ０．３　ｐｇずつの５ＩＤＮＡ及び５ＩＩＤＮＡを４０
ｐｍｏｌのリン酸化されたＤＮＡ断片１２７と、２７ｍ
の１ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｆ　（ｐＨ７，５）、　０．１
ｍＭ　ＥＤＴＡ中で混合する。

この混合物に３４のＩＯＸポリメラーゼ−リガーゼ緩衝
液（Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１、６５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（／！
　（ｐＨ７，５）。

８０ｓ＋Ｍ　ＭｇＣｌ　！及び１０ａｅＭ　β−メルカ
プトエタノール加熱してＤＮＡ断片を変性せしめる。次
に、この混合物を徐々に（約１°Ｃ／分）３０°Ｃまで
冷却し、そしてこの温度で３０分間インキュベートする
。さらに、この混合物を４°Ｃにて３０分間インキュベ
ートシ、そして次に水中で１０分間インキュベートする
。

１２ｕｌの４種類のデオキシリボヌクレオチドホスソエ
ート（７．５ｍＭずつ）、６ｄの１０ｍＭ　ＡＴＰ、６
ＩＪＩのＴ４　ＤＮ＾リガーゼ（２．５Ｕ／ｊＪ）及び
１．　２　ｊ１！のＫｌｅｎｏｗ　ＤＮＡポリメラーゼ
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，　　５　Ｕ　／　ｔｄ　）を
添加し、そしてＤＮＡ混合物（合計容量５５ｊ１１）を
１２．５°Ｃにて１６時間インキュベートする。

ＤＮＡ混合物を２ユニツトのエンドヌクレアーゼ［ｃｏ
Ｒ　Ｉにより３７°Ｃにて１時間消化して未変化の出発
プラスミドｐＭＬ３５０を破壊する。この方法によりプ
ラスミドｐＢＨ１０９が形成される。プラスミドｐＢ１
１１０９は、成熟デスルファトヒルジンをコードする遺
伝子に読枠を合わせて連結されたｏａ＋ｐＡ−２シグナ
ル配列に作用可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結されたｌ
ａｃプロモーター／オペレーター及びｔｐｐプロモータ
ーを含有する。

カルシウム処理された大腸菌ＩＩ　８　１０１による形
質転換を前記のようにして行う。使用した全反応混合物
は５５Ｊ１！である。

１００個の形質転換されたコロニーを培養し、各コロニ
ーからプラスミドＤＮＡを調製し、そしてＥｃｏＲ　Ｉ
で消化する，ＥｃｏＲｌにより消化されないすべてのプ
ラスミドＤＮＡはＥｃｏＲ　１部位を欠く有効なプラス
ミドｐＢ８１０９である。

２個の同一のコロニーが同定された．その内の１つを選
択し、そしてｐＢＨ１０９と命名する。

ｏａ＋ｐＡ−２リ一ダー配列に続く　Ｆ，−Ｆ，−ＤＮ
＾の正しい配列を配列分析により確認する。

ヒルジンの　　　　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　ｂ慢Ｃｙ
ｓ　ｌｉｅ　Ｌｅｕコート配列　　５　’　ＣＡＧ　Ｇ
ＧＴ　ＡＡＣ　ＡＡＡ　ＴＧＣ　ＡＴＣ　ＣＴＧ　３　
’変異Ｌ　ｆ．：、　　５　’　ＣＡＧ　ＧＧＴ　ＡＡ
Ｃ　ＡＡＴ　ＴＧＣ　ＡＴＣ　ＣＴＧ　３　’コード配
列　　　　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　
Ｉｌｅ　Ｌｅｕアプライド・バイオシステムス（モデル
３８０Ｂ　）合成機により、ホスホラミデート法（Ｍ．
Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ。

Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｅｎｚｙｓａｔｉｃ　Ｓｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ　＊ｆ　Ｇｅｎｅ　Ｆｒａｇｍｅｎ　ｔ
ｓ　（Ｈ．Ｇ．Ｇａｓｓｅｎ及びＡ．Ｌａｎｇｌｉ）　
Ｖｅｒｌａｇ　Ｃｈｅｍｉｅ。

Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，西独〕を用いて変異原プライマーを
合成する。

５　ｕｌのＭ１３ｍｐ１９二本鎖Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｄｓ−
ＤＮＡ　；　０．　１　ｎ／ｄ　；　ＢＲＬ）に、２Ｉ
の反応媒体２　（５００ａ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ１ＩＣｊ２　
（ｐＨ８．　０　）、　１００ｍＭ　ＭｇＣ．ｅ　ｚ．
　５００ｍＭ　ＮａＣｌ　）（ＢＲＬ）、ｌ　ｐｌ（Ｄ
　Ｘｂａ　Ｉ　（ＩＯＵ／　ｐｌ）　、０．　５　ｉｄ
のＢａａ＋１１　１　　（ＩＯＵ／ＩＡＩ）及び１２ｊ
１！の水を加える。３７°Ｃにて１．５時間のインキュ
ベーションの後、０．　５μｌのＢａａ＋Ｈ　Ｉ、２．
　５　ＩＩＩの反応媒体３　（５００１ＩＭ　Ｔｒｉｓ
−１ｆ（Ｊ！（ｐＨ８．０　）、　　１００ｍＭ　　Ｍ
ｇＣｆ　２＋　　１０００ＩＩＭ　　ＮａＣｆ　　）　
　（ＢＲＬ）　　、及び２Ｉの水を加え、そして３７°
Ｃにて１時間インキュベーションを続ける。容量を水に
より　１００Ｊにする．このｄｓ−ＤＮＡをフェノール
抽出及びエタノール沈澱により単離し、そして３０ｄの
’ｒ　Ｅ　１，１衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２
　、　１ｎＭ　ＥＤＴＡ，　ｐ）１８．　０　）に２容
解する。

旦ＮＡ（旧１人 ５ｎのプラスミドｐＢ１１１０９をχｂａｒ及びＢａｍ
Ｈ　Ｉにより上記の様にして切断し、そして消化物を、
３．５％ポリアクリルアミドゲルをＩＸＴＢＥ緩衝液（
ＩＯＸ　ＴＢＥ緩衝液：　１０８　ｇ　Ｔｒｉｓ、　５
５　ｇ硼酸、９，３ｇＥＤＴＡ・２　ＨｔＯ／　ｘ　）
と共に用いて１５０Ｖにて３時間電気泳動する。１０Ｊ
１！の臭化エチジウム溶液（水中１０ｇ／ｄ）を含有す
るＩＸＴＢＥ緩衝液４００ｄにゲルを浸漬した後、ヒル
ジン遺伝子（２５０ｂｐ）を含有するＸｂａ　Ｉ　−Ｂ
ａｍＨＩ断片をＵＶ光のもとで可視化する。制限断片を
含有するゲル部分をゲルから切り取り、そして５００１
１！の０，５ＸＴＢＥと共に透析バッグに入れ、そして
泳動緩衝液として０．５ＸＴＢＥを用いてＢＩＯ−ＲＡ
Ｄミニゲル電気泳動装置中で１７０Ｖにて３０分間、Ｄ
ＮＡを電気溶出する。ＤＮＡを、０．５ＸＴＢＨにより
平衡化したエルチップ（Ｅｌｕｔｔｐ）＝ｄカラム（Ｓ
ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｌｌ）に負荷する。

カラムを２−の０．５ＸＴＢＩｌ！で洗浄し、そしてＤ
ＮＡを０．５　Ｘ　ＴＢＥ（ｌ　ｄ）中ＩＭＮａｃｆｆ
ｉにより溶出する。ＤＮＡをエタノールにより沈澱せし
め、そして１０Ｊ１！のＴＥ緩衝液中に再溶解する。

１３ｍ　１９へのＸｂａ　Ｉ　−Ｂａｉｌ　Ｉヒルジン
　　　の５ＩのＸｂａ　Ｉ　−ＢａｍＨＩヒルジン挿入
部、２１１１のＸｂａ　Ｉ　−Ｂａｍｌｌ　Ｉ切断Ｍ１
３ｍｐ１９、ＩＩのＩＯＸリガーゼ緩衝液（５０＋＋Ｍ
　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐＨ７、５）、　１０ａ＋Ｍ
ＭｇＣｌ□、１０ＩＩＭジチオスレイトール〕、】Ｉｌ
ｌのＡＴＰ、及び１．５　ＩｌｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ
（ＢＲＬ、ＩＵ／ｄ）を混合し、そして１４°Ｃにて一
夜インキユベートする。　Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇ　　（Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｓｏｌｏｇｙ月ｌ４．２
ｌ−７８（１９８３）　）の方法に従って大腸菌ＪＭＩ
ＯＩコンピテント細胞を形質転換する。１２個の透明な
プラークを拾い、そして各プラークからＪｏＭｅｓｓｉ
ｎｇ（前掲）により記載されるようにして各プラークか
ら単ｔｉ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｓｓ−ＤＮＡ）を調製する。

このＭ１３ｍｐ１９／ヒルジンと称するＤＮＡを５０ｄ
のＴＥ緩衝液（０，１〜０．５Ｍｇ　／　ｔｔｌ　）に
再溶解する。

２００ｐｓ＋ｏｌ　（２３Ｊ）の変異原ブライマー１（
前記を参照のこと）を、３１１１のＩＯＸキナーゼ緩衝
液（１Ｍ　Ｔｒｒｓ−ＨＣＩ　、　０．１　Ｍ　ＭｇＣ
１ｌ　Ｏ，Ｉ　Ｍジチオスレイトール、ｐ）！８．３）
、３１１１の１ｌＭ　ＡＴＰ、及びｌμｌのＴ４ポリヌ
クレオチドキナーゼ（ＢＲＬ　、　ＩＯＵ／Ｉ）を加え
ることによりリン酸化する。３７°Ｃにて１時間のイン
キュベーションの後、６５°Ｃにて１０分間加熱するこ
とにより反応を停止せしめる。

６Ｉｔｌ（０，５ｘ）の単鎖Ｍ１３ｍｐ１９／ヒルジン
を３ｔｄ　（２０ｐｍｏｌ）のリン酸化された変異原オ
リゴデオキシリボヌクレオチド（６，６ｐｍｏｆ／　ｐ
ｌ　）及びＩＡの緩衝液Ａ　（０，２Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｊ！　（ｐＨ７，５）、　０．１　ＭＭｇＣｌ　ｚ、
０．５　Ｍ　ＮａＣ１、０，０１Ｖ　ＤＴＴ）と共ニア
０℃にて５分間インキヱベートし、そして３０分間にわ
たって徐々に室温まで冷却する。

延ｌ二１猪反応 前記のアニール処理された混合物にＩＩの緩衝液Ｂ　（
０，２Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　（ｐＨ７，５）、　０．
　Ｉ　Ｍ　ＭｇＣｊ２ｔ。

０．０１Ｍ　ＤＴＴ）、１　ｕｌ　（７）１０ｓ＋Ｍ　
ＡＴＰ、　４　ｔｄ　ノ２　ｄ　ｄＮＴＰ混合物、５Ｉ
のＴ、　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ。

ＩＵ／メ）、及び５ＩのＴ４１）ＮＡリガーゼ（８ＲＬ
、ＩＵ／ｌｄ）を加える。この混合物を１６℃にて３時
間インキエベートする。６５°Ｃにて１ｏ分間インキエ
ベートすることにより反応を停止する。

び　　　　　　　ＤＮＡの 前記連結混合物を水により１：２０で稀釈し、そしてそ
の１Ｊｌｌ及び５４、並びに未稀釈の連結混合物ＩＪ！
Ｉを用いてコンピテント大腸菌ＢＭＩＩ　７１−８７１
−８ｌ細胞（Ｂ、にｒａｍｅｒ、　Ｗ、Ｋｒａｍｅｒ及
び１１．−Ｊ、　Ｆｒ１ｔｚ、　Ｃｅ１Ｉ共、　８７９
−８８７（１９８４）　）を形質転換する。ｒＭ１３ｃ
ｌｏｎｉＢ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ＩＩａｎ
ｄｂｏｏＪ　（Ａｔｔｒｅｒｓｈａｙａにより発行）に
記載されているようにしてプレートする。１２個の無色
のプラークを拾い、そして５ｓ−ＤＮＡを前記のように
して・調製する。

についての　　ＤＮＡのスクリーニング変異した単鎖Ｄ
ＮＡについてスクリーニングするため、１２個の５ｓ−
ＤＮ＾サンプルのそれぞれをジデオキシヌクレオチド・
チエイン・ターミネーション法（Ｆ、Ｓａｎｇｅｒ、　
Ｓ、Ｎ１ｃｋｌｅｒ及びＡ、Ｒ，Ｃｏｕｌｓｏｎ。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ＋、　ＵＳＡ　７
４．５４６３−５４６７（１９７７）　）により配列決
定する。まず、予想される変異した塩基に対応するジデ
オキシヌクレオチドのみを反応において使用する０次に
、幾つかの陽性変異体からの５ｓ−ＤＮＡを、Ｔａｂｏ
ｒ及びＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ　（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８４．４７６７
−４７７１（１９８７）　）の方法に従ってＴ、　ＤＮ
Ａポリメラーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、　ＵＳＢ）を用
いて配列決定して変異体の全ＤＮＡ配列を確立する。組
換えヒルジンの２７位のＬｙｓ−ｅＡｓｎ変異をコード
する予想通りの塩基変化がＤＮＡ配列中に観察される。

予想通りの配列を有するファージＤＮＡをＭ１３ｍｐ１
９／ヒルジンに２７Ｎと称する。

ｒＭ１３　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　５ｅｑｕｅｎｃｉ
Ｂ　１ｌａｎｄｂｏｏｋ、１（Ａｍｅｒｓｈａｍ発行）
に記載されているようにして、コンピテント大腸菌ＪＭ
ＩＯＩ細胞を１０〜２０ｎＨの単鎖ヒルジンに２１Ｎ変
異体ＤＮＡにより形質転換しそしてｄｓ−ＤＮＡを調製
する。４０〜５０ｘの収量のｄｓ−ＤＮＡが１００−の
培養物から得られる。

ヒルジンＸｂａ　　−ＢａｍＨの 変異したヒルジンＸｂａ　Ｉ　−ＢａｍＨ１挿入部を２
５ｐｇのｄｓ−ＤＮＡから切り出し、そしてセクション
ＩＢに記載したようにして精製する。ＤＮＡを２０４の
無菌水に溶解する。

６μ！の反応媒体２　（ＢＲＬ）　、２　ａｌ　（２０
ユニツト）のＸｂａ　Ｉ　、　　Ｉ　ｍ　（１０ユニツ
ト）のＢａ５ａｌｔ　Ｉ　、　　１　ａｔ（１０ユニツ
ト）のＥｃｏＲｌ及び３２４の水（合計５０ｐｌ）を加
え、そして３７°Ｃにて３時間インキュベートすること
により約１．５　ｔｎｔのｐｌＮ−ＩＩＩ　−ｏａｅｐ
Ａ−２プラスミドの消化物を調製する。ＩＩＩＩ（１０
ユニツト）のＢａ５ｌｌ　Ｉ　、　　ｌ　ｔｄ　（１０
ユニツト）のＥｃｏＲＩ、５Ｊ１１の反応媒体３　（Ｂ
ＲＬ）及び１２ｊ１１の水を加え、そしてインキュベー
ションを３７°Ｃにて１時間続ける。

９ＪＩＩのヒルジンに２７Ｎ　Ｘｂａ　Ｉ　−ＢａｍＨ
Ｉ挿入部ＤＮＡ、２ｄのＸｂａ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ切断
ｐｌＮ−ＩＩＩ　−ｏｍｐＡ−２ベクターＤＮＡ、３Ｉ
のＩＯＸ連結緩衝液（ＢＲＬ）及び１μ１（ＩＵ／ｄ）
のＴ、　ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ）を混合し、そして１
４°Ｃにて１６〜２０時間インキュベートする。

Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇ（前掲）の方法に従って、５ｊｌｌ
の連結反応混合物を用いて０．３１ｒＩＲの大腸菌ＪＭ
ＩＯＩコンピテント細胞を形質転換する。３ｍの２ＸＹ
↑／アンピシリン（５０趨アンピシリン／ｄ２Ｘ’ｌ↑
）をサンプルに加え、そして細胞を室温にて１時間増殖
せしめる。培養物の１ＩＩＩｌのサンプルを取り、そし
てＬＢ／アンピシリン（５０ｎアンピシリン／ＩＩＩＬ
Ｂ−寒天）プレート上に注ぎ、そして３７℃にて一夜増
殖せしめる。この形質転換プラスミドＤＮＡをｐｌＮ−
ｍ　−ｏｍｐＡ−２／ＨＩＲ−に２７Ｎと称する。

ＬＢ／アンピシリンプレートから１０個の細菌コロニー
を拾い、そして５−のＬＢ／アンピシリン（５ＯＮアン
ピシリン／ｄＬＢ）中で３７°Ｃにて５時間、別々に増
殖せしめる。１−のサンプルを各培養チューブから取り
、そして細胞を遠心分離により回収する（３０００ｘｇ
、５分間）。各サンプルの細胞を１００μｆの１０ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−ＩＩｃ／！　（ｐ）１Ｂ、　１　）により
ＯｏＣにて３０分間処理することにより浸透圧ショック
にかけて細菌のペリプラズム空間中の物質を放出せしめ
る。細胞を前記のようにして遠心分離により除去し、そ
して上清をヒルジン活性について試験する。最も高い阻
害活性を示すサンプルをバッチ培養から選択する。

最も活性なサンプルからの残りの細胞（４ｄ分）を用い
て１１のＬＢ／アンピシリン（５０４アンピシリン／ｄ
ＬＢ）に接種する。培養物を３７°Ｃにて一夜増殖せし
め、そして細胞を遠心分ｊｉ！　（３０００ｘｇにて１
５分間）により回収する。細胞ペレットを５゜ｄの１０
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２　（ｐＨ８，１）に０°Ｃに
て１時間再懸濁することにより浸透圧ショックをかける
。

６０００ｘｇにて１０分間の遠心により細胞をペリプラ
ズム画分から除去する。

Ａｓｎ”　　　　””スルフ　トヒルジンのペリプラズ
ムの画分のｐｉｆを０．１　Ｍ　１ｌｃｆにより６．５
に調整し、そして０．４５．ｎフィルター（Ｎａ　Ｉｇ
ｅｎｅ　）を通して濾過する。蛋白質を、５０ｍＭ　ｂ
ｉｓ−Ｔｒｉｓ−１１Ｃ１緩衝液（ｐｌ＋６．５）によ
り平衡化したＭｏｎｏ−ＱカラムＦＰＬＣ系（Ｐａｓｔ
　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ
ｒａｐｈｙ＋Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ）に負荷する
。ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−１１ｃｆ　（ｐＨ６，５）中０−
３００ｍＭ　ＮａＣｅの４５分間にわたる直線グラジェ
ントを用いてデスルファトヒルジン変異体をカラムから
溶出する。カラム溶出液の０．８　ｄずつの両分を集め
、そして前記のようにしてヒルジン活性について試験す
る。デスルファトヒルジン変異体含有画分をプールし、
上記のようにして濾過し、そして水中０．０９　ｖ　／
　ｖ％トリフルオロ酢酸により平衡化されたＢｒｏｗｎ
ｌｅｅ　Ｌａｂｓ　Ｃ８逆相ＨＰＬＣカラムを用いてＭ
ｉｌｌｉｐｏｒｅ−Ｗａｔｅｒｓ　ＨＰＬＣ系上でクロ
マトグラフ処理する。水中０．０９　ｖ　／　ｖ％トリ
フルオロ酢酸中７〜２８　ｖ　／　ｖ％アセトニトリル
の直線グラジェントによりカラムからヒルジン変異体を
溶出する。約９８％以上の純度を有する〔＾ｓ　ｎ　ｔ
　？　）デスルファトヒルジンを２８分における単一ピ
ークとして得る。

ヒルジンの コード鎖 Ｇ１口 ５’ＣＡＧ Ｇｌｙ ＧＧＴ Ａｓｎ　１．ｙｚ　Ｃｙｓ　Ｉｌｅ　ＬｅｕＡＡＣＡＡ
Ａ　　ＴＧＣＡＴＣＣＴＧ ３′ 変異原プラ イマー２Ａ ３　’　　ＧＴＣＣＣへ ＴＧ ＴＴ ＡＣＣ ＡＧ ＣＡＧ ５′ 変異した コード鎖 ５’ＣＡＧ １ｎ ＧＧＴ　　ＡＡＣＣＡＡ　　ＴＧＣ八ＴＣＣＴＧＧｌｙ
　　Ａｓｎ　　Ｇｉｎ　　Ｃｙｓ　　ｌｉｅ　　Ｌｅｕ
３′ ｂ：Ｌｓ４７蔦ら＾ｒ　４７への−１ ヒルジンの　　　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　１．１２　
Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒコード鎖　５　’　ＧＧＴ　Ａ
ＣＣＣＣＧ　ＡＡＡ　ＣＣＧ　ＣＡＧ　ＴＣＴ　３　’
変異した　　５　’　ＧＧＴ　ＡＣＣＣＣＧ　ＡＧＡ　
ＣＣＧ　ＣＡＧ　ＴＣＴコード鎖　　　　　Ｇｌｙ　Ｔ
ｈｒ　Ｐｒｏ　幻ＩＰｒｏ　Ｇｉｎ　５ｅｒ３′ 変異原プライマー２Ａ及び２Ｂを用いて前記の方法を繰
り返し、Ｌｙｓ　２７がＧｉｎ　２７により置き換えら
れておりそしてＬｙａ　４７がＡｒｇ　４７に置き換え
られている目的の変異体蛋白質を得、そして特徴付ける
。形質転換プラスミドＤＮＡをｐｌＮ−ｌｌ−０ｆａＰ
Ａ−２／ＨＩＲ−に２７Ｑ、に４７Ｒと称する。この変
異体蛋白質を（Ｇｉｎ”、八ｒ　ｇ　４　？　）−デス
ルファトヒルジンる。

３４　　　　　３６　　　　　３Ｂ ヒルジンの　　　　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　１，２Ｈ
　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ｃｙｓコード鎖　　５　’　ＧＡＣ
　ＧＧＴ　Ｇ＾＾ＡＡＡ　ＡＡＣ　ＣＡＧ　ＴＧＣ　３
変異原 ブライマー３ ３’ＣＴＧ ＣＡ ＴＴ ＴＴ ＴＧ ＧＴＣ 八ＣＧ 変異した　　　５　’　ＧＡＣ　ＧＧＴ　ＧＡＡ　ＣＡ
Ａ　ＡＡＣ　ＣＡＧ↑ＧＣ３’コード鎖　　　　　　Ａ
ｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ｃｙ
ｓｂ）Ｌｓ２７１°ＧＩｎ２７への・ Ｌｙｓ　２７からＧｌｎ　２７への変異はＤ（前記）に
従って行う。

ｃ）Ｌ　ｓ　４７　）”Ａｒ　　４７への・Ｌｙｓ　４
７からＡｒｇ　４７への変異はＤ（前記）に従って行う
。

前記の方法を変異原プライマー２Ａ．３及び２Ｂを用い
て行い、Ｌｙｓ　２７がＧｉｎ　２７に置き換えられて
おり、Ｌｙｓ　３６がＧｌｎ　３６により置き換えられ
ており、そしてＬｙｓ　４７がＡｒｇ　４７により置き
換えられている目的の変異体蛋白質を得、そして特徴付
ける。形質転換プラスミドＤＮＡをｐｌＮ−　ｍ　−ｏ
ｎ＋ｐＡ−　２／ＩＩＩＲ−に２７Ｑ　、　Ｋ３６Ｑ　
、　Ｋ４７Ｒと称する。変異体蛋白質を（Ｇｉｎ”、　
Ｇｉｎ”、　Ａｒｇ”　）−デスルファトヒルジンと称
する。

Ｆ。

メ オニン による Ｇｌｎ” ＾ｒ ヒルジンの　　シグナル配列　　　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｔ
ｙｒ　ｒｈｒ　Ａｓｐ　Ｃｙｓコ−）’Ｉ　　５’ＧＣ
ＧＣＡＧＧＣＣ、、・ＧＴＴＧＴＴＴＡＣＡＣＣＧＡＣ
ＴＧＣ３１Ｂシタ５’　ＧＣＧ　（：ＡＧ　ＧＣＣＡＴ
Ｇ　ＧＴＴ　ＧＴＴ　ＴＡＣＡＣＣＧＡＣＴＧＣ３コー
ド鎖　　シグナル配列　Ｍｅｔνａｌ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ
　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ変異原プライマー２Ａ、２Ｂ
及び４を用いて前記の方法を反復することにより、（Ｇ
ｉｎ”、　Ａｒｇ”］−デスルファトヒルジンのＮ−末
端がｎｅｔにより延長されている目的の変異体蛋白質を
得、そして特徴付ける。この蛋白質をメチオニル−（Ｇ
ｉｎ”Ａｒｇ４′〕−デスルファトヒルジンと称する。

ヒルジンの Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｐ
ｒｏ　抛Ｇｌｕ　Ｔｙｒｅｕ Ｇｉｎ ＣＴＧ ＣＡＧ ３′ 変異原 プライマー　５ ３　　’　　ＣＣＡ　　ＣＴＧ　　ＡＡＧ　　ＧＴＴ　
　ｆｉ’ｒＴ　　ＴＡＧ　　ＧＧＣＧＴＴ　　ＧＴＴ　
　ＡＴＧＧＡＣＧＴＣ５’ 変異した コード鎖 ５　　’　　ＧＧＴ　　ＧＡＣＴＴＣＣＡＡ　　ＣＡＡ
　　ＡＴＣＣＣＧ　　ＣＡＡ、ＣＡＡ　ＴＡＣＧｌｙ　
Ｇｉｙ　Ｐｈｅ　Ｇｌｎ　Ｇｌｎ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｇ
ｌｎ　Ｇｉｎ　ＴｙｒＣＴＧ　ＣＡＧ　　３　’ Ｌｅｕ　　Ｇｌｎ 変異原プライマー５を用いて前記の方法を反復すること
により、Ｇｌｕ　５７，５８，６１．６２がＧ１ｎ５７
　。

５８　、６１　、６２により宜き換えられている目的の
変異体蛋白質を得、そして特徴付ける。この変異体蛋白
質を（Ｇｉｎ”・ｓａ・６１・６２）−デスルファトヒ
ルジンと称する。

デスルファトヒルジンをコードするＤＮＡ配列を、プロ
リンをコードするオリゴヌクレオチドＣＣＡにより延長
する。生ずる新しいデスルファトヒルジンを酵母におい
て発現せしめる。このものは、そのＣ−末端のプロリン
を伴って６６個のアミノ酸を含有する。このペプチドを
（Ｐｒｏ”　）デスルファトヒルジンと称する。

酵母発現プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＦＬ−）１
１Ｒ（第４図を参照のこと；ヨーロッパ特許出願Ｎｃｔ
２２５．６３３）を制限エンドヌクレアーゼＳａｌ　！
及びｔ！ｃｏＲｌにより消化する。４７８ｂｐ　Ｓａｔ
　Ｉ　　ＥｃｏＲｌ断片を、ＴＢＥｌｌ衝液（９０＋ｉ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−塩基、９０ｍＭ硼酸、２．５ｍＭＥＤＴ
Ａ　、　ｐＨ８，３）中０．８％分取用アガロースゲル
上で分離する。臭化エチジウムで染色された断片をゲル
から単離する。ＤＮＡを０．２Ｘ　ＴＢＥ　ｉｌ街液中
で４５分間ｌＯ抛Ａにて電気溶出しそしてＤＥ５２　（
ワットマン）イオン交換クロマトグラフィーにより精製
する。ＤＮＡをＤＢ５２カラムから高塩濃度緩衝液（１
，５Ｍ　ＮａＣｌ！、　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−）１ｃｊ
！　（ｐＨ８，０）、　　１ａ＋Ｍｆ’ＤＴ＾〕により
溶出し、エタノールで沈澱せしめ、そして水に０．１　
ｐＩｌｏｌ／　ｔｌの濃度で再溶解する。この４７８ｂ
ｐ　Ｓａｌ　Ｉ　−ＥｃｏＲｌ断片はＢｇｌ　ＩＩ　−
ＥｃｏＲＩＧＡＰＦＬプロモーター断片に融合したｐ８
Ｒ３２２の５ａ１７−Ｂａａ＋ＨＩ配列を含有する。

プラスミドｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲをＢａ
ｍＨＩ及び５ａｉｌにより消化する。大６．７ｋｂベク
ター断片を前記のようにして単離する。小７４０ｂｐ断
片も単離する。このものは、デスルファトヒルジンのコ
ード配列に読枠を合わせて融合した■匹シグナル配列に
加えて４７８ｂｐ　Ｓａｔ　Ｉ　−ＥｃｏＲｌ断片（上
記参照のこと）を含有する。この７４０ｂｐ断片をＡｓ
ｕ　ｆｌにより消化する。ＤＮＡをフェノール／クロロ
ボルムにより抽出し、エタノールにより沈澱せしめ、ソ
シて水に再溶解する。

次の式： ％式％ で表わされる合成オリゴヌクレオチドを、４０ｄの６０
ｍ１’ｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｉ！（ｐＨ７，５）、　１０
ｍＭ　ＭｇＣｌ！、ｔ、　　５ａ＋Ｍ　ＤＴＴ。

０、５　＊Ｍ　ＡＴＰ及び２７ＵのＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼ（ｆｌｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）中で３７”Ｃに
て４５分間キナーゼ処理する。オリゴヌクレオチド（１
）の反応混合物とオリゴヌクレオチド（２）のそれを−
緒にする。

この混合物を７５°Ｃにて１０分間加熱し、そして室温
に放冷する。アニールされたオリゴヌクレオチドリンカ
ー（１＋２）を−２０°Ｃにて貯蔵する。

０．８５ｎ（３，８ｐｍｏ＋　）のＡｓｕ　ＩＩ消化Ｄ
ＮＡを１５°Ｃにて１６時間、１００倍過剰量のキナー
ゼ処理されそしてアニールされたオリゴヌクレオチドリ
ンカーと１５０４の６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−）ｉｃｆｆｉ
　（ｐＨ７，５）、　１抛ＭＭｇＣ１，，。

５ｍＭ　ＤＴＴ、　３．５ｍＭ　ＡＴＰ及び１２００ｔ
ＪのＴ４　ＤＮＡリガーゼ（バイオラプス）と共にイン
キエベートする。

８５℃にて１０分間にわたりＴ、　ＤＮＡリガーゼを不
活性化した後、ｌｏｗＭ　ＥＤＴＡ　、　３００ｍＭ酢
酸ナトリウム（ｐＨ６，０）及び０．５４容量のイソプ
ロパツールの存在下でＤＮＡを沈澱せしめることにより
過剰のリンカ−を除去する。生ずる断片をＴＢＥＩＩ衝
液中２％分取用アガロースゲル上で分離する。２６２ｂ
ｐ断片を電気溶出によりゲルから回収しそしてエタノー
ル沈澱せしめる。ＤＮＡをＱ、　ｌ　ｐｍｏｌ／　ｐｌ
の濃度に再懸濁する。ｆｉｃｏＲＩ　−ＢａｍＨＩ断片
は、Ｐｒｏ　６６をコードする追加のＣＣＡ）リプレッ
トと共にデスルファトヒルジンのコード配列を含有する
。

上記のようにして単離した３つのＤＮＡ断片を次の反応
により連結する。すなわち、Ｑ、２ｐｒａｏｌの４７８
ｂｐ　Ｓａｔ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩ断片、Ｑ、　２ｐｍｏ
ｌの２６２ｂｐＥｃｏＲＩ　　Ｒａｍ）Ｉ　Ｉ断片及び
Ｑ、　ｌ　ｐｌＩＩｏｌの６．７ｋｂベクタ一断片を１
０４の６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＩＩＣｆｆｉ　（ｐＨ７，
５）、　１０ｓ＋ＭＭｇＣ１，ｔ、　　５ｍＭ　ＤＴＴ
、　　１ｍＭ　ＡＴＰ及び２００ＵのＴ、　ＤＮＡリガ
ーゼ中で１５°Ｃにて６時間連結する。この連結混合物
の１　ｐｌのアリコートを１００＃のカルシウム処理さ
れた形質転換コンピテント大腸菌ＨＢＩＯＩ細胞に加え
る。

１２個の形質転換されたアンピシリン耐性コロニーを１
００■／ｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地中で増殖
せしめる。プラスミドＤＮＡを調製しくＨｏｌｍｅｓら
、Ａｎａｌ、Ｂｔｏｃｈｅｍ、月、４（１９８１）、　
　１９３）、そしてＢａａ）ｌ　ｌ及びｆｉｃｏＲＩに
よる二重消化によって分析する。ＤＮＡ中の変異の存在
をＤＮＡ配列決定（Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏ、Ｎａｔｌ
、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４（１９７７）５４
６３　）により確認する。ヒルジン構造遺伝子中にＣＣ
Ａコドンを有する１つのクローンをｐＪＤＢ２０７／Ｇ
ＡＰＦＬ−１１１Ｒ（Ｐｒｏ　　（ｉ６）と称する。

ヒルジンの コード鎖 シグナル配列　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｓ
ｐ　Ｃｙｓ５　　’　　ＧＣＧ　　ＣＡＧ　　ＧＣＣＧ
ＴＴ　　ＧＴＴ　　ＴＡＣＡＣＣＧＡＣＴＧＣ３′ 変異した コード鎖 ５　　’　　ＧＣＧ　　ＣＡＧ　　ＧＣＣＡＴＴ　　Ａ
ＴＴ　　ＴＡＣＡＣＣＧＡＣＴＧＣシグナル配列　月ｊ
月ヱＴｙｒ　Ｔｈｒ＾ｓｐ　Ｃｙｓ３′ 変異原プライマー６を用いて前記の方法を反復して、Ｎ
−末端アミノ酸Ｖａｔ　　１　、２がＩｌｅ　ｌ　、　
２により置き換えられている目的の変異体蛋白質を得、
そして特徴付ける。この変異体蛋白質を（Ｉｌｅ”）−
デスルファトヒルジンと称する。

Ｊ、ヒルジンの　　Ｖａｌ　　１　　”ＧＩ　　Ｉへの
ヒルジンの　　シグナル配列　Ｖａｔ　Ｖａｔ　Ｔｙｒ
　Ｔｈｒ＾ｓｐ　Ｃｙｓコード鎖　５　’　ＧＣＧ　Ｃ
ＡＧ　ＧＣＣＧＴＴ　ＧＴＴ　ＴＡＣＡＣＣＧＡＣＴＧ
Ｃ３′ 変異した　５　’　ＧＣＧ　ＣＡＧ　ＧＣＣ応迂ＧＴＴ
　Ｔ＾ＣＡＣＣＧＡＣＴＧＣ３’コード鎖　　シグナル
配列　リ１Ｖａｌ　Ｔｙｒ　ＴｈｒΔｓｐ　Ｃｙｓ変異
変異原ブライマー用いて前記の方法を反復することによ
り、Ｎ−末端アミノ酸Ｖａｌ　　ｌがｃｔｙｌにより置
き換えられている目的の変異体蛋白質を得、そして特徴
付ける。この変異体を（Ｇｌｙ’）−デスルファトヒル
シンと称する。

同様にして例３に詳述した方法を適用することにより、
デスルファトヒルジンＩＩＶＩ、ヒルジン１１ｖ２及び
ヒルジンＰＡの他の所望の変異体を製造することができ
る。

■玉　　　　　　　は　　のための この医薬組成物は、それぞれが１０■の凍結乾燥された
活性化因子ｔ−１’Ａと３００＋ｎｇのデキストロース
を含有するバイアル７個、及び３０■の凍結乾燥された
デスルファトヒルジンＩＩＶＩと１００ｍｇのデキスト
ロースを含有するバイアル８個から成る。

ｔ−ＰＡの非経口投与用の溶液は、８バイアルのそれぞ
れの内容物を、酢酸によりｐ１１４に調整された１００
ｍＭ酢酸アンモニウムを含有する無菌のパイロジエン不
含有溶剤のｌＯｄのアンプル１個に溶解することにより
調製する。

デスルファトヒルジンの非経口投与用溶液は、バイアル
の内容物を３ｊｌｌ！の無菌０．９％塩化ナトリウム溶
液に溶解することにより調製する。

７ａｉの緩衝液中１０％の合計プラスミノーゲン活性化
因子量（すなわち７■ｔ−ＰＡ）及び３ｄの緩衝液中３
０■のデスルファトヒルジンを、１０ａｌの無菌０．９
％塩化す）　ＩＪウム溶液を収容する無菌の注射器に吸
い込み、そして最初の投与として５分間にわたり静脈内
に投与する。残りの６３■のｔ−ＰＡは無菌０．９％塩
化ナトリウム溶液を収容する２５０ｄボトルに注射し、
そして次に９０分間にわたって静脈内に注入して、閉塞
した血管の開通を達成する。

あるいは、７■のｔ−ＰＡ（７，ｄ）及び１０＋ａｇの
デスルファトヒルジン（１，ｄ）を前記のようにして溶
解し、そして５分間にわたりポルスとして投与する。残
’Ｑの６３■のｔ−ＰＡ及び２０ｍｇのデスルファトヒ
ルジンを、合計容量３１５ｄの０．９％塩化ナトリウム
溶液中で９０分間にわたり注入する。

ｔ−ＰＡの代りに、前記の他のプラスミノーゲン活性化
因子、例えばｓｃｕ−ＰＡ又はトＰＡ／ｔ−ＰＡハイブ
リドプラスミノーゲン活性化因子を同盟使用することが
可能である。同様に、デスルファトヒルジンＨＶＩの代
りに、同じ量の前記の他のヒルジン、例えばヒルジンＰ
Ａ又はデスルファトヒルジンＨν１の変異体を使用する
ことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、それぞれヘパリン又はデスルファトヒルジン
の存在下でのｔ−ＰＡによる血餅の溶解の間のフィブリ
ンの蓄積を示す。 第２図は、種々の濃度のデスルファトヒルジンの存在下
でのｔ−ＰＡによる血餅の溶解の間のフィブリンの蓄積
を示す。 第３図は、プラスミドｐＭＬ３５０の作製過程を模式第
４図は、プラスミドｐＪＤＢ２０７／Ｇ＾円化−肛Ｒの
プラスミド地図を模式的に示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、成分Ａとしてのプラスミノーゲン活性化因子及び成
   分Ｂとしてのヒルジンを医薬として許容されるキャリヤ
   ーと共に含んで成る医薬組合せ組成物。 ２、成分Ａとして単鎖形のプラスミノーゲン活性化因子
   を含んで成る請求項１に記載の医薬組成物。 ３、成分Ａとして、グリコシル化されているか又は部分
   的にグリコシル化されているか又はグリコシル化されて
   いない形態を包含するｔ−ＰＡ及びｕ−ＰＡ、ｕ−ＰＡ
   ／ｔ−ＰＡハイブリドプラスミノーゲン活性化因子、並
   びに繊溶活性を維持しているこれらの変異体及び断片か
   ら成る群から選択されたプラスミノーゲン活性化因子を
   含んで成る請求項１に記載の医薬組成物。 ４、成分Ａとして、次の式（ I ）： 【遺伝子配列があります】（ I ） （式中、Ｘ＿１及びＸ＿２は相互に独立にＬｙｓ、塩基
   性アミノ酸残基以外のアミノ酸残基又は化学結合を表わ
   し、Ｙ＿１はＡｒｇ、塩基性アミノ酸残基以外のアミノ
   酸残基又は化学結合であり、Ｙ＿２はＰｈｅ、酸性アミ
   ノ酸残基又は化学結合であり、Ｙ＿３はＬｙｓ、塩基性
   アミノ酸残基以外のアミノ酸残基又は化学結合であり、
   Ｚ＿１はＡｓｎであるか又は他のアミノ酸残基であり、
   そしてＺ＿２はＴｈｒであるか又はＳｅｒ以外の他のア
   ミノ酸残基である）で表わされるプラスミノーゲン活性
   化因子を含んで成る請求項１に記載の医薬組成物。 ５、成分Ａとして、Ｘ＿１がＬｙｓ、Ｇｌｙ又はＳｅｒ
   であり、Ｘ＿２がＬｙｓであり、Ｙ＿１がＡｒｇであり
   、Ｙ＿２がＰｈｅ、Ａｓｐ又はＧｌｕであり、Ｙ＿３が
   Ｌｙｓであり、Ｚ＿１がＡｓｎ又はＧｌｎであり、そし
   てＺ＿２がＴｈｒである式（ I ）のプラスミノーゲン
   活性化因子を含んで成る請求項４に記載の医薬組成物。 ６、成分Ａとして、ｓｃｕ−ＰＡ、〔Ｇｌｙ＾１＾３＾
   ５〕−ｓｃｕ−ＰＡ、〔Ｓｅｒ＾１＾３＾５〕−ｓｃｕ
   −ＰＡ、〔Ａｓｐ＾１＾５＾７〕−ｓｃｕ−ＰＡ、〔Ｓ
   ｅｒ＾１＾３＾５，Ａｓｐ＾１＾５＾７〕−ｓｃｕ−Ｐ
   Ａ及び〔Ｇｌｙ＾１＾３＾５，Ａｓｐ＾１＾５＾７〕−
   ｓｃｕ−ＰＡ（Ａｓｎ＾３＾０＾２が酵母特異的にグリ
   コシル化されている）、並びに〔Ｇｌｎ＾３＾０＾２〕
   −ｓｃｕ−ＰＡ、〔Ｇｌｙ＾１＾３＾５，Ａｓｐ＾１＾
   ５＾７，Ｇｌｎ＾３＾０＾２〕−ｓｃｕ−ＰＡ及び〔Ｓ
   ｅｒ＾１＾３＾５，Ａｓｐ＾１＾５＾７，Ｇｌｎ＾３＾
   ０＾２〕−ｓｃｕ−ＰＡから成る群から選択されたプラ
   スミノーゲン活性化因子を含んで成る請求項４に記載の
   医薬組成物。 ７、成分Ａとしてｓｕｃ−ＰＡを含んで成る請求項４に
   記載の医薬組成物。 ８、成分Ａとして、次の式（II）： 【遺伝子配列があります】（II） （式中、Ｘ＿１、Ｘ＿２及びＸ＿３はそれぞれＡｓｎ又
   は他の遺伝的にコードされたアミノ酸であり、Ｙ＿１及
   びＹ＿２はそれぞれＳｅｒであるか又はＴｈｒ以外の他
   の遺伝的にコードされたアミノ酸であり、そしてＹ＿３
   はＴｈｒであるか又はＳｅｒ以外の他の遺伝的にコード
   されたアミノ酸である） で表わされるプラスミノーゲン活性化因子を含んで成る
   請求項１に記載の医薬組成物。 ９、成分Ａとして、基Ｘ＿１、Ｘ＿２及びＸ＿３の１個
   、２個又は３個がＡｓｎでありそして他の基がＧｌｎ、
   Ｔｈｒ及びＳｅｒから選択されたアミノ酸残基であり、
   Ｙ＿１及びＹ＿２がそれぞれＳｅｒであり、そしてＹ＿
   ３がＴｈｒであり；あるいはＸ＿１、Ｘ＿２及びＸ＿３
   がそれぞれＡｓｎであり、基Ｙ＿１及びＹ＿２の１個又
   は２個がＳｅｒでありそして他の基がＡｌａ及びＡｓｎ
   から成る群から選択され、そしてＹ＿３がＴｈｒであり
   ；あるいはＸ＿１、Ｘ＿２及びＸ＿３がそれぞれＡｓｎ
   であり、Ｙ＿１及びＹ＿２がそれぞれＳｅｒであり、そ
   してＹ＿３がＡｌａ及びＡｓｎから成る群から選択され
   る式（II）のプラスミノーゲン活性化因子を含んで成る
   請求項１に記載の医薬組成物。 １０、成分Ａとして、ｔ−ＰＡ、〔Ａｓｎ＾１＾１＾９
   〕−ｔ−ＰＡ、〔Ａｌａ＾１＾８＾６〕−ｔ−ＰＡ、〔
   Ａｌａ＾４＾５＾０〕−ｔ−ＰＡ、〔Ａｓｎ＾１＾１＾
   ９，Ａｌａ＾１＾８＾６〕−ｔ−ＰＡ、〔Ａｓｎ＾１＾
   １＾９，Ａｌａ＾１＾８＾６，Ａｓｎ＾４＾５＾０〕−
   ｔ−ＰＡ及び〔Ａｓｎ＾１＾１＾９，Ａｌａ＾１＾８＾
   ６，Ａｌａ＾４＾５＾０〕−ｔ−ＰＡから成る群から選
   択されたプラスミノーゲン活性化因子を含んで成る請求
   項８に記載の医薬組成物。 １１、成分Ａとしてｔ−ＰＡを含んで成る請求項８に記
   載の医薬組成物。 １２、成分Ａとして、ヒトｔ−ＰＡの触媒ドメインに直
   列に連結された、ヒトｕ−ＰＡのすべてのもしくは個別
   のＡ−鎖ドメイン又はヒトｕ−ＰＡ及びヒトｔ−ＰＡの
   個別のＡ−鎖ドメインを含有するアミノ酸配列を含んで
   成る単鎖ハイブリドプラスミノーゲン活性化因子；ヒト
   ｕ−ＰＡの触媒領域に直列に連結された、ヒトｔ−ＰＡ
   のすべてのもしくは個別のＡ−鎖ドメイン又はヒトｔ−
   ＰＡ及びｕ−ＰＡの個別のＡ−鎖ドメインを含有するア
   ミノ酸配列を含んで成る単鎖ハイブリドプラスミノーゲ
   ン活性化因子；あるいはｕ−ＰＡクリングルに続くｕ−
   ＰＡ活性化部位までのアミノ酸セグメントがｔ−ＰＡク
   リングル２に続くｔ−ＰＡ活性化部位までのアミノ酸セ
   グメントにより置き換えられている点においてｕ−ＰＡ
   とは異る単鎖ハイブリドプラスミノーゲン活性化因子、
   を含んで成る請求項１に記載の医薬組成物。 １３、成分Ａとして、ヒトｕ−ＰＡの触媒領域に直列に
   連結された、ヒトｔ−ＰＡのＡ−鎖ドメインのすべてを
   含有するアミノ酸配列、ヒトｔ−ＰＡの個別のＡ−鎖ド
   メイン例えばヒトｔ−ＰＡのフィンガードメイン又はク
   リングルドメイン特にクリングル２ドメインを含有する
   アミノ酸配列、及びヒトｔ−ＰＡ及び／又はヒトｕ−Ｐ
   Ａの２個、３個もしくは４個のＡ−鎖ドメイン、特にヒ
   トｔ−ＰＡの２個もしくは３個のドメイン又はヒトｕ−
   ＰＡ及びヒトｔ−ＰＡの２個もしくは３個のドメイン、
   例えばヒトｔ−ＰＡのフィンガードメイン、成長因子ド
   メイン及びクリングル２ドメイン、ヒトｔ−ＰＡのフィ
   ンガードメイン及びクリングル２ドメイン、又はｕ−Ｐ
   Ａ成長因子ドメイン及びヒトｔ−ＰＡクリングル２ドメ
   インを含有するアミノ酸配列、並びにヒトｔ−ＰＡの触
   媒領域に直列に連結された、ｕ−ＰＡ成長因子ドメイン
   及びｔ−ＰＡクリングル２ドメインを含有するアミノ酸
   配列、から成る群から選択されたアミノ酸配列を含んで
   成る単鎖ハイブリドプラスミノーゲン活性化因子を含ん
   で成る請求項１２記載の医薬組成物。 １４、成分Ａとして、ｔ−ＰＡの触媒領域（Ｂ−鎖）に
   直列に連結された、ｕ−ＰＡのＡ−鎖又はｕ−ＰＡ成長
   因子ドメインとｔ−ＰＡクリングル２ドメインとから本
   質的に成るＡ−鎖を含んで成るハイブリドプラスミノー
   ゲン活性化因子、及びｕ−ＰＡの触媒領域（Ｂ−鎖）に
   直列に連結された、ｔ−ＰＡのＡ−鎖、ｔ−ＰＡのフィ
   ンガー領域ドメインから本質的に成るＡ−鎖、ｕ−ＰＡ
   成長因子ドメインとｔ−ＰＡクリングル２ドメインとか
   ら本質的に成るＡ−鎖、又はｔ−ＰＡのフィンガードメ
   インと成長因子ドメインとクリングル２ドメインとから
   本質的に成るＡ−鎖を含んで成るプラスミノーゲン活性
   化因子、から成る群から選択された単鎖ハイブリドプラ
   スミノーゲン活性化因子（ここで、前記Ａ−鎖は前記Ｂ
   −鎖に連結配列を介して連結されており、該連結配列は
   活性化部位と、前記Ｂ−鎖への硫黄−硫黄結合を形成す
   ることができるシステイン残基とを含んで成る）、ある
   いは、ｕ−ＰＡの触媒領域（Ｂ−鎖）に活性化部位にお
   いて連結されたｔ−ＰＡクリングル２ドメインから本質
   的に成るＡ−鎖を含んで成る単鎖ハイブリドプラスミノ
   ーゲン活性化因子、を含んで成る請求項１２に記載の医
   薬組成物。 １５、成分Ａとして、ｔ−ＰＡの触媒領域（Ｂ−鎖）に
   直列に連結された、ｕ−ＰＡ成長因子ドメインとｔ−Ｐ
   Ａクリングル２ドメインとから本質上成るＡ鎖を含んで
   成る単鎖ハイブリドプラスミノーゲン活性化因子、又は
   ｕ−ＰＡの触媒領域（Ｂ−鎖）に直列に連結された、ｔ
   −ＰＡクリングル２ドメインから本質上成るか又はｔ−
   ＰＡフィンガードメインとクリングル２ドメインとから
   本質上成るＡ−鎖を含んで成る単鎖ハイブリドプラスミ
   ノーゲン活性化因子であって、前記Ａ−鎖と前記Ｂ−鎖
   との間の連結が活性化部位にあるものを含んで成る請求
   項１２に記載の医薬組成物。 １６、成分Ａとして、〔ｕＰＡ（１−４４）−ｔＰＡ（
   １７６−５２７）〕〔ｔＰＡ（１−４９）−ｔＰＡ（１
   ７６−２７５）−ｕＰＡ（１５９−４１１）〕及び〔ｔ
   ＰＡ（１−３）ｔＰＡ（１７６−２７５）−ｕＰＡ（１
   ５９−４１１）〕から成る群から選択された単鎖ハイブ
   リドプラスミノーゲン活性化因子を含んで成る請求項１
   ２に記載の医薬組成物。 １７、成分Ａとして、Ｎ−グリコシル化部位の少なくと
   も１つがこの部位においてグリコシル化が起り得ない様
   に変形されているｕ−ＰＡ／ｔ−ＰＡハイブリドプラス
   ミノーゲン活性化因子の変異体を含んで成る請求項１に
   記載の医薬組成物。 １８、成分Ｂとして、次の式（III）： 【遺伝子配列があります】（III） 〔式中ＷはＴｙｒのフェノール性ヒドロキシル基（デス
   ルファトヒニジンＨＶ１）又は式−Ｏ−ＳＯ＿３Ｈの基
   （ヒルジンＨＶ１）を表わす〕により表わされるヒルジ
   ン変形体ＨＶ１： 次の式（IV）： 【遺伝子配列があります】（IV） で表わされるヒルジン変形体ＨＶ２；及び 次の式（Ｖ）： 【遺伝子配列があります】（Ｖ） で表わされるヒルジン変形体ＰＡ； から成る群から選択されたヒルジン、又はこれらのヒル
   ジン変形体のいずれかの変異体もしくは断片であって抗
   血栓活性を維持しているものを含んで成る請求項１に記
   載の医薬組成物。 １９、成分Ｂとして、デスルファトヒルジンＨＶ１、ヒ
   ルジンＨＶ１、ヒルジンＨＶ２及びヒルジンＰＡから成
   る群から選択されたヒルジンを含んで成る請求項１８に
   記載の医薬組成物。 ２０、成分Ｂとして、デスルファトヒルジンＨＶ１を含
   んで成る請求項１８に記載の医薬組成物。 ２１、成分Ｂとして、〔Ｉｌｅ＾１＾，＾２〕−デスル
   ファトヒルジンＨＶ１、〔Ｇｌｙ＾１〕−デスルファト
   ヒルジンＨＶ１、〔Ｇｌｎ＾５＾７＾，＾５＾８＾，＾
   ６＾１＾，＾６＾２〕−デスルファトヒルジンＨＶ１、
   〔Ｐｒｏ＾６＾６〕−デスルファトヒルジンＨＶ１、〔
   Ｇｌｎ＾２＾７，Ａｒｇ＾４＾７〕−デスルファトヒル
   ジンＨＶ１、〔Ｍｅｔ＾０，Ｇｌｎ＾２＾７，Ａｒｇ＾
   ４＾７〕−デスルファトヒルジンＨＶ１、〔Ｇｌｎ＾２
   ＾７，Ｇｌｎ＾３＾７，Ａｒｇ＾４＾７〕−デスルファ
   トヒルジンＨＶ１、〔ｄｅｓ−Ｖａｌ＾１，Ｔｈｒ＾２
   〕−デスルファトヒルジンＨＶ１、及び〔Ｌｙｓ＾４＾
   ７〕−ヒルジンＨＶ２から成る群から選択されたヒルジ
   ンを含んで成る請求項１８に記載の医薬組成物。 ２２、成分Ａとしてのｓｃｕ−ＰＡ、ｔ−ＰＡ、〔Ａｌ
   ａ＾４＾５＾０〕−ｔ−ＰＡ、〔Ａｓｎ＾１＾１＾９、
   Ａｌａ＾１＾８＾６、Ａｌａ＾４＾５＾０〕−ｔ−ＰＡ
   、〔ｕＰＡ（１−４４）−ｔＰＡ（１７６−５２７）〕
   、〔ｔＰＡ（１−４９）−ｔＰＡ（１７６−２７５）−
   ｕＰＡ（１５９−４１１）〕及び〔ｔＰＡ（１−３）−
   ｔＰＡ（１７６−２７５）−ｕＰＡ（１５９−４１１）
   〕から成る群から選択されたプラスミノーゲン活性化因
   子、及び成分ＢとしてのデスルファトヒルジンＨＶ１を
   含んで成る請求項１に記載の医薬組成物。 ２３、人体又は動物体の処置方法において使用するため
   の請求項１に記載の医薬組成物。 ２４、血栓症又は血栓症により惹起される疾患、動脈硬
   化、心筋梗塞及び脳梗塞、静脈血栓症、血栓塞栓症、術
   後血栓症並びに血栓性静脈炎の予防又は治療において使
   用するための請求項１に記載の医薬組成物。 ２５、心筋梗塞の予防又は治療において使用するための
   請求項１に記載の医薬組成物。 ２６、成分Ａ対成分Ｂの重量比が２０：１〜２：１であ
   る請求項１に記載の医薬組成物。 ２７、成分Ａと成分Ｂの重量比が５：１〜２：１である
   請求項１に記載の医薬組成物。