FI90787B - Menetelmä desulfatohirudiinin valmistamiseksi - Google Patents

Description

90787

Menetelmä desulfatohirudiinin valmistamiseksi -Förfarande för framställning av desulfatohirudin 5 Keksintö koskee desulfatohirudiinia koodittavia DNA-sekvensse-jä sisältäviä yhdistelmävektoreita ja menetelmää desulfatohi-rudiinin valmistamiseksi mainitulla yhdistelmävektorilla transformoitujen isäntäsolujen avulla.

10 Terveen nisäkkään elimistön plasmassa muodostuu dynaaminen tasapaino fibrinolyyttisen systeemin ja koagulaatiosysteemin välillä, mikä ylläpitää toimintakykyistä suoniverkostoa. Veri-suonivammoissa koagulaatiosysteemi saostaa fibriini-matriisin, joka hemostaattisen tilan saavuttamisen jälkeen hajotetaan 15 taas fibrinolyyttisellä systeemillä. Tapauksissa, joissa elimistön fibrinolyyttinen potentiaali on riittämätön poistamaan verisuonten sisäiset tukokset, esim. kuten on laita tromboem-boliaa tai leikkauksen jälkeisiä komplikaatioita sairastavilla, saattaa olla välttämätöntä tukea elimistöä antamalla trom-20 bolyyttisiä aineita tai antikoagulantteja.

Sopivina antikoagulaatioterapiayhdisteinä on tähän asti käytetty ennen muuta hepariinia, mutta myös 4-hydroksikumariini-ja 1,3-indaanidionijohdannaisia. Vaikka näillä aineilla saavu-25 tetaan huomattavia tuloksia, on niillä kuitenkin muutamia haittavaikutuksia. Niinpä hepariini ei vaikuta suoraan veren hyytymistapahtumaan, vaan kehittää epäsuorasti koagulaatiota estävän vaikutuksensa kiihdyttämällä trombiinin ja tekijän X inhibitiota antitrombiini III:11a.

30

Hepariini vaikuttaa elimistössä edelleen lukuisilla, ei-spesi-fisillä reaktioilla ja neutraloi verihiutaletekijän 4, mikä erityisesti vähentää sen käyttökelpoisuutta veren hyytymisen häiriöissä, jotka johtuvat hyytymisaktiivisten aineiden, esim.

35 fibrinogeenin lisääntyneestä käytöstä (Verbrauchs-Koagulopat- hie) tai vastaavasti hajapesäkkeisessä suonensisäisessä hyytymisessä (disseminierte intravasale Gerinnung (DIC)). Näin oi- 2

Ien esiintyy vaihtoehtoisten ja spesifisempien, antikoagulaa-tiohoidossa käytettävien aineiden tarvetta.

Jo kauan on tunnettu luonnollinen verijuotikkaissa (Hirudo 5 medicinalis) esiintyvä antikoagulantti, hirudiini. Hirudiini on 65 aminohaposta muodostuva polypeptidi, jonka primäärira-kenne on täysin selvitetty (1) ja se sisältää rakenteellisina tunnusmerkkeinä N-päässä hydrofobisten aminohappojen kasauman ja C-päässä polaaristen aminohappojen kasauman, sulfaattimono-10 esterinä esiintyvän tyrosiini-tähteen (Tyr63) ja kolme disul- fidisiltaa, joiden tarkkaa järjestystä ei kylläkään vielä tunneta.

Hirudiini, jonka Kj-arvo (kompleksi-dissosiaatiovakio) on 15 6 · 10'nM, on vahvin tunnettu trombiini-inhibiittori ja sille on tunnusomaista spesifinen affiniteetti trombiinkin nähden; veren hyytymiseen vaikuttavat muut entsyymit eivät inhiboidu. Päinvastoin kuin hepariini, hirudiini kohdistaa inhiboivan vaikutuksensa suoraan trombiinkin eikä vaikuta, kuten heparii-20 ni, antitrombiini III:n välityksellä. Puhdistetun hirudiinin ainoa, farmakologisesti ymmärrettävä vaikutus on veren hyytymisen estäminen tai verisuonitukosten ehkäiseminen. Annostettaessa suonensisäisesti koirille ei edes suurilla annoksilla havaittu mitään vaikutusta sydämen lyöntitiheyteen, hengityk-25 seen, verenpaineeseen, verihiutaleiden lukumäärään, fibrino- geeniin tai hemoglobiiniin. Rotalla, sialla ja koiralla suoritetuissa testeissä osoittautuu hirudiini tehokkaaksi kokeellisessa tromboosissa (aikaansaadaan joko salpauksella tai trombiini-injektiolla), endotoksiinisessa shokissa sekä DIC: 30 ssä (disseminierter intravasaler Gerinnung). Suorissa vertailukokeissa hepariinin kanssa, milloin tahansa niitä suoritettiin, hirudiini osoittautui paremmaksi.

Vaikka hirudiini on jo kauan ollut tunnettu, ei hirudiinilla 35 tähän asti ole ollut niin laajaa, terapeuttista käyttöä, jota odottaisi sen erinomaisten biologisten ominaisuuksien perusteella. Sen yleistä käyttöä lääketieteessä on erityisesti ra- il 90787 3 joittanut vaikeasti voitettava haitta, nimittäin sen äärimmäisen rajoitettu saantimahdollisuus. Tähän asti on hirudiini-valmisteet saatu yksinomaan kalliista ja vaikeasti saatavissa olevasta luonnonmateriaalista, lähtemällä verijuotikas-uut-5 teista aikaavievillä ja suuria kustannuksia vaativilla eris-tämis- ja puhdistamismenetelmillä (vrt. viite 2). 65 aminohapon suhteellisen pitkä sekvenssi on myös klassisella peptidi-synteesillä näyttänyt taloudelliselta kannalta vähemmän lupaa-valta.

10

Riittävien hirudiinimäärien valmistamiseksi, jotka vasta tekevät mahdolliseksi tietyt kliiniset tutkimukset niiden terapeuttisesti tehosta ja niiden laajan terapeuttisen käytön an-tikoagulanttihoidossa, täytyy näin ollen saada uusia keinoja.

15 Tähän sopii erityisesti yhdistelmä-DNA-tekniikka. Sen avulla on mahdollista valmistaa erilaisia, fysiologisesti aktiivisia polypeptidejä viljelemällä vastaavasti geneettisesti modifioituja mikro-organismeja tai nisäkässoluviljelmiä.

20 Tämän keksinnön tarkoituksena on geeniteknologian keinoin muodostaa ilmentämissysteemi joka tekee mahdolliseksi hirudiini-aktiivisuuden omaavien polypeptidien valmistuksen teollisessa mittakaavassa. Tämä tehtävä ratkaistaan tässä keksinnössä val- 25 mistamalla yhdistelmäplasmideja, jotka sisältävät hirudiinin aminohapposekvenssiä koodittavan DNA-sekvenssin, jota tällainen ilmentymisenohjaussekvenssi säätelee siten, että tällä yhdistelmävektorilla transformoituneet isäntäsolut tuottavat hirudiini-aktiivisuuden omaavia polypeptidejä.

30

Oli odotettavissa, että tällaisten DNA-sekvenssien ilmentyminen transformoiduissa isäntäsoluissa (lukuunottamatta transformoituja juotikassoluja) ylimääräisen, sisäisen sulfaattia-siirtävän entsyymisysteemin puuttuessa johtaisi tuotteeseen, 35 joka eroaa luonnollisesta hirudiinista olennaisesti sulfaat-titähteen puuttuessa tyrosiini-63:sta. Sulfaattitähteen biologista funktiota proteiineissa yleensä ja hirudiinissa eri- 4 tyisesti ei ole yksityiskohtaisesti täysin selvitetty; kuitenkin sulfaattitähteen pitäisi nykyisen tietämyksen mukaisesti vaikuttaa proteiinin fysiologisiin ominaisuuksiin huomattavasti. Niinpä sulfaattitähteellä olisi seuraavat funktiot: 5 (1) positiivinen vaikutus proteiinin biologiseen aktiivisuuteen; (2) ottaa osaa sääteleviin soluprosesseihin (kuten on tunnettua reversiibelistä fosforyloinnista); 10 (3) stimuloida eritystä, t.s. sulfatointi toimii leimaajana sekretorisen proteiinin tunnistamiseksi; kaikki tunnetut, sulfatoidut proteiinit ovat sekretorisia tai transmembra-naalisia proteiineja.

15 Yllättävällä tavalla on nyt havaittu, että vastoin teoreettisia odotuksia hirudiinin arvokkaat, biologiset ominaisuudet säilyvät myös silloin, kun Tyrö-tähteen fenolisen hydroksyy-lin, tunnusomainen sulfaattimonoesteriryhmä poistetaan. Keksinnön mukaisten, transformoitujen mikro-organismien avulla 20 valmistetut hirudiiniyhdisteet, joilta puuttuu sulfaattitähde ("desulfatohirudiinit") omaavat nimittäin luonnolliseen hiru-diiniin verrattuna sen biologiset ominaisuudet, erityisesti sen antikoaguloivan vaikutuksen, kvalitatiivisesti ja kvantitatiivisesti ainakin samanarvoisena.

25

Seuraavassa DNA-sekvensseillä tai geeneillä, jotka kooditta-vat hirudiinin aminohapposekvenssiä, on ymmärrettävä tarkoitettavan sellaisia DNA-sekvenssejä tai geenejä, jotka ilmentymisellä tuottavat hirudiinin kaltaisia polypeptidejä, jotka 30 eroavat luonnollisesta hirudiinista erityisesti sulfaattieste-riryhmän puuttuessa tyrosiini-63 : sta (•'desulfatohirudiinit") .

Hirudiinin aminohapposekvenssiä koodittavien DNA-sekvenssien valmistaminen 35

Menetelmässä DNA-sekvenssien, jotka koodattavat hirudiinin aminohapposekvenssiä, ja niiden fragmenttien valmistamiseksi

II

90787 5 juotikkaan perimä-DNA:sta eristetään hirudiini-rakennegeeni tai hirudiini-mRNA:sta valmistetaan komplementaarinen kaksi-säikeinen hirudiini-DNA (hirudiini-ds cDNA) tai valmistetaan hirudiinin aminohapposekvenssiä koodittava geeni tai sen frag-5 mentteja kemiallisen ja entsymaattisen menetelmän avulla.

Perimän hirudiini-DNA ja hirudiini-ds cDNA saadaan esimerkiksi sinänsä tunnetuilla menetelmillä. Niinpä perimän hirudiini-DNA: ta saadaan esimerkiksi juotikasgeenipankista, joka sisäl-10 tää hirudiini-geenin siten, että juotikas-DNA-fragmentit kloonataan mikro-organismiin ja kloonit, jotka sisältävät hirudiini-DNA: n, identifioidaan esimerkiksi pesäke-hybridisaatiolla käyttäen radioaktiivisesti leimattua hirudiini-DNA-spesifistä oligodeoksinukleotidia, joka sisältää ainakin 15, mieluimmin 15 15-30 deoksinukleotidia. Näin saadut DNA-fragmentit sisältävät hirudiini-geenin lisäksi yleensä muita, ei-toivottuja DNA-jaksoja, jotka voidaan lohkaista pois käsittelemällä sopivilla ekso- tai endonukleaaseilla.

20 Kaksisäikeinen hirudiini-cDNA voidaan valmistaa esimerkiksi siten, että sopivista, mieluimmin hirudiinin muodostamiseksi indusoiduista juotikassoluista eristetään mRNA, näin saatu mRNA-seos rikastetaan sinänsä tunnetulla tavalla hirudiini-mRNA^ suhteen, tätä mRNA:ta käytetään templaattina yksisäi-25 keisen cDNA:n valmistuksessa, siitä syntetisoidaan RNA:sta riippumattoman DNA-polymeraasin avulla ds-cDNA ja tämä kloonataan sopivaan vektoriin. Kloonit, jotka sisältävät hirudii-ni-cDNA:n, identifioidaan esimerkiksi, kuten edellä esitettiin, pesäkehybridisaatiolla käyttäen radioaktiivisesti lei-30 mattua, hirudiini-DNA-spesifistä oligodeoksinukleotidia.

Tällä tavalla valmistettuihin perimän hirudiini-DNA:hän tai hirudiini-cDNA:hän liitetään mieluimmin 5' - ja 3'-päähän kemiallisesti syntetisoidut adapteri-oligodeoksinukleotidit, 35 jotka sisältävät tunnistussekvenssin yhdelle tai useammalle restriktiendonukleaasille (-nukleaaseille) ja siten helpottavat liittämistä sopiviin vektoreihin. Lisäksi hirudiini-DNA:n 6 tai -cDNA:n 5'-pään adapterimolekyylin täytyy sisältää vielä luennanaloitussignaali (ATG). Luennanaloitussignaalin tulee sijaita siten, että hirudiinin ensimmäisen aminohapon kodoni seuraa sitä välittömästi.

5

Koska luonnollisen hirudiini-geenin rakennetta ei tunneta ja hirudiinin aminohapposekvenssiä koodittavan geenin ("desulfa-tohirudiini-geenin") kemiallinen synteesi nykyaikaisilla synteesimenetelmillä tarjoaa etuja, erityisesti ajankäytössä, on 10 viimeksi mainittu esitetty tässä selityksessä.

Desulfatohirudiini-aeenin kemiallinen synteesi

Menetelmässä desulfatohirudiinin rakennegeenin tai sen frag-15 menttien valmistamiseksi desulfatohirudiini-geenin koodittavan ja komplementaarisen säikeen segmentit syntetisoidaan kemiallisesti ja saadut segmentit muutetaan entsymaattisesti desulfatohirudiinin rakennegeeniksi tai sen fragmenteiksi.

20 Tässä esitetään myös kaksisäikeinen DNA, joka koodittaa desul-fatohirudiinia.

Mainitut DNA:t sisältävät desulfatohirudiinin kodonien lisäksi luennanaloitus- ja lopetussignaalit, jotka mahdollistavat il-25 mentymisen sopivissa isäntäsoluissa esimerkiksi E. coli:ssa, ja lisäksi päissä nukleotidisekvenssejä, jotka soveltuvat vektoriin liittämiseen.

Eräässä edullisessa suoritusmuodossa, DNA sisältää 5'-päässä 30 restriktioentsyymillä leikattavissa olevan nukleotidisekvens-sin, jota seuraa luennanaloitussignaali, hirudiinin aminohappojen kodonit, jotka mahdollisesti sisältävät yhden tai useampia restriktioentsyymien katkaisukohtia, luennanlopetussig-naalin ja 3'-päässä restriktioentsyymillä katkaistavissa ole-35 van nukleotidisekvenssin. Keksinnön mukaisesti käyttökelpoisia restriktioentsyymejä ovat esimerkiksi EcoRI, EcoRII, BamHI, Hpall, PstI, Hinfl tai Hindlll.

7 90787

Erityisesti on kyseessä kaksisäikeinen DNA, joka muodostuu kaavan (I) mukaisesta nukleotidisekvenssistä ja komplementaarisesta nukleotidisekvenssistä 5 5' Met (Χ·)„ atg

Vai Vai Tyr Thr Asp Cys Thr Glu 10 GTX GTX TAY ACX GAY TGY ACX GAM

Ser Gly Gin Asn Leu Cys Leu Cyn

QRS GGX CAM AAY YTZ TGY YTZ TGY

15 Glu Gly Ser Asn Vai Cys Gly Gin

GAM CGX QRS AAY GTX TGY GGX CAM

Gly Asn LYs Cys Ile Leu Gly Ser

GGX AAY AAM TGY ATN YTZ GGX QRS

20

Asp Gly Glu Lys Asn Gin Cys Vai

GAY GGX GAM AAM AAY CAM TGY GTX

Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro

25 ACX GGX GAM GGX ACX CCX AAM CCX

Gin Ser His Asn Asp Gly Asp Phe

CAM QRS CAY AAY GAY GGX GAY TTY

30 Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu

GAM GAM ATN CCX GAM GAM TAY YTZ

Gin NON 3' CAM TMK (X · ) o, 35 (I) jossa on esitetty 5'-päästä alkava nukleotidisekvenssi ja selvyyden vuoksi, jokaisen tripletin koodittamat aminohapot 40 on merkitty esiin ja jossa symboleilla on seuraavat merkitykset : A deoksiadenosyyli T tymidyyli G deoksiguanosyyli 45 C deoksisytidyyli X A, T, C tai G, Y T tai C, 8 Z A, T, C tai G, kun Y = C, tai Z = A tai G, kun Y = T, Q T tai A, R c tai S = A, T, C tai G, kun Q = T, 5 tai R = G ja S = T tai C, kun Q = A, M A tai G, L A tai C,

N T, C tai A

K A tai G, kun M = A, 10 tai K = A, kun M = G, ja (X')« ja (X')m tarkoittavat nukleotidisekvenssejä, joissa n ja m ovat suurempia kuin 3 ja pienempiä kuin 100, erityisesti suurempia kuin 5 ja pienempiä kuin 15, jotka sekvenssit restriktioentsyymi tunnistaa ja jotka se kykenee katkaisemaan. 15

Eräässä edullisessa suoritusmuodossa DNA-sekvenssi sisältää 5'-päässä EcoRIrllä katkaistavissa olevan, keskellä EcoRII:lla katkaistavissa olevan ja 3'-päässä BamHI:llä katkaistavissa olevan nukleotidisekvenssin.

20

Ensi sijassa kyseessä on sellainen kaksisäikeinen DNA, joka sisältää E. colin suosimia ja hirudiinin aminohappoja koodit-tavia triplettejä. Tällaisia triplettejä ovat erityisesti glysiinille (Gly) GGT

25 kysteiinille (Cys) TGC

valiinille (Vai) GTT

leusiinille (Leu) CTG

seriinille (Ser) TCT

treoniinille (Thr) ACC

30 fenyylialaniinille (Phe) TTC

tyrosiinilie (Tyr) TAC

metioniinille (Met) ATG

asparagiinihapolle (Asp) GAC

glutamiinihapolle (Glu) GAA

35 lysiinille (Lys) AAA

isoleusiinille (Ile) ATG

histidiinille (His) CAC

90787 9

proliinille (Pro) CCG

glutamiinille (Gin) CAG

asparagiinille (Asn) AAC

5 Edullinen lopetussignaali (NON) on kodoni TAG.

Hirudiinin aminohapposekvenssiä koodittavan geenin eräs edullinen suoritusmuoto esitettynä edellä kuvatulla tavalla on kaavan (II) mukainen DNA.

10

MetValValTyrThrAepCysThrGluSerGlyGlnAsnLeuCyeLeuCysGluGly

CTGGAATTCATGGTTGTTTACACCGACTGCACCGAATCTGGTCAGAACCTGTGCCTGTGCGAAGGT

GACCTTAAGTACCAACAAATGTGGCTGACGTGGCTTAGACCAGTCTTGGACACGGACACGCTTCCA

(EcoRl) 15

SerABnValCysGlyGlnGlyAsnLyaCyelleLeuGlySerAepGlyGluLysAsnGlnCyeVal

TCTAACGTTTGCGGTCAGGGTAACAAATGCATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAAACCAGTGCGTT

AGATTGCAAACGCCAGTCCCATTGTTTACGTAGGACCCAAGACTGCCACTITTTTTGGTCACGCAA

(EcoRIl)

ThrGlyGluGlyThrProLysProGlnSerHisAsnAspGlyAepPheGluGluIleProGluGlu „ _ ACCGGTGAAGGTACCCCGAAACCGCAGTCTCACAACGACGGTGACTTCGAAGAAATCCCGGAAGAA j n

TGGCCACTTCCATGGGGCTTTGGCGTCAGAGTGTTGCTGCCACTGAAGCTTCTTTAGGGCCTTCTT

TyrLeuGlnNON

TACCTGCAGTAGGATCCTG

ATGGACGTCATCCTAGGAC

(BamHl) (II).

25 jossa A, T, G, C tarkoittavat samaa kuin kaavassa (I) ja joissa ymmärtämisen helpottamiseksi on merkitty esiin aminohapot, joita kukin tripletti koodittaa, sekä restriktioentsyymien 30 katkaisukohdat.

Voidaan valmistaa myös DNA:n fragmentteja, jotka koodittavat desulfatohirudiinia.

35 Erityisesti voidaan valmistaa desulfatohirudiini-geenin kaksi-säikeisiä DNA-fragmentteja, erityisesti sellaisia, joiden päät voidaan katkaista restriktioentsyymeillä. Hirudiinigeenin täi- 10 laiset kaksisäikeiset DNA-fragmentit käsittävät erityisesti 30 - 70 emäsparia.

Esimerkkeinä esitettiin kaavan (III) (F,) ja kaavan (IV) (F2) 5 mukaisia DNA-fragmentteja:

MetValValTyrThrAspCysThrGluSerGlyGlnAsnLeuCyeLeuCyeGluGly

CTGGAATTCATGGTTGTTTACACCGACTGCACCGAATCTGGTCAGAACCTGTGCCTGTGCGAAGGT

GACCTTAAGTACCAACAAATGTGGCTGACGTGGCTTAGACCAGTCTTGGACACGGACACGCTTCCA

(EcoRl) 10

SerAenValCyeGlyGlnGlyAsnLyeCyelleLeuGlySer

TCTAACGTTTGCGGTCAGGGTAACAAATGCATCCTGGGTTCTG

AGATTGCAAACGCCAGTCCCATTGTTTACGTAGGACCCAAGAC

(EcoRII)

Fj (III) 15 IleLeuGlySerAspGlyGluLysABTiGlnCyeValThrGlyGluGlyThrProLysPro CATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAAACCAGTGCGTTACCGGTGAAGGTACCCCGAAACCG GTAGGACCCAAGACTGCCACTTTTTTTGGTCACGCAATGGCCACTTCCATGGGGCTTTGGC (EcoRII)

GlnSerHieABnAspGlyAspPheGluGluIleProGluGluTyrLeuGlnNON CAGTCTCACAACGACGGTGACTTCGAAGAAATCCCGGAAGAATACCTGCAGTAGGATCCTG 2 0 GTCAGAGTGTTGCTGCCACTGAAGCTTCTTTAGGGCCTTCTTATGGACGTCATCCTAGGAC

(BamHI) f2 (IV)

Voidaan valmistaa myös desulfatohirudiini-geenin yksisäikeisiä DNA-fragmentteja, erityisesti sellaisia, jotka voidaan kemial-25 lisillä ja/tai entsymaattisilla menetelmillä koota täydelliseksi desulfatohirudiini-geeniksi. Ensi sijassa valmistetaan yksisäikeisiä DNA-fragmentteja, joissa on enemmän kuin 20 nukleotidia, erityisesti 20 - 70 nukleotidia.

30 Esimerkeissä on kuvattu yksisäikeisiä ja kaksisäikeisiä DNA-fragmentteja.

DNA:n synteesimenetelmistä on S.A. Narang (3) esittänyt yhteenvedon. Tunnetuilla synteesimenetelmillä voidaan valmistaa 35 polynukleotideja, joiden pituus on 20 emästä, tällöin saannot ovat hyviä, puhtausaste on korkea ja valmistusaika on suhteellisen lyhyt. Sopivasti suojatut nukleotidit liitetään toisiin- 90787 11 sa fosfodiesterimenetelmällä (4), vielä tehokkaammalla fosfo-triesterimenetelmällä (5) tai fosfiittitriesterimenetelmällä (6). Kiinteätaasi-menetelmä tekee mahdolliseksi oligo- ja po-lynukleotidien yksinkertaisemman synteesin, kun nukleotidiket-5 jut sitoutuvat sopivaan polymeeriin. Itakura et ai. (7) käyttävät kiinteäfaasi-synteesissä yksittäisten nukleotidien sijasta fosfotriesteri-menetelmällä yhteenliitettyjä trinukleo-tideja, jotka siten voidaan lyhyessä ajassa ja hyvillä saannoilla kondensoida esimerkiksi 31 emästä sisältäväksi polynuk-10 leotidiksi. Varsinainen kaksisäikeinen DNA voidaan entsymaattisesti rakentaa kemiallisesti valmistetuista, lyhyistä segmenteistä. Khorana et ai. (8) käyttävät tähän tarkoitukseen päällekkäin ulottuvia kummankin DNA-säikeen polynukleotidisek-venssejä, jotka emäspariutumisen avulla pysyvät oikeassa jär-15 jestyksessä ja sen jälkeen liittyvät yhteen kemiallisesti DNA-ligaasientsyymillä. Eräs toinen mahdollisuus on inkuboida kulloinkin kummankin DNA-säikeen polynukleotidisekvenssiä, joissa on lyhyet, toistensa yli ulottuvat päät, neljän tarvittavan deoksinukleosidi-trifosfaatin läsnäollessa ja DNA-polymeraa-20 sin, esim. DNA-polymeraasin I:n polymeraasi I:n Klenow-frag-mentin, T4 DNA-polymeraasin tai AMV:n (linnun myeloblastosis-virus) käänteis-transkriptaasin kanssa. Tällöin emäspariutumisen seurauksena molemmat polynukleotidisekvenssit pysyvät oikeassa järjestyksessä ja entsyymi suorittaa täydentämisen 25 tarvittavilla nukleotideilla täydelliseksi kaksisäikeiseksi DNA:ksi (9). Itakura et ai. (10) esittävät, miten tällä periaatteella voidaan saada DNA-polymeraasi I:n (Klenow-fragment-ti) läsnäollessa neljästä kemiallisesti syntetisoidusta, 39-42 emäksen pituisesta fragmentista rakennetuksi ihmisen leuko-30 syytti-interferonin a2-geenin 132 emäsparin pituinen segmentti, jolloin saavutetaan 40 %:n säästö kemiallisessa synteesissä verrattuna edellä kuvattuun menetelmään, jossa käytetään ainoastaan ligaasia.

35 Tässä esitetään menetelmä sellaisten DNA-ketjujen valmistamiseksi, jotka sisältävät desulfatohirudiinin rakennegeenin ja soveltuvat ilmentymiseen isäntäsoluissa ja joiden päät tekevät 12 mahdolliseksi liittymisen vektoreihin, ja niiden fragmenttien valmistamiseksi siten, että a) sopivasti suojattu deoksinukleosidi sidotaan kiinteään kan-toaineeseen, 5 b) valmistetaan sopivasti suojattuja di-, tri- tai tetranuk-leotideja fosfotriesteri- tai fosfiitti-menetelmallä, c) kantoaineeseen sitoutunut deoksinukleosidi tai oligodeok-10 sinukleotidi liitetään sopivasti suojattuun mono- tai (kohdan b mukaan valmistettuun) di-, tri- tai tetranukleotidiin fosfotriesteri- tai fosfiitti-menetelmällä, d) kohdan c) mukaisesti saadut, kantoaineeseen sitoutuneet 15 oligodeoksinukleotidit pituudeltaan noin 20 - noin 70 emästä, lohkaistaan pois kantoaineesta, mahdollisesti puhdistetaan, vapautetaan suojaryhmistä ja vapaat 5'-päässä olevat hydrok-siryhmät fosforyloidaan, 20 el) 2 oligodeoksinukleotidia, kumpikin pituudeltaan noin 20 -noin 70 emästä koodittavasta ja komplenlentaarisesta säikeestä sisältäen ainakin 3, mieluimmin 8-1“, päällekkäin ulottuvaa emäsparia, liitetään rinnakkain pariksi ja täydennetään DNA-polymeraasilla neljän deoksinukleosidi-trifosfaatin läsnäol-25 lessa kaksisäikeiseksi DNA-segmentiksi (desulfatohirudiini-geenin fragmentit), ja mahdollisesti 2 kaksisäikeistä DNA-segmenttiä, joissa on sopivat, kohdan d) mukaisesti fosforyloidut päät, liitetään 30 ligaasin avulla desulfatohirudiini-rakennegeeniksi, tai 2 saatua, kaksisäikeistä DNA-segmenttiä subkloonattuna sopiviin vektoreihin, jonka jälkeen fosforyloidaan kohdan d) mukaisesti ja liitetään ligaasin avulla desulfatohirudiini-35 rakennegeeniksi, tai e2) vaihtoehtoisesti molemmat 2 oligodeoksinukleotidia kooda- li 90787 13 tusta ja komplementaarisesta säikeestä, pituudeltaan esim. 20 - 70 emästä ja sisältäen kulloinkin, ainakin 3, mieluimmin 8-15 päällekkäin ulottuvaa emäsparia, liitetään rinnakkain pariksi, täydennetään DNA-polymeraasilla neljän deoksinukleo-5 sidi-trifosfaatin läsnäollessa ja liitetään ligaasin avulla desulfatohi rud i i n i-rakennegeeniks i.

Esitetty menetelmä on sinänsä tunnettu, kuitenkin vasta olosuhteiden ja tässä esitettyjen parannusten sopivat kombinaa-10 tiot tekevät mahdolliseksi hirudiinin aminohapposekvenssiä koodittavien DNA-ketjujen valmistuksen.

Kohdassa a) voidaan käyttää monia kiinteitä kantoaineita, kuten erilailla kytkeytyneitä ja turpoavia polystyreenejä, 15 polyakryyliamideja, polyakryyliamidi-kopolymeereja, orgaanisille aineille, kuten piimaalle, piihappogeelille tai alok-sille levitettyjä polyamideja tai funktionalisoituja silaa-neja. Keksinnön mukaisessa eräässä edullisessa suoritusmuodossa käytetään kiinteinä kantoaineina ristiinkytkettyjä 20 polystyreenejä, jotka kiinnitysryhmien ("spacer"), kuten 2-12 C-atomia sisältävien, 1-5 polaarisen, kaksiarvoisen funktionaalisen ryhmän, kuten iminon, okson, tion, oksi-karbonyylin tai aminokarbonyylin katkaisemien alkyleeniryh-mien välityksellä liitetään sinänsä tunnetulla tavalla deoksi-25 nukleosidiin, jonka 5'-OH-ryhmä on sopivasti suojattu. Erityisen edullista on saattaa kaavan (V) mukaisen, 5'-asemastaan ja mahdollisesti emäsosastaan suojattu nukleosidi, jossa R1 tarkoittaa hapolla poislohkaistavissa olevaa suojaryhmää, kuten triaryylimetyylisuojaryhmää, esimerkiksi 4-metoksitrityyli-30 tai 4,4'-dimetoksitrityyliryhmää tai trialempialkyylisilyyli-suojaryhmää, esimerkiksi tert.-butyylidimetyylisilyyliryhmää ja jossa B tarkoittaa mahdollisesti suojattua emästä, joka on tymyyli, sytosyyli, adenyyli tai guanyyli, reagoimaan meripih-kahappoanhydridin kanssa mahdollisesti emästen, kuten pyridii-35 nin, trietyyliamiinin tai dimetyyliaminopyridiinin läsnäollessa, jota seuraa reaktio aminometyloidun polystyreenin kanssa, joka on ristiinkytketty 0,5-2 prosentilla divinyylibentsee- 14 niä karboksyylihappotähteen aktivoivien reagenssien, mieluimmin N-hydroksisukkinimidin tai p-nitrofenolin ja vettä poistavien aineiden kuten karbodi-imidien, esimerkiksi disyklohek-syylikarbodi-imidin avulla (kaavio 1).

5

Reaktio tapahtuu inertissä, ei-proottisessa liuottimessa, esim. pyridiinissä, tetrahydrofuraanissa, dioksaanissa, etik-kahappoetyyliesterissä, kloroformissa, metyleenikloridissä, dimetyyliformamidissa tai dietyyliasetamidissa tai näiden 10 seoksissa, huoneen lämpötilassa tai hiukan korotetussa tai alennetussa lämpötilassa, esim. noin -10°C - noin 50°C, mieluimmin huoneen lämpötilassa, reaktio vettäsitovan aineen läsnäollessa myös alhaisemmassa lämpötilassa, esim. noin 0° C:ssa.

15

Kaavio 1 il %

20 ί P

B \ /

U

-OH ---- -OCCH2CH2COOH

R °\ R °\ 8 (v) j N-hydroksisukkinimidi disykloheksyy 1 ikarbodi- imidi S % 2. H2NCH2—y- polystyreeni • ne n * *·· R1 -o^CH2CH2jjNHCH2—^ polystyreeni (VI) 30

Di-, tri- tai tetranukleotidien valmistuksessa kohdan b) mukaisesti (Kaavio 2), saatetaan kaavan (V) mukaiset 5'-asemassa ja mahdollisesti emäsosassa suojatut nukleosidit, joissa R1 ja 35 B tarkoittavat samaa kuin edellä, reagoimaan kaavan (VII) mukaisen aktivoidun fosforiesterin kanssa, jossa X1 ja X2 tarkoittavat, toisistaan riippumatta, hydroksia tai siitä johdet- n 90787 15 tuja suoloja, halogeenia, imidatsolyylia, 1,2,4-triatsol-l-yyliä, tetratsolyyliä tai 1-bentstriatsolyylioksia ja X2 tarkoittaa lisäksi myös 2-syanoetyylioksia, 2-trihalogeenietyyli-oksia, 2-aryylisulfonyylietyylioksia, 2-alempialkyylitioetyy-5 lioksia, 2-aryylitioetyylioksia tai 2-(4-nitrofenyyli)-etyyli-oksia ja R2 tarkoittaa emäksellä tai nukleofiililla, kuten ammoniumhydroksidilla, tiofenolaatilla tai aryylialdoksimaa-tilla poislohkaistavissa olevaa suojaryhmää, kuten mahdollisesti halogeenilla, nitrolla ja/tai alempialkyylillä substi-10 tuoitua fenyyliä, metyyliä tai mahdollisesti nitrolla substi-tuoitua bentsyyliä, tai metalli-ionilla poislohkaistavissa olevaa suojaryhmää, kuten 8-kinolyyliä tai 5-kloori-8-kinolyy-liä, mahdollisesti vettä poistavien aineiden tai emästen läsnäollessa.

15

Sen jälkeen tällä tavalla muodostunut, kaavan (VIII) mukainen yhdiste, jossa R1, X2 ja R2 tarkoittavat samaa kuin edellä, ensin saatetaan reagoimaan mahdollisesti 2-substituoidun etanolin kanssa, joka muuntaa tähteen X2 ryhmäksi OR3, jossa R3 20 tarkoittaa syanoetyyliä, 2-trihalogeenietyyliä, 2-aryylisulfo-nyylietyyliä,- 2-alempialkyylitioetyyliä, 2-aryylitioetyyliä tai 2-(4-nitrofenyyli)-etyyliä, jonka jälkeen suojaryhmä Rl lohkaistaan pois ja tällä tavalla valmistettu, kaavan (IX) mukainen yhdiste saatetaan reagoimaan kaavan (VIII) mukaisen 25 toisen yhdisteen kanssa, mahdollisesti vettä poistavien aineiden läsnäollessa tai emästen läsnäollessa, kaavan (X) mukaiseksi dinukleotidiksi (Kaavio 2). Mahdollisesti kaavan (VIII) mukainen yhdiste muutetaan reaktiolla emästen ja veden kanssa toiseksi, kaavan (VIII) mukaiseksi yhdisteeksi, jossa X2 tar-30 koittaa hydroksia tai siitä johdettua suolaa.

Reaktiot tapahtuvat jossain edellämainituista inerteistä liuottimista huoneen lämpötilassa tai hiukan korotetussa tai alennetussa lämpötilassa, esim. huoneen lämpötilassa.

35

Suojaryhmän R1 poislohkaisu suoritetaan esim. happojen, kuten mineraalihappojen, esim. suolahapon tai rikkihapon, karboksyy- 16 lihapon, esim. etikkahapon, trikloorietikkahapon tai muurahaishapon, sulfonihapon, esim. metaani- tai p-tolueenisulfoni-hapon tai erityisesti Lewis-hapon, esim. sinkkikloridin, sink-kibromidin, aluminiumkloridin, dialkyylialuminiumhalogenidin, 5 esim. dibutyyli- tai dietyyliaminiumkloridin tai booritrifluo-ridin avulla, 10°C-50°C:ssa, erityisesti huoneen lämpötilassa. Käytettäessä dialkyylialuminiumhalogenidia tapahtuu poisloh-kaisu lipoiiilisessa liuottimessa, erityisesti tolueenissa ja käytettäessä jotain muuta mainituista Lewis-hapoista tapahtuu 10 poislohkaisu liuotinseoksessa, joka muodostuu halogeenihiili-vedystä, esim. metyleenikloridista ja alempialkanolista, esim. etanolista tai isopropanolista.

Kaavio 2 15 11 B 1'

Rio -OH + X1 -P-X*--♦ R10 —0-F-X* -HO -0-?-0R3 \ 0RJ n· OR2 n· ÖR*

v VII VIII IX

20 O f o VIII + IX -» -O-P x R* 0χ R* ό Οχ OR1 e ♦ 25 Kaavan (X) mukaisten dinukleotidien valmistus käsittää myös kaavan (V) mukaisten nukleosidien, joissa R1 ja B tarkoittavat samaa kuin edellä, reaktion kaavan (VIIA) mukaisten fos-fiittien kanssa, joissa X1 tarkoittaa halogeenia, erityisesti klooria, X2 tarkoittaa halogeenia, erityisesti klooria tai 30 dialempialkyyliaminoa, erityisesti dimetyyliaminoa tai di-iso-propyyliaminoa tai morfolinoa, piperidinoa tai pyrrolidinoa ja R2 tarkoittaa samaa kuin kaavassa (VII), erityisesti metyyliä, mahdollisesti sopivan emäksen läsnäollessa (Kaavio 3). Keksinnön mukaisesti saatavat, kaavan (VIHA) mukaiset yhdisteet 35 saatetaan toisaalta reagoimaan 2-substituoidun etanolin kanssa, joka muuttaa tähteen X2 ryhmäksi OR3, jossa R3 tarkoittaa samaa kuin edellä, tämän jälkeen hapetusaineella, esimerkiksi 90787 17 jodilla emäksen läsnäollessa hapetetaan fosfaatiksi ja suoja-ryhmä R1 lohkaistaan pois, jolloin muodostuu kaavan (IX) mukainen yhdiste, toisaalta ne saatetaan reagoimaan kaavan (IX) mukaisen yhdisteen kanssa, jonka jälkeen hapetusaineella, esi-5 merkiksi jodilla emäksen läsnäollessa hapetetaan kaavan (X) mukaiseksi yhdisteeksi.

Kaavio 3 10 :i

1. RJOH

ft1 o -OH 4 χ.-Ρ-χ* -- R10 -o-P-x' hapetus (IX) \ ÖR* 0R2 3. R1 poistetaan (V) (VI IA) (VIHA)

15 I 1. IX

I 2. hapetus (X)

Trinukleotidien valmistamiseksi kaavan (X) mukaisista dinuk-20 leotideista, joissa R1, R2 ja R3 tarkoittavat samaa kuin edellä ja joissa B1 ja B2 tarkoittavat toisistaan riippumatta tymyy-lia, sytosyyliä, adenyyliä tai guanyyliä, lohkaistaan pois suojaryhmä R1 ja saatu yhdiste saatetaan reagoimaan kaavan (VIII) mukaisen yhdisteen kanssa, mahdollisesti vettä pois-25 tavien aineiden läsnäollessa tai emästen läsnäollessa, tai kaavan (VIHA) mukaisen yhdisteen kanssa, jonka jälkeen suoritetaan hapetus, jolloin muodostuu kaavan (XI) mukainen yhdiste (Kaavio 4). Suojaryhmän R1 poislohkaisu ja kondensaatio kaavan (XI) mukaisiksi trinukleotideiksi tapahtuu samalla tavalla, 30 kuin on esitetty kaavan (X) mukaisten dinukleotidien valmistuksen yhteydessä.

18

Kaavio 4 5 B*

X— HOs-k -fr tTlffilA

• \ *· hapetus ]l3 Bl B2 10 Rln -0-1 -0-1 —O-P-OR3 (XI) R °\ R2 0 0 R26\ ÖR2 • \ \ • · 15

Tetranukleotidien valmistamiseksi kaavan (XI) mukaiset trinuk-leotidit 4 saatetaan reagoimaan, kuten edellä on esitetty kaavan (X) mukaisille dinukleotideille.

20 Eräässä vaihtoehtoisessa suoritusmuodossa käytetään suojaryh-mänä R1 4-metoksitrityyliryhmää, suojaryhmänä R2 kloorilla sub-stituoitua fenyyliryhmää, erityisesti 2-kloorifenyyliä ja suojaryhmänä R3 2-syanoetyyliryhmää. Kaavan (VII) mukaisessa yhdisteessä tähde X1 ja X2 on 1-bentstriatsolyylioksi-tähde.

25

Kaavan (XI) mukaiset trinukleotidit valmistetaan mieluimmin siten, että kaavan (X) mukaisista dinukleotideista lohkaistaan pois suojaryhmä R1 ja saatu yhdiste saatetaan reagoimaan kaavan (VIII) mukaisen yhdisteen kanssa, jossa X2 tarkoittaa hydrok-30 syyliä tai siitä johdettu suola, vettä poistavan aineen läsnäollessa (Kaavio 4). Vettä poistavia aineita ovat esimerkiksi 2,4,6-trimetyyli- tai tri-isopropyylibentseenisulfonyyliklori-di, -imidatsoli, -tetratsoli tai -1,2,4-triatsoli, mahdollisesti substituoituna nitrolla. Edullinen vettä poistava aine 35 on l-(2,4,6-trimetyylibentseenisulfonyyli)-3-nitro-l,2,4-tri-atsoli (XII).

90787 19

Mieluimmin käytetään nukleosideja, joiden emäsosan vapaa aminoryhmä on suojattu. Edullisia suojaryhmiä ovat bentsoyyli adeniinille, bentsoyyli tai 4-metoksibentsoyyli sytosiinille, isobutyryyli tai difenyyliasetyyli guaniinille. Tymiiniä käy-5 tetään mieluimmin ilman suojaryhmää.

Oligonukleotidien valmistuksessa kohdan c) mukaisesti käytetään sinänsä tunnettua laitetta, jossa on puoliautomaattinen tai täysin automaattinen, mikroprosessoriohjattu liuottimien 10 ja reagenssien syöttösysteemi. Kohdan a) mukaisesti valmistetusta, kaavan (VI) mukaisesta yhdisteestä lohkaistaan pois suojaryhmä R1, kuten edellä esitettiin, jonka jälkeen se saatetaan reagoimaan joko kaavan (VIII) tai kaavan (VIHA) mukaisen yhdisteen kanssa tai kaavan (X) tai (XI) mukaisen yhdisteen 15 kanssa, joista sitä ennen on lohkaistu suojaryhmä R3 pois emäksillä (2-syanoetyyli-ryhmä, esimerkiksi trialkyyliamiinilla, esim. trietyyliamiinilla jossain edellä mainitussa, inertissä liuottimessa tai liuotinseoksessa 10°C - 40°C:ssä erityisesti huoneen lämpötilassa), mahdollisesti vettä poistavan aineen 20 läsnäollessa tai emäksen läsnäollessa. Reaktiossa voidaan kaavan (X) mukaisen dinukleotidin tai kaavan (XI ) mukaisen tri-nukleotidin sijasta käyttää kohdan b) mukaisesti valmistettua tetranukleotidia. Käytettäessä kaavan (VIIIA) mukaista fos-fiittia, suoritetaan lopuksi käsittely hapetusaineella, esi-25 merkiksi jodilla emäksen läsnäollessa. Tällä tavalla valmistettu, kaavan (XIII) mukainen yhdiste, jossa R1, R2 ja B tarkoittavat samaa kuin edellä ja n on kokonaisluku 1-4, saatetaan niin monta kertaa reasoimaan kaavan (VI) mukaiselle yhdisteelle esitettyjen reaktiovaiheiden mukaisesti (R*:n pois-30 lohkaisu, reaktio kaavojen (VIII), (VIHA), (X), (XI) mukaisten yhdisteiden tai vastaavan tetranukleotidin kanssa, mahdollisesti jälkikäsittely hapetusaineella), kunnes muodostuu kaavan (XIII) mukainen yhdiste, jossa n on mieluimmin kokonaisluku välillä noin 19- noin 69.

35 20

B

r1 o -0-P -0CCH2CH2CNHCH2—y V-polystyreeni X , RJi\ Ö fl 5 \ x \

Jn

XIII

Eräässä edullisessa suoritusmuodossa käytetään suojaryhmänä R1 4-metoksitrityyliä, ja poislohkaisu suoritetaan sinkkibromi-10 dilla CH- tai NH-happamen yhdisteen, erityisesti 1,2,4-triat-solin tai tetratsolin läsnäollessa.

Esimerkiksi 1,2,4-triatsolin käyttö 4-metoksitrityyli-suoja-ryhmän poislohkaisussa on uutta ja johtaa yllättäen siihen, 15 että poislohkaisu tapahtuu nopeasti suurilla saannoilla ilman sivureaktioita. Erityisen edullista on käyttää sinkkibromidia ja 1,2,4-triatsolia molaarisen suhteen ollessa 20:1 - 100:1 liuotinseoksessa, joka muodostuu aproottisesta liuottimesta ja alkoholista, esimerkiksi metyleenikloridista ja 2-propanolis-20 ta.

Eräässä edullisessa suoritusmuodossa kaavan (VI) tai kaavan (XIII) mukainen yhdiste, jossa suojaryhmä R1 on lohkaistu pois, saatetaan reagoimaan kaavan (XI) mukaisen trinukleotidin kans-25 sa, jossa suojaryhmä R3 on lohkaistu pois vettä poistavan aineen, kuten esimerkiksi 2,4,6-trimetyyli- tai tri-isopropyy-libentseenisulfonyylikloridin, -imidatsolin, -tetratsolin tai -1,2,4-triatsolin läsnäollessa, joka mahdollisesti on substi-tuoitu nitrolla. Erityisen edullinen on 1-(2,4,6-trimetyyli-30 bentseenisulfonyyli)-3-nitro-l,2,4-triatsoli (XII).

Erityisen edullinen yhdistelmä, jossa suojaryhmänä R1 käytetään 4-metoksitrityyliryhmää, ja R*:n poislohkaisuun käytetään sinkkibromidia 1,2,4-triatsolin läsnäollessa ja vettä poistavana 35 aineena kaavan (XIII) mukaisen suojauksesta vapautetun oligo-nukleotidipolystyreeni-hartsin reaktiossa suojauksesta vapautetun kaavan (XI) mukaisen trinukleotidin kanssa käytetään

II

90787 21 kaavan (XII) mukaista triatsolia, mahdollistaa sen, että yllättäen voidaan valmistaa myös pitkiä nukleotidiketjuja, joissa on noin 40 - noin 70 emästä, lyhyessä ajassa suurilla saannoilla ja hyvin puhtaassa muodossa.

5

Oligodeoksinukleotidien poislohkaisuun kantoaineesta ja suoja-ryhmien poistamiseen kohdan c) mukaisesti käytetään sinänsä tunnettuja menetelmiä. Erityisen edullinen reagenssi kanto-aineen poislohkaisemiseksi ja edullisen 2-kloorifenyyli-suoja-10 ryhmän poistamiseksi on aryylialdoksimaatti, esimerkiksi 1,1,3,3-tetrametyyliguanidinium-2-nitrobentsaldoksimaatti. Reaktio tapahtuu jossain edellä mainituista, inerteistä liuottimista, johon lisätään vähän vettä, esim. 95-%:isessa pyri-diinissä, huoneen lämpötilassa. Lopuksi saatetaan reagoimaan 15 vesipitoisen ammoniakin kanssa huoneen lämpötilassa tai korotetussa lämpötilassa, esim. 20eC - 70°C:ssa, erityisesti 50°C:ssa.

Oligodeoksinukleotidien yhteenliittämistä varten tuodaan 5*-20 päässä olevaan hydroksiryhmään fosfaattitähde. Fosfaattitäh-teen liittäminen (fosforylointi) tapahtuu sinänsä tunnetulla tavalla T4-polynukleotidi-kinaasin avulla ATP:n läsnäollessa.

Valmistetut koodittavan ja komplementaarisen DNA-säikeen oli-25 godeoksinukleotidit sisältävät päällekkäin ulottuvia sekvenssejä, joissa on ainakin 3, mieluimmin 8-15 päällekkäin ulottuvaa emäsparia. Sekoituksen tuloksena tällaiset oligodeoksi-nukleotidi-parit pysyvät yhdessä vetysiltasidoksilla.

30 Ulkopuolelle jäävät yksisäikeiset päät toimivat kohdan el) ja e2) mukaisesti matriisina (templaattina) toisen (komplementaarisen) säikeen rakentamisessa DNA-polymeraasilla, esim. DNA-polymeraasi I:llä, DNA-polymeraasi I:n Klenow-fragmentilla tai T4-DNA-polymeraasilla tai AMV käänteistranskriptaasilla neljän 35 deoksinukleosiditrifosfaatin (dATP, dCTP, dGTP ja TTP) läsnäollessa. Täydentämisessä muodostuvilla kaksisäikeisillä DNA-ketjuilla, jotka ovat erityisesti desulfatohirudiini-geenin 22 fragmentteja (menetelmä el) tai täydellisiä desulfatohirudii-ni-geenejä (menetelmä e2), on tylpät päät.

Menetemävaiheen el) mukaisesti saatavat desulfatohirudiinigee-5 nin fragmentit sisältävät päissä nukleotidisekvenssejä, jotka restriktioendonukleaasit kykenevät tunnistamaan ja katkaisemaan.

Riippuen aina nukleotidisekvenssien ja vastaavasti restriktio-10 endonukleaasien valinnasta, muodostuu lohkaistaessa täydellisiä emäsparillisia (tylppiä) päitä ("blunt ends") tai päitä, joissa on ulkoneva DNA-säie ("staggered ends"). Restriktiotun-nistussekvenssit valitaan siten, että liitettäessä DNA-frag-mentteja, jotka on käsitelty tylppiä päitä muodostavilla rest-15 riktioendonukleaaseilla, DNA-fragmenttien koheesiivisten päiden emäspariutuessa ja liitettäessä sitten yhteen niiden ulkonevia päitä sisältäviä DNA-säikeitä, saadaan täydellinen de-sulfatohirudiini-rakennegeeni. Kahden kaksisäikeisen DNA-frag-mentin yhteenliittäminen vaatii yhden 5’-päässä olevan fos-20 faattiryhmän donori-fragmentissa ja vapaan 3'-päässä olevan hydroksiryhmän akseptori-fragmentissa. Kohdassa el) saadut DNA-fragmentit ovat jo valmiiksi 5'-päistään fosforyloituja ja liitetään yhteen sinänsä tunnetulla tavalla ligaasin, erityisesti T4-DNA-ligaasin avulla.

25

Eräässä suoritusmuodossa valmistetaan kuvatulla tavalla desul-fatohirudiini-geenin kaksi fragmenttia, erityisesti kaavan (III) tai (IV) mukaiset fragmentit Fi ja F2. Fragmentit, jotka voidaan tarvittaessa subkloonata sopivaan vektoriin, sisältä-30 vät kukin mieluimmin liittymispäissä yhden restriktioendonuk-leaasin, erityisesti EcoRII:n tunnistussekvenssin, minkä vuoksi mainitulla restriktioentsyymillä suoritetun lohkaisun ja molempien fragmenttien yhteenliittämisen jälkeen muodostuu oikealla tavalla koodittava desulfatohirudiini-DNA-sekvenssi. 35 Lisäksi osa l sisältää ennen luennanaloitussignaalia (ATG) ja osa 2 luennanlopetussignaalin (esim. ATG) jälkeen muita "terminaalisia" restriktiokohtia, jotka tekevät mahdolliseksi de-

II

90787 23 sulfatohirudiini-geenin tai desulfatohirudiini-geenifragmentin liittämisen sopivaan vektoriin.

Esimerkiksi desulfatohirudiini-geeni valmistetaan kahdessa, 5 kaavan (lii) ja (IV) mukaisessa osassa F, ja F2, jotka mahdollisesti subkloonataan ja restriktioentsyymillä EcoRII suoritetun lohkaisun ja yhteenliittämisen jälkeen muodostavat oikean desulfatohirudiini-DNA-sekvenssin, ja joissa F, sisältää ennen luennanaloitussignaalia EcoRI-restriktiokohdan.

10

Eräässä edullisessa suoritusmuodossa (menetelmä e2) liitetään kulloinkin kaksi oligodeoksinukleotidia, jotka ovat peräisin koodittavasta tai komplementaarisesta säikeestä, ainakin kolmen, mieluimmin 8-15:n komplementaarisen emäksen avulla, täy-15 dennetään DNA-polymeraasilla, esim. jollain edellä mainitulla ja liitetään yhteen T4 DNA-ligaasilla desulfatohirudiini-raken-negeeniksi.

Hirudiinin aminohapposekvenssiä koodittavan geenin sisältävien 20 ilmentvmisvektoreiden valmistus

Keksintö koskee erityisesti ilmentymisvektoreita, jotka sisältävät desulfatohirudiinia koodittavan DNA-sekvenssin, jota ilmentymisenohjaussekvenssi säätelee siten, että näillä ilmen-25 tymisvektoreilla transformoitunut isäntäsolu tuottaa desulfa-tohirudiina.

Tämän keksinnön mukaiset ilmentymisvektorit valmistetaan esim. siten, että vektori-DNA:han, joka sisältää ilmentymisenohjaus-30 sekvenssin, liitetään desulfatohirudiinia koodittava DNA-sek-venssi siten, että ilmentymisenohjaussekvenssi säätelee mainittua DNA-sekvenssiä.

Sopivan vektorin valinta riippuu transformointiin käytettäväs-35 tä isäntäsolusta. Sopivia isäntiä ovat esimerkiksi mikro-organismit, kuten hiivat, esim. Saccharomvces cerevisiae ja erityisesti bakteerikannat, joihin restriktio- tai muuntoentsyy- mit eivät vaikuta, ennen muuta kannat Escherichia coli, esim.

E. coli X1776, E. coli HB101, E. coli W3110 Δ102, E. coli HB101/LM1035, E. coli JA221 (30) tai E. coli K12 kanta 294.

24 5 Edullisia isäntäsoluja ovat mainitut E. coli-kannat. erityisesti E. coli HB101, £. coli JA221 ja JS. coli W3110A102.

Periaatteessa sopivia ovat kaikki vektorit, jotka replikoivat ja ilmentävät keksinnön mukaisia, heterologisia desulfatohiru-10 diinin aminohapposekvenssiä koodittavia DNA-sekvenssejä valitussa isännässä.

Esimerkkejä vektoreista, jotka ovat sopivia desulfatohirudii-ni-geenin ilmentämiseen E. coli-kannassa, ovat bakteriofaagit, 15 esim. bakteriofaagi X:n johdannaiset tai plasmidit, kuten erityisesti plasmidi colEl ja sen johdannaiset, esim. pMB9, PSF2124, pBR317 tai pBR322. Tämän keksinnön mukaiset edulliset vektorit ovat plasimidin pBR322 johdannaisia. Sopivat vektorit sisältävät täydellisen replikonin ja merkkigeenin, mikä tekee 20 mahdolliseksi ilmentymisplasmideilla transformoituneiden mikro-organismien valinnan ja identifioimisen fenotyyppisen tunnusmerkin perusteella. Sopivat markkerigeenit antavat mikro-organismille esim. vastustuskyvyn raskasmetallien, antibioottien ja vastaavien suhteen. Edelleen sisältävät tämän keksin-25 nön kannalta edulliset vektorit replikoni- ja merkkigeeni- alueiden lisäksi restriktioendonukleaasien tunnistussekvens-sejä niin että näihin kohtiin voidaan liittää hirudiinin aminohapposekvenssiä koodittava DNA-sekvenssi ja mahdollisesti ilmentymisenohjaussekvenssi. Edullinen vektori, plasmidi 30 pBR322, sisältää ehjän replikonin, tetrasykliinille ja ampi- silliinille resistenssin antavat merkkigeenit (tetR ja ampR) ja joukon ainoastaan kerran esiintyviä restriktioendonukleaasien, esim. PstI (pilkkoo ampR-geenin kohdalta, tetR-geeni jää ehyeksi) , BamHI, Hindlll, Sali (pilkkovat kaikki tetR-geenin kohdal-35 ta, ampR-geeni jää ehyeksi), NruI ja EcoRI.

Desulfatohirudiinin ilmentymisen säätelemiseksi voidaan käyt- 90787 25 tää useampia ilmentymisenohjaussekvenssejä. Erityisesti käytetään transformoitavien isäntäsolujen voimakkaasti ilmentyvien geenien ilmentymisenohjaussekvenssejä. Kun yhdistelmävektorina on pBR322, ja isäntämikro-organismina E. coli, ovat sopivia 5 esimerkiksi laktoosioperonin, tryptofaanioperonin, arabinoosi-operonin ja vastaavien ilmentymisenohjaussekvenssit (jotka sisältävät mm. promoottorin ja ribosomaalisen sidoskohdan), /3-laktamaasigeenin ilmentymisenohjaussekvenssi, λΝ-faagigeenin tai fd-faagin kerrosproteiinigeenin ja muiden vastaavat sek-10 venssit. /3-laktamaasigeenin (/3-lac-geeni) promoottori sisältyy jo plasmidiin pBR322, kun taas muut ilmentymiskontrollisek-venssit täytyy liittää plasmidiin. Tämän keksinnön kannalta edullinen ilmentymisenohjaussekvenssi on tryptofaanioperonin (trp po) ilmentymisenohjaussekvenssi. Hiivoissa tapahtuvaan 15 replikaatioon ja ilmentymiseen sopivat vektorit sisältävät hiivaan soveltuvan replikoitumisen aloituskohdan ja selektiivisen geneettisen markkerin hiivoille. Yhdistelmävektorit, jotka sisältävät hiivaan soveltuvan replikoitumisen alkukohdan, esim. kromosomaalisen autonomisesti replikoituvan segmen-20 tin (ars), säilyvät transformoitumisen jälkeen hiivasolussa ekstrakromosomaalisesti ja ne replikoituvat mitoosissa autonomisesti. Edelleen voidaan käyttää yhdistelmävektoreita, jotka sisältävät hiivan homologisia 2M-plasmidi-DNA-sekvenssejä. Tällaiset yhdistelmävektorit yhtyvät rekombinoitumalla solun 25 sisällä jo esiintyviin 2M-plasmideihin tai ne replikoituvat autonomisesti. 2M-sekvenssit ovat erityisen sopivia plasmi-deille, joilla on suurempi transformointitaajuus ja antavat suuren kopiomäärän. Sopivia merkkigeenejä hiivoille ovat ennen muuta sellaiset, jotka tekevät isännän antibioottien suhteen 30 resistentiksi, tai auksotrofisten hiivamutanttien ollessa kyseessä, geenit, jotka täydentävät isännän vajavuuksia. Vastaavat geenit antavat vastustuskyvyn, esim. sykloheksimidian-tibiootin suhteen tai ne huolehtivat prototrofiästä auksotro-fisessa hiivamutantissa, esim. URA3, Leu2-. HIS3- tai ennen 35 muuta TRP-oeeni. Mieluimmin hiiva-yhdistelmävektorit sisältävät edelleen replikoitumisen aloituskohdan ja merkkigeenin bakteeri-isännälle, erityisesti E. colille. jolloin yhdistel- 26 mävektoreiden ja niiden esiasteiden rakentaminen ja kloonaus voi tapahtua bakteeri-isännässä. Hiivassa tapahtuvaan ilmentymiseen sopivia ilmentymisenohjaussekvenssejä ovat esimerkiksi TRP1-. ADHI-. ADHII-. PH03- tai PH05-geenin ilmentymisenoh-5 jaussekvenssit ja lisäksi glykolyyttiseen hajoamiseen liittyvät promoottorit, esim. PGK- ja GAPDH-promoottori.

Erityisesti keksintö koskee replikaatioon ja fenotyyppiseen selektioon pystyviä ilmentymisvektoreita, jotka sisältävät 10 ilmentymisenohjaussekvenssin ja hirudiinin aminohapposekvenssiä koodattavan DNA-sekvenssin, jolloin mainittu DNA-sekvenssi yhdessä transkription aloitussignaalin ja -lopetussignaalin sekä luennanaloitussignaalin ja -lopetussignaalin kanssa on sijoitettu mainittuun ilmentymisplasmidiin mainitun ilmentymi-15 senohjaussekvenssin säätelyn alaisuuteen siten, että mainitulla ilmentymisplasmidilla transformoituneet isäntäsolut tuottavat desulfatohirudiinia.

Jotta saavutettaisiin tehokas ilmentyminen, pitää desulfatohi-20 rudiinigeenin sijaita oikealla tavalla ("faasissa") ilmentymisenohjaussekvenssin suhteen. On edullista liittää ilroentymi-senohjaussekvenssi pää-mRNA-alun ja geeniä koodittavan sekvenssin ATG:n välisellä alueella, joka luonnostaan kytkeytyy ilmentymisenohjaussekvenssiin (esim. /3-lac-koodisekvenssi käy-25 tettäessä 0-lac-promoottoria), desulfatohirudiinigeeniin, joka mielellään tuo mukanaan oman luennanaloitussignaalinsa (ATG) ja luennanlopetussignaalinsa (esim. TAG). Näin taataan tehokas transkriptio ja luenta.

30 Esimerkiksi vektori, erityisesti pBR322, leikataan restriktio-endonukleaasilla ja näin saatuun, mahdollisesti vielä modifioituun lineaariseen vektoriin liitetään vastaavilla tunnis-tuspäillä varustettu ilmentymisenohjaussekvenssi. Ilmentymi-senohjaussekvenssi sisältää 3'-päässä (luennan suunnassa) res-35 triktioendonukleaasin tunnistussekvenssin, niin että ilmentymisenohjaussekvenssin jo sisältävä vektori voidaan leikata mainitulla restriktioentsyymillä ja sen jälkeen liittää vek- n 90787 27 toriin sopivilla pälliä varustettu desulfatohirudiini-geeni. Tällöin muodostuu kahden yhdistelmäplasmidin seos, joista toinen sisältää geenin oikeassa ja toinen väärässä suunnassa. On edullista pilkkoa ilmentymisenohjaussekvenssin jo sisältävä 5 vektori vielä jollain toisella restriktioendonukleaasilla vek-tori-DNA:n sisällä ja liittää muodostuvaan vektori-fragmenttiin oikeilla päillä varustettu desulfatohirudiini-geeni.

Kaikki vektoriin kohdistuvat toimenpiteet tapahtuvat mieluimmin siten, että replikonin ja ainakin yhden merkkigeenin toi-10 minta pysyy koskemattomana.

Eräässä tämän keksinnön mukaisessa edullisessa suoritusmuodossa leikataan pBR322:sta johdettu vektori, joka sisältää ilmentymisenohjaussekvenssin, erityisesti tryptofaani-operonin (trp 15 po) ilmentymisenohjaussekvenssin, joka 3'-päässä (pää-mRNA-aloituskohdan ja ensimmäisen ATG:n välissä) sisältää tunnis-tuskohdan yhdelle, mielellään kohesiivisia päitä muodostavalle restriktioendonukleaasille, esim. EcoRI:lle, tästä kohdasta mainitulla restriktioendonukleaasilla ja vektori-DNA-osasta 20 toisella restriktioendonukleaasilla, joka muodostaa tylppiä tai mieluimmin kohesiivisia päitä, esim. BamHI, jonka jälkeen näin linearisoitu vektori kytketään vastaavia päitä sisältävään desulfatohirudiinigeeniin (esim. sellaiseen, joka sisältää EcoRI-pään ennen ATG-aloituskohtaa ja BamHI-pään luen-25 nanlopetuskodonin jälkeen). Kytkentä tapahtuu tunnetulla tavalla pariuttamalla komplementaariset (kohesiiviset) päät ja liittämällä esim. T4-DNA-ligaasilla.

mRNA:n kautta genomisesta DNA:sta saatu tai synteettisesti 30 valmistettu, vastaavat kohesiiviset (erityisesti EcoRI- ja

BamHI-) päät omaava desulfatohirudiinigeeni voidaan ennen il-mentymisplasmidiin liittämistä myös kloonata vektoriin, esim. pBR322:een, suuremman desulfatohirudiini-geenimäärän valmistamiseksi, esimerkiksi sekvenssianalyysiä varten. Yhdistel-35 mäplasmidin sisältämän kloonin eristäminen suoritetaan esimerkiksi desulfatohirudiini-geenin suhteen spesifisellä, radioak-tiivisesti leimatulla oligodeoksinukleotidikoettimella (katso 28 edellä). Desulfatohirudiini-geenin karakterisointi tapahtuu esimerkiksi menetelmällä, jonka ovat esittäneet Maxam ja Gilbert (11) .

5 Eräässä toisessa keksinnön mukaisessa suoritusmuodossa syntetisoidaan desulfatohirudiini-geenin kaksi osaa. Osa 1, joka käsittää geenin 1. osan, sisältää ennen ATG:tä ja lopussa kulloinkin tunnistussekvenssin kohesiivisia päitä muodostaville restriktioendonukleaaseille, esim. ennen ATG:tä, EcoRI:lle ja 10 lopussa EcoRII:lle. Osa 2, joka käsittää geenin jälkimmäisen osan, sisältää vastaavat tunnistussekvenssit, alussa esim. EcoRIItlle ja luennanlopetussignaalin (esim. TAG:n) jälkeen BamHI:lle. Osat pilkotaan ulompien tunnistussekvenssiensä kohdista (osa 1 esim. EcoRI:llä ja osa 2 vastaavasti BamHIzllä) 15 ja alakloonataan vastaavasti leikattuun vektoriin (esim. pBR3-22). Osat sisältävien kloorien identifioiminen ja osien karakterisoiminen tapahtuu edellä esitetyllä tavalla. Osat leikataan sen jälkeen vastaavilla restriktioendonukleaaseilla yh-distelmävektorista (osa 1 esim. EcoRI:llä ja EcoRII:lla ja osa 20 2 esim. EcoRII:lla ja BamHI:llä ja liitetään yhteen kohesii- visten päidensä, erityisesti EcoRII-päiden kautta, jolloin muodostuu täydellinen desulfatohirudiini-geeni, joka sijoitetaan esitetyllä tavalla vektori-DNA:han.

25 Mikro-organismien transformaatio

Menetelmässä transformoitujen isäntäsolujen valmistamiseksi isäntäsolu transformoidaan ilmentämisvektorilla, joka sisältää hirudiinin aminohapposekvenssiä koodittavan, ilmentymisenoh-30 jaussekvenssin säätelemän DNA-sekvenssin.

Sopivia isäntäsoluja ovat esimerkiksi edellä mainitut mikro-organismit, kuten kannat Saccharomvces cerevisiae ja erityisesti Escherichia coli. Transformaatio keksinnön mukaisella 35 ilmentämisplasmidilla tapahtuu esimerkiksi kirjallisuudessa kuvatulla tavalla, kuten esitetään kannoille S. cerevisiae (12) ja E. coli (14). Transformoitujen isäntäsolujen eristämi-

II

90787 29 nen tapahtuu edullisesti selektiivisestä elatusaineesta, johon on lisätty biosidi, jota vastaan ilmentymisplasmidin sisältävä merkkigeeni antaa vastustuskyvyn. Kun, kuten on edullista, ilmentymisplasmidit sisältävät ampR-geenin, lisätään elatus-5 aineeseen ampisilliinia. Solut, jotka eivät sisällä ilmenty-misplasmidia, kuolevat tällaisessa elatusaineessa.

Transformoituneiden isäntäsoluien viljely ia desulfatohiru-diinin talteenotto 10

Transformoituneita isäntäsoluja voidaan käyttää desulfatohiru-diinin valmistamiseksi. Desulfatohirudiinin valmistusmenetelmälle on tunnusomaista, että transformoituja isäntäsoluja viljellään ja tuote vapautetaan isäntäsoluista ja eristetään.

15

Desulfatohirudiini-yhdisteillä, joilla on desulfatohirudiinin primäärirakenteesta johdettu rakenne, on ymmärrettävä tarkoitettavan modifioituja desulfatohirudiini-yhdisteitä, jolloin modifiointi muodostuu mieluimmin desulfatohirudiinin primääri-20 rakenteen lyhentyessä esim. 1-10, erityisesti 1-6 aminohappo-osalla N-päässä ja/tai 1-6, erityisesti 2 aminohappo-osalla C-päässä tai desulfatohirudiini-molekyylin modifiointi tapahtuu N-päässä, esim. N-terminaalinen asetylointi tai roetiony-lointi.

25 Näin ollen keksintö koskee ennen muuta desulfatohirudiinin ja sen suolojen valmistusmenetelmää, jolle on tunnusomaista, että ilmentymisplasmidilla, joka sisältää desulfatohirudiinin aminohapposekvenssiä koodittavan, ilmentymisenohjaussekvenssin 30 säätelemän DNA sekvenssin, transformoituneita isäntäsoluja viljellään nestemäisessä elatusaineessa, joka sisältää assimiloituvia hiili- ja typpilähteitä, ja tuote vapautetaan isäntäsoluista ja eristetään.

35 Keksintö koskee erityisesti menetelmää seuraavan kaavan mukaisten hirudiiniyhdisteiden valmistamiseksi 5 30

ValValTyrThrAspCysThrGluSerGlyGlnAsnLeuCysLeuCysGluGlySerAsnValCys

GlyGlnGlyAsnLysCysIleLeuGlySerAspGlyGluLysAsnGlnCysValThrGlyGluGly

ThrProLysProGlnSerHisAsnAspGlyAspPheGluGluIleProGluGluTyrLeuGln ja sen suolojen valmistamiseksi.

Menetelmän mukaisesti saatavassa, desulfatohirudiinissa ovat 10 kysteiini-tähteet Cys mieluimmin samassa järjestyksessä kuin luonnollisessa hirudiinissa parittain disulfidi-siltojen kyt-kemänä.

Transformoituneiden isäntäsolujen viljely tapahtuu sinänsä 15 tunnetulla tavalla. Niinpä voidaan transformoituneiden isän- tämikro-organismien viljelemiseksi käyttää erilaisia hiililäh-teitä. Esimerkiksi edullisia hiililähteitä ovat assimiloituvat hiilihydraatit, kuten glukoosi, maltoosi, mannitoli tai laktoosi tai asetaatti, jota voidaan käyttää joko pelkästään tai 20 sopivina seoksina. Sopivia typpilähteitä ovat esimerkiksi aminohapot, kuten kasaminohapot, peptidit ja proteiinit ja näiden hajoamistuotteet, kuten tryptoni, peptoni tai lihauutteet; edelleen hiivauutteet, mallasuute, kuten myös ammoniumsuolat, esim. ammoniumkloridi, -sulfaatti tai -nitraatti, joita voi-25 daan käyttää pelkästään tai sopivina seoksina. Epäorgaanisia suoloja joita myös voidaan käyttää, ovat esim. natriumin, kaliumin, magnesiumin ja kalsiumin sulfaatit, kloridit, fosfaatit ja karbonaatit.

30 Edelleen ravintoalusta sisältää esim. kasvua edistäviä aineita, kuten hivenaineita, esim. rautaa, sinkkiä, mangaania ja vastaavia ja mieluimmin aineita, jotka saavat aikaan valintapaineen ja estävät sellaisten solujen kasvun, jotka ovat menettäneet ilmentämisplasmidin. Niinpä ravintoalustaan lisätään 35 esimerkiksi ampisilliinia, kun ilmentymisplasmidi sisältää ampR-geenin. Antibioottisesti tehokkaan aineen tällainen lisäys vaikuttaa myös niin, että kontaminoivat, antibiooteille herkät 90787 31 mikro-organismit kuolevat.

Viljely tapahtuu sinänsä tunnetun menetelmän mukaisesti. Viljelyolosuhteet, kuten lämpötila, ravintoalustan pH-arvo ja 5 käymisaika, valitaan niin, että saadaan maksimaalinen hirudii-nitiitteri. Niinpä E. coli- tai hiivakantaa viljellään mieluimmin aerobisissa oloissa pinnanalaisviljelmänä ravistellen tai sekoittaen noin 20 - 40°C:n lämpötilassa, mieluimmin noin 30° C:ssa ja pH-arvossa 4-9, mieluimmin pH:ssa 7, noin 4-20 10 tuntia, mieluimmin 8-12 tuntia. Tällöin ilmentymistuote kerääntyy solun sisään.

Kun solutiheys on saavuttanut riittävän arvon, viljely lopetetaan ja tuote vapautetaan mikro-organismien soluista. Tätä 15 varten solut rikotaan, esim. käsittelemällä detergentillä, kuten SDS tai Triton, tai lyysoidaan lysotsyymillä tai samalla tavalla vaikuttavalla entsyymillä. Vaihtoehtoisesti tai lisäksi voidaan käyttää solujen rikkomiseen mekaanisia voimia, kuten leikkausvoimia (esim. X-puristin, ranskalainen puristin, 20 Dyna-mylly) tai ravistelua lasihelmien tai aluminiumoksidin kanssa tai vuorotellen jäädyttämistä, esim. nestemäisessä ty-pessä, ja sulattamista esim. 30 - 40°C:seen sekä ultraääntä. Muodostunut seos, joka sisältää proteiinit, nukleiinihapot ja muut solun aineosat, rikastetaan sentrifugoinnin jälkeen pro-25 teiinin suhteen sinänsä tunnetulla tavalla. Niinpä esim. suurin osa ei-proteiiniaineosista erotetaan polyetyleeni-imiini-käsittelyllä ja proteiinit, mukaan luettuna hirudiini-yhdis-teet, saostetaan kyllästämällä liuos ammoniumsulfaatilla tai muilla suoloilla. Bakteerien proteiinit voidaan saostaa myös 30 hapottamalla etikkahapolla (esim. 0,1 %, pH 4-5). Hirudiini-yhdisteet voidaan rikastaa myös uuttamalla etikkahappoinen, sakan yläpuolella oleva liuos n-butanolilla. Muita puhdistus-vaiheita ovat esimerkiksi kromatografiset menetelmät, kuten ioninvaihtokromatografia, geelipermeaatiokromatografia, par-35 titiokromatografia, HPLC, käänteisfaasi-HPLC ja vastaavat.

Niinpä seosaineosien erottaminen tapahtuu dialyysillä, varauksesta riippuen geeli- tai kantoainevapaalla elektroforeesilla, 32 molekyylikoon mukaan sopivalla Sephadex-pylväällä, affiniteet-tikromatografisesti, käyttäen esim. vasta-aineilla, erityisesti monoklonaalisilla vasta-aineilla tai trombiinilla kytkettyä sopivaa kantoainetta affiniteettikromatografiässä, tai muilla, 5 erityisesti kirjallisuudesta tunnetuilla menetelmillä.

Ilmentyneiden hirudiiniyhdisteiden eristäminen käsittää esimerkiksi seuraavat vaiheet: 10 Solujen erottaminen viljelyliuoksesta sentrifugoimalla; raakauutteen valmistus rikkomalla solut, esim. käsittelemällä lyysoivalla entsyymillä ja/tai vuorotellen jäädyttämällä ja sulattamalla; liukenemattomien aineosien sentrifugoiminen pois; 15 DNA:n saostaminen lisäämällä polyetyleeni-imiiniä; proteiinien saostaminen ammoniumsulfaatilla; liuotetun sakan affiniteettikromatografia desulfatohirudiinin monoklonaalisia vasta-aineita sisältävässä pylväässä tai trom-biini-pylväässä; näin saadusta liuoksesta suolan poistaminen 20 dialyysillä tai kromatografisesti Sephadex G25:llä tai Sepha-dex G10:llä.

Vaihtoehtoisesti voidaan DNA:n erottamisen jälkeen bakteeri-proteiinit saostaa l-%:isella etikkahapolla, happamesta, sakan 25 yläpuolella olevasta liuoksesta uutetaan hirudiiniyhdiste n-butanolilla tai happamelle, sakan yläpuolella olevalle nesteelle suoritetaan suoraan ioninvaihtokromatografia (esim. dietyyliaminoetyyliselluloosalla DEAE 53). Muut puhdistusvai-heet käsittävät geelisuodatuksen Sephadex G50:llä (tai G75: 30 llä) ja käänteisfaasi-HPLC:n. Suolan poistaminen tapahtuu Sephadex G25:llä.

Hirudiini-aktiivisuuden toteamiseksi voidaan suorittaa testi hirudiinin tai desulfatohirudiinin vasta-aineilla (esim. ka-35 nista tai hybridomasoluista saatavilla monoklonaalisilla vasta-aineilla) , trombiini-testi (15) tai verenhyytyrnistesti (16).

Il 90787 33

Yhdiste A: RP-HPLC, retentioaika 16,83 min; FPLC; eluutio 390 mM:lla NaCl; UV (vesi): = 275 nm;

Yhdiste B: RP-HPLC: retentioaika 18,43 min; 5 Yhdiste C: RP-HPLC: retentioaika 19,6 min; FPLC; eluutio 420 mM:lla NaCl;

Yhdiste D: RP-HPLC: retentioaika 20,6 min; FPLC: eluutio 460 mM:lla NaCl;

Yhdiste E: RP-HPLC: retentioaika 21,53 min; FPLC: 10 Eluutio 500 mM:lla NaCl; UV (vesi) λ,,*, = 273 nm: ja menetelmää niiden valmistamiseksi transformoitujen aktiivi-kantojen avulla.

15 Keksinnön mukaisesti valmistettava desulfatohirudiini voi olla ei ainoastaan vapaassa muodossa vaan myös suolojensa muodossa, erityisesti farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojensa muodossa. Koska se sisältää useampia aminohappotähteitä, joissa on vapaat aminoryhmät, voi keksinnön mukainen yhdiste olla esim.

20 happoadditiosuolojen muodossa. Happoadditiosuoloina tulevat kysymykseen erityisesti fysiologisesti käyttökelpoiset suolat tavallisesti käytettyjen, terapeuttisesti hyväksyttävien happojen kanssa; epäorgaanisista hapoista voidaan mainita halo-geenivetyhapot, kuten kloorivetyhappo, mutta myös rikkihappo 25 tai fosfori- tai pyrofosforihappo; orgaanisista hapoista ovat sopivia ensi sijassa sulfonihapot, kuten bentseeni- tai p-to-lueenisulfonihappo tai alempialkaanisulfonihapot, kuten metaa-nisulfonihappo, sekä karboksyylihapot, kuten etikkahappo, maitohappo, palmitiinihappo ja steariinihappo, omenahappo, viini-30 happo, askorbiinihappo ja sitruunahappo. Koska desulfohirudii-ni sisältää myös aminohappotähteitä, joissa on vapaita karbok-syyliryhmiä, voi se olla myös metallisuolana, erityisesti al-kalimetalli- tai maa-alkalimetallisuolana, esim. natrium-, kalium-, kalsium, tai magnesiumsuolana tai myös amroonium-35 suolana, johdettuna ammoniakista tai fysiologisesti hyväksyttävästä, orgaanisesta, typpeä sisältävästä emäksestä. Koska yhdiste sisältää yhtä aikaa vapaita karboksyyliryhmiä ja va- 34 paita aminoryhmiä, voi se olla sisäisenä suolana.

Riippuen aina työskentelytavasta saadaan keksinnön mukaiset yhdisteet vapaassa muodossa, happoadditiosuolojen muodossa tai 5 suoloina emästen kanssa. Happoadditiosuoloista ja emästen kanssa saaduista suoloista voidaan vapaa yhdiste saada sinänsä tunnetulla tavalla, esimerkiksi säätämällä pH-arvo isoelektri-seen pisteeseen. Vapaasta yhdisteestä voidaan puolestaan saada reaktioilla happojen tai emästen kanssa, esim. sellaisten 10 kanssa, jotka muodostavat edellä mainittuja suoloja, ja haihduttamalla tai lyofilisoimalla terapeuttisesti hyväksyttäviä happoadditiosuoloja tai suoloja emästen kanssa.

Desulfatohirudiinin monoklonaaliset vasta-aineet ia tällaisia 15 vasta-aineita sisältävät testipakkaukset

Vasta-aineiden ominaisuudella, sitoutua spesifisiin antigee-neihin on kehon ulkopuolella käyttöä kvalitatiivisissa ja kvantitatiivisissa määrityksissä (immunomääritykset) ja anti-20 geenien puhdistamisessa (immunoaffiniteettikromatografia).

Immunisoitujen eläinten seerumi sisältää tavallisesti useita erilaisia vasta-aineita, jotka reagoivat saman antigeenin eri kiinnittymiskohtien kanssa erilaisella affiniteetilla, lisäksi kuitenkin myös vasta-aineita muille antigeeneille, jotka hei-25 jastavat yksilön aikaisempia kokemuksia. Vasta-aineiden menestyksellinen käyttö antigeenien määrityksessä ja puhdistuksessa vaatii kuitenkin korkeaa spesifisyyttä ja toistettavuutta.

Homogeenisia vasta-aineita, jotka täyttävät nämä vaatimukset, 30 on saatu Köhlerin ja Milsteinin (17) esittämällä hybridooma-tekniikalla. Periaatteessa tekniikka perustuu siihen, että immunisoitujen eläinten vasta-aineita erittävät B-lymfosyytit, esim. pernasta saadut, liitetään ("fuusioidaan”) tuumorisolui-hin. Muodostuneissa hybridooma-soluissa yhdistyy kyky lisään-35 tyä jakautumalla rajattomasti kykyyn tuottaa ja erittää vasta-ainetta samantyyppisenä. Viljelemällä selektiivisessä ela-tusaineessa, jossa fuusioitumattomat tuumorisolut kuolevat, 90787 35 mutta hybridooma-solut lisääntyvät ja sopivilla manipulaatioilla voidaan saada klooneja, t.s. solupopulaatioita, jotka polveutuvat yhdestä ainoasta hybridooma-solusta ja ovat geneettisesti identtisiä, näitä voidaan viljellä ja solujen 5 tuottamat monoklonaaliset vasta-aineet voidaan eristää.

Tässä kuvataan myös desulfatohirudiinin ja hirudiinin mono-klonaalisia vasta-aineita, hybridooma-soluja, jotka tuottavat tällaisia vasta-aineita, ja menetelmä niiden valmistamiseksi.

10 Edullisia ovat hybridooma-solulinjat ja näiden erittämät monoklonaaliset vasta-aineet, jotka reagoivat spesifisesti desulfatohirudiinin tai hirudiinin kanssa. Desulfatohirudiini ja hirudiinin monoklonaalisten vasta-aineiden valmistusmenetelmälle on tunnusomaista, että hiiret immunisoidaan desulfatohi-15 rudiinilla tai hirudiinilla, näin immunisoitujen eläinten /3-1-ymfosyytit fuusioidaan myeloomasoluihin, muodostuneet hybridooma-solut kloonataan, jonka jälkeen viljellään in vitro tai injektoimalla hiiriin ja viljelmästä eristetään vasta-aineet.

20 Tässä kuvataan myös näitä vasta-aineita sisältäviä immuno- affiniteettikromatografiapylväitä ja immunomäärityksiin tarkoitettuja testipakkauksia.

Tässä menetelmässä hiiret, esim. Balb/c-hiiret immunisoidaan 25 sinänsä tunnetulla tavalla. Yllättävällä tavalla immunisointi onnistuu, vaikka desulfatohirudiini ja hirudiini ovat suhteellisen pieniä proteiinimolekyylejä. Eräässä edullisessa suoritusmuodossa desulfatohirudiinia tai hirudiinia injektoidaan noin viikoittain tai myös pidemmin aikavälein useamman viikon 30 ajan, esimerkiksi 5-12 viikon ajan, kunnes on muodostunut riittävä määrä vasta-ainetta tuottavia /3-lymfosyyttejä.

Immunisoitujen hiirten /3-lymbosyyttejä sisältäviä elimiä, esim. pernasoluja, otetaan talteen ja fuusioidaan sellaisten 35 myeloomasolujen kanssa, jotka sisältämänsä mutaation vuoksi eivät kasva selektiivisellä elatusaineella. Tällaiset myeloo-masolut ovat tunnettuja ja niitä ovat esimerkiksi X63-Ag8, 36 X63-Ag8.5.3, MPC-11, NSl-Ag4/l, MOPC-21 NS/1 tai SP 2/0. Edullisessa suoritusmuodossa immunisoidun hiiren pernasolut fuusioidaan solulinjan X63-Ag8.6.5.3 myeloomasolujen kanssa.

5 Fuusio suoritetaan sinänsä tunnetulla menetelmällä sekoittamalla β-lymfosyytit ja myeloomasolut, samalla lisäten solufuu-sioainetta, kuten polyetyleeniglykolia, Sendai-virusta, kal-siumkloridia tai lysolesitiiniä. Mieluimmin fuusioidaan poly-etyleeniglykolin läsnäollessa, esimerkiksi sellaisen, jonka 10 molekyylipaino on 1000 - 4000. Fuusion jälkeen muodostunutta hybridiä viljellään sinänsä tunnetun menetelmän mukaisesti selektiivisessä elatusaineessa, jota on täydennetty hypoksan-tiinilla, aminopteriinillä ja tymidiinillä (HAT-elatusaine). Fuusioitumattomat myeloomasolut eivät kykene kasvamaan tässä 15 elatusaineessa ja kuolevat kuten myös normaalit lymfosyytit.

Hybridooma-viljelmien liuokset voidaan sinänsä tunnetulla menetelmällä testata spesifisten vasta-aineiden pitoisuuden suhteen, esimerkiksi radio-immunomäärityksellä tai agglutinoin-20 nilla. Tällöin todetaan yllättävällä tavalla, että kuvatulla menetelmällä voidaan saada hybridooma-soluja, jotka esittävät desulfatohirudiinin tai hirudiinin suhteen spesifisiä vasta-aineita.

25 Ne hybridooma-solut, jotka tuottavat halutun spesifisyyden omaavia vasta-aineita, valitaan fuusiolla tuotetun seoksen erilaisista hybridooma-soluista kloonaamalla. Tässä käytetään apuna sinänsä tunnettua menetelmää, jota nimitetään "rajoittavaksi laimentamiseksi" ("limiting dilution") ja jossa teh-30 dään viljelmät lähtien yhdestä ainoasta kasvavasta solusta.

Massatuotantoa varten ne hybridooma-solukloonit, jotka tuottavat halutun spesifisyyden omaavia vasta-aineita, viljellään joko sinänsä tunnetussa elatusaineessa in vitro tai injek-35 toidaan hiiriin solujen lisääntymiseksi. Edullisessa suoritusmuodossa hybridooma-solut injektoidaan Pristanilla etukäteen käsiteltyihin hiiriin, otetaan talteen askites-neste ja sii-

II

37 90787 tä seostamalla ammoniurasulfaattiliuoksella eristetään vasta-aine.

Näiden hybridooma-solujen avulla saatuja desulfatohirudiini-5 ja hirudiini-spesifisiä vasta-aineita voidaan käyttää sinänsä tunnetulla tavalla immuno-affiniteettikromatografiapylväiden valmistuksessa. Eräässä edullisessa suoritusmuodossa sopivaan kantoaineeseen (suspendoitu puskuriliuokseen) lisätään vasta-aine-liuos, sitoutumattomat osat pestään pois ja kantoaineen 10 vapaat kohdat tilkitään.

Hybridooma-solujen avulla valmistettuja desulfatohirudiini- ja hirudiini-spesifisiä vasta-aineita voidaan käyttää sinänsä tunnetulla tavalla testipakkauksien valmistamiseksi. Nämä tes-15 tipakkaukset voivat perustua erilaisiin menetelmiin, esimerkiksi radio-immunodiffuusioon, latex-agglutinointiin, täplä-testeihin, kompetitiiviseen tai "sandwiGh,,-radio-immunomääri-tykseen, entsyymi-immunomääritykseen, immunofluoresenssiin tai immunokemiallisiin entsyymitesteihin. Tällaiset pakkaukset 20 voivat tavallisten vasta-aineiden lisäksi sisältää erilaista alkuperää olevia vasta-ainekonjugaatteja entsyymien tai fluo-jresenssikantoaineiden kanssa, lisäksi radioaktiivisella isotoopilla kuten J12S leimattua desulfatohirudiinia tai hirudii-nia, tai konjugoituna entsyymien, esimerkiksi piparjuuriperok-25 sidaasin tai alkalisen fosfataasin kanssa, myös entsyymisubs-traatteja, sopivia puskureita, geelejä, lateksia, poly-styreeniä tai muita täyteaineita ja kantoaineita.

Farmaseuttiset valmisteet 30 Tämän keksinnön mukaisesti saatava desulfatohirudiini omaa arvokkaita farmakologisia ominaisuuksia ja sitä voidaan, kuten juotikkaista uutettua hirudiinia, käyttää ennaltaehkäisevästi tai erityisesti terapeuttisesti.

Keksinnön mukaisesti valmistettavat desulfatohirudiini-yhdis-teet osoittautuvat biologisen aktiivisuutensa suhteen olevan 35 38 ainakin ekvivalentteja luonnolliseen hirudiiniin verrattaessa. Niinpä esimerkiksi desulfatohirudiinin K^arvo on noin lO"11 M. Desulfatohirudiini on täysin spesifinen trombiinille eikä osoita minkäänlaista vuorovaikutusta veren hyytymissysteemin 5 muiden proteinaasien kanssa. Aktiivinen toksisuus on lisäksi erittäin vähäinen; niinpä rotalla annoksella esim. 1 g/kg ei todeta minkäänlaisia toksisia vaikutuksia. Sen lisäksi ei havaita minkäänlaisia hypersensitiivisiä tai allergisia reaktioita.

10

Keksinnön mukaista uutta desulfatohirudiini-yhdistettä voidaan siten käyttää samalla tavalla kuin luonnollista hirudiinia tromboosien ja tromboembolian hoidossa, mukaanluettuna leikkausten jälkeisten tromboosien ennaltaehkäisy, niitä voidaan 15 käyttää akuuttiin shokki-hoitoon (esim. septisessä tai polytraumaattisessa shokissa), hyytymisaktiivisten aineiden lisääntyneestä käytöstä johtuvien veren hyytymishäiröiden hoidossa, veridialyysissä, verierotuksessa ja "kehon ulkopuolisessa verenkierrossa" eli käytettäessä sydän-keuhkokonetta 20 sydänleikkausten yhteydessä.

Desulfatohirudiinista voidaan valmistaa farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisältävät desulfatohirudiinia tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävää suolaa, mahdollisesti yhdessä far-25 maseuttisesti hyväksyttävien kanto- ja/tai apuaineiden kanssa.

Näitä koostumuksia voidaan käyttää erityisesti edellä mainituissa indikaatioissa, kun ne annostetaan parenteraalisesti, kuten suonensisäisesti, ihonsisäisesti, ihonalaisesti tai 30 lihaksensisäisesti tai pinnallisesti.

Desulfatohirudiinia ja sitä sisältäviä farmaseuttisia koostumuksia voidaan käyttää ihmis- ja eläinkehojen ennaltaehkäisevässä ja terapeuttisessa hoidossa, erityisesti edellä maini-35 tuissa sairauksissa, ensi sijassa veren hyytymisen estämiseksi ihmis- ja eläinkehon sisällä ja ulkopuolella.

li 90787 39

Annostus riippuu ensi sijassa spesifisestä annostusmuodosta ja hoidon tai ennaltaehkäisyn tarkoituksesta. Yksittäisannosten suuruus sekä annostuskaavio voidaan parhaiten määrittää kulloisenkin sairaustapauksen yksilöllisten vaatimusten perus-5 teella; tähän tarvittavat menetelmät relevanttien veriarvojen määrittämiseksi ovat alan ammattimiehelle tunnettuja. Tavallisesti keksinnön mukaisten yhdisteiden injektio terapeuttisesti tehokkaana määränä on annosalueella noin 0,005 - noin 0,1 mg/kehon painokilo. Edullinen alue on noin 0,01 - noin 10 0,05 mg/kehon painokilo. Annostus tapahtuu suonensisäisesti, lihaksensisäisesti tai ihonalaisesti injektoimalla. Vastaavasti sisältävät parenteraaliseen annostukseen tarkoitetut farmaseuttiset valmisteet yksikköannosmuodossa, annostustavasta riippuen, annosta kohti noin 0,4 - noin 7,5 mg keksinnön mu-15 kaista yhdistettä. Aktiiviaineen lisäksi nämä farmaseuttiset koostumukset sisältävät tavallisesti vielä puskurin, esim. fosfaattipuskurin, jonka pH-arvon tulee olla noin 3,5-7, ja myös natriumkloridia, mannitolia tai sorbitolia isotonian säätämiseksi. Ne voivat olla pakastekuivatussa tai liuotetussa 20 muodossa, jolloin liuokset voivat sisältää edullisesti anti-bakteerisesti vaikuttavan säilöntäaineen, esim. 0,2 - 0,3 % 4-hydroksibentsoehappometyyliesteriä tai -etyyliesteriä.

Topikaaliseen käyttöön tarkoitettu valmiste voi olla vesipi-25 toisena liuoksena, lotionina tai geelinä, öljymäisenä liuoksena tai suspensiona tai rasvaa sisältävänä tai erityisesti emulsiosalvana. Vesipitoisen liuoksen muodossa oleva valmiste saadaan esimerkiksi siten, että keksinnön mukainen aktiiviaine tai sen terapeuttisesti hyväksyttävä suola liuotetaan vesipi-30 toiseen puskuriliuokseen, jonka pH on 4 - 6,5, ja haluttaessa lisätään jokin muu aktiiviaine, esim. anti-inflammatorinen aine ja/tai polymeerinen tartunta-aine, esim. polyvinyylipyr-rolidoni ja/tai säilöntäaine. Aktiiviaineen pitoisuus nousee noin 0,1 - noin 1,5 mg:aan, mieluimmin 0,25 - 1,0 mg:aan 10 35 ml:ssa liuosta tai 10 g:ssa geeliä.

Öljymäinen annostusmuoto topikaaliseen annostukseen sisältää 40 esimerkiksi keksinnön mukaisen aktiiviaineen tai sen terapeuttisesti hyväksyttävän suolan suspendoituna öljyyn, mahdollisesti samalla lisätään turvottavia aineita, kuten aluminium-stearaattia ja/tai pinta-aktiivisia aineita (tensidejä), joi-5 den HBL-arvo ("hydrophilic-lipophilic-balance") on alle 10, kuten useampiarvoisten alkoholien rasvahappomonoestereitä, esim. glyseriinimonostearaattia, sorbitaanimonolauraattia, sorbitaanimonostearaattia tai sorbitaanimono-oleaattia. Rasvapitoinen salva saadaan esim. suspendoimalla keksinnön mu-10 kainen aktiiviaine tai sen suola siveltävään rasvaperusainee-seen, mahdollisesti samalla lisätään tensidiä, jonka HLB-arvo on alle 10. Emulsiosalva saadaan hiertämällä keksinnön mukaisen aktiiviaineen tai sen suolan vesipitoista liuosta pehmeässä, siveltävässä rasvaperusaineessa, samalla lisätään tensi-15 diä, jonka HLB-arvo on alle 10. Kaikki nämä topIkaaliset an-nostusmuodot voivat sisältää myös säilöntäaineita. Aktiivi-aineen pitoisuus nousee noin 0,1 - noin 1,5 mg:aan, mieluimmin 0,25 - 1,0 mg:aan noin 10 g:ssa perusainetta.

20 Edellä kuvattujen ja niiden kanssa analogisten farmaseuttisten koostumusten, jotka on tarkoitettu ihmisen tai nisäkkään kehon suoraan lääkinnälliseen käyttöön, lisäksi esitetään farmaseuttisia koostumuksia ja valmisteita, joita käytetään elävän ihmisen tai nisäkkään kehon ulkopuolella lääkinnällisessä 25 käytössä. Tällaisia koostumuksia ja valmisteita käytetään ensi sijassa hyytymistä estävänä lisäaineena veressä, joka kiertää kehon ulkopuolella tai jota käsitellään kehon ulkopuolella (esim. kehon ulkopuolinen verenkierto tai dialyysi keinomunuaisessa) , säilytetään tai modifioidaan (esim. veren erot-30 taminen). Koostumukseltaan ovat tällaiset valmisteet, kuten varastointiliuokset tai myös yksikköannosmuodossa olevat valmisteet samankaltaisia kuin yllä kuvatut injektointivalmis-teet; tarkoituksenmukaisesti sovitetaan aktiiviainemäärä tai vastaavasti -pitoisuus käsiteltävän veren tilavuuden mukaan, 35 tai tarkemmin sanottuna, sen sisältämän trombiinimäärän mukaan. Tällöin on huomattava, että keksinnön mukaiset aktiivi-aineet (vapaassa muodossa) inaktivoivat täydellisesti noin 90787 41 5-kertaisen painomäärän trombiinia, ovat myös suurempina määrinä fysiologisesti harmittomia ja erittyvät kiertävästä verestä suurinakin pitoisuuksina hyvin nopeasti, eli ei ole mitään vaaraa yliannostuksesta, myöskään esim. verensiirroissa.

5 Kulloinkin tietyn tarkoituksen mukaan on sopiva annos noin 0,01 - noin 1,0 mg aktiiviainetta/litra verta, jolloin ylärajan saa vielä ylittää ilman vaaraa.

Erityisesti keksintö koskee esimerkeissä kuvattua menetel-10 mää desulfatohirudiinin valmistamiseksi transformoituneiden • mikro-organismien avulla.

42

Seuraavat esimerkit ja merkinnät kuvaavat keksintöä, ne eivät kuitenkaan rajoita keksinnön piiriä millään tapaa.

Kokeellinen osa 5

Esimerkeissä käytetyillä lyhenteillä on seuraavat merkitykset: TNE liuos, joka sisältää 100 mM NaCl, 50 mM Tris.HCl pH 7,5 ja 5 mM EDTA, 10 SDS natriumdodekyylisulfaatti EDTA ety1eenidiami initetraetikkahappo DTT 1,4-ditiotreitoli (l,4-dimerkapto-2,3-butaanidio- li) BSA naudan seerumialbumiini 15 EtBr etidiumbromidi

Tris tris-(hydroksimetyyli)-aminometaani

Tris.HCl tris'in monohydrokloridi 20 Esimerkki 1: Suojatun nukleosidi-polvstvreenihartsin valmistus mmt-o-t-o-coch2ch2co-nhch2-^ ^-(P)

Seokseen, jossa on 2,57 g (5 mmoolia) 5'-(4-metoksitrityyli-tymidiiniä (MMT-O-T-OH) 20 ml:ssa abs. pyridiiniä, lisätään 750 mg meripihkahappoanhydridiä ja 910 mg 4-dimetyyliaminopy-30 ridiiniä ja seoksen annetaan seistä huoneen lämpötilassa 16

II

90787 43 tuntia. Pyridiiniliuos haihdutetaan, jonka jälkeen jäännös liuotetaan 200 ml:aan etikkahappoetyyliesteriä, ravistellaan kaksi kertaa, kummallakin kertaa 200 ml:11a 0,1 M fosfaatti-puskuria, samalla lisätään 10 ml kyllästettyä keittosuolaliuos-5 ta, pestään vielä kerran kyllästetyllä keittosuolaliuoksella, kuivataan, haihdutetaan ja lisätään tipoittain heksaania. Saostunut tuote erotetaan ja hierretään kaksi kertaa eetterin kanssa, sen jälkeen liuotetaan 300 ml:aan etikkahappoetyyliesteriä ja ravistellaan 0°C:ssa 180 ml:11a 0,1 M kaliumvety-10 sulfaattia, jonka pH 2,5. Etikkaesteriliuos pestään kaksi kertaa vedellä, jonka jälkeen se kuivataan natriumsulfaatil-la, suodatetaan, lisätään 0,5 ml pyridiiniä, haihdutetaan ja laimennetaan tipoittain heksaanilla.

Saostunut meripihkahappojohdannainen suodatetaan.

15 1,0 g tätä yhdistettä yhdessä 190 mg:n kanssa N-hydroksi- sukkinimidiä liuotetaan 4 ml:aan etikkahappoetyyliesteriä ja 2 ml:aan dimetyyliformamidia ja 0°C:ssa lisätään 370 mg N,N'-disykloheksyylikarbodi-imidiä. Seosta seisotetaan yön yli jääkaapissa, jonka jälkeen saostunut N,N1-disykloheksyylikar-20 bamidi suodatetaan pois, suodos laimennetaan etikkahappoetyy-liesterillä, uutetaan kylmällä 0,1 M natriumvetykarbonaatil-la ja vedellä, kuivataan ja haihdutetaan kuiviin tyhjössä. Jäännös kromatografoidaan piihappogeelillä, eluointiaineena etikkahappoetyyliesteri. DC: R^ 0,45 dikloorimetaani-metano-25 Iissä (9:1) .

100 mg tätä N-sukkinimidoyyli-meripihkahappoesteriä hämmennetään 1 g:n kanssa aminometyyli-polystyreeniä (amiinipitoisuus 110 ymoolia/g) 2 ml:ssa dikloorimetaania ja 4 ml:ssa dimetyyliformamidia 20 tunnin ajan. Polymeerihartsi suodatetaan ja 30 pestään dimetyylformamidilla, metanolilla, dikloorimetaanil-la ja metanolilla. Kuivauksen jälkeen reagoimattomat amino-ryhmät asetyloidaan siten, että hartsia hämmennetään 6 ml:ssa pyridiiniä 1 ml:n kanssa etikkahappoanhydridiä ja 100 mg:n 44 kanssa 4-dimetyyliaminopyridiiniä 30 minuutin ajan. Polymee-rihartsi pestään dikloorimetaanilla, dimetyyliformamidilla, metanolilla ja dikloorimetaanilla ja kuivataan vakiopainoon. Spektroskooppinen metoksitrityyli (MMT)-määritys osoittaa 5 lisäyksen arvoksi 57 ymoolia/g.

Esimerkki 2;

Esimerkin 1 mukaisesti valmistetaan seuraava suojattu nukleo-sidi-polystyreeni-hartsi: MMT-0-Glb-0C0CH2CH2C0NHCH2—^ ^-(P) 10 5’-(4-metoksitrityyli)-N-isobutyryyli-deoksiguanosiinista, lisäyksen arvo 32 ymoolia/g.

Esimerkki 3; Trinukleotidin synteesi

MMT—0--T-0 P—0--CH2CHzCN

K > • Ma _._C* J»_ a) Dinukleotidin synteesi; 7,73 g (15 mmoolia) 5'-(4-metoksitrityyli)-tymidiiniä (MMT-15 O-T-OH) haihdutetaan kaksi kertaa abs. pyridiinin kanssa.

Jäännös liuotetaan 20 mlraan abs. tetrahydrofuraania ja lisätään tipoittain 80 mlraan 2-kloorifenyyli-di-(1-bentsotri-atsolyyli)-fosfaatin 0,2 M liuosta tetrahydrofuraanissa, samalla hämmentäen ja kosteudelta suojaten, ja reaktioseosta 20 hämmennetään 1 tunti huoneen lämpötilassa. 2-kloorifenyyli- 1-bentsotriatsolyyli-51-(4-metoksitrityyli)-tymidiini-S*-fosfaatin saatu liuos jaetaan kolmeen osaan.

11 90787 45 a) Hydrolyysi trietyyliammonium-2-kloorifenyyli-5'- (4-me-toksitrityyli)-tymidiini-31-fosfaatiksi:

Yhteen kolmasosaan edellä saatua 2-kloorifenyyli-1-bentso-triatsolyyli-5(4-metoksitrityyli)-tymidiini-3'-fosfaatti-5 liuosta lisätään, samalla jäähdyttäen, 100 ml 0,5 M trietyy-liammoniumbikarbonaattia. 15 minuutin kuluttua uutetaan di-kloorimetaanilla. Dikloorimetaaniliuos pestään vedellä, haihdutetaan ja siihen lisätään tipoittain petrolieetteriä.

Saatu sakka imusuodatetaan, pestään eetteri-petrolieetteril-10 lä 1:1 ja kuivataan tyhjössä.

DC : R^ 0,35 dikloorimetaani-metanoli-vedessä (75:22:3).

β) Esteröinti 2-syanoetyyli-2-kloorifenyyli-5'-(4-metoksitrityyli) -tymidiini-3'-fosfaatti ja 4-metoksitrityyli-suojaryhmän poislohkaisu 15 Yhteen kolmasosaan edellä saatua 2-kloorifenyyli-1-bentsotri-atsolyyli-51 -(4-metoksitrityyli)-tymidiini-fosfaattiliuosta lisätään 1,3 ml 2-syanoetanolia ja 2 ml pyridiiniä. Seoksen annetaan olla yön yli huoneen lämpötilassa. Liuotin tislataan pois tyhjössä ja jäännös liuotetaan etikkahappoetyyli-20 esteriin ja ravistellaan toistuvasti 0,1 M fosfaattipuskurilla pH 7 ja vedellä. Orgaaninen faasi kuivataan, haihdutetaan ja lisätään tipoittain heksaaniin. Sakka suodatetaan, liuotetaan 50 ml:aan dikloorimetaani-metanolia 7:3 ja 0°C:ssa lisätään liuos, jossa on 3,8 g p-tolueenisulfonihappomono-25 hydraattia 75 ml:ssa dikloorimetaani-metanolia 7:3. Kahden tunnin kuluttua reaktioliuos laimennetaan dikloorimetaanilla ja ravistellaan kylmällä natriumvetykarbonaattiliuoksella. Orgaaninen faasi erotetaan ja siihen lisätään heksaania. Saostunut 2-syanoetyyli-2-kloorifenyyli-tymidiini-3'-fos-30 faatti kromatografoidaan piihappogeelillä, eluointiaineena dikloorimetaani-metanoli 96:4. DC: R^ 0,45 dikloorimetaani-metanolissa (9:1).

46 γ) Kondensaatio 51-(4-metoksitrityyli)-3'-syanoetyyli)-bis-tymidiini-dinukleotidiksi: 2,2 g 2-syanoetyyli-2-kloorifenyyli-tymidiini-3'-fosfaattia, josta vesi on poistettu haihduttamalla kaksi kertaa abs. py-5 ridiinin kanssa, liuotetaan 20 ml:aan abs. tetrahydrofuraa- nia ja lisätään jäljellä olevaan 2-kloorifenyyli-1-bentsotri-atsolyyli-5(4-metoksitrityyli)-tymidiini-3'-fosfaattiliuok-seen. 18 tunnin kuluttua huoneen lämpötilassa, lisätään reak-tioliuokseen, samalla jäillä jäähdyttäen, 10 ml vettä ja 200 10 ml etikkahappoetyyliesteriä. Orgaaninen faasi pestään toistuvasti natriumvetykarbonaatilla ja vedellä, kuivataan nat-riumsulfaatilla ja haihdutetaan pieneen tilavuuteen. Fosfaatti-osa ja 5'- tai 3'-päässä suojattu dinukleotidi saostetaan lisäämällä tipoittain eetteri-heksaania 1:1. DC: R^ 0,48 15 dikloorimetaani-metanolissa (9:1).

b) Trinukleotidin synteesi 1,17 g (1 mmoolia) edellä kuvattua, täysin suojattua dinukleo-tidia liuotetaan 30 ml:aan dikloorimetaani-metanolia 7:3 ja tähän lisätään, samalla jäillä jäähdyttäen, liuos, jossa 20 on 1,9 g p-tolueenisulfonihappomonohydraattia 20 ml:ssa dikloorimetaani-metanolia 7:3. Kahden tunnin kuluttua lisätään jääkylmää natriumvetykarbonaattiliuosta ja uutetaan dikloori-metaanilla. Orgaaninen faasi kuivataan, haihdutetaan ja lisätään tipoittain heksaaniin. Saostunut raaka dinukleotidi, 25 jossa on vapaa 51-hydroksiryhmä, kromatografoidaan piihappo-geelillä eluointiaineena 2-8-prosenttinen metanolin gradient-ti dikloorimetaanissa. DC: 0,33 dikloorimetaani-metanolis sa (9:1) .

850 mg tätä 5'-hydroksi-dinukleotidia ja 1,06 g trietyyli-30. ammonium-2-kloorifenyyli-5'-(4-metoksitrityyli)-tymidiini-3'-fosfaattia (vrt. kohta a) a)) haihdutetaan kaksi kertaa

II

47 90787 pyridiinin kanssa, sen jälkeen liuotetaan 10 ml:aan abs. py-ridiiniä ja lisätään 560 mg 1-mesityleenisulfonyyli-3-nitro- 1,2,4-triatsolia (MSNT). Kahden tunnin kuluttua lisätään 2 ml jääkylmää vettä ja siitä tunnin kuluttua uutetaan dikloori-5 metaanilla. Orgaaninen faasi pestään kyllästetyllä natriumve-tykarbonaatilla ja vedellä, kuivataan, haihdutetaan ja lisätään eetteriä. Saostunut trinukleotidi puhdistetaan kromato-grafoimalla piihappogeelillä. 0,45 dikloorimetaanimetano- lissa (9:1).

10 Esimerkki 4:

Esimerkin 3 mukaisesti valmistetaan seuraavat, suojatut tri-nukleotidit, joiden yleinen kaava on

MMT—0—B1—0— 1—0—B!—0—P—O—ϊ!—O—|-0CH2CHjCN

l<"> k > \*/ ·/ ,·· ci ci ci 12 3 12 3 joka lyhennetään B B B . Nukleosideille B , B , B käytetään seuraavia lyhenteitä: A = N-bentsoyyli-deoksiadenosiini C = N-bentsoyyli-deoksisytidiini G = N-isobutyryyli-deoksiguanosiini T = tymidiini 48

Yhdiste Rf1 Yhdiste Rfa* TTT 0,45 ATG 0,48 TTC 0,55 ACT 0,53 TCT 0,46 ACC 0,48 TAC 0,56 ATT 0,55 TGC 0,44 ACA 0,53 TAG 0,60 AAC 0,46 TGT 0,42 AAA 0,51 TGA 0,44 AGT 0,45 CTT 0,53 AGG 0,38 CTG 0,46 GTT 0,45 CCT 0,45 GTC 0,44 CCC 0,59 GTG 0,35 CCG 0,47 GCA 0,49 CCA 0,51 GCG 0,48 CAT 0,55 GAT 0,44 CAC 0,51 GAC 0,48 CGC 0,46 GAG 0,48 CGA 0,38 GAA 0,50 CAG 0,44 GGC 0,42 CGG 0,38 GGT 0,46 CGT 0,49 GGG 0,35 GGA 0,44

Ohutkerroskromatogrammi piihappogeelillä, eluointiaineena dikloorimetaani-metanoli 9:1.

90787 49

Esimerkki 5: 67 emäksen pituisen DNA-jakson syntetisointi, alkaen DNA-säikeen emäksestä n;p 96 emäkseen n to 162 (96/67) a) Trinukleotidin 2-syaanietyylisuojaryhmän poislohkaisu 5 10 ymoolia trinukleotidia esimerkistä 3 tai 4 liuotetaan/ samalla kosteudelta suojaten, 60 yl:aan pyridiini-asetonit-riili-trietyyliamiinia 1:1:1. Yhden tunnin kuluttua huoneen lämpötilassa lisätään tipoittain 0,7 ml peroksidivapaata eetteriä ja sakka sentrifugoidaan pois. Raaka trietyyliammonium-10 suola liuotetaan 50 yl:aan pyridiiniä ja saostetaan vielä kerran 0,5 ml:11a eetteriä, sentrifugoidaan ja kuivataan 15 tuntia suurtyhjössä.

b) Osittain suojatun trinukleotidin liittäminen polystyree-nihartsiin sidottuun oligonukleotidiketjuun: 15 Kaikki toimenpiteet suoritetaan kosteudelta suojaten 220 yl:n reaktioastiassa ja mikroprosessoriohjattua liuotin- ja rea-genssilisäystä käyttäen. 13 mg (0,74 ymoolia) tymiini-poly-styreenihartsia (esimerkki 1) laitetaan reaktioastiaan ja suoritetaan seuraavat toimenpiteet: 20 1. metyleenikloridia, 2 ml/min., 4 min.

2. metyleenikloridi-isopropanolia (85:15), 2 ml/min., 2 min.

3. sinkkibromidia 1 M ja 1,2,4-triatsolia 0,02 M metyleeni-kloridi-isopropanolissa (85:15), 2 ml/min., 2-3,5 min.

4. metyleenikloridi-isopropanolia (85:15), 2 ml/min., 4 min.

25 5. trietyyliammoniumasetaattia 0,5 M DMF:ssä, 2 ml/min., 5 min.

6. molekyyliseulalla kuivattua pyridiiniä, 2 ml/min., 3 min.

7. tetrahydrofuraania (peroksidivapaata, molekyyliseulalla kuivattua), 2 ml/min., 3 min.

8. typpivirta, 10 min.

30 9. injektoidaan 10 ymoolia trinukleotidia GTC (trimetyyli- 50 ammoniumsuola vaiheesta a) ) ja 8,9 nig (30 ymoolia) 1-mesityleenisulfonyyli-3-nitro-1,2,4-triatsolia (MSNT) liuotettuna 150 yl:aan pyridiiniä 10.45°C, 20 min.

5 11.pyridiiniä, 2 ml/min., 4 min.

12. asetanhydridiä 5 % ja 4-dimetyyliaminopyridiiniä 2,5 % pyridiinissä, 2 ml/min., 4 min.

13. pyridiiniä, 2 ml/min., 4 min.

14. pyridiini-isopropanolia (1:1), 2 ml/min., 3 min.

10 Kaikki 14 vaihetta toistetaan 21 kertaa, jolloin 9. vaiheessa GTC:n sijasta lisätään kulloinkin seuraavat trinukleotidit trietyyliammoniumsuolojensa muodossa (vaihe a)) annetussa järjestyksessä: GCA, ACC, GAA, CCC, TAC, AGG, TGA, CGG, TAC, CGT, CCA, AAA, AAA, TGA, CGG, TGA, TTC, GGG, CCT, CAT. Kes-15 kimääräinen yhteenliittymissaanto on 97%. Lopputuotteella on seuraava rakenne: HMT-CATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAAACCAGTGCGTTACCGGTGAAGGTACCCCGAAACCGCAG TCT-polysty reeni c) DNA-fragmentin irrottaminen kantoaineesta ja suojaryh-mien poislohkaisu: 40,0 mg (noin 0,60 ymoolia) DNA-synteesihartsia 96/67 20 pidetään 66 mg:n (0,40 mmoolia) kanssa o-nitrobentsaldok- siimia ja 50 yl:n (0,40 mmoolia) kanssa 1,1,3,3-tetrametyy-liguanidiinia 400 yl:ssa 95-%:sta pyridiiniä 3 tunnin ajan 50°C:ssa ja 12 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Pyridiini poistetaan typellä, jonka jälkeen jäännökseen lisätään 1,6 25 ml vesipitoista ammoniakkia (33 %) ja pidetään suljetussa astiassa 24 tuntia 50°C:ssa.

Erotetusta, nestemäisestä faasista poistetaan ammoniakki tyhjössä ja pestään 3 kertaa, joka kerta 3 ml:11a peroksidi-vapaata dietyylieetteriä. Pienempimolekyyliset aineosat 30 erotetaan Biogel P6-pylväällä (100-200 mesh, 3 x 66 cm, 0,01

II

90787 51 molaarinen trimetyyliammoniumvetykarbonaatti pH 7,5, 1,5 ml/ min.), jonka jälkeen eristetään 285 OD:tä (260 nm) DNA.

Yhteensä 60 OD:tä erotetaan HPLC-pylväässä (PRP-1/Hamilton, 250 x 4,6 nm). Gradientti (liuos A: 0,05 M trietyyliammonium-5 asetaatti pH 7,0; liuos B: liuos Arasetonitriili 1:1): 30 % B:tä A:ssa —> 60 % B:tä A:ssa 20 minuutissa 50°C:ssa ja 2 ml/min. Lipofiilinen pääpiikki (retentioaika noin 14 minuuttia) yhdistetään, konsentroidaan DE52-selluloosa - (Whatman) pylväässä, eluoidaan ja seostetaan etanolilla. 4-metoksitrityy-10 lisuojaryhmän poislohkaisemiseksi sakka liuotetaan 50 yl:aan etikkahappo/vettä (4:1) ja pidetään 45 minuuttia huoneen lämpötilassa. Reaktiotuote lyofilisoidaan, seostetaan etanolilla ja puhdistamista varten erotetaan elektroforeettisesti 8-prosenttisella polyakryyliamidigeelillä (7 M karbamidi).

15 Haluttuja DNA-kokoja vastaava kaista leikataan irti ja tuote elektroeluoidaan konsentroidaan DE52 selluloosalla ja DNA 96/67, jonka rakenne on 5' -CATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAAACCAGTGCGTTACCGGTGAAGCTACCCCGAAACCG CAGTCT-3' saostetaan etanolilla.

Esimerkki 6: Esimerkin 5 mukaisesti valmistetaan seuraavat 20 DNA-fragmentit (5'-3'): 1/58 CTGGAATTCATGGTTGTTTACACCGACTGCACCGAATCTGGTCAGAACCTGTGCCTGT 46/64 komplementaarinen CAGAACCCAGGATGCATTTGTTACCCTGACCGCAAACGTTAGAACCTTCGCACAGGCACAGGTT 154/64 komplementaarinen

CAGGATCCTACTGCAGGTATTCTTCCGGGATTTCTTCGAAGTCACCGTCGTTGTGAGACTGCGG

52

Esimerkki 7: Fragmenttien 1/58/46/64 komplementaarinen, 96/67 ja 154/64 komplementaarinen/ fosforylointi

Fosforylointi ja radioaktiivinen leimaaminen 5'-päissä tapah-22 tuu (γ- P) ATP:llä ja polynukleotidi-kinaasilla (Boeh-5 ringer) kuten esitetään viitteessä (18).

Esimerkki 8: Polymerointi kaksoissäikeeksi II (desulfatohiru-diinigeenin osa F^ 50 pmoolia fragmenttia 96/67, kinasoitu, ja 50 pmoolia fragmenttia 154/64, kinasoitu, liuotetaan 24 yl:aan vettä, liuos 10 kuumennetaan 3 minuutin kuluessa 90°C:seen ja jäähdytetään 5 minuutin kuluessa 12°C:seen. Lisätään 4 pl endo-R-puskuria (0,1-molaarinen Tris.HCl, pH 7,5, 66 mM MgCl2, 66 mM 8-mer-kaptoetanolia, 0,6 M NaCl), 10 yl deoksinukleosiditrifosfaat- -3 tiseosta (dATP, dCTP, dGTP, TTP, jokainen 2 *10 molaarinen, 15 pH säädetään NH^tlla arvoon 7,0) ja 2 1 (10 yksikköä) DNA- polymeraasia I, Klenow-fragmentti (Boehringer), jonka jälkeen inkuboidaan 30 minuutin ajan 12°C:ssa. Reaktio pysäytetään kuumentamalla 3 minuutin kuluessa 90°C:seen ja seosta säilytetään jatkotyöskentelyä varten -80°C:ssa.

20 Vastaavalla tavalla fragmentit 1/58, kinasoitu, ja 46/64, kinasoitu, saatetaan reagoimaan kaksoissäikeeksi I (desulfato-hirudiini-geenin osa F^).

Kaksoissäikeiden I ja II rakenteet ovat seuraavat:

Kaksoissäie I

CTGGAATTCATGGTTGTTTACACCGACTGCACCGAATCTGGTCAGAACCTGTGCCTGTGCGAAGGTTC

GACCTTAAGTACCAACAAATGTGGCTGACGTGGCTTAGACCAGTCTTGGACACGGACACGCTTCCAAG

TAACGTTTGCGGTCAGGGTAACAAATGCATCCTGGGTTCTG

ATTGCAAACGCCAGTCCCATTGTTTACGTAGGACCCAAGAC

n 90787 53

Kaksoissäie II

CATCCTGCGTTCTGACGGTGAAAAAAACCAGTGCGTTACCGGTGAAGGTACCCCGAAACCGCAGTCTC

GTAGGACCCAAGACTGCCACTTTTTTTGGTCACGCAATGGCCACTTCCATGGGGCTTTGGCGTCAGAG

ACAACGACGGTGACTTCGAAGAAATCCCGGAAGAATACCTGCAGTAGGATCCTG

TGTTGCTGCCACTGAAGCTTCTTTAGGGCCTTCTTATGGACGTCATCCTAGGAC

Desulfatohirudiini-geenin osien ja F2 valmistus on esitetty seuraavassa kaaviossa I: 54

Kaavio I; Desulfatohirudiini-geenin ja F^-F2~DNA:n osien ja F2 valmistus 1/58 96/67 --46/64. ---154/64 ♦ 1T4- polynukleotidi- Τ4- polynukleotidi- kinaasi kinaasi pariutuminen ,r pariutuminen m ti n_ 111111 i--

IDNA-polymeraasi I |DNA- polymeraasi I

J(Klenov), dNTP:t j(Klenow), dNTP:t 'n n I n I n ! I H11111 n 11 ΠΤιΤΓ ................... m n t t t t

£coRI EcoRII EcoRII BamHI

osa F^ osa Fj |(alakloonaus) I (alakloonaus) |ecoR11 iEcoRll

M ! 111 i 111M 111111 n'i I n»I»1111111 m 111 iTTTT

t t

RcoRI EcoRII EcoRII BamHI

1 pariutuminen T^-DNA- ligaas i

-, , I I I I 1 n 1 I........ I I 1 n I I H I H H I I I I I......I I I I HI I I I

t t *

EcoRI EcoRII BamHI

Fj-F2_DNA (desulfatohirudiini-geeni)

II

90787 55

Esimerkki 9; Fragmenttien 1/58, 46/64, kinasoitu, 96/67 kinasoitu ja 154/64 polymerointi ja liittäminen; desulfatohirudiini-geenin valmistus

50 pmoolia kutakin fragmenttia 1/58, 46/64, kinasoitu, 96/67 5 kinasoitu ja 154/64 liuotetaan 48 yl:aan vettä, liuos kuumennetaan 3 minuutin kuluessa 90°C:seen ja jäähdytetään 5 minuutin sisällä 12°C:seen. Lisätään 8 yl Endo-R-puskuria (vrt. esimerkki 8). 20 yl deoksinukleosiditrifosfaatti-seosta (dATP, dCTP, dGTF, TTP, jokainen 0,002 moolinen, pH säädetty 10 NH^tlla arvoon 7,0) ja 2 yl (10 yksikköä) DNA-polymeraasia I, Klenow-fragmentti (Boehringer), jonka jälkeen inkuboidaan 30 min. 12°C:ssa. Reaktio pysäytetään kuumentamalla 3 minuutin kuluessa 90°C:seen ja DNA eristetään, fenoli/kloroformi-uuton jälkeen.etanolisaostuksella. Muodostunut DNA-seos liuotetaan 15 100 pl:aan ligaasipuskuria (66 mM Tris.HCl pH 7,5, 6,6 mM

MgCl2· 10 mM ditiotreitolia, 5 mM ATP), lisätään 50 yksikköä (2 yl) T^DNA-ligaasia (Biolabs) ja inkuboidaan 20 tunnin ajan 20 C:ssa. Reaktio pysäytetään kuumentamalla 5 minuutin kuluessa 70°C:seen ja fenoli/kloroformi-uuton jälkeen DNA 20 eristetään etanolisaostuksella. Seos erotetaan 8-%:isessa polyakryyliamidigeelissä (denaturoitu) elektroforeesilla, jonka jälkeen liitäntätuote jossa on 217 emäsparia elektro-eluoidaan, konsentroidaan DE52-selluloosapylvääseen ja eluoin-nin jälkeen eristetään etanolisaostuksella.

25 Desulfatohirudiini-geenillä on seuraava rakenne:

CTGGAATTCATGGTTGTTTACACCGACTGCACCGAATCTGGTCAGAACCTGTGCCTGTGCGAAGGT

GACCTTAAGTACCAACAAATGTGGCTGACGTGGCTTAGACCAGTCTTGGACACGGACACGCTTCCA

TCTAACGTTTGCGGTCAGGGTAACAAATGCATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAAACCAGTGCGTT

AGATTGCAAACGCCAGTCCCATTGTTTACGTAGGACCCAAGACTGCCACTTTTTTTGGTCACGCAA

ACCGGTGAAGGTACCCCGAAACCGCAGTCTCACAACGACGGTGACTTCGAAGAAATCCCGGAAGAA

TGGCCACTTCCATGGGGC1TTGGCGTCAGAGTGTTGCTGCCACTGAAGCTTCTTTAGGGCCTTCTT

TACCTGCAGTAGGATCCTG

ATGGACGTCATCCTAGGAC

56

Desulfatohirudiiinigeenin valmistus neljästä fragmentista on esitetty seuraavassa kaaviossa II:

Kaavio 6: Hirudiinigeenin valmistus neljästä synteettisestä fragmentista___ 1/58 96/67 . A6/64 154/64 |TA"£olynukleotidikinaasi J, pariutuminen TTiTT_11 ι ΤΤ TTTTT___ IDNA-polymeraasi I (Klenow) jdNIPs TTTmimiiiimmmini» TTTTi niiiiminnimiiiiiimi | T^- DNA- ligaasi

Tm n 11 n i n 11 n 111 m 1111111111111 n n i n i n n n 1111 m m n 1111 t t

Ec«U F.-Fz-DNA Ba"HI

(desulfatohirudiini-geeni)

II

90787 57

Esimerkki 10: Desulfatohirudiinigeenin F^DNA:n sisältävän plasmidin pML 300 valmistus (Kuvio 1) a) Linearisoidun vektorin pBR322/EcoRI/PvuII valmistus 5 yg pBR322 plasmidi-DNA:ta pilkotaan 5 yksiköllä PvuII re-5 striktioendonukleaasia (Biolabs) 200 ml:ssa liuosta, jossa on 100 yg/ml gelatiinia, 1 tunnin ajan 37°C:ssa. Sen jälkeen liuos säädetään pitoisuuteen 100 mM Tris.HCl (pH 7,5) 50 mM NaCl, ja DNA pilkotaan 30 yksiköllä EcoRI-restriktioendonuk-leaasia (Biolabs) 2 tuntia 37°C:ssa. Sen jälkeen liuos sääde-10 tään pitoisuuteen 50 mM Tris.HCl pH 8 ja DNA-konsentraation ollessa 10 yg/yl, inkuboidaan 2 yksikön kanssa vasikan sisäelinten alkalista fosfataasia (Boehringer) 30 minuutin ajan 37°C:ssa. Entsyymi inaktivoidaan kuumentamalla liuosta 60 minuutin ajan 65°C:ssa. Sen jälkeen liuos säädetään TNE-pitoi-15 suuteen, uutetaan 1 tilavuudella fenolia ja kloroformia ja pilkottu DNA saostetaan 2 tilavuudella alkoholia -20°C:ssa yön kuluessa.

pBR322 DNS:sta irti leikattu vektori (pBR322/EcoRI/PvuII, 2297 emäsparia) erotetaan geelielektroforeesilla 1-%:isessa, 20 matalalla sulavassa agaroosissa (Biorad), joka on valmistettu Tris-asetaatti-EDTA-puskuriin pH 8, pienestä DNA-fragmentista (2067 emäsparia). Sen jälkeen kun DNA on värjätty agaroosigee-lillä EtBr:llä, geelin kohdat, jotka sisältävät pBR322/EcoRII/ PvuII vektorin (=2297 emäsparia) DNA-kaistat, leikataan irti 25 geelistä ja nesteytetään 65°C:ssa 19 minuutin ajan. Tähän DNA-liuokseen lisätään 20 tilavuutta TNE:tä, DNA puhdistetaan Mueller et al.:n (19) esittämällä tavalla DE-52-kromatogra-fisesti, uutetaan fenoli/kloroformilla ja DNA saostetaan -20°C:ssa yön yli alkoholilla. DNA-sakka liuotetaan 50 yl:aan 30 liuosta, jossa on 0,01 M Tris.HCl (pH 8), 0,1 mM EDTA, ja säilytetään -20°C:ssa kunnes sitä käytetään. Saadaan 1,4 yg (=3,2 pmoolia päitä). DNA:ta.

58 b) F^-DNA/EcoRII:n valmistus 24 ng (=1,3 pmoolia päitä) kemiallisesti syntetisoitua -DNA:ta (katso esimerkki 8) pilkotaan 5 yksiköllä EcoRI-re-striktioendonukleaasia (Biolabs) 50 yl:ssa liuosta, jossa on 5 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl ja 100 yg/ml gelatiinia, 30 minuutin ajan 37°C:ssa. Sen jälkeen liuokseen lisätään 0,06 yg (=0,14 pmoolia päitä) linearisoitua vektoria pBR322/ EcoRI/PvuII (esimerkki 10a). Sen jälkeen entsyymi inaktivoi-daan kuumentamalla 65°C:seen 10 minuutin kuluttua, liuos sää-10 detään TNE-pitoisuuteen ja uutetaan fenoli/kloroformilla. DNA saostetaan alkoholilla. Saostunutta DNA:ta säilytetään alkoholissa -20°C:ssa, kunnes työskentelyä jatketaan.

c) pBR322/EcoRI/PvuII-vektori-DNA:n liittäminen F^-DNA/EcoRI: een ja plasmidin pML300 rakentaminen_ 15 Esimerkissä 10b) saatu DNA-sakka, joka sisältää molemmat mainitut DNA-jaksot, liuotetaan 20 yl:aan liuosta, jossa on 50 mM Tris.HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP, 100 yg/ml gelatiinia, ja käsitellään 25 yksiköllä/yl DNA-ligaasia (Biolabs) 15 C:ssa 3 tunnin ajan. Tällä tavalla muo-20 dostuu rekombinoidun plasmidin pML300 liuos, joka sisältää F .j -DNA: n.

d) E.colin HB101-solujen transformointi plasmidilla pML300

Transformoinnissa tarvittavat, kalsiumilla esikäsitellyt E.co-li HB101-solut valmistetaan kuten Mandel et ai. ovat esittä-25 neet (14).

Kohdassa c) saatua liuosta, joka sisältää yhdistelmäplasmidin pML300, kuumennetaan 10 minuutissa 65°C:seen T^-DNA-ligaasin inaktivoimiseksi, jonka jälkeen jäähdytetään 37°C:seen. 10 yl tätä reaktioseosta lisätään 150 yl:aan kalsiumilla käsitelty-

II

90787 59 jä E.coli HB101-soluja 10 mM:ssä MgCl2 ja 10 mM:ssä Tris.

HC1 (pH 7,5), kokonaistilavuuden ollessa 200 yl.

Sen jälkeen tätä seosta jäähdytetään jäissä 30 minuutin ajan, kuumennetaan 2 minuutissa 42°C:seen, jonka jälkeen annetaan 5 seistä 50 minuutin ajan 1 ml:ssa L-kasvualustaa (vrt. esimerkki 18 37°C:ssa. Tämän jälkeen seos levitetään 0,2 ml:n eris sä 5 agarmaljoille (McConkey-agar, Difco), jotka sisältävät 60 yg/ml ampisilliinia (Serva). Sen jälkeen agarmaljoja pidetään 37°C:ssa 16-18 tuntia. Saadaan 484 transformoituneiden 10 E.coli HB101-solujen ampisilliini-resistenttiä pesäkettä.

e) F^-DNA:ta sisältävien pesäkkeiden seulonta 470 transformoitunutta pesäkettä (esimerkki 10d) painetaa-nitroselluloosasuodattimille B85 (Schleicher ja Schiill) . Menetelmällä, jonka ovat esittäneet Grunstein ja Hogness (20), 15 pesäkkeet lyysoidaan ja niiden denaturoitunut DNA kiinnitetään suodattimelle. Sen jälkeen tapahtuu suodattimen esihybridi-sointi 20 ml:ssa (per suodatin) liuosta, jossa on 4 x SET =liuos, jossa on 30 mM Tris.HCl (pH 8) 150 mM NaCl, 1 mM EDTA , 0,1 % (paino/tilavuus) Ficoll 400 (Pharmacia) 0,5 % 20 SDS, 50 yg/ml denaturoitua vasikan kateenkorva-DNA, 4 tuntia 64°C:ssa. Tämän jälkeen nitroselluloosasuodattimet käsitellään 20 mlrssa (per suodin) liuosta, jossa on 5 x SET (paino/ til.), Ficoll 400:aa; 0,2 % SDS:a ja 50 yg/ml denaturoitua o 32 vasikan kateenkorva-DNA:ta, 16 tunnin ajan 64°C:ssa P-ra- 3 4 25 dioaktiivisesti leimatulla koettimella (noin 10 -10 Cerencov cpm per suodatin). Koettimena käytetään komplementaarista oli-gonukleotidia 46/64 (vrt. esimerkki 6).

Sen jälkeen suodattimet pestään kaksi kertaa huoneen lämpötilassa liuoksessa, jossa on 2 x SET ja 0,2 % SDS, jonka jäl-30 keen kaksi kertaa liuoksessa, jossa on 2 x SET ja 0,5 % SDS, 60°C:ssa (ensin 30 min. sitten 60 min ajan). Tämän jälkeen suo- 60 dattimet kuivataan 3 MM paperin (Whatman) välissä ja -80°C: ssa 1-2 päivän ajan siirretään röntgenfilmille (Fuji), käyttäen vahvistusfoliota (Intensifying screen, Ilford).

Saadussa autoradiogrammissa näkyy 71 positiivista pesäkettä 5 (kloonia), joita voidaan käyttää jatkotyöskentelyssä, yhdelle niistä annetaan nimi pML300.

Esimerkki 11: Desulfatohirudiinigeenin F2-DNA:n sisältävän plasmidin pML305 valmistus (Kuvio 2) ._ a) Linearisoidun vektorin pBR322 /BamHl/NruI valmistus 10 5 yg pBR322-plasmidi-DNA:ta pilkotaan 30 yksiköllä BamHI- restriktioendonukleaasia 30 minuutin ajan liuoksessa, jossa on 100 mM NaCl, 6 mM Tris.HCl (pH 7,9), 6 mM MgCl2 ja 100 yg/ml gelatiinia. Sen jälkeen lisätään liuos, jossa on 15 yksikköä PvuII-restriltioendonukleaasia, ja leikataan 2 tun-15 tia 37°C:ssa.

Reaktioseos kuumennetaan 10 minuutin kuluessa 70°C:seen entsyymin inaktivoimiseksi. Sen jälkeen molemmat DNA-fragmentit erotetaan toisistaan geelielektroforeesilla 1-%:isessa matalalla sulavassa agaroosissa, joka on valmistettu Tris-asetaat-20 ti-EDTA-puskuriin pH 8 (katso esimerkki 10a).

pBR322 BamHI/PvuII vektorin DNA-jaksot (= 2672 emäsparia) leikataan irti, nesteytetään ja Mueller et ai.:n (19) esittämällä tavalla puhdistetaan DE-52-kromatografisesti. Saadaan 0,75 yg (=1,5 pmoolia päitä) DNA:ta.

25 b) F2-DNA/BamHI:n valmistus 25 yg (=1,3 pmoolia päitä) kemiallisesti syntetisoitua F2~ DNA:ta (esimerkki 8) pilkotaan 16 yksiköllä BamHI-restriktio-

II

90787 61 endonukleaasia (Biolabs) 20 yl:ssa liuosta, jossa on 150 mM NaCl, 6 mM Tris.HCl (pH 7,9), 6 mM MgCl2 ja 100 yg/ml gelatiinia, 30 minuutin ajan 37°C:ssa. Sen jälkeen lisätään line-arisoidun vektorin pBR322/BamHI/PvuII (esimerkki 11a) 60 ng: 5 n liuos (= 96 nmoolia päitä), koko liuos säädetään TNE-pitoi-suuteen ja uutetaan fenoli/kloroformilla ja DNA saostetaan 2 tilavuudella alkoholia. Saostunutta DNA:ta säilytetään alkoholissa -20°C:ssa, jatkotyöskentelyä varten.

c) pBR322/BamHI/PvuII-vektori-DNA:n liittäminen F2~DNA/ 10 BamHIzeen ja plasmidin pML305 rakentaminen_

Esimerkissä 11b) saatu DNA-sakka, joka sisältää molemmat mainitut DNA-rakenneosat, liuotetaan 20 yl:aan liuosta, jossa on 50 mM Tris.HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP, 100 yg/ml gelatiinia, ja käsitellään 15 yksiköllä/ 15 yl DNA-ligaasia (Biolabs) 15°C:ssa 3 tuntia. Tällä tavalla muodostuu liuokseen yhdistelmäplasmidia pML305, joka sisältää F2-DNA:n.

d) E.coli HB101-solujen transformointi plasmidilla pML 305

Kalsiumilla käsiteltyjen E. coll HB101-solujen transformoin-20 ti tapahtuu esimerkissä 10d) esitetyllä tavalla. Käytetään 10 yl esimerkissä 12c) saatua reaktioseosta. Saadaan 313 am-pisi11iini-resistenttiä pesäkettä.

e) F2~DNA:ta sisältävien pesäkkeiden seulonta 65 transformoitunutta pesäkettä (esimerkki 11d) testataan 25 F2-DNA:n suhteen, esimerkissä 10e) esitetyllä tavalla. Radioaktiivisena koettimena käytetään komplementaarista oligo-nukleotidia 154/64 (vrt. esimerkki 6). Autoradiogrammi sisältää 2 positiivista pesäkettä, joista toiselle annetaan nimi pML305.

62

Esimerkki 12; Kloonien pML300 ja pML305 karakterisointi

Yhdistelmäplasmidien pML300 ja pML305 DNA:t eristetään menetelmällä, jonka on esittänyt Ish-Horowitz .(21). F^-DNA- ja F2-DNA-inserttien nukleotidisekvenssit määritetään menetel-5 mällä, jonka ovat esittäneet Maxam ja Gilbert (11). Tätä varten kulloinkin 10 yg pML300:n plasmidi-DNA:ta pilkotaan EcoRI-restriktioendonukleaasilla ja 10 yg pML305:n plasmidi-DNA:ta pilkotaan BamHI-restriktioendonukleaasilla ja linearisoidut DNA:t eristetään geelieluutiolla agaroosigeelistä (vrt. esi-10 merkki 10a)). Sen jälkeen eristetyt DNA:t pilkotaan alkali-sella fosfataasilla ja kromatografoidaan DE-52:lla (vrt.

esimerkki 11a). Sitten DNA:t 5'-päissä leimataan radioaktii-32 visesti (γ- p)ATP:llä (spesifinen aktiivisuus > 5000 Ci/ mmoolia, Amersham) ja T^-polynukleotidi-kinaasilla (P-L-Bio-15 chemicals).

Sen jälkeen radioaktiivisesti leimatut DNA:t pilkotaan eräällä toisella restriktioendonukleaasilla (EcoRII). Muodostuneet DNA-fragmentit eristetään geelieluutiolla agaroosista. pML 300:n ollessa kyseessä EcoRII-EcoRI* fragmentista (noin 109 20 emäsparia F^-DNA:n nukleotidisekvenssi, pML305:n ollessa kyseessä määritetään F2-DNA EcoRII-BamHI*-fragmentissa (noin 122 emäsparia). (* tarkoittaa DNA-päätä, joka on leimattu radioaktiivisesti).

F1-DNA:lie ja Fj-DNA^le määritetyt nukleotidisekvenssit 25 ovat identtiset esimerkissä 8 esitettyjen kanssa.

Il 90787 63

Esimerkki 13; Ilmentymisplasmidin pML310 valmistus a) Linearisoidun vektorin pHRil48/EcoRI/BamHI, joka sisältää trp-promoottori-operaattorin, rakentaminen (kuvio 3 ja kuvio 4)__ 5 A. Plasmidin p159 rakentaminen 10 g plasmidia pBRH. (22) pilkotaan 50 yksiköllä EcoRI:tä

** O

(Biolabs) 60 minuutin ajan 37 C:ssa ja pilkottu seos fraktioidaan fenoliuuton jälkeen, sakkaroosi-tiheysgradientilla (5-23%) liuoksessa, jossa on 50 mM Tris.HCl (pH 8,0), 1 mM 10 EDTA TST41-roottorissa (Kontron AG). Sentrifugointi kestää 14 tuntia 40 000 rpm ja 15°C. 0,3 ml:n fraktiot kerätään ISCO-gradienttikerääjällä 1 ml/min. Fraktiot, jotka sisältävät pienemmän fragmentin, yhdistetään, liuos säädetään TNE-pitoisuuteen ja saostetaan 2 tilavuudella etanolia -20°C:ssa. 15 DNA liuotetaan Eppendorf-sentrifuugissa sentrifugoinnin jälkeen 100 yl:aan liuosta, jossa on 10 mM Tris. HC1 pH 7,5, 0,5 mM EDTA. 5 yg näitä DNA-fragmentteja pilkotaan 5 yksiköllä Bglll (Biolabs) 60 minuutin ajan 37°C:ssa. Reaktioseos uutetaan fenolilla ja kloroformilla ja DNA:ta inkuboidaan 20 2 tilavuuden kanssa etanolia -80°C:ssa 10 minuutin ajan ja DNA kerätään sentrifugoimalla ja liuotetaan uudestaan 50 yl: aan liuosta, jossa on 50 mM Tris.HCl (pH 8,0). Otetaan 2 yl tätä liuosta (0,2 yg DNA) ja DNA-konsentraatiossa 10 ng/yl inkuboidaan 50 mM:ssa Tris-HCl (pH 8,0) 1 yksikön kanssa 25 vasikan sisäelinten alkalista fosfataasia (Boehringer) 30 minuuttia 37°C:ssa. Entsyymi inaktivoidaan kuumentamalla 60 minuuttia 65°C:ssa. Otetaan 0,04 yg DNA:ta ja 5'-päätä inkuboidaan 10 yCi:llä (γ zp)ATP:tä (>5000 Ci/mmol. Amersham) ja 5 yksiköllä T^ polynukleotidi-kinaasia (P-L Biochemicals)

30 20 yl:n reaktiotilavuudessa, jossa on 50 mM Tris-HCl (pH

9,5), 10 mM MgC^ ja 5 mM DTT, 30 minuuttia 37 C:ssa. Radioaktiivinen koetin sekoitetaan leimaamattoman koettimen kanssa (katso edellä) ja DNA-fragmentit fraktioidaan 5-23 % 64 sakkaroosi-tiheysgradientilla liuoksessa, jossa on 50 mM Tris.HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, TST60-roottorissa. Sentrifu-gointi kestää 5 tuntia 60 000 rpm ja 15 C. Kootaan 0,2 ml:n fraktiot. Jokaisen fraktion radioaktiivisuus määritetään mit-5 taamalla Cerencov-säteily ja siten identifioidaan fraktiot. Halutut fraktiot, jotka sisältävät pienen DNA-fragmentin, yhdistetään, DNA saostetaan 2 tilavuudella etanolia ja sentri-fugoinnin jälkeen liuotetaan uudestaan 20 yl:aan liuosta, jossa on 10 mM Tris-HCl pH 7,5 ja 0,5 mM EDTA.

32 10 P-leimattu EcoRI-Bglll-DNA-fragmentti pilkotaan osittain 0,2 yksiköllä Taql (Biolabs) 50 yl:n tilavuudessa 10 minuutin ajan 37°C:ssa. Reaktioseos säädetään pitoisuuteen 0,2 % SDS, 10 % glyserolia, 10 mM EDTA, 0,05 % bromifenoli-sinistä ja DNA-fragmentit erotetaan 6-%:sella polyakryyliamidigeelillä, 15 joka on valmistettu Tris-boraatti-EDTA-liuokseen (23). Auto-radiogrammista identifioidaan halutut EcoRI-TaqI:n sisältävät kaistat (suurempi osafragmentti). Tämä fragmentti (L, katso kuvio 3) uutetaan geelistä ja puhdistetaan (19) ja liuotetaan 10 yl:aan liuosta, jossa on 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA.

20 Akseptori-plasmidina käytetään pBR322, joka on pilkottu Clal: llä ja EcoRI:llä, 2 yg pBR322 pilkotaan 4 yksiköllä Clalrtä (Biolabs) 20 yl:n reaktiotilavuudessa 60 minuutin ajan 37°C: ssa. Proteiini uutetaan fenolilla ja sen jälkeen DNA saostetaan 2 tilavuudella etanolia -80°C:ssa 10 minuutin kuluessa. 25 DNA kerätään sentrifugoimalla ja sen jälkeen pilkotaan 10 yksiköllä EcoRIrtä (Biolabs) 30 minuutin ajan 37°C:ssa 20 yl:n reaktiotilavuudessa. Tämän jälkeen liuokseen lisätään 2 tilavuutta 0,1 M Tris.HCl (pH 8,7) ja inkuboidaan 1 yksikön kanssa vasikan sisäelinten alkalista fosfataasia (Boeh-30 ringer) 30 minuutin ajan 37°C:ssa. Fosfataasi inaktivoidaan sen jälkeen inkuboimalla 65°C:ssa 60 minuutin ajan.

100 ng akseptori-plasmidia inkuboidaan 2 tunnin ajan 5 yl:n 90787 65 kanssa fragmenttia L-DNA 15 yl:n reaktiotilavuudessa, jossa on 10 mM MgCl2, 20 mM Tris.HCl (pH 7,8), 10 mM DTT, 0,5 mM ATP, ja 30 yksikköä reaktiotilavuuden yl:aa kohti DNA-ligaasia (Biolabs).

5 5 yl tätä liuosta lisätään seokseen, jossa on 150 yl kalsium- kloridilla käsiteltyjä E. coli HB101-soluja (14) liuoksessa, jossa on 10 mM MgCl2, 10 mM CaCl2 ja 10 mM Tris.HCl (pH 7,5) kokonaistilavuuden ollessa 200 yl. Seosta jäähdytetään 20 minuuttia jäissä, kuumennetaan 1 minuutissa 42°C:seen ja in-10 kuboidaan 10 minuuttia 20°C:ssa. Lisätään 1 ml tryptoni-kasvu-alustaa(tryptoni-kasvualusta sisältää 10 g Bacto-Tryptonia (Difco); 1 g hiivauutetta (Difco); 1 g glukoosia? 8 g NaCl ja 294 mg CaCl2.2 H20 1 litrassa tislattua vettä) ja seosta inkuboidaan 30 minuuttia 37°C:ssa, samalla ravistaen 300 15 kierr./min . Seos levitetään kahdelle agarmaljalle (McConkey Agar, Difco; 0,6 ml/malja), johon on lisätty 50 yg/ml:a am-pisilliinia (Sigma). Levyjä inkuboidaan 12-17 tuntia 37°C:ssa.

10 erilaisen pesäkkeen plasmidi-DNA eristetään seuraavalla tavalla: 20 Pesäkkeillä siirrostetaan 10 ml tryptoni-kasvualustaa, joka on täydennetty 50 yg:lla/ml ampisilliinia, kuten edellä, 25 ml:n erlenmeyerkolvissa. Viljelmiä ravistellaan 15-18 tuntia 37°C:ssa ja 300 kierr./min. Solut erotetaan sentri-fugoimalla (Sorval, HS-4 roottori, 10 min. 4000 kierr./min., 25 4°C). Saadaan noin 0,1 g soluja ja nämä suspendoidaan uudes taan 1 ml:aan 50 mM Tris.HCl (pH 8,0). Lisätään 0,25 ml lysotsyymiliuosta (10 mg/ml 50 mM:ssa Tris.HCl (pH 8,0); lysotsyymia myy Sigma) ja inkuboidaan 10 minuuttia 0°C:ssa, jonka jälkeen lisätään 0,15 ml 0,5 mM EDTA (pH 7,5). Edel-30 leen 10 minuutin kuluttua 0°C:ssa lisätään 60 yl 2-%:ista Triton X-100 (Merck). 30 minuutin kuluttua 0°C:ssa sentri-fugoidaan koetin 30 minuuttia 15 000 kierr./min ja 4°C:ssa 6 6

Sorval SA-600 roottorissa. Supernatantti deproteinoidaan 1 tilavuudella fenolia (kyllästetty TNEthen). Faasit erotetaan sentrifugoimalla (Sorval HB-4 roottori) 10 minuutin ajan 5000 kierr./min ja 4°C:ssa. Ylempi faasi uutetaan kaksi ker-5 taa 1 tilavuudella kloroformia. Haiman RNAasi A:ta (sigma; 10 mg/ml TNE:ssä 10 min. kuumennetaan etukäteen 85°C:ssa) lisätään loppukonsentraatioon 25 yg/ml ja seosta inkuboidaan 40 minuuttia 37°C:ssa. Sen jälkeen liuos säädetään pitoisuuteen 1 M NaCl ja 10 % polyetyleeniglykoli 6000 (Fluka, käsi-10 tellään autoklaavissa 20 min., 120°C:ssa) ja inkuboidaan 2 tuntia -10°C:ssa. Sakka kerätään Sorval HB-4 roottorissa (20 min. 10000 kierr./min., 0°C:ssa) ja liuotetaan uudestaan 100 yl:aan TNE:tä. DNA-liuos uutetaan 1 tilavuudella fenolia ja DNA saostetaan 2 tilavuudella etanolia 10 min. -80°C:ssa. 15 Sakka kerätään sentrifugoimalla Eppendorf-sentrifuugissa ja DNA liuotetaan uudestaan 20 yl:aan liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl (pH 7,5) ja 0,5 mM EDTA. 10 ml:n viljelmästä saadaan 8-10 yg plasmidi-DNA:ta.

Plasmidi-DNA:t analysoidaan, kun on pilkottu seuraavilla re-20 striktioentsyymeillä:

Kulloinkin 0,5 yg plasmidi-DNA:ta pilkotaan Hpal:llä (Bio-labs) sekä Hpalrllä (Biolabs) ja EcoRIsllä (Biolabs), Clal: llä (Biolabs) entsyymivalmistajän antamien standardimenetelmien mukaan. DNA:t fraktioidaan 1-%:lla agaroosigeelillä, jo-25 ka on valmistettu liuokseen, jossa on 40 mM Tris-asetaattia (pH 7,8), 1 mM EDTA ja 0,5 yg/ml etidiumbromidia. Halutut plasmidit sisältävät Hpal-kohdan ja tuottavat 3-kertaisen katkaisun jälkeen suuren DNA-fragmentin lisäksi 2 pienempää fragmenttia, jotka ovat suurempia kuin pBR322:n pieni EcoRI-30 Clal-fragmentti. Yhdelle näistä plasmideista annetaan nimi p159 (katso kuvio 3).

Il 90787 67 B. Plasmidin pHRi145 rakentaminen 2 yg p159-DNA:ta pilkotaan 10 yksiköllä EcoRIitä (Biolabs) 30 minuutin ajan 37°C:ssa. DNA uutetaan fenolilla, seostetaan etanolilla ja sentrifugoinnin jälkeen liuotetaan 10 yl: 5 aan liuosta, jossa on 10 mM Tris.HCl (pH 7,5), 0,5 mM EDTA. EcoRI:llä katkaistu DNA käsitellään edelleen 5 yksiköllä DNA-polymeraasia (Klenow-fragmentti) (Boehringer) liuoksessa, jossa on 10 mM MgCl2» 10 mM β-merkaptoetanolia, 50 mM NaCl, 0,1 mM dATP (P & L Biochemicals), 0,1 mM dTTP (P&L Biochemi-10 cals) 15 minuutin ajan 12°C:ssa. Sen jälkeen polymeraasi inaktivoidaan inkuboimalla 85°C:ssa 5 minuutin ajan. Reaktio-seos laimennetaan 10-kertaisesti liuoksella, jossa on 20 mM Tris.HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP (Sigma), ja inkuboidaan 30 yksikön kanssa DNA-ligaasia per yl reak-15 tioseosta 1 tunti 15°C:ssa.

50 ng DNA:ta levitetään McConkey-agar-maljoille, joissa on transformoitua E.colia (kuten edellä on esitetty) ja 50 yg/ ml ampisilliinia.

Eristetään 10 erilaista pesäkettä kuten edellä esitettiin.

20 Plasmidi-DNA:t analysoidaan liittämällä EcoRIiteen. Halutut plasmidit ovat EcoRI-resistenttejä. Analyysi suoritetaan edellä esitetyllä tavalla. Yhtä halutuista plasmideista nimitetään HRi145 (kuvio 3).

C. Plasmidin pHRi148 rakentaminen 25 2 yg pHRil45-DNA:ta käsitellään 5 yksiköllä Clal:tä (Boehrin ger) 60 minuutin ajan 37°C:ssa, jonka jälkeen proteiini poistetaan uuttamalla fenolilla. DNA-saostetaan etanolilla, jonka jälkeen se liuotetaan 20 yl:aan liuosta, jossa on 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,5 mM EDTA. Ulostyöntyvät päät täydenne-30 tään edellä esitetyllä tavalla, DNA-polymeraasi I:llä (Kle- 68 now-fragmentti) , paitsi että dATP ja dTTP korvataan dCTP: llä (P&L Biochemicals) ja dGTP:llä (P&L Biochemicals). Polymeraasi inaktivoidaan inkuboimalla 85°C:ssa 5 minuutin ajan. Reaktioseokseen lisätään 2 tilavuutta 0,1 M Tris.HCl 5 (pH 8,7) ja inkuboidaan 0,5 yksikön kanssa vasikan fosfataa-sia (Boehringer) 30 minuutin ajan 37°C:ssa. Reaktioseokses-ta poistetaan proteiini fenoliuutolla. DNA-saostetaan etanolilla ja liuotetaan 8 yl:aan liuosta, jossa on 10 mM Tris. HC1 (pH 7,5) 0,5 mM EDTA.

10 Kemiallisesti syntetisoitu DNA-sidoksenmuodostaja jonka kaava on 5'-GAATTCCATGGTACCATGGAATTC-3' fosforyloidaan 5'-päässä siten, että 8 pmoolia sidoksenmuo- 32 ™ 1

dostajaa inkuboidaan 5 yCi:n kanssa(γ- ^p)ATP (5500 Ci.mmol Amersham) 8 yl:n reaktiotilavuudessa, joka sisältää 0,1 mM 15 rATP (Sigma), 50 mM Tris.HCl (pH 9,5), 10 mM MgCl2, 5 mM

DTT ja 2 yksikköä polynukleotidi-kinaasia (P&L Biochemi-vals), 30 minuutin ajan 37°C:ssa. Reaktio pysäytetään jäähdyttämällä -80°C:ssa.

Sen jälkeen radioaktiivisesti leimattu sidoksenmuodostaja 20 käsitellään 1 yg:lla Clalttä ja fosfataasilla ja liitetään pHRi145-DNA:hän (katso edellä ) 20 yl:n reaktiotilavuudes sa, joka sisältää 0,5 mM rATP (Sigma), 10 mM DTT (Calbiochem), 20 mM Tris.HCl (pH 7,8), 1 mM MgCl2, ja 800 yksikköä T4 DNA-ligaasia (Biolabs). Inkubointi suoritetaan 15°C:ssa 2 tun-25 nin ajan. Ligaasi inaktivoidaan inkuboimalla 85°C:ssa 10 minuutin ajan. Sen jälkeen lisätään 2 tilavuutta vettä, säädetään keittosuolaliuoksella pitoisuuteen 10 mM ja lisätään 30 minuutin kuluessa 37°C:ssa 20 yksikköä Kpnl:tä (Biolabs). Uutetaan fenolilla ja kloroformilla, jonka jälkeen seos frak-30 tioidaan 0,9-%:sella matalalla sulavalla agaroosigeelillä (Biorad), joka on valmistettu liuokseen, jossa on 40 mM Tris.asetaatti (pH 7,8), 1 mM EDTA ja 0,5 yg/ml etidium-

II

90787 69 bromidia. UV-säteilytyksellä nähtävissä oleva kaista, jolla on sama liikkuvuus kuin samansuuruisella merkki-DNA:lla, leikataan irti leikkausveitsellä. Geelipalaa sulatetaan 5 mi- o o nuuttia 65 C:ssa, jonka jälkeen se jäähdytetään 37 Csseen.

5 Saadaan noin 20 yl:n tilavuus. Otetaan 5 yl tätä liuosta ja inkuboidaan 12 tunnin ajan 15°C:ssa 400 yksikön kanssa T^-ligaasia (Biolabs) 10 yl:n reaktiotilavuudessa, joka säädetään pitoisuuteen 0,5 mM ATP, 10 mM DTT, 10 mM MgCl2, 20 mM Tris.HCl (pH 7,8). Ligaasi-seokseen (kiinteytyy 15°C:ssa) 10 lisätään 1/10 tilavuutta liuosta, jossa on 100 mM Tris.HCl (pH 7,5), 100 mM CaC^ ja 100 mM MgCl2/ ja inkuboidaan 65°C: ssa 5 minuutin ajan. Sen jälkeen liuos käytetään kalsiumilla käsiteltyjen (kuten edellä on esitetty) E.coli HB101-solujen transformointiin. Käytetään McConkey-agarmaljoja, joihin 15 on lisätty 50 yg/ml ampisilliinia.

Eristetään 10 eri pesäkkeen plasmidi-DNA:t, kuten edellä on esitetty, ja DNA:lie suoritetaan seuraavat restriktioentsyy-mianalyysit: Käytetään aina 0,5 yg plasmidi-DNA:ta, joka peräkkäin pilkotaan Kpnl:llä (Biolabs), NcoI:llä (Biolabs) 20 ja EcoRI:llä (Biolabs) entsyymivalmistajan suositusten mukaan. Pilkkomistuotteet fraktioidaan 1-%:isella agaroosi-geelillä, joka on valmistettu liuokseen, jossa on 40 mM Tris.asetaattia (pH 7,8) , 1 mM EDTA, b,5 yg/ml etidiumbro-midia. Kaikilla plasmideilla esiintyy kulloinkin yksi näistä 25 entsyymipilkkoniiskohdista, kuten halutaankin. Yhdelle annetaan nimi HRi148.

Plasmidi HRi148 sisältää tryptofaani-promoottori-operaatto-rin ja ribosomaalisen sidoskohdan aina ATG:hen asti. Hiru-diini kuten myös muut heterologiset geenit voidaan liittää 30 suoraan plasmidissa kerran esiintyvään EcoRI-, Ncol-, Kpnl-kohtaan. Lisäksi tämä rakenne tekee mahdolliseksi heterolo-gisten geenien suoran liittämisen ja ilmentymisen, ilman että translaation aloittamiseksi tarvittavan ATG:n täytyy esiintyä vastaavassa geenissä. Tämä voidaan helposti tehdä 70 pilkkomalla NcoI:llä ja täydentämällä ulkonevat päät DNA-po-lymeraasilla I, kuten on esitetty, tai pilkkomalla Kpnlrllä ja poistamalla ulkonevat päät nukleaasilla S1. Plasmidi HRi148 on siten laaja-alainen käyttökelpoinen ilmentymisplasmidi.

5 D. Linearisoidun vektorin pHRi148/EcoRI/BamKI valmistus 5 yg pHRi148:n plasmidi-DNA:ta pilkotaan restriktioendonuk-leaaseilla EcoRI ja BamHI. Poisleikattu vektori pHRi148/ EcoRI/BamHI eristetään tiheysgradienttisentrifugoimalla.

b) F^-DNA/EcoRI/EcoRII:n ja F2~DNA/BamHI/EcoRII:n valmistus 10 I -DNA/EcoRI/EcoRII:n valmistus 5 yg pML300:n plasmidi-DNA:ta pilkotaan ensin 10 yksiköllä EcoRI-restriktioendonukleaasia 50 yl:ssa liuosta, jossa on 100 mM Tris.HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl ja 100 yg/ml gelatiinia, I tunnin ajan 37°C:ssa. Osa (0,5 yg) tästä linearisoidusta 15 plasmidi-DNA/EcoRI:stä eristetään geelieluutiolla agaroosi- geelistä (vrt. esimerkki 10a) ja leimataan radioaktiivisesti (γ- P)ATP:llä (vrt. esimerkki 12). Sen jälkeen pääosa plas-midi-DNA/EcoRI:stä sekoitetaan tämän radioaktiivisesti leimatun DNA:n kanssa, pilkotaan EcoRII-restriktioendonukleaasil-20 la ja EcoRII-EcoRI* DNA-fragmentti (109 emäsparia) erotetaan geelieelektroforeesilla 8-%:isella polyakryyliamidilla. 200 yg F^-DNA/EcoRI*/EcoRIl:ta eristetään geelieluutiolla.

II F2-DNA/BamHI/EcoRII:n valmistus 5 yg pML305:n plasmidi-DNA:ta pilkotaan 10 yksiköllä BamHI-25 restriktioendonukleaasia. Osa (0,5 yg) tästä linearisoidusta plasmidi-DNA/BamHI:stä eristetään geelieluutiolla agaroosi-geelistä (vrt. esimerkki 10a) ja leimataan radioaktiivisesti n 32 71 90787 (γ- p)ATP:llä (vrt. esimerkki 12). Sen jälkeen pääosa plas-midi-DNA/BamHI:stä sekoitetaan tämän radioaktiivisesti leimatun DNA:n kanssa, pilkotaan EcoRII-restriltioendonukleaa-silla ja EcoRII-BamHI*-DNA-fragmentti (122 emäsparia) erote-5 taan geelielektroforeesilla 8-%:isella polyakryyliamidilla.

250 yg F2~DNA/BamHI*/EcoRII:ta eristetään.

c) F^-DNA:n liittäminen F2~DNA:han ja ilmentymisplasmi-din pML310 rakentaminen 10 ng (= 473 nmoolia päitä) F^-DNA/EcoRI/EcoRII ja 9 ng 10 (=495 nmoolia päitä) F2_DNA/NamHI/EcoRII käsitellään 20 yl:n tilavuudessa T^-DNA-ligaasilla, kuten edellä esimerkissä 10c) kuvataan. Sen jälkeen seos uutetaan fenoli/kloroformilla ja DNA saostetaan alkoholilla. Sen jälkeen DNA-sakka liuotetaan esimerkissä 10c) esitetyllä tavalla ja pilkotaan EcoRI- ja 15 BamHI-restriktioendonukleaaseilla. Sitten liuos säädetään TNE-pitoisuuteen ja lisätään 30 ng (= 50 nmoolia päitä) vektori-DNA pHR148/EcoRI/BamHI (vrt. esimerkki 13aD). Sen jälkeen liuos uutetaan fenoli/kloroformilla ja DNA saostetaan alkoholilla. Saostunut DNA-seos käsitellään, kuten 20 esimerkissä 10c) on esitetty, T^-DNA-ligaasilla (Bioläbs). Tällä tavalla muodostuu liuokseen yhdistelmäplasmidi, joka sisältää F^-F2~DNA:n (desulfatohirudiinigeenin) inserttinä.

d) E.coli HB101-solujen transformointi plasmidilla pML310

Kalsiumilla käsiteltyjen E.coli HB101-solujen transformoin-25 ti tapahtuu esimerkissä 10d) kuvatulla tavalla. Käytetään 10 yl esimerkissä 13c) saatua reaktioseosta. Saadaan 420 ampisilliini-resistenttiä pesäkettä.

e) F^-Fj-DNAsn sisältävien pesäkkeiden seulonta 18 transformoituneesta pesäkkeestä (esimerkki 13d) testa- 72 taan niiden -F2~DNA-pitoisuus, kuten esimerkissä 10e) kuvataan- Radioaktiivisena koettimena käytetään esimerkeissä 5 ja 6 kuvattujen oligodeoksinukleotidien seosta. Autoradio-grammi sisältää 12 positiivista pesäkettä, joista viidelle 5 annetaan nimet pML310, pML311, pML312, pML313, pML314.

Esimerkki 14: Kloonin pML310 karakterisointi F1-F2“DNA-sekvenssin karakterisointi yhdistelmäplasmidissa pML310 tapahtuu sekvensoimalla F^-F2_DNA menetelmällä, jonka ovat esittäneet Maxam ja Gilbert (11), kuten esimerkissä 12 10 kuvataan. Testataan 10 yg plasmidi-DNA:ta. F^-F2~DNA:n nuk-leotidisekvenssi on identtinen kuvatun synteettisen desulfa-tohirudiinigeenin kanssa.

Esimerkki 15: Ilmentymisplasmidin pML315 valmistus a. F^-DNA:n liittäminen F2~DNA:han ja ilmentymisplasmi- 1 5 din pML315 rakentaminen 24 yg (= 1,3 pmoolia päitä) tai 26 yg (= 1,3 pmoolia päitä) kemiallisesti syntetisoitua F^- tai F2~DNA:ta (katso esimerkki 8 ja kaavio I) pilkotaan 5 yksiköllä EcoRII-restriltio-endonukleaasia (Biolabs) 20 yl:n tilavuudessa, jossa on 50 20 mM Tris.HCl (pH 8), 5 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 100 yg/ ml gelatiinia, 30 minuutin ajan 37°C:ssa. Sen jälkeen seos uutetaan fenoli/kloroformilla ja DNA saostetaan alkoholilla. DNA-sakka liuotetaan esimerkissä 10c) esitetyllä tavalla ja käsitellään T^-DNA-ligaasilla kolmen tunnin ajan 15°C:ssa.

25 Sen jälkeen seos uutetaan fenoli/kloroformilla ja saostetaan esimerkissä 10b) esitetyllä tavalla. DNA-sakka liuotetaan (vrt, esimerkki 10c) ja pilkotaan EcoRI- ja BamHI-restrik-tioendonukleaaseilla 30 minuutin ajan 37°C:ssa. Sen jälkeen lisätään 70 ng (= 0,1 pmoolia päitä) linearisoidun vektorin 30 pHRil48/EcoRI/BamHI-liuosta (esimerkki 13aD), koko liuos 90787 73 säädetään TNE-pitoisuuteen ja uutetaan fenoli/kloroformilla ja DNA saostetaan 2 tilavuudella alkoholia.

Saatu DNA-sakka, joka sisältää molemmat DNA-rakenneosat (FΊ-F2“DNA/EcoRI/BamHI ja pHRil48/EcoRI/BamEI), liuotetaan 5 20 yl:aan liuosta, jossa on 50 mM Tris.HCl (pH 7,8), 10 mM

MgC^» 10 mM DTT, 0,5 mM ATP, 100 yg/ml gelatiinia, ja käsitellään 15 yksiköllä/yl T^-DNA-ligaasia (Biolabs) 15°C:ssa 3 tuntia. Tällä tavalla muodostuu liuokseen yhdistelmäplasmi-di pML315, joka sisältää F^-F2~DNA:n (=desulfatohirudiinigee-10 nin).

b) E.coli HB101-solujen transformointi plasmidilla pML315

Kalsiumilla käsiteltyjen E.coli HB101-solujen transformoin-tiin käytetään 10 yl plasmidin pML315 sisältävää seosta (esimerkki 15a). Saadaan noin 236 ampisilliini-resistenttiä pesä-15 kettä.

c) F^-F2-DNA:n sisältävien pesäkkeiden seulonta

Transformoiduista pesäkkeistä (esimerkki 15b) testataan F^-F2~DNA:n esiintyminen, kuten esimerkissä 13e) esitetään.

Saadaan 5 positiivista pesäkettä, joita merkitään pML315-20 pML319.

Esimerkki 16: Ilmentymisplasmidin pML320 valmistus

a. Synteettisen F^-F2~DNA:n liittäminen vektori-DNA

pHRil48/EcoRI/BamHI:hin.

20 yg täysin synteettisesti valmistettua desulfatohirudiini-2? geeniä (F1-F2'-DNA, vrt. esimerkki 9) pilkotaan 20 ylrssa liuosta, jossa on 100 mM Tris.HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl ja 74 100 yg/ml gelatiinia, restriktioentsyymillä EcoRI ja sen jälkeen BamHI:lla. Liuos säädetään TNE-pitoisuuteen, jonka jälkeen lisätään 30 yg (= 50 nmoolia päitä) vektori-DNA pHR i148/EcoRI/BamHI:tä (vrt. esimerkki 13aD). Liuos uutetaan fe-5 noli/kloroformilla ja DNA saostetaan alkoholilla. DNA-sakka käsitellään, kuten esimerkissä 10c) esitetään,Τ^-DNA-ligaa-silla (Biolabs). Tällä tavalla liuoksessa muodostuu yhdis-telmäplasmidi (pML320), joka sisältää F^-F2~DNA:n (Hirudii-nigeenin) inserttinä.

10 b. E. coli HBIOI-solujen transformointi plasmidilla pML320

Kalsiumilla käsiteltyjen E. coli HB101-solujen transformointi tapahtuu kuten esimerkissä 10d) esitetään. Käytetään 10 yl esimerkissä 16a) saatua reaktioseosta. Saadaan 173 ampisil-liiniresistenttiä pesäkettä.

15 c. F^-F2~DNA:n sisältävien pesäkkeiden seulonta 11 transformoidusta pesäkkeestä (esimerkki 16b) testataan, esimerkissä 10e) esitetyllä tavalla, niiden F^-F2~DNA-pitoi-suus. Radioaktiivisena koettimena käytetään esimerkeissä 5 ja 6 kuvattujen oligodeoksinukleotidien seosta. Autoradio-20 grammi sisältää 14 positiivista pesäkettä. Viidelle niistä annetaan nimi pML320, pML321, pML322, pML323 ja pML324.

Esimerkki 17: Kloonien pML315 ja pML320 karakterisointi F^-F2~sekvenssien karakterisointi plasmideissa pML315 ja pML320 tapahtuu F^-F2~DNA:n sekvenssoinnilla menetelmän mu-25 kaan, jonka ovat esittäneet Maxam ja Gilbert (11), kuten esimerkissä 12 kuvataan. Molempien plasmidien DNA-inserttien nukleotidisekvenssit ovat identtiset synteettisen hirudiini-geenin kanssa.

90787 75

Esimerkki 18: Hirudiiniaktiivisuuden omaavien polypeptidien synteesi E.coli-soluilla, joissa on yhdistel-mähiru^diinigeenin sisältäviä plasmideja_ a. Hirudiiniaktiivisuuden omaavien polypeptidien synteesi 5 Jokaisesta 15 kloonista, joka sisältää yhdistelmädesulfato-hirudiini-geenin, nimittäin E. coll HB101 pML 310, E. coll HB101 pHL 311, E. coll HB101 pML 312, E. coll HB101 pML 313, E. coll HB101 pML 314, E- coll HB101 pML 315, E. coll HB101 pML 316, E. coll HB101 pML 317, E. coll HB101 pML 318,, E. coll HB101 pML 319, E. coll HB101 pML 320, E. coll HB101 pML 321, E. coll HB101 pML 322, E. coli HB101 pML 323, E. coll HB101 pML 324 testataan kyky tuottaa hirudiiniaktiivisuutta.

Tätä varten edellä mainittuja klooneja viljellään 5 ml:ssa L-elatusainetta yön yli (16 tuntia) 37°C:ssa ja 250 kierr./ 10 min. L-elatusaineella on seuraava koostumus:

Bacto-tryptonia 10 g

Bacto-hiivauutetta 5 g

NaCl 5 g glukoosia 5 g 15 ampisilliinia 0,1 g 1 ml tätä yön yli kasvatettua viljelmää siirretään seuraava-na päivänä 25 ml:aan M9-elatusainetta. M9-elatusaineella on seuraava koostumus: 76 Νβ2ΗΡ04·7Η*0 13,25 g KHjPO^ 3,0 g

NaCl 0.5 g NHy Cl 1,0 g

CaCl2*2H20 0,015 g

MgSO^·7H20 0,25 g kasaminohappoja 2·5 2 vitamiinia B-| 0,0099 g glukoosia 5,0 g ampisilliinia 8 ..... o

Viljellään 37 C:ssa ja 250 kierr./min. niin kauan, kunnes bakteerisuspension absorbanssi (°D623^ on noin 0,9-1,0. Sen jälkeen solut otetaan talteen (5 ml kasvavaa viljelmää) ja bakteerit suspendoidaan uudestaan 0,5 ml:aan liuosta, jossa 5 on 50 mM Tris.HCl (pH 8) ja 30 mM NaCl. Tämän jälkeen suspensio säädetään pitoisuuteen 1 mg/ml lysotsyymiä (Boehringer) ja laitetaan jäihin 30 minuutin ajaksi. Bakteerit rikotaan jäädyttämällä suspensio vuorotellen enstemäisessä typessä ja sulattamalla 37°C:ssa. Tämä toimenpide toistetaan 5 ker-10 taa, sen jälkeen seosta sentrifugoidaan 30 minuuttia 16 000 kierr./min. /4°C:ssa. Supernatantista tutkitaan desulfatohi-rudiinipitoisuus siten, että lisätään vasta-ainetta (vrt. esimerkki 18), supernatantti testataan HPLC:llä tai mitataan trombiini-inhibitio (15).

15 Saatiin seuraavat tulokset:

II

90787 77

Bakteeriuute Desulfatohirudiinin muodostus E. coll HB101 pML 310 4 E. coll HB101 pML 311 4 E. coll HB101 pML 312 + E. coli HB101 pML 313 + E. coli HB101 pML 31A 4 E. coll HB101 pML 315 4 E. coll HB101 pML 316 4 E. coll HB101 pML 317 4 E. coll HB101 pML 318 4 E. coll HB101 pML 319 4 E. coll HB101 pML 320 4 E. coll HB101 pML 321 4 E. coli HB101 pML 322 4 E. coli HB101 pML 323 4 E. coll HB101 pML 324 4 E. coli HB101 pHRl 148 (kontrolli) E. coli HB101 PBR322 (kontrolli) E. coli HB101 (kontrolli)

Esimerkki 19: Hirudiiniaktiivisuuden toteaminen

Noin 5-10 pl näytettä, joka sisältää hirudiiniaktiivisuuden omaavia polypeptidejä (vrt. esimerkki 18) lisätään tipoittain 2 nitroselluloosapaperille (1 cm ) (NZ) (BIORAD) ja kuivataan 5 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. Tämän jälkeen nitrosellu- loosapaperia inkuboidaan 1 tunti 37°C:ssa 3-%:isessa seeru-mialbumiiniliuoksessa, jossa on 0,1 M Tris.HCl (pH 8) ja 0,9 % NaCl.

Tämän jälkeen NZ pestään liuoksessa, jossa on 0,01 M Tris.

10 HC1 (pH 8) ja 0,9% NaCl, 30 minuutin ajan. Tällöin liuos vaihdetaan viisi kertaa. Sen jälkeen pesty NZ käsitellään 78 2 tunnin ajan 25°C:ssa 3-%:isessa seerumialbumiiniliuokses-sa, jossa on 0,01 M Tris.HCl (pH 8), 0,9% NaCl ja 2 yg/ml hirudiinin vasta-ainetta (kaniineista valmistettua tai mono-klonaalista vasta-ainetta). Sen jälkeen NZ pestään kuten edel-5 lä esitettiin.

Tämän jälkeen NZ käsitellään 2-3 tunnin ajan 25°C:ssa 3%: isella seerumialbumiiniliuoksella, jossa on 0,01 M Tris.HCl 125 (pH 8) ja 0,9% NaCl ja joka sisältää 0,2yCi/ml I-proteii-nia A (spesifinen aktiivisuus 89,8 yCi/mg) NEN). Sen jälkeen 10 NZ pestään taas edellä esitetyllä tavalla, kuivataan ja γ-las-kimessa (Multi Gramma, 1260 gammalaskija, LKB; Wallace) määritetään sitoutunut radioaktiivisuus, joka on nitroselluloo-sapaperissa olevan hirudiiniaktiivisuuden omaavan polypepti-din mitta.

15 Vaihtoehtoisessa menetelmässä suoritetaan edellä esitetylle näytteelle SDS-polyakryyliamidigeeli-elektroforeesi (PAGE) (vrt. (24)). PAGE-elektroferogrammi siirretään sähköimulla (Elektro-Blotting) nitroselluloosapaperiin. Sen jälkeen NZ käsitellään edellä kuvatulla tavalla ja/tai autoradiografoi-20 daan yön yli röntgenfilmi (Fuji) ne NZ:n kohdat, jotka sisältävät hirudiiniaktiivisuuden omaavia polypeptideitä, näkyvät filmillä mustina täplinä.

Esimerkki 20: Desulfatohirudiinin eristäminen ja puhdistami nen trombiinipylvään avulla 25 a. Polypeptidiliuoksen valmistaminen trombiinipylvästä varten 1 ml kasvustoa (saatu esimerkin 18 mukaisesti) jäähdytetään 4°C:seen ja solut erotetaan sentrifugoimalla (5000 kierr./min. 15 min., Sorvali RC 3B). Kirkas supernatantti 30 ei sisällä hirudiiniaktiivisuutta.

90787 79

Sen jälkeen solut suspendoidaan 12 mitään lyysointipuskuria )50 mM Tris.HCl pH 8, 30 mM NaCl). Tähän seokseen lisätään 15 mg lysotsyymiä (Boehringer) ja tätä seosta pidetään sen jälkeen 30 min, 4°C:ssa. Sitten solut rikotaan jäädyttämäl-5 lä 4 kertaa nestemäisessä typessä ja taas sulatetaan 37°C: ssa. Sen jälkeen sentrifugoidaan 30 min, 16 000 kierr./min., 4°C. Supernatantti sisältää hirudiiniaktiivisuuden. Sen jälkeen supernatanttiin (15 ml) liuotetaan 7,7 g kiinteää ammo-niumsulfaattia. Samean seoksen annetaan seistä 4°C:ssa 30 10 minuutin ajan, jonka jälkeen sentrifugoidaan (katso edellä). Kostea sedimentti liuotetaan 1 ml:aan 0,05 mM Tris.HCl pH 8 puskuria ja saadaan haluttu polypeptidiliuos.

b. Hirudiinin puhdistus trombiinipylväässä

Trombiinipylväs (pakatun kolonnin tilavuus 4 ml) tasapaino-15 tetaan 0,05 M Tris.HCl-puskurilla pH 8. Edellä saatu polypeptidiliuos laitetaan 5 ml:n annoksina 4°C:ssa pylvääseen liuottimen valutusnopeuden ollessa 7 ml/tunti. Sen jälkeen pestään 25 ml:lla 0,05 M Tris.HCl (pH 8). Ensimmäiset fraktiot sisältävät adsorboitumattomia polypeptideja, jotka hei-20 tetään pois. Sen jälkeen pylväs pestään 10 ml:lla 1,5 M

bentsamidiinia (Merck) (vrt. (25)) 0,05 M:ssa Tris.HCl (pH 8) ja saaduista fraktioista testataan hirudiiniaktiivisuus trom-biinitestillä (15) . Fraktiot, jotka sisältävät polypeptidit, määritetään mittaamalla OD_on . Fraktiot 25 ja 26 sisältä- 2 ö Unin 25 vät hirudiiniaktiivisuuden; niitä säilytetään -20°C;ssa tai jäähauteessa, kunnes työskentelyä jatketaan. Hirudiiniaktiivisuus nousee fraktiossa 25 20 yg:aan/ml ja fraktiossa 26 52 .pg:aan/ml. Sitten fraktiot dialysoidaan tai suola poistetaan Sephadex-G25 (Pharmacia) -pylväässä.

30 Tuotteen SDS-polyakryyliamidigeeli-elektroforeesi antaa tulokseksi molekyylipainon noin 7000-80000 daltonia ja tämän kokonaislukukertoja (oligomeerit).

80 c. Trombiinipylvään valmistus

Affi-Gel 10 (Bio Rad) pestään valmistajan ohjeiden mukaisesti kylmällä, tislatulla vedellä ja kytkentäpuskurilla pH 8,5 (0,1 M NaHC0^/Na2C02-liuos). Geelin 50-%:nen suspensio kyt-5 kentäpuskurissa (4 ml) siirretään muoviputkeen, sekoitetaan yhtä suuren määrän kanssa trombiiniliuosta (120 mg 4 ml:ssa kytkentäpuskuria) (Calbiochem) ja pyöritetään yön yli 4°C: ssa. Sen jälkeen geeli pestään kytkentäpuskurilla. Vielä aktiivisten kohtien sulkemiseksi geeli käsitellään 0,1 ml:11a 10 1 M etanoliamiini-HCl-liuosta (pH 8,0) per geeli 3 tunnin ajan 4°C:ssa, jonka jälkeen pestään fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella, joka sisältää 10 mM natriumatsidia per gee-li-ml ja tämän jälkeen pidetään 4°C:ssa. Kytkeytymisaste määritetään mittaamalla ekstinktio 280 nmrssa ja arvoksi saa-15 daan 15-30 mg hirudiinia/geeli-ml.

4 ml muodostunutta trombiinigeeliä käytetään valmistettaessa affiniteettipylväs.

Esimerkki 21:

Erilaisten E. coli-kantojen transformointi plasmidilla pML310 20 _ja transformoituneiden isäntäsolujen viljely_

Esimerkissä 10d) esitetyllä tavalla kannat E. coli JA221, E, coli LM1035 ja E. coli W3110A102 transformoidaan plasmidilla pML310. Transformoiduista pesäkkeistä testataan -F2~DNA:n esiintyminen, kuten esimerkissä 10e) kuvataan. Saa-25 daan kulloinkin 5, 3 tai 5 positiivista pesäkettä, joita merkitään seuraavalla tavalla: n 90787 81 E. coli .JA221 /pML310/l E. coll JA221/pML310/2 E. coli JA221/pML310/3 E. coli JA221/pML310/4 E. coli JA221/pML3l0/5 E. coli LM 1035/pML310/l E. coli LM 1035/pML310/2 E. coli LM 1035/pML310/3 E. coli W31l0A102/pML310/l E. coli w3110A102/pML310/2 E. coli W3110A102/pML310/3 E. coli W3110A102/pML310/4 E. coli W3110A102/pML310/5

Mainittuja klooneja viljellään modifioidulla M9-elatusai-neella, jonka koostumus on seuraava:

Na2HP04.7H20 9,0 g KH2P04 3,0 g

NaCl 0,5 g NH4C1 3,5 g

CaCl2.2H20 0,015 g

MgS04.7H20 0,25 g kasaminohappoja 7,0 g hiivauutetta 5,0 g vitamiinia 0,0099 g rauta-III-sitraattia 0,006 g MOPS (3-morfolinopropaani-1-sulfonihappoa) 34,0 g glukoosia 20,0 g ampisilliinia 0,1 g

Viljellään 37°C:ssa ja 180 kierr./min. niin kauan, että bak-teerisuspension absorbanssi (ODg2^) on noin 1. Sen jälkeen solut poistetaan (5 ml kasvatettua viljelmää) ja bakteerit suspendoidaan uudestaan 0,5 ml:aan liuosta, jossa on 50 mM

82

Tris.HCl (pH 8) ja 30 mM NaCl. Tämän jälkeen suspension pitoisuus säädetään 1 mg/ml lysotsyymiä (Boehringer) ja pidetään 30 minuuttia jäissä. Bakteerit rikotaan jäädyttämällä suspensio nestemäisessä typessä ja sulattamalla 37°C:ssa vuorotellen. 5 Tämä vaihe toistetaan 5-kertaa. Sen jälkeen seosta sentrifugoi-daan 30 minuuttia 16 000 kierr./min. 4°C:ssa.

Kaikki kloonit tutkitaan hirudiiniaktiivisuuden omaavien poly-peptidien muodostumisen suhteen, mittaamalla niissä trombii-ni-inhibitio (15). Kaikissa bakteeriuutteissa todetaan hiru-10 diiniaktiivisuutta (300-600 ng/ml viljelyliuosta).. Esimerkiksi määritetään seuraavat hirudiiniaktiivisuudet:

Kanta Hirudiini-aktiivisuus (vig/1 viljelyliuosta) E. coli LM1035/pML310/1 300 E. coli JA 221/pML310/1 500 15 E. coli W3110Δ102/pML310/1 600

Esimerkki 22: Transformoituneen kannan E. coli W3110A102/ pML310/l fermentointi 5000 litran käymisastias-_sa ja viljelmän jatkokäsittely_

Esimerkissä 21 kuvatulla tavalla, viljellään 5000 litran 20 käymisastiassa E. coli W3110Δ102/pML310/1-soluja 3000 litrassa modifioitua M9-ela_tusainetta, kunnes suspension absor-banssi (OD^j) on. saavuttanut arvon noin 10-13.

Kasvusto (pH 7,4) jäähdytetään 10°C:seen ja solut kerätään Alfa-Laval BRPX-207 keräyslaitteella. Kirkas supernatantti 25 ei sisällä hirudiiniaktiivisuutta ja se heitetään pois.

Lietteenpoiston aikana poistetaan lietettä jatkuvasti osittain lietetilasta lyysipuskurilla A (50 mM Tris.HCl, 30 mM NaCl, pH säädetään HCl:llä arvoon 8,0) ja lopuksi sentrifuu-gin säiliön sisältö (7 1) työnnetään ulos liettämällä täysin 30 lyysipuskurilla A. Saatu solumassa säädetään puskurilla A ti- li 90787 S3 lavuuteen 375 1 ja pH arvoon 7,6. Jäähdytetään 5-10°C:seen, jonka jälkeen suspensio lasketaan Dyno-myllyn (tyyppi KD5) läpi, mylly on varustettu 4,2 litralla lasihelmiä, joiden halkaisija on 0,5 - 0,75 mm. Tällöin solut rikkoutuvat. Näin 5 saatu suspensio säädetään etikkahapolla etikkahappopitoisuu- teen, joka on 2 % (til./til.) ja hämmennetään yön yli 10°C: ssa. Suspensiosta, jonka pH on 3,9, poistetaan liete edellä kuvatulla menetelmällä. Kirkas supernatantti, 300 litraa, konsentroidaan 35 litraan tiputuskalvohaihduttimessa (tunti- 10 kapasiteetti 60 litraa vettä). Hieman samea konsentraatti sentrifugoidaan ja näin saatu kirkas supernatantti diasuoda- tetaan ultrasuodatuslaitteessa DDS = Lab 35, joka on varus- 2 tettu GR 81 PP-membraanilla (pinta 2,5 m )2 % etikkahappoa tai 0,02 M Tris-HCl-puskuria (pH 7,5) vastaan. Lopputilavuus 15 on 31 litraa.

2 litran erä tätä kirkasta proteiiniliuosta laitetaan Sepha-dex G 50 F-pylvääseen (KS 370 Pharmacia), jonka pakatun kolonnin tilavuus on 96 litraa, pylväs on tasapaino!tettu 2 % etikkahapolla. 15 litraa eluaattia sisältää pääfraktiot, se haih-20 dutetaan ultrasuodatuksella ja sen jälkeen diasuodatetaan vettä vastaan. Näin saatu, kirkas, vesipitoinen liuos lyofili-soidaan. Työskentelyä voidaan jatkaa seuraavissa esimerkeissä kuvatulla tavalla.

Esimerkki 23; Kannan E. coli W3110Δ102/pML310/1 viljely 25 laboratoriomittakaavassa_

Kantaa E. coli W3110Δ102/pML310/1 inkuboidaan 37°C:ssa ja 200 kierr./min 24 tuntia ravistelukolvissa. Elatusaineella on seuraava koostumus (g/1):

Na2HP04.7H20 9,0 g KH2P04 3,0

NaCl 0,5

CaCl2 0,015

MgS04.7H20 0,25 84 rauta-(III)-sitraatti 0,006 MOPS 40 NH4C1 3,5 kasaminohapot 7,0 hiivauute 5,0

Cerelose (glukoosi) 20 ampisilliini 0,1

Elatusaineen pH-arvo on 6,54. Viljelyn kuluessa absorbanssi (ODgosnjj,) kohoaa arvoon 14,9.

Solut (50 ml kasvatettua viljelmää) erotetaan ja suspendoi-daan uudestaan 5 ml:aan liuosta, jossa on 50 mM Tris.HCl 5 (pH 8,0) ja 30 mM NaCl. Tämän jälkeen suspensiota ravistellaan 5 g:n kanssa jäähdytettyjä lasihelmiä (halkaisija 0,5 mm) tai lisäämällä lysotsyymiä (Boehringer), loppukonsentraatio 1 mg/ml, ravistellaan suurella intensiteetillä 30-45 minuutin aikavälein Multi-Tube Vortexer-laitteessa. 0,5 mitään 10 seosta lisätään 0,5 ml 2 % etikkahappoa ja seosta sentrifu-goidaan 20 minuuttia 4°C:ssa 12 000 kierr./min. supernatan-tista testataan hirudiiniaktiivisuus (trombiini-inhibitio). Trombiini-inhibitiotesti suoritetaan seuraavalla tavalla:

Testi perustuu siihen, että määritetään p-nitroaniliinin 15 entsymaattinen lohkaisu kromotsyymi-TH-substraatista (tosyy-liglysyyli-propyyli-arginiini-4-nitroanidili-asetaatti). Muodostunut p-nitroaniliini mitataan kolorimetrisesti 405 nmtssa (Dynatechen Micro-Elisa Auto Reader, Kloten). Testi suoritetaan mikrotitrauslevyillä, joissa on tasaiset pohjat 20 (Costar, Serocluster, luettelonto 3590). Reaktioaika on 2 tuntia 37°C:ssa lämpökaapissa. Testiä varten 20 yl määritettävää liuosta laimennetaan 30 yltlla täyttöpuskuria (0,2 M Tris.HCl pH 7,5, 1 M NaCl, 100 yg/ml naudan seerumialbu-miinia) ja lisätään 20 yl entsyymiliuosta (10 mg ihmisplas- 25 masta saatua lyofilisoitua trombiinia (Boehringer) liuotettuna 1 mitään kahdesti tislattua vettä ja laimennettuna noin

II

90787 85 1:4000 edellä mainitulla täyttöpuskurilla) ja 150 yl substraat-tiliuosta (20 ng kromotsyylmi TH:ta (Boehringer) liuotettuna 4 ml:aan kahdesti tislattua vettä ja laimennettuna 1:15 edellä mainitulla täyttöpuskurilla). Kaikki liuokset mitataan 5 sokea-liuosta vastaan, joka muodostuu 70 yl:sta täyttöpus- kuria (kts. edellä) ja 150 yl:sta substraattiliuosta, ja ent-syymikontrolliliuosta vastaan, joka muodostuu 50 ylrsta täyttöpuskuria, 20 yl:sta entsyymiliuosta ja 150 yl:sta substraattiliuosta. Entsyymikontrolliliuoksen OD405nm“ arvo 10 2 tunnin jälkeen 37°C:ssa antaa tulokseksi 100 %:n aktii visuuden ja arvon tulisi olla noin 0,8 - 0,2. Näytteen trom-biini-inhibitio (prosenteissa) lasketaan seuraavan kaavan mukaisesti 100 x nävtteen OD.nt.

%-trombiini-inhibitio = 100 ---—- entsyymikontrolliliuoksen OD405nm 15 Edellä esitetyn liuoksen trombiini-inhibitio on 49,7 % / 20 yl.

Esimerkki 24: Puhdistusmenetelmä hirudiiniyhdisteiden rikas- tamiseksi kasvustoista_

Esimerkissä 22 esitetyllä tavalla viljellään kantaa E.coli W3110Δ102/pML310/1 käymisastiassa. Sen jälkeen solut erote-20 taan, sentrifugoidaan alas ja konsentroitu supernatantti etikkahappokäsittelyn jälkeen ultrasuodatetaan ja dialysoi-daan. Tällä tavalla saadut liuokset voidaan puhdistaa esimerkiksi ioninvaihtokromatografisesti.

a) Anioninvaihtokromatografia MONO Q-pylväässä (Pharmacia) 25 trömbiinia inhiboivien fraktioiden saamiseksi_ 8,5 ml proteiiniliuosta (20 mM Tris.HCl pH 7,5/150 mM NaCl) laitetaan Mono Q-pylvääseen valmistajan Pharmacian kromato-grafiasysteemin avulla <"fast protein liquid chromatography" FPLC) ja eluoidaan seuraavissa olosuhteissa.

86

Kokeelliset olot: pylväs: Mono Q/ 4,6 mm x 150 mm; puskuri A: 20 mM Tris.HCl pH 7,5; puskuri B: 20 mM Tris.HCl/1 M NaCl. Lineaarinen suolagradientti: A. 9 ml:n kuluessa eluoidaan 15-%.:isella puskurilla B, 10,7 ml:n kuluessa B:n osuus ko-5 hoaa 70%:iin. AUFS 1,0 280 nm:ssa, 1 ml fraktiot.

Eluointitilavuudessa (fraktiot 1-10) erotetaan peräkkäin eluoituvien hirudiiniyhdisteiden suurempi proteiinihuippu. Fraktiot 17-23 osoittavat trombiini-testissä trombiini-in-hibitiota, joka on välillä 20-100 %, jolloin pääfraktio 10 (fraktiot 20 ja 21), jotka omaavat 92-prosenttisen inhibition, eluoidaan 500 mM:n NaCl-konsentraatiossa.

b) Anioninvaihtokromatografia DEAE-selluloosapylväässä hiru- diiniyhdisteiden rikastamiseksi_ 10 ml:lie dialysaattia suoritetaan anionivaihtokromatogra-15 fia DE 53 -pylväässä (valmistaja Whatman) pH-arvossa 7,5

(kromatografointiolosuhteet: pylväs 1 x 5 cm (10 ml). Elu-ointipuskuri A: 20 mM ammoniumasetaatti, 100 mM NaCl, pH

7,5. Eluointipuskuri B: 20 mM ammoniumasetaatti, 1 M NaCl, pH 4,0. Lineaarinen suolagradientti, aina 4 pylvästilaviiut-20 ta puskuria A vast. B). Hirudiiniyhdisteet eluoidaan pitoisuuteen 0,4 M NaCl. Osoitus suoritetaan trombiini-inhibitio-testillä.

c) Suolan poisto P-6 DG "Desalting Gel"-pylväässä (valmista- ja Bio-Rad)_ 25 110 ml dialysaattia (20 mM Tris.HCl, pH 7,5, konsentroitua proteiiniliuosta 2,6 litrasta supernatanttia) erotetaan samalla tavalla kuin esimerkissä 24b) on esitetty DE-53-pylväässä. Hirudiiniyhdisteet eluoituvat fraktioissa 46-52 (150 ml), ne erotetaan erilaisista, nopeammin eluoituvista 30 ei-aktiivisista proteiinihuipuista ja konsentroidaan pyörö-

II

90787 87 haihduttimessa noin 12 ml:aan. Näin saatu, kirkas proteiini-liuos laitetaan Biogel P-6 DG-pylvääseen ja eluoidaan vedellä.

Kokeelliset olosuhteet: Pylväs 2,5 x 9 cm, stationäärinen 5 faasi 45 ml Biogel P-6- DG Desalting Gel; läpivirtausnopeus 1,15 ml/min, 4,6 ml:n fraktiot. Suolapitoisuus voidaan testata mittaamalla johtokyky tai testaamalla hopeanitraatin avulla (AgCl-saostus). Pääosa aktiivisuudesta eluoituu fraktioissa 7 - 10, joka voidaan todeta trombiini-inhibitio-testillä.

10 Fraktiot 8-10 yhdistetään (13,5 ml),konsentroidaan pyöröhaih-duttimessa 1 ml:aan ja kirkas liuos laitetaan Sephadex G 50-fine-pylvääseen (Pharmacia), jonka pakatun kolonnin tilavuus on 160 ml, pylväs on tasapainotettu 1-prosenttisella etikka-hapolla.

15 d) Geelisuodatus Sephadex G 50 fine-pylväällä (valmistaja: Pharmacia)_

Kokeelliset olosuhteet: pylväs: Sephadex G50 fine (31 g), 2,5 cm x 64 cm, tilavuus 310 ml; liuotin: 1 % etikkahappo; läpivirtausnopeus 43 ml/tunti, 3,8 ml:n fraktiot. AUFS: 20 0,1 282 nm:ssa. Paperinsyöttö 3,0 cm/tunti. Eluoitu aktiivi suus testataan trombiini-inhibitiotestillä. 50 ml:ssa (fraktiot 39-52) saadut pääfraktiot eluoituvat nopeammin kuin ei-aktiiviset sivutuotteet. (Fraktiot 53-80). Aktiivisten fraktioiden trombiini-inhibitio kohoaa 80-100-prosentin inhibi-25 tioon.

e) Kationinvaihtokromatografia CM-selluloosalla aktiivisten lysaattien etukäteen rikastamiseksi 10 ml dialysaattia (20 mM Tris.HCl, konsentraatti (1:20) 200 ml:sta supernatanttia, pH säädetty arvoon 2,0 3 ml:11a 4 N HCl:ää) erotetaan kationinvaihtajalla (CM-selluloosa). Hirudiiniyhdisteet eluoituvat fraktioissa 4-8 saadussa elu- 88 ointitilavuudessa. Testaus tapahtuu trombiini-inhibitiotes-tillä. Fraktiot 5 ja 6 inhiboivat 89-prosenttisesti, vastaten 88 % per 20 yl eluaattia.

Kokeelliset olosuhteet: pylväs 1,5 x 8 cm, stationäärifaasi 5 19 ml CM-selluloosaa (los MZ-3146). Läpivirtausnopeus: 43

ml/tunti, 3,8 ml:n fraktiot. Lineaarinen suolagradientti puskuri A. 20 mM NH OAc, pH säädetty arvoon 2 4N HCl:llä, puskuri B: 200 mM NH^OAc, pH 6,5, aina 5 pylvästilavuutta, AUFS

1,0 282 nm:ssa.

10 Esimerkki 25: Transformoituneen kannan E. coli W3110A102/ pML310/l fermentointi ja kasvuston jatkokäsittely

Esimerkissä 22 esitetyllä tavalla viljellään käymisastiassa kantaa E. coli W3110Δ102/pML310/1 8 litrassa elatusainetta L 5 tunnin ajan, jolloin suspension absorbanssi (°Dg23^ saa~ 15 vuttaa arvon noin 5.

Kasvustosta (pH 7,2) alassentrifugoidut solut jäähdytetään 10°C:seen, rikotaan lysotsyymikäsittelyllä ja toistuvasti (4x) vuorotellen jäädyttämällä nestemäisessä typessä ja sulattamalla noin 30°C:seen. Näin saatu suspensio (2,5 1 ) lai-20 mennetaan 1,5%:sella etikkahapolla (2,4 1) ja hämmennetään 4°C:ssa 30 min. Saostuneet bakteeriproteiinit ja muut solun aineosat sentrifugoidaan 30 min. 4°C:ssa 900 kierr./min. Kirkas supernatantti 3,2 1 konsentroidaan pyöröhaihduttimessa (valm. Biichi) 320 ml:aan. Konsentraatti dialysoidaan yön yli 25 4°C:ssa 20 mM Tris.HCl-puskuria pH 7,5 vastaan ja heikosti samea dialysaatti sentrifugoidaan kauan. Lopputilavuus on 300 ml. Kirkas proteiiniliuos (0,02 M Tris.HCl pH 7) laitetaan dietyyliaminoetyyli-selluloosa-(DE 53 valm . Whatman) (20 g) pylvääseen, jonka pakatun kolonnin tilavuus 20 ml, 30 pylväs on tasapainotettu puskurilla A (puskuri A: 20 mM am-moniumasetaatti/100 mM NaCl, pH 7,5). Ensin pestään 1 pyi-västilavuudella (45 ml) vakiovirtauksessa (43 ml/h) ja sen 90787 89 jälkeen lineaarisella suolagradientilla, eluoiden kulloinkin viidellä pylväs-tilavuudella puskuria A ja vastaavasti puskuria B (puskuri B: 20 mM ammoniumasetaatti/4 M NaCl, pH 5,0).

100 ml:aan eluaattia sisältyvät trombiini-inhibitiotestissä 5 aktiiviset pääfraktiot (fraktiot 24-26), dialysoidaan yön yli 4°C:ssa 20 mM Tris.HCl-puskuria pH 7,5 vastaan ja sen jälkeen konsentroidaan pyöröhaihduttimessa 35°C:ssa 5 ml:n lopputilavuuteen.

Näin saatu, kirkas vesipitoinen liuos laitetaan Sephadex 10 G-50 fine-pylvääseen (Pharmacia), jonka pakatun kolonnin ti lavuus on 160 ml, pylväs (2,5 x 64 cm Biorad) on tasapaino!-tettu 5 % etikkahapolla. 50 mlraan eluaattia sisältyvä (fraktiot 5-7, virtausnopeus 50 ml/h, 25 min./fraktiot) pääaktii-visuus haihdutetaan pyöröhaihduttimessa, jonka jälkeen suori-15 tetaan käänteisfaasi-HPLC-erotus. Erä (500 jjl) yksittäistä fraktiota konsentroidaan "speed vac"-konsentraattorissa (valm. Savant) 1:10 ja käänteisfaasi-HPLC-analyysillä tutkitaan sen sisältämät desulfatohirudiini-yhdisteet. Liuokset sisältävät desulfatohirudiiniyhdisteitä. Fraktio 6 (18 ml) 20 sisältää prosentuaalisesti vähäisimmän määrän sivutuotteita ja se puhdistetaan edelleen puolipreparatiivisella käänteis-faasi-HPLC:llä.

Kokeelliset olosuhteet: Vydac 218 TP 510 RP-HPLC-pylväs, 10 x 250 mm; fraktion 6 erien määrät (200 pl 1:10 konsentroi-25 tua) erotusta kohti; AUFS 0,5 220 nm:ssa; läpivirtausnopeus: 2 ml/min. Eluentti: A: 0,1 % trifluorietikkahappo, B: ase-tonitriili/vesi 8:2 + 0,07 % trifluorietikkahappo, 1 min.

16% B, sen jälkeen 40 minuutin kuluessa B:n osuus nousee 64%:iin. Näin saadut fraktiot laimennetaan 1:1 vedellä ja 30 lyofilisoidaan. Jäännös muodostuu puhtaista desulfatohiru-diiniyhdisteistä.

Esimerkki 26: Kannan E. coli W3110Δ102/pML310/1 fermentoin-nista saadun tuoteseoksen analyysi_ 90

Esimerkin 25 mukaisesti saadut, trombiini-inhibitiotestissä aktiiviset fraktiot tutkitaan HPLC-analyysillä, kahdessa eri olosuhteessa.

a) Kokeelliset olosuhteet n:o 1: 5 Nucleosil (MN) C18, 5 pm RP-HPLC-pylväs, 4,6 x 120 mm; 50 pl hirudiini-yhdisteitä erotusta kohti, Att. 6 214 nm:ssa; läpi-virtausnopeus 1,2 ml/min; eluentti: A: 0,1 % trifluorietikka-happo, B: asetonitriili/vesi 8:2 + 0,07 & trifluorietikkahap-po, 2 min. 16 % B, sen jälkeen 30 minuutin kuluessa B:n osuus 10 nousee 64%:iin. Vastapaine: 107 baaria.

Yhden minuutin aikavälein kerätään fraktiot (yhteensä 30), jotka tutkitaan trombiini-inhibitiotestillä ja vasta-ainetestillä (vrt. esimerkki 19). Fraktiot 12-15 osoittautuvat aktiivisiksi. Lisäksi määritetään fraktion 14 aktiivisen hi-15 rudiiniyhdisteen aminohappokoostumus, N-pää ja C-pää. Tämä fraktio (n:o 14) on verrattavissa desulfatohirudiiniin, joka, kuten esimerkissä 28 kuvataan, saadaan saattamalla verijuo-tikkaista saatu luonnollinen hirudiini reagoimaan aryylisul-fataasi-entsyymin kanssa. Tulokset on esitetty seuraavassa 20 Taulukossa 1:

Taulukko 1: . Retentioaika Trombiini- Vasta-aine- fraktio (min) inhibitio (%) testi Δ (cpm)

Fr 12 11,75 + 35 +

Fr 13 12,50 ++ ♦

Fr 14 12,80 +♦ 79 + 13850

Fr 15 13,14 + 27 ♦ 12440 kontrolli - - 9-250 tesulfato- 12 .g tt 86 ♦ urudiini il 90787 91

Kontrollikannan E. coli Κ3110Δ102 ("Kontrolli") fraktiot eivät ole aktiivisia trombiini-inhibitiotestissä eivätkä vasta-ainetestissä. Tällaiset fraktiot saadaan viljelemällä transformoitumatonta kantaa E. coli W3110A102 samoissa olo-5 suhteissa, kuin esimerkissä 22 esitetään ja käsittelemällä kasvusto edelleen esimerkin 25 mukaisesti.

b.) Kokeelliset olosuhteet n:o 2: RP-HPLC-pylväs, Vydac 218 TP 5415 4,6 x 150 mn; 100 pl (1:10 kons.) , fraktiota 6 (vrt. esimerkki 25) erotusta kohti; 10 AUFS 0,1 214 nmrssa; läpivirtausnopeus 1,2 ml/min; eluentti: A. 0,1 % trifluorietikkahappo, B: asetonitriili/vesi 8:2+ 0,07 % trifluorietikkahappo. Gradientti: 2 min 16 % B, sen jälkeen 3 minuutin kuluessa B:n osuus nousee 20%:iin, sen jälkeen 15 minuutin kuluessa B:n osuus nousee 25%:iin, jonka 15 jälkeen 27 minuutin kuluessa B:n osuus nousee 64%:iin. Vasta-paine 160 baaria.

Seuraavassa taulukossa 2 on esitetty trombiini-inhibitiotestissä ja vasta-ainetestissä aktiiviset fraktiot. Taulukossa on lisäksi esitetty konsentraatiot NaCl:lle raM:ssa, jotka 20 vaaditaan fraktioiden eluoimiseksi Mono Q-pylväästä (anioni-vaihtokromatografia) (vrt. esimerkki 24a), sekä eräiden fraktioiden pitkäaaltoiset UV-absorptiovyöt (UV ^ ks)). Kaikil la fraktioilla on lisäksi positiivinen reaktio anti-hirudiini-vasta-aineella (virt. esimerkki 30) .

92

Taulukko 2:

Reten- lixnibiini^asta-aine FPLC UV(X ) saanto fraktio tioai- inhibitjA J1 2 3 4 5 6 7®"8 μ g te testi Δ/cp» *“ K*C1 n:° (»In.)

RP-HPLC

1 15,63 97,8 ± 2 16Ί96 350 223s,274 4 2 16,83 91,9 t 2 14*157 390 275 1.6 3 18,43 79,9 l 2 9*257 1 4 19,6 81,7 ± 5 11*877 420 1.5 5 20,6 50,4 t 5 7'647 460 1.5 6 21,53 66,1 ± 5 9*584 500 273 1.5 kontrolli - O 508 PB5- 66 puskuri

Desulfato- 15A5 97f3 ± 2 15*400 350 274 ca. 4 lirudiini

Esimerkki 27:

Kannan E. coli W3110Δ102/pML310/1 fermentoimalla saatujen desulfatohirudiiniyhdisteiden karakterisointi

Il

Hirudiiniyhdiste fraktiosta 14 (vrt. esimerkki 26, "Ko-5 keelliset olosuhteet n:o 1" Taulukko 1) tai fraktiosta 1 2 (vrt. esimerkki 26 "Kokeelliset olosuhteet n:o 2, Taulukko 2), 3 karakterisoidaan seuraavalla tavalla: 4 a) Aminohappokoostumuksen määrittäminen 5

Noin 2,5 pg hirudiiniyhdistettä hydrolysoidaan 6 N HClsllä 6 10 110°C:ssa 24 tunnin ajan, jonka jälkeen analysoidaan Chang et 7 al:n esittämällä menetelmällä (DABS-Cl-menetelmä) (Viite 31).

8

Hydrolysaatti sisältää seuraavan koostumuksen.

90787 93

Aminohappo Hydrolysaatti Aminohappo Hydrolysaatti

Asp 9,8 (9) Ile 1.8 (2)

Thr A,2 (A) Leu 3.9 (A)

Ser A,A (A) Tyr 1,5 (2)

Glu 12,6 (13) Phe 1 (1)

Pro 3,7 (3) Hie 1,1 (1)

Gly 9,3 (9) Lye 3,A (3)

Vai 3,5 (A) Met O (0) kystiini 2,2 (3) yhteensä (65) b) Osittaiset sekvenssianalyysit 5 yg (750 pmoolia) hirudiiniyhdistettä tutkitaan klassisella sekvenssianalyysillä Edmanin mukaisesti ja N-terminaaliset fenyylitiohydantoiini (PTH)-aminohapot määritetään RP-HPLC:llä.

5 Tulos: sykli 1 5 10 aminohappo Vai Vai Tyr Thr Asp n.b.Thr Glu Ser Gly sykli 11 15 aminohappo Gin Asn Leu n.b. Leu n.b. Glu 10 (n.b. ei määritetty).

Tutkitun, biosynteettiset hirudiiniyhdisteen N-terminaalinen sekvenssi on täten identtinen luonnollisen hirudiinin kanssa (viite 1).

c) C-terminaalisten aminohappojen määrittäminen karboksipep-tidaasi Y-hajotuksella 94 C-terminaalisten aminohappojen ajasta riippuva hajottaminen karboksipeptidaasilla Y tuottaa C-pään 60 65 - He - Pro - Glu - Glu - Tyr - Leu - Gin

Aminohappojen määrittäminen tapahtuu aminohappoanalysaatto- 6 3 5 rilla. Tällöin osoittautuu, että Tyr ei ole sulfatoitunut (desulfatohirudiini!).

Transformoituneen E. coli W3110Δ102/pML310/1-kannan fermen-toinnin päätuotteessa on kysymys desulfatohirudiinista , minkä myös rakennetiedot ja vertailu luonnon hirudiinista saa-10 tuun desulfatohirudiiniin osoittavat.

II Muiden käymistuotteiden rakennetta ei vielä ole täysin selvitetty. Fraktioissa 2-6 (vrt. taulukko 2) esiintyy määriteltyjä yhdisteitä, jotka HPLC- ja FPLC-arvojen sekä UV-absorptiomaksimien perusteella on riittävästi määritelty.

On varmaa, että näissä yhdisteissä esiintyy desulfatohiru-15 diinin kaltaisia yhdisteitä, jotka eroavat desulfatohirudii nista rakenteellisen mikroheterogeenisyytensä vuoksi (esim. eri tavalla kytketyneet S-S-sillat) tai modifikaatioilla N-tai C-päissä (esim. N-terminaalinen metionyyli-tähde tai N-terminaali on asyloitu, kuten formyloitu tai asetyloitu).

20 Myös kantojen E. coli LM1035/pML310/1, E. coli JA221/pML 310/1 ja E. coli HB101/pML310 fermentoinnissa voidaan desulfatohirudiini identifioida päätuotteena.

Esimerkki 28: Desulfatohirudiinin valmistus luonnollisesta hirudiinista vertailua varten 25 Luonnollinen hirudiini liuotetaan pitoisuuteen 2 mg/ml puskuria (0,1 M ammoniumasetaatti, pH 5,5). 20 yg:aan hirudiinia (10 yl liuosta) lisätään 100 yl aryylisulfataasin, josta suo-

II

90787 95 la on poistettu, (Boehringer)-liuosta, joka sisältää 16 yg aryylisulfataasia. Inkuboidaan 25°C:ssa ja reaktiota seurataan HPLC-analyyseillä. 6 tunnin inkuboinnin jälkeen yli 90% hirudiinista on desulfatoitunut. Muodostuneen desulfatohi--5 rudiinin retentioaika laskettuna esimerkissä 26 ("Kokeelliset olosuhteet a":) kuvatuissa olosuhteissa on 12,8 min ja esimerkissä 26 ("Kokeelliset olosuhteet b”) kuvatuissa olosuhteissa 15,45 min.

Aminohappokoostumus, sekvenssianalyysi Edman-hajotuksella ja 10 C-terminaalisten aminohappojen määrittäminen karboksipepti-daasi- Y-hajotuksella antaa tulokseksi desulfatohirudiinil-le odotetut arvot.

Esimerkki 29; Desulfatohirudiiniyhdisteiden ilmentyminen hiivassa (S. cerevisiae) .

15 Vieraan proteiinin ilmentyminen hiivassa vaatii tietyn ilmen-tymissysteemin. Sen tulee sisältää vahva hiivapromoottori, mieluimmin indusoitavissa oleva hiivapromoottori ja sopivat transkription lopetussignaalit plasmidivektorille, jolla hiivasolut voidaan transformoida. Vektori sisältää myös DNA-20 sekvenssit, mieluimmin hiiva 2y-sekvenssit, jotka takaavat kromosomien ulkopuolisen replikaation ja suuren kopiomäärän. Sen tulee lisäksi sisältää valintamerkki hiivalle, mieluimmin hiiva LEU2-geenille ja pBR322 DNA-sekvenssit, joissa on luennanaloituskohta ja valintamerkki, mieluimmin ampisillii-25 ni-resistenssigeeni, käytettäväksi E. colissa. Tällaisina vektoreina sopivia ovat muun muassa sukkulavektorit, jotka lisääntyvät E. colissa ja hiivassa.

Ilmentymissysteemi, joka täyttää nämä vaatimukset, on kuvattu eurooppalaisessa patenttihakemuksessa n:o 100,561 ja 30 esimerkein osoitettu tehokas ilmentyminen hiivassa. Vieraat geenit ilmentyvät hiivassa indusoitavissa olevan hapanfosfa-taasin PH05-promoottorin kontrolloimina.

96 PH05-promoottori, vieras geeni ja PH05-transkription lope-tuskohta ovat integroituneet sarjaan hiiva-vektorissa pJDB207, joka sisältää myös hiiva-2y plasmidin DNA-sekvens-sit, hiiva-LEU2-geenin, ampisilliini-resistenssigeenin ja 5 E. coli luennanaloituskohdan.

Ilmentymisplasmidi pJDB207R/PHO5-HIR valmistetaan seuraaval-la tavalla: a) pJDB207-vektorin fragmentin eristäminen 6 yg plasmidia pJDB207R/IF (a-3) (EP 100,561) pilkotaan täy-10 dellisesti restriktioendonukleaasilla BamHI. Muodostuneet DNA-fragment.it (6,85 ke ja 1,15 ke) saostetaan etanolilla ja otetaan 400 yl:aan liuosta, jossa on 50 mM Tris.HCl pH 8. Lisätään 4,5 yksikköä vasikan suoli-fosfataasia (Boehringer, Mannheim). Seosta inkuboidaan 1 tunti 37°C:ssa, jonka jäl-15 keen fosfataasi inaktivoidaan 65°C:ssa 1,5 tuntia. Liuos säädetään pitoisuuteen 150 mM NaCl ja sen jälkeen laitetaan DE52 (Whatman) anionvaihtopylvääseen (100 yl tilavuus), joka pylväs etukäteen on tasapainotettu liuoksella, jossa on 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA. Pestään kerran sa-20 maila puskurilla, jonka jälkeen DNA eluoidaan 400 yl:lla liuosta, jossa on 1,5 M NaCl, 10 mM Tris.HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, ja saostetaan etanolilla. Suuri 6,85 ke:n BamHI-frag-mentti erotetaan pienestä fragmentista 1,2-%:sella agaroosi-geelillä. Tris-boraatti-EDTA-puskurissa, pH 8,3.

25 b) 534 bp PH05 promoottori-fragmenttien eristäminen 6 yg plasmidia p31/R (EP 100,561) pilkotaan restriktioendo-nukleaaseilla EcoRI ja BamHI. Muodostuneet 3 DNA-fragmenttia erotetaan 1,2-%:isella agaroosigeelillä. Tris-boraatti-EDTA-puskurissa pH 8,3. 534 bp BamHI-EcoRI-fragmentti eristetään. 30 Se sisältää PH05-promoottorin mukaan luettuna transkriptio-aloituskohdat .

il 90787 97 c) Hirudiinia koodittavan sekvenssin sisältävän 206 bp DNA-fragmentin eristäminen 9 pg plasmidia pML310 (vrt. esimerkki 13c) pilkotaan täydellisesti restriktioentsyymeillä BamHI ja EcoRI. Muodostuneet 5 kaksi DNA-fragmenttia erotetaan 1,2-%:isella agaroosigeelillä. Tris-boraatti-EDTA-puskurissa pH 8,3. 206 bp EcoRI-BamHI-fragmentti eristetään.

g) DNA-fragmenttien liittäminen

Agaroosigeelipaloista saadaan elektroeluoimalla kolme koh-10 dissa a-c mainittua (katso edellä) DNA-fragmenttia, ne puhdistetaan DE52 (Whatman) anioninvaihtajassa, saostetaan etanolilla ja suspendoidaan uudestaan veteen.

0,1 pmoolia (0,45 pg) 6,85 ke BamHI vektori-fragmenttia, 0,3 pmoolia (0,1 pg) 534 bp BamHI-EcoRI PHQ5-promoottori-15 fragmenttia ja 0,25 pmoolia (34 ng) pML310:n 206 bp EcoRI-

BamHI-fragmenttia liitetään 15°C:ssa 16 tunnin ajan 15 piissä liuosta, jossa on 60 mM Tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 20 mM DTT, 1 mM ATP, 600 yksiköllä DNA-ligaasia (Biolabs).

g 24 transformoitunutta amp -pesäkettä kasvatetaan erikseen 20 LB-elatusaineessa, joka sisältää 100 pg/ml ampisilliinia. Plasmidi-DNA eristetään menetelmällä, jonka ovat esittäneet Holmes et ai. (32) ja analysoidaan Hindlll/EcoRI kaksoisleik-kauksella. Noin 600 emässuuruisen EcoRI-HindIII-fragmentin esiintyminen osoittaa, että kyseessä olevassa kloonissa PH05 25 promopttori-hirudiini-DNA-fragmentti on vektorissa oikeassa suunnassa transkriptiolopetussignaalin suhteen. Kuten oli odotettua noin 50%:ssa klooneista ovat inertit oikeassa suunnassa. Yhtä näistä klooneista nimitetään pJDB207R/PHO5-HIR.

e) Saccharomyces cerevisiae GRF18;n transformointi 30 Saccharomyces cerevisiae kanta GRF18 (a, his3-11 , his3-15, 98 p leu2-3, leu2-112, can ) transformoidaan plasmidilla pJDB207R/ PH05-HIR menetelmällä, jonka ovat esittäneet Hinnen et ai.

(12). Transformoituneet hiivasolut valitaan agarmaljoilla, joissa on hiiva-minimialustaa ilman leusiinia. Transformoitu 5 hiivapesäke eristetään ja merkitään Saccharomyces cerevisiae GRF.18/pJDB207R/PH05-HIR.

f) S. cerevisiae GRF18/pJDB207R/PHQ5-HIR:n kasvatus S. cerevisiae GRF18/pJDB207R/PHQ5-HIR soluja kasvatetaan 20 ml:ssa hiivaminimialustaa (Difco hiiva typpialusta, ilman 10 aminohappoja, johon on lisätty 2 % glukoosia ja 20 mg/1 L-histidiiniä) 30°C:ssa ravistellen, kunnes solutiheys on 3 x 7 10 solua/ml. Solut pestään 0,9-%:isessa NaCl:ssä, jonka jälkeen niitä käytetään ympättäessä 50 ml: matala-P^-minimi-alustaviljelmiä. Matala-P^-minimialusta vastaa koostumuksel-15 taan Difco-hiiva-typpi-emäs-alustaa (ilman aminohappoja), se sisältää kuitenkin 0,03 g/1 KI^PO^, 1 g/1 KCl, 10 g/1 L-as-paragiinia (NH^jSO^in, 2 % glukoosin ja 1 g/1 L-histidiinin sijasta. Viljelmää ympätään, kunnes solutiheys on 4 x 10^ solua/ml ja ravistellaan 30°C:ssa 24 tuntia 200 kierr./min.

20 g. S. cerevisiae GRF18/pJDB207R/PHQ5-HIR:n fermentoinnilla saadun tuoteseoksen analyysi

Solut erotetaan (vrt. esimerkki 29f) tavalliseen tapaan (vrt. esim. eurooppalainen patenttihakemus n:o 100,561). 1,5% etik-kahapolla käsitelty supernatantti sentrifugoidaan ja kulloin-25 kin 2 ml kirkasta liuosta kuivataan "Speed Vac" konsentraatto-rissa ja suurtyhjössä. Näytteet liuotetaan yksittäin 100 μΐ: aan vettä ja niille suoritetaan HPLC-analyysi (olosuhteet kuten esimerkissä 26a). Yksittäisten fraktioiden trombiini-inhibitio testataan. Fraktio, jonka retentioaika on 12,8 min, 30 omaa 89,6 % trombiini-inhibition. Aminohappokoostumuksen perusteella se on desulfatohirudiini.

Il 90787 99

Esimerkki 30; Monoklonaalisia anti-hirudiini-vasta-aineita sisältävät testipakkaukset hirudiinin määrittämiseksi/ kompetitiivinen radio-immunomääritys a. Monoklonaalisten anti-hirudiini-vasta-aineiden valmistus 5 A) Hiirten immunisointi

Lyofilisoidussa muodossa olevaa puhdasta hirudiinia (3 mg) liuotetaan pieneen määrään 0,1-%:ista etikkahappoa, jonka jälkeen täytetään 3 ml:aan fosfaattipuskuroidulla keittosuola-liuoksella. pH säädetään arvoon 7,2. Erät tätä antigeeniliuos-10 ta sekoitetaan yhtä suurien määrien kanssa täydellista Freun-din apuainetta tai fosfaattipuskuroitua suolaliuosta.

Naaras-Balb/c-hiirille (8 viikon ikäisiä, hankittu Sisselnin eläinfarmilta, Sveitsistä) injektoidaan suonensisäisesti 100 pi g hirudiinia liuoksena puskuroidussa suolaliuoksessa.

15 Neljä päivää myöhemmin otetaan perna fuusiota varten.

B) Hydridomien valmistus ja vasta-ainetesti

Hybridomasolujen valmistus tapahtuu fuusioimalla saadut pernasolut myeloomasolulinjan X63-Ag8.6.5.3 (26) kanssa. Tällöin 8 7 käytetään 10 pernasolua ja 10 myeloomasolua. Fusio suori-20 tetaan kuten viitteessä (27) esitetään.

Anti-hirudiini-aktiivisuus määritetään hybridomaliuoksissa radioimmunomäärityksen avulla (RIA, (28)).

C) Anti-hirudiini-vasta-aineen eristäminen ja puhdistaminen askites-nesteestä 25 Balb/c hiiret käsitellään etukäteen intraperitoneaalisesti 0,4 ml:lla Pristania (Carl Roth). Viikon kuluttua injektoidaan intraperitoneaalisesti 2 - 5 x 10^ kloonattua hybridoma-so-lua. Jokaiselta hiireltä otetaan toistuvasti askites-nestettä 1 00 ja jäähdytetään -80°C:ssa. Kerätyt nesteet yhdistetään ja sentrifugoidaan 30 min 4°C:ssa 16 000 kierr./min. Rasva poistetaan imemällä ja jäljelle jäävään Debri-vapaaseen superna-tanttiin lisätään tipoittain hitaasti, samalla jäähdyttäen 5 0°C:ssa, 0,9 tilavuusekvivalenttia kyllästettyä ammoniumsul-faattiliuosta. Saatu raaka immunoglobuliinifraktio jaetaan käyttäen 0,1 m Tris.HCl (pH 8,2) Sephacryl G 2000 (Pharmacia) pylvästä valmistajan ohjeiden mukaisesti. Aktiiviset fraktiot yhdistetään ja konsentroidaan Amicon XM50-suodattimella 10 (Amicon).

b. Testipakkaus kompetitiivista radio-immunomääritystä varten

Esimerkin 30 aC) mukaisesti valmistettu anti-hirudiinivasta-aineliuos laimennetaan fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PSB-liuos) konsentraatioon 1 yg/100 yl. 100 μΐ tätä liuosta 15 inkuboidaan 2 tunnin ajan 37°C:ssa muoviputkissa tai muovisilla mikrotitrauslevyillä, jolloin vasta-aine adsorboituu epäspesifisesti muovipinnalle. Muovipinnalla olevien, vielä vapaiden aktiivisten kohtien täyttämiseksi, käsitellään naudan-seerumialbumiini-liuoksella f-BSA-liuos) .

20 Näyteliuoksen tai standardiliuoksen laimennussarjaan BSA- liuoksessa lisätään aina 50 yl liuosta, joka on tunnetulla 125 tavalla (29) radioaktiivisella -jodilla leimattua hiru-diinia, jonka aktiivisuus 10 000 cpm / 50 yl, jonka jälkeen inkuboidaan muovipinnoilla 2 tuntia 37°C:ssa ja 12 tuntia 25 4°C:ssa. Putket tai mikrotitrauslevyt pestään fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella ja radioaktiivisuus mitataan. Hirudiinin pitoisuus näyteliuoksessa määritetään standardi-liuoksen avulla valmistetusta vertailukäyrästä.

Testipakkaus kuvattua radio-immunotestiä varten sisältää: 30 2 ml anti-hirudiini-vasta-aineliuosta esimerkistä 30aC), pi toisuus 1-10 mg/ml.

90787 101 100 ml fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS-liuos) 100 ml 0,3 % naudan suuremialbumiinia ja 0,1 % natriumatsi-dia PBS-liuoksessa (BSA-liuos) 2 ml radioaktiivista hirudiiniliuosta, jonka aktiivisuus on 5 200 000 cpm/ml 2 ml standardiliuosta, joka sisältää 100 ng/ml hirudiinia 1 ml:n muoviputket tai muoviset mikrolevyt

Esimerkki 31 ; Parenteraaliseen annostukseen tarkoitettu farmaseuttinen valmiste, joka sisältää desul-1 0 fatohirudiiniyhdistettä

Liuos, joka esimerkin 27 mukaisesti sisältää desulfatohiru-diiniyhdistettä, diasyloidaan 0,9-prosenttisista NaCl-liuos-ta vastaan. Liuoksen pitoisuus säädetään laimentamalla samalla NaCl-liuoksella 0,2 mg:aan/ml tai 2 mg:aan/ml. Tämä liuos 15 steriloidaan ultrasuodattamalla (membraaneissa 0,22 pm:n huokoset) .

Steriloidut liuokset ovat suoraan käyttökelpoisia, esim. las-kimonsisäiseen annostukseen. Samalla tavalla valmistetaan parenteraalisesti annostettavat liuokset, jotka sisältävät 20 esimerkin 27 mukaisten desulfatohirudiini-yhdisteiden seoksia.

102

Kirjallisuusviitteet; 1. J. Dodt et el., FEBS Lettere 165, 180 (1984) 2. P. Walsroann et el., Pharmazie 36, 653 (1981) 3. S.A. Narang, Tetrahedron 39, 3 (1983) 4. K.L. Agarwal et ai., Angew. Chem. f^4, 489 (1972) 5. C.B. Reese, Tetrahedron 34, 3143 (1972) 6. R.L. Letsinger ja W.B. Lunsford, J. Am. Chem. Soc. 98, 3655 (1976) 7. K. Itakura et ai., J. Am. Chem. Soc. 103, 706 (1981) 8. H.G. Khorana et ai., J. Biol. Chem. 251, 565 (1976) 9. S.A. Narang et ai.. Anal. Blochem. 121, 356 (1982) 10. K. Itakura et ai., J. Biol. Chem. 257, 9226 (1982) 11. A.M. Maxam ja W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 7jUt 560 (1977) ; katso myös Meth. Enzym. 65, 499 (1980) 12. A. Hinnen et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75, 1929 (1978) 13. Anagnostopoulos et ai., J. Bacteriol. ΙΠ, 741 (1961) 14. M. Mandel et ai., J. Mol. Biol. 53, 159 (1970) 15. H.U. Bergmeyer (Hrsgb.), Methods of Enzymatic Analysis, Voi. II, 3. painos S. 314-316, Verlag Chemie, Weinheim 1983.

16. F. Markvardt et ai., Thromb. Haemostasis 42, 226 (1982) 17. Köhler ja Milstein, Nature 256, 495 (1975) 18. Molecular Cloning, A Laboratory Manual (ed. T. Maniatis et al.), Cold Spring Harbor Lab., 1982, S. 125 19. W. Muller et al., J. Mol. Biol. 124, 343 (1978) 20. M. Grunstein ja D.S. Hogneas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3961 (1979) 21. Ish-Horowitz, in loc. cit. 18), S. 368 22. DE-OS 3 111 405 (Genentech) 23. A.C. Peacock et al.. Biochemistry 6, 1818 (1967) 24. U.K. Laemmli, Nature 227, 680 (1970) 25. P. Walsmann, Pharmazie 36, 860 (1981) 26. J.F. Kearney et al., J. Immunol. 123, 1548 (1979) 27. S. Alkan et al.. Mol. Immunol. 20, 203 (1983) 28. T. Chard, An Introduction to Radioimmunoassay and related Techniques, North-Holland Pubi. Comp., Amsterdam 1978

II

90787 103 29. A.E. Bolton ja W.M. Hunter. Biochem. J. 1JI3, 529 (1973) 30. J. Clarke ja J. Carbon, J. Mol. Biol. 120, 517 (1978) 31. J.Y. Chang et al., Methods in Enzymology, 91, 41 (1983) 32. D.S. Holmes et al.. Anal. Biochem. 114, 193 (1981)

Claims (4)

1. Ilmentymisvektori, tunnettu siitä, että se sisältää desulfatohirudiinia, jonka aminohapposekvenssi on ValValTyrThrAspCysThrGluSerGlyGlnAsnLeuCysLeuCysGluGlySerAsnValCys GlyGlnGlyAsnLysCysIleLeuGlySerAspGlyGluLysAsnGlnCysValThrGlyGluGly ThrProLysProGlnSerHisAsnAspGlyAspPheGluGluIleProGluGluTyrLeuGln koodittavan DNA-sekvenssin, jota E. colin tai hiivan ilmentymisenohjaussekvenssi säätelee siten, että tällä ilmentymisplasmidilla transformoituneet E. coli- tai hiivasolut tuottavat desulfatohirudiinia.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen ilmentymisvektori, tunnettu siitä, että ilmentymisenohjaussekvenssi on E. colin tryptofaanioperonin tai hiiva-PH05-geenin ilmentymisenohjaussekvenssi.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen ilmentymisvektori, tunnettu siitä, että se soveltuu desulfatohiru-diinin ilmentämiseen jossakin Saccharomvces cerevisiae-kannassa.

4. Menetelmä desulftohirudiinin, jonka aminohapposekvenssi on ValValTyrThrAspCysThrGluSerGlyGInAsnLeuCysLeuCysGluGlySerAsnValCys GlyGlnGlyAsnLysCysIleLeuGlySerAspGlyGluLysAsnGlnCysValThrGlyGluGly ThrProLysProGlnSecHisAsnAspGlyAspPheGluGluIleProGluGluTyrLeuGln ja sen suolojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 1 mukaisella ilmentymisplasmidilla transformoituja Ej. coli- tai hiivasoluja viljellään nestemäisessä elatusaineessa, joka sisältää assimiloituvia hiili- ja typpilähteitä, ja desulfatohirudiini eristetään, ja saatu suola muutetaan haluttaessa vapaaksi polypeptidiksi tai saatu polypeptidi suolakseen. Il 1 05 90787 Pat.ent.krav: