JPH037583A - 部分的二本鎖オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドの形成方法 - Google Patents
部分的二本鎖オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドの形成方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は新規な二本鎖のオリゴヌクレオチド及び該オリ
ゴヌクレオチドの形成方法に関する。
ゴヌクレオチドの形成方法に関する。
また、さらに本発明は標識された二本鎖オリゴヌクレオ
チド及び該オリゴヌクレオチドを形成する方法にも好適
に利用されうる形成方法に関する。
チド及び該オリゴヌクレオチドを形成する方法にも好適
に利用されうる形成方法に関する。
近年の遺伝子操作技術の発達により、成る特定の遺伝子
をクローニングし、それを大腸菌または、枯草菌等で発
現させ、大量に遺伝子産物である蛋白質を得ることが可
能になった。この方法では増殖の早い菌に蛋白質を産生
させるために、本来、酵素で精製分離等が困難な蛋白質
をも容易にしかも大量に得られるという利点があり、工
業的には低コスト化が可能になる。
をクローニングし、それを大腸菌または、枯草菌等で発
現させ、大量に遺伝子産物である蛋白質を得ることが可
能になった。この方法では増殖の早い菌に蛋白質を産生
させるために、本来、酵素で精製分離等が困難な蛋白質
をも容易にしかも大量に得られるという利点があり、工
業的には低コスト化が可能になる。
しかし、一方、どのような蛋白質でも同じ方法でうま（
発現できるとは限らない。そのような場合に、所望の蛋
白質の構造遺伝子の塩基配列を宿主である、例えば、大
腸菌でよく使用されるコドンに置き換えて合成遺伝子を
構成することにより、発現可能になった例も多い。
発現できるとは限らない。そのような場合に、所望の蛋
白質の構造遺伝子の塩基配列を宿主である、例えば、大
腸菌でよく使用されるコドンに置き換えて合成遺伝子を
構成することにより、発現可能になった例も多い。
また、最近では蛋白質を改変し、その機能とアミノ酸配
列の関連を調べたり、より高機能にする試みがなされて
いる。このような場合、あらかじめその蛋白質の構造遺
伝子に、アミノ酸配列は変えずに、可能な限りの制限酵
素切断部位を導入した遺伝子を構築し、それを合成し、
発現させて、その後導入された制限酵素切断部位を利用
して一部を入れ替え、蛋白質を改変する場合が多い。
列の関連を調べたり、より高機能にする試みがなされて
いる。このような場合、あらかじめその蛋白質の構造遺
伝子に、アミノ酸配列は変えずに、可能な限りの制限酵
素切断部位を導入した遺伝子を構築し、それを合成し、
発現させて、その後導入された制限酵素切断部位を利用
して一部を入れ替え、蛋白質を改変する場合が多い。
現在、行なわれている遺伝子（以下本件では二本鎖オリ
ゴヌクレオチドという。）合成方法に、例えば、所望の
ＤＮＡの各鎖を１００ ｍ ａ ｒ以下に分けて、ＤＮ
Ａ合成装置で合成し、アニーリングによって二本鎖にす
る方法もしくはそれら二本鎖にしたあとで、それぞれ順
番に並ぶように連結する方法がある。具体的に説明する
と、１００塩基対の二本鎖オリゴヌクレオチドを合成し
ようとする場合、１００ ｍ ｅ ｒのオリゴヌクレオ
チドを２本合成し、次に、それぞれ相補的なオリゴヌク
レオチド同士をアニールし、二本鎖を形成させたり、も
しくは２００塩基対の二本鎖オリゴヌクレオチドを合成
しようとする場合、１００ｍｅｒのオリゴヌクレオチド
を４本合成し、次にそれぞれ相補的なオリゴヌクレオチ
ド同士をアニールし、二本鎖を形成させ、該二本鎖の２
組を連結させた力、５００塩基対の遺伝子を合成しよう
とする場合、１００ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを１０
本合成する。次に、それぞれ相補的なオリゴヌクレオチ
ド同士をアニールし、二本鎖を形成させ、連結する等の
方法がとられている。
ゴヌクレオチドという。）合成方法に、例えば、所望の
ＤＮＡの各鎖を１００ ｍ ａ ｒ以下に分けて、ＤＮ
Ａ合成装置で合成し、アニーリングによって二本鎖にす
る方法もしくはそれら二本鎖にしたあとで、それぞれ順
番に並ぶように連結する方法がある。具体的に説明する
と、１００塩基対の二本鎖オリゴヌクレオチドを合成し
ようとする場合、１００ ｍ ｅ ｒのオリゴヌクレオ
チドを２本合成し、次に、それぞれ相補的なオリゴヌク
レオチド同士をアニールし、二本鎖を形成させたり、も
しくは２００塩基対の二本鎖オリゴヌクレオチドを合成
しようとする場合、１００ｍｅｒのオリゴヌクレオチド
を４本合成し、次にそれぞれ相補的なオリゴヌクレオチ
ド同士をアニールし、二本鎖を形成させ、該二本鎖の２
組を連結させた力、５００塩基対の遺伝子を合成しよう
とする場合、１００ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを１０
本合成する。次に、それぞれ相補的なオリゴヌクレオチ
ド同士をアニールし、二本鎖を形成させ、連結する等の
方法がとられている。
上記二本鎖のオリゴヌクレオチドを作成するにあたりで
は、−本鎖のオリゴヌクレオチドが１００ ｍ ｅ ｒ
以下であるなら、それぞれ二本合成し、アニーリングに
よって二本鎖に形成させなくても、プライマー伸展法に
より、二本鎖を形成させることができる。
は、−本鎖のオリゴヌクレオチドが１００ ｍ ｅ ｒ
以下であるなら、それぞれ二本合成し、アニーリングに
よって二本鎖に形成させなくても、プライマー伸展法に
より、二本鎖を形成させることができる。
具体的には１００塩基対の二本鎖オリゴヌクレオチドを
合成する場合、１００ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを一
本合成し、それを鋳型とし、また別に該オリゴヌクレオ
チドと相補的な配列を持つ８塩基以上のオリゴヌクレオ
チドをプライマーとして結合させ、順次プライマー側か
ら核酸塩基を重合させてい（ことができる。
合成する場合、１００ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを一
本合成し、それを鋳型とし、また別に該オリゴヌクレオ
チドと相補的な配列を持つ８塩基以上のオリゴヌクレオ
チドをプライマーとして結合させ、順次プライマー側か
ら核酸塩基を重合させてい（ことができる。
一方、代表的なりＮＡ標識方法としては、（１）末端標
識法、（２）ニックトランスレーション法、（３）置換
合成法、及び（４）プライマー伸展法を利用したものが
知られている。
識法、（２）ニックトランスレーション法、（３）置換
合成法、及び（４）プライマー伸展法を利用したものが
知られている。
以下、標識された二本鎖オリゴヌクレオチドを得る各方
法について説明する。
法について説明する。
末端標識法は５′末端のリン酸基をアルカリフォスファ
ターゼで除去し、それにポリヌクレオチドキナーゼを作
用させて再びリン酸化する際に標識２ する方法で、 Ｐでの放射性標識に利用されている。
ターゼで除去し、それにポリヌクレオチドキナーゼを作
用させて再びリン酸化する際に標識２ する方法で、 Ｐでの放射性標識に利用されている。
また、３′末端の標識には、ターミナルトランスフェラ
ーゼ法、ＤＮＡポリメラーゼ法等がある。
ーゼ法、ＤＮＡポリメラーゼ法等がある。
ターミナルトランスフェラーゼ法は酵素により標識され
たヌクレオチドトリフオスフェートを３′末端に多数個
順次結合させる方法であり、一方ＤＮＡポリメラーゼ法
は制限酵素で切断されたＤＮＡの突き出た一本鎖部分を
酵素により修飾し、相補的な二本鎖を形成させる際に、
標識ヌクレオチドを取り込ませる方法である。該末端標
識法はこのように標識される部位が１か所または２か所
程度に限定されるため、比活性の高いプローブを得るこ
とは困難である。−船釣には比活性の高い放射性同意元
素による標識が行なわれる。
たヌクレオチドトリフオスフェートを３′末端に多数個
順次結合させる方法であり、一方ＤＮＡポリメラーゼ法
は制限酵素で切断されたＤＮＡの突き出た一本鎖部分を
酵素により修飾し、相補的な二本鎖を形成させる際に、
標識ヌクレオチドを取り込ませる方法である。該末端標
識法はこのように標識される部位が１か所または２か所
程度に限定されるため、比活性の高いプローブを得るこ
とは困難である。−船釣には比活性の高い放射性同意元
素による標識が行なわれる。
これに対しニックトランスレーション及び置換合成法は
、多数の標識化合物を取り込ませ、高い比活性を持つＤ
ＮＡプローブを作製することができる。つまり、ニック
トランスレーションでは膵臓由来のＤＮａｓｅＩでＤＮ
Ａの二本鎖をランダムに加水分解し切れ目を作る。この
切れ目をＤＮＡポリメラーゼＩが認識し、ＤＮＡ鎮を５
′側から分解し、それと同時に５′側から３′側へポリ
メラーゼ活性によりニックを持たないＩ）ＮＡ鎖を鋳型
として相補的なりＮＡが合成され、その際基質として標
識されたヌクレオチドトリフオスフェートが取りこまれ
る。
、多数の標識化合物を取り込ませ、高い比活性を持つＤ
ＮＡプローブを作製することができる。つまり、ニック
トランスレーションでは膵臓由来のＤＮａｓｅＩでＤＮ
Ａの二本鎖をランダムに加水分解し切れ目を作る。この
切れ目をＤＮＡポリメラーゼＩが認識し、ＤＮＡ鎮を５
′側から分解し、それと同時に５′側から３′側へポリ
メラーゼ活性によりニックを持たないＩ）ＮＡ鎖を鋳型
として相補的なりＮＡが合成され、その際基質として標
識されたヌクレオチドトリフオスフェートが取りこまれ
る。
また置換合成法はＴ４ＤＮＡポリメラーゼの３′エキソ
ヌクレアーゼ活性により二本鎖の両３′末端を適当な長
さ削り、その後ポリメラーゼ活性により修復する際に標
識ヌクレオチドを取り込む方法である。該方法はいずれ
も数百塩基対以上の長いＤＮＡを標識する場合にのみ有
効である。
ヌクレアーゼ活性により二本鎖の両３′末端を適当な長
さ削り、その後ポリメラーゼ活性により修復する際に標
識ヌクレオチドを取り込む方法である。該方法はいずれ
も数百塩基対以上の長いＤＮＡを標識する場合にのみ有
効である。
プライマー伸展法は、ＤＮＡの塩基配列を決定する方法
であるサンガー法を応用したもので、鋳型となる一本鎖
ＤＮＡオリゴヌクレオチドを合成し、その３′末端と相
補的な配列を持つ８塩基以上のオリゴヌクレオチドをプ
ライマーとして結合させ、ＤＮＡポリメラーゼＩの１
ａ ｒ ｇ ｅ ｆ ｒ ａ ｇ ｍ ｅ ｎ を等
により５′側から３′側に相補的な配列を持つＤＮＡを
合成させる際に、標識ヌクレオチドを取り込ませる方法
である。
であるサンガー法を応用したもので、鋳型となる一本鎖
ＤＮＡオリゴヌクレオチドを合成し、その３′末端と相
補的な配列を持つ８塩基以上のオリゴヌクレオチドをプ
ライマーとして結合させ、ＤＮＡポリメラーゼＩの１
ａ ｒ ｇ ｅ ｆ ｒ ａ ｇ ｍ ｅ ｎ を等
により５′側から３′側に相補的な配列を持つＤＮＡを
合成させる際に、標識ヌクレオチドを取り込ませる方法
である。
ところで、近年プロティンシーケンサ−の発達、及びＤ
ＮＡ合成装置の普及は、遺伝子操作を著しく進展させた
。つまり、少量の蛋白質からそのアミノ酸配列の一部を
容易に知ることができるようになり、さらに、ＤＮＡ合
成装置によりオリゴヌクレオチドが自動的に合成できる
ようになったことにより、目的の蛋白質のアミノ酸配列
の一部を決め、それを基にＤＮＡの塩基配列を推定し化
学合成し、何らかの標識を施してプローブとして用いる
ことができるようになった。
ＮＡ合成装置の普及は、遺伝子操作を著しく進展させた
。つまり、少量の蛋白質からそのアミノ酸配列の一部を
容易に知ることができるようになり、さらに、ＤＮＡ合
成装置によりオリゴヌクレオチドが自動的に合成できる
ようになったことにより、目的の蛋白質のアミノ酸配列
の一部を決め、それを基にＤＮＡの塩基配列を推定し化
学合成し、何らかの標識を施してプローブとして用いる
ことができるようになった。
更に該オリゴヌクレオチドプローブはカマ状赤血球、あ
る種の筋ジストロフィー等多くの遺伝子疾患、癌性疾患
、または伝染性疾患と関連する制限酵素断片長条型によ
る遺伝子解析（ＲＦＬＰ；ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆ
ｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉ
ｓｍ）にも広く利用されてきている。
る種の筋ジストロフィー等多くの遺伝子疾患、癌性疾患
、または伝染性疾患と関連する制限酵素断片長条型によ
る遺伝子解析（ＲＦＬＰ；ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆ
ｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉ
ｓｍ）にも広く利用されてきている。
〔本発明が解決しようとしている問題点〕このように、
最近、特に合成遺伝子を作製することが非常に重要にな
ってきているが、市販のＤＮＡ合成装置の合成能力は、
現在のところ１００ ｍ ｅ ｒ程度以下である。しか
もその収率は高いとは言えない。従って、合成したオリ
ゴヌクレオチドをゲル電気泳動等で分離し、所望のバン
ドのみを抽出しなければならない。例えば、前述した事
例の場合（２００塩基対の二本鎖オリゴヌクレオチドを
合成する場合）、１００ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを
４本合成し、さらに精製してから使用することになる。
最近、特に合成遺伝子を作製することが非常に重要にな
ってきているが、市販のＤＮＡ合成装置の合成能力は、
現在のところ１００ ｍ ｅ ｒ程度以下である。しか
もその収率は高いとは言えない。従って、合成したオリ
ゴヌクレオチドをゲル電気泳動等で分離し、所望のバン
ドのみを抽出しなければならない。例えば、前述した事
例の場合（２００塩基対の二本鎖オリゴヌクレオチドを
合成する場合）、１００ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを
４本合成し、さらに精製してから使用することになる。
また５００塩基対の二本鎖オリゴヌクレオチドを合成す
る場合、１００ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを１０本合
成し、さらに精製してから使用することになる。
る場合、１００ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを１０本合
成し、さらに精製してから使用することになる。
次に、これらのオリゴヌクレオチドをアニールして、二
本鎖を形成させ、連結するわけであるが、二組のオリゴ
ヌクレオチドはＡＢの順と、ＢＡの順の二種類の結合の
仕方がある。そのため、結合体について、塩基配列を決
めて、ＡＢの順のみを選択する必要がある。必ず両方向
について二種類の結合体が得られ、それを塩基配列を決
めることにより、所望のもののみを得る操作が必要であ
る。しかし、上記の操作はかなり繁雑であり、しかも純
度を満足させるために精製を行うと、合成収率が悪くな
り、純度及び収率ともに満足できる方法ではなかつた。
本鎖を形成させ、連結するわけであるが、二組のオリゴ
ヌクレオチドはＡＢの順と、ＢＡの順の二種類の結合の
仕方がある。そのため、結合体について、塩基配列を決
めて、ＡＢの順のみを選択する必要がある。必ず両方向
について二種類の結合体が得られ、それを塩基配列を決
めることにより、所望のもののみを得る操作が必要であ
る。しかし、上記の操作はかなり繁雑であり、しかも純
度を満足させるために精製を行うと、合成収率が悪くな
り、純度及び収率ともに満足できる方法ではなかつた。
また、前述のように、ブライマー伸展法等により二本鎖
オリゴヌクレオチドを形成したとしても、アニールで連
結させる前の二本鎖オリゴヌクレオチドの最大塩基対の
数は１００までであり、（現在のところ一本鎖オリゴヌ
クレオチドの合成能力は１００ ｍ ｅ ｒ以下である
ため）、連結の操作なしに、−度に２００塩基対の二本
鎖オリゴヌクレオチドを合成する方法は得られていなか
った。
オリゴヌクレオチドを形成したとしても、アニールで連
結させる前の二本鎖オリゴヌクレオチドの最大塩基対の
数は１００までであり、（現在のところ一本鎖オリゴヌ
クレオチドの合成能力は１００ ｍ ｅ ｒ以下である
ため）、連結の操作なしに、−度に２００塩基対の二本
鎖オリゴヌクレオチドを合成する方法は得られていなか
った。
一方、一般にプローブとして利用されるＤＮＡオリゴヌ
クレオチドの長さが長ければ長いほど、ハイブリダイゼ
ーション時の相補的結合の誤りが防げる。しかしプライ
マー伸展法によって長い標識ＤＮＡを得るためには、鋳
型となる一本鎖ＤＮＡとして長いものが必要になる。と
ころが、ＤＮＡ合成装置での合成収率は合成しようとす
るオリゴヌクレオチドの長さが低いほど低下する。しか
も鎖長の短い副産物も増加するため、鋳型ＤＮＡとして
利用するためには目的のものを分離精製する必要がある
。
クレオチドの長さが長ければ長いほど、ハイブリダイゼ
ーション時の相補的結合の誤りが防げる。しかしプライ
マー伸展法によって長い標識ＤＮＡを得るためには、鋳
型となる一本鎖ＤＮＡとして長いものが必要になる。と
ころが、ＤＮＡ合成装置での合成収率は合成しようとす
るオリゴヌクレオチドの長さが低いほど低下する。しか
も鎖長の短い副産物も増加するため、鋳型ＤＮＡとして
利用するためには目的のものを分離精製する必要がある
。
またＤＮＡポリメラーゼによって長い領域を合成する場
合、何らかの障害により途中で合成が止まり、標識され
たオリゴヌクレオチドの長さに差が出てくることがある
。特に、悲放射性標識物質を取り込ませる場合、標識物
質の側鎖等が酵素反応の妨げとなって、予定されたもの
より短い産物ができやすい。このことは単にハイブリダ
イゼーションの効率を低下させるのみならず、ハイブリ
ダイゼーション反応条件（温度、ホルムアミド含量等）
に影響を与え、ハイブリダイゼーション反応そのものが
うま（行かないことになりかねない。
合、何らかの障害により途中で合成が止まり、標識され
たオリゴヌクレオチドの長さに差が出てくることがある
。特に、悲放射性標識物質を取り込ませる場合、標識物
質の側鎖等が酵素反応の妨げとなって、予定されたもの
より短い産物ができやすい。このことは単にハイブリダ
イゼーションの効率を低下させるのみならず、ハイブリ
ダイゼーション反応条件（温度、ホルムアミド含量等）
に影響を与え、ハイブリダイゼーション反応そのものが
うま（行かないことになりかねない。
更に、この方法では二本鎖のうち片方の鎖は鋳型として
のみ機能するだけで、標識され、プローブとしてハイブ
リダイゼーション反応溶液に加えられるのはプライマー
側の一本のみである。したがって全ＤＮＡのうち実際に
利用されるのは半分だけということになり、効率が悪い
。さらに、ハイありうる。
のみ機能するだけで、標識され、プローブとしてハイブ
リダイゼーション反応溶液に加えられるのはプライマー
側の一本のみである。したがって全ＤＮＡのうち実際に
利用されるのは半分だけということになり、効率が悪い
。さらに、ハイありうる。
この問題はプローブの長さに関係なく、ブライマー伸展
法で合成されたプローブすべてにあてはまるものであり
、高感度な検出を要求されるような系では大量のプロー
ブを必要とし、さらに場合によつては標識のはいってい
ない鋳型部分のみを回収する操作も必要となりつる。
法で合成されたプローブすべてにあてはまるものであり
、高感度な検出を要求されるような系では大量のプロー
ブを必要とし、さらに場合によつては標識のはいってい
ない鋳型部分のみを回収する操作も必要となりつる。
そこで本発明は、精度よ（かつ合成収率も高い二本鎖オ
リゴヌクレオチドの形成方法を提供することを目的とす
る。
リゴヌクレオチドの形成方法を提供することを目的とす
る。
また、本発明は、精度よくかつ合成収率も高い標識され
た任意の長さの二本鎖オリゴヌクレオチドの形成方法で
あって、さらに比活性の高いプローブとして働く標識二
本鎖オリゴヌクレオチドを形成する方法を提供すること
を目的をする。
た任意の長さの二本鎖オリゴヌクレオチドの形成方法で
あって、さらに比活性の高いプローブとして働く標識二
本鎖オリゴヌクレオチドを形成する方法を提供すること
を目的をする。
つまり本発明は、ａ）おのおののオリゴヌクレオチドの
末端領域の一部が互いに第二のオリゴヌクレオチドをも
つ少なくとも一対のオリゴヌクレオチドを合成する工程
、ｂ）前記一対のの５′末端領域と第二のオリゴヌクレ
オチドで結合させる工程、Ｃ）おのおののオリゴヌクレ
オチドに核酸塩基を重合させる工程とを有することを特
徴とするオリゴヌクレオチドの形成方法を提供するもの
である。
末端領域の一部が互いに第二のオリゴヌクレオチドをも
つ少なくとも一対のオリゴヌクレオチドを合成する工程
、ｂ）前記一対のの５′末端領域と第二のオリゴヌクレ
オチドで結合させる工程、Ｃ）おのおののオリゴヌクレ
オチドに核酸塩基を重合させる工程とを有することを特
徴とするオリゴヌクレオチドの形成方法を提供するもの
である。
また、ｄ）おのおののオリゴヌクレオチドの末端領域の
一部が互いに第二のオリゴヌクレオチドをもつ少なくと
も一対のオリゴヌクレオチドを合成する工程、ｅ）前記
一対のの５′末端領域と第二のオリゴヌクレオチドで結
合させる工程、ｆ）おのおののオリゴヌクレオチドに標
識を施した核酸塩基を重合させる工程とを有することを
特徴とする標識オリゴヌクレオチドの形成方法を提供す
るものである。
一部が互いに第二のオリゴヌクレオチドをもつ少なくと
も一対のオリゴヌクレオチドを合成する工程、ｅ）前記
一対のの５′末端領域と第二のオリゴヌクレオチドで結
合させる工程、ｆ）おのおののオリゴヌクレオチドに標
識を施した核酸塩基を重合させる工程とを有することを
特徴とする標識オリゴヌクレオチドの形成方法を提供す
るものである。
また、上記ｄ）〜ｆ）工程により得られた、相補的な結
合部をもつ一対のオリゴヌクレオチドの双方のオリゴヌ
クレオチドに標識された核酸塩基を導入させたことを特
徴とする標識二本鎖オリゴヌクレオチドも提供する。
合部をもつ一対のオリゴヌクレオチドの双方のオリゴヌ
クレオチドに標識された核酸塩基を導入させたことを特
徴とする標識二本鎖オリゴヌクレオチドも提供する。
本発明の第１は上記の点に解決を与えることを目的とし
、プライマー伸展法において、二本鎖のそれぞれの鎖が
鋳型とプライマーの両方を兼ね備えるように発明された
ものである。
、プライマー伸展法において、二本鎖のそれぞれの鎖が
鋳型とプライマーの両方を兼ね備えるように発明された
ものである。
第１の発明における鋳型及び、プライマーとは、合成さ
れた二種類のオリゴヌクレオチドが相補的配列で部分的
二本鎖を形成した場合に、非結合部である突き出た一本
鎖を鋳型といい、部分的二本鎖を構成するそれぞれの鎖
のうち、突き出た一本鎖と反対側の結合に関与している
鎖をプライマーという。
れた二種類のオリゴヌクレオチドが相補的配列で部分的
二本鎖を形成した場合に、非結合部である突き出た一本
鎖を鋳型といい、部分的二本鎖を構成するそれぞれの鎖
のうち、突き出た一本鎖と反対側の結合に関与している
鎖をプライマーという。
つまり、本発明を具体的に説明すると以下のようになる
。
。
（ａ） ３’末端に６塩基対以上の相補的な配列を持つ
二本の一本鎖オリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成装置によ
って合成する。（ｂ）次に、アニーリング反応によりこ
れら二本のオリゴヌクレオチドを相補的な部分で結合さ
せ、部分的に二本鎖を構成させる。（ｃ）このとき形成
された部分的二本鎖が二本のそれぞれ合成されたＤＮＡ
のプライマーとして働く。異なるヌクレオチドトリフオ
スフェート、及び該ヌクレオチドトリフオスフェートの
重合のための試薬によって、つきでた−本鎖部分を鋳型
として、５′側から３′側方向に相補的な配列をもつオ
リゴヌクレオチドを合成しながら二本鎖を形成する。
二本の一本鎖オリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成装置によ
って合成する。（ｂ）次に、アニーリング反応によりこ
れら二本のオリゴヌクレオチドを相補的な部分で結合さ
せ、部分的に二本鎖を構成させる。（ｃ）このとき形成
された部分的二本鎖が二本のそれぞれ合成されたＤＮＡ
のプライマーとして働く。異なるヌクレオチドトリフオ
スフェート、及び該ヌクレオチドトリフオスフェートの
重合のための試薬によって、つきでた−本鎖部分を鋳型
として、５′側から３′側方向に相補的な配列をもつオ
リゴヌクレオチドを合成しながら二本鎖を形成する。
より詳細に説明すると、（ａ）で合成されるオリゴヌク
レオチドの長さは、実際に必要な長さより短かくて良い
。
レオチドの長さは、実際に必要な長さより短かくて良い
。
（ｂ）アニーリング反応では、該二種類の一本鎖オリゴ
ヌクレオチド混合物を適当な緩衝液中で、６５度以上で
１分間以上、好ましくは６５度にて１０分間、或は、９
５度にて１分間以上加熱し、その後、溶液を室温に放冷
する。この反応により、該オリゴヌクレオチドは互いに
相補的な配列で結合し、部分的二本鎖を形成する。
ヌクレオチド混合物を適当な緩衝液中で、６５度以上で
１分間以上、好ましくは６５度にて１０分間、或は、９
５度にて１分間以上加熱し、その後、溶液を室温に放冷
する。この反応により、該オリゴヌクレオチドは互いに
相補的な配列で結合し、部分的二本鎖を形成する。
（Ｃ）該溶液に合成試薬としてヌクレオチドトリフオス
フェートであるｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ。
フェートであるｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ。
及び、ＴＴＰを適当量加える。
また、重合試薬として用いる酵素には、Ｅ、 ｃｏｌｔ
ＤＮＡポリメラーゼｌ５ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎ
ｏｗ断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ、 Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ。
ＤＮＡポリメラーゼｌ５ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎ
ｏｗ断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ、 Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ。
ｅｔ、 ａｌ、 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ １０８． ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ａｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｔ７ＤＮＡポリメラ
ーゼ（Ｓ、 Ｔａｂｏｒ ｅｔ、 ａｌ、 Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔｌ。
ｇ １０８． ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ａｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｔ７ＤＮＡポリメラ
ーゼ（Ｓ、 Ｔａｂｏｒ ｅｔ、 ａｌ、 Ｐｒｏｃ
、 Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、 ８４．４７６７−４
７７１ （１９８７）、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒ１
に、 ５ａｉｋｉ、 ｅｔ。
７７１ （１９８７）、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒ１
に、 ５ａｉｋｉ、 ｅｔ。
ａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ、 ２３９．４８７−４９１ （
１９８８）、他の入手可能なりＮＡポリメラーゼ類、逆
転写酵素、及び他の酵素、例えば、各核酸の相補的であ
るプライマー伸展生成物を形成するために適当な態様で
のヌクレオチドの結合を促進する酵素が含まれる。
１９８８）、他の入手可能なりＮＡポリメラーゼ類、逆
転写酵素、及び他の酵素、例えば、各核酸の相補的であ
るプライマー伸展生成物を形成するために適当な態様で
のヌクレオチドの結合を促進する酵素が含まれる。
以上により、部分的二本鎖オリゴヌクレオチドを経て、
二本鎖オリゴヌクレオチドが形成される。
二本鎖オリゴヌクレオチドが形成される。
一方、上記方法を利用・して、標識二本鎖オリゴヌクレ
オチドも形成でき、以下同様に説明する。
オチドも形成でき、以下同様に説明する。
つまり、（ｄ） ３’末端に６塩基対以上の相補的な配
列を持つ二本の一本鎖オリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成
装置によって合成する。（ｅ）次に、アニーリング反応
によりこれら二本のオリゴヌクレオチドを相補的な部分
で結合させ、部分的に二本鎖を構成させる。（ｆ）この
とき形成された部分的二本鎖が二本のそれぞれ合成され
たＤＮＡのプライマーとして働き、異なるヌクレオチド
トリフオスフェート、標識ヌクレオチドトリフオスフェ
ート、及び、該ヌクレオチドトリフオスフェートの重合
のための試薬によって、つきでた−本鎖部分を鋳型とし
て、５′側から３′側方向に相補的な配列をもつオリボ
ヌクレオチドを合成しながら二本鎖を形成する。該反応
の際に、標識ヌクレオチドトリフオスフェートを取り込
ませることができる。該反応生成物を変性条件下で処理
し、プローブとしてハイブリダイゼーション反応に使用
する。（ｄ）、 （ｅ）は前述の（ａ）、 （ｂ）
の通りである。（ｆ）をより詳細に説明する。
列を持つ二本の一本鎖オリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成
装置によって合成する。（ｅ）次に、アニーリング反応
によりこれら二本のオリゴヌクレオチドを相補的な部分
で結合させ、部分的に二本鎖を構成させる。（ｆ）この
とき形成された部分的二本鎖が二本のそれぞれ合成され
たＤＮＡのプライマーとして働き、異なるヌクレオチド
トリフオスフェート、標識ヌクレオチドトリフオスフェ
ート、及び、該ヌクレオチドトリフオスフェートの重合
のための試薬によって、つきでた−本鎖部分を鋳型とし
て、５′側から３′側方向に相補的な配列をもつオリボ
ヌクレオチドを合成しながら二本鎖を形成する。該反応
の際に、標識ヌクレオチドトリフオスフェートを取り込
ませることができる。該反応生成物を変性条件下で処理
し、プローブとしてハイブリダイゼーション反応に使用
する。（ｄ）、 （ｅ）は前述の（ａ）、 （ｂ）
の通りである。（ｆ）をより詳細に説明する。
（ｆ）該溶液に合成試薬としてヌクレオチドトリフオス
フェートであるｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ。
フェートであるｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ。
及び、ＴＴＰを適当量加える。このとき、一種類以上の
標識ヌクレオチドトリフオスフェートを加える。この場
合、該標識物質のみを加えてもよいし、未標識物質を混
在させてもよい。標識物質としては、放射性同意元素は
もちろんのこと、ビオチン或は、ジニトロフェニルヌク
レオチド誘導体をはじめとする非放射性標識物質を使用
することができる。重合試薬として用いる酵素としては
前述の通りである。
標識ヌクレオチドトリフオスフェートを加える。この場
合、該標識物質のみを加えてもよいし、未標識物質を混
在させてもよい。標識物質としては、放射性同意元素は
もちろんのこと、ビオチン或は、ジニトロフェニルヌク
レオチド誘導体をはじめとする非放射性標識物質を使用
することができる。重合試薬として用いる酵素としては
前述の通りである。
上記の形成方法で二本鎖オリゴヌクレオチドを形成させ
ると、１００ｍｅｒ以上の長さのオリゴヌクレオチドか
ら成る二本鎖オリゴヌクレオチドが簡便に作成できるよ
うになる。
ると、１００ｍｅｒ以上の長さのオリゴヌクレオチドか
ら成る二本鎖オリゴヌクレオチドが簡便に作成できるよ
うになる。
１）従来のブライマー伸展法では、１００ ｍ ｅ ｒ
程度の遺伝子を一度に精度良（かつ収率よ（作成するこ
とは、困難であった。なぜなら、そのためには、その長
さの鋳型ＤＮＡの合成が必要であり、また、ＤＮＡ合成
装置の合成限界が１００ｍａｒ程度だからである。しか
も、１００ｍｅｒを合成しようとすると、その合成収率
は、現状では１０％以下である。
程度の遺伝子を一度に精度良（かつ収率よ（作成するこ
とは、困難であった。なぜなら、そのためには、その長
さの鋳型ＤＮＡの合成が必要であり、また、ＤＮＡ合成
装置の合成限界が１００ｍａｒ程度だからである。しか
も、１００ｍｅｒを合成しようとすると、その合成収率
は、現状では１０％以下である。
そのため、次反応の前に所望の長さのもののみ精製し、
副産物を除くことが必要である。しかし、１塩基の違い
もなく精度良く精製することは非常に難しい。
副産物を除くことが必要である。しかし、１塩基の違い
もなく精度良く精製することは非常に難しい。
これに対し、本発明の方法では、プローブの長さより短
い長さのオリゴヌクレオチドを合成するだけで十分であ
る。これにより、１００塩基対の遺伝子を作製する場合
、アニーリングの部分を８塩基対とすると、例えば、５
４塩基の長さのオリゴヌクレオチドを２本合成すれば良
いことになる。当然のことながら、１００塩基のオリゴ
ヌクレオチドを合成する場合に比べると５４塩基の場合
の方が、合成収率も良いし、副産物も少ない。従って、
精製も簡単である。
い長さのオリゴヌクレオチドを合成するだけで十分であ
る。これにより、１００塩基対の遺伝子を作製する場合
、アニーリングの部分を８塩基対とすると、例えば、５
４塩基の長さのオリゴヌクレオチドを２本合成すれば良
いことになる。当然のことながら、１００塩基のオリゴ
ヌクレオチドを合成する場合に比べると５４塩基の場合
の方が、合成収率も良いし、副産物も少ない。従って、
精製も簡単である。
更に、本発明によれば、これまでほとんど不可能であっ
た１ ００ ｍ ｅ ｒ以上の遺伝子の合成、例えば２
００塩基対の遺伝子の合成等が一度に行なえるようにな
る。合成装置で一度に合成できる限界である１００ｍｅ
ｒのオリゴヌクレオチドを２本合成し、酵素による伸展
反応を行なえば、２００塩基対に近い長さの遺伝子が合
成されることになる。
た１ ００ ｍ ｅ ｒ以上の遺伝子の合成、例えば２
００塩基対の遺伝子の合成等が一度に行なえるようにな
る。合成装置で一度に合成できる限界である１００ｍｅ
ｒのオリゴヌクレオチドを２本合成し、酵素による伸展
反応を行なえば、２００塩基対に近い長さの遺伝子が合
成されることになる。
２）重合試薬による反応においても、従来の方法の場合
には、酵素によって多数のヌクレオチドを重合させなけ
ればならなかった。ところが、酵素が伸展させうる長さ
にもそれぞれ限界がある。その結果反応が途中で止まっ
てしまい短い遺伝子ができやすい。
には、酵素によって多数のヌクレオチドを重合させなけ
ればならなかった。ところが、酵素が伸展させうる長さ
にもそれぞれ限界がある。その結果反応が途中で止まっ
てしまい短い遺伝子ができやすい。
本発明の場合には、酵素によって重合させるヌクレオチ
ドの長さが従来よりかなり短い。１００ ｍ ｅ ｒの
遺伝子を作成する場合、従来法では９２塩基伸展させる
のに対し、４６塩基ずつ伸展させればよい。
ドの長さが従来よりかなり短い。１００ ｍ ｅ ｒの
遺伝子を作成する場合、従来法では９２塩基伸展させる
のに対し、４６塩基ずつ伸展させればよい。
９２塩基伸展させるのにくらべて、４６塩基伸展させる
場合の方が、反応が短時間に、より完全に進行する。こ
のことにより、長さの揃った二本鎖ＤＮＡが得られ、ベ
クターへの連結反応効率、及び、トランスフォーメーシ
ョン効率が大幅に向上する。
場合の方が、反応が短時間に、より完全に進行する。こ
のことにより、長さの揃った二本鎖ＤＮＡが得られ、ベ
クターへの連結反応効率、及び、トランスフォーメーシ
ョン効率が大幅に向上する。
さらに、二本鎖オリゴヌクレオチドが標識されている場
合、本発明の方法を用いると、以下のような効果がある
。
合、本発明の方法を用いると、以下のような効果がある
。
３）重合試薬による反応においても、従来の方法の場合
には、酵素によって多数のヌクレオチドを重合させなけ
ればならなかりた。ところが、酵素が伸展させつる長さ
にもそれぞれ限界がある。放射性同位体を用いた標識の
場合でも、酵素反応生成物をゲル電気泳動で調べてみる
と、所望のバンドよりも短い副産物が多数見られる。従
って、従来の方法の場合、所望の長さのＤＮＡのみゲル
から切り出して、それからＤＮＡを抽出してからプロー
ブとして使用しなければならなかった。非放射性標識の
場合には、標識物質の構造が酵素反応を阻害し、その結
果反応が途中で止まってしまう場合も多い。しかも、放
射性同位体標識と異なり、検出には発色反応等を利用し
ているため、ゲル電気泳動での精製はできず、精製が困
難である。
には、酵素によって多数のヌクレオチドを重合させなけ
ればならなかりた。ところが、酵素が伸展させつる長さ
にもそれぞれ限界がある。放射性同位体を用いた標識の
場合でも、酵素反応生成物をゲル電気泳動で調べてみる
と、所望のバンドよりも短い副産物が多数見られる。従
って、従来の方法の場合、所望の長さのＤＮＡのみゲル
から切り出して、それからＤＮＡを抽出してからプロー
ブとして使用しなければならなかった。非放射性標識の
場合には、標識物質の構造が酵素反応を阻害し、その結
果反応が途中で止まってしまう場合も多い。しかも、放
射性同位体標識と異なり、検出には発色反応等を利用し
ているため、ゲル電気泳動での精製はできず、精製が困
難である。
本発明の場合には、酵素によって重合させるヌクレオチ
ドの長さが従来よりかなり短い。５０ ｍ ｅ ｒのプ
ローブを作成する場合、従来法では４２塩基伸展させる
のに対し、２１塩基ずつ伸展させればよい。
ドの長さが従来よりかなり短い。５０ ｍ ｅ ｒのプ
ローブを作成する場合、従来法では４２塩基伸展させる
のに対し、２１塩基ずつ伸展させればよい。
４２塩基伸展させるのにくらべて、２１塩基伸展させる
場合のほうが、反応が短時間に、より完全に進行し、精
製が不要である。このことにより、精製の手間が省けた
だけでなく、非放射性物質による長さの揃った標識オリ
ゴヌクレオチドを容易に得ることが可能になる。
場合のほうが、反応が短時間に、より完全に進行し、精
製が不要である。このことにより、精製の手間が省けた
だけでなく、非放射性物質による長さの揃った標識オリ
ゴヌクレオチドを容易に得ることが可能になる。
また、この方法では任意の長さで任意の数の標識物がと
りこまれたプローブの作製が可能になりこれまでプライ
マー伸展法或はニックトランスレーション法では標識の
割合が低（、作製が困難だった５０〜２００塩基対長の
プローブも容易に作製できるようになる。
りこまれたプローブの作製が可能になりこれまでプライ
マー伸展法或はニックトランスレーション法では標識の
割合が低（、作製が困難だった５０〜２００塩基対長の
プローブも容易に作製できるようになる。
さらに、その結果精製したオリゴヌクレオチドの二本鎖
は、両方の鎖に標識物質が取り込まれており、それぞれ
の鎖が比活性の高いプローブとして働き、ハイブリダイ
ゼーションの効率が高まる。
は、両方の鎖に標識物質が取り込まれており、それぞれ
の鎖が比活性の高いプローブとして働き、ハイブリダイ
ゼーションの効率が高まる。
その結果、遺伝子疾患、癌性疾患または伝染性疾患と関
連している特定配列の有無、或は繰り返し配列の有無を
調べるのに有効な２０塩基対以下のプローブを用いての
解析においても感度の上昇がみられる。
連している特定配列の有無、或は繰り返し配列の有無を
調べるのに有効な２０塩基対以下のプローブを用いての
解析においても感度の上昇がみられる。
さらに本発明は、
■ おのおのの３′末端領域で互いに第二のオリゴヌク
レオチドをもつ第一のオリゴヌクレオチドと第二のオリ
ゴヌクレオチドを合成する工程、および前記第一又は第
二のオリゴヌクレオチドの５′末端領域と第二のオリゴ
ヌクレオチドを合成する第三のオリゴヌクレオチドを合
成する工程、■ 前記第一のオリゴヌクレオチドと第二
のの５′末端領域と第二のオリゴヌクレオチドをもつ５
′末端領域を有する第三のオリゴヌクレオチド又は第二
のオリゴヌクレオチドのいずれかと第三のの５′末端領
域と第二のオリゴヌクレオチドで結合させる工程、 ■ 前記■と■の工程を経て得られたオリゴヌクレオチ
ドに核酸塩基を重合・連結させる工程とを有することを
特徴とするオリゴヌクレオチドの形成方法を提供する。
レオチドをもつ第一のオリゴヌクレオチドと第二のオリ
ゴヌクレオチドを合成する工程、および前記第一又は第
二のオリゴヌクレオチドの５′末端領域と第二のオリゴ
ヌクレオチドを合成する第三のオリゴヌクレオチドを合
成する工程、■ 前記第一のオリゴヌクレオチドと第二
のの５′末端領域と第二のオリゴヌクレオチドをもつ５
′末端領域を有する第三のオリゴヌクレオチド又は第二
のオリゴヌクレオチドのいずれかと第三のの５′末端領
域と第二のオリゴヌクレオチドで結合させる工程、 ■ 前記■と■の工程を経て得られたオリゴヌクレオチ
ドに核酸塩基を重合・連結させる工程とを有することを
特徴とするオリゴヌクレオチドの形成方法を提供する。
さらに本発明は、
■ おのおのの３′末端領域で互いに第二のオリゴヌク
レオチドをもつ第一のオリゴヌクレオチドと第二のオリ
ゴヌクレオチドを合成する工程、および前記第一又は第
二のオリゴヌクレオチドの５′末端領域と第二のオリゴ
ヌクレオチドを合成する第三のオリゴヌクレオチドを合
成する工程、■ 前記第一のオリゴヌクレオチドと第二
のの５′末端領域と第二のオリゴヌクレオチドをもつ５
′末端領域を有する第三のオリゴヌクレオチド又は第二
のオリゴヌクレオチドのいずれかと第三のの５′末端領
域と第二のオリゴヌクレオチドで結合させる工程、 ■ 前記■と［５］の工程を経て得られたオリゴヌクレ
オチドに標識を施した核酸塩基を有する核酸塩基を重合
・連結させる工程とを有することを特徴とする標識オリ
ゴヌクレオチドの形成方法を提供する。
レオチドをもつ第一のオリゴヌクレオチドと第二のオリ
ゴヌクレオチドを合成する工程、および前記第一又は第
二のオリゴヌクレオチドの５′末端領域と第二のオリゴ
ヌクレオチドを合成する第三のオリゴヌクレオチドを合
成する工程、■ 前記第一のオリゴヌクレオチドと第二
のの５′末端領域と第二のオリゴヌクレオチドをもつ５
′末端領域を有する第三のオリゴヌクレオチド又は第二
のオリゴヌクレオチドのいずれかと第三のの５′末端領
域と第二のオリゴヌクレオチドで結合させる工程、 ■ 前記■と［５］の工程を経て得られたオリゴヌクレ
オチドに標識を施した核酸塩基を有する核酸塩基を重合
・連結させる工程とを有することを特徴とする標識オリ
ゴヌクレオチドの形成方法を提供する。
本発明の第２は上記の点に解決を与えることを目的とし
、プライマー伸展法において、複数個のオリゴヌクレオ
チドのそれぞれの鎖が鋳型ブライマーの両方を兼ね備え
るように発明されたものである。
、プライマー伸展法において、複数個のオリゴヌクレオ
チドのそれぞれの鎖が鋳型ブライマーの両方を兼ね備え
るように発明されたものである。
第２発明における鋳型及び、ブライマーとは、合成され
た複数種のオリゴヌクレオチドが相補的配列で部分的二
本鎖を形成した場合に、非結合部である突き出た一本鎖
を鋳型といい、部分的二本鎖を構成するそれぞれの鎖の
うち、突き出た一本鎖と反対側の結合に関与している鎖
をプライマーという。
た複数種のオリゴヌクレオチドが相補的配列で部分的二
本鎖を形成した場合に、非結合部である突き出た一本鎖
を鋳型といい、部分的二本鎖を構成するそれぞれの鎖の
うち、突き出た一本鎖と反対側の結合に関与している鎖
をプライマーという。
つまり、本発明を具体的に説明すると、以下のようにな
る。
る。
所望の核酸塩基配列に対し、（１）第１図のように３′
末端或はまた５′末端に６塩基対以上の相補的な配列を
持つ複数個の一本鎖オリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成装
置によって合成する。（２）次に、各オリゴヌクレオチ
ドの５′末端にリン酸基を付ける。（３）次に、アニー
リング反応によりこれら二本のオリゴヌクレオチドを相
補的な部分で結合させ、部分的に二本鎖を構成させる。
末端或はまた５′末端に６塩基対以上の相補的な配列を
持つ複数個の一本鎖オリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成装
置によって合成する。（２）次に、各オリゴヌクレオチ
ドの５′末端にリン酸基を付ける。（３）次に、アニー
リング反応によりこれら二本のオリゴヌクレオチドを相
補的な部分で結合させ、部分的に二本鎖を構成させる。
（４）このとき形成された部分的二本鎖の一本が他方の
合成されたオリゴヌクレオチドのブライマーとして働く
。種類の異なるヌクレオチドトリフオスフェート及び該
ヌクレオチドトリフオスフェートの重合のための試薬に
よって、つきでた−本鎖部分を鋳型として、５′側から
３′側方向に相補的な配列をもつオリゴヌクレオチドを
合成しながら二本鎖を形成する。（５）このようにして
作製されたオリゴヌクレオチドにニック（切れ目）が入
っている場合には、酵素等により切れ目がないように連
結してもよい。
合成されたオリゴヌクレオチドのブライマーとして働く
。種類の異なるヌクレオチドトリフオスフェート及び該
ヌクレオチドトリフオスフェートの重合のための試薬に
よって、つきでた−本鎖部分を鋳型として、５′側から
３′側方向に相補的な配列をもつオリゴヌクレオチドを
合成しながら二本鎖を形成する。（５）このようにして
作製されたオリゴヌクレオチドにニック（切れ目）が入
っている場合には、酵素等により切れ目がないように連
結してもよい。
より詳細に説明すると、
（１）で合成されるオリゴヌクレオチドの長さは、ＤＮ
Ａ合成装置で一度の合成できる長さ（通、常１００ｍｅ
ｒ以下）である。
Ａ合成装置で一度の合成できる長さ（通、常１００ｍｅ
ｒ以下）である。
（２） ５’末端にリン酸基をつける方法は化学的合成
によっても、ＡＴＰ存在下、Ｔ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼ等酵素による方法でも良い。
によっても、ＡＴＰ存在下、Ｔ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼ等酵素による方法でも良い。
少なくとも該操作により、オリゴヌクレオチドの未満に
リン酸基を付けておけば、上記（４）の工程で核酸塩基
を重合させていった時、重合試薬の選択のし方によって
は、重合時に自然に重合された核酸塩基とリン酸基の付
いたオリゴヌクレオチドの末端部で連結が行われること
がある。しかし、それだけで連結が不充分である場合に
は、以下（５）でのべるように連結試薬を用いて連結さ
せる。
リン酸基を付けておけば、上記（４）の工程で核酸塩基
を重合させていった時、重合試薬の選択のし方によって
は、重合時に自然に重合された核酸塩基とリン酸基の付
いたオリゴヌクレオチドの末端部で連結が行われること
がある。しかし、それだけで連結が不充分である場合に
は、以下（５）でのべるように連結試薬を用いて連結さ
せる。
（３）アニーリング反応では、該複数個の一本鎖オリゴ
ヌクレオチド混合物を適当な緩衝液中で、６５度以上で
１分間以上、好ましくは６５度にて１０分間、或いは、
９５度にて１分間以上加熱し、その後、溶液を室温に放
冷する。この反応により、該オリゴヌクレオチドは互い
に相補的な配列で結合し、部分的二本鎖を形成する。
ヌクレオチド混合物を適当な緩衝液中で、６５度以上で
１分間以上、好ましくは６５度にて１０分間、或いは、
９５度にて１分間以上加熱し、その後、溶液を室温に放
冷する。この反応により、該オリゴヌクレオチドは互い
に相補的な配列で結合し、部分的二本鎖を形成する。
（４）該溶液に合成試薬としてヌクレオチドトリフオス
フェートであるｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びＴＴ
Ｐを適量加える。
フェートであるｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びＴＴ
Ｐを適量加える。
また、重合試薬として用いる酵素には、Ｅ、ｃｏｌｉ
ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅ
ｎｏｗ断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ。
ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅ
ｎｏｗ断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ。
Ｍａｎｉａｔｉｓ、 ｅｔ、 ａｔ、 Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ ＣＩｏｎｉｎｇ１０８゜Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂａｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｔ７ＤＮＡ
ポリメラーゼ（Ｓ、Ｔａｂｏｒ ｅｔ、 ａｌ、 Ｐ
ｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
ａｒ ＣＩｏｎｉｎｇ１０８゜Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂａｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｔ７ＤＮＡ
ポリメラーゼ（Ｓ、Ｔａｂｏｒ ｅｔ、 ａｌ、 Ｐ
ｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、 ８４．４７６７−４
７７１ （１９８７）。
７７１ （１９８７）。
Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒ，に、５ａｉｋｉ、 ｅｔ
。
。
ａｌ、 ５ｃｉｅｎｅｃｅ、 ２３９． ４８７−４
９１ （１９８８）、他の入手可能なりＮＡポリメラー
ゼ類、逆転写酵素、及び他の酵素、例えば、各核酸の相
補的であるブライマー伸展生物を形成するために適当な
態様でのヌクレオチドの結合を促進する酵素が含まれる
。
９１ （１９８８）、他の入手可能なりＮＡポリメラー
ゼ類、逆転写酵素、及び他の酵素、例えば、各核酸の相
補的であるブライマー伸展生物を形成するために適当な
態様でのヌクレオチドの結合を促進する酵素が含まれる
。
（５）の反応は、ＤＮＡＮカリゼによって行われる。
ＤＮＡＮカリゼは、Ｅ、ｃｏｌｉ由来のものでもファー
ジＴ４由来のものでも良いし、或いは、同じ様な働きを
する他の酵素でも良い。
ジＴ４由来のものでも良いし、或いは、同じ様な働きを
する他の酵素でも良い。
以上により、二本鎖オリゴヌクレオチドが形成される。
一方、上記方法を利用して、標識二本鎖オリゴヌクレオ
チドも形成でき、以下同様に説明する。
チドも形成でき、以下同様に説明する。
（６）第１図のように３′末端、或いはまた５′末端に
６塩基対以上の相補的な配列を持つ複数個の一本鎖オリ
ゴヌクレオチドをＤＮＡ合成装置によって合成する。（
７）次に、各オリゴヌクレオチドの５′末端にリン酸基
を付ける。（８）次に、アニーリング反応によりこれら
二本のオリゴヌクレオチドを相補的な部分で結合させ、
部分的に二本鎖を構成させる。（９）このとき形成され
た部分的二本鎖の一本が他方の合成されたオリゴヌクレ
オチドのプライマーとして働き、種類の異なるヌクレオ
チドトリフオスフェート、標識ヌクレオチドトリフオス
フェート及び該ヌクレオチドトリフオスフェートの重合
のための試薬によって、つきでた−本鎖部分を鋳型とし
て、５′側から３′側方向に相補的な配列をもつオリゴ
ヌクレオチドを合成しながら二本鎖を形成する。該反応
の際に、標識ヌクレオチドトリフオスフェートを取り込
ませることができる。（１０）このようにして作製され
たオリゴヌクレオチドにニック（切れ目）が入っている
場合には、酵素等により切れ目がないように連結しても
よい。以上により、標識二本鎖オリゴヌクレオチドを形
成する。さらにハイブリダイゼーション反応に使用する
際には、（１１）該反応生物を変性条件下で処理し、二
本鎖を一本鎖に分離させ、プローブとしてハイブリダイ
ゼーション反応に使用する。より詳細に説明すると、（
６）、 （７）及び（８）は前述の（１）、 （２
）及び（３）の通りである。
６塩基対以上の相補的な配列を持つ複数個の一本鎖オリ
ゴヌクレオチドをＤＮＡ合成装置によって合成する。（
７）次に、各オリゴヌクレオチドの５′末端にリン酸基
を付ける。（８）次に、アニーリング反応によりこれら
二本のオリゴヌクレオチドを相補的な部分で結合させ、
部分的に二本鎖を構成させる。（９）このとき形成され
た部分的二本鎖の一本が他方の合成されたオリゴヌクレ
オチドのプライマーとして働き、種類の異なるヌクレオ
チドトリフオスフェート、標識ヌクレオチドトリフオス
フェート及び該ヌクレオチドトリフオスフェートの重合
のための試薬によって、つきでた−本鎖部分を鋳型とし
て、５′側から３′側方向に相補的な配列をもつオリゴ
ヌクレオチドを合成しながら二本鎖を形成する。該反応
の際に、標識ヌクレオチドトリフオスフェートを取り込
ませることができる。（１０）このようにして作製され
たオリゴヌクレオチドにニック（切れ目）が入っている
場合には、酵素等により切れ目がないように連結しても
よい。以上により、標識二本鎖オリゴヌクレオチドを形
成する。さらにハイブリダイゼーション反応に使用する
際には、（１１）該反応生物を変性条件下で処理し、二
本鎖を一本鎖に分離させ、プローブとしてハイブリダイ
ゼーション反応に使用する。より詳細に説明すると、（
６）、 （７）及び（８）は前述の（１）、 （２
）及び（３）の通りである。
（９）をさらに詳細に説明する。
（９）該溶液中に合成試薬としてヌクレオチドトリフオ
スフェートであるｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びＴ
ＴＰを適量加える。このとき、一種類以上の標識ヌクレ
オチドトリフオスフェートを加える。この場合、該標識
物質のみを加えてもよいし、非標識物質を混在させても
よい。
スフェートであるｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びＴ
ＴＰを適量加える。このとき、一種類以上の標識ヌクレ
オチドトリフオスフェートを加える。この場合、該標識
物質のみを加えてもよいし、非標識物質を混在させても
よい。
非標識ヌクレオチドトリフオスフェートを全（加えず、
標識物質のみを加えた場合、作成されたＤＮＡは、標識
された領域と標識されない領域が交互になるように構成
されたものになる。
標識物質のみを加えた場合、作成されたＤＮＡは、標識
された領域と標識されない領域が交互になるように構成
されたものになる。
標識物質としては、放射同位元素はもちろんの、こと、
ビオチン或は、ジニトロフェニルヌクレオチド誘導体を
はじめとする非放射性物質を使用することができる。
ビオチン或は、ジニトロフェニルヌクレオチド誘導体を
はじめとする非放射性物質を使用することができる。
また、重合試薬として用いる酵素には、Ｅ、ｃｏｌｉＤ
ＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏ
ｗ断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ、 ｅｔ。
ＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏ
ｗ断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ、 ｅｔ。
ａｌ、 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ １０
８． Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂａｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ）、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓ、Ｔａ
ｂｏｒ ｅｔ、 ａｌ、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａ
ｃａｄ。
８． Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂａｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ）、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓ、Ｔａ
ｂｏｒ ｅｔ、 ａｌ、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａ
ｃａｄ。
Ｓｃｉ、 ＵＳ、Ａ、 ８４．４７６７−４７７１ （
１９８７）、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒ９に、５ａｉ
ｋｉ、 ｅｔ。
１９８７）、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒ９に、５ａｉ
ｋｉ、 ｅｔ。
ａｌ、５ｃｉｅｎｅｃｅ、２３９，４８７−４９１ （
１９８８）、他の入手可能なりＮＡポリメラーゼ類、逆
転写酵素、及び他の酵素、例えば、各核酸の相補的であ
るプライマー伸展生成物を形成するために適当な態様で
のヌクレオチドの結合を促進する酵素が含まれる。
１９８８）、他の入手可能なりＮＡポリメラーゼ類、逆
転写酵素、及び他の酵素、例えば、各核酸の相補的であ
るプライマー伸展生成物を形成するために適当な態様で
のヌクレオチドの結合を促進する酵素が含まれる。
（ｌＯ）連結試薬として用いる酵素としては、ＤＮＡＮ
カリゼがある。ＤＮＡＮカリゼは、Ｅ、ｃｏｌｉ由来の
ものでもファージＴ４由来のものでも良いし、或いは同
じ様な働きをする他の酵素でも良い。
カリゼがある。ＤＮＡＮカリゼは、Ｅ、ｃｏｌｉ由来の
ものでもファージＴ４由来のものでも良いし、或いは同
じ様な働きをする他の酵素でも良い。
（１１）変性熱変性（例えば、９５度にて５分）でも、
アルカリによる方法でも、二本鎖を一本鎖に分離する方
法であれば他の方法でも良い。
アルカリによる方法でも、二本鎖を一本鎖に分離する方
法であれば他の方法でも良い。
例えば、５００塩基対の長さの二本鎖オリゴヌクレオチ
ドを作成しようとする場合、従来の方法では、１００ｍ
ｅｒのオリゴヌクレオチドをｌＯ本合成し、それぞれ連
結することが必要である。
ドを作成しようとする場合、従来の方法では、１００ｍ
ｅｒのオリゴヌクレオチドをｌＯ本合成し、それぞれ連
結することが必要である。
逐次二本鎖を合成して逐次連結し長いＤＮＡを作成する
場合、連結のさいの方向性を統一するために、各連結ス
テップの精製が必要になり、最終的な収率が低下してし
まう。
場合、連結のさいの方向性を統一するために、各連結ス
テップの精製が必要になり、最終的な収率が低下してし
まう。
これに対し、本発明の上記の形成方法では、あらかじめ
相補的な配列で水素結合を形成させてから、伸展反応で
鎖長をのばすため、すべてのオリゴヌクレオチドの混合
物を用いて一度に反応を行えるという利点がある。
相補的な配列で水素結合を形成させてから、伸展反応で
鎖長をのばすため、すべてのオリゴヌクレオチドの混合
物を用いて一度に反応を行えるという利点がある。
さらに該方法は、収率が向上し、ひいては精製の不要な
精度のよい形成方法となる。
精度のよい形成方法となる。
以下のようにして、本発明の形成方法を用いて５００塩
基対の遺伝子を作成する場合（つまりアニリングの部分
を８塩基対とすると、例えば、１００ ｍ ｅ ｒの長
さのオリゴヌクレオチドを５本および４０ ｍ ｅ ｒ
のオリゴヌクレオチドを一本合成して二本鎖オリゴヌク
レオチド形成するなら）、従来法の１０本に比べると、
約半分ですみ、試薬、時間および労力の節約となる。
基対の遺伝子を作成する場合（つまりアニリングの部分
を８塩基対とすると、例えば、１００ ｍ ｅ ｒの長
さのオリゴヌクレオチドを５本および４０ ｍ ｅ ｒ
のオリゴヌクレオチドを一本合成して二本鎖オリゴヌク
レオチド形成するなら）、従来法の１０本に比べると、
約半分ですみ、試薬、時間および労力の節約となる。
さらに従来法に比べ、逐次連結の手間と各ステップでの
チエツクの手間が省ける。
チエツクの手間が省ける。
また、１００塩基対の長さの二本鎖オリゴヌクレオチド
を形成しようとする場合、前述の逐次連結法で、例えば
５０ｍｅｒを４本作成して行うと、連結の際の方向性が
決まってないことによる低収率が問題となる。そこで−
度に１００ｍａｒのオリゴヌクレオチドを二本作成し、
アニールして二本鎖を形成させる方法が考えられる。
を形成しようとする場合、前述の逐次連結法で、例えば
５０ｍｅｒを４本作成して行うと、連結の際の方向性が
決まってないことによる低収率が問題となる。そこで−
度に１００ｍａｒのオリゴヌクレオチドを二本作成し、
アニールして二本鎖を形成させる方法が考えられる。
しかし、該方法にも以下の問題がある。１００ ｍ ｅ
ｒのオリゴヌクレオチドを一度に合成しようとすると
、その合成収率は、現状では１０％以下である。
ｒのオリゴヌクレオチドを一度に合成しようとすると
、その合成収率は、現状では１０％以下である。
そのため、次反応の前に所望の長さのもののみ精製し、
副産物を除（ことが必要であるが、１塩基の違いもなく
精度良く精製することは非常に難しい。
副産物を除（ことが必要であるが、１塩基の違いもなく
精度良く精製することは非常に難しい。
これに対し、本発明の方法を用いれば、前述の逐次連結
法で説明している低収率等の問題なく短い長さのオリゴ
ヌクレオチドを高収率で連結させ二本鎖オリゴヌクレオ
チドを合成することができる。例えば、１００塩基対の
長さの二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する場合、本発
明の方法では、アニーリング部分を６塩基対とすると、
例えば２５ ｍ ａ ｒの長さのオリゴヌクレオチドを
４本および２４ ｍ ｅ ｒの長さのオリゴヌクレオチ
ドを１本合成して形成させればよい。
法で説明している低収率等の問題なく短い長さのオリゴ
ヌクレオチドを高収率で連結させ二本鎖オリゴヌクレオ
チドを合成することができる。例えば、１００塩基対の
長さの二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する場合、本発
明の方法では、アニーリング部分を６塩基対とすると、
例えば２５ ｍ ａ ｒの長さのオリゴヌクレオチドを
４本および２４ ｍ ｅ ｒの長さのオリゴヌクレオチ
ドを１本合成して形成させればよい。
つまり、前述の逐次連結法での連結の際の方向性は問題
がないばかりか、短い長いのオリゴヌクレオチドが使用
できるため、１００ ｍ ｅ ｒのオリゴヌクレオチド
を合成するよりも２５ ｍ ｅ ｒのオリゴヌクレオチ
ドを合成する方が合成収率も良いし、副産物も少ない。
がないばかりか、短い長いのオリゴヌクレオチドが使用
できるため、１００ ｍ ｅ ｒのオリゴヌクレオチド
を合成するよりも２５ ｍ ｅ ｒのオリゴヌクレオチ
ドを合成する方が合成収率も良いし、副産物も少ない。
従って、精製も簡単となる。
さらに、二本鎖オリゴヌクレオチドが標識されている場
合、本発明の方法を用いると、以下のような効果がある
。
合、本発明の方法を用いると、以下のような効果がある
。
従来ニックトランスレーション法では、ニックのはいる
位置が特定できなかったために、その標識位置、および
標識量を制御することができなかった。そのためプロー
ブの強度も作成条件によって異なり、一定の強度を持つ
ものを毎回作成することは難しかった。
位置が特定できなかったために、その標識位置、および
標識量を制御することができなかった。そのためプロー
ブの強度も作成条件によって異なり、一定の強度を持つ
ものを毎回作成することは難しかった。
本発明の場合には、プローブ設計時に、あらかじめ、標
識量が予測でき、使用目的に応じてコントロールしなが
ら作製出来る。
識量が予測でき、使用目的に応じてコントロールしなが
ら作製出来る。
さらに、酵素反応時に、標識物質のみを加えることによ
り、標識領域と非標識領域が交互に入ったＤＮＡを作成
することも可能である。
り、標識領域と非標識領域が交互に入ったＤＮＡを作成
することも可能である。
このようにして作成したオリゴヌクレオチドの二本鎖は
、両方の鎖に標識物質が取り込まれており、それぞれの
鎖が比活性の高いプローブとし働く。
、両方の鎖に標識物質が取り込まれており、それぞれの
鎖が比活性の高いプローブとし働く。
従来のブライマー伸展法では５０塩基対以下の長さのも
の、ニックトランスレーション法では５００塩基対以上
の長さのものに標識を入れることができたが、本発明で
はこれらの中間の長さのプローブの作成も可能にできる
。
の、ニックトランスレーション法では５００塩基対以上
の長さのものに標識を入れることができたが、本発明で
はこれらの中間の長さのプローブの作成も可能にできる
。
以下、実施例を挙げて具体的に説明する。
実施例１
各々５′末端にＥｃｏＲＩの部位を持つ下記のような二
種類のオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌ
ｉｄ Ｂ’ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社３８１Ａ型）により
合成した。
種類のオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌ
ｉｄ Ｂ’ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社３８１Ａ型）により
合成した。
“ＧＣＧＣＴＡＡＴＧＧＧＡＡＴＴＣＧＧＡＣＧＣＴＣ
ＴＡＴＴＴＣＣＴＣＧＴＧＡＡＡＧＧＧＡＴＧＧＧＣＧ
ＴＴＧＣＧＧＡＣＣＣＡＧＡＴＧＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴ
ＣＴＡＣＧＣＣＡＴＴＧＣＧＣＡＧ””ＣＴ ＣＧ Ｃ
ＣＣＡＧＧＡＡＴＴＣＣＧＴＴＣＡＣＧＡＴＧＴＡＣＣ
ＴＣＴＣＧＡＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＴＡＴＧＧＣＣＴ
ＣＡＣＡＡＴＧＧＴＡＣＣＧＴＴＣＧＧＴＧＧＧＧＡＧ
ＣＣＴＧＣＴＧＣＧＣＡＡ”このうちの３′末端から８
塩基がそれぞれ互いに相補的な配列をもつ。
ＴＡＴＴＴＣＣＴＣＧＴＧＡＡＡＧＧＧＡＴＧＧＧＣＧ
ＴＴＧＣＧＧＡＣＣＣＡＧＡＴＧＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴ
ＣＴＡＣＧＣＣＡＴＴＧＣＧＣＡＧ””ＣＴ ＣＧ Ｃ
ＣＣＡＧＧＡＡＴＴＣＣＧＴＴＣＡＣＧＡＴＧＴＡＣＣ
ＴＣＴＣＧＡＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＴＡＴＧＧＣＣＴ
ＣＡＣＡＡＴＧＧＴＡＣＣＧＴＴＣＧＧＴＧＧＧＧＡＧ
ＣＣＴＧＣＴＧＣＧＣＡＡ”このうちの３′末端から８
塩基がそれぞれ互いに相補的な配列をもつ。
これらの合成されたオリゴヌクレオチドの一部について
、７Ｍ尿素を含む１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動を行ないその純度を調べた。その結果、１０％程度の
純度であったので、各オリゴヌクレオチド２μｇを上記
電気泳動にて精製し、１ ｍ Ｍ Ｅ Ｄ Ｔ Ａにて
抽出し以下の反応に用いた。
、７Ｍ尿素を含む１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動を行ないその純度を調べた。その結果、１０％程度の
純度であったので、各オリゴヌクレオチド２μｇを上記
電気泳動にて精製し、１ ｍ Ｍ Ｅ Ｄ Ｔ Ａにて
抽出し以下の反応に用いた。
エツベンドルフチューブに各オリゴヌクレオチド２μｇ
を入れ、ＩＯＸアニーリング溶液（１００ｍ ＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ ｐＨ８，０−６０ｍＭ ＭｇＣｌ！２
−６０ｍＭβ−メルカプトエタノール−５００ｍＭ
ＮａＣ！りを５μｌ加え、蒸留水にて、５０μｌに調整
した。これを６５度の温水が入ったビーカー中で１０分
間加温し、その後室温になるまでゆっ（り冷ました（所
要時間約１時間）。この反応で二本のオリゴヌクレオチ
ドは下記のような部分的二本鎖を形成する。
を入れ、ＩＯＸアニーリング溶液（１００ｍ ＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ ｐＨ８，０−６０ｍＭ ＭｇＣｌ！２
−６０ｍＭβ−メルカプトエタノール−５００ｍＭ
ＮａＣ！りを５μｌ加え、蒸留水にて、５０μｌに調整
した。これを６５度の温水が入ったビーカー中で１０分
間加温し、その後室温になるまでゆっ（り冷ました（所
要時間約１時間）。この反応で二本のオリゴヌクレオチ
ドは下記のような部分的二本鎖を形成する。
−非結合部一−コｒ−−結合部一一１−非結合部一この
溶液６０μｌｌに１ ｍ Ｍ ｄ Ａ Ｔ Ｐ 、
ｄ Ｇ Ｔ Ｐ 、 Ｔ Ｔ Ｐ 。
溶液６０μｌｌに１ ｍ Ｍ ｄ Ａ Ｔ Ｐ 、
ｄ Ｇ Ｔ Ｐ 、 Ｔ Ｔ Ｐ 。
及びｄＣＴＰをそれぞれ２μｌ、１０ｘアニーリング溶
液５μｌ、蒸留水３２μｌを加え、よ（混和したあとＤ
ＮＡポリメラーゼ■のＫｌｅｎｏｗ断片（ＴＯＹＯＢＯ
社製）１６単位を加え、３７度にて１時間加温し、伸展
反応を行なった。
液５μｌ、蒸留水３２μｌを加え、よ（混和したあとＤ
ＮＡポリメラーゼ■のＫｌｅｎｏｗ断片（ＴＯＹＯＢＯ
社製）１６単位を加え、３７度にて１時間加温し、伸展
反応を行なった。
その後、二本鎖ＤＮＡが計画通り作成されているか確認
するため、上記反応溶液からフェノール抽出、エタノー
ル沈殿を行なった後、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化を行な
い、この断片をクローニングベクターｐＵｃ１９のＥｃ
ｏＲ１部位につなぎ込んだ。この合成合成により作製し
た。下図のような８７． ８７．９５及び７９塩基長の
オリゴヌクレオチドを４本合成した。
するため、上記反応溶液からフェノール抽出、エタノー
ル沈殿を行なった後、制限酵素ＥｃｏＲＩで消化を行な
い、この断片をクローニングベクターｐＵｃ１９のＥｃ
ｏＲ１部位につなぎ込んだ。この合成合成により作製し
た。下図のような８７． ８７．９５及び７９塩基長の
オリゴヌクレオチドを４本合成した。
ＤＮＡＩμｇあたり１０’コロニ一以上ｍ二本鎖合成遺
伝子を含むプラスミドを保有するコロニーを得た。合成
が不完全な場合にはｐＵｃ１９のＥｃｏＲＩ部位には連
結されないことを考えると、酵素による伸展反応が完全
に行なわれたといえる。
伝子を含むプラスミドを保有するコロニーを得た。合成
が不完全な場合にはｐＵｃ１９のＥｃｏＲＩ部位には連
結されないことを考えると、酵素による伸展反応が完全
に行なわれたといえる。
このコロニーから定法（修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼに
よるＤＮＡ塩基配列決定法；細胞工学ｖｏ１．７Ｎ０．
９ １９８８ ｐ６１）に従ってＤＮＡを調製し、Ｄ
ＮＡ５ＥＱＵＥＮＣＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭ（ＡＢＩ社３
７０Ａ）を用いて塩基配列を確認したところ、当初設計
した二本鎖ＤＮＡが間違いな（合成されていることが確
認された。
よるＤＮＡ塩基配列決定法；細胞工学ｖｏ１．７Ｎ０．
９ １９８８ ｐ６１）に従ってＤＮＡを調製し、Ｄ
ＮＡ５ＥＱＵＥＮＣＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭ（ＡＢＩ社３
７０Ａ）を用いて塩基配列を確認したところ、当初設計
した二本鎖ＤＮＡが間違いな（合成されていることが確
認された。
各オリゴヌクレオチドの収率はｌｏ％程度であるため、
各オリゴヌクレオチドをゲル電気泳動により精製し、そ
れぞれの長さに担当するバンドをゲルから切り出し抽出
した。その後抽出物をあらためてゲル電気泳動により調
べるとそれぞれのオリゴヌクレオチドには１０％以上の
１塩基短い（合成が途中で止まった）オリゴヌクレオチ
ドが混入していた。
各オリゴヌクレオチドをゲル電気泳動により精製し、そ
れぞれの長さに担当するバンドをゲルから切り出し抽出
した。その後抽出物をあらためてゲル電気泳動により調
べるとそれぞれのオリゴヌクレオチドには１０％以上の
１塩基短い（合成が途中で止まった）オリゴヌクレオチ
ドが混入していた。
これらの４本のオリゴヌクレオチドを連結し、制限酵素
ＥｃｏＲＩで消化後この断片をクローニングベクターＰ
ＵＣ１９のＥｃｏＲ１部位につなぎこんだ。この合成遺
伝子が挿入されたプラスシトＰＵＣＩ９を大腸菌ＪＭ１
０９にトランスフォーメーションしたところそのトラン
スフォーメーションの効率はＤＮＡ１μｇあたり１０’
コロニ一程度であった。
ＥｃｏＲＩで消化後この断片をクローニングベクターＰ
ＵＣ１９のＥｃｏＲ１部位につなぎこんだ。この合成遺
伝子が挿入されたプラスシトＰＵＣＩ９を大腸菌ＪＭ１
０９にトランスフォーメーションしたところそのトラン
スフォーメーションの効率はＤＮＡ１μｇあたり１０’
コロニ一程度であった。
ｒランスフォーメーション効率のこのような低下は、そ
れぞれの鎖において２本（ＡとＢ或いはＣとＤ）が連結
する際に、１塩基短いオリゴヌクレオチドの混入が連結
効率を低下させたためと考えられる。
れぞれの鎖において２本（ＡとＢ或いはＣとＤ）が連結
する際に、１塩基短いオリゴヌクレオチドの混入が連結
効率を低下させたためと考えられる。
本実施例では合成する手間が従来例の半分であるばかり
でなく、このような連結の際の効率の低下を避けること
もできる点で有効である。
でなく、このような連結の際の効率の低下を避けること
もできる点で有効である。
実施例２
プラスミドｐＵｃ１９の塩基配列の一部に対応する下記
のような二種類のオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成装置
（ＡＰＰｌｉｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社３８１Ａ型
）によ社会８１Ａ型 ・：″″ＧＡＴＣＧＣＣＣＴＴＣＣＣＡＡＣＡＧＴＴＧ
ＣＧＣＡＧ４′ＧＡＴＣＧＣＣＣＴＴＣＣＣＡＡＣＡＧ
ＴＴＧＣＧＣＡＧ４′ニー□うちの３′末端から８塩基
がそれぞれ互いに相補的な配列をもつ。
のような二種類のオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成装置
（ＡＰＰｌｉｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社３８１Ａ型
）によ社会８１Ａ型 ・：″″ＧＡＴＣＧＣＣＣＴＴＣＣＣＡＡＣＡＧＴＴＧ
ＣＧＣＡＧ４′ＧＡＴＣＧＣＣＣＴＴＣＣＣＡＡＣＡＧ
ＴＴＧＣＧＣＡＧ４′ニー□うちの３′末端から８塩基
がそれぞれ互いに相補的な配列をもつ。
これらの合成されたオリゴヌクレオチドの一部について
、７Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルデミド電気泳動を
行ないその純度を調べた。その結果、９５％以上の純度
であったので、それ以上の精製を行なわずに以下の反応
に用いた。
、７Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルデミド電気泳動を
行ないその純度を調べた。その結果、９５％以上の純度
であったので、それ以上の精製を行なわずに以下の反応
に用いた。
エツペンドルフチューブに各オリゴヌクレオチド２μｇ
（約１３０ｐｍｏｌｅ）に１０ｘアニーリング溶液（１
００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ１ｐＨ８，０−６０ｍＭＭｇ（
１２−０−６Ｏβ−メルカプトエタノール−５００ｍＭ
ＮａＣｆ）を５μｌ加え、蒸留水にて５０μｌに調整し
た。これを６５度の温水が入ったビーカー中で１０分間
加温し、その後室温になるまでゆっくり冷ました（所要
時間約１時間）。この反応で二本のオリゴヌクレオチド
は下記のような部分的二本鎖を形成する。
（約１３０ｐｍｏｌｅ）に１０ｘアニーリング溶液（１
００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ１ｐＨ８，０−６０ｍＭＭｇ（
１２−０−６Ｏβ−メルカプトエタノール−５００ｍＭ
ＮａＣｆ）を５μｌ加え、蒸留水にて５０μｌに調整し
た。これを６５度の温水が入ったビーカー中で１０分間
加温し、その後室温になるまでゆっくり冷ました（所要
時間約１時間）。この反応で二本のオリゴヌクレオチド
は下記のような部分的二本鎖を形成する。
この溶液５０μ！に１ ｍ Ｍ ｄ Ａ Ｔ Ｐ 、
ｄ Ｇ Ｔ Ｐ及びｄＣＴＰをそれぞれ２μ、＋２．
０．４ｍＭビオチン化ＵＴＰ（ＢＲＬ社製）を５μＡ、
１０ｘアニーリング溶液５μｌ、蒸留水３２μｍを加え
、よ（混和したあとＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏ
ｗ断片（ＴＯＹＯＢＯ社製）１６単位を加え、３７度に
て１時間加温し、伸展反応を行なった。
ｄ Ｇ Ｔ Ｐ及びｄＣＴＰをそれぞれ２μ、＋２．
０．４ｍＭビオチン化ＵＴＰ（ＢＲＬ社製）を５μＡ、
１０ｘアニーリング溶液５μｌ、蒸留水３２μｍを加え
、よ（混和したあとＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏ
ｗ断片（ＴＯＹＯＢＯ社製）１６単位を加え、３７度に
て１時間加温し、伸展反応を行なった。
その後、未反応のビオチン化ＵＴＰを除去するために、
反応溶液をゲル濾過カラム（Ｂｉｏ−ｇｅｌｐ２ ；Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ社製０ 、５ ｘ ５ ｃ ｍ ）で精製
した。目的の標識ヌクレオチドはほとんどカラムを素通
りした分画に回収された。
反応溶液をゲル濾過カラム（Ｂｉｏ−ｇｅｌｐ２ ；Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ社製０ 、５ ｘ ５ ｃ ｍ ）で精製
した。目的の標識ヌクレオチドはほとんどカラムを素通
りした分画に回収された。
各フラクションを０．６ｍｌずつ収集し、それぞれ２μ
！をニトロセルロースフィルターに吸着させ、ＢＲＬ社
のプロトコールに従ってビオチンの発色反応を行なつた
ところ、２番目のフラクションが強く発色し、目的のオ
リゴヌクレオチドがビオチンによって標識されているこ
とが確認できた。
！をニトロセルロースフィルターに吸着させ、ＢＲＬ社
のプロトコールに従ってビオチンの発色反応を行なつた
ところ、２番目のフラクションが強く発色し、目的のオ
リゴヌクレオチドがビオチンによって標識されているこ
とが確認できた。
さらに、各フランクジョンの一部と、未反応のオリゴヌ
クレオチドをアガロースゲル電気泳動で調べたところ、
２番目のフラクションのオリゴヌクレオチドは明らかに
未反応のオリゴヌクレオチドよりも長く一本のバンドと
して検出され、酵素による伸展反応が完全に行なわれた
ことが確認された。
クレオチドをアガロースゲル電気泳動で調べたところ、
２番目のフラクションのオリゴヌクレオチドは明らかに
未反応のオリゴヌクレオチドよりも長く一本のバンドと
して検出され、酵素による伸展反応が完全に行なわれた
ことが確認された。
このプローブを用いて、コロニーハイブリダイゼーショ
ン、サザンハイブリダイゼーション、及び、スポットハ
イブリダイゼーションを行なったところ、いずれもｐＵ
ｃ１９プラスミドＤＮＡの部分のみが明確に発色した。
ン、サザンハイブリダイゼーション、及び、スポットハ
イブリダイゼーションを行なったところ、いずれもｐＵ
ｃ１９プラスミドＤＮＡの部分のみが明確に発色した。
次に、従来例（置換合成法及びプライマー伸展法）との
比較を行なった。
比較を行なった。
実施例２と同様の４１塩基対のプローブを置換合成法に
より作製した。つまり４１塩基長のオリゴヌクレオチド
を２本合成し、ゲル電気泳動により精製後（約５０％の
収率）二本鎖とした。
より作製した。つまり４１塩基長のオリゴヌクレオチド
を２本合成し、ゲル電気泳動により精製後（約５０％の
収率）二本鎖とした。
次に、その５′末端のリン酸を除去し、そのかわりにビ
オチン化ｄＵＴＰをＴ４ファージ由来ポリヌクレオキナ
ーゼで導入し、標識化したものを一本鎖に解離しプロー
ブとした。
オチン化ｄＵＴＰをＴ４ファージ由来ポリヌクレオキナ
ーゼで導入し、標識化したものを一本鎖に解離しプロー
ブとした。
また、上記４１塩基長のオリゴヌクレオチドのうち１本
と、それと３′末端が相補的な８塩基長のブライマーを
合成し、アニーリングさせた後、実施例２と同様な方法
でＫｌｅｎｏｗ断片による伸展反応でプローブを作製し
た（プライマー伸展法）。
と、それと３′末端が相補的な８塩基長のブライマーを
合成し、アニーリングさせた後、実施例２と同様な方法
でＫｌｅｎｏｗ断片による伸展反応でプローブを作製し
た（プライマー伸展法）。
プラスミドＤＮＡ ＰＵＣ１９及びＰＢＲ３２２をア
ルカリにより変性後、第４図のように１群Ｎｏ、ｉ〜１
０．１群Ｎｏ、１〜１０量のＤＮＡをニトロセルロース
フィルターにスポットした。
ルカリにより変性後、第４図のように１群Ｎｏ、ｉ〜１
０．１群Ｎｏ、１〜１０量のＤＮＡをニトロセルロース
フィルターにスポットした。
このようなフィルターを３枚作製し、８０°Ｃ２時間加
温後３種類のプローブ（従来法２種及び本実施例２）を
用いてハイブリダイゼーション反応を行なった。
温後３種類のプローブ（従来法２種及び本実施例２）を
用いてハイブリダイゼーション反応を行なった。
常法に従い発色反応を行なったところ、置換合成法によ
るプローブではＩの群では５ｎｇまで発色し、■群のコ
ントロールでは発色をみせなかった。
るプローブではＩの群では５ｎｇまで発色し、■群のコ
ントロールでは発色をみせなかった。
次にプライマー伸展法によるプローブを用いた場合には
ｌｎｇまで発色し、■群では発色しなかった。
ｌｎｇまで発色し、■群では発色しなかった。
本発明の方法により作製したプローブでは、０．１ｎｇ
まで発色し、■群のコントロールでは発色しなかった。
まで発色し、■群のコントロールでは発色しなかった。
この実験の結果、本発明の方法ではプローブ作製法が従
来の方法よりも容易なばかりでなく、検出感度も１０〜
５０倍上昇することが確認できた。
来の方法よりも容易なばかりでなく、検出感度も１０〜
５０倍上昇することが確認できた。
実施例３
高度好塩菌に存在する蛋白質であるバクテリオロドプシ
ンを精製し、そのＮ末端からのアミノ酸配列をプロティ
ンシーケンサ−により１６番目迄決定した。それをもと
に、ＤＮＡの塩基配列を推定し、下記のような２本のオ
リゴヌクレオチドをＤＮＡ合成装置により合成した。
ンを精製し、そのＮ末端からのアミノ酸配列をプロティ
ンシーケンサ−により１６番目迄決定した。それをもと
に、ＤＮＡの塩基配列を推定し、下記のような２本のオ
リゴヌクレオチドをＤＮＡ合成装置により合成した。
このうち、３′末端から８塩基対は互いに相補的な配列
である。
である。
合成されたオリゴヌクレオチドの一部を７Ｍ尿素を含む
１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にてその純度を
調べると、９０％以上の純度であると判断されたので、
さらに精製せずに以下の反応に使用した。
１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にてその純度を
調べると、９０％以上の純度であると判断されたので、
さらに精製せずに以下の反応に使用した。
エツペンドルフチューブに、各オリゴヌクレオチド−４
５ｎｇ （３ｐｍｏｌｅ）に１０ｘアニーリング溶液（
実施例２参照）２μｌを加え、蒸留水で２０μｌに調製
した。
５ｎｇ （３ｐｍｏｌｅ）に１０ｘアニーリング溶液（
実施例２参照）２μｌを加え、蒸留水で２０μｌに調製
した。
６５度の温水２００ｍｊ？を入れたビーカー中で１０分
間加温し、それを室温になるまでゆっくり放冷した。こ
の反応で２本のオリゴヌクレオチドは下記のようにアニ
ールする。
間加温し、それを室温になるまでゆっくり放冷した。こ
の反応で２本のオリゴヌクレオチドは下記のようにアニ
ールする。
次に、このアニールしたオリゴヌクレオチド溶液２０
μｆに１０ｘアニーリング溶液２ μＩ！ 、 １ｍ
ＭｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、及び、ｄＧＴＰを各２μ！加え
、さらに、：、”２Ｐ −Ｔ Ｔ Ｐ １００μＣｉ、
さらに、蒸留水を加えて全液量を４０μｌとした後、Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片１単位を加え、
水中で１時間反応させた。
μｆに１０ｘアニーリング溶液２ μＩ！ 、 １ｍ
ＭｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、及び、ｄＧＴＰを各２μ！加え
、さらに、：、”２Ｐ −Ｔ Ｔ Ｐ １００μＣｉ、
さらに、蒸留水を加えて全液量を４０μｌとした後、Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片１単位を加え、
水中で１時間反応させた。
この反応生成物の中から、未反応の、ａ２Ｐ−ＴＴＰを
除去するために、反応溶液に９８％ホルムアミド−０，
０５％キシレンシアノ−ルーブロモフェノールブルー溶
液２０μｌを加えて、９０度で２分間加熱し、変性させ
てから、７Ｍ尿素を含む１０％ポリアクリルアミドゲル
電気泳動を行なった。ｔｏｏｏｖ。
除去するために、反応溶液に９８％ホルムアミド−０，
０５％キシレンシアノ−ルーブロモフェノールブルー溶
液２０μｌを加えて、９０度で２分間加熱し、変性させ
てから、７Ｍ尿素を含む１０％ポリアクリルアミドゲル
電気泳動を行なった。ｔｏｏｏｖ。
３時間の泳動後ゲルをガラス板からはずし、そのうえに
Ｘ線フィルムをあてて、約３０秒間放置した。
Ｘ線フィルムをあてて、約３０秒間放置した。
このフィルムを現像したところ、参考図のようなバンド
が得られた。キシレンシアツール、及び、ブロモフェノ
ールブルーの泳動された位置から推定すると、このバン
ドは４８ｍａｒに相当し、２８ｍａｒの合成オリゴヌク
レオチドが伸展反応により４８ ｍ ａ ｒになったこ
とが確認された。しかも、伸展反応は完全に行なわれて
おり、長さの短い副産物は見られず、単一のバンドであ
った。
が得られた。キシレンシアツール、及び、ブロモフェノ
ールブルーの泳動された位置から推定すると、このバン
ドは４８ｍａｒに相当し、２８ｍａｒの合成オリゴヌク
レオチドが伸展反応により４８ ｍ ａ ｒになったこ
とが確認された。しかも、伸展反応は完全に行なわれて
おり、長さの短い副産物は見られず、単一のバンドであ
った。
この位置に対応するゲルを切り出し、１ ｍ Ｍ Ｅ
Ｄ Ｔ Ａ溶液で３７度にて一昼夜抽出し、その強度を
液体シンチレーションカウンターで測定してみると、作
製されたプローブは１０’ｃｐｍ以上のきわめて強い強
度をもつことがわかった。
Ｄ Ｔ Ａ溶液で３７度にて一昼夜抽出し、その強度を
液体シンチレーションカウンターで測定してみると、作
製されたプローブは１０’ｃｐｍ以上のきわめて強い強
度をもつことがわかった。
このプローブを用いたハイブリダイゼーション反応は、
コロニー、サザン、スポットのいずれも良好な結果を与
えた。
コロニー、サザン、スポットのいずれも良好な結果を与
えた。
実施例４
実施例２のｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びビオチン
化ＵＴＰをそれぞれ２１ｔｌの１ ｍ Ｍ Ａ Ｔ
Ｐ 、 Ｇ Ｔ Ｐ及びＣＴＰと５μ！の０．４ｍＭビ
オチン化ＵＴＰに変えた他は実施例２と同様の実験を行
なったところ、該実施例４でも良好な結果が得られた。
化ＵＴＰをそれぞれ２１ｔｌの１ ｍ Ｍ Ａ Ｔ
Ｐ 、 Ｇ Ｔ Ｐ及びＣＴＰと５μ！の０．４ｍＭビ
オチン化ＵＴＰに変えた他は実施例２と同様の実験を行
なったところ、該実施例４でも良好な結果が得られた。
実施例５
実施例２のｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰを加える際、
さらに２μｌの１ｍＭ ＴＴＰを加えて以下同様の実
験を行なった。該実施例５も良好な結果を示した。
さらに２μｌの１ｍＭ ＴＴＰを加えて以下同様の実
験を行なった。該実施例５も良好な結果を示した。
実施例６
下記のような３本のオリゴヌクレオチドＤＮＡ合成装置
（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社３８１型
）により合成した。
（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社３８１型
）により合成した。
１）５’ ＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＧＴＡＣＴＧＴＴＧＣ
ＡＴＧＴＴＧＧＡＧＴＴＡＴＴＧＣＣＡＡＣＡＧＣＡＧ
ＴＧＧＡＧＧＧＧＧＴＡＴＣＧＣＡＧＧＣＣＣＡＧＡＴ
ＣＡＣＣＧＧＡＣＧＴＴＣＴＧＧＣＴＡＧＣＧＣＴＣＧ
ＧＴＡＣＧ３’２）５’ ＧＣＧＣＴＡＡＴＧＧＧＡ
ＣＴＣＧＧＧＡＣＧＣＴＣＴＡＴＴＴＣＣＴＣＧＴＧＡ
ＡＡＧＧＧＡＴＧＧＧＣＧＴＣＴＣＧＧＡＣＣＣＡＧＡ
ＴＧＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＣＧＣＣＡＴＣＡＣＧ
ＡＣＧＧＡＣ旦Ｕ口哩≧９Δ３′３）５’ ＡＴＴＡ
ＧＣＧＣＣＴＣＧＴＣＣＣＡＧＣＣＡＴＣＧＣＧＴＴＣ
ＡＣＧＡＴＣＴＡＣＣＴＣＴＣＧＡＴＧＣＴＧＣＴＧＧ
ＧＧＴＡＴＧＧＣＣＴＣＡＣＡＡＴＧＧＴＡＣＣＧＴＴ
ＣＧＴＣＧＴＡＧＡＧＴＴＡＡＡＣＡＡＣＡＧ３’１番
目と３番目の合成オリゴヌクレオチドには、制限酵素Ｅ
ｃｏＲ１部位を組み込んである。また、３′末端、或い
はまた５′末端から８塩基対（下線部）は互いに相補的
な配列である。
ＡＴＧＴＴＧＧＡＧＴＴＡＴＴＧＣＣＡＡＣＡＧＣＡＧ
ＴＧＧＡＧＧＧＧＧＴＡＴＣＧＣＡＧＧＣＣＣＡＧＡＴ
ＣＡＣＣＧＧＡＣＧＴＴＣＴＧＧＣＴＡＧＣＧＣＴＣＧ
ＧＴＡＣＧ３’２）５’ ＧＣＧＣＴＡＡＴＧＧＧＡ
ＣＴＣＧＧＧＡＣＧＣＴＣＴＡＴＴＴＣＣＴＣＧＴＧＡ
ＡＡＧＧＧＡＴＧＧＧＣＧＴＣＴＣＧＧＡＣＣＣＡＧＡ
ＴＧＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＣＧＣＣＡＴＣＡＣＧ
ＡＣＧＧＡＣ旦Ｕ口哩≧９Δ３′３）５’ ＡＴＴＡ
ＧＣＧＣＣＴＣＧＴＣＣＣＡＧＣＣＡＴＣＧＣＧＴＴＣ
ＡＣＧＡＴＣＴＡＣＣＴＣＴＣＧＡＴＧＣＴＧＣＴＧＧ
ＧＧＴＡＴＧＧＣＣＴＣＡＣＡＡＴＧＧＴＡＣＣＧＴＴ
ＣＧＴＣＧＴＡＧＡＧＴＴＡＡＡＣＡＡＣＡＧ３’１番
目と３番目の合成オリゴヌクレオチドには、制限酵素Ｅ
ｃｏＲ１部位を組み込んである。また、３′末端、或い
はまた５′末端から８塩基対（下線部）は互いに相補的
な配列である。
合成されたオリゴヌクレオチドの一部を７Ｍ尿素を含む
１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にてその純度を
調べると、ｌＯ％程度の純度であると判断されたので、
所望の長さのバンドをゲルから切り出して１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡにより抽出し、エタノール沈澱にて回収した後、
以下の反応に用いた。
１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にてその純度を
調べると、ｌＯ％程度の純度であると判断されたので、
所望の長さのバンドをゲルから切り出して１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡにより抽出し、エタノール沈澱にて回収した後、
以下の反応に用いた。
各オリゴヌクレオチド０．１μｇをエツペンドルフチュ
ーブに入れ、ＩＯＸキナーゼ緩衝液（０，５ＭＴｒｉｓ
−ＨＣｊ’ ｐＨ８，０−０，１Ｍ ＭｇＣｌ！２
−０．１Ｍβ−メルカプトエタノール） １０μｌ、１
ｍＭＡＴＰ１０μｍ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ
１μｆ （１０単位）（ＴＯＹＯＢＯ社製）を加え、３
７度にて１時間加温した。
ーブに入れ、ＩＯＸキナーゼ緩衝液（０，５ＭＴｒｉｓ
−ＨＣｊ’ ｐＨ８，０−０，１Ｍ ＭｇＣｌ！２
−０．１Ｍβ−メルカプトエタノール） １０μｌ、１
ｍＭＡＴＰ１０μｍ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ
１μｆ （１０単位）（ＴＯＹＯＢＯ社製）を加え、３
７度にて１時間加温した。
次に、１０ｘアニーリング溶液（１００ｍ Ｍ Ｔ ｒ
ｉ ｓ −Ｈ（ｌ ｐＨ８，０−６０ｍＭ Ｍｇ
Ｃ１２−６０ｍＭβ−０ｍＭβ−メルカプトエタノール
５０ＮａＣｊ！ ） ５ μｉ！を加え、蒸留水で５０
μｌに調製した。
ｉ ｓ −Ｈ（ｌ ｐＨ８，０−６０ｍＭ Ｍｇ
Ｃ１２−６０ｍＭβ−０ｍＭβ−メルカプトエタノール
５０ＮａＣｊ！ ） ５ μｉ！を加え、蒸留水で５０
μｌに調製した。
これらのオリゴヌクレオチドを６５度の温水２００ｍ１
を入れたビーカー中で１０分間加温し、それを室温にな
るまでゆっくり放冷した。この反応で３本のオリゴヌク
レオチドは第２図のようにアニールする。
を入れたビーカー中で１０分間加温し、それを室温にな
るまでゆっくり放冷した。この反応で３本のオリゴヌク
レオチドは第２図のようにアニールする。
次に、このアニールしたオリゴヌクレオチド溶液５０７
１１！に１０ｘアニーリング溶液５ μｍ、１ｍＭｄＡ
ＴＰ。
１１！に１０ｘアニーリング溶液５ μｍ、１ｍＭｄＡ
ＴＰ。
ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びＴＴＰを各２μ！加え、さらに
、蒸留水を加えて全液量を１００μｌとした後、ＤＮＡ
ポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片２単位を加え、３７
度にて１時間反応させ、伸展反応を行なった。
、蒸留水を加えて全液量を１００μｌとした後、ＤＮＡ
ポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片２単位を加え、３７
度にて１時間反応させ、伸展反応を行なった。
さらに、上記反応溶液をフェノール抽出し、エタノール
沈澱にてＤＮＡ回収したあと、その長さを１０％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動にて調べたところ、約３００
塩基対の所にバンドが検出された。
沈澱にてＤＮＡ回収したあと、その長さを１０％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動にて調べたところ、約３００
塩基対の所にバンドが検出された。
次に、制限酵素ＥｃｏＲＩで常法にしたがって消化を行
ない、この合成遺伝子をＭ１３ファージのＥｃｏＲＩ部
位に連結した。それを大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、
合成遺伝子を含むプラスミドを保有するプラークを得た
。常法にしたがってこの合成遺伝子の塩基配列をＤＮＡ
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ （ＡＢ１
社３７０Ａ）により調べたところ当初の設計どうりの順
番に連結されていることが確認できた。
ない、この合成遺伝子をＭ１３ファージのＥｃｏＲＩ部
位に連結した。それを大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、
合成遺伝子を含むプラスミドを保有するプラークを得た
。常法にしたがってこの合成遺伝子の塩基配列をＤＮＡ
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ （ＡＢ１
社３７０Ａ）により調べたところ当初の設計どうりの順
番に連結されていることが確認できた。
１００塩基長程度のオリゴヌクレオチドの合成には約１
日を要する。従来の方法により、実施例１と同じ合成遺
伝子を作製するためには、実施例６で合成した１００塩
基長のオリゴヌクレオチド３本の他に９２．９２．８４
塩基長のオリゴヌクレオチドを合成しなければならない
。そのためには最低３日余分に合成に時間が必要である
。その上精製にも手間がかかる。
日を要する。従来の方法により、実施例１と同じ合成遺
伝子を作製するためには、実施例６で合成した１００塩
基長のオリゴヌクレオチド３本の他に９２．９２．８４
塩基長のオリゴヌクレオチドを合成しなければならない
。そのためには最低３日余分に合成に時間が必要である
。その上精製にも手間がかかる。
本発明の方法によると従来の方法と同じ長さの合成遺伝
子を作製する場合に、従来の半分の時間と半分の試薬で
作製できた。
子を作製する場合に、従来の半分の時間と半分の試薬で
作製できた。
実施例７
実施例６で用いた３本のオリゴヌクレオチドにさらに下
記に示す３本のオリゴヌクレオチドを合成し、計６本の
オリゴヌクレオチドを用いて実施例６と同様の実験を行
なった。
記に示す３本のオリゴヌクレオチドを合成し、計６本の
オリゴヌクレオチドを用いて実施例６と同様の実験を行
なった。
４）５’ ＴＧＡＣＧＧＴＴＣＡＴＣＧＧＴＴＣＴＡＡ
ＡＴＴＣＣＧＴＣＡＣＧＡＧＣＧＴＡＣＣＡＴＡＣＴＡ
ＡＴＴＧＧＡＴＣＴＡＣＴＧＧＧＣＧＣＧＧＴＡＣＧＣ
ＴＧＡＣＴＧＧＣＴＧＴＴＣＡＣＣＡＣＧＣＣＧＣＴＧ
ＴＴＧＴＴ３’５）５’ ＡＡＣＣＧＴＣＡＴＣＧＣＧ
ＴＴＧＣＧＣＧＴＴＧＡＣＧＣＧＧＡＴＣＡＧＧＧＡＡ
ＣＧＧＴＴＡＧＡＣＣＴＣＧＣＧＴＴＧＣＴＣＧＴＴＣ
ＡＣＧＣＣＧＡＴＣＡＧＧＧＡＡＣＧＡＴＣＴＡＣＴＧ
ＧＧＣＧＣＧＧＴＡＣＧＣ３’６）５’ ＴＧＡＧＡ
ＡＴＴＣＧＣＧＡＴＣＴＴＣＧＧＣＧＡＡＧＣＣＧＡＡ
ＧＣＧＣＣＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＧＴＡＣＣＧ３’ 実施例６に記載の１番目の合成オリゴヌクレオチドと６
番目の合成オリゴヌクレオチドには、制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ部位を組み込んである。また、３′ 末端、或いはま
た５′ 末端から８塩基対（下線部）は互いに相補的な
配列である。
ＡＴＴＣＣＧＴＣＡＣＧＡＧＣＧＴＡＣＣＡＴＡＣＴＡ
ＡＴＴＧＧＡＴＣＴＡＣＴＧＧＧＣＧＣＧＧＴＡＣＧＣ
ＴＧＡＣＴＧＧＣＴＧＴＴＣＡＣＣＡＣＧＣＣＧＣＴＧ
ＴＴＧＴＴ３’５）５’ ＡＡＣＣＧＴＣＡＴＣＧＣＧ
ＴＴＧＣＧＣＧＴＴＧＡＣＧＣＧＧＡＴＣＡＧＧＧＡＡ
ＣＧＧＴＴＡＧＡＣＣＴＣＧＣＧＴＴＧＣＴＣＧＴＴＣ
ＡＣＧＣＣＧＡＴＣＡＧＧＧＡＡＣＧＡＴＣＴＡＣＴＧ
ＧＧＣＧＣＧＧＴＡＣＧＣ３’６）５’ ＴＧＡＧＡ
ＡＴＴＣＧＣＧＡＴＣＴＴＣＧＧＣＧＡＡＧＣＣＧＡＡ
ＧＣＧＣＣＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＧＴＡＣＣＧ３’ 実施例６に記載の１番目の合成オリゴヌクレオチドと６
番目の合成オリゴヌクレオチドには、制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ部位を組み込んである。また、３′ 末端、或いはま
た５′ 末端から８塩基対（下線部）は互いに相補的な
配列である。
合成されたオリゴヌクレオチドの一部を７Ｍ尿素を含む
１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にてその純度を
調べると、１０％程度の純度であると判断されたので、
所望の長さのバンドをゲルから切り出して１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡにより抽出し、エタノール沈澱にて回収した後、
以下の反応に用いた。
１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にてその純度を
調べると、１０％程度の純度であると判断されたので、
所望の長さのバンドをゲルから切り出して１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡにより抽出し、エタノール沈澱にて回収した後、
以下の反応に用いた。
各オリゴヌクレオチド０．１μｇをエツペンドルフチュ
ーブに入れ、１０Ｘキナーゼ緩衝液（０，５ＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌ２ ｐＨ８，０−０，ＩＭ ＭｇＣｆ１２
−０．１Ｍβ−メルカプトエタノール）１０μ！！ 、
１ ｍ Ｍ Ａ Ｔ Ｐ１０μ！及びＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼ１μｆ （１０単位）（ＴＯＹＯＢＯ
社製）を加え、３７度にて１時間加温した。
ーブに入れ、１０Ｘキナーゼ緩衝液（０，５ＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌ２ ｐＨ８，０−０，ＩＭ ＭｇＣｆ１２
−０．１Ｍβ−メルカプトエタノール）１０μ！！ 、
１ ｍ Ｍ Ａ Ｔ Ｐ１０μ！及びＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼ１μｆ （１０単位）（ＴＯＹＯＢＯ
社製）を加え、３７度にて１時間加温した。
次に、１０ｘアニーリング溶液（１００ｍ Ｍ Ｔ ｒ
ｉ ｓ −ＨＣｌ ｐＨ８，０−６０ｍＭ Ｍｇ
Ｃ１２−６０ｍＭβ−メルカプトエタノール−５００ｍ
Ｍ ＮａＣ１）５Ｉｌｌ加え、蒸留水で５０μｌに調
製した。
ｉ ｓ −ＨＣｌ ｐＨ８，０−６０ｍＭ Ｍｇ
Ｃ１２−６０ｍＭβ−メルカプトエタノール−５００ｍ
Ｍ ＮａＣ１）５Ｉｌｌ加え、蒸留水で５０μｌに調
製した。
これらのオリゴヌクレオチドを６５度の温水２００ｍ１
ｌを入れたビーカー中で１０分間加温し、それを室温に
なるまでゆっくり放冷した。この反応で６本のオリゴヌ
クレオチドは第３図のようにアニールする。
ｌを入れたビーカー中で１０分間加温し、それを室温に
なるまでゆっくり放冷した。この反応で６本のオリゴヌ
クレオチドは第３図のようにアニールする。
次に、このアニールしたオリゴヌクレオチド溶液５０ｐ
ｌに１０ｘアニーリング溶液５ μｍ、１ｍＭｄＡＴＰ
。
ｌに１０ｘアニーリング溶液５ μｍ、１ｍＭｄＡＴＰ
。
ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びＴＴＰを各２μ！加え、さらに
、蒸留水を加えて全液量を１００μ矛とした後、ＤＮＡ
ポリメラーゼエのＫｌｅｎｏｗ断片１２単位を加え、３
７度にて１時間反応させ、伸展反応を行なった。
、蒸留水を加えて全液量を１００μ矛とした後、ＤＮＡ
ポリメラーゼエのＫｌｅｎｏｗ断片１２単位を加え、３
７度にて１時間反応させ、伸展反応を行なった。
さらに、上記反応溶液をフェノール抽出し、エタノール
沈澱にてＤＮＡ回収したあと、その長さを１０％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動にて調べたところ、約５００
塩基対の所にバンドが検出された。
沈澱にてＤＮＡ回収したあと、その長さを１０％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動にて調べたところ、約５００
塩基対の所にバンドが検出された。
次に、制限酵素ＥｃｏＲＩで常法にしたがって消化を行
ない、この合成遺伝子をＭ１３ファージのＥｃｏＲ１部
位に連結した。それを大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、
合成遺伝子を含むプラスミドを保有するプラークを得た
。常法にしたがってこの合成遺伝子の塩基配列をＤＮＡ
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ （ＡＢＩ
社３７０Ａ）により調べたところ当初の設計どうりの順
番に連結されていることが確認できた。
ない、この合成遺伝子をＭ１３ファージのＥｃｏＲ１部
位に連結した。それを大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、
合成遺伝子を含むプラスミドを保有するプラークを得た
。常法にしたがってこの合成遺伝子の塩基配列をＤＮＡ
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ （ＡＢＩ
社３７０Ａ）により調べたところ当初の設計どうりの順
番に連結されていることが確認できた。
実施例８
プラスミドｐＵｃ１９の塩基配列の一部に対応する下記
のような四種類のオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成装置
（Ａｐｐｌｉｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社３８１Ａ型
）によ社会８１Ａ型 このうちの３′末端或いはまた５′ 末端から８塩基が
それぞれ互いに相補的な配列をもつ。
のような四種類のオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成装置
（Ａｐｐｌｉｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社３８１Ａ型
）によ社会８１Ａ型 このうちの３′末端或いはまた５′ 末端から８塩基が
それぞれ互いに相補的な配列をもつ。
これらの合成されたオリゴヌクレオチドの一部について
、７Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動を行ないその純度を調べた。その結果、９５％以上の
純度であったので、それ以上の精製を行なわずに以下の
反応に用いた。
、７Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動を行ないその純度を調べた。その結果、９５％以上の
純度であったので、それ以上の精製を行なわずに以下の
反応に用いた。
各オリゴヌクレオチド２μｇ（約１３０ｐｍｏｆｅ）を
エツペンドルフチューブに入れ、ＩＯＸキナーゼ緩衝液
（０，５ＭＴｒｉｓＨＣ１ｐＨ８，０−０，１ＭＭｇＣ
ｊ？ ２−０．１Ｍβ−メルカプトエタノール）１０
μｍ、１ｍＭＡＴＰ１０μｌ及びＴ４ポリヌクレオチキ
ドナーゼｌμＩ！（１０単位）（ＴＯＹＯＢＯ社製）を
加え、３７度にて１時間加温した。
エツペンドルフチューブに入れ、ＩＯＸキナーゼ緩衝液
（０，５ＭＴｒｉｓＨＣ１ｐＨ８，０−０，１ＭＭｇＣ
ｊ？ ２−０．１Ｍβ−メルカプトエタノール）１０
μｍ、１ｍＭＡＴＰ１０μｌ及びＴ４ポリヌクレオチキ
ドナーゼｌμＩ！（１０単位）（ＴＯＹＯＢＯ社製）を
加え、３７度にて１時間加温した。
次に、１０ｘアニーリング溶液（１００ｍ Ｍ Ｔ ｒ
ｉ ｓ −ＨＣｌ ｐＨ８，０−６＋ＯｍＭ Ｍｇ
Ｃ１２−６０ｍＭβ−メルカプトエタノール５００ｍＭ
ＮａＣｊり５μ！加え、蒸留水にて５０μｌに調整
した。これを６５度の温水が入ったビーカー中で１０分
間加温し、その後室温になるまでゆっくり冷ました（所
要時間約１時間）。この反応で４本のオリゴヌクレオチ
ドは下記のような部分的２本鎖を形成する。
ｉ ｓ −ＨＣｌ ｐＨ８，０−６＋ＯｍＭ Ｍｇ
Ｃ１２−６０ｍＭβ−メルカプトエタノール５００ｍＭ
ＮａＣｊり５μ！加え、蒸留水にて５０μｌに調整
した。これを６５度の温水が入ったビーカー中で１０分
間加温し、その後室温になるまでゆっくり冷ました（所
要時間約１時間）。この反応で４本のオリゴヌクレオチ
ドは下記のような部分的２本鎖を形成する。
５・ＧＣＣＡＴＴ・・・ＣＴＧＣＧＣＡＡ ＧＧＧＣＧ
ＡＴＣ・・・ＣＣＴＣＴＴＣＧ ”この溶液５０μｍに
１ ｍ Ｍ ｄ Ａ Ｔ Ｐ 、 ｄ Ｇ Ｔ Ｐ及び
ｄＣＴＰをそれぞれ２ μｌ 、 ０．４ｍＭビオチン
化ＵＴＰ （ＢＲＬ社製）を５μｍ、１０ｘアニーリン
グ溶液５μ！。
ＡＴＣ・・・ＣＣＴＣＴＴＣＧ ”この溶液５０μｍに
１ ｍ Ｍ ｄ Ａ Ｔ Ｐ 、 ｄ Ｇ Ｔ Ｐ及び
ｄＣＴＰをそれぞれ２ μｌ 、 ０．４ｍＭビオチン
化ＵＴＰ （ＢＲＬ社製）を５μｍ、１０ｘアニーリン
グ溶液５μ！。
蒸留水３２μｌを加え、よく混和したあとＤＮＡポリメ
ラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片（ＴＯＹＯＢＯ社製）１６
単位を加え、３７度にて１時間加温し、伸展反応を行な
った。
ラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片（ＴＯＹＯＢＯ社製）１６
単位を加え、３７度にて１時間加温し、伸展反応を行な
った。
その後、未反応のビオチン化ＵＴＰを除去するために、
反応溶液をゲル濾過カラム（Ｂｉｏ−ｇｅｔ Ｐ２
；Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製０．５Ｘ５ｃｍ）で精製した。目
的の標識ヌクレオチドはは、とんどカラムを素通りした
分画に回収された。
反応溶液をゲル濾過カラム（Ｂｉｏ−ｇｅｔ Ｐ２
；Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製０．５Ｘ５ｃｍ）で精製した。目
的の標識ヌクレオチドはは、とんどカラムを素通りした
分画に回収された。
各フラクションを０．５ｍｌずつ収集し、それぞれ２μ
ｌをニトロセルロースフィルターに吸着させ、ＢＲＬ社
のプロトコールに従って発色反応を行なったところ、２
番目のフラクションが強く発色し、目的のオリゴヌクレ
オチドがビオチンによって標識されていることが確認で
きた。
ｌをニトロセルロースフィルターに吸着させ、ＢＲＬ社
のプロトコールに従って発色反応を行なったところ、２
番目のフラクションが強く発色し、目的のオリゴヌクレ
オチドがビオチンによって標識されていることが確認で
きた。
次に、従来例（置換合成法ニックトランスレーション法
及びプライマー伸展法）との比較を行なった。
及びプライマー伸展法）との比較を行なった。
実施例７と同様の８０塩基対のプローブを置換合成法に
より作製した。つまり８０塩基長のオリゴヌクレオチド
を２本合成し、ゲル電気泳動により精製後（約２０％の
収率）２本鎖とした。
より作製した。つまり８０塩基長のオリゴヌクレオチド
を２本合成し、ゲル電気泳動により精製後（約２０％の
収率）２本鎖とした。
次に、その５′末端のリン酸を除去し、そのかわりにビ
オチン化ｄＵＴＰをＴ４ファージ由来ポリヌクレオキナ
ーゼで導入し、標識化したものを一本鎖に解離しプロー
ブＡとした。
オチン化ｄＵＴＰをＴ４ファージ由来ポリヌクレオキナ
ーゼで導入し、標識化したものを一本鎖に解離しプロー
ブＡとした。
上記の８０塩基対の２本鎖オリゴヌクレオチドにニック
トランスレーションによりビオチン化ｄＵＴＰをとりこ
ませてプローブＢとした。
トランスレーションによりビオチン化ｄＵＴＰをとりこ
ませてプローブＢとした。
また、上記８０塩基長のオリゴヌクレオチドのうち１本
と、それと３′末端が相補的な８塩基長のプライマーを
合成し、アニーリングさせた後、実施例２と同様な方法
でＫｌｅｎｏｗ断片による伸展反応でプローブＣを作製
した（プライマー伸展法）。
と、それと３′末端が相補的な８塩基長のプライマーを
合成し、アニーリングさせた後、実施例２と同様な方法
でＫｌｅｎｏｗ断片による伸展反応でプローブＣを作製
した（プライマー伸展法）。
各プローブＡ、 Ｂ、 Ｃを実施例８と同様ゲル３
過カラムで精製した。Ａでは本実施例と同様２番目のフ
ラクションに発色がみられたがその程度は、本発明より
もかなりうすいものであった。Ｂではほとんど発色せず
反応が良好に行なわれていなかったことが示された。Ｃ
では２番目のフラクションの他に３．４番目も発色し、
長さの短い副産物がかなりできていることが示された。
過カラムで精製した。Ａでは本実施例と同様２番目のフ
ラクションに発色がみられたがその程度は、本発明より
もかなりうすいものであった。Ｂではほとんど発色せず
反応が良好に行なわれていなかったことが示された。Ｃ
では２番目のフラクションの他に３．４番目も発色し、
長さの短い副産物がかなりできていることが示された。
これらのことから８０塩基対のプローブ作製にはニック
トランスレーション法及びプライマー伸展法は不適当で
あることが示された。
トランスレーション法及びプライマー伸展法は不適当で
あることが示された。
次に、プラスミドＤＮＡ ＰＯＣｌ２及びＰＢＲ３２
２をアルカリにより変性後、第４図のように１群Ｎｏ。
２をアルカリにより変性後、第４図のように１群Ｎｏ。
１−１０，１群ＮＯ３１〜１０量のＤＮＡをニトロセル
ロースフィルターにスポットした。
ロースフィルターにスポットした。
このようなフィルターを２枚作製し、８０°０２時間加
熱後２種類のプローブ（従来法である置換合成法及び本
実施例８）を用いてハイブリダイゼーション反応を行な
った。
熱後２種類のプローブ（従来法である置換合成法及び本
実施例８）を用いてハイブリダイゼーション反応を行な
った。
常法に従い発色反応を行なったところ、置換合成法によ
るプローブではＩの群では５ｎｇまで発色発色し、■群
のコントロールでは発色しなかった。
るプローブではＩの群では５ｎｇまで発色発色し、■群
のコントロールでは発色しなかった。
この実験の結果、本発明の方法ではプローブ作製法が従
来の方法よりも容易なばかりでな（、検出感度も１００
倍上昇することが、確認できた。
来の方法よりも容易なばかりでな（、検出感度も１００
倍上昇することが、確認できた。
実施例９
高度好塩菌に存在する蛋白質であるバクテリオロドプシ
ンのＤＮＡの塩基配列の一部である４本のオリゴヌクレ
オチドをＤＮＡ合成装置により合成した。
ンのＤＮＡの塩基配列の一部である４本のオリゴヌクレ
オチドをＤＮＡ合成装置により合成した。
このうち、３′ 末端から８塩基対は互いに相補的な配
列である。
列である。
合成されたオリゴヌクレオチドの一部を７Ｍ尿素を含む
１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にてその純度を
調べると、９０％以上の純度であると判断されたので、
さらに精製せずに以下の反応に使用した。
１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にてその純度を
調べると、９０％以上の純度であると判断されたので、
さらに精製せずに以下の反応に使用した。
各オリゴヌクレオチド４５ｎｇをエツペンドルフチュー
ブに入れ、ＩＯＸキナーゼ緩衝液（０、５Ｍ Ｔ ｒ
ｉ ５ＨＣｆ ｐＨ８，００，ＩＭ ＭｇＣ１２
０，１Ｍβ−メルカプトエタノール）１０ μ！！、１
ｍＭＡＴＰ１０μ！及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ
ｌμ１（１０単位）（ＴＯＹＯＢＯ社製）を加え、３７
度にて１時間加温した。
ブに入れ、ＩＯＸキナーゼ緩衝液（０、５Ｍ Ｔ ｒ
ｉ ５ＨＣｆ ｐＨ８，００，ＩＭ ＭｇＣ１２
０，１Ｍβ−メルカプトエタノール）１０ μ！！、１
ｍＭＡＴＰ１０μ！及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ
ｌμ１（１０単位）（ＴＯＹＯＢＯ社製）を加え、３７
度にて１時間加温した。
次に、ｆｏｘアニーリング溶液（実施例３参照）２μｌ
加え、蒸留水で２０μｌに調整した。
加え、蒸留水で２０μｌに調整した。
これを、６５度の温水２００ｍｆを入れたビーカー中で
１０分間加温し、それを室温になるまでゆっくり放冷し
た。この反応で４本のオリゴヌクレオチドはアニールす
る。
１０分間加温し、それを室温になるまでゆっくり放冷し
た。この反応で４本のオリゴヌクレオチドはアニールす
る。
次に、このアニールしたオリゴヌクレオチド溶液２０μ
ｌに１０ｘアニーリング溶液２μｔ２、４２ｐ−ｄ Ａ
Ｔ Ｐ 、 、’３’？Ｐ ｄ ＣＴ Ｐ 、 ニ
ー 舒Ｐ −ｄ Ｇ Ｔ Ｐ 及Ｕ ：、 ！２ｐ−Ｔ
ＴＰ１００μＣｉをそれぞれ加え、さらに、蒸留水を加
えて全液量を４０μｌとした後、ＤＮＡポリメラーゼ■
のＫｌｅｎｏｗ断片１単位を加え、３７度３０分間加温
した。この反応生成物のなかから、未反応のｒ、！ｐ−
ＮＴＰを除去するために、反応溶液に９８％ホルムアミ
ド−０，０５％キシレンシアノ−ルーブロモフェノール
ブルー溶液２０μｌを加えて、９０度で２分間加熱し、
変性させから、７Ｍ尿素を含む１０％ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動を行なった。
ｌに１０ｘアニーリング溶液２μｔ２、４２ｐ−ｄ Ａ
Ｔ Ｐ 、 、’３’？Ｐ ｄ ＣＴ Ｐ 、 ニ
ー 舒Ｐ −ｄ Ｇ Ｔ Ｐ 及Ｕ ：、 ！２ｐ−Ｔ
ＴＰ１００μＣｉをそれぞれ加え、さらに、蒸留水を加
えて全液量を４０μｌとした後、ＤＮＡポリメラーゼ■
のＫｌｅｎｏｗ断片１単位を加え、３７度３０分間加温
した。この反応生成物のなかから、未反応のｒ、！ｐ−
ＮＴＰを除去するために、反応溶液に９８％ホルムアミ
ド−０，０５％キシレンシアノ−ルーブロモフェノール
ブルー溶液２０μｌを加えて、９０度で２分間加熱し、
変性させから、７Ｍ尿素を含む１０％ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動を行なった。
１０００Ｖ、３時間の泳動後ゲルをガラス板からはずし
、そのうえにＸ線フィルムをあてて、約３０秒間放置し
た。このフィルムを現像したところ、７８ｍｅｒに対応
するバンドが一本得られ、他の短、！為産物は見られず
、２４ ｍ ａ ｒの４本の合成オリゴヌクレオチドが
伸展反応により完全に７８ｍａｒになったことが確認さ
れた。また、この伸展反応物が、交互に標識の入ったも
のであることが確認された。
、そのうえにＸ線フィルムをあてて、約３０秒間放置し
た。このフィルムを現像したところ、７８ｍｅｒに対応
するバンドが一本得られ、他の短、！為産物は見られず
、２４ ｍ ａ ｒの４本の合成オリゴヌクレオチドが
伸展反応により完全に７８ｍａｒになったことが確認さ
れた。また、この伸展反応物が、交互に標識の入ったも
のであることが確認された。
この位置に対応するゲルを切り出し、１ ｍ Ｍ Ｅ
Ｄ Ｔ Ａ溶液で３７度にて一昼夜抽出し、その強度を
液体シンチレーションカウンターで測定してみると、作
製されたプローブは１１０ｌ０ｃｐ以上のきわめて強い
強度をもつことがわかった。
Ｄ Ｔ Ａ溶液で３７度にて一昼夜抽出し、その強度を
液体シンチレーションカウンターで測定してみると、作
製されたプローブは１１０ｌ０ｃｐ以上のきわめて強い
強度をもつことがわかった。
このプローブを用いたハイブリダイゼーション反応は、
コロニー、サザン、スポットのいずれも良好な結果を与
えた。
コロニー、サザン、スポットのいずれも良好な結果を与
えた。
実施例８と同様に従来法により７８ ｍ ａ ｒのプロ
ーブを３種作製した。その後エタノール沈殿により未反
応の放射性物質をとり除き、沈殿物の放射線の強度をシ
ンチレーションカウンターで測定すると、置換合成法に
より作製したプローブＡでは１０’ｃｐｍプライマー伸
展法ではｌｏ”ｃｐｍｓニックトランスレーション法で
は１０”ｃｐｍの強度を示した。
ーブを３種作製した。その後エタノール沈殿により未反
応の放射性物質をとり除き、沈殿物の放射線の強度をシ
ンチレーションカウンターで測定すると、置換合成法に
より作製したプローブＡでは１０’ｃｐｍプライマー伸
展法ではｌｏ”ｃｐｍｓニックトランスレーション法で
は１０”ｃｐｍの強度を示した。
これらのプローブをゲル電気泳動で調べてみると、プロ
ーブＡ及びプローブＣでは７８ ｍ ａ ｒの部分にバ
ンドが観測されたものの、プローブＢでは７８ ｍ ａ
ｒを最長に短い副産物のバンドが数多く観測され、７
８ ｍ ａ ｒに相当するバンドのみを切り出して抽出
し、エタノール沈殿で回収して放射線の強度を測定する
と１０’ｃｐｍ程度であった。
ーブＡ及びプローブＣでは７８ ｍ ａ ｒの部分にバ
ンドが観測されたものの、プローブＢでは７８ ｍ ａ
ｒを最長に短い副産物のバンドが数多く観測され、７
８ ｍ ａ ｒに相当するバンドのみを切り出して抽出
し、エタノール沈殿で回収して放射線の強度を測定する
と１０’ｃｐｍ程度であった。
これらのプローブを用いて高度好塩菌の全ＤＮＡのＰｓ
ｔＩ消化物に対しサザンハイプリダイゼーションを行な
った。各レーンに０．０１μｇ、 ０．０５μｇ。
ｔＩ消化物に対しサザンハイプリダイゼーションを行な
った。各レーンに０．０１μｇ、 ０．０５μｇ。
０．１μｇ、 ０．５μｇ、 １μｇ、 ２μｇのＰｓ
ｔＩ消化物を泳動しサザンプロット後、サザンハイプリ
ダイゼーションを行なった。
ｔＩ消化物を泳動しサザンプロット後、サザンハイプリ
ダイゼーションを行なった。
プローブＡ及びＢでは２μｇ及びｌμｇ泳動したレーン
に、５ｋｂ程度の長さのハイブリダイズする弱いバンド
がみられた。プローブＣではバンドは観測されなかった
。本発明の方法では０．０１μｇのレーンにおいてもＳ
ｋｂ付近に強いバンドが観測され、従来法の１００倍以
上の検出感度であることが示された。
に、５ｋｂ程度の長さのハイブリダイズする弱いバンド
がみられた。プローブＣではバンドは観測されなかった
。本発明の方法では０．０１μｇのレーンにおいてもＳ
ｋｂ付近に強いバンドが観測され、従来法の１００倍以
上の検出感度であることが示された。
実施例１０
実施例８のｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びビオチン
化ＵＴＰを、それぞれ２７１１の１ ｍ Ｍ Ａ Ｔ
Ｐ 、 Ｇ Ｔ Ｐ及びＣＴＰと５７１１の０ 、４
ｍ Ｍビオチン化ＵＴＰに変えた他は実施例８と同様の
実験を行なった。
化ＵＴＰを、それぞれ２７１１の１ ｍ Ｍ Ａ Ｔ
Ｐ 、 Ｇ Ｔ Ｐ及びＣＴＰと５７１１の０ 、４
ｍ Ｍビオチン化ＵＴＰに変えた他は実施例８と同様の
実験を行なった。
このようにして作成したオリゴヌクレオチド２本鎖は、
両方の鎖にＤＮＡ領域とＲＮＡ領域が交互に入ったオリ
ゴヌクレオチドとなっていた。
両方の鎖にＤＮＡ領域とＲＮＡ領域が交互に入ったオリ
ゴヌクレオチドとなっていた。
実施例１１
実施例８のｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰを加える際、
さらに２μｌの１ｍＭ ＴＴＰを加えて以下同様の実
験を行なった。
さらに２μｌの１ｍＭ ＴＴＰを加えて以下同様の実
験を行なった。
該実施例１１も良好な結果を示した。
上記実施例から明らかなように、第１の発明により、合
成収率も良いし、副産物も少ない１．従って、精製も簡
単な方法が得られた。
成収率も良いし、副産物も少ない１．従って、精製も簡
単な方法が得られた。
さらに２００塩基対に近い長さの遺伝子が一度に合成で
きる方法が得たれた。
きる方法が得たれた。
また、第２の発明の方法では、今までよりも短いオリゴ
ヌクレオチドを合成すれば良いので、精製の手間が省け
た。また、−本鎖ＤＮＡを鋳型にしてＤＮＡポリメラー
ゼ等により合成させる反応においても、従来の方法より
短時間に、しかもより完全に進行させることが確認でき
た。成る意味では、ニックトランスレーション法とブラ
イマー伸展法で作製できない長さのプローブ作製法とも
いえる。
ヌクレオチドを合成すれば良いので、精製の手間が省け
た。また、−本鎖ＤＮＡを鋳型にしてＤＮＡポリメラー
ゼ等により合成させる反応においても、従来の方法より
短時間に、しかもより完全に進行させることが確認でき
た。成る意味では、ニックトランスレーション法とブラ
イマー伸展法で作製できない長さのプローブ作製法とも
いえる。
さらに本発明に得られた標識二本鎖オリゴヌクレオチド
は、両方の鎖に標識物質が取り込まれており、それぞれ
の鎖が比活性の高いプローブとして働くので、ハイブリ
ダイゼーションの効率を高めることができた。
は、両方の鎖に標識物質が取り込まれており、それぞれ
の鎖が比活性の高いプローブとして働くので、ハイブリ
ダイゼーションの効率を高めることができた。
第１図、第２図及び第３図は本発明に用いる部分的２本
鎖を説明するための概略図であり、第４図は実施例２及
び実施例８を説明する図である。 ３′５′ ＴＣＣＩ；ＡＡＴＴ、、、、、、、ＴＣＧＧＴＡＣ６１
１１１１１１１ Ａ６ｃｃＡＴｌｉＣ ＡＴＴＡＧＣＧＣ−・・−・ ＋１１１１１１ ・・・・・ＴＡＡＴにＧＣ＆ ＡＡ ＣＡ Ａ ＣＡθ （υ
鎖を説明するための概略図であり、第４図は実施例２及
び実施例８を説明する図である。 ３′５′ ＴＣＣＩ；ＡＡＴＴ、、、、、、、ＴＣＧＧＴＡＣ６１
１１１１１１１ Ａ６ｃｃＡＴｌｉＣ ＡＴＴＡＧＣＧＣ−・・−・ ＋１１１１１１ ・・・・・ＴＡＡＴにＧＣ＆ ＡＡ ＣＡ Ａ ＣＡθ （υ
Claims (24)
- （１）ａ）おのおののオリゴヌクレオチドの末端領域の
一部が互いに相補的な配列部をもつ少なくとも一対のオ
リゴヌクレオチドを合成する工程、 ｂ）前記一対のオリゴヌクレオチドを該相補的な配列部
で結合させる工程、 ｃ）おのおののオリゴヌクレオチドに核酸塩基を重合さ
せる工程とを有することを特徴とするオリゴヌクレオチ
ドの形成方法。 - （２）前記ｃ）工程でヌクレオチドトリフオスフェート
と重合試薬を使用する請求項１記載のヌクレオチドの形
成方法。 - （３）該重合試薬がＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ
、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ
断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラー
ゼ、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素で
ある請求項２記載のオリゴヌクレオチドの形成方法。 - （４）ｄ）おのおののオリゴヌクレオチドの末端領域の
一部が互いに相補的な配列部をもつ少なくとも一対のオ
リゴヌクレオチドを合成する工程、 ｅ）前記一対のオリゴヌクレオチドを該相補的な配列部
で結合させる工程、 ｆ）おのおののオリゴヌクレオチドに標識を施した核酸
塩基を重合させる工程とを有することを特徴とする標識
オリゴヌクレオチドの形成方法。 - （５）前記ｆ）工程でヌクレオチドトリフオスフェート
と、標識ヌクレオチドトリフオスフェートと重合試薬を
使用する請求項４記載のオリゴヌクレオチドの形成方法
。 - （６）該標識ヌクレオチドが放射性同位元素、ビオチン
誘導体、ジニトロフェニル誘導体により標識されている
ことを特徴とする請求項５記載の標識オリゴヌクレオチ
ドの形成方法。 - （７）該重合試薬がＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ
、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ
断片、Ｔ４ポリメラーゼ、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ
、または逆転写酵素である請求項５記載の標識オリゴヌ
クレオチドの形成方法。 - （８）おのおののオリゴヌクレオチドの末端領域の一部
が相補的な配列で結合した部分的二本鎖オリゴヌクレオ
チドであって、おのおの非結合部は酵素による伸展法に
よる鋳型である部分的二本鎖オリゴヌクレオチド。 - （９）相補的な結合部をもつ一対のオリゴヌクレオチド
の双方のオリゴヌクレオチドに標識された核酸塩基を導
入させたことを特徴とする標識二本鎖オリゴヌクレオチ
ド。 - （１０）前記標識二本鎖オリゴヌクレオチドの核酸配列
が遺伝子疾患、癌性疾患または伝染性疾患と関連してい
る請求項９記載の標識二本鎖オリゴヌクレオチド。 - （１１）請求項４で形成した標識オリゴヌクレオチドを
二本鎖から一本鎖に形成する工程を経てプローブに使用
することを特徴とする標識オリゴヌクレオチドの形成方
法。 - （１２）［１］おのおのの３′末端領域で互いに相補的
な配列部をもつ第一のオリゴヌクレオチドと第二のオリ
ゴヌクレオチドを合成する工程および前記第一又は第二
のオリゴヌクレオチドの５′末端領域と相補的な配列部
をもつ５′末端領域を有する第三のオリゴヌクレオチド
を合成する工程、 ［２］前記第一のオリゴヌクレオチドと第二のオリゴヌ
クレオチドを該相補的な配列部で結合させる工程、およ
び前記第一のオリゴヌクレオチド又は第二のオリゴヌク
レオチドのいずれかと第三のオリゴヌクレオチドを該相
補的な配列部で結合させる工程、 ［３］前記［１］と［２］の工程を経て得られたオリゴ
ヌクレオチドに核酸塩基を重合・連結させる工程とを有
することを特徴とするオリゴヌクレオチドの形成方法。 - （１３）前記［３］工程の核酸塩基を重合・連結させる
際、ヌクレオチドトリフオスフェートと重合試薬を使用
する請求項１２記載のオリゴヌクレオチドの形成方法。 - （１４）該重合試薬がＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラー
ゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏ
ｗ断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラ
ーゼ、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素
である請求項１３記載のオリゴヌクレオチドの形成方法
。 - （１５）前記［３］工程の重合・連結させる際、連結試
薬を使用する請求項１２記載のオリゴヌクレオチドの形
成方法。 - （１６）該連結試薬がＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡライゲース
またはＴ４ＤＮＡライゲースである請求項１２記載のオ
リゴヌクレオチドの形成方法。 - （１７）［４］おのおのの３′末端領域で互いに相補的
な配列部をもつ第一のオリゴヌクレオチドと第二のオリ
ゴヌクレオチドを合成する工程および前記第一又は第二
のオリゴヌクレオチドの５′末端領域と相補的な配列部
をもつ５′末端領域を有する第三のオリゴヌクレオチド
を合成する工程、 ［５］前記第一のオリゴヌクレオチドと第二のオリゴヌ
クレオチドを該相補的な配列部で結合させる工程、およ
び前記第一のオリゴヌクレオチド又は第二のオリゴヌク
レオチドのいずれかと第三のオリゴヌクレオチドを該相
補的な配列部で結合させる工程、 ［６］前記［４］と［５］の工程を経て得られたオリゴ
ヌクレオチドに標識を施した核酸塩基を有する核酸塩基
を重合・連結させる工程とを有することを特徴とする標
識オリゴヌクレオチドの形成方法。 - （１８）前記［６］工程の核酸塩基を重合・連結させる
際、ヌクレオチドトリフオスフェートと標識ヌクレオチ
ドトリフオスフェート重合試薬を使用する請求項１７記
載の標識オリゴヌクレオチドの形成方法。 - （１９）該標識ヌクレオチドが放射性同位元素、ビオチ
ン誘導体、ジニトロフェニル誘導体により標識されてい
ることを特徴とする請求項１８記載の標識オリゴヌクレ
オチドの形成方法。 - （２０）該重合試薬がＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラー
ゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏ
ｗ断片、Ｔ４ポリメラーゼ、熱安定性ＤＮＡポリメラー
ゼ、または逆転写酵素である請求項１８記載の標識オリ
ゴヌクレオチドの形成方法。 - （２１）前記［６］工程の重合・連結させる際、連結試
薬を使用する請求項１７記載の標識オリゴヌクレオチド
の形成方法。 - （２２）該連結試薬がＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡライゲース
または、Ｔ４ＤＮＡライゲースである請求項１７記載の
標識オリゴヌクレオチドの形成方法。 - （２３）さらに［６］の工程経て得られた標識オリゴヌ
クレオチド１本鎖に分離する工程を有する請求項１７記
載の標識オリゴヌクレオチドの形成方法。 - （２４）請求項２３の方法により得られた標識オリゴヌ
クレオチドを用いるプローブ。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34313489A JPH037583A (ja) | 1989-02-28 | 1989-12-29 | 部分的二本鎖オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドの形成方法 |
| EP90103830A EP0385410B1 (en) | 1989-02-28 | 1990-02-27 | Partially double-stranded oligonucleotide and method for forming oligonucleotide |
| DE69028725T DE69028725T2 (de) | 1989-02-28 | 1990-02-27 | Partiell doppelsträngiges Oligonukleotid und Verfahren zu seiner Bildung |
| AT90103830T ATE143696T1 (de) | 1989-02-28 | 1990-02-27 | Partiell doppelsträngiges oligonukleotid und verfahren zu seiner bildung |
| US07/974,303 US5830643A (en) | 1989-02-28 | 1992-11-10 | Partially double-stranded oligonucleotide and method for forming oligonucleotide |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4890889 | 1989-02-28 | ||
| JP1-48908 | 1989-02-28 | ||
| JP1-50738 | 1989-03-01 | ||
| JP34313489A JPH037583A (ja) | 1989-02-28 | 1989-12-29 | 部分的二本鎖オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドの形成方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH037583A true JPH037583A (ja) | 1991-01-14 |
Family
ID=26389254
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP34313489A Pending JPH037583A (ja) | 1989-02-28 | 1989-12-29 | 部分的二本鎖オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドの形成方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH037583A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9258074B2 (en) | 2000-12-11 | 2016-02-09 | Sharp Kabushiki Kaisha | Wireless communication system |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6119492A (ja) * | 1984-06-14 | 1986-01-28 | チバ‐ガイギー アクチエンゲゼルシヤフト | ヒルジン化合物の製造方法 |
-
1989
- 1989-12-29 JP JP34313489A patent/JPH037583A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6119492A (ja) * | 1984-06-14 | 1986-01-28 | チバ‐ガイギー アクチエンゲゼルシヤフト | ヒルジン化合物の製造方法 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9258074B2 (en) | 2000-12-11 | 2016-02-09 | Sharp Kabushiki Kaisha | Wireless communication system |
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