JPH11503919A

JPH11503919A - 核酸の同時配列決定

Info

Publication number: JPH11503919A
Application number: JP8532185A
Authority: JP
Inventors: アンゾルゲヴィルヘルム; フォスハルトムート; シュテーゲマンヨーゼフ; ヴィーマンシュテファン
Original assignee: オイロペイシェスラボラトリウムフュアモレクラールビオロギー（エーエムベーエル）
Priority date: 1995-04-27
Filing date: 1996-04-26
Publication date: 1999-04-06
Also published as: EP0826067A1; WO1996034114A1; DE19515552A1; US5976802A

Abstract

(57)【要約】本発明は、標識付けられたデオキシリボヌクレオシド三リン酸を核酸−プライマー分子に結合させる酵素的標識付け反応による標識付けられた核酸断片の形成及び標識付けを介するヌクレイン配列の決定を包含する、核酸の配列特異的標識付けの方法に関し、この際、単一の反応容器中で、１又は数個の核酸−プライマー分子及び各々異なる標識化基及び異なる塩基を含有する少なくとも２種の標識付けられたデオキシリボヌクレオシド三リン酸の同時の存在下に、かつ、核酸−プライマー分子に、標識付けられたデオキシリボヌクレオシド三リン酸の１種類だけを結合させる条件下で、標識付け反応を行なう。

Description

【発明の詳細な説明】核酸の同時配列決定本発明は、標識付けられたデオキシリボヌクレオシド三リン酸を核酸−プライマー分子に結合させる酵素的標識付け反応による標識付けられた核酸断片の形成及び標識付けを介するヌクレイン配列の決定を包含する、核酸の配列特異性標識付け及び同時配列決定のための方法に関する。サンガーによる酵素的鎖遮断法によるＤＮＡ−配列決定の際には、核酸−鋳型（Matritze）から出発して、多数の異なる長さの標識付けられた核酸断片を酵素的伸長反応及び終止反応によって形成し、この際、合成オリゴヌクレオチドプライマーは、ポリメラーゼ及びデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）及び鎖遮断分子、特にジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）の混合物を用いて伸長されかつ終止される。その際、通例は、４つのバッチ中で、各々デオキシリボヌクレオシド三リン酸の混合物（ｄＮＴＰｓ）及び各々１つのジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を使用する。この方法で、伸長する核酸鎖中への鎖遮断分子の統計的組込みが達成され、この際、鎖遮断分子の組込みの後に、遊離の３′−ＯＨ− 基の欠如に基づき、ＤＮＡ−鎖はもはやそれ以上伸長することはできない。従って、統計的に見て、各組込み可能な位置に鎖遮断分子１個を含有し、そこで終止する、異なる長さの多数のＤＮＡ−断片が生じる。各鎖遮断分子の組込みに基づき１個の塩基で特異的に終止する断片を有するこれらの４つのバッチは、例えば、ポリアクリルアミドーゲル電気泳動法により、その長さにより、通例、４つの異なる痕跡に分離され、これら核酸断片の標識付けを介して配列が決定される。現在、ＤＮＡ−配列決定は、通例、非−放射性標識付け、特に、蛍光−標識付けを使用する自動化システムにより実施されている（L.M.Smith et al、Nature3 21(1986)、674〜679；W.Ansorge et al、J．Biochem．Biophys．Meth．13(1986) 、315〜323）。これらの自動化システムでは、ヌクレオチド配列は、標識付けられた断片の分離の間に直接読み取られ、コンピューターに直接入力される。核酸の配列決定のための自動化法においては、非−放射性標識付けられた基は、標識付けられたプライマー分子、標識付けられた鎖遮断分子を介してか又は標識付けられたｄＮＴＰを介する分子内標識として挿入することができる。これら全ての公知の標識付け法では、配列決定反応が各々単独で反応容器中で実施され、従って配列決定反応では常に１つの配列だけが得られる。世界知的所有権特許出願（ＷＯ）９３／０３１８０号明細書に、核酸断片が、分子内標識としての少なくとも１つの非−放射性の標識付けられたｄＮＴＰの組込みにより決定される、核酸の配列決定法が記載されていて、ここでは、核酸断片への分子内標識の挿入は鎖遮断分子の不在下に行なわれる。 Wiemann et al（Anal．Biochem．224（1995）117〜121）によって、単一の反応容器中で、２種の異なる標識付けられたプライマー分子を用いる、２つの核酸配列の同時決定が記載された。しかしながら、この方法の欠点は、色素標識付けられたオリゴヌクレオチドプライマーを使用しなければならず、その製造は極めて経費がかかり又は／及び労力がいることにある。特に、各配列決定反応のために異なるプライマーを使用すべきである、“ウオーキング・プライマー（Walkir g primer）”−法の使用下でのより長い遺伝子断片の配列決定の際に、これらの欠点が現われる。更に、標識付けられたプライマーの使用によって、しばしば、核酸鋳型でのプライマーのハイブリダイゼーションが阻止され、このことは不正確な配列決定結果をもたらし得る。これらの欠点を回避するために、２つの配列決定反応を、各々、１個の標識付けられていないプライマー及び２種の各々異なる標識付けられたｄＮＴＰの１種を用いて、２つの別々の反応容器中で実施し、２つの生成物を混合させ、それらを同時にゲル上に置き、かつ配列を決定することができる。しかしながら、この方法の欠点は、別々の反応容器中での２つの配列決定反応の実施が、経費がかかり煩雑であることにある。従って、本方法の課題は、公知技術水準の欠点を少なくとも部分的に排除している、核酸の配列特異性標識付け法及び配列決定法を提供することであった。特に、本発明による方法は、少なくとも２種の異なる標識付けられたｄＮＴＰ及び少なくとも２個の、有利に標識付けられていないのプライマー分子の使用下で、単一の反応容器中で、２つ又はそれ以上の配列決定反応の同時実施を可能にすべきである。本発明による課題は、標識付けられたデオキシリボヌクレオシド三リン酸を核酸−プライマー分子に結合させる酵素的標識付け反応による標識付けられた核酸断片の形成及び標識付けを介する核酸配列の決定を包含する、核酸の配列特異的標識付けのための方法によって解決され、この際、この方法は、単一の反応容器中で、１又は数個の核酸−プライマー分子及び各々異なる標識化基及び異なる塩基を含有する少なくとも２種の標識付けられたデオキシリボヌクレオシド三リン酸の同時の存在下に、かつ核酸−プライマー分子に、各々ただ１種の標識付けられたデオキシリボヌクレオシド三リン酸を結合させる条件下で、標識付け反応を行なうことを特徴とする。核酸−プライマー分子は、核酸、有利に、各反応条件下でそれでハイブリダイゼーション反応を成立させるために、反応バッチ中に存在する１個の核酸に対して充分に相補的であるＤＮＡである。このプライマー分子の長さは、有利にヌクレオチド１０〜１００、特に有利に１２〜５０、最も有利に１２〜３０である。本発明による方法では、１つの核酸−プライマー分子に、各々、標識付けられたｄＮＴＰｓのただ１種だけ、有利には、各々、標識付けられたｄＮＴＰｓのただ１種だけ、有利には、各々、標識付けられたｄＮＴＰただ１種だけが結合されるように、酵素的標識付け反応の実施が行なわれる。標識付けられたｄＮＴＰは、有利に、プライマーの３′−末端（位置＋１）に直接結合される。この場合には、標識付けられたｄＮＴＰの塩基は、プライマー分子とハイブリダイズする核酸上にプライマーに対して相補的な領域の５′−側に直接配列されている塩基に対して相補的である。ただ１種の標識の特異的組込みが、各プライマーの背後で保証されている限り、この標識をプライマーの３′−末端とは大きく間隔をあけて組込むことができる（位置＋２、＋３、＋４等）。そのために、少なくとも２つの異なる標識付けられたｄＮＴＰｓに加えて、標識付けられていないｄＮＴＰｓがこの標識付け反応で存在することもできる。しかしながら、プライマーの３′−末端塩基が、使用される標識付けられたｄＮＴＰの塩基と同じである場合には、３′−エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを使用する場合に、標識付けられたｄＮＴＰｓが、交換反応で、１又は数個のプライマーの末端塩基として導入されるように、１又は数個のプライマー分子の配列を選択することもできる。酵素的標識付け反応の実施の際の条件は、統計的に、ただ１個の標識付けられたデオキシリボヌクレオシド三リン酸をプライマーに結合することができるように選択される。この反応特異性を達成するためには、有利に反応条件（例えば、ポリメラーゼ−酵素又は／及びｄＮＴＰの濃度、温度、他の成分の濃度等）は相応に選択される。更に次に説明されるように、反応の特異性をプライマー分子の選択によって高めることができる。本発明による方法によって、例えば、２以上のプライマー分子、有利に標識されていないプライマー分子及び数個の標識付けられたｄＮＴＰを用いてのＤＮＡ −断片の同時配列決定が１つの反応容器中で可能である。配列決定すべき核酸の異なる鎖の所で、又は同一の核酸−鎖上の異なる位置で、幾つかの標識付け反応を同時に実施することができる。驚異的にも、本発明による方法の特異性は高いので、数個の他の異なって標識付けられたｄＮＴＰ、プライマー分子及び核酸− 鋳型分子が同一の反応容器中に存在している場合ですら、統計的に、ただ１種の標識、特にただ１つの標識付けられたｄＮＴＰを一定のプライマー分子に結合させることができる。ただ１つの配列決定反応での、１又は数個のＤＮＡ−鋳型及び２以上のプライマー分子及び標識付けられたｄＮＴＰｓの組合せによって、配列決定反応の実施のための経費は、約５０〜７５％ほど減少させることができる。化学薬品の経費も、労力の経費も減少される。このことは、特に大規模な配列決定プロジェクト、例えば”ヒューマン・ゲノム（Human Genome）”−配列決定プロジェクト又は他のゲノム−プロジェクトにとっては重要である。本発明による方法のための適用形のもう１つの領域に、例えば、医学的診断、分子生物学、生化学及び化学におけるＤＮＡ−断片の配列決定、マッピング（Ka rtierung）及び選択的標識付けがある。最も重要な適用形は、蛍光−標識化基（ markierungsgruppe）を用いる自動化されたＤＮＡ−配列決定である。特別な適用形は、標識付けられたｄＮＴＰの配列特異的組込みを基礎とする３個までの塩基からプライマーへの限られた範囲内でだけで核酸配列が決定される、所謂、ミニ配列決定（Minisequenzieren）である。もう１つの可能な適用は、遺伝子、特にヒト遺伝子中の点突然変異の立証である。この場合、突然変異の” ホット・スポット（Hot Spot）”直前にプライマーが存在するように、プライマー分子が選択される。たった１個のプライマーが２以上の異なる標識付けられたｄＮＴＰと一緒に使用され、標識付け反応が実施される。核酸−鋳型上の相応する塩基に対して相補的である１個だけの標識付けられたｄＮＴＰが組込まれる。引続き、伸長されたプライマー分子が分析され、標識化基がそのスペクトル特性によって同定される。この方法で、当該遺伝子の配列に関する逆推論が可能である。核酸の配列決定のための適用時において、本発明による方法の実施は、有利に、次のように行う：ａ）少なくとも１個の核酸−プライマー分子を配列決定すべき核酸に結合させ、ｂ）ポリメラーゼ及び各々異なる標識化基及び異なる塩基を有する少なくとも２種の標識付けられたデオキシリボヌクレオシド三リン酸を添加し、ｃ）反応混合物を、単一の反応容器中で、１個のプライマー分子に各々１種類だけの標識付けられたデオキシリボヌクレオシド三リン酸が結合されるような条件下で恒温保持し、かつｄ）１又は数個の核酸配列を、標識付けられたデオキシリボヌクレオシド三リン酸の配列特異的組込みを介して決定する。本発明による方法では、１反応バッチ中で、各々異なる標識化基及び異なる塩基を有する標識付けられたデオキシリボヌクレオシド三リン酸少なくとも２種を使用し、即ち、それらの各々が異なる標識化基を有する最高４種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（塩基Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧに相応する）を使用することができる。標識化基は放射性又は非−放射性標識であってよく、一緒に検出可能でなければならない。非−放射性標識化基、特に蛍光標識化基、例えば蛍光色素、例えばローダミン、ローダミンの誘導体、例えば、メチルローダミン、テキサスレッド、フィコエリトリン、フルオレセイン及びその誘導体、ＣＹ３、ＣＹ５、ＣＹ２、クマリン、赤外線４０、ＭＲ２００、ボジピー（Bodipy）−色素（分子試料）、ｄＮＴＰｓの１，Ｎ６−エテノ −修飾基（分子試料）、ＩＲＤ４０等が有利である。他の好適な非 −放射性標識化基は、例えば、金属、核磁気共鳴によって又は超電気伝導性量子干渉検出器（ＳＱＩＤ）によって検出可能である磁気標識化基又はリン光色素である。各標識の決定のために、好適な励起−又は／及び検出システムを使用することができる。商業的に得られる蛍光標識されたｄＮＴＰの例は、例えばフルオレセイン−ｄＵＴＰ、フルオレセイン−ｄＡＴＰ（Boehringer Mannheim、Pharmacia）；テキサスレッド−ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰ（NEN-Dupont）、ＣＹ５−ｄＡＴＰ及びｄＣＴＰ並びにＣＹ３−ｄＡＴＰ（Pharmacia）である。同時に一緒に検出することができる蛍光標識化基を使用するのが有利である。即ち、例えば蛍光基の励起のために、相応する検出システムと連結されている２以上の異なるレーザーシステムを使用することができる。例えば、アルゴンレーザー（発光波長＝４８８ｎｍ）及び相応する検出器を用いて、フルオレセイン− 標識化基を、自動化されたＤＮＡ−配列決定システム中で立証することができる。第２のレーザーとして、例えば、テキサスレッドで標識された核酸の立証のための相応する検出器と一緒に、ヘリウム−ネオン−レーザー（発光波長＝５９４ｎｍ）を使用することができる。バンドパスフィルター（Bandpassfilter）によって、２つのレーザーシステムの間の干渉を抑制することができる。２つの検出装置（各レーザーに対して１個）によって、データが示される。他方で、１つだけのレーザーシステムによって励起され、かつ各々異なる検出システムによって別々に決定され得る蛍光色素の組合せを使用することもできる。標識付け反応の間に標識付けられたｄＮＴＰｓの濃度は、特に僅少であるので、所定のポリメラーゼ−濃度では実際に１つだけの標識付けられたｄＮＴＰをプライマー分子に結合させることができる。従って、標識付けられたｄＮＴＰｓは、０．０５〜５μモル／リットルの濃度で、特に０．１〜２．５μモル／リットルの濃度で使用するのが有利である。そのようなｄＮＴＰ−濃度では、反応混合物中に存在するポリメラーゼは、統計的に１個だけの分子ｄＮＴＰをプライマーに結合させることができる。ポリメラーゼ濃度は、有利に１〜２０Ｕ、特に有利に５〜１５Ｕ（１バッチ当たり）である。特に数個のプライマー分子の同時使用の際には、前記の濃度範囲の厳守は絶対的であり得、それというのも、高すぎるｄＮＴＰ−又は／及び酵素濃度では、数個の異なる標識付けられたｄＮＴＰが、１つだけのプライマーに結合することが可能であるからである。更に、標識化分子（例えばフルオレセイン、テキサスレッド等）の選択により、ｄＮＴＰ（ｄＵＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ等）の選択により、又は／及びｄＮＴＰ及び標識化分子の結合の種類（例えば、スペーサーアームの長さ）により、標識付けられたｄＮＴＰの組込みの特異性は影響され得る。プライマー分子へのｄＮＴＰの酵素的結合のために、本発明による方法では、ポリメラーゼ、特にＥ．ｃｏｌｉ−ＤＮＡ−ポリメラーゼＩのクレノウ−断片、非修飾のＴ７−ＤＮＡ−ポリメラーゼ、修飾されたＴ７−ＤＮＡ−ポリメラーゼ（セクエナーゼ（Sequenase））、Ｔ４−ＤＮＡ−ポリメラーゼ、Ｔａｑ−ＤＮＡ−ポリメラーゼ、Ｂｓｔ−ＤＮＡ−ポリメラーゼ又は逆転写酵素を使用する。これらの酵素のうち、３′− エキソヌクレアーゼ活性のないポリメラーゼ、例えば修飾されたＴ７−ポリメラーゼが有利である。しかしながら、本発明の一定の実施態様においては、標識付けられたデオキシリボヌクレオシド三リン酸が、交換反応で、逐次行なわれるエキソヌクレアーゼ −及びポリメラーゼ活性によって、プライマー分子の最終塩基として（位置−１）挿入される場合には、３′−エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、例えば、非修飾Ｔ７ポリメラーゼも有利であり得る。本発明による方法の１つの利点は、標識付けられたプライマー分子を必要としないので簡単なことである。このことは特に、例えば、ヒトゲノム又は他のゲノムプロジェクトのような大規模な配列決定プロジェクトにとって重要である。他方で、核酸配列についての情報を場合により付加的に得るために、所望の場合には、標識付けられたプライマーも当然使用することができる。更に、配列決定反応は、標識付けられていないプライマー及び標識付けられた（蛍光色素又は他種の、例えばジゴキシゲニン、ビオチン、金属等）プライマーの組合せを用いて実施することができ、この場合には、特に、内部標識が各々標識付けられていないプライマーにのみ結合されるように、プライマーの選択を行うべきである。標識付けられたプライマーは、特に、標識付けられたｄＮＴＰｓ以外の標識化基を有する。２個又はそれ以上のプライマー分子の使用下での核酸の同時配列決定の場合には、プライマー分子の選択が重要である。即ち、プライマーは、ポリメラーゼによるプライマーの伸長の際に、次の塩基として組込まれる異なるヌクレオチドによって随伴されねばならない。この方法で、標識付け反応の際には、各々１種だけの標識化基が１種のプライマー分子に結合される。標識付け反応の際の反応条件の選択によって、他の標識化基の組込みを遮断することができる。本発明の有利な１実施形態は、配列決定すべき核酸の異なる領域に結合する少なくとも２つのプライマー分子を使用する方法に関し、その際、その３′−末端に次の塩基として結合すべき塩基が各々異なっているようにプライマー分子を選択し、かつこの際、相応する塩基を有する１個の標識付けられたデオキシリボヌクレオシド三リン酸が各プライマー分子のために使用され、従って、各プライマー分子に各々１個だけの特有の異なる標識付けられたデオキシリボヌクレオシド三リン酸が結合される。よりよく理解するために、本出願では、プライマー分子の３′−末端の塩基を、各々”位置−１”で表わす。ポリメラーゼによってプライマー分子の３′−末端に次の塩基として結合すべき塩基を、”位置＋１”で表わし、１つおいた次の塩基として結合すべき塩基を、”位置＋２”で表わす。標識付け反応の特異性を高めるために、有利には、プライマー分子の構築の際に、なお他の基準を考慮しなければならない。即ち、１バッチ中で、プライマーの３′−末端に次の塩基として結合すべき塩基（位置＋１）が、他の１個のプライマーの３′−末端に１つおいた次の塩基として結合すべき塩基（位置＋２）と同じではないようなプライマー分子だけを、使用するのが有利である。それによって、プライマー分子が２つの異なる標識化基で標識されるという確率は減少される。更に、プライマー分子の３′−末端の塩基（位置−１）が、他の１つのプライマー分子の３′−末端に次の塩基として結合すべき塩基（位置＋１）と同じではないプライマー分子を使用することが有利である。この方法で、使用されたポリメラーゼ酵素の３′−エキソヌクレアーゼ活性に基づく可能な二重標識付けを回避することができる。３′−エキソヌクレアーゼ活性を持たないポリメラーゼ、例えば、修飾されたＴ７−ポリメラーゼの使用の際には、この選択基準は必ずしも考慮される必要はない。２個以上のプライマー分子の使用の際には、本発明の方法により、２つ以上の核酸配列を同時に決定することができる。本発明による方法の配列決定反応は、通例、２段階で実施される。先ず、１つの標識付け反応で、各々１種だけの標識付けられたｄＮＴＰｓがプライマーの３ ′−末端に結合される。１つだけの特有の標識付けられたｄＮＴＰがプライマーに結合されるのが特に有利である。標識付けられたｄＮＴＰがその３′−末端（位置＋１）に直接結合されるように、プライマーを選択するのが有利である。更に、この標識付け反応では、標識付けられたｄＮＴＰのみが存在することが有利である。それというのも、こうして、鋳型上の第２の結合部位へのプライマーの不所望な結合の際に、標識付けられたｄＮＴＰｓの組み込みの確率が減少されるからである。最後に、特に、プライマーが、標識付けられたｄＮＴＰとして標識付け反応のバッチ中に存在するヌクレオチドで終了する場合には、３′−エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡポリメラーゼ、例えば、セクエナーゼ（Sequ enase（登録商標））の使用も有利である。次の段階として、それによって重合が終了される鎖遮断分子の組込みまで、伸長反応が行なわれる。この伸長反応は、有利に、別々のバッチ中で、標識付け反応によって特異的に標識付けられたオリゴヌクレオチドプライマー、ポリメラーゼ、鋳型としての配列決定すべき核酸、４種の標識付けられていないデオキシリボヌクレオシド三リン酸及び各々１つの鎖遮断分子の存在で実施される。その際、プライマーの伸長によって、各々のプライマーに特異的な標識化基を有し、鎖遮断分子の組込みによって終了している核酸鎖が生じる。従って、本発明による方法による核酸配列の決定は、有利に、（ｄ１）反応混合物を、標識付けられたデオキシリボヌクレオシド三リン酸の結合後に、複数のバッチに分け、４種の標識付けられていないデオキシリボヌクレオシド三リン酸及び各々１つの異なる鎖遮断分子を含有する伸長試薬を各バッチに添加し、バッチを恒温保持し、（ｄ２）（ｄ１）から得られる核酸断片をその大きさによって分離し、かつ（ｄ３）核酸配列を個々の断片の標識付けを介して決定することによって行なわれる。この伸長反応において、４種の標識付けられていないｄＮＴＰは、標識付け反応の際に使用される標識付けられたｄＮＴＰに比べて、大過剰で存在し、従って、伸長反応の間には、標識付けられたｄＮＴＰのそれ以上の組み込みは起こらない。標識付けられていないデオキシリボヌクレオシド三リン酸は、標識付けられたデオキシリボヌクレオシド三リン酸に対して、少なくとも１００−倍の過剰量で、特に有利に、少なくとも１０００−倍の過剰量で存在するのが有利である。従って、伸長成分中の標識付けられていないｄＮＴＰの濃度は、有利に、０．０５〜５ミリモル／リットル、特に有利に、０．１〜２．５ミリモル／リットルである。鎖遮断分子として、デオキシリボースの３′−位置で、それが遊離ＯＨ−基を持たないように修飾されているが、それにも拘らず、ポリメラーゼによって基質として受容されるデオキシリボヌクレオシド三リン酸を使用するのが有利である。そのような鎖遮断分子の例は、例えば、３′−フルオル−、３′−Ｏ−アルキル−及び３′−Ｈ−修飾されたデオキシリボヌクレオシドである。鎖遮断分子として、３′−Ｈ−修飾されたデオキシリボヌクレオチド、即ち、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を使用するのが有利である。本発明による方法では、標識付けられていない鎖遮断分子を用いて操作するのが有利であるが、当業者に公知であるように、標識付けられた鎖遮断分子を使用することも可能である。標識付けを介する核酸配列の決定は、通例、標識付けられた核酸断片を縦に分離することによって行なわれる。この分離は、公知技術水準の全方法により、例えば、様々な電気泳動法（例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動法）又はクロマトグラフィー法（例えば、ＨＰＬＣ）によって行なわれることができ、この際、ゲル電気泳動的分離が有利である。更に、標識付けられた核酸の分離は、自体任意の方法で、例えば、手で、半自動的に、又は自動的に行なうことができるが、この際、自動化された配列決定装置の使用が一般に有利である。この場合には、標識付けられた核酸の分離は、２０〜５００μｍ、有利に１００μｍ厚の超薄なゲルプレート（例えば、Stegemann et al、Methods in Mol.and Cell.Biol.2(1991)182〜184参照）で、又は毛細管で実施することができる。しかしながら、この配列決定は、自動化されていない装置中で、例えば、ブロット−法により行なうこともできる。本発明による方法による配列決定のために、配列決定すべき核酸を極めて僅少量で使用する場合には、増幅工程を実施することもできる。増幅の可能性は、２種のプライマーの使用下で、ポリメラーゼ−鎖反応（ＰＣＲ）の１又は数サイクルを、本来の配列決定の前に実施することにある。ＰＣＲは、通例、標識付けられたｄＮＴＰの不在で行なわれる。即ち、配列決定すべき核酸を、本来の配列決定過程の実施の前に、増幅させることができる。他方で、この増幅工程は、”サーモサイクリング（Thermocycling）”−反応を用いて行なうこともできる。サーモサイクリング−反応は、”正常な”配列決定反応に相応し、これは勿論（ＰＣＲの様に）数サイクルで実施される。反応バッチは、核酸−鋳型、プライマー分子、ｄＮＴＰ及び各々相応する鎖遮断分子並びに特に熱安定性のポリメラーゼを含有する。この方法で、１サイクル当たり、常に一定量の標識付けられた核酸断片が合成され、この際、数サイクルで、多量の標識付けられた断片を生成させることができる。配列決定すべき核酸は、１本鎖形でも、２本鎖形でも存在し得る。配列決定すべき核酸が、２本鎖のＤＮＡ−領域−例えば、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ（ラムダ又はＰ１）、ウイルス性ベクター又は合成染色体上にある場合に、良好な結果が得られる。本発明のもう１つの目的は、核酸への個々の標識化基の選択的挿入のための試薬キットであり、これは標識付け又は配列決定のために必要である他の成分と共に、各々異なる標識化基及び異なる塩基を含有する少なくとも２つの標識付けられたデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含有する。この試薬は、例えば、溶液、懸濁液又は凍結乾燥体の形で存在してよい。この試薬キットは、特に核酸の配列決定のために使用され、付加的な試薬（例えば、酵素、プライマー、緩衝溶液、標識付けられていないｄＮＴＰｓ、ターミネーター）を含有することができる。次の実施例につき、本発明を第１〜４図と関連させて詳説する。第１図は、本発明による配列決定過程を図で示し、第２図は、フルオレセイン−１５−ｄＡＴＰ及びテキサスレッド−５−ｄＣＴＰの存在で、２つの標識付けられていないプライマーの同時使用下での、プラスミド配列決定の結果を示し、第３図は、標識付けられたｄＮＴＰの多重組込みのための試験結果を示し、かつ第４図は、プライマーへの標識の組込みに関する試験結果を示す。例１２つのプライマーを用いる同時ＤＮＡ配列決定ヒトのケラチノサイト（Keratinocyten）−ｃＤＮＡ−バンクから由来するｃＤＮＡ−分子を、標準法で、ブルースクリプト（Bluescript）−ベクター（St ratagene,LaJolla、Californien、USA）中でクローン化した。プラスミド−ＤＮＡ′ｓをクイアゲン（Quiagen；Hilden、Deutschland）又はヌクレオボンド（Nu cleobond）AXイオン交換体カラム（Macherey-Nagel、Dueren、Deutschland）の使用下で精製した。全プライマーを、コンピュータプログラム・ゲンスキッパー（Computerprogra mme Geneskipper；EMBL、Heidelberg、Deutschland）、オリゴ^TM(Oligo^TM)、4.1 （Medprobe、Oslo、Norwegen）の使用下で展開させた。２量体形成の傾向を有せず、鋳型上の他の結合部位又はヘア・ピン構造の形成の傾向を有しないプライマー対を選択した。プライマーの１方を、次の塩基として３′−末端に”Ａ”を結合させるように選択した。第２のプライマーを、次の塩基として”Ｃ”を結合させるように選択した。プライマーを、EMBLの多重セグメント−ＤＮＡ−シンセサイザー（Segmennt-DNA-S ynthesizer）上で合成した（Ansorge et al、Electrophoresis 13（1992）616〜 619）。配列決定のために、次の反応記録を使用した：１．変性及びアニーリング２本鎖ＤＮＡ（５〜８ｋｂ）５〜１０μｇを、２つの標識付けられていないプライマー分子（各々、総容量１２μｌ中の２ピコモル）と混合させ、ＮａＯＨ− 溶液（１モル／ｌ）１μｌの添加及び３分間６５℃への加熱により変性させた。３７℃への１分間の冷却及び短時間の遠心分離後に、ＨＣｌ（１モル／ｌ）１μ ｌ及びアニーリング緩衝液（Tris／Hcl（pH８）１モル／ｌ、MgCl₂ 0.1/l）２μ ｌを添加した。２．標識付け反応前記のバッチに、フルオレセイン−１５−ｄＡＴＰ（１０マイクロモル／ｌ）、テキサスレッド−５−ｄＣＴＰ１０マイクロモル／ｌ及び天然のＴ７ＤＮＡ− ポリメラーゼ（８Ｕ／μｌ）又はセクエナーゼ（１３Ｕ／μｌ）各々１μ１を添加した。反応混合物を１０分間３７℃で恒温保持した。３．伸長及び終止このバッチに、伸長緩衝液（クエン酸ナトリウム３０４ミリモル／ｌ、ＭｎＣｌ₂ ４０ミリモル／ｌ、ジチオトレイトール３２４ミリモル／ｌ）１μｌを添加し、混合させた。次いで、溶液を部分分けし、各々の終止溶液（Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）４０ミリモル／ｌ、ＮａＣｌ５０ミリモル／ｌ、各ｄｄＮＴＰ５マイクロモル／ｌ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、Ｃ⁷−ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ各１ミリモル／ｌ）３μｌ及びＤＭＳＯ１μｌから成る４分割した伸長／終止混合物を添加した。５分間３７℃ で恒温保持し、終止溶液（脱イオン化ホルムアルデヒド中、デキストランブルー６ｍｇ／ｍｌ及びＥＤＴＡ２０ミリモル、ｐＨ７．３）４μｌの添加により反応を停止させた。次いで、試料を４分間８５℃で変性させ、配列ゲル上に加えた。４．ＤＮＡ−配列決定装置変更されたＤＮＡ−配列決定装置の構成は、Wiemann et al（Anal．Biochem．（1995）117〜121に詳説されている。通常のアルゴン−レーザー−検出器システムに加えて、この配列決定装置中に、相応する検出器を備えたヘリウム−ネオン −レーザーを設置した。Ａｒ−レーザーが、フルオレセイン−標識された試料を励起させ、一方で、ＨｅＮｅ−レーザーを、テキサスレッド標識されたＤＮＡ− 断片の励起のために使用される。双方のレーザー線を、ゲルの片側上で２つのスペーサーの間に配置されている単一の光結合プレートを用いて、ゲル中に導く。レーザーと２つの異なるレーザーの組合せとの間の０．７ｃｍの空間的距離、相応する蛍光団を有する検出器−及びフィルターシステムは、配列信号の交錯検出が現われないことを保証する。５．ゲル電気泳動変性された６．５％ジュラシル(Duracyl)（Millipore、Bedford、Massachuset ts、USA）配列決定ゲル上でＤＮＡ−断片の分離を行なった。テキサスレッド −標識された断片では１８．５ｃｍ、フルオレセイン−標識された断片では１９．２ｃｍの距離をおいて、標準（Standard）A.L.F.（Pharmacia、Uppsala、 Sch weden）ガラス板の使用下で分離を行なった。双方の反応体の配列をオン−ラインで検出し、コンピューターに蓄積させた。第１図は、核酸の同時配列決定の原則を図示している。変性後に、２つのプライマーは、配列決定すべき核酸−鋳型の各々相補的な領域に結合する。鋳型は、１本鎖又は２本鎖のＤＮＡの同一鎖から、又は同じ２鎖のＤＮＡの異なる鎖から、又は異なるＤＮＡ′ｓから由来してよい。配列決定反応の際には、２つの異なった標識付けられたｄＮＴＰが使用される。配列決定反応の標識付け段階では、２つの標識付けられたヌクレオチド、フルオレセイン−１５−ｄＡＴＰ及びテキサスレッド−５−ｄＣＴＰだけが存在する。１種だけの色素を用いる特異的生成物の選択的標識付けは、第１塩基としての各ヌクレオチドの組み込みによって、プライマー分子の下流に直接達する。この反応は、プライマーに直接結合された塩基が、１個の標識付けられたｄＮＴＰが組込まれるか又は組込まれないかを識別する因子である、点突然変異のミニ配列決定（Syvaenen et al、Ge nomics 8（1990）、684〜692）と匹敵する。プライマーに直接結合すべき塩基が異なっている、例えば”Ａ”及び”Ｃ”であるように、プライマーの選択が行なわれる。この標識付け段階では、各プライマー中に、正しいヌクレオチドだけが常に組込まれる。第１の標識付けられたｄＮＴＰの組込みの後に、ポリメラーゼはポーズ（Pouse）を置くことができる。それというのも標識付けられたｄＮＴＰが僅少な濃度でのみ存在するからである。このポリメラーゼは鋳型から離脱し、標識付けられたｄＮＴＰｓが組込まれるまで、他のプライマー分子の伸長のために使用することもできる（例えば、サイクル配列決定で）。伸長反応及び終結反応の際に、標識付けられていないｄＮＴＰの大過剰に基づき、標識付けられたｄＮＴＰはそれ以上組込まれない。第２図は、プラスミド−ＤＮＡの双方の鎖の同時配列決定の際に得られた配列データを示している。２つの標識付けられていないウオーキング（Walking）− プライマーを使用した。第２図は、フルオレセイン−１５−ｄＡＴＰを用いて得られた配列を示しており、第２ｂ図は、テキサスレッド−５−ｄＣＴＰを用いて得られた配列を示している。第３図は、標識付けられたｄＮＴＰの多重組込みについての試験結果を示している。その際、位置＋１及び＋２に、先ず”Ｃ”が、次いで”Ａ”が、もしくは、先ず”Ａ”が、次いで”Ｃ”が組込まれる配列決定プライマーが選択されていた。配列決定反応は、天然のＴ７−ＤＮＡ−ポリメラーゼを用いて実施される。第３ａ図は、位置＋１に”Ｃ”及び位置＋２に”Ａ” を有するプライマーのテキサスレッド−信号を示している。第３ｂ図は、同じプライマーのフルオレセイン−信号を示している。第３ｃ図は、位置＋１に”Ａ” 及び位置＋２に”Ｃ”を有するプライマーのテキサスレッド−信号を示している。第３ｄ図は、第３ｃ図からのプライマーを用いるフルオレセイン−信号を示している。第３図から、位置＋２のフルオレセイン−１５−ｄＡＴＰの組み込みは行なわれなかったことが判る（第３ｂ図）。それに反して、第３ｃ図は、位置＋２でテキサスレッド−５−ｄＣＴＰの僅少な組み込みが行なわれたことを示している。しかし、位置＋２における標識が位置＋１における標識よりも明らかに弱いので、第２のプライマーで得られた配列データも明白である。第４図は、プライマー内の標識の組込みについての試験結果を示している。３ ′−末端塩基（位置−１）としての”Ａ”を含有し、次の塩基（位置＋１）としての”Ｃ”が組込まれるべき配列決定プライマー、並びに、逆の塩基順序を有するプライマーを選択する。配列決定反応は、天然のＴ７−ＤＮＡ−ポリメラーゼ（ｎ−Ｔ７）又はセクエナーゼ（Ｓｅｑ）を用いて実施された。第４ａ図は、セクエナーゼ及び３′−末端塩基としての”Ａ”及び位置＋１に”Ｃ”を有するプライマーを用いる配列決定からのテキサスレッド−信号を示している。第４ｂ図は、セクエナーゼ及び第４ａ図のプライマーを用いる配列決定からのフルオレセイン信号を示している。第４ｃ図は、天然のＴ７−ポリメラーゼ及び第４ａ図のプライマーを用いる配列決定のテキサスレッド−信号を示している。第４ｄ図は、天然のＴ７−ＤＮＡ−ポリメラーゼ及び第４ａ図のプライマーを用いる配列決定からのフルオレセイン−信号を示している。第４ｅ図は、セクエナーゼ及び３′−末端塩基としての”Ｃ”及び位置＋１に”Ａ”を有するプライマーを用いる配列決定のフルオレセイン信号を示している。第４ｆ図は、セクエナーゼ及び第４ｅ図のプライマーを用いる配列決定からのテキサスレッド−信号を示している。セクエナーゼ（バージョン２．０）及び３′−末端”Ａ”を有するプライマーを用いて反応を実施する際に、位置＋１にテキサスレッド−ｄＣＴＰだけが組込まれ（第４ａ図）、一方で位置−１でフルオレセインｄＡＴＰはプライマー中に組込まれなかった（第４ｂ図）。それに対して、天然のＴ７−ＤＮＡ−ポリメラーゼを用いては、プライマー内（位置−１）のフルオレセイン−ｄＡＴＰの僅少な組み込みが認められた（第４ｄ図）。プライマーの最終塩基としての”Ｃ”及び後続塩基としての”Ａ”を用いて、セクエナーゼの使用の際にも、位置−１でのテキサスレッド−ｄＣＴＰの組み込みが行なわれたことが判明した（第４ｆ図）。しかしながら、僅少な信号強度に基づき、配列決定反応の顕著な障害は現れない。

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Claims

【特許請求の範囲】１．標識付けられたデオキシリボヌクレオシド三リン酸を核酸−プライマー分子に結合させる酵素的標識付け反応による、標識付けられた核酸断片の形成及び標識付けを介するヌクレイン配列の決定を包含する、核酸の配列特異的標識付けのために、単一の反応容器中で、１又は数個の核酸−プライマー分子及び各々異なる標識化基及び異なる塩基を含有する少なくとも２種の標識付けられたデオキシリボヌクレオシド三リン酸の同時の存在下に、かつ、核酸−プライマー分子に、標識付けられたデオキシリボヌクレオシド三リン酸の１種類だけを結合させる条件下で標識付け反応を行なうことを特徴とする核酸を配列特異的に標識付けする方法。２．核酸の配列決定のために、ａ）少なくとも１個の核酸−プライマー分子を配列決定すべき核酸に結合させ、ｂ）ポリメラーゼ及び各々異なる標識化基及び異なる塩基を有する少なくとも２種の標識付けられたデオキシリボヌクレオシド三リン酸を添加し、ｃ）この反応混合物を、単一の反応容器中で、プライマー分子に各々標識付けられたデオキシリボヌクレオシド三リン酸の１種類だけを結合させるような条件下で恒温保持し、かつｄ）標識付けられたデオキシリボヌクレオシド三リン酸の配列特異的組込みを介して、１又は数個の核酸配列を決定することを特徴とする核酸の配列決定法。３．１個の核酸−プライマー分子に、各々１個だけの標識付けられたデオキシリボヌクレオシド三リン酸を結合させる、請求項１又は２に記載の方法。４．標識付けられたデオキシリボヌクレオシド三リン酸を、プライマー分子の３ ′−末端（位置＋１）に直接結合させる、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。５．プライマー分子への標識付けられたデオキシリボヌクレオシド三リン酸の結合のために、３′−エキソヌクレアーゼ活性を持たないＤＮＡ−ポリメラーゼを使用する、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。６．修飾されたＴ７ＤＮＡ−ポリメラーゼを使用する、請求項５に記載の方法。７．プライマー分子への標識付けられたデオキシリボヌクレオシド三リン酸の結合のために、３′−エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ−ポリメラーゼを使用する、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。８．標識付けられたデオキシリボヌクレオシド三リン酸を、交換反応で配列的に行なわれるＤＮＡ−ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性及びポリメラーゼ活性により、プライマー分子の最終塩基（位置−１）として挿入させる、請求項７に記載の方法。９．標識化基を持たない核酸−プライマー分子を使用する、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法。 10．標識付けられたデオキシリボヌクレオシド三リン酸とは異なる標識を有する標識付けられた核酸−プライマー分子を使用する、請求項１から１８までのいずれか１項に記載の方法。 11．プライマー分子の標識化基を、蛍光色素、金属、ビオチン及びジゴキシゲニンから選択する、請求項１０に記載の方法。 12．標識付けられたデオキシリボヌクレオシド三リン酸を、０．０５〜５マイクロモル／ｌの濃度で使用する、請求項１から１１までのいずれか１項に記載の方法。 13．標識付けられたデオキシリボヌクレオシド三リン酸を、０．１〜２．５マイクロモル／ｌの濃度で使用する、請求項１２に記載の方法。 14．請求項１から１３までのいずれか１項に記載の核酸の同時配列決定のために、配列決定すべき核酸の異なる領域に結合する少なくとも２個のプライマー分子を使用し、この際、それらの３′−末端に次の塩基として結合すべき塩基（位置＋１）が各々異なるようにプライマー分子を選択し、かつ各プライマー分子のために、相応する塩基を有する標識付けられたデオキシリボヌクレオシド三リン酸を使用して、各プライマー分子に各々１個だけの異なる標識付けられたデオキシリボヌクレオシド三リン酸が結合させることを特徴とする、核酸の同時配列決定法。 15．プライマー分子の３′−末端に次の塩基として結合すべき塩基（位置＋１）が他のプライマー分子の３′−末端に１つおいた次の塩基として結合すべき塩基（位置＋２）とは同じではないプライマー分子を使用する、請求項１４に記載の方法。 16．プライマー分子の３′−末端における塩基（位置−１）が他のプライマー分子の３′−末端に次の塩基として結合すべき塩基（位置＋１）と同じではないプライマー分子を使用する、請求項１４又は１５に記載の方法。 17．核酸配列の決定のために、（ｄ１）反応混合物を標識付けられたデオキシリボヌクレオシド三リン酸の結合後に分割し、各バッチに４種の標識されていないデオキシリボヌクレオシド三リン酸及び各々１個の異なる鎖遮断分子を含有する伸長試薬を添加し、バッチを恒温保持し、（ｄ２）（ｄ１）から得られる核酸断片をその大きさによって分け、かつ（ｄ３）個々の断片の標識付けを介して核酸配列を決定する、請求項２から１６までのいずれか１項に記載の方法。 18．２つ又はそれ以上の核酸配列を同時に決定する、請求項１から１７までのいずれか１項に記載の方法。 19．配列決定を自動化された配列決定装置中で実施する、請求項１から１８までのいずれか１項に記載の方法。 20．各々異なる蛍光標識化基を有する少なくとも２種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸を使用する、請求項１から１９までのいずれか１項に記載の方法。 21．蛍光標識化基は、フルオレセイン又はその誘導体、テキサスレッド、ローダミン又はその誘導体、フィコエリトリン、ＣＹ３、ＣＹ５、ＣＹ２、ＣＹ７、クマリン、赤外線４０、ＭＲ２００、ボジピー（Bodipy）−色素、ＩＲＤ４０及び１，Ｎ⁶−エテノ−修飾基から選択される、請求項２０に記載の方法。 22．同時に一緒に検出することができる蛍光標識化基を使用する、請求項２０又は２１に記載の方法。 23．検出のために、２種又はそれ以上の異なるレーザーシステムを使用する、請求項２２に記載の方法。 24．検出のために、単一のレーザーシステムを使用する、請求項２２に記載の方法。 25．デオキシリボヌクレオシド三リン酸を０．０５〜５ミリモル／ｌの濃度で使用する、請求項１７に記載の方法。 26．デオキシリボヌクレオシド三リン酸を０．１〜２．５ミリモル／ｌの濃度で使用する、請求項２５に記載の方法。 27．標識付け又は配列決定のために必要な成分の他に、各々異なる標識化基及び異なる塩基を含有する少なくとも２種の標識付けられたデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含有する、請求項１から２６までのいずれか１項に記載の方法を実施するための試薬キット。 28．核酸の配列決定のための、請求項２７に記載の試薬キットの使用。