JPH0876B2 - 核酸標的物の生成法 - Google Patents

核酸標的物の生成法

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JPH0876B2
JPH0876B2 JP4310521A JP31052192A JPH0876B2 JP H0876 B2 JPH0876 B2 JP H0876B2 JP 4310521 A JP4310521 A JP 4310521A JP 31052192 A JP31052192 A JP 31052192A JP H0876 B2 JPH0876 B2 JP H0876B2
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target nucleic
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ジョージ・テレンス・ウォーカー
マイケル・シー・リトル
ジェームズ・ジー・ナデュー
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ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、増幅に先立つ、標的核
酸の調製法に関する。
【０００２】
【従来の技術】核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ま
たはリボ核酸（ＲＮＡ）のいずれかの形態である。ＤＮ
ＡおよびＲＮＡは、多数のヌクレオチド骨格から形成さ
れる高分子量ポリマーである。各ヌクレオチドは塩基
（プリンまたはピリミジン）、糖（リボースまたはデオ
キシリボース）およびリン酸分子からなる。ＤＮＡは、
糖デオキシリボースおよび塩基アデニン（Ａ）、グアニ
ン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）からな
る。
【０００３】核酸は直鎖状に連結されて遺伝子コードを
構成する。３つのヌクレオチド各々の配列は、翻訳の過
程において一つのアミノ酸のためのコードとして読まれ
うる（ＤＮＡは転写の過程において最初にＲＮＡに変換
されなければならない）。それぞれの３つの塩基配列内
の塩基の組み合わせを変えることにより、別のアミノ酸
がコードされる。さまざまな３つの塩基配列の連結によ
り、アミノ酸配列は蛋白質およびポリペプチドを構成で
きる。一つの蛋白質の完全なコードユニットは遺伝子と
呼ばれる。ひとつまたは複数の遺伝子コピーが一つの生
物内に存在しうる。幾つかの遺伝子は数百から数千コピ
ー存在する。他の遺伝子は通常単一コピーで存在する。
【０００４】コピー数にかかわらず、遺伝子は一つの生
物内で連結されて、高等生物においては染色体と呼ばれ
るより高度な構造単位が構成される。幾つかの下等生物
においては、プラスミドと呼ばれる染色体外ユニットの
遺伝子が存在する。遺伝子は互いに直接末端同士で連結
される必要はない。特定の非コード領域（即ちイントロ
ン：アミノ酸に翻訳されない塩基配列）が遺伝子間また
は遺伝子内において存在する。即ち、特定の生物のヌク
レオチド配列はゲノムと呼ばれるその生物の遺伝子構造
を決定する。（したがって、ひとつの生物から単離され
たＤＮＡはゲノミックＤＮＡと呼ばれる。）ほとんどの
生物のＤＮＡは、二本鎖の形で形成されており、ＤＮＡ
の二本の鎖は、接近した二重らせんにより対になってい
る。このモデルにおいて、対合している鎖同士はＡとＴ
およびＣとＧの間で水素結合を形成している。即ち、一
方の鎖の配列がＡＴＣＧ（５’→３’）であれば相補鎖
はＴＡＧＣ（３’→５’）となる。しかしながら、両方
の鎖は相補的な塩基対合様式においてのみ同じ遺伝子コ
ードを含む。したがって、いずれかのＤＮＡ鎖が読めれ
ば、コードしている方の遺伝子配列が決定される。
【０００５】核酸の配列、構造および機能のさらなる記
述はワトソン（Ｗａｔｓｏｎ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ、ベンジャミ
ン（Ｗ．Ｊ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ）、Ｉｎｃ．（第３版、
１９７７年）の特に６章−１４章を参照せよ。
【０００６】試料中に存在する核酸の遺伝子配列の理解
および決定は、多くの理由から重要である。第一に、多
くの疾患は正常な遺伝子のヌクレオチド配列が幾つかの
様式により変化を受けるという意味において遺伝的なも
のである。そのような変化は、ひとつの塩基が別の塩基
に置換されることにより生じる。３つの塩基が一つのア
ミノ酸を供給するので、一つの塩基の変化（点突然変異
とよばれる）が一つのアミノ酸の変更をもたらし、正常
な蛋白質の代わりに欠損蛋白質が細胞内で作られる。鎌
形赤血球貧血症は、一つの遺伝子内の一つの塩基の変化
により引き起こされる、そのような遺伝的欠損の古典的
な例である。一つの遺伝子の欠損により引き起こされる
疾患の例は、第ＩＸ因子欠損および第ＶＩＩＩ因子欠
損、アデノシンデアミナーゼ欠損、プリンヌクレオチド
ホスホリラーゼ欠損、オルニチントランスカルバミラー
ゼ欠損、アルギニンスクシネートシンターゼ欠損、ベー
タサラセミア、α1抗トリプシン欠損、グルコセレブロ
シダーゼ欠損、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ欠損
およびヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトラン
スフェラーゼ欠損を含む。さらに他の疾患、例えば癌
は、活性化、転座、転移、コピー数の増加および／また
はオンコジーンと呼ばれる、ゲノム内に存在することが
知られている遺伝子のサプレッションの除去により引き
起こされると信じられている。特定の癌について明らか
であると信じられているオンコジーンの例は、神経芽細
胞腫、網膜芽細胞腫および小細胞肺癌のＮ−ｍｙｃおよ
び慢性骨髄性白血病のｃ−ａｂｌを含む。癌の診断に関
するオンコジーンの関連記述および特定のオンコジーン
のリストはワインバーグ（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ）、Ｓｃ
ｉ．Ａｍｅｒ．，１９８３年１１月、スラモン（Ｓｌａ
ｍｏｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４：２５６（１９８
４）、米国特許第４，６９９，８７７号および第４，９
１８，１６２号を参照せよ。
【０００７】第二に、核酸の配列の変化に加えて、構造
的なレベルで生じる遺伝的な変化がある。そのような変
化は、挿入、欠失および染色体内の転座を含み、また染
色体数の増加または減少を含む。前者の例として、その
ような変化は交さと呼ばれる現象によりもたらされ、一
つの染色体ＤＮＡの鎖がさまざまな長さの別の染色体Ｄ
ＮＡと交換される。即ち、例えば正常な個体において、
蛋白質Ｘの遺伝子が第１染色体に存在する場合、交さ後
にその遺伝子が第４染色体に転座し（第４染色体から第
１染色体への同様な交換があってもなくても）、細胞は
Ｘを生産しない。
【０００８】染色体数の増加または減少例（異数性：ａ
ｎｅｕｐｌｏｉｄｙと呼ばれる）において、各々の正確
な染色体コピー数を有する正常な個体の代わりに(例え
ば、ＸおよびＹ染色体以外の二本のヒト染色体)、違う
数になる。例えばヒトにおいては、ダウン症候群は正常
な２コピーの代わりに第２１染色体を３コピー有する結
果になる。他の異数体状態は第１３染色体と第１８染色
体を含むトリソミーによりもたらされる。
【０００９】第三に、感染性疾患は、寄生虫、微生物お
よびウイルスにより引き起こされ、それらすべては自分
の核酸を有する。生物学的材料の試料中のこれら生物の
存在は、しばしば多くの慣用的な方法（例えば培養）に
より測定される。しかしながら、各々の生物は自分のゲ
ノムをもっているために、単一の種（幾つかの近縁種、
属またはより高いレベルの近縁種）に特定の核酸の遺伝
子または配列があれば、ゲノムはそれらの生物（または
種等々）に「跡（フィンガープリント）」を供給する。
本発明が適用されるウイルスの例はＨＩＶ，ＨＰＶ，Ｅ
ＢＶ，ＨＳＶ，Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイル
スおよびＣＭＶを含む。本発明が適用される微生物の例
はバクテリアを含み、より特定すればヘモフィルスイン
フルエンザ、マイコプラズマ、レジュネラ、ミコバクテ
リア、クラミジア、カンジダ、淋菌、赤痢菌およびサル
モネラを含む。
【００１０】上記の各例において、疾患または生物に特
定の配列を同定することにより、その配列が存在すれば
試料から核酸を単離し、そして配列を決定できる。多く
の方法がこの目的のために開発されて来た。
【００１１】疾患または生物に特定のひとつまたは複数
の配列が同定されることが重要なことであっても、本発
明の実施において標的配列が何かということまたはそれ
が如何にして同定されるかということは重要でない。核
酸試料中の標的配列の存在を検出するためのもっとも直
接的な手段は、標的配列に相補的なプローブ配列を合成
することである。（装置としては例えばアプライドバイ
オシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ）３８０Ｂが、この目的のための比較的短い核酸配列
を合成するために現在使用される。）そして合成された
プローブ配列は核酸配列を含む試料に用いることがで
き、そして標的配列が存在すれば該プローブはそれと反
応して反応産物を生成する。標的配列がなく、そして非
特異的な結合も阻止すれば、反応産物は生成されない。
合成プローブを検出可能な標識物で標識すれば、反応産
物は標識物の存在量を測定することにより検出できる。
サザンブロッティングは、この方法が使用される一つの
例である。
【００１２】しかしながら、このアプローチの困難性
は、試料中に存在する標的配列のコピー数が少ない場合
に（即ち、１０7未満）容易に応用されないことであ
る。そのような場合、シグナルとノイズを区別すること
（即ち、プローブと標的配列間の真の結合と、プローブ
と非標的配列間の非特異的な結合を区別すること）が困
難である。この問題を解決するための一つの方法はシグ
ナルを増やすことである。したがって、試料中に存在す
る標的配列を増幅するために、多くの方法が述べられて
きた。
【００１３】最もよく知られた増幅法の一つに、ポリメ
ラーゼチェインリアクション法（ＰＣＲと呼ばれる）が
あるが、それは米国特許第４，６８３，１９５号、第
４，６８３，２０２号および第４，８００，１５９号に
詳細に記述されている。ＰＣＲにおいては、簡単に言え
ば標的配列の反対の相補鎖の領域に相補的な２つのプラ
イマーを調製することである。過剰量のデオキシヌクレ
オシド３リン酸をＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ
ポリメラーゼ）と共に反応混合物に加える。標的配列が
試料中に存在すれば、プライマーは標的配列に結合し、
そしてポリメラーゼは該プライマーから標的配列に沿っ
てヌクレオチドを付加することにより伸長合成反応を行
う。反応混合物の温度を上昇および低下させることによ
り、伸長合成されたプライマーは標的配列から解離する
ことにより反応産物を生成し、そして過剰量のプライマ
ーが標的配列および反応産物に結合することにより、反
応が繰り返される。
【００１４】他の増幅法は１９８９年６月１４日に公開
された欧州特許出願第３２０，３０８号に記述されてお
り、その内容はリガーゼチェインリアクション法（ＬＣ
Ｒと呼ばれる）である。ＬＣＲにおいて、二本の相補鎖
プローブの対が調製され、そして標的配列の存在下にお
いて、その対が、標的配列の反対の相補鎖と結合してと
なりあう。リガーゼの存在下において、２つのプローブ
の対が結合することにより、単一のユニットを生成す
る。ＰＣＲのように温度を上下させることにより、結合
していた連結ユニットは標的配列から解離し、そして過
剰量のプローブ対の連結のための標的配列として使用さ
れる。米国特許第４，８８３，７５０号は、ＬＣＲに類
似した、プローブ対を標的配列に結合させるための方法
を記述しているが、増幅工程は記述していない。
【００１５】さらに別の増幅法が、１９８７年１０月２
２日に公開されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８
８０に記述されており、その方法はＱベータレプリカー
ゼ法と呼ばれる。この方法によれば、標的配列に相補的
な領域を有するＲＮＡの複製型配列をＲＮＡポリメラー
ゼ存在下において試料に添加する。ポリメラーゼは複製
型配列をコピーし、これを次に検出できる。
【００１６】さらに別の増幅法は、１９８８年９月２１
日に公開された英国特許出願第２２０２ ３２８号、お
よび１９８９年１０月５日に公開されたＰＣＴ出願ＰＣ
Ｔ／ＵＳ８９／０１０２５において記述されている。前
者の出願は、修飾されたプライマーを用いる、ＰＣＲに
類似の、温度および酵素依存性合成である。プライマー
は、捕捉モイエティ（Ｍｏｉｅｔｙ）（例えばビオチ
ン）および／または探知器モイエティ（例えば酵素）を
用いて標識することにより修飾される。後者の出願にお
いては、過剰量の標識プローブを試料に添加する。標的
配列の存在下において、プローブが結合し、そして酵素
により分解される。分解後、標的配列は過剰量のプロー
ブにより結合していたときのままで解離する。標識プロ
ーブの分解は、標的配列の存在を示す。そして最後に、
１９９１年１月３１日出願の米国特許第０７／６４８，
２５７号が開示し、そして請求の範囲に記載しているこ
とは、制限酵素を使用した増幅の前に標的物を生成する
ことからなる、核酸の増幅法（鎖置換型増幅法と呼ばれ
る）である。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】上記の引用された増幅
法それぞれは、増幅すべき所望の形で核酸配列が入手で
きるかどうかにより制約を受けうる。さらに、規定され
た５’末端および３’末端を有する（即ち、特定のヌク
レオチドの位置で終わってる）増幅可能な標的断片を生
成する要求は絶えず求められている到達点である。
【００１８】
【課題を解決するための手段】本発明は、（ａ）プライ
マーを核酸配列にハイブリダイズさせ、（ｂ）（ａ）の
上記プライマーの５’に位置する（ａ）の上記核酸配列
にプライマーをハイブリダイズさせ、そして（ｃ）両方
のプライマーから合成することにより（ａ）の上記プラ
イマーを上記核酸から置換する工程からなる、核酸生成
法に関する。
【００１９】本発明は、次に増幅およびクローニングを
行うために５’末端および３’末端が規定された標的核
酸配列を生成する方法に関する。
【００２０】さらに、この方法は上記（ｃ）の後に加熱
工程を実施することができ、何度も繰り返される。
【００２１】標的断片が二本鎖の核酸の場合は、この方
法はさらに核酸断片を変成することにより一度だけ一本
鎖の標的配列を形成する工程を含む。核酸がＲＮＡの場
合は、逆転写酵素を使用してＲＮＡからＤＮＡに変換す
ることが好ましい。
【００２２】次の置換型増幅法（ＳＤＡ）が強化される
のは、各起源の標的鎖から多数の修飾されたニッキング
部位が生じるからである。従来報告されていたＳＤＡ法
はプライマーの結合前に標的物の制限酵素処理を含み、
そして一方の末端にのみ修飾されたニッキング部位を有
する２つの二本鎖断片のみを生成した。この制限酵素に
よる処理工程は規定された５’末端および３’末端を有
する標的断片を提供するために必要であった。その後
の、これら標的断片の３’末端へのＳＤＡプライマーの
結合、およびその後の、クレノーを欠損したエキソヌク
レアーゼ（ｅｘｏ-クレノー）による伸長合成は、ＳＤ
Ａが開始するための、ニッキング酵素の認識部位を提供
した。これに対して、本発明の標的物生成法は合計６つ
の修飾されたニッキング部位を有する４つの二本鎖断片
を生じる（図１を参照せよ）。さらに、標的配列は今
や、便利な周辺の制限部位を考慮せずに選択できる。最
後に付け加えれば、ＳＤＡは今や、二本鎖または一本鎖
のいずれの標的ＤＮＡ標的試料にも適用できる。以前
は、標的物は制限酵素による分割のために二本鎖でなけ
ればならなかった。本明細書において使用されている、
ニッキングという言葉は二本鎖の認識部位内に存在する
２つの鎖のうちの一方だけを選択的に切断することを意
味する。
【００２３】本発明はさらに、上述の方法により生じた
反応産物の分離法および／または検出法に関する。この
分離法は、磁気的な分離、膜による捕捉および固形支持
体上での捕捉を含む。各方法において、捕捉モイエティ
は磁気ビーズ、膜または固形支持体に結合される。そし
てビーズ、膜または固形支持体について、反応産物の存
在または不在をアッセイできる。捕捉モイエティの例
は、生成された反応産物に相補的な核酸配列およびプラ
イマーまたは反応産物に取り込まれるリセプターに対す
る抗体を含む。分離系は検出系と連動していてもしてい
なくてもよい。
【００２４】本発明はさらに、配列分析のためのプロー
ブまた鋳型として機能できる増幅産物を生成する方法に
関する。このフォーマットにおいて、上述の方法および
段階を使用することにより、増幅産物を生成する。そし
て、増幅産物を処理することにより、例えば制限酵素を
使用して増幅産物からニッキング酵素認識配列を除去で
きる。このようにして、認識配列は除去され、そして残
った増幅産物は他の系において使用できるプローブから
なる。
【００２５】本発明を実施するために、標的核酸配列を
含むと予測されているどのような材料からも試料が単離
される。動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒ
トにおけるそのような材料源は、血液、骨髄、リンパ
球、硬組織（例えば、肝臓、脾臓、腎臓、肺、卵巣、等
々）、唾液、便および尿からなる。他の材料源は、生物
学的有機体を含むと予測されている、植物、土壌および
他の材料に由来する。
【００２６】これら材料からの核酸の単離は、多数ある
任意の方法により行うことができる。そのような方法
は、洗浄剤による溶解物、音波処理、ガラスビーズを用
いた振盪撹拌およびフレンチプレスの使用を含む。幾つ
かの例において、単離された核酸を精製することが有利
である（例えば、内在性ヌクレアーゼが存在すると
き）。これらの例において、核酸の精製はフェノール抽
出、クロマトグラフィー、イオン交換、ゲル電気泳動ま
たは密度に依存した遠心分離により実施される。
【００２７】核酸が単離されたら、以後の説明の都合上
ゲノミックな核酸はＤＮＡであり、二本鎖であると想定
する。
【００２８】その後のＳＤＡのための本発明による標的
物生成法を始めるために、過剰量の４つのプライマーの
存在下で増幅すべき核酸（例えば標的物）を熱変成する
（図１）。２つのプライマー（Ｓ1およびＳ2）は典型的
なＳＤＡプライマーであり、それらの３’末端に標的物
結合領域、および標的物の相補配列の５’に位置するニ
ッキング酵素認識配列を有する。２つのＳＤＡプライマ
ー（Ｓ1およびＳ2）は指数的増幅に必要であり、ＳＤＡ
プライマー（Ｓ1またはＳ2）のいずれか一方のみは一次
的増幅に必要である。他の２つのプライマー（Ｂ1およ
びＢ2）は単に標的物への結合領域からなる。（Ｂ1また
はＢ2のいずれか一方のみの上流のプライマーは絶対に
必要である。）Ｓ1およびＳ2は増幅される配列の周辺の
位置において標的物の二本の鎖の別々の鎖に結合する。
Ｂ1およびＢ2はそれぞれＳ1およびＳ2の上流に結合す
る。ｅｘｏ-クレノーは３つのデオキシヌクレオシド３
リン酸および１つの標識デオキシヌクレオシド３リン酸
を使用して、４つ全部のプライマーから同時に伸長合成
する。Ｓ1およびＳ2からの伸長合成により２つの産物、
Ｓ1−ｅｘｔおよびＳ2−ｅｘｔが形成される。Ｂ1およ
びＢ2の伸長合成により標的鋳型からＳ1−ｅｘｔおよび
Ｓ2−ｅｘｔが置換される。置換された一本鎖のＳ1−ｅ
ｘｔはＳ2およびＢ2の標的となる。同様に、置換された
Ｓ2−ｅｘｔはＳ1およびＢ1の標的となる。４つすべて
のプライマーは鋳型Ｓ1−ｅｘｔおよびＳ2−ｅｘｔの上
で伸長合成される。伸長合成と置換の工程を一緒に行う
ことにより、修飾されたニッキング酵素の認識部位を各
末端に有する２つの二本鎖断片と、修飾されたニッキン
グ酵素の認識部位を一方の末端のみに有する、より長い
２つの二本鎖断片とが生じる。工程を追ってこの方法を
記載してきたが、この方法は実際は同時に起こる。今
や、増幅法は、以下に記載されそして引用により本明細
書の一部をなす米国特許第０７／６４８，２５７号にも
記載されている鎖置換型増幅法（ＳＤＡ）により、実施
できる。
【００２９】本発明は、プライマーを結合させる前に慣
用的に行われていた制限酵素による処理工程の必要性を
排除する。即ち、便利な制限部位に囲まれた標的配列を
定める必要性を排除することにより、配列の標的物の選
択を単純化することに加えて、工程数およびコストが減
少する。さらに、本発明は、感度が増加し、増幅のため
の標的核酸配列の選択におけるより一層の自由をさらに
提供し、そして増幅に要する時間を少なくする。
【００３０】標的物の生成のためのこの方法は、他の増
幅法、例えばポリメラーゼチェインリアクション法（Ｐ
ＣＲ）、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，エルリッヒ
（Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ）編集、［ストックトン プレ
ス（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、
ニューヨーク州、１９８９］、転写に基づく増幅システ
ム（ＴＡＳ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３（１９８９）、ライゲーシ
ョン増幅反応（ＬＡＲ）、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６
０（１９８９）、リガーゼに基づく増幅システム（ＬＡ
Ｓ）、Ｇｅｎｅ ８９：１１７（１９９０）、および
Ｑ．Ｂ．レプリカーゼ、ロメル（Ｌｏｍｅｌｌ）ら、Ｃ
ｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３５：１８２６（１９８９）、およ
び３ＳＲ、グアテリ（Ｊ．Ｇｕａｔｅｌｌｉ）ら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１
８７４（１９９０）を用いて行うことができる。
【００３１】本発明の標的物生成法をＳＤＡ以外の増幅
法と共に用いるならば、いくつかの修飾がなされうる。
引き続く増幅をポリメラーゼチェインリアクション法に
より行うのであれば、プライマーはどのような認識配列
も含む必要はない。同様に、増幅をＱベータレプリカー
ゼにより行うのであれば、認識配列は、Ｑベータレプリ
カーゼにより認識されるＲＮＡ配列の転写のためのＲＮ
Ａポリメラーゼのプロモーターを含むべきである（クラ
マー（Ｆ．Ｒ．Ｋｒａｍｅｒ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３３
９：４０１（１９８９））。３ＳＲを使用してＤＮＡを
増幅するのであれば、プライマーＳ1および／またはＳ2
は、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター部位を含むはず
である。φ２９の複製システム（ジェネンテック社（Ｇ
ｅｎｅｎｔｅｃｈ）、国際公開第９０／１００６４号を
参照せよ）を使用して増幅を行うのであれば、Ｓ1およ
びＳ2は複製開始点の配列を含むはずである。
【００３２】さらに、この方法は、図１の工程を本質的
に何度も繰り返すことにより行うことができる。通常二
本鎖断片を変成するために加熱が適用される。このよう
な方法は、ニッキング酵素の必要性を排除し、そして修
飾されたヌクレオシドの必要性を排除する。即ち、この
方法は本質的に増幅法となる。
【００３３】図１の略図による標的物の生成によれば、
ＨｉｎｃＩＩを増幅のためのニッキング酵素として使用
するＳＤＡにより、標的核酸配列が増幅できる。図１の
最後の４つの標的断片は自動的に増幅サイクルの「定常
状態」の連続に入るが、その際、ＨｉｎｃＩＩは一方の
鎖がホスホロチオエート化されている（ｈｅｍｉｐｈｏ
ｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）認識部位にニックを入
れ、そしてｅｘｏ-クレノーは反対側のＳＤＡプライマ
ーの標的となる下流の鎖を置換しながらニックの３’末
端から伸長合成する（図２）。これらの工程は増幅の過
程において連続的に繰り返される。例えば、図２の工程
の約２３回の繰り返しまたはサイクルから１０7倍の増
幅が理論的に得られる（２23＝１０7）。図２において
置換された各々の鎖は、５’末端に配列5’ＧＡＣおよ
び３’末端に相補配列5’ＧＴＣを含む。5’ＧＡＣはニ
ック部位の３’に位置するＨｉｎｃＩＩ認識配列の一部
である。
【００３４】図１から図２への移行は図１の最後の二本
鎖断片を詳細に説明することにより、より明らかになる
であろう。ＨｉｎｃＩＩが、Ｓ1プライマー配列を含む
断片の左末端の、一方の鎖がホスホロチオエート化され
ている部位にニックを入れるならば、ｅｘｏ-クレノー
はニック部位から複製を開始し、そして５’末端に5’
ＧＡＣを有する下流の鎖および３’末端のプライマーＳ
2の完全な相補配列を置換する。Ｓ2はこの置換された鎖
に結合し、そしてｅｘｏ-クレノーは「ｄＧＴＰ，ｄＣ
ＴＰ，ＴＴＰおよびｄＡＴＰ（αＳ）を使用した重合」
による標識工程の産物として図２の右側に示される二本
鎖断片を形成するＳ2を伸長合成する。同様の反応が、
図１の下部に示された完全なセットの断片を用いて起こ
る。
【００３５】この方法において使用される第一のプライ
マー（例えば、図１のＳ1およびＳ2を参照せよ）は通常
２０−１００ヌクレオチドを有する。約２５−４０ヌク
レオチドのプライマーが好ましい。この配列は、ハイス
トリンジェンシー条件においても結合が生じるように、
標的物上の配列に実質的に相同性であるべきである。次
の増幅工程に依存して、次にＳＤＡを行うのであればエ
ンドヌクレアーゼにより認識され、またはポリメラーゼ
（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、Ｑベータレプリカーゼ、複製
開始点を認識する酵素（例えばφ２９）および類似物に
より認識される配列（５’末端に向かって）もプライマ
ーは含んでいなければならない（認識配列と呼ばれ
る）。認識配列は、ＳＤＡを使用する場合は通常はパリ
ンドロームでないが、このことは必ずしも必要でない。
２つのプライマーが好ましいが、絶対に必要とされるの
は１つだけであり、望むなら好きなだけのプライマーを
使用することができる（より多くのプライマーを使用す
ればより多くの増幅可能な標的物が生成される）。
【００３６】第二のプライマー（例えば、図１のＢ1お
よびＢ2を参照せよ）もすぐ上に記述されるような様式
で設計されるが、しかし第二のプライマーは認識配列を
含んでいてもよいが含む必要はなく、認識配列を含むこ
とが好ましい。好ましくは第二のセットのプライマーは
約８から約１００ヌクレオチド塩基の長さ、より好まし
くは認識部位を含めて約２５から約４０ヌクレオチド塩
基の長さである。プライマーが認識部位を含まないのな
らば、約１０から約２５ヌクレオチド塩基の長さが好ま
しい。
【００３７】第二のプライマーは第一のプライマーの上
流（５’）に結合すべきであり、ここで鎖置換活性を有
しかつ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠損するＤ
ＮＡポリメラーゼにより伸長合成される。第二のプライ
マーが伸長合成されるにつれて、第一のプライマーの伸
長合成産物が置換される。外側プライマー（若しくは
「第二の」プライマー）は２つ使用することが好ましい
が、絶対に必要なのは１つだけであり（例えばＢ1）、
望むならば好きなだけの数を使用できる（標的物の生産
工程（図１）において使用されるプライマーが多けれ
ば、ニックを入れられ得る認識部位を含む増幅可能な標
的断片の数が増える。これはより多くの増幅率をもたら
す。）。
【００３８】標的核酸が二本鎖ならば、それらを変成す
ることにより一本鎖にして、プライマーを標的鎖に結合
させる。反応温度を約９５℃に上昇させることは核酸を
変成させるのに好ましい方法である。他の方法はｐＨを
上昇させることであるが、この方法はプライマーを標的
物に結合させるためにｐＨを低下させることを必要とす
る。
【００３９】生じた核酸標的物を次いて増幅するために
ＳＤＡを用いるのであれば、核酸を変成させる前または
変成させた後に、少なくとも一つが置換された（または
修飾された）過剰量の４つすべてのデオキシヌクレオシ
ド３リン酸、ポリメラーゼ、ニッキング酵素、および少
なくとも第一および第二のプライマーからなる混合物も
添加する。高温で核酸を変成するのであれば、高温耐性
酵素を使用しない限り、変成後に酵素を添加したほうが
よい。置換されたデオキシヌクレオチド３リン酸の修飾
は、置換されたデオキシヌクレオシドを含む鎖中におい
てはニッキング酵素による分割が阻害されるが他方の鎖
の分割は阻害されないような修飾にするべきである。こ
のような修飾されたデオキシヌクレオシド３リン酸の例
は、２’−デオキシアデノシン５’−Ｏ−（１−チオ３
リン酸）、５−メチルデオキシシチジン５’−３リン
酸、２’−デオキシウリジン５’−３リン酸および７−
デアザ−２’−デオキシグアノシン５’−３リン酸を含
みうる。
【００４０】デオキシヌクレオチドの置換は，鎖に入っ
た後に実施してもよいことは認識されるべきである。例
えば、メチラーゼ、例えばＭ．ＴａｑＩを使用すること
により、合成鎖にメチル基を加えることができる。そし
て最後に述べれば、一方の鎖のみにニックを入れるニッ
キング酵素を使用するのであれば、修飾されたデオキシ
ヌクレオチドを使用する必要性は排除される。
【００４１】標的物の生成およびＳＤＡのための反応成
分からなる混合物は、必要であればＮＭＰ（１−メチル
２ピロリジノン）、グリセロール、ポリ（エチレングリ
コール）、ジメチルスルフォキシドおよび／またはホル
ムアミドを含みうる。そのような有機溶剤を含むことは
バックグラウンドのハイブリダイゼーション反応を緩和
する助けとなると信じられる。
【００４２】さらに、すべてのヌクレオシドが置換され
ているならば、ポリメラーゼは５’→３’エキソヌクレ
アーゼ活性を欠く必要がないことは認識されるべきであ
る。合成鎖全体の置換体の存在は、システムを不活性化
することなしにそのような活性を阻害するために機能す
る。
【００４３】明らかに、ＳＤＡを増幅法として用いず、
そして例えばＰＣＲ法を使用するのであれば、修飾され
たヌクレオチドを使用する必要はなく、またニッキング
酵素は必要ない。
【００４４】プライマーに入れられた認識配列の選択に
おいて記述されたように、この方法において使用される
エンドヌクレアーゼは、認識配列の３’（または５’）
において鎖を切断するように選択するべきである。さら
にエンドヌクレアーゼは、ポリメラーゼの存在により標
的鎖内に生成する相補的な認識配列を切断しないように
選択され、さらに合理的な速度でニックの入った認識配
列を解離させるように選択されるべきである。高温耐性
である必要はない。エンドヌクレアーゼはＨｉｎｃＩ
Ｉ，ＨｉｎｄＩＩ，ＡｖａＩ，Ｆｎｕ４ＨＩ，Ｔｔｈｌ
ｌｌＩ，およびＮｃｉＩが好ましい。
【００４５】本明細書において詳細に説明されたことに
加えて、幾つかの代わりのニッキング酵素系を想定する
ことができる。例えば、クラスＩＩＳの制限酵素（例え
ば、ＦｏｋＩ）は一本のポリペプチドユニット内に２つ
のＤＮＡ切断中心を含む。例えば部位特異的変異導入法
により、切断中心の一つが不活性化されていれば、その
結果生成されるニッキング酵素は、修飾されたデオキシ
ヌクレオシド３リン酸を必要とせずに増幅系において使
用できるであろう。もう一つの例として、制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩは、正規でない認識部位において、または正規の
認識部位がオリゴプリン領域によりはさまれている場合
に、一方の鎖を選択的に切断することが示された（チェ
ルキング（Ｔｈｉｅｌｋｉｎｇ）ら、（１９９０）Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９，４６８２；レザー（Ｌｅ
ｓｓｅｒ）ら、（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５０，
７７６；ベンディッティとウエルズ（Ｖｅｎｄｉｔｔｉ
＆Ｗｅｌｌｓ）（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６６，１６７８６）。他の例として、制限酵素Ｄｐｎ
Ｉ（ニューイングランドバイオラブズ社、ベバリ、ＭＡ
から市販されている）は両鎖にｍｅ6ｄＡを含む認識部
位を切断する。ＤｐｎＩまたは類似の制限酵素は一方の
鎖がメチル化された認識部位のメチル含有鎖にニックを
入れることができる。このような系は、未修飾のデオキ
シヌクレオシド３リン酸と共にメチル化された認識部位
を含むＳＤＡプライマー（Ｓ1およびＳ2）を用いるはず
である。別法として、特定の制限酵素は、一方の鎖がメ
チル化された認識部位のメチル化されていない鎖を切断
することが知られている（例えば、ＭｓｐＩとｍｅ5ｄ
Ｃ）。このような系は、メチル化されたデオキシヌクレ
オシド３リン酸を使用するであろう。最終的には、複製
蛋白質の認識する複製開始点を使用して認識部位の一方
の鎖にニックを入れてもよい。
【００４６】以下の表は酵素、それらの認識部位および
この方法に使用するための修飾されたｄＮＴＰを列挙し
たものである： 酵素 認識部位（５’−３’） 修飾されたｄＮＴＰ ＨｉｎｃII ＧＴＴＧＡＣ ｄＡＴＰ（αＳ） ＨｉｎｃII ＧＴＣＡＡＣ ｄＧＴＰ（αＳ） ＡｖａＩ ＣＣＣＧＡＧ ＴＴＰ（αＳ） ＡｖａＩ ＣＴＣＧＧＧ ｄＣＴＰ（αＳ） ＮｃｉＩ ＣＣＧＧＧ ｄＣＴＰ（αＳ） ＨｉｎｄII ＧＴＴＧＡＣ ｄＡＴＰ（αＳ） ＨｉｎｄII ＧＴＣＡＡＣ ｄＧＴＰ（αＳ） Ｆｎｕ４HI ＧＣＧＧＣ ｄＣＴＰ（αＳ） ＢｓｔXI ＣＣＡＡＡＡＣＣＣＴＧＧ ＴＴＰ（αＳ） 配列番号：１５ ＢｓｔXI ＣＣＡＧＧＴＴＴＴＧＧ ｄＣＴＰ（αＳ） 配列番号：１６ ＢｓｍＩ ＡＡＡＧＣＡＴＴＣ ＴＴＰ（αＳ） ＢｓｒＩ ＡＡＣＣＡＧＴ ＴＴＰ（αＳ） ＢｓａＩ ＧＧＴＣＴＣＴＴＴＴＴＴ ｄＡＴＰ（αＳ） 配列番号：１７ ＮｌａIV ＧＧＡＡＣＣ ＴＴＰ（αＳ） ＮｓｐＩ ＧＣＡＴＧＴ ｄＣＴＰ（αＳ） ＮｓｐＩ ＧＣＡＴＧＴ ｄＣＴＰ（αＳ）および ｄＧＴＰ（αＳ） ＰｆｌＭＩ ＣＣＡＧＧＴＴＴＴＧＧ ｄＣＴＰ（αＳ） 配列番号：１８ ＨｐｈＩ ＧＧＴＧＡＧＧＡＴＣＧＴＴＴ ｄＡＴＰ（αＳ） 配列番号：１９ ＡｌｗＩ ＧＧＡＴＣＧＴＴＴＴＴ ｄＡＴＰ（αＳ） 配列番号：２０ ＦｏｋＩ ＧＧＡＴＧＧＣＡＴ ＧＴＣＴＴＴＴＧＧＧ ｄＣＴＰ（αＳ） 配列番号：２１ ＡｃｃＩ ＧＴＡＧＡＣ ｄＣＴＰ（αＳ） ＡｃｃＩ ＧＴＡＧＡＣ ＴＴＰ（αＳ） ＡｃｃＩ ＧＴＡＧＡＣ ＴＴＰ（αＳ）および ｄＣＴＰ（αＳ） ＡｃｃＩ ＧＴＣＴＡＣ ｄＡＴＰ（αＳ） ＡｃｃＩ ＧＴＣＴＡＣ ｄＧＴＰ（αＳ） ＡｃｃＩ ＧＴＣＴＡＣ ｄＡＴＰ（αＳ）および ｄＧＴＰ（αＳ） TthlllＩ ＧＡＣＣＡＣＧＴＣ ＴＴＰ（αＳ） TthlllＩ ＧＡＣＣＡＣＧＴＣ ＴＴＰ（αＳ）および ｄＧＴＰ（αＳ） TthlllＩ ＧＡＣＧＴＧＧＴＣ ｄＣＴＰ（αＳ） TthlllＩ ＧＡＣＧＴＧＧＴＣ ｄＣＴＰ（αＳ）および ｄＡＴＰ（αＳ） ＳＤＡおよび標的物生成法のための、この方法に有用な
ポリメラーゼは、ニックから５’−３’方向に重合を開
始するものを含む。ポリメラーゼはニック下流の重合鎖
の置換もすべきであり、そして重要なことはあらゆる
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠いているべきで
ある。ポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼＩのク
レノー断片およびＤＮＡポリメラーゼＩのエキソヌクレ
アーゼ欠損クレノー断片およびＢｓｔポリメラーゼ由来
の同様の断片（バイオラッド社、リッチモンド、ＣＡ）
が有用である。シークエネース１．０およびシークエネ
ース２．０（米国バイオケミカル社）、Ｔ５ＤＮＡポリ
メラーゼおよびφ２９ＤＮＡポリメラーゼも使用され
る。通常エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ
は、その活性がブロッキング剤の添加によりブロックさ
れるとそのような活性を「失った」と見なされうること
は認識すべきである。
【００４７】この方法のさらなる特徴は、合成において
温度を上下する必要がないことである。多くの増幅法
は、温度を上下することにより合成鎖から標的物を解離
する必要がある。この方法においては、変成後に単一の
温度を使用することができる。非特異的な結合を最少に
するために反応温度を十分に高く、しかし標的鎖にプロ
ーブが結合する時間を最少にするように反応温度を十分
に低く、ストリンジェンシーのレベルを設定すべきであ
る。さらに、適当な温度により酵素活性を十分に保護す
べきである。約３７℃から約４２℃が好ましい温度であ
ることが分かった。酵素および核酸の変成が避けられ
る。
【００４８】標的物の生成から次の鎖置換型増幅法によ
る増幅までの、本発明の工程の簡単な概要は、過剰量の
４プライマーの存在下において熱変成された標的ＤＮＡ
試料である（図１を参照せよ）。２つのプライマー（Ｓ
1およびＳ2）は典型的なＳＤＡプライマーであり、それ
らの３’末端に標的結合領域、およびそれらの５’末端
にＨｉｎｃＩＩ認識配列（５’ＧＴＴＧＡＣ）を有す
る。他の２つのプライマー（Ｂ1およびＢ2）は単に標的
結合領域からなる（制限部位認識配列を含みうるが、そ
の必要はない）。Ｓ1およびＳ2は増幅される配列をはさ
んで標的と反対の鎖に結合する。Ｂ1およびＢ2はそれぞ
れＳ1およびＳ2の上流に結合する。ｅｘｏ-クレノーは
ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ＴＴＰおよびｄＡＴＰ（αＳ）を
使用して４つのプライマーから同時に伸長合成する。Ｓ
1およびＳ2からの伸長合成は２つの産物、Ｓ1−ｅｘｔ
およびＳ2−ｅｘｔを形成する。Ｂ1およびＢ2からの伸
長合成は起源の標的鋳型からのＳ1−ｅｘｔおよびＳ2−
ｅｘｔの置換をもたらす。置換された一本鎖Ｓ1−ｅｘ
ｔはＳ2およびＢ2の標的となる。同様に、置換されたＳ
2−ｅｘｔはＳ1およびＢ1の標的となる。Ｓ1−ｅｘｔお
よびＳ2−ｅｘｔの上ではすべての４つのプライマーが
伸長合成される。伸長合成と置換の工程を組み合わせる
ことにより、一方の鎖がホスホロチオエート化されてい
るＨｉｎｃＩＩ認識部位を各末端に有する２つの二本鎖
断片、および一方の末端のみがホスホロチオエート化さ
れているＨｉｎｃＩＩ部位を有する２つのより長い二本
鎖断片を生じる。これら４つの標的断片は直ちに増幅サ
イクルの「定常状態」の連続に入るが、その際、制限酵
素ＨｉｎｃＩＩは一方の鎖がホスホロチオエート化され
ている認識部位にニックを入れ、そしてポリメラーゼｅ
ｘｏ-クレノーは反対のＳＤＡプライマーのための標的
となる下流の鎖を置換しながらニックから複製を開始す
る（図２を参照せよ）。この増幅サイクルを連続的に繰
り返すことにより、過剰コピー数の標的物が生成される
（前述のとおり、ＳＤＡは使用できる多くの増幅法のう
ちの単なるひとつである）。
【００４９】図３において、ＳＤＡを使用する配列分析
のための合成プローブまたは鋳型の一例が示されてい
る。この実施例において、鎖Ｐはプライマーを表し、エ
ンドヌクレアーゼＨｉｎｃＩＩにより認識される配列Ｇ
ＴＴＧＡＣを５’末端に含む。標的物はすでに断片化さ
れ、一本鎖にされている。この方法において、プライマ
ーは標的物に結合し、そしてポリメラーゼ、デオキシヌ
クレオシド３リン酸およびαチオ置換デオキシアデノシ
ン３リン酸の存在下においてプライマーから標的物の長
さの分伸長合成されるが、標的物は認識配列を通って伸
長合成される。エンドヌクレアーゼＨｉｎｃＩＩの存在
下において、プライマー鎖はＴ−Ｇ残基間でニックを入
れられる。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くポ
リメラーゼの存在下において、３’末端のニックから伸
長合成され、プライマー鎖の下流は、ニックから始まる
標的鎖から解離することにより、反応産物が生成され、
そして新しい鎖が合成される。要約すれば、新たに合成
された鎖もエンドヌクレアーゼによりニックが入り、そ
してポリメラーゼがこの鎖を置換してもう一つの鎖を生
成し、このようにして反応を故意に停止させるかまたは
試薬のうちの一つが使い尽くされるかのいずれかまで反
応が繰り返される。
【００５０】当業者であれば、ＨｉｎｃＩＩに代えて、
特定の配列を認識してニックを入れる制限酵素を使用し
てもよいことは認識されるはずである。例えば、制限酵
素ＮｃｉＩを使用するのであれば、プライマーはＮｃｉ
Ｉにより認識されるＣＣＧＧＧ配列を５’末端に含む。
制限酵素ＮｃｉＩの存在下においてプライマー鎖はＣ−
Ｇ残基間でニックを入れられる。
【００５１】図３に示されるとおり、配列分析のための
プローブまたは鋳型を生成する別法とは、２つのプライ
マー（Ｓ1およびＳ2）を使用する指数的ＳＤＡである
が、その際一方のプライマーは他方のプライマーと比較
して大過剰量である。その結果、他方の鎖に比較して一
方の一本鎖が過剰に生成される。
【００５２】図４においては、制限消化物により生じた
二本鎖標的断片のためのＳＤＡの一例が示されている
（本発明の標的物の生成法に対比して）。２つのプライ
マー（Ｐ1およびＰ2）があり、それぞれは２つの標的配
列（Ｔ1およびＴ2）に相補的である。そして反応は図１
のように進行する。しかしながら、Ｐ1はＴ2により生成
された反応産物に結合し、Ｐ2はＴ1により生成された反
応産物に結合することは注意を要する。この様式におい
て、増幅は対数的に進行する。
【００５３】増幅された標的物の存在は、多くのあらゆ
る方法により検出できる。一つの方法は、ゲル電気泳動
による特定のサイズの反応産物の検出である。この方法
は使用したヌクレオチドが32Ｐのような放射性標識のと
きに特に有用である。他の方法はビオチンのような物理
的な標識を用いた標識ヌクレオチドの使用を含む。そし
て反応産物を含むビオチンはペルオキシダーゼのような
シグナルを発する酵素に結合したアビジンにより同定さ
れうる。
【００５４】本発明の実施において有用である検出系
は、分離を要しない均一な系（ホモジニアスシステム）
および不均一な系（ヘテロジニアスシステム）を含む。
各系において、ひとつまたは複数の検出可能なマーカー
が使用され、好ましくは自動化された方法により、検出
系からの反応または放射が監視される。均一な系の例
は、蛍光偏光、酵素を介するイムノアッセイ、蛍光エネ
ルギー転移、ハイブリダイゼーション保護（例えばアク
リジニウムルミネッセンス）およびクローン化された酵
素のドナーイムノアッセイを含む。不均一な系の例は、
酵素標識（例えばペルオキシダーゼ、アルカリホスファ
ターゼおよびベータ−ガラクトシダーゼ）、蛍光標識
（例えば酵素標識および直接の蛍光標識［例えばフルオ
レセインおよびローダミン］）、ケミルミネッセンスお
よびバイオルミネッセンスを含む。リポソームまたは他
の袋状粒子も染色剤または他の検出可能なマーカーによ
り満たされて、そのような検出系において使用されう
る。これらの系において、検出可能なマーカーは直接ま
たは間接に捕捉モイエティに結合でき、また反応産物は
リガンドにより認識されうるリセプターの存在下におい
て生成しうる。
【００５５】一つの方法は電気泳動により特定の大きさ
を有する検出反応産物である。他の方法は、32Ｐでプロ
ーブ配列を放射標識し、そして例えば反応産物により発
せられる放射活性をそのままあるいは電気泳動により検
出する。さらなる方法は、プライマーに結合分子（例え
ばビオチン−アビジン）、および酵素（例えばアルカリ
ホスファターゼ）、蛍光染色剤（例えばフィコビリ蛋白
質）またはそれらの組み合わせを添加することにより化
学的に修飾する。他の方法は、反応産物に結合し、そし
てポリメラーゼ存在下において伸長合成反応される検出
プライマーの開発である。この検出プライマーは上述の
ように放射標識により、または化学的に修飾できる。こ
れらの方法の多くは、固相法並びに液相系に使用され
る。これらの方法並びに他の方法の多くは、米国特許第
４，３５８，５３５号、第４，７０５，８８６号、第
４，７４３，５３５号、第４，７７７，１２９号、第
４，７６７，６９９号、および第４，７６７，７００号
に記述されている。
【００５６】図１の略図は２つのポリメラーゼチェイン
リアクションサイクルとして記述されうるが、その際、
間に入る熱変成工程は上流のプライマー（Ｂ1および
Ｂ2）の第二の組、および鎖置換活性を有しかつ５’→
３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＤＮＡポリメラーゼ
の使用により置き換えられた。結果的にこの略図は、多
くの応用における使用のための、規定された５’末端お
よび３’末端を有する二本鎖断片を生成するための一般
的で便利な方法を示す。応用とは、Ｓ1およびＳ2中のニ
ッキング酵素認識配列を任意の適当な制限部位で置換す
ることにより図１の最後の生成断片をクローニングベク
ターに連結できるようにすること、（図１の略図は修飾
されたデオキシヌクレオシド３リン酸の使用を必要とし
ない）、ＳＤＡプライマー中のニッキング酵素認識配列
の一方または両方を転写の鋳型の生成のためにＲＮＡポ
リメラーゼのプロモーター（例えばバクテリオファー
ジ）により置換すること、および鎖置換活性を有し、か
つ５’→３’エキソヌクレアーゼを欠損している逆転写
酵素を使用して、この技術を二本鎖ｃＤＮＡの合成に適
用しうること（ＲＮａｓｅＨ活性を有する逆転写酵素は
必要ない）を含む。逆転写酵素の例はクレノーである
（マイヤー（Ｔ．Ｗ．Ｍｙｅｒｓ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ ３０：７６６１（１９９１））。
【００５７】本発明において記述されたような、増幅工
程と共に標的物を調製する使用法は、いかなる特定の応
用にも限定されない。本発明の標的物調製法および増幅
法が使用できる応用分野は、診断、ＲＮＡの増幅、（例
えば、遺伝子発現の監視）、珍しい機能的核酸分子のイ
ンビトロ選択および増幅において、（グリーン（Ｇｒｅ
ｅｎ）ら、ＭＥＴＨＯＤＳ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ
ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
２：７５−８６（１９９１）を参照せよ）、長い配列の
増幅に続く内部配列の増幅（「入れ子式（ｎｅｓｔｅ
ｄ）」増幅とも呼ばれる）、部位特異的変異導入、クロ
ーニング、配列決定、遺伝子診断、オンコジーンの診
断、未知の配列領域の増幅、およびオイルの流出の追跡
および安全性の証明のような非生物学的応用を含むがこ
れらに限定されない（エルリッヒ（Ｅｒｌｉｃｈ）ら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ２５２：１６４３（１９９１）を参照せ
よ）。
【００５８】以下の実施例は、ここに記述された本発明
の特定の態様を例示する。当業者には明らかなとおり、
さまざまな変化および修飾は、記述された本発明の目的
の範囲内で可能であり、そして予想される。
【００５９】
【実施例】実施例１ 標的物の生成 ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅ
ｒｃｕｌｏｓｉｓ）の標的ゲノミックＤＮＡ量を変えた
１００μｌの反応物を調製した。標的配列はヒト型結核
菌のＩＳ６１１０インサーションエレメント（ｉｎｓｅ
ｒｔｉｏｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）のヌクレオチド９７７−
１０２３である（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ １８，１８８（１９９０））。
【００６０】５０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４ ５０ｍＭ 塩化カリウム ５０ｍＭ 塩化ナトリウム ６ｍＭ 塩化マグネシウム １ｍＭ ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ＴＴＰ，ｄＡＴＰ（α
Ｓ） １００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ １ｍＭ ＤＴＴ １または１０μｇ ヒト胎盤ＤＮＡ ３％（ｖ／ｖ） １−メチル２−ピロリジノン １μＭ プライマー（配列番号１０） １μＭ プライマー（配列番号１１） １μＭ プライマー（配列番号１２） １μＭ プライマー（配列番号１３） ヒト型結核菌のゲノミックＤＮＡ量を変える 各試料を９８℃において３分間加熱した後３７℃におい
て２分間置いた。次に、１０ユニットのｅｘｏ-クレノ
ー（ユナイテッドステイツバイオケミカル社（Ｕｎｉｔ
ｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ））およ
び３００ユニットのＨｉｎｃＩＩ（ニューイングランド
バイオラブズ社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａ
ｂｓ））を各試料に添加し、３７℃においてインキュベ
ートした。試料アリコート（１０μｌ）を２時間後に取
り以下の分析を行った。
【００６１】２μｌの１μＭ 32Ｐ−プライマー（配列
番号１４）を各１０μｌの試料アリコートに添加して９
５℃において２分間加熱後、３７℃において２分間置い
た。２μｌの１ユニット／μｌクレノー（ベーリンガー
−マンハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−ｍａｎｎｈｅ
ｉｍ）、インディアナポリス、ＩＮ）を、次に変成ゲル
電気泳動により分析される試料に添加した。鎖置換増幅
法による生成物は32Ｐ−プライマー（配列番号１４）か
ら３５ないし５６ヌクレオチドに伸長合成される。該当
するバンドを切り出し、そして液体シンチレーションカ
ウントを行った。その結果を要約する。
【００６２】 ヒト型結核菌ゲノム ヒト 電気泳動のコピー（分子）＊ ＤＮＡ（μｇ）＋ 32Ｐ−バンド（ｃｐｍ）＃ ５００ １ １．９×１０5 ５０ １ ３．９×１０4 ５ １ ６．１×１０3 ０ １ ３．３×１０3＠ ５００ １０ ５．０×１０4 ５０ １０ ５．４×１０3 ５ １０ ８．９×１０2 ０ １０ ４．８×１０2＠ ＊ゲル電気泳動により分析されたアリコートに最初に存
在した分子数 ＋完全な１００μｌのＳＤＡ反応におけるヒト胎盤ＤＮ
Ａの量 ＃バックグラウンドを修正した ＠追跡量の標的物と不注意による汚染によるシグナル 増幅工程は５ゲノムコピーと０ゲノムコピーの標的ヒト
型結核菌配列の間で明らかに区別される。さらに、増幅
シグナルは最初の標的物の量に依存し、これによって定
量的増幅法および検出法のための手段が提供される。
【００６３】実施例２ この実施例は、増幅前に標的断片を生成するために、Ｆ
ｏｋＩ制限段階を使用したＳＤＡを例示する。アプライ
ドバイオシステムズ社３８０Ｂ装置および一次アミンを
３’末端に取り込む３’−アミン−ＯＮ ＣＰＧカラム
（クロンテックラボラトリーズ社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、パロアルト、ＣＡ）を使
用して、２つのプライマーを合成した。ヌクレオチドを
アンモニウム塩により脱保護し、そして変成ゲル電気泳
動により精製した。プライマー配列は、配列番号１およ
び配列番号２であった。
【００６４】０．０５ｍｇ／ｍｌ大腸菌ＤＮＡ、５０ｍ
Ｍ酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭ
ＤＴＴ、１２．５ｍＭ ＴＲＩＳ（ｐＨ７．９）によ
り、２５℃において、プラスミドｐＢＲ３２２（ベーリ
ンガーマンハイム社、インディアナポリス、ＩＮ）を連
続希釈した。１μｇの大腸菌ＤＮＡとさまざまな量のｐ
ＢＲ３２２を含む２０μｌの試料を、１０ユニットのＦ
ｏｋＩ（ニューイングランドバイオラブス社、ビバリー
（Ｂｅｖｅｒｌｙ）、ＭＡ）を用いて３７℃において３
時間消化した。ｐＢＲ３２２／大腸菌ＤＮＡのＦｏｋＩ
消化物を１２．５ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸マグ
ネシウム、１ｍＭ ＤＴＴ、２５℃の１２．５ｍＭ Ｔ
ＲＩＳ（ｐＨ７．９）、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、そ
れぞれ０．３ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ、ｄＣ
ＴＰ（αＳ）（ファルマシア社、ピスカタウエイ、Ｎ
Ｊ）および０．１μＭのそれぞれのプライマーにより１
００μｌに希釈した。４ユニットのＤＮＡポリメラーゼ
Ｉの５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損クレノー断片
（米国バイオケミカル社、クリーブランド、ＯＨ）およ
び４８ユニットのＮｃｉＩ（ニューイングランドバイオ
ラブズ社）を添加して、１セットの試料を４５℃におい
て４時間、鎖置換型増幅させた。第二のセットの試料
は、未増幅の標準として、ポリメラーゼおよびＮｃｉＩ
を添加せずに反応させた。
【００６５】反応産物を検出するために、ｐＢＲ３２２
に特異的な検出プローブ、配列番号３を調製し、ポリヌ
クレオチドキナーゼを用いて32Ｐで標識した。増幅およ
び未増幅のＦｏｋＩ／ｐＢＲ３２２／大腸菌ＤＮＡ試料
の１０μｌアリコートを、２μｌの１．８μＭ 32Ｐ標
識プローブ、０．５ユニット／μｌのＴａｑ ＤＮＡポ
リメラーゼ（ユナイテッドステイツバイオケミカル社）
と混合した。試料を９５℃において２分間、５０℃にお
いて５分間加熱し、５０％尿素で急冷し、そして一部を
変成１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて泳動し
た。増幅反応産物の存在は、４３または６０ヌクレオチ
ドの長さへの、32Ｐ標識検出プローブの伸長合成により
検出された。未増幅のＦｏｋＩ／ｐＢＲ３２２は４０ヌ
クレオチドへの伸長合成により示された。電気泳動の32
Ｐ標識バンドは、適当なバックグラウンドバンドを差し
引いて、液体シンチレーションカウンティングにより定
量された。結果を表１に示す。
【００６６】
【表１】 表１＃ｐＢＲ３２２分子 増幅された場合 増幅されなかった場合 （±５０ｃｐｍ） （±５０ｃｐｍ） ３×１０8 ５２９００ ２１５ ３×１０7 １８２００ ２４ ３×１０6 ５６９０ ２１ ３×１０5 ２９８ ０ ０ ３７ ＮＤ ＮＤ＝測定されなかった 表１から理解できるように、アリコートのｐＢＲ３２２
のＤＮＡの量が減少すると共に、１分あたりのカウント
数（ＣＰＭ）も減少する。
【００６７】実施例３ この実施例は、合成一本鎖標的ＤＮＡ配列を使用したＳ
ＤＡを例示する。合成核酸標的物は、配列番号４を含ん
で構築された。制限酵素ＨｉｎｃＩＩ（ニューイングラ
ンドバイオラブズ社）を使用した鎖置換型増幅のための
プライマーは、３’−アミン−オンＣＰＧカラムを使用
して、３’−ＮＨ2キャップを供給するようにして合成
された。使用されたプライマーの配列は、配列番号５お
よび配列番号６であった。
【００６８】反応産物の検出のためのプローブは、配列
番号７であった。すべての合成配列は、上記のアプライ
ドバイオシステムズ社３８０Ｂ装置により合成され、そ
して５０％尿素を含む１０％または１５％ポリアクリル
アミドゲルにより精製された。切り出されたバンドは１
／２×ＴＢＥ緩衝液中で電気的に溶出された。
【００６９】配列番号４を０．３μＭのプライマー（即
ち、配列番号５および配列番号６）中に希釈することに
より、標的物／μｌで６００，０００分子の最終保存濃
縮物が供給された。この混合物を３分間沸騰させ、３７
℃において静置した。そして、プライマーの存在下にお
いてこの保存溶液の連続４倍の希釈液を調製した。（対
照には、増幅プライマーのみが存在する。）２０μｌの
希釈された保存溶液を混合物に添加することにより、最
終体積を６０μｌにした。成分の最終濃度は以下のとお
りである：２０ｍＭ ＴＲＩＳ（ｐＨ７．２）（２５
℃）、０．１μＭのプライマー配列、２０ｍＭ硫酸アン
モニウム、５０ｍＭ塩化カリウム、５０ユニットのＨｉ
ｎｃＩＩ、５ユニットのエキソヌクレアーゼ欠損クレノ
ーポリメラーゼ（米国バイオケミカル社）、１ｍＭ Ｄ
ＴＴ、５ｍＭ塩化マグネシウム、およびそれぞれ３００
μＭの５’ｄＣＴＰ，５’ｄＧＴＰ，５’ｄＴＴＰおよ
び５’ｄＡＴＰ（αＳ）。増幅反応は、３７℃において
１時間または２時間行った。一つの反応セットには、１
時間後さらに５０ユニットのＨｉｎｃＩＩを添加し、さ
らに１時間反応させた。
【００７０】反応時間の終了時に各混合物の１０μｌア
リコートを氷上に静置した。この１０μｌに、32Ｐで標
識されたばかりの捕捉プローブの１μＭ保存溶液を添加
した。この混合物を３分間沸騰し、３７℃に冷やし、同
時に１μｌの１ユニットのシークエネース２．０（米国
バイオケミカル社）を添加した。（この酵素は、捕捉プ
ローブが反応産物に結合している場合、あらゆる反応産
物の完全長に沿って捕捉プローブを重合する。）この伸
長合成反応は３７℃において１５分間行った。この混合
物に、５０％尿素中の泳動染色液を等量添加した。５０
％尿素を含む１０％ポリアクリルアミドゲルにより泳動
する前に、試料を再び３分間沸騰させた。最初の６０μ
ｌの反応混合物のうちの２．５μｌに相当する量の試料
を泳動した。ゲルを除去した後、５９Ｗにおいて１時間
から１．５時間電気泳動を行い、そして−７０℃におい
て一晩フィルム上に置いた。露出後バンドを可視化し、
バンドを切り出し、そして液体シンチレーションにより
定量した。
【００７１】
【表２】 表２ ＃標的物 １時間 ２時間 ＨｉｎｃＩＩを添加して２時間 （ｃｐｍ） （ｃｐｍ） （ｃｐｍ） ０ ０ ０ ０ ２０００ ＮＤ ２ ８ ８０００ ４ １２ ３６ ３０，０００ ３７ ７８ １２９ １２５，０００ １７５ １９６ ７４６ ５００，０００ ８２４ １８５８ ２６６５ 表２を参照すると、最初の標的物が０から３００００の
間でＳＤＡがはっきりと区別されることが理解できる。
【００７２】実施例４ この実施例は、ＳＤＡ前にＦｏｋＩ制限消化物を使用し
ている。以下のプライマー配列が使用された：配列番号
８および配列番号９。
【００７３】これらの配列は、他の実施例のように生成
され、プラスミドｐＢＲ３２２内の標的配列を検出する
ために使用された。
【００７４】１μｇのｐＢＲ３２２を、８ユニットのＦ
ｏｋＩにより、３７℃において２時間消化し、そして
０．０５ｍｇ／ｍｌのヒト胎盤ＤＮＡのＨｐｈＩ消化
物、５０ｍＭ塩化カリウム、２０ｍＭ硫酸アンモニウ
ム、１ｍＭ ＤＴＴおよび２０ｍＭＴＲＩＳ（２５℃に
おいてｐＨ７．２）により連続的に希釈した。０．５μ
ｇのヒト胎盤ＤＮＡおよびさまざまな量のｐＢＲ３２２
を含む１０μｌの試料を、５０ｍＭ塩化カリウム、５ｍ
Ｍ塩化マグネシウム、２０ｍＭ硫酸アンモニウム、１ｍ
Ｍ ＤＴＴおよび２０ｍＭ ＴＲＩＳ（２５℃において
ｐＨ７．２）、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、それぞれ
０．１ｍＭのｄＧＴＰ、ＴＴＰ、ｄＣＴＰ（ファルマシ
ア社）、０．５ｍＭのｄＡＴＰ（αＳ）（ファルマシア
社）および０．１μＭの各プローブにより１００μｌに
希釈した。５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＩの５’→
３’エキソヌクレアーゼ欠損クレノー断片および５０ユ
ニットのＨｉｎｃＩＩを添加して、１セットの試料を３
９℃において３．５時間、鎖置換型増幅させた。第二の
セットの試料は、未増幅の標準として、ポリメラーゼお
よびＨｉｎｃＩＩを添加せずに反応させた。
【００７５】反応産物を検出するために、配列番号７を
含むｐＢＲ３２２検出プライマーを32Ｐで標識して使用
した。増幅および未増幅のＦｏｋＩ／ｐＢＲ３２２／ヒ
ト胎盤ＤＮＡ試料の１０μｌアリコートを、２μｌの１
μＭ 32Ｐ標識検出プライマーと混合し、そして９５℃
において２分間加熱した。次に、２ユニットのシークエ
ネース２．０を添加し、試料を３７℃において５分間イ
ンキュベートした。試料を５０％尿素により急冷し、そ
して変成１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて泳
動した。増幅反応産物の存在は、５４または７５ヌクレ
オチドの長さへの、32Ｐ標識検出プライマーの伸長合成
により検出された。未増幅のＦｏｋＩ／ｐＢＲ３２２は
５０ヌクレオチドへの伸長合成により示された。32Ｐ標
識バンドの電気泳動は、適当なバックグラウンドバンド
を差し引いて、液体シンチレーションカウンティングに
より定量された。結果を表３に示す。
【００７６】
【表３】 表３＃ｐＢＲ３２２分子 増幅された場合 増幅されなかった場合 （±１０ｃｐｍ） （±１０ｃｐｍ） １０9 ＮＤ １９６３ １０8 ＮＤ ２５７ １０7 ＮＤ ＮＤ １０6 １３５４０８ ＮＤ １０5 １３８４１ ＮＤ １０4 ２３２４ ＮＤ １０3 ３８０ ＮＤ ０ １３９＊ ＮＤ ＮＤ＝測定されなかった ＊ｐＢＲ３２２分子を添加しなかった増幅産物は、不注
意によるｐＢＲ３２２の混入により、標的物に特異的な
バンド（５４ｍｅｒおよび７５ｍｅｒ）を僅かに生じ
た。
【００７７】１０9および１０8のｐＢＲ３２２分子を用
いて増幅されなかった試料と、１０4および１０3のｐＢ
Ｒ３２２分子を含むそれぞれの試料との比較から、１０
5倍以上の増幅率が示唆される。さらに、緩衝液の組成
とデオキシヌクレオシド３リン酸の濃度を調整すること
により、増幅効果が改良されることがわかった。硫酸ア
ンモニウムを含有し、相対的に低いｐＨおよびｄＡＴＰ
（αＳ）：ｄＧＴＰの率が５：１のときに、増幅効率を
高めることがわかった。
【００７８】本発明は、特定の修飾に関して記述された
が、それらの詳細は限定されるものではなく、本発明の
趣旨および目的の範囲内でさまざまな均等物、変化およ
び修飾を用いてよいことは明らかであり、そのような均
等な態様はここに含まれるべきことが理解される。
【００７９】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の種類 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｕｎｓｕｒｅ 存在位置：１．．３９ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 TCATTTCTTA CTTTACCGGG AAAAATCACT CAGGGTCAA 39 配列番号：２ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の種類 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｕｎｓｕｒｅ 存在位置：１．．４０ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 TCATTTCTTA CTTTACCGGG ACCCTGTGGA ACACCTACAT 40 配列番号：３ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の種類 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｕｎｓｕｒｅ 存在位置：１．．１９ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 CCAGCGCTTC GTTAATACA 19 配列番号：４ 配列の長さ：６０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の種類 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｕｎｓｕｒｅ 存在位置：１．．６０ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ACCCTGTGGA ACACCTACAT CTGTATTAAC GAAGCGCTGG CATTGACCCT GAGTGATTTT 60 配列番号：５ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の種類 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｕｎｓｕｒｅ 存在位置：１．．３３ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GGATATTTAT TGTTGACTTA CCCTGTGGAA CAC 33 配列番号：６ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の種類 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｕｎｓｕｒｅ 存在位置：１．．３５ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GGAATAATAA TATGTTGACT TGAAAAATCA CTCAG 35 配列番号：７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の種類 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｕｎｓｕｒｅ 存在位置：１．．２０ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ACATCTGTAT TAACGAAGCG 20 配列番号：８ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の種類 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｕｎｓｕｒｅ 存在位置：１．．４１ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 TTGAAGTAAC CGACTATTGT TGACTACCCT GTGGAACACC T 41 配列番号：９ 配列の長さ：４３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の種類 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｕｎｓｕｒｅ 存在位置：１．．４３ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 TTGAATAGTC GGTTACTTGT TGACTCAGAG AAAAATCACT CAG 43 配列番号：１０ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の種類 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｕｎｓｕｒｅ 存在位置：１．．３７ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 TTGAATAGTC GGTTACTTGT TGACACTCGA CCTGAAA 37 配列番号：１１ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の種類 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｕｎｓｕｒｅ 存在位置：１．．３７ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 TTGAAGTAAC CGACTATTGT TGACACTGAG ATCCCCT 37 配列番号：１２ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の種類 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｕｎｓｕｒｅ 存在位置：１．．３７ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 TTGAATAGTC GGTTACTTGT TGACCCGCCA ACAAGAA 37 配列番号：１３ 配列の長さ：３７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の種類 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｕｎｓｕｒｅ 存在位置：１．．３７ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 TTGAAGTAAC CGACTATTGT TGACCGCTGA ACCGGAT 37 配列番号：１４ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の種類 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｕｎｓｕｒｅ 存在位置：１．．１５ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 CGTTATCCAC CATAC 15 配列番号：１５ 配列の長さ：１２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の種類 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｕｎｓｕｒｅ 存在位置：１．．１２ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 CCAAAACCCT GG 12 配列番号：１６ 配列の長さ：１１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の種類 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｕｎｓｕｒｅ 存在位置：１．．１１ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 CCAGGTTTTG G 11 配列番号：１７ 配列の長さ：１２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の種類 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｕｎｓｕｒｅ 存在位置：１．．１２ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GGTCTCTTTT TT 12 配列番号：１８ 配列の長さ：１１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の種類 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｕｎｓｕｒｅ 存在位置：１．．１１ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 CCAGGTTTTG G 11 配列番号：１９ 配列の長さ：１４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の種類 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｕｎｓｕｒｅ 存在位置：１．．１４ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GGTGAGGATC GTTT 14 配列番号：２０ 配列の長さ：１１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の種類 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｕｎｓｕｒｅ 存在位置：１．．１１ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GGATCGTTTT T 11 配列番号：２１ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の種類 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｕｎｓｕｒｅ 存在位置：１．．１９ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GGATGGCATG TCTTTTGGG 19
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、鎖置換型増幅法のための標的物生成法
の略図である。この図は、起源の標的配列を、図２に表
されている「定常状態」増幅法に移行させる最初の工程
を表す。標的ＤＮＡ試料を熱変成させる。過剰に存在す
る４つのプライマー（Ｂ1，Ｂ2，Ｓ1およびＳ2）は、増
幅される配列の外側の位置で標的鎖に結合する。プライ
マーＳ1およびＳ2はそれらの５’末端にＨｉｎｃＩＩ認
識配列を有する。ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ＴＴＰおよびｄ
ＡＴＰ（αＳ）を使用して、ｅｘｏ-クレノーにより４
つのプライマーから同時に伸長合成する。Ｂ1からの伸
長合成によりプライマーＳ1からの伸長合成産物（Ｓ1−
ｅｘｔ）が置換される。同様に、Ｂ2からの伸長合成に
よりＳ2伸長合成産物Ｓ2−ｅｘｔが置換される。Ｂ2お
よびＳ2は置換されたＳ1−ｅｘｔに結合する。Ｂ1およ
びＳ2は置換されたＳ2−ｅｘｔに結合する。鋳型Ｓ1−
ｅｘｔおよびＳ2−ｅｘｔ上の伸長合成および増幅によ
り、各末端の一方の鎖がホスホロチオエート化されてい
るＨｉｎｃＩＩ部位を有する２つの断片、および一方の
末端のみで一方の鎖がホスホロチオエート化されている
ＨｉｎｃＩＩ部位を有する２つのより長い断片が生成さ
れる。ＨｉｎｃＩＩのニッキングおよびｅｘｏ-クレノ
ーによる伸長合成／増幅反応は、これら４つの断片から
開始し、図２に表されている「定常状態」の連続反応に
すぐにたどり着く。センスＤＮＡおよびアンチセンスＤ
ＮＡは細線と太線により区別される。ＨｉｎｃＩＩ認識
配列は線上の伸び上がった部分により表される。
【図２】図２は、鎖置換型増幅（ＳＤＡ）反応の「定常
状態」の連続である。以下の反応工程は増幅の間連続的
に繰り返される。過剰に存在するのは２つのＳＤＡプラ
イマー（Ｓ1およびＳ2）である。Ｓ1の３’末端が標的
（Ｔ1）となる置換鎖の３’末端に結合して５’が飛び
出た二本鎖を形成する。同様に、Ｓ2は置換鎖Ｔ2に結合
する。Ｓ1およびＳ2の５’の飛び出しは制限酵素Ｈｉｎ
ｃＩＩの認識配列（５’ＧＴＴＧＡＣ３’）を含む。ｅ
ｘｏ-クレノーはｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ＴＴＰおよびｄ
ＡＴＰ（αＳ）を使用して該二本鎖の３’末端から伸長
合成し、Ｓ1Ｔ1およびＳ2Ｔ2上に一方の鎖がホスホロチ
オエート化された認識部位を生成する。ＨｉｎｃＩＩは
一方の鎖がホスホロチオエート化された認識部位の保護
されていないプライマー鎖にニックを入れ、修飾されて
いる相補鎖を完全なまま残す。ｅｘｏ-クレノーはＳ1Ｔ
1上のニックにおいて３’末端から伸長合成し、Ｔ2と機
能的に均等な下流の鎖を置換する。同様に、Ｓ2Ｔ2上の
ニックにおける伸長合成により、Ｔ1と機能的に均等な
下流の鎖が置換される。ニッキングおよび重合／置換工
程はＳ1Ｔ1およびＳ2Ｔ2上で連続的に繰り返されるが、
それはニックにおける伸長合成により、ニックを入れる
ことが可能なＨｉｎｃＩＩ認識部位を生じるからであ
る。標的の増幅は指数的であるが、それは標的Ｓ1とな
るＳ2Ｔ2から鎖が置換されると同時に標的Ｓ2となるＳ1
Ｔ1から鎖が置換されるからである。センスＤＮＡおよ
びアンチセンスＤＮＡは細線と太線により区別される。
ＨｉｎｃＩＩ認識配列の一部５’ＧＡＣおよびその相補
配列５’ＧＴＣは、それぞれ置換鎖の５’末端および
３’末端に存在し、小さな箱型で表される。
【図３】図３は、直鎖状増幅物を生成する、ひとつのＳ
ＤＡプライマーのみを使用する鎖置換型増幅法（ＳＤ
Ａ）の工程を示す。
【図４】図４は、ＳＤＡの前の標的物生成のための（本
発明の標的物生成法との比較）、２つのＳＤＡプライマ
ーを使用した鎖置換型増幅法（ＳＤＡ）および制限消化
工程を示す。２つのＳＤＡプライマーの使用は（ひとつ
のＳＤＡの使用に対して）指数的に増幅物を生成する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マイケル・シー・リトル アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27610，ローリー，ウィンウェイ・ドライ ブ 1729 (72)発明者 ジェームズ・ジー・ナデュー アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27713，ダーラム，ウッドクロフト・パー クウェイ 200−56シー (56)参考文献 特開 平２−303489（ＪＰ，Ａ) ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣ Ｉ．ＵＳＡ，87（1990）Ｐ．4971−4975

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ａ）二本鎖標的核酸配列の一方の鎖の上
    流に第１プライマーをハイブリダイズさせるが、その
    際、該第１プライマーは制限酵素認識配列を５’に、お
    よび標的核酸配列に相補的な配列を３’に含む増幅プラ
    イマーであり、 （ｂ）上記（ａ）の工程と同時に、上記第１プライマー
    がハイブリダイズする領域の上流において、上記標的核
    酸配列に第２プライマーをハイブリダイズさせるが、そ
    の際、第２プライマーは標的核酸配列に相補的な配列の
    みからなり、 （ｃ）制限酵素認識配列を含む第１プライマーの伸長合
    成産物が第２プライマーの伸長合成産物により標的核酸
    から置換されるように、第１および第２プライマーを伸
    長合成し、そして （ｄ）認識配列を必要とするが加熱工程を含まない恒温
    増幅反応により、置換された第１プライマー伸長合成産
    物を増幅する工程からなる、核酸配列を生成および増幅
    するための方法。
  2. 【請求項２】上記（ａ）〜（ｄ）の工程に続き、さら
    に、 （ｅ）二本鎖標的核酸配列の他方の鎖の上流に第３プラ
    イマーをハイブリダイズさせるが、その際、該第３プラ
    イマーは制限酵素認識配列を５’に、および標的核酸配
    列に相補的な配列を３’に含む増幅プライマーであり、 （ｆ）上記（ｅ）の工程と同時に、上記第３プライマー
    がハイブリダイズする領域の上流において、上流標的核
    酸配列に第４プライマーをハイブリダイズさせるが、そ
    の際、第４プライマーは上記標的核酸配列の他方の鎖に
    相補的な配列のみからなり、 （ｇ）制限酵素認識配列を含む第３プライマーの伸長合
    成産物が第４プライマーの伸長合成産物により標的核酸
    から置換されるように、第３および第４プライマーを伸
    長合成し、そして （ｈ）認識配列を必要とするが加熱工程を含まない恒温
    増幅反応により、置換された第３プライマー伸長合成産
    物を増幅する工程を含む、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】上記認識配列が、Ｑベータレプリカーゼ、
    制限酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、または複製配列の複製
    開始点を認識する酵素により認識される、請求項１記載
    の方法。
  4. 【請求項４】上記認識配列が制限酵素により認識され、
    かつ、一方の鎖のみの選択的分割をもたらす少なくとも
    ひとつのデオキシヌクレオシド３リン酸の存在下でプラ
    イマーからの伸長合成が生じる、請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】上記認識配列が、制限酵素ＨｉｎｃＩＩ，
    ＡｖａＩ，ＮｃｉＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，Ｆｎｕ４ＨＩ，
    ＢｓｔＸＩ，ＢｓｍＩ，ＢｓｒＩ，ＢｓａＩ，ＮｌａＩ
    Ｖ，ＮｓｐＩ，ＰｆｌＭＩ，ＨｐｈＩ，ＡｌｗＩ，Ｆｏ
    ｋＩ，ＡｃｃＩおよびＴｔｈｌｌｌＩからなる群より選
    択される制限酵素により認識される配列である、請求項
    ４記載の方法。
  6. 【請求項６】（ａ）二本鎖標的核酸配列の一方の鎖の
    ５’末端に一本鎖プライマー（Ｓ１）をハイブリダイズ
    させるが、その際、上記Ｓ１プライマーは、ＨｉｎｃＩ
    Ｉ認識配列を５’に、および上記標的配列に相補的な配
    列を３’に含み、 （ｂ）上記（ａ）の工程と同時に、上記二本鎖標的核酸
    配列の他方の鎖の５’末端に一本鎖プライマー（Ｓ２）
    をハイブリダイズさせるが、その際、上記Ｓ２プライマ
    ーは、ＨｉｎｃＩＩ認識配列を５’に、および上記標的
    配列に相補的な配列を３’に含み、 （ｃ）上記（ａ）の工程と同時に、上記Ｓ１プライマー
    がハイブリダイズする領域の上流において、上記標的核
    酸配列に置換用一本鎖プライマー（Ｂ１）をハイブリダ
    イズさせるが、その際、上記Ｂ１プライマーは標的核酸
    配列に相補的な配列のみからなり、 （ｄ）上記（ａ）の工程と同時に、上記Ｓ２プライマー
    がハイブリダイズする領域の上流において、上記標的核
    酸配列に置換用一本鎖プライマー（Ｂ２）をハイブリダ
    イズさせるが、その際、上記Ｂ２プライマーは標的核酸
    配列に相補的な配列のみからなり、 （ｅ）制限酵素認識配列を含むＳ１プライマーおよびＳ
    ２プライマーの伸長合成産物がそれぞれＢ１プライマー
    およびＢ２プライマーの伸長合成産物により標的核酸か
    ら置換されるように、ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰお
    よびｄＡＴＰ（αＳ）の存在下でＳ１、Ｓ２、Ｂ１およ
    びＢ２プライマーを伸長合成し、 （ｆ）Ｓ１プライマーおよびＢ１プライマーを、上記Ｓ
    ２プライマーの伸長合成産物にハイブリダイズさせ、 （ｇ）Ｓ２プライマーおよびＢ２プライマーを、上記Ｓ
    １プライマーの伸長合成産物にハイブリダイズさせ、 （ｈ）制限酵素認識配列を含むＳ１プライマーおよびＳ
    ２プライマーの伸長合成産物がそれぞれＢ１プライマー
    およびＢ２プライマーの伸長合成産物により標的核酸か
    ら置換されるように、ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰお
    よびｄＡＴＰ（αＳ）の存在下でＳ１、Ｓ２、Ｂ１およ
    びＢ２プライマーを伸長合成し、 （ｉ）合成された一本鎖の伸長合成産物を互いの相補鎖
    とハイブリダイズさせて二本鎖にし、そして （ｊ）ＨｉｎｃＩＩ認識配列において制限酵素Ｈｉｎｃ
    ＩＩがニックを入れることにより、第２伸長合成産物を
    増幅する工程からなる、核酸配列を生成および増幅する
    ための方法。
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