CN105378107A - 多重甲基化-特异性扩增系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于实施多重扩增反应的系统和方法。特别地，本发明涉及多重甲基化-特异性扩增系统和方法。DNA甲基化为可被遗传并随后去除而不改变DNA序列的一种DNA化学修饰。因此，其为表观遗传密码的一部分(Jaenisch&Bird.？(2003)Nature？Genetics,33,245，通过引用以其整体结合到本文中)。DNA甲基化涉及向DNA核碱基添加甲基。

Description

多重甲基化-特异性扩增系统和方法
本申请要求于2013年3月14日提交的临时专利申请序列号61/782,370的优先权，该临时专利申请通过引用以其整体结合到本文中。
发明领域
本发明涉及用于实施多重扩增反应的系统和方法。特别地，本发明涉及多重甲基化-特异性扩增系统和方法。
背景
DNA甲基化为可被遗传并随后去除而不改变DNA序列的一种DNA化学修饰。因此，其为表观遗传密码的一部分(Jaenisch & Bird. (2003) Nature Genetics, 33, 245，通过引用以其整体结合到本文中)。DNA甲基化涉及向DNA核碱基添加甲基。在最常见的例子中，将甲基添加到胞嘧啶嘧啶环的第5个碳。胞嘧啶甲基化通常具有减少基因表达的作用。
甲基化为所有病毒自我/非自我识别的常见能力。所检查的每种脊椎动物中均已发现胞嘧啶5位置的DNA甲基化。在成年体细胞组织中，DNA甲基化通常发生在CpG二核苷酸背景下；非-CpG甲基化在胚胎干细胞中普遍存在(Dodge等(2002) Gene 289 (1-2): 41–48., Haines等(2001) Developmental Biology 240 (2): 585–598., 通过引用以其整体结合到本文中)。在植物中，胞嘧啶对称(CpG或CpNpG)和不对称(CpNpNp)地甲基化。人的长期记忆存储可通过DNA甲基化调节(Miller & Sweatt. (2007-03-15) Neuron 53 (6): 857–869., Powell & Devin. (2008) New Scientist., 通过引用以其整体结合到本文中)。
在哺乳动物中，DNA甲基化是正常发育所必不可少的并且与包括印记、X-染色体失活、重复元件和致癌作用的抑制在内的许多关键过程有关。哺乳动物中所有CpG的60-90%为甲基化的(Tucker. (2001) Neuron. 30(3): 649-52., 通过引用以其整体结合到本文中)。CpG被分为称作“CpG岛”的簇，其存在于许多基因的5’调节区域。在许多疾病过程例如癌症中，基因启动子CpG岛获得异常的超甲基化，这导致可遗传的转录沉默。
用于改善甲基化检测测定的灵敏度和鲁棒性(robustness)的方法是需要的。
发明概述
本发明涉及用于实施多重扩增反应的系统和方法。特别地，本发明涉及多重甲基化-特异性扩增系统和方法。
例如，在一些实施方案中，本发明提供一种方法，包括：a) 用甲基化-特异性检测试剂处理靶核酸；b) 同时扩增靶核酸内的多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、2-30、2-20、3-20、3-15、4-20、5-20、6-20、8-20、10-20等)核酸片段以产生多个扩增子；和c) 检测所述多个扩增子。在一些实施方案中，所述靶包含CpG岛。在一些实施方案中，所述靶为基因的启动子区域。在一些实施方案中，所述甲基化特异性试剂为亚硫酸氢盐。在一些实施方案中，所述同时扩增在单个反应容器(例如，孔、管等)中进行。在一些实施方案中，所述核酸靶富含GC。在一些实施方案中，亚硫酸氢盐与未甲基化的胞嘧啶残基反应，将其转化为尿嘧啶残基，并且不与甲基化的胞嘧啶残基反应，使其保持为5-甲基胞嘧啶。在一些实施方案中，所述扩增为PCR。在一些实施方案中，所述检测包括使扩增子与多个核酸探针接触。在一些实施方案中，所述核酸探针包含可检测的标记。在一些实施方案中，所有探针包含相同的标记。在一些实施方案中，所述标记为荧光标记，尽管考虑其它标记。在一些实施方案中，所述扩增和检测包括实时PCR扩增和检测。在一些实施方案中，所述检测包括选自，例如，质谱分析、测序或杂交的核酸检测技术。
本发明进一步的实施方案提供一种方法，包括：a) 用甲基化-特异性检测试剂处理靶核酸；b) 同时扩增靶核酸内的至少5个核酸片段以产生多个扩增子；和c) 检测所述多个扩增子。
本发明额外的实施方案提供一种方法，包括：a) 用甲基化-特异性检测试剂处理靶核酸；b) 同时扩增靶核酸内的至少10个核酸片段以产生多个扩增子；和c) 检测所述多个扩增子。
在一些实施方案中，本发明提供扩增核酸的方法，包括：a) 同时扩增已经用甲基化-特异性检测试剂处理的靶核酸内的多个核酸片段以产生多个扩增子；和b) 检测所述扩增子。
在进一步的实施方案中，本发明提供一种方法，包括：a) 用甲基化-特异性检测试剂处理启动子核酸；b) 同时扩增靶核酸内的多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、2-30、2-20、3-20、3-15、4-20、5-20、6-20、8-20、10-20等)核酸片段以产生多个扩增子；和c) 检测所述多个扩增子。
在又其它的实施方案中，本发明提供一种方法，包括：a) 用亚硫酸氢盐试剂处理靶核酸；b) 同时扩增靶核酸内的多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、2-30、2-20、3-20、3-15、4-20、5-20、6-20、8-20、10-20等)核酸片段以产生多个扩增子；和c) 检测所述多个扩增子。
在更进一步的实施方案中，本发明提供一种方法，包括：a) 用甲基化-特异性检测试剂处理靶核酸；b) 同时PCR扩增靶核酸内的多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、2-30、2-20、3-20、3-15、4-20、5-20、6-20、8-20、10-20等)核酸片段以产生多个扩增子；和c) 检测所述多个扩增子。
在一些实施方案中，本发明提供一种方法，包括：a) 用甲基化-特异性检测试剂处理靶核酸；b) 同时扩增靶核酸内的多个(例如，2, 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、2-30、2-20、3-20、3-15、4-20、5-20、6-20、8-20、10-20等)核酸片段以产生多个扩增子；和c) 使用包含相同标记的多个核酸探针检测所述多个扩增子。
在一些实施方案中，本发明提供包含实施甲基化-特异性多重扩增反应中所必需的、足够的或有用的试剂(例如，引物、探针、亚硫酸氢盐、缓冲液等)的系统、组合物或试剂盒。
基于本文所包含的教导，额外的实施方案将对相关领域技术人员显而易见。
发明详述
本发明涉及用于实施多重扩增反应的系统和方法。特别地，本发明涉及多重甲基化-特异性扩增系统和方法。
定义
为了便于理解本技术，下文定义了多个术语和短语。额外的定义贯穿整个详述而说明。
如本文所使用的，“一个”或“一种”或“所述”可意指一个或一个以上。例如，“一个”物件可意指一个物件或多个物件。
如本文所使用的术语“标记”是指可用于提供可检测(优选可定量)效果并且可连接至核酸或蛋白质的任何原子或分子。标记包括但不限于染料、放射性标记例如32P、结合部分例如生物素、半抗原例如地高辛、发光、发磷光或发荧光的部分以及单独或与可抑制或改变荧光共振能量转移(FRET)发射谱的部分组合的荧光染料。标记可提供可通过荧光、放射性、比色法、重量分析法、X-射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。标记可为带电的部分(阳性或阴性电荷)或备选地，可为电荷中性，只要包含该标记的序列可被检测。
术语“引物”是指当放置在诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下时(例如，在核苷酸和诱导剂例如DNA聚合酶的存在下以及在合适的温度和pH下)能够充当合成起始点的寡核苷酸，无论是在纯化的限制酶消化产物中天然存在的还是合成产生的。为了在扩增中达到最大效率，所述引物优选为单链的，但可备选地为双链的。若为双链，首先处理引物以分开其两条链，然后用于制备延伸产物。优选地，所述引物为寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长以便在诱导剂存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于多个因素，包括温度、引物来源和方法的用途。
术语“靶”，当关于聚合酶链反应使用时，是指用于聚合酶链反应的引物所结合的核酸区域。因此，“靶”寻求从其它核酸序列中分选出。“片段”定义为靶序列内的核酸区域。
如本文所使用的，术语“受试者”和“患者”是指任何动物，例如狗、猫、鸟、牲畜，特别地哺乳动物，优选人。
如本文所使用的，术语“灵敏度”定义为通过真阳性数目除以真阳性和假阴性总和而计算的测定(例如，方法、检验)性能的统计度量。
如本文所使用的，术语“特异性”定义为通过真阴性数目除以真阴性和假阳性总和计算的测定(例如，方法、检验)性能的统计度量。
如本文所使用的，术语“扩增子”是指经由扩增反应产生的核酸。扩增子通常为双链DNA；然而，其可为RNA和/或DNA:RNA。扩增子包括与样品核酸互补的DNA。在一些实施方案中，引物对配置为从样品核酸产生扩增子。因此，任何给定扩增子的碱基组成可包括引物对、引物对的互补序列和经扩增产生扩增子的样品核酸区域。本领域技术人员理解，所设计引物对序列掺入扩增子中可替代引物结合位点的天然序列及其互补序列。在某些实施方案中，使用引物扩增靶区域后，得到的具有引物序列的扩增子被用于后续分析(例如碱基组成测定)。在一些实施方案中，扩增子进一步包含与后续分析相容的一段。
术语“使…扩增”或“扩增”在核酸的情况下是指多核苷酸或多核苷酸的一部分的多个拷贝的产生，典型地从少量的多核苷酸(例如，少至单个多核苷酸分子)开始，其中扩增产物或扩增子一般为可检测的。多核苷酸的扩增包括多个化学和酶促过程。在聚合酶链反应(PCR)或连接酶链反应(LCR)期间从靶或模板DNA分子的一个或少数拷贝产生多个DNA拷贝为扩增的形式。扩增并不限于起始分子的严格复制。例如，使用反转录(RT)-PCR从样品中有限量的RNA产生多个cDNA分子为扩增的一种形式。此外，在转录过程中从单个DNA分子产生多个RNA分子也是扩增的一种形式。
如本文所使用的，术语“样品”以其最广泛的含义使用。在某种意义上，其意味着包括获自任何来源的代表性部分或培养物，包括生物和环境来源。生物样品可从动物(包括人)获得并且包括液体、固体、组织和气体。生物样品包括血液制品，例如血浆、血清等。环境样品包括环境材料例如表面物质、土壤、泥、淤泥、生物膜、水和工业样品。然而这些例子不应解释为限制适用于本发明的样品类型。
本技术的实施方案
尽管本文的公开内容涉及某些说明性的实施方案，应理解的是这些实施方案以举例的方式而非以限制的方式呈现。
本公开内容的实施方案提供用于多重甲基化-特异性PCR的系统和方法。在一些实施方案中，对于特定甲基化靶(例如，启动子或其它核酸，如CpG岛)所述系统和方法利用多于一个的扩增子(例如，2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、15个或更多、20个或更多等)。在一些实施方案中，在单个反应中产生2到30、2到20、2到15、2到10、5到30、5到20、5到10或5到10个扩增子。在一些实施方案中，扩增子重叠或不重叠。
本公开内容的实施方案在图1中说明。本公开内容用亚硫酸氢盐PCR说明，尽管可利用其它甲基化-特异性检测或鉴定试剂或方法。黑色实线(顶部)代表DNA靶的序列。中间分段的黑线代表亚硫酸氢盐处理之后的序列，亚硫酸氢盐处理导致非甲基化C'转化为U'并且还导致断裂。每个短线代表关于靶序列的一个独特扩增子。底部的线代表靶向靶核酸不同区域的扩增子。
在一些实施方案中，用可检测的标记(例如，荧光标记探针或引物)检测各个扩增子。在一些实施方案中，用于检测各个独特扩增子的标记为相同的。例如，在一些实施方案中，使用具有荧光或其它标记的探针分析PCR过程(例如，实时PCR)。在图1中，示出了10个独特的扩增子，尽管本公开内容并不限于检测10个扩增子。
在一些实施方案中，所有的反应在单个管或反应容器或体积(例如，孔、通道等)中进行。在一些实施方案中，为给定启动子所选择的扩增子为连续的、重叠的或重叠与连续的组合。在一些实施方案中，所述测定为自动化的(例如，使用机器人技术)。
本公开内容不限于特定的甲基化检测或扩增方法。下文描述了示例性的甲基化-特异性检测方法、扩增方法和检测方法。本文所述系统和方法中可利用额外的方法。
I. 甲基化检测技术
在一些实施方案中，本公开内容提供用于检测甲基化DNA的系统和方法(例如，多重检测)。示例性的甲基化-特异性检测和扩增方法在以下描述。
A. 甲基化 - 特异性检测
在一些实施方案中，甲基化分析利用亚硫酸氢盐转化或甲基化敏感性限制酶(MSRE)。亚硫酸氢盐转化方法利用测序、引物-探针、引物-凝胶或引物-阵列分析。
用于分析DNA的5-甲基胞嘧啶的一个方法基于亚硫酸氢盐与胞嘧啶的特异反应，其在随后的碱水解时转化为在其碱基配对行为中与胸腺嘧啶对应的尿嘧啶。5-甲基胞嘧啶在这些条件下保持未被修饰。因此，原始DNA以这样的方式转化使得原本在其杂交行为中不能与胞嘧啶区分的甲基胞嘧啶现在可被检测，例如，通过扩增和杂交或测序。这些技术基于目前已充分利用的碱基配对。
检测5-甲基胞嘧啶的方法的综述可从下列概论文章中获悉：Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255.
亚硫酸氢盐技术涉及已知基因的短特异性片段，该片段在亚硫酸氢盐处理之后扩增并经完全测序(Olek, A.和Walter, J., Nat Genet. 1997, 17, 275-276)或通过引物延伸反应(Gonzalgo, M. L.,和Jones, P. A., Nucl. Acids Res. 1997, 25, 2529-2531, WO 9500669)或通过酶消化(Xiong, Z.和Laird, P. W., Nucl. Acids. Res. 1997, 25, 2532-2534)检测单个胞嘧啶的位置。此外，通过杂交检测也已经有描述(Olek等, WO 99 28498)。
论述使用亚硫酸氢盐技术用于在个体基因中进行甲基化检测的其它出版物为：Xiong, Z.和Laird, P. W. (1997), Nucl. Acids Res. 25, 2532; Gonzalgo, M. L.和Jones, P. A. (1997), Nucl. Acids Res. 25, 2529; Grigg, S.和Clark, S. (1994), Bioassays 16, 431; Zeschnik, M.等 (1997), Human Molecular Genetics 6, 387; Teil, R.等 (1994), Nucl. Acids Res. 22, 695; Martin, V.等 (1995), Gene 157, 261; WO 97 46705; WO 95 15373和WO 45560，通过引用以其整体结合到本文中。使用亚硫酸氢盐技术检测DNA样品中的胞嘧啶甲基化在7,524,629中描述，其通过引用以其整体结合到本文中。
额外的用于检测甲基化状态的方法在以下文献中描述，例如，Lombaerts, M.等 (2006) British Journal of Cancer. 94:661-671; Yoshiura, K.等 (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92:7416-7419; Lind, G. E.等 (2004) Molecular Cancer 3:28; Kumagai, T.等 (2007) Int. J. Cancer. 121:656-665; Hennig, G.等 (1996) J. Biol. Chem. 271(1):595-602; Marchevsky, A. M.等 (2004). Journal of Molecular Diagnostics 6:28-36; Reinhold, W. C.等 (2007). Mol. Cancer. Ther. 6:391-403; Hu, X-C.等 (2002) Life Sciences 71:1397-1404; 或Nakata, S.等 (2006) Cancer 106(10):2190-2199，其各自通过引用以其整体结合到本文中。市售试剂盒也可用于测定肿瘤细胞中的启动子甲基化状态(例如，Panomics, Redwood City, Calif的启动子甲基化PCR试剂盒)。
本领域已知多种甲基化测定程序并且根据本技术可与亚硫酸氢盐处理联合使用。这些测定允许测定核酸序列内一个或多个CpG二核苷酸(例如，CpG岛)的甲基化状态。在其它技术中，这样的测定涉及亚硫酸氢盐-处理的核酸的测序、PCR (用于序列-特异性扩增)、DNA印迹分析和甲基化-敏感性限制酶的使用。
“HeavyMethyl™”测定技术为用于基于亚硫酸氢盐-处理的DNA的甲基化-特异性扩增而评估甲基化差异的定量方法。覆盖扩增引物之间的CpG位置的甲基化-特异性阻断探针(阻断剂)或被扩增引物覆盖的甲基化-特异性阻断探针(阻断剂)，使得能够进行核酸样品的甲基化-特异性选择性扩增。
术语“HeavyMethyl™ MethyLight™”测定是指MethyLight™测定的变型的HeavyMethyl™ MethyLight™测定，其中将MethyLight™测定与覆盖扩增引物之间的CpG位置的甲基化特异性阻断探针组合。HeavyMethyl™测定还可与甲基化特异性扩增引物组合使用。
用于HeavyMethyl™分析的典型试剂(例如，如可存在于典型的基于MethyLight™的试剂盒中)可包括，但不限于：特定位点(例如，特异性基因、标志、DMR、基因区、标志区、亚硫酸氢盐处理的DNA序列、CpG岛或亚硫酸氢盐处理的DNA序列或CpG岛等)的PCR引物、阻断寡核苷酸、优化的PCR缓冲液和脱氧核苷酸以及Taq聚合酶。
术语“MSP”(甲基化-特异性PCR)是指Herman等 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9821–9826和美国专利号5,786,146所描述的本领域所公认的甲基化测定。
MSP (甲基化-特异性PCR)允许评估CpG岛内几乎任何CpG位点群的甲基化状态，而不依赖于甲基化-敏感性限制酶的使用(Herman等 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996; 美国专利号5,786,146)。简言之，DNA通过亚硫酸氢钠修饰，这将未甲基化的，而非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，产物随后用相比未甲基化DNA针对甲基化DNA特异的引物扩增。MSP仅需要少量DNA，对给定CpG岛位点的0.1%甲基化等位基因敏感，并且可在从石蜡包埋样品提取的DNA上进行。用于MSP分析的典型试剂(例如，如可存在于典型的基于MSP的试剂盒中的)可包括，但不限于：特异性位点(例如，特异性基因、标志、DMR、基因区、标志区、亚硫酸氢盐处理的DNA序列、CpG岛等)的甲基化和未甲基化PCR引物、优化的PCR缓冲液和脱氧核苷酸以及特异性探针。
MethyLight™测定为利用基于荧光的实时PCR (例如，TaqMan®)的高通量定量甲基化测定(Eads等, Cancer Res. 59:2302-2306, 1999)，所述实时PCR步骤后无需进一步处理。简言之，MethyLight™过程开始于基因组DNA的混合样品，所述样品根据标准程序在亚硫酸氢钠反应中转化为甲基化-依赖性序列差异的混合池(亚硫酸氢盐过程将未甲基化的胞嘧啶残基转化为尿嘧啶)。然后在“偏倚(biased)”反应中例如，用与已知CpG二核苷酸重叠的PCR引物进行基于荧光的PCR。序列区分在扩增过程水平和荧光检测过程水平二者进行。
MethyLight™测定被用作核酸，例如基因组DNA样品中甲基化模式的定量检验，其中序列区分在探针杂交水平进行。在一种定量形式中，PCR反应在存在与特定的推定甲基化位点重叠的荧光探针时提供甲基化特异性扩增。通过其中既无引物也无探针覆盖在任何CpG二核苷酸上的反应提供输入DNA量的无偏(unbiased)对照。或者，通过用不覆盖已知甲基化位点的对照寡核苷酸(例如，基于荧光形式的HeavyMethyl™和MSP技术)或用覆盖潜在甲基化位点的寡核苷酸探测偏倚的PCR池，实现基因组甲基化的定量试验。
MethyLight™方法与任何合适的探针(例如，“TaqMan®”探针、Lightcycler®探针，等)一起使用。例如，在一些应用中用亚硫酸氢钠处理双链基因组DNA并使其经受使用TaqMan®探针的两组PCR反应之一，例如，用MSP引物和/或HeavyMethyl阻断剂寡核苷酸以及TaqMan®探针。TaqMan®探针用荧光“报告”和“猝灭剂”分子双重标记并设计为对相对高GC含量的区域具有特异性以便其在PCR循环中在约比正向或反向引物高10℃的温度时熔解。这允许TaqMan®探针在PCR退火/延伸步骤保持完全杂交。由于Taq聚合酶在PCR期间酶促合成新链，其将最终到达退火的TaqMan®探针。然后Taq聚合酶的5’到3’外切核酸酶活性将通过消化TaqMan®探针将其置换以释放荧光报告分子用于使用实时荧光检测系统定量检测其此刻未猝灭的信号。
用于MethyLight™分析的典型试剂(例如，如可能存在于典型的基于MethyLight™的试剂盒中的)可包括，但不限于：特异性位点(例如，特异性基因、标志、DMR、基因区、标志区、亚硫酸氢盐处理的DNA序列、CpG岛等)的PCR引物、TaqMan®或Lightcycler®探针、优化的PCR缓冲液和脱氧核苷酸以及Taq聚合酶。
B. 扩增
在一些实施方案中，甲基化特异性检测之后或与其同时地，扩增核酸。核酸扩增技术的说明性非-限制实例包括，但不限于，聚合酶链反应(PCR)、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、转录-介导的扩增(TMA)、连接酶链反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域普通技术人员将认识到某些扩增技术(例如，PCR)需要在扩增前将RNA反转录为DNA (例如，RT-PCR)，而其它扩增技术直接扩增RNA (例如，TMA和NASBA)。
聚合酶链反应(美国专利号4,683,195、4,683,202、4,800,159和4,965,188，其各自通过引用以其整体结合到本文中)，通常称为PCR，使用多个变性、引物对与相反链的退火和引物延伸的循环，从而以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数。在称为RT-PCR的变型中，使用反转录酶(RT)从mRNA制备互补DNA (cDNA)，然后通过PCR扩增cDNA以产生DNA的多个拷贝。对于PCR的其它不同变换，参见，例如，美国专利号4,683,195、4,683,202和4,800,159; Mullis等, Meth. Enzymol. 155: 335 (1987); 和Murakawa等, DNA 7: 287 (1988), 其各自通过引用以其整体结合到本文中。
转录介导的扩增(美国专利号5,480,784和5,399,491，其各自通过引用以其整体结合到本文中)，通常称为TMA，在其中靶序列的多个RNA拷贝自动催化产生额外拷贝的基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自动催化合成靶核酸序列的多个拷贝。参见，例如，美国专利号5,399,491和5,824,518，其各自通过引用以其整体结合到本文中。在美国公布号20060046265 (通过引用以其整体结合到本文中)中所述的一个变型中，TMA任选包括使用阻断部分、终止部分和其它改善TMA方法灵敏度和准确度的修饰部分。
连接酶链反应(Weiss, R., Science 254: 1292 (1991), 通过引用以其整体结合到本文中)，通常称为LCR，使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸。所述DNA寡核苷酸在热变性、杂交和连接的重复循环中通过DNA连接酶共价连接而产生可检测的双链的连接寡核苷酸产物。
链置换扩增(Walker, G.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 392-396 (1992); 美国专利号5,270,184和5,455,166，其各自通过引用以其整体结合到本文中)，通常称为SDA，使用以下循环：引物对序列与靶序列的相反链退火、在dNTPαS存在下的引物延伸而产生双螺旋半硫代磷酸酯化引物延伸产物、内切核酸酶介导的半修饰限制性内切核酸酶识别位点的切口产生、以及聚合酶-介导的引物从切口3’末端延伸以置换现有链并产生用于下一轮引物退火、产生切口和链置换的链，该循环导致产物的几何扩增。嗜热SDA (tSDA)在基本上相同的方法中以较高的温度使用嗜热内切核酸酶和聚合酶(欧洲专利号0 684 315)。
其它扩增方法包括，例如：基于核酸序列的扩增(美国专利号5,130,238，通过引用以其整体结合到本文中)，通常称为NASBA；使用RNA复制酶扩增探针分子本身的方法(Lizardi等, BioTechnol. 6: 1197 (1988), 通过引用以其整体结合到本文中)，通常称为Qβ复制酶；基于转录的扩增方法(Kwoh等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173 (1989))；和自动维持序列复制(Guatelli等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874 (1990), 其各自通过引用以其整体结合到本文中)。对于已知扩增方法的进一步讨论参见Diagnostic Medical Microbiology: Principles and Applications (Persing等, Eds.), pp. 51-87 (美国微生物学会, Washington, DC (1993))中的Persing, David H., “In Vitro Nucleic Acid Amplification Techniques (体外核酸扩增技术)”。
在一些实施方案中，扩增为等温扩增方法。在一些实施方案中，扩增方法为固相扩增、聚合酶集落技术(polony)扩增、集落扩增、乳液PCR、珠-RCA、表面RCA、表面SDA等，如本领域技术人员将认识到的。在一些实施方案中，使用这样的扩增方法，其使得溶液中游离DNA分子扩增或仅通过DNA分子的一端束缚在合适基质上的DNA分子扩增。在一些实施方案中，使用依赖桥式PCR的方法，其中将两个PCR引物连接到一个表面上(参见，例如，WO 2000/018957、U.S. 7,972,820、7,790,418和Adessi等, Nucleic Acids Research (2000): 28(20): E87; 其各自通过引用结合到本文中)。在一些情况下本发明方法可创建“聚合酶集落技术”，或“polony”，这指的是保持相同扩增子空间成簇的多重扩增(参见Harvard Molecular Technology Group and Lipper Center for Computational Genetics website (哈佛大学分子科技集团和Lipper计算遗传学中心网站))。这些包括，例如，原位聚合酶集落技术(Mitra和Church, Nucleic Acid Research 27, e34, Dec. 15, 1999)、原位滚环扩增(RCA) (Lizardi等, Nature Genetics 19, 225, 1998年7月)、桥式PCR (美国专利号5,641,658)、picotiter PCR (Leamon等, Electrophoresis 24, 3769, 2003年11月)和乳液PCR (Dressman等, PNAS 100, 8817, Jul. 22, 2003)。
适合用于本发明实施方案的核酸聚合酶的实例包括，但不限于，DNA聚合酶(Klenow片段、T4 DNA聚合酶)、在多种热稳定细菌中鉴定和克隆的热稳定DNA聚合酶(Perler F. B.等, Adv. Protein Chem. 1996, 48:377-435)(例如Taq、VENT、Pfu、Tfl DNA聚合酶)及其遗传上修饰的衍生物(TaqGold、VENTexo、Pfu exo)。优选用于集落引物延伸的核酸聚合酶在引物与模板杂交产生足够特异性以避免模板的不完全或虚假扩增的温度下稳定。
扩增溶液优选包含天然或非-天然存在的，例如用荧光或放射性基团修饰的脱氧核糖核苷酸三磷酸，例如dATP、dTTP、dCTP、dGTP作为核苷酸前体。为了增加核酸的可检测性和/或功能多样性已经为化学和生物方法开发了各种各样的合成修饰的核酸。这些功能化的/修饰的分子可与天然聚合酶完全相容、保持天然对应物的碱基配对和复制性质，如最近所综述的(Thum O等, Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40 (21): 3990-3993)。
扩增溶液的其它组分因核酸聚合酶的选择而添加，其基本上对应于本领域已知有效支持各种聚合酶活性的化合物。现有技术众所周知，诸如二甲基亚砜(DMSO)、牛血清白蛋白(BSA)、Triton X-100或MgCl2等化合物的浓度对于得到最佳扩增至关重要，因此对于本发明方法，操作者可在后文所呈现实施例的基础上容易地调整此浓度。
在一些实施方案中，扩增反应扩增靶的多个片段。在一些实施方案中，所述片段不重叠。在一些实施方案中，片段重叠一个或多个核苷酸。在一些实施方案中，扩增子为交错的。在一些实施方案中，扩增子为连续的。
在一些实施方案中，扩增反应产生2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45或50或更多个扩增子。在一些实施方案中，在单个反应中产生2到30、2到20、2到15、2到10、5到30、5到20、5到10或5到10个扩增子。
在一些实施方案中，核酸靶为基因、基因的启动子区域或其它核酸。在一些实施方案中，靶包含CpG岛。
C. 检测
在一些实施方案中，通过标记探针与核酸的结合检测所扩增的核酸。在一些实施方案中，检测为实时检测(例如，与扩增同时)。扩增过程的“实时”评估涉及在扩增反应期间连续或周期性地测定反应混合物中扩增子的量，和使用所测定的值计算样品中初始存在的靶序列的量。本领域已熟知多种用于基于实时扩增而测定样品中存在的初始靶序列的量的方法。这些包括美国专利号6,303,305和6,541,205中所公开的方法，其各自通过引用以其整体结合到本文中。另一个用于测定样品中初始存在的靶序列的量但并非基于实时扩增的方法在美国专利号5,710,029中公开，该专利通过引用以其整体结合到本文中。
扩增产物可通过使用多个自我-杂交的探针实时检测，所述探针的多数具有茎-环结构。这样的自我-杂交探针经标记，使其根据探针是自我-杂交状态还是通过与靶序列杂交改变的状态而发射不同的可检测信号。作为非限制性实例，“分子火炬(molecular torch)”为一种包括通过连接区(例如，非核苷酸接头)连接并在预定的杂交测定条件下互相杂交的自我-互补的不同区域(称为“靶结合结构域”和“靶关闭结构域”)的自我-杂交探针。在一个优选的实施方案中，分子火炬在靶结合结构域中包含1-约20个碱基长并且可容易在链置换条件下与扩增反应中存在的靶序列杂交的单链碱基区域。在链置换条件下，分子火炬的两个互补区域(可为完全或部分互补的)的杂交为有利的，除非存在靶序列，其将与靶结合结构域中存在的单链区域结合并置换所有或部分靶关闭结构域。分子火炬的靶结合结构域和靶关闭结构域包含放置的可检测标记或一对相互作用的标记(例如，发光剂/猝灭剂)以便该分子火炬自我-杂交时产生与该分子火炬与靶序列杂交时不同的信号，从而允许在未杂交的分子火炬存在下检测所检验样品中的探针:靶双链体。分子火炬和多种类型的相互作用标记对在美国专利号6,534,274中公开，该专利通过引用以其整体结合到本文中。
具有自我-互补性的检测探针的另一个实例为“分子信标(molecular beacon)”。分子信标包含具有以下的核酸分子：靶互补序列、使探针在无扩增反应中所存在的靶序列时保持为闭合构象的亲和对(或核酸臂)和当探针为闭合构象时相互作用的标记对。靶序列与靶互补序列的杂交将亲和对的成员分离，从而使探针转变为开放构象。由于标记对的相互作用减少，向开放构象的转变是可检测的，标记对可为，例如，荧光团和猝灭剂(例如，DABCYL和EDANS)。分子信标在美国专利号5,925,517和6,150,097中公开，这些专利通过引用以其整体结合到本文中。
其它自我-杂交的探针为本领域普通技术人员所熟知。作为非限制性实例，具有相互作用标记的探针结合对，例如美国专利号5,928,862 (通过引用以其整体结合到本文中)中公开的那些，可适用于本发明中。本发明中还可利用用于检测单核苷酸多态性(SNPs)的探针系统。额外的检测系统包括“分子开关”，如美国公布号20050042638中所公开的，其通过引用以其整体结合到本文中。其它探针，例如包含嵌入染料和/或荧光染料的那些，也可用于本发明扩增产物的检测。参见，例如，美国专利号5,814,447 (通过引用以其整体结合到本文中)。
在一些实施方案中，利用毛细管电泳(CE)分析核酸片段。毛细管电泳期间，将核酸(例如，PCR反应的产物)电动注入用聚合物填充的毛细管中。应用高电压以便荧光DNA片段通过大小分离并且通过激光/照相机系统检测。在一些实施方案中，利用来自Life Technogies (Grand Island, NY)的CE系统调整片段大小(fragment sizing)(参见例如，US 6706162、US8043493，其各自通过引用以其整体结合到本文中)。
在一些实施方案中，将检测方法中利用的探针和/或引物标记。在一些实施方案中，将探针/引物生物素化并且标签结合试剂为链霉亲和素试剂，例如链霉亲和素珠。通过使链与链霉亲和素珠接触而分离包含生物素化引物的复制核酸链(例如，生物素化引物延伸得到的引物延伸产物)。可利用标记引物与标签结合试剂的任何组合。其它合适的实例包括半抗原化的引物和珠或其它包含抗体或其它与半抗原结合的抗原结合蛋白的试剂。合适的半抗原包括，但不限于，吡唑(特别地硝基吡唑)、硝基苯基化合物、苯并呋咱、三萜、脲和硫脲(特别地苯基脲，甚至更特别地苯基硫脲)、鱼藤酮和鱼藤酮衍生物(本文也称为拟鱼藤酮)、噁唑和噻唑(特别是噁唑和噻唑磺酰胺)、香豆素和香豆素衍生物、环木脂体(通过鬼臼毒素和鬼臼毒素衍生物例示)及其组合。半抗原的具体实例包括，但不限于，2,4-二硝基苯酚(DNP)、生物素、荧光素衍生物(FITC、TAMRA、德克萨斯红等)、地高辛(Digoxygenin, DIG)、5-硝基-3-吡唑脲(硝基吡唑，NP)、4,5,-二甲氧-2-硝基肉桂酰胺(硝基肉桂酰胺，NCA)、2-(3,4-二甲氧基苯基)-喹啉-4-脲(苯基喹诺酮，DPQ)、2,1,3-苯并噁二唑-5-脲(苯并呋咱，BF)、3-羟基-2-喹喔啉脲(羟基喹喔啉，HQ)、4-(二甲氨基)偶氮苯-4’-磺酰胺(DABSYL)、鱼藤酮异噁唑啉(Rot)、(E)-2-(2-(2-氧代-2,3-二氢-1H-苯并[b][1,4]二氮杂 -4-基)苯氧基)乙酰胺(苯并二氮杂，BD)、7-(二乙氨基)-2-氧代-2H-色烯-3-羧酸(香豆素343，CDO)、2-乙酰氨基-4-甲基-5-噻唑磺酰胺(噻唑磺酰胺，TS)和对甲氧基苯基吡唑基鬼臼酰胺(p-Mehtoxyphenylpyrazopodophyllamide) (Podo)。
在一些实施方案中，核酸通过使用质谱分析(例如，Abbott PLEX-ID系统, Abbot Ibis Biosciences, Abbott Park, Illinois)鉴定独特的碱基组成标记(base composition signature，BCS)而检测和表征，如美国专利7,108,974、8,017,743和8,017,322中所描述的，其各自通过引用以其整体结合到本文中。
在一些实施方案中，利用核酸测序方法来检测。在一些实施方案中，本文所提供的技术可用于第二代(又称下一代或Next-Gen)、第三代(又称下下代)或第四代(又称N3-Gen)测序技术，包括但不限于，焦磷酸测序、连接法测序(sequencing-by-ligation)、单分子测序、合成法测序(sequence-by-synthesis) (SBS)、大规模并行克隆、大规模并行单分子SBS、大规模并行单分子实时、大规模并行单分子实时纳米孔技术等。Morozova和Marra在Genomics, 92: 255 (2008)中提供了一些此种技术的综述，通过引用以其整体结合到本文中。本领域普通技术人员将认识到由于RNA在细胞中不太稳定并且实验中更易被核酸酶攻击，因此测序前通常将RNA反转录为DNA。
本领域已知多种DNA测序技术，包括基于荧光的测序方法(参见，例如，Birren等, Genome Analysis: Analyzing DNA (基因组分析：分析DNA), 1, Cold Spring Harbor, N.Y.; 通过引用以其整体结合到本文中)。在一些实施方案中，所述技术可用于该领域所理解的自动化测序技术。在一些实施方案中，本技术可用于分段扩增子的并行测序(Kevin McKernan等的PCT公布号WO2006084132，通过引用以其整体结合到本文中)。在一些实施方案中，所述技术可用于通过并行寡核苷酸延伸的DNA测序(参见，例如，Macevicz等的美国专利号5,750,341和Macevicz等的美国专利号6,306,597，二者通过引用以其整体结合到本文中)。可使用所述技术的测序技术的额外实例包括Church polony技术(Mitra等, 2003, Analytical Biochemistry 320, 55-65; Shendure等, 2005 Science 309, 1728-1732; 美国专利号6,432,360, 美国专利号6,485,944, 美国专利号6,511,803; 通过引用以其整体结合到本文中)、454 picotiter焦磷酸测序技术(Margulies等, 2005 Nature 437, 376-380; US 20050130173; 通过引用以其整体结合到本文中)、Solexa单碱基添加技术(Bennett等, 2005, Pharmacogenomics, 6, 373-382; 美国专利号6,787,308; 美国专利号6,833,246; 通过引用以其整体结合到本文中)、Lynx大规模并行标记测序技术(Brenner等 (2000). Nat. Biotechnol. 18:630-634; 美国专利号5,695,934; 美国专利号5,714,330; 通过引用以其整体结合到本文中)和Adessi PCR集落技术(Adessi等 (2000). Nucleic Acid Res. 28, E87; WO 00018957; 通过引用以其整体结合到本文中)。
下一代测序(NGS)方法具有大规模并行、高通量策略这一共同特征，目标是比先前测序方法的成本更低(参见，例如，Voelkerding等, Clinical Chem., 55: 641-658, 2009; MacLean等, Nature Rev. Microbiol., 7: 287-296; 各自通过引用以其整体结合到本文中)。NGS方法可大致分为通常使用模板扩增的那些和不使用模板扩增的那些。需要扩增的方法包括作为454技术平台(例如，GS20和GS FLX)由Roche商业化的焦磷酸测序、由Illumina商业化的Solexa平台和由Applied Biosystems商业化的Supported Oligonucleotide Ligation and Detection (SOLiD)平台。非扩增方法，也称为单分子测序，例如Helicos BioSciences商业化的HeliScope平台以及分别由VisiGen、Oxford Nanopore Technologies Ltd., Life Technologies/Ion Torrent和Pacific Biosciences商业化的新兴平台。
在焦磷酸测序中(Voelkerding等, Clinical Chem., 55: 641-658, 2009; MacLean等, Nature Rev. Microbiol., 7: 287-296; 美国专利号6,210,891; 美国专利号6,258,568; 各自通过引用以其整体结合到本文中)，将模板DNA片段化、末端-修复、与接头连接并通过用含有与接头互补的寡核苷酸的珠子捕获单个模板分子的原位克隆扩增。将含有单个模板类型的各珠划分为油包水微泡，并使用称作乳液PCR的技术克隆扩增模板。扩增后使乳液破裂并将珠子沉积到测序反应期间充当流动池的picotitre板的单个孔中。在测序酶和发光报告物例如荧光素酶存在下，在流动池中，将4种dNTP试剂的每种进行有序反复引入。如果适当的dNTP被加至测序引物的3’末端，结果产生的ATP导致孔内发光的爆发，这使用CCD照相机记录。达到大于或等于400个碱基的阅读长度是可能的，并且可达到106个序列阅读，结果是多达5亿个碱基对(Mb)的序列。
在Solexa/Illumina平台中(Voelkerding等, Clinical Chem., 55: 641-658, 2009; MacLean等, Nature Rev. Microbiol., 7: 287-296; 美国专利号6,833,246; 美国专利号7,115,400; 美国专利号6,969,488; 各自通过引用以其整体结合到本文中)，测序数据以较短长度阅读的形式产生。在该方法中，末端修复单链片段化的DNA以产生5’-磷酸化钝末端，接着为Klenow-介导的单个A碱基至片段3’末端的添加。A-添加促进T-突出接头寡核苷酸的添加，其随后用于捕获布满寡核苷酸锚的流动池表面的模板-接头分子。所述锚用作PCR引物，但由于模板的长度以及其与其它附近锚寡核苷酸的接近度，PCR延伸导致该分子“拱悬(arching over)”与邻近锚寡核苷酸杂交以在流动池表面上形成桥状结构。将这些DNA环变性和切割。然后用可逆染料终止剂对正向链测序。所掺入核苷酸的序列通过检测掺入后荧光而测定，去除各荧光剂(fluor)和阻断(block)，然后进行下一个dNTP添加循环。序列阅读长度范围为36个核苷酸到超过50个核苷酸，每个分析运行的总体输出超过十亿个核苷酸对。
使用SOLiD技术对核酸分子测序(Voelkerding等, Clinical Chem., 55: 641-658, 2009; MacLean等, Nature Rev. Microbiol., 7: 287-296; 美国专利号5,912,148; 美国专利号6,130,073; 各自通过引用以其整体结合到本文中)也涉及模板的片段化、与寡核苷酸接头连接、连接至珠和通过乳液PCR克隆扩增。这之后，将含有模板的珠子固定化在玻璃流动池的衍生表面，并使与接头寡核苷酸互补的引物退火。然而，不是利用该引物进行3’延伸，而是用于提供5’磷酸基团与包含两个探针-特异性碱基接着6个简并碱基和4种荧光标记之一的检查探针(interrogation probe)连接。在SOLiD系统中，检查探针在每个探针的3’末端具有16种可能的两个碱基组合并且在5’末端具有4种荧光剂之一。荧光剂颜色，以及因此各个探针的身份，对应于指定的颜色-空间编码方案。多轮(通常7)探针退火、连接和荧光剂检测之后是变性，然后使用相对于最初的引物具有1个碱基偏移的引物第二轮测序。以这种方式，可以计算方式重构模板序列，并且模板碱基被检查两次，使得准确度增加。序列阅读长度平均35个核苷酸，并且每次测序运行的总体输出超过40亿碱基。
在某些实施方案中，所述技术可用于纳米孔测序(参见，例如，Astier等, J. Am. Chem. Soc. 2006 Feb 8; 128(5):1705–10, 通过引用结合到本文中)。纳米孔测序的理论与当将纳米孔浸在电导液中并在跨过纳米孔而施加电势(电压)时所发生的有关。在这些条件下，可观察到由于通过纳米孔的离子传导所致的轻微电流，并且电流的量对纳米孔的大小极度敏感。随着核酸的各个碱基穿过纳米孔，这导致通过纳米孔的电流强度变化，该变化对于四个碱基中的每个是不同的，从而允许确定DNA分子的序列。
在某些实施方案中，所述技术可用于Helicos BioSciences的HeliScope (Voelkerding等, Clinical Chem., 55: 641-658, 2009; MacLean等, Nature Rev. Microbiol., 7: 287-296; 美国专利号7,169,560; 美国专利号7,282,337; 美国专利号7,482,120; 美国专利号7,501,245; 美国专利号6,818,395; 美国专利号6,911,345; 美国专利号7,501,245; 各自通过引用以其整体结合到本文中)。将模板DNA片段化并在3’末端多聚腺苷化，最后的腺苷含有荧光标记。将变性的多聚腺苷化模板片段连接至流动池表面上的多聚(dT)寡核苷酸。用CCD照相机记录所捕获模板分子的最初物理位置，然后切割标记并洗去。测序通过添加聚合酶和系列添加荧光标记的dNTP试剂完成。掺入事件导致与dNTP对应的荧光剂信号，并且在每轮dNTP添加前用CCD照相机捕获信号。序列阅读长度范围为25-50个核苷酸，每次分析运行的总体输出超过10亿核苷酸对。
离子激流技术(Ion Torrent technology)为基于对DNA聚合期间所释放氢离子的检测的DNA测序方法(参见，例如，Science 327(5970): 1190 (2010); 美国专利申请公布号20090026082、20090127589、20100301398、20100197507、20100188073和20100137143，通过引用以其整体结合用于所有目的)。微孔包含待测序的模板DNA链。微孔层之下为高灵敏度的ISFET离子传感器。所有层均被包含在CMOS半导体芯片内，与电子工业中所使用的类似。当将dNTP掺入到生长的互补链中时释放氢离子，这触发高灵敏度的离子传感器。若模板序列中存在均聚物重复，单个循环中将掺入多个dNTP分子。这导致相应数目的氢释放以及按比例增高的电子信号。该技术与其它测序技术的不同之处在于不使用修饰的核苷酸或光学。对于50个碱基阅读，离子激流测序仪的每个碱基的准确度为~99.6%，每次运行产生~100 Mb。阅读长度为100个碱基对。长度为5个重复的均聚物重复的准确度为~98%。离子激流测序的益处为快的测序速度以及低前期和运行成本。
所述技术可用于Stratos Genomics Inc.所开发的另一种核酸测序方法，并且涉及Xpandomers的使用。该测序方法通常包括提供由模板-定向合成所产生的子链。所述子链一般在与所有或部分靶核酸的连续核苷酸序列所对应的序列中包含多个偶联的亚基，其中单个亚基含有系链(tether)、至少一个探针或核碱基残基以及至少一个可选择性切割的键。可选择性切割的键被切割，产生长度长于子链的多个亚基的Xpandomer。Xpandomer通常在与全部或部分靶核酸的连续核苷酸序列所对应的序列中含有系链和用于解析遗传信息的报告元件。然后检测Xpandomer的报告元件。关于基于Xpandomer的方法的更多细节在，例如，2008年6月19日提交的标题为“High Throughput Nucleic Acid Sequencing by Expansion (通过扩展的高通量核酸测序)”的美国专利公布号20090035777中描述，该专利以其整体结合到本文中。
其它新兴的单分子测序方法包括使用VisiGen平台的实时合成法测序(Voelkerding等, Clinical Chem., 55: 641–58, 2009; 美国专利号7,329,492; 美国专利申请序列号11/671956; 美国专利申请序列号11/781166; 各自通过引用以其整体结合到本文中)，其中使用荧光修饰的聚合酶和荧光受体分子使固定的引物DNA模板经受链延伸，在核苷酸添加时导致可检测的荧光共振能量转移(FRET)。
在一些实施方案中，检测方法利用杂交测定。核酸杂交技术的说明性非-限制实例包括，但不限于，微阵列，其包括但不限于：DNA微阵列(例如，cDNA微阵列和寡核苷酸微阵列)。DNA微阵列，通常称为基因芯片、DNA芯片或生物芯片，为附着在固体表面(例如，玻璃、塑料或硅片)，为表达谱分析或同时监测数千个基因表达水平的目的而形成阵列的显微DNA斑点的集合。附着的DNA片段称为探针，在单个DNA微阵列中可使用数千个探针。微阵列可用于通过比较疾病与正常细胞中的基因表达而鉴定疾病基因或转录物。微阵列可使用多种技术制造，包括但不限于：使用细尖针(fine-pointed pins)打印在载玻片上、使用预制的掩膜光刻、使用动态微镜装置光刻、喷墨打印或微电极阵列上的电化学。
DNA和RNA印迹分别被用于检测特定DNA或RNA序列。将从样品中提取的DNA或RNA片段化，在基质凝胶上电泳分离并转移到膜滤器上。使结合滤器的DNA或RNA标记探针杂交，所述标记探针与目的序列互补。检测结合到滤器上的杂交探针。该程序的一种变型为反向RNA印迹，其中附着在膜上的底物核酸为所分离DNA片段的集合并且探针为从组织提取并标记的RNA。
一个说明性的检测方法，杂交保护测定(HPA)涉及使化学发光寡核苷酸探针(例如，吖啶酯标记(AE)探针)与靶序列杂交、有选择地水解未杂交探针上存在的化学发光标记和在光度计中测量剩余的探针所产生的化学发光。参见，例如，美国专利号5,283,174和Norman C. Nelson等, Nonisotopic Probing, Blotting, and Sequencing, ch. 17 (非同位素探查、印迹和测序，第17章) (Larry J. Kricka ed., 2d ed. 1995, 其各自通过引用以其整体结合到本文中)。
D. 分析
在一个实施方案中，使用基于计算机的分析程序为最终用户(例如，医务人员)将检测测定所产生的原始数据(例如核酸的甲基化水平)转化为预测值数据。用户可使用任何合适的方法存取该预测数据。因此，在一些优选的实施方案中，本发明给不太可能经受遗传学或分子生物学训练的用户提供不需理解原始数据的另一益处。数据以其最有用的形式直接呈现给最终用户。然后用户能够立即利用该信息以确定(例如，在医学诊断、研究或筛查中的)有用信息。
本发明考虑了能够向进行测定的实验室、信息提供者、医务人员和受试者以及从进行测定的实验室、信息提供者、医务人员和受试者接受、处理和传送信息的任何方法。例如，在本发明一些实施方案中，从受试者获得样品(例如，血液、细胞或组织样品)并将其呈交给位于世界任何部分(例如，在与受试者居住或信息最终使用的国家不同的国家)的概况分析(profiling)服务(例如，医疗设施的实验室、基因组概况分析业务，等)以产生原始数据。样品包含组织或其它生物样品时，受试者可访问医疗中心以获取样品并送至概况分析中心，或受试者可自己收集样品(例如，颊拭子)并直接送至概况分析中心。样品包含先前测定的生物信息时，该信息可由受试者直接送至概况分析服务(例如，可用计算机扫描包含该信息的信息卡并使用电子通信系统将数据传送至概况分析中心的计算机)。一旦被概况分析服务接收，该样品即被处理并产生受试者所期需的特定于该信息的概况(例如，甲基化数据)。
然后将数据制作为适于最终用户(例如，医务人员)解读的格式。例如，制作的格式可为对受试者的结论或评估(例如，发展癌症的风险或癌症存在的可能性)，而不是提供原始数据。数据可通过任何合适的方法显示给用户。例如，在一些实施方案中，概况分析服务产生用户可打印的或显示在计算机监视器上的报告。
在一些实施方案中，所述信息首先在当地医疗设施或区域设施分析。然后将原始数据送至中央处理设施进一步分析和/或将原始数据转化为对用户有用的信息。中央处理设施提供隐私(所有数据以统一的安全协议存储在中央设施中)、速度和数据分析的一致性等优势。然后中央处理设施可在受试者治疗后控制数据的结局。例如，使用电子通信系统，中央设施可向最终用户、受试者或研究人员提供数据。
E. 系统和试剂盒
在一些实施方案中，本发明提供用于扩增和/或分析核酸的试剂盒和系统。在一些实施方案中，试剂盒包含分析和检测甲基化核酸所必需、足够或有用的试剂(例如，引物、探针、固体载体、试剂、对照、说明书等)。例如，在一些实施方案中，试剂盒包含用于扩增靶的多个扩增子的引物对。在一些实施方案中，试剂盒包含多个标记探针(例如，包含相同或不同标记)。在一些实施方案中，试剂盒包含用于甲基化-特异性检测的试剂(例如，亚硫酸氢盐试剂)。在一些实施方案中，系统包括自动化样品和试剂处理装置(例如，机器人)。
II. 用途
本文所述系统和方法可用于多种研究、筛查和诊断应用中。在一些实施方案中，利用上述多重甲基化特异性扩增方法预测受试者对疾病的易感性、诊断受试者中的疾病、预测受试者中疾病复发的可能性、提供患有疾病的受试者的预后或选择患有疾病的受试者以用特定疗法治疗。这些方法优选包括提供来自受试者的基因组DNA样品；和通过上述方法检测基因组DNA样品预定区域的甲基化状态。在一些实施方案中，基因组DNA预定区域与参考甲基化状态相比改变的5-羟甲基胞嘧啶和/或5-甲基胞嘧啶的甲基化水平(例如，更高或更低的水平)提供选自以下的指示：受试者对疾病易感性的指示、受试者患有疾病的指示、受试者中疾病复发可能性的指示、受试者存活的指示以及受试者为用特定疗法治疗的候选者的指示。
在一些实施方案中，本文所述系统和方法靶向甲基化的基因启动子。基因启动子在癌症患者中为经常甲基化的并且已经显示此甲基化与相关基因的转录抑制有关。基因启动子的大小可从约500个碱基到大于1000个碱基变化。在一些利用PCR测定的实施方案中，扩增子大小通常为100个碱基对或更小。因此，在一些实施方案中，几个扩增子靶向特定基因启动子或其它靶核酸。在一些实施方案中，在单个PCR反应孔或管中产生多个扩增子。在一些实施方案中，各个独特的探针使用相同类型的信号传导分子(例如，荧光团)。这导致相对于使用与单个扩增子相关的单个探针的扩增反应，信号增加，因此导致相对于利用单个扩增子的方法，测定灵敏度增加。在一些实施方案中，非互补DNA的两条独特链均通过天然双链DNA的亚硫酸氢盐转化产生。
本文所述系统和方法可用于任何数目的甲基化检测测定中。在一些实施方案中，所述多重方法用于启动子甲基化测定中以检测疾病(例如，癌症)。
上述说明书中提及的所有出版物和专利通过引用以其整体结合到本文中用于所有目的。所述组合物、方法和技术的用途的多种修饰和变更将对本领域技术人员显而易见而不脱离所述技术的范围和精神。尽管所述技术已经结合具体的示例性实施方案进行描述，但应理解的是所要求保护的本发明不应被过度限制在这样的具体实施方案中。实际上，对相关领域技术人员显而易见的所述实施本发明的模式的多种修饰旨在所附权利要求书的范围内。

Claims (24)

1. 一种方法，包括：
a) 用甲基化-特异性检测试剂处理靶核酸；
b) 同时扩增所述靶核酸内的多个核酸片段以产生多个扩增子；和
c) 检测所述多个扩增子。
2. 权利要求1的方法，其中所述靶为基因的启动子区域。
3. 权利要求1的方法，其中所述甲基化特异性试剂为亚硫酸氢盐。
4. 权利要求1的方法，其中所述同时扩增在单个反应容器中进行。
5. 权利要求1的方法，其中所述核酸靶富含GC。
6. 权利要求5的方法，其中所述核酸靶包含CpG岛。
7. 权利要求3的方法，其中亚硫酸氢盐与未甲基化的胞嘧啶残基反应，将其转化为尿嘧啶残基。
8. 权利要求3的方法，其中亚硫酸氢盐不与甲基化的胞嘧啶残基反应，使其保持为5-甲基胞嘧啶。
9. 权利要求1的方法，其中所述扩增为PCR。
10. 权利要求1的方法，其中所述检测包括使所述扩增子与多个核酸探针接触。
11. 权利要求10的方法，其中所述核酸探针包含可检测的标记。
12. 权利要求11的方法，其中所述多个核酸探针包含相同的标记。
13. 权利要求11或12的方法，其中所述标记为荧光标记。
14. 权利要求4-13中任一项的方法，其中所述扩增和检测包括实时PCR扩增和检测。
15. 权利要求1的方法，其中所述检测包括选自质谱分析、测序和杂交的核酸检测技术。
16. 权利要求1-15中任一项的方法，其中所述多个扩增子包括至少5个扩增子。
17. 权利要求1-15中任一项的方法，其中所述多个扩增子包括至少10个扩增子。
18. 扩增核酸的方法，包括：
a) 同时扩增已经用甲基化-特异性检测试剂处理的靶核酸内的多个核酸片段以产生多个扩增子；和
b) 检测所述扩增子。
19. 一种方法，包括：
a) 用甲基化-特异性检测试剂处理靶核酸；
b) 同时扩增所述靶核酸内的多个核酸片段以产生多个扩增子；和
c) 使所述扩增子与多个核酸探针接触以检测所述多个扩增子。
20. 一种试剂盒，包含：
a) 用于扩增靶核酸的多个引物对；
b) 与通过所述多个引物对扩增的扩增子特异性结合的多个核酸探针；和
c) 甲基化特异性检测试剂。
21. 权利要求20的试剂盒，其中所述探针包含可检测的标记。
22. 权利要求21的试剂盒，其中所述探针包含相同的标记。
23. 权利要求20或21的试剂盒，其中所述标记为荧光标记。
24. 权利要求18的试剂盒，其中所述甲基化特异性试剂为亚硫酸氢盐。
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