DE19959691A1

DE19959691A1 - Verfahren zur parallelen Detektions des Methylierungszustandes von genomischer DNA

Info

Publication number: DE19959691A1
Application number: DE19959691A
Authority: DE
Inventors: Alexander Olek; Christian Piepenbrock
Original assignee: Epigenomics AG
Current assignee: Epigenomics AG
Priority date: 1999-12-06
Filing date: 1999-12-06
Publication date: 2001-08-16
Also published as: CA2395047A1; WO2001042493A3; DE10083729D2; EP1238112A2; WO2001042493A2; AU2663201A; AU778411B2; US20040248090A1

Abstract

Beschrieben ist ein Verfahren zur parallelen Detektion des Methylierungszustandes von genomischer DNA, bei dem man folgende Schritte ausführt: DOLLAR A a) in einer genomischen DNA-Probe wandelt man durch chemische Behandlung an der 5'-Position unmethylierte Cytosinbasen in Uracil, Thymidin oder eine andere vom Hybridisierungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base um; DOLLAR A b) aus dieser chemisch behandelten genomischen DNA amplifiziert man mehr als zehn unterschiedliche Fragmente, die jeweils weniger als 2000 Basenpaare lang sind, gleichzeitig durch Verwendung von synthetischen Oligonukleotiden als Primer, wobei diese Primer jeweils Sequenzen aus an der Genregulation beteiligten und/oder transkribierten und/oder translatierten genomischen Sequenzen enthalten, wie sie nach einer Behandlung gemäß Schritt a) vorliegen würden; DOLLAR A c) man bestimmt den Sequenzkontext aller oder eines Teils der in den amplifizierten Fragmenten enthaltenen CpG Dinukleotide oder CpNpG Trinukleotide.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur parallelen Detektion des Methylierungszustandes von genomischer DNA.

Die nach den methodischen Entwicklungen der letzten Jahre in der Molekularbiologie gut studierten Beobachtungsebenen sind die Gene selbst, die Übersetzung dieser Gene in RNA und die daraus entstehenden Proteine. Wann im Laufe der Entwicklung eines Individuums welches Gen angeschaltet wird und wie Aktivieren und Inhibieren bestimmter Gene in bestimmten Zellen und Geweben gesteuert wird, ist mit hoher Wahrscheinlichkeit mit Ausmaß und Charakter der Methylierung der Gene bzw. des Genoms korrelierbar. Insofern ist die Annahme naheliegend, daß pathogene Zustände sich in einem veränderten Methylierungsmuster einzelner Gene oder des Genoms äußern.

Stand der Technik sind Verfahren, welche das Studium von Methylierungsmustern einzelner Gene gestatten. Jüngere Fortentwicklungen dieser Methode erlauben auch die Analyse kleinster Mengen an Ausgangsmaterial. Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zur parallelen Detektion des Methylierungszustandes genomischer DNA Proben, wobei ausgehend von einer Probe gleichzeitig zahlreiche verschiedenene Fragmente aus an der Genregulation beteiligten oder/und transkribierten und/oder translatierten Sequenzen amplifiziert werden und anschließend der Sequenzkontext in den amplifizierten Fragmenten enthaltenen CpG Dinukleotide untersucht wird.

5-Methylcytosin ist die häufigste kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryotischer Zellen. Sie spielt beispielsweise eine Rolle in der Regulation der Transkription, genomischem Imprinting und in der Tumorgenese. Die Identifizierung von 5- Methylcytosin als Bestandteil genetischer Information ist daher von erheblichem Interesse. 5-Methylcytosin-Positionen können jedoch nicht durch Sequenzierung identifiziert werden, da 5-Methylcytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweist wie Cytosin. Darüber hinaus geht bei einer PCR-Amplifikation die epigenetische Information, welche die 5-Methylcytosine tragen, vollständig verloren.

Die Modifikation der genomischen Base Cytosin zu 5'-Methylcytosin stellt den bis heute wichtigsten und best-untersuchten epigenetischen Parameter dar. Trotzdem gibt es bis heute zwar Methoden, umfassende Genotypen von Zellen und Individuen zu ermitteln, aber noch keine vergleichbaren Ansätze auch in großem Maße epigenotypische Information zu generieren und auszuwerten.

Es sind im Prinzip drei prinzipiell verschiedene Methoden bekannt, den 5-Methyl-Status eines Cytosins im Sequenzkontext zu bestimmen.

Die erste prinzipielle Methode beruht auf der Verwendung von Restriktionsendo nukleasen (RE), welche "methylierungssensitiv" sind. REs zeichnen sich dadurch aus, daß sie an einer bestimmten DNA-Sequenz, meist zwischen 4 und 8 Basen lang, einen Schnitt in die DNA einführen. Die Position solcher Schnitte kann dann durch Gelektrophorese, Transfer auf eine Membran und Hybridisierung nachgewiesen werden. Methylierungssensitiv bedeutet, daß bestimmte Basen innerhalb der Erkennungssequenz unmethyliert vorliegen müssen, damit der Schnitt erfolgen kann. Das Bandenmuster nach einem Restriktionsschnitt und Gelektrophorese ändert sich also je nach Methylierungsmuster der DNA. Allerdings befinden sich die wenigsten methylierbaren CpG innerhalb von Erkennungssequenzen von REs, können also nach dieser Methode nicht untersucht werden.

Die Empfindlichkeit dieser Methoden ist extrem niedrig (Bird, A.P., and Southern, E.M., J. Mol. Biol. 118, 27-47). Eine Variante kombiniert PCR mit dieser Methode, eine Amplifikation durch zwei auf beiden Seiten der Erkennungssequenz liegende Primer erfolgt nach einem Schnitt nur dann, wenn die Erkennungssequenz methyliert vorliegt. Die Empfindlichkeit steigt in diesem Fall auf theoretisch ein einziges Molekül der Zielsequenz, allerdings können mit hohem Aufwand nur einzelne Positionen untersucht werden (Shemer, R. et al., PNAS 93, 6371-6376). Wiederum ist Voraussetzung, daß sich die methylierbare Position innerhalb der Erkennungssequenz einer RE befindet.

Die zweite Variante beruht auf partieller chemischer Spaltung von Gesamt-DNA, nach dem Vorbild einer Maxam-Gilbert Sequenzierreaktion, Ligation von Adaptoren an die so generierten Enden, Amplifikation mit generischen Primern und Auftrennung auf einer Gelektrophorese. Mit diesem Verfahren können definierte Bereiche bis zur Größe von weniger als tausend Basenpaaren untersucht werden. Das Verfahren ist allerdings so kompliziert und unzuverlässig, daß es praktisch nicht mehr verwendet wird (Ward, C. et al., J. Biol. Chem. 265, 3030-3033).

Eine relativ neue und die mittlerweile am häufigsten angewandte Methode zur Untersuchung von DNA auf 5-Methylcytosin beruht auf der spezifischen Reaktion von Bisulphit mit Cytosin, das nach anschließender alkalischer Hydrolyse in Uracil umgewandelt wird, welches in seinem Basen-Paarungsverhalten dem Thymidin entspricht. 5-Methylcytosin wird dagegen unter diesen Bedingungen nicht modifiziert. Damit wird die ursprüngliche DNA so umgewandelt, daß Methylcytosin, welches ursprünglich durch sein Hybridisierungsverhalten vom Cytosin nicht unterschieden werden kann, jetzt durch "normale" molekularbiologische Techniken als einzig verbliebenes Cytosin beispielsweise durch Amplifikation und Hybridisierung oder Sequenzierung nachgewiesen werden kann. Alle diese Techniken beruhen auf Basenpaarung, welche jetzt voll ausgenutzt werden kann. Der Stand der Technik, was die Empfindlichkeit betrifft, wird durch ein Verfahren definiert, welches die zu untersuchende DNA in einer Agarose-Matrix einschließt, dadurch die Diffusion und Renaturierung der DNA (Bisulphit reagiert nur an einzelsträngiger DNA) verhindert und alle Fällungs- und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek, A. et al., Nucl. Acids. Res. 24, 5064-5066). Mit dieser Methode können einzelne Zellen untersucht werden, was das Potential der Methode veranschaulicht. Allerdings werden bisher nur einzelne Regionen bis etwa 3000 Basenpaare Länge untersucht, eine globale Untersuchung von Zellen auf Tausende von möglichen Methylierungsereignissen ist nicht möglich. Allerdings kann auch dieses Verfahren keine sehr kleinen Fragmente aus geringen Probenmengen zuverlässig analysieren. Diese gehen trotz Diffusionsschutz durch die Matrix verloren.

Eine Übersicht über die weiteren bekannte Möglichkeiten, 5-Methylcytsosine nachzuweisen, kann auch dem folgenden Übersichtsartikel entnommen werden: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 26, 2255 (1998).

Die Bisulphit-Technik wird bisher bis auf wenige Ausnahmen (z. B. Zeschnigk, M. et al., Eur. J. Hum. Gen. 5, 94-98; Kubota T. et al., Nat. Genet. 16, 16-17) nur in der Forschung angewendet. Immer aber werden kurze, spezifische Stücke eines bekannten Gens nach einer Bisulphit-Behandlung amplifiziert und entweder komplett sequenziert (Olek, A. and Walter, J., Nat. Genet. 17, 275-276) oder einzelne Cytosin- Positionen durch eine "Primer-Extension-Reaktion" (Gonzalgo, M. L. and Jones, P. A., Nucl. Acids. Res. 25, 2529-2531) oder Enzymschnitt (Xiong, Z. and Laird, P. W., Nucl. Acids. Res. 25, 2532-2534) nachgewiesen. Zudem ist auch der Nachweis durch Hybridisierung beschrieben worden (Olek et al. WO9928498).

Gemeinsamkeiten zwischen Promotoren bestehen nicht nur im Vorkommen von TATA- oder GC-Boxen sondern auch darin, für welche Transkriptionsfaktoren sie Bindestellen besitzen und in welchem Abstand diese sich zueinander befinden. Die existierenden Bindestellen für ein bestimmtes Protein stimmen in ihrer Sequenz nicht vollständig überein, es finden sich aber konservierte Folgen von mindestens 4 Basen, die durch das Einfügen von "Wobbles", d. h. Positionen, an denen sich jeweils unterschiedliche Basen befinden, noch verlängert werden können. Des weiteren liegen diese Bindestellen in bestimmten Abständen zueinander vor.

Die Verteilung der DNA im Interphase-Chromatin, das den größten Teil des nuklearen Volumens einnimmt, unterliegt jedoch einer ganz speziellen Ordnung. So ist die DNA an mehreren Stellen an die nukleare Matrix, eine filamentöse Struktur an der Innenseite der nuklearen Membran, angeheftet. Diese Regionen bezeichnet man als matrix attachment regions (MAR) oder scaffold attachment regions (SAR). Das Anheften hat wesentlichen Einfluß auf die Transkription bzw. die Replikation. Diese MAR-Fragmente weisen keine konservativen Sequenzen auf, bestehen allerdings zu 70% aus A bzw. T und liegen in der Nähe von cis-agierenden Regionen, die die Transkription allgemein regulieren, und Topoisomerase II-Erkennungsstellen.

Neben Promotoren und Enhancern existieren weitere regulatorische Elemente für verschiedene Gene, sogenannte Insulators. Diese Insulators können z. B. die Wirkung des Enhancers auf den Promotor inhibieren, wenn sie zwischen Enhancer und Promotor liegen, oder aber, zwischen Heterochromatin und einem Gen gelegen, das aktive Gen vor dem Einfluß des Heterochromatins schützen. Beispiele für solche Insulators sind: 1. sogenannte LCR (locus control regions), welche aus mehreren gegenüber DNAase I hypersensitiven Stellen besteht; 2. bestimmte Sequenzen wie SCS (specialized chromatin structures) bzw. SCS', 350 bzw. 200 bp lang und hoch resistent gegen Degradierung durch DNAase I und auf beiden Seiten von hypersensitiven Stellen flankiert (Abstand je 100 bp). An scs' bindet das Protein BEAF- 32. Diese Insulators können auf beiden Seiten des Gens liegen.

Eine Übersicht über den Stand der Technik in der Oligomer Array Herstellung läßt sich auch einer im Januar 1999 erschienen Sonderausgabe von Nature Genetics (Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999) und der dort zitierten Literatur entnehmen.

Patente, die sich allgemein auf die Verwendung von Oligomer Arrays und photolithographisches Maskendesign beziehen, sind z. B. US-A 5,837,832, US-A 5,856,174, WO-A 98/27430 und US-A 5,856,101. Zudem existieren einige Stoff- und Verfahrenspatente, welche die Verwendung photolabiler Schutzgruppen an Nukleosiden einschränken, so z. B. WO-A98/39348 und US-A 5,763,599.

Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI) ist eine neue, sehr leistungsfähige Entwicklung für die Analyse von Biomolekülen (Karas, M. and Hillenkamp, F. 1988. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10.000 daltons. Anal. Chem. 60: 2299-2301). Ein Analytmolekül wird in eine im UV absorbierende Matrix eingebettet. Durch einen kurzen Laserpuls wird die Matrix ins Vakuum verdampft und das Analyt so unfragmentiert in die Gasphase befördert. Eine angelegte Spannung beschleunigt die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund ihrer verschiedenen Massen werden Ionen unterschiedlich stark beschleunigt. Kleinere Ionen erreichen den Detektor früher als größere und die Flugzeit wird in die Masse der Ionen umgerechnet.

Für die Abtastung eines immobilisierten DNA-Arrays sind vielfach fluoreszent markierte Sonden verwendet worden. Besonders geeignet sind für die Fluoreszenzmarkierung ist das einfache Anbringen von Cy3 und Cy5 Farbstoffen am 5'OH der jeweiligen Sonde. Die Detektion der Fluoreszenz der hybridisierten Sonden erfolgt beispielsweise über ein Konfokalmikroskop. Die Farbstoffe Cy3 und Cy5 sind, neben vielen anderen, kommerziell erhältlich.

Um die erwartete Anzahl von amplifizierten Fragmenten ausgehend von einer beliebigen Templat-DNA und zweien nicht für jeweils eine bestimmte Position spezifischen Primern zu berechnen, muß ein statistisches Modell über den Aufbau des Genoms zu Grunde gelegt werden.

Wir geben hier die Berechnung für drei Modelle an, beziehen uns allerdings in diesem Patent auf die in Modell 3 beschriebene Methode.

Modell 1

Im einfachsten Fall wird angenommen, daß ein primärer DNA-Strang eine Zufallsfolge von vier gleich häufig vorkommenden Basen ist. Damit ergibt sich als Wahrscheinlichkeit, daß sich für einen beliebiger Primer PrimA (der Länge k) an einer gegebenen Stelle im Genom eine perfekte Basenpaarung ergibt:

P_a(PrimA) = 0.25^k (Modell 1 für DNA)
(diese Wahrscheinlichkeit ist für den sense- und anti-sense-Strang der DNA gleich)

Bei einer Bisulfitbehandlung der DNA werden diejenigen Cytosine durch Uracil ersetzt, die nicht zu einem methylierten CG gehören. Das Basenpaarungsverhalten des Uracils entspricht dem des Thymins. Da CG in der DNA sehr selten sind (unter zwei Prozent), kann die statistische Häufigkeit der Cs nach der Bisulfitbehandlung vernachlässigt werden. Die Wahrscheinlichkeit, daß sich für einen Primer PrimB (Länge k, davon a As, t Ts, g Gs und c Cs) auf bisulfitbehandelter DNA eine perfekte Basenpaarung ergibt, ist unterschiedlich für einen mit Bisulfit behandelten Strang und den zugehörigen anti sense Strang:

P_ls(PrimB) = 0.5^a.0.25^t.0.25^c.0^g (Modell 1 für Bisulfit-DNA-Strang)
P_la(PrimB) = 0.25^a.0.5^t.0^c.0.25^g (Modell 1 für anti-sense-Strang zu einem Bisulfit-DNA-Strang)
(wenn der Primer C oder G enthält, wird somit einer der Wahrscheinlichkeitswerte 0).

Modell 2

Zählungen der Basenhäufigkeiten der DNA ergeben, daß die vier Basen in der DNA nicht gleichverteilt sind. Entsprechend kann man aus DNA-Datenbanken folgende Häufigkeiten (Wahrscheinlichkeiten für ein Vorkommen) der Basen ermitteln.

P_DNA(A) = 0.2811
P_DNA(T) = 0.2784
P_DNA(C) = 0.2206
P_DNA(G) = 0.2199

Als Grundlage für diese Statistik (und die folgenden für Modell 2 und 3) dienen ca. 6% des Genoms vom Homo Sapiens aus High Throughput Sequencing Projekten (Datenbank "htgs" vom NIH/NCBI vom 6.9.1999). Die Gesamtmenge der Daten beträgt mehr als 1.5 × 10⁸ Basenpaare, was einem Schätzfehler für die Einzelwahrscheinlichkeiten kleiner 10^-5 entspricht.

Mit Hilfe dieser Werte läßt sich das Modell 1 verbessern.

Damit ist die Wahrscheinlichkeit, daß sich für einen Primer PrimC (Länge k, davon a As, t Ts, g Gs und c Cs) eine perfekte Basenpaarung ergibt:

P₂(PrimC) = P_DNA(T)^a.P_DNA(A)^t.P_DNA(C)^g.P_DNA(G)^c (Modell 3 für DNA)

Für den mit Bisulfit behandelten Strang ergeben sich folgende Wahrscheinlichkeiten unter der Annahme, daß alle CpG-Positionen methyliert sind (man erhält eine gleiche Statistik für die Bisulfitbehandlung des DNA-sense- und des DNA-antisense-Stranges):

P_bDNA(A) = 0.2811
P_bDNA(C) = 0.0140
P_bDNA(G) = 0.2199
P_bDNA(T) = 0.4850

Damit ergibt sich als Wahrscheinlichkeit, daß sich für einen Primer PrimD (Länge k, davon a As, t Ts, g Gs und c Cs) eine perfekte Basenpaarung ergibt:

P_2s(PrimD) = P_bDNA(T)^a.P_bDNA(A)^t.P_bDNA(C)^g.P_bDNA(G)^c (Modell 3 für Bisulfit-DNA- Strang)
P_2a(PrimD) = P_bDNA(A)^a.*P_bDNA(T)^t.P_bDNA(G)^g.P_bDNA(C)^c (Modell 3 für anti-sense- Strang zu einem Bisulfit-DNA-Strang)

Modell 3

Wesentliche Schätzfehler in Modell 2 ergeben sich vor allem bei der mit Bisulfit behandelten DNA aus der Tatsache, daß C nur noch im Kontext CG auftreten kann. Modell 3 berücksichtigt diese Eigenschaft und nimmt an, daß die primäre DNA eine Zufallsfolge mit Abhängigkeit direkt benachbarter Basen ist (Markov-Kette erster Ordnung). Die empirisch aus der Datenbank (vollständig methyliert; mit Bisulphit behandelt) ermittelten paarweisen Basenwahrscheinlichkeiten ergeben sich gleich für beide DNA-Stränge als P_bDNA(von; nach) aus der folgenden Tabelle:

P_bDNA(A) = 0.2811
P_bDNA(C) = 0.0140
P_bDNA(G) = 0.2199
P_bDNA(T) = 0.4850

und für den dazu revers-komplementären Strang (durch entsprechendes Austauschen der Einträge) P_rbDNA(von; nach)

PrbDNA(A) = 0.4850
PrbDNA(C) = 0.2199
PrbDNA(G) = 0.0140
PrbDNA(T) = 0.2811

Damit hängt die Wahrscheinlichkeit, daß sich für einen Primer PrimE (mit der Basenfolge B₁ B₂ B₃ B₄. . .; z. B. ATTG. . .) eine perfekte Basenpaarung ergibt, von der genauen Abfolge der Basen ab und ergibt sich als das Produkt:

(Modell 3 für Bisulfit-DNA-Strang)

(Modell 3 für anti-sense-Strang zu einem Bisulfit-DNA-Strang)

Berechnung der Anzahl der zu erwartenden amplifizierten Fragmente

Die mit Bisulfit behandelte DNA wird unter Benutzung einer Anzahl Primer amplifiziert. Aus Sicht des Modells besteht die DNA aus je einem sense- und einem anti-sense- Strang der Länge N Basen (alle Chromosomen werden hier zusammengefaßt). Für einen Primer Prim ist zu erwarten, daß er auf dem sense-Strang

N.P_s(Prim)

perfekte Basenpaarungen ergibt - für diese Berechnung können die Funktionen P_1s, P_2s oder P_3s von Modell 1, 2 oder 3 eingesetzt werden, je nach gewünschter Abschätzungsgüte. Werden mehrere Primer (PrimU, PrimV, PrimW, PrimX, etc.) gleichzeitig verwendet, ergibt sich als Wahrscheinlichkeit für eine perfekte Basenpaarung auf dem sense-Strang an einer gegebenen Position:

P_s(Primers) = P_s(PrimU)
+(1-P_s(PrimU))P_s(PrimV)
+(1-P_s(PrimU))(1-P_s(PrimV))P_s(PrimW)
+(1-P_s(PrimU))(1-P_s(PrimV))(1-P_s(PrimW))P_s(PrimX)
+. . .

Und damit als Anzahl der zu erwartenden perfekten Basenparungen mit irgendeinem der Primer

N.P_s(Primers)

Für die Bestimmung von P_a(Primers) auf dem anti-sense-Strang werden die analogen Gleichungen verwendet. Ein Amplifikat entsteht genau dann, wenn bei einer perfekten Basenpaarung auf dem sense-Strang innerhalb der maximalen Fragmentlänge M ein Primer auf dem Gegenstrang eine perfekte Basenpaarung bildet. Die Wahrscheinlichkeit dafür ist

Für große M und kleine P_a(Primers) kann dieses durch folgenden Ausdruck berechnet werden:

Für die Gesamtzahl F der Fragmente, die durch die Amplifikation beider Stränge zu erwarten sind, ergibt sich damit:

Diese Methode liefert einen präzisen Erwartungswert für die Vorhersage der Anzahl der Bindungssites bestimmter Sequenzen an ein beliebiges zuvor mit Bisulfit behandeltes genomisches DNA Fragment. Sie dient hier als Grundlage für die Berechnung der statistisch erwarteten Anzahl von Amplifikaten in einer PCR-Reaktion ausgehend von zwei Primersequenzen und einer DNA der Länge N, wobei nur die Amplifikate berücksichtigt werden, die eine Anzahl von M Nukleotiden nicht überschreiten. In diesem Patent wird davon ausgegangen, daß M den Wert 2000 hat.

Die bekannten Verfahren für den Nachweis von Cytosin Methylierungen in genomischer DNA sind prinzipiell nicht so ausgelegt, daß eine Vielzahl von Zielregionen im zu untersuchenden Genom gleichzeitig erfaßt werden. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zu schaffen, mit dem eine Probe genomischer DNA gleichzeitig an mehreren Positionen gleichzeitig auf Cytosin Methylierung hin untersucht werden kann.

Die Aufgabe wird durch die kennzeichnenden Merkmale des Anspruchs 1 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der Merkmal sind in den abhängigen Ansprüchen gekennzeichnet.

Im Unterschied zu anderen Verfahren kann nach chemischer Vorbehandlung der DNA durch Verwendung entsprechend angepaßter Primerpaare eine Amplifikation von vielen Zielregionen gleichzeitig erfolgen. Dabei ist es nicht unbedingt notwendig den Sequenzkontext aller dieser Zielregionen vorab zu kennen, da in vielen Fällen, wie nachfolgend auch beispielhaft aufgeführt, Konsensussequenzen aus der Sequenzierung verwandter Zielregionen bekannt sind, die wie unten beschrieben für das Design für bestimmte Zielregionen spezifischer oder selektiver Primerpaare eingesetzt werden können. Das Verfahren ist dann erfolgreich angewandt, wenn die Amplifikation der chemisch vorbehandelten genomischen DNA mehr Fragmente bis maximal 2000 Basenpaare Länge als statistisch zu erwarten aus den jeweils zu untersuchenden Zielregionen liefert.

Dabei wird der statistische Erwartungswert für die Anzahl dieser Fragmente über die im Stand der Technik aufgeführten Formeln berechnet. Die Anzahl der im Amplifikationsschritt hergestellten Fragmente kann dagegen mittels einer beliebigen molekularbiologischen, chemischen oder physikalischen Methode nachgewiesen werden.

Für die Durchführung der erforderlichen statistischen Betrachtungen, die auch für die unten aufgeführten Ansprüche relevant sind, werden die folgenden Werte angenommen:

Das menschliche haploide Genom enthält 3 Milliarden Basenpaare und 100.000 Gene, die wiederum im Mittel eine 2000 Basenpaare lange mRNA codieren, die Gene inklusive der Introns sind durchschnittlich 15000 Basenpaare lang. Promotoren umfassen je Gen 1000 Basenpaare durchschnittlich. Ist daher der statistische Erwartungswert für die Anzahl der Amplifikate, die ausgehend von zwei Primern in transkribierten Sequenzen liegen, zu berechnen, so ist zunächst der Erwartungswert für das Gesamtgenom nach obiger Formel (Methode 3) zu berechnen und mit dem Anteil der transkribierten Sequenzen am Gesamtgenom zu berechnen. Analog wird für Teile eines beliebigen Genoms sowie für Promotoren und translatierte Sequenzen (mRNA codierend) vorgegangen.

Die vorliegende Erfindung beschreibt somit ein Verfahren zur parallelen Detektion des Methylierungszustandes genomischer DNA. Dabei sollen mehrere Cytosin- Methylierungen in einer DNA-Probe gleichzeitig analysiert werden. Dazu werden die folgenden Verfahrensschritte nacheinander ausgeführt:
Zuerst wird eine genomische DNA Probe derart chemisch behandelt, daß an der 5'- Position unmethylierte Cytosinbasen in Uracil, Thymin oder eine andere vom Hybridisierungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base verwandelt werden.

Bevorzugt wird dazu die oben beschriebene Behandlung genomischer DNA mit Bisulfit (Hydrogensulfit, Disulfit) und anschließender alkalischer Hydrolyse verwendet, die zu einer Umwandlung nicht methylierter Cytosin-Nukleobasen in Uracil führt.

In einem zweiten Verfahrensschritt werden aus der vorbehandelten genomischen DNA mehr als zehn unterschiedliche Fragmente gleichzeitig durch Verwendung von synthetischen Oligonukleotiden als Primer amplifiziert, wobei mehr als doppelt so viele Fragmente als statistisch zu erwarten aus an der Genregulation beteiligten, transkribierten und/oder translatierten Sequenzen stammen. Dies kann mittels verschiedener Methoden erreicht werden.

In einer bevorzugten Variante des Verfahrens enthält mindestens eines der für die Amplifikation verwendeten Oligonukleotide weniger Nukleobasen als es statistisch für eine sequenzspezifische Hybridisierung an die chemisch behandelte genomische DNA Probe erforderlich wäre, was zur Amplifikation mehrerer Fragmente gleichzeitig führen kann. Dabei ist die Gesamtzahl der in diesem Oligonukleotid enthaltenen Nukleobasen kleiner als 17. In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens ist die Anzahl der in diesem Oligonukleotid enthaltenen Nukleobasen kleiner als 14.

In einer weiteren, bevorzugten Variante des Verfahrens werden für die Amplifikation mehr als 4 Oligonukleotide mit unterschiedlicher Sequenz gleichzeitig in einem Reaktionsgefäß verwendet. In einer besonders bevorzugten Varianten werden zur Herstellung eines komplexen Amplifikates mehr als 26 verschiedene Oligonukleotide gleichzeitig verwendet. In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens stammt mehr als eine doppelt so hohe Anzahl, wie statistisch zu erwarten, aus an der Regulation von Genen beteiligten Genomabschnitten, z. B. Promotoren und Enhancern, stammt, als bei einer rein zufälligen Wahl der Oligonukleotidsequenzen zu erwarten wäre. In einer weiteren besonders bevorzugten Variante des Verfahrens stammt mehr als eine doppelt so hohe Anzahl der amplifizierten Fragmente aus Genomabschnitten, die in mindestens einer Zelle des jeweiligen Organismus in mRNA transkribiert werden, oder aber aus nach der Transkription in mRNA gespliceten Genomabschnitten (Exons), als bei einer rein zufälligen Wahl der Oligonukleotidsequenzen zu erwarten wäre.

In einer weiteren besonders bevorzugten Variante des Verfahrens stammt mehr als eine doppelt so hohe Anzahl der amplifizierten Fragmente aus Genomabschnitten, welche für Teile einer oder mehrerer Genfamilien kodieren, oder aber sie stammen aus Genomabschnitten, welche für sogenannte "matrix attachment sites" (MARs)- charakteristische Sequenzen enthalten, als bei einer rein zufälligen Wahl der Oligonukleotidsequenzen zu erwarten wäre.

In einer weiteren besonders bevorzugten Variante des Verfahrens stammt mehr als eine doppelt so hohe Anzahl der amplifizierten Fragmente aus Genomabschnitten, welche als sogenannte "boundary elements" die Verpackungsdichte des Chromatins organisieren, oder aber sie stammen aus multiple drug resistance gene" (MDR)- Promotoren oder kodierenden Regionen, als bei einer rein zufälligen Wahl der Oligonukleotidsequenzen zu erwarten wäre.

In einer weiteren, besonders bevorzugten Variante des Verfahrens werden zur Amplifkation der beschriebenen Fragmente zwei Oligonukleotide oder zwei Klassen von Oligonukleotiden verwendet, von denen eines oder eine Klasse außer im Kontext CpG oder CpNpG zwar die Base C enthalten kann, nicht aber die Base G und von denen das andere oder die andere Klasse außer im Kontext CpG oder CpNpG zwar die Base G, nicht aber die Base C enthalten kann.

In einer weiteren bevorzugten Variante des Verfahrens wird die Amplifikation mittels zweier Oligonukleotide durchgeführt, von denen eines eine vier bis sechzehn Basen lange Sequenz enthält, die zu einer solchen DNA komplementär ist oder dieser entspricht, wie sie entstehen würde, wenn ein ebenso langes DNA Fragment, an welches einer der Faktoren
AhR/Arnt aryl hydrocarbon receptor/aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator
Arnt aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator
AML-1a CBFA2; core-binding factor, runt domain, alpha subunit 2 (acute myeloid leukemia 1; aml1 oncogene)
AP-1 activator protein-1 (AP-1); Synonyme: c-Jun
C/EBP CCAAT/enhancer binding protein
C/EBPalpha CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP), alpha
C/EBPbeta CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP), beta
CDP CUTL1; cut (Drosophila)-like 1 (CCAAT displacement protein)
CDP CUTL1; cut (Drosophila)-like 1 (CCAAT displacement protein)
CDP CR1 complement component (3b/4b) receptor 1
CDP CR3 complement component (3b/4b) receptor 3
CHOP-C/EBPalpha DDIT; DNA-damage-inducible transcript 3/CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP), alpha
c-Myc/Max avian myelocytomatosis viral oncogene/MYC-ASSOCIATED FACTOR X
CREB cAMP responsive element binding protein
CRE-BP1 CYCLIC AMP RESPONSE ELEMENT-BINDING PROTEIN 2, CREB2, CREBP1; now ATF2; activating transcription factor 2
CRE-BP1/c-Jun activator protein-1 (AP-1); Synonyme: c-Jun
CREB MP responsive element binding protein
E2F E2F transcription factor (originally identified as a DNA- binding protein essential E1A-dependent activation of the adenovirus E2 promoter)
E47 transcription factor 3 (E2A immunoglobulin enhancer binding factors E12/E47)
E47 transcription factor 3 (E2A immunoglobulin enhancer binding factors E12/E47)
Egr-1 early growth response 1
Egr-2 early growth response 2 (Krox-20 (Drosophila) homolog)
ELK-1 ELK1, member of ETS (environmental tobacco smoke) oncogene family
Freac-2 FKHL6; forkhead (Drosophila)-like 6; FORKHEAD-RELATED ACTIVATOR 2; FREAC2
Freac-3 FKHL7; forkhead (Drosophila)-like 7; FORKHEAD-RELATED ACTIVATOR 3; FREAC3
Freac-4 FKHL8; forkhead (Drosophila)-like 8; FORKHEAD-RELATED ACTIVATOR 4; FREAC4
Freac-7 FKHL11; forkhead (Drosophila)-like 9; FORKHEAD- RELATED ACTIVATOR 7; FREAC7
GATA-1 GATA-binding protein 1 /Enhancer-Binding Protein GATA1
GATA-1 GATA-binding protein 1/Enhancer-Binding Protein GATA1
GATA-1 GATA-binding protein 1 /Enhancer-Binding Protein GATA1
GATA-2 GATA-binding protein 2/Enhancer-Binding Protein GATA2
GATA-3 GATA-binding protein 3/Enhancer-Binding Protein GATA3
GATA-X
HFH-3 FKHL10; forkhead (Drosophila)-like 10; FORKHEAD- RELATED ACTIVATOR 6; FREAC6
HNF-1 TCF1; transcription factor 1, hepatic; LF-B1, hepatic nuclear factor (HNF1), albumin proximal factor
HNF-4 hepatocyte nuclear factor 4
IRF-1 interferon regulatory factor 1
ISRE interferon-stimulated response element
Lmo2 complex LIM domain only 2 (rhombotin-like 1)
MEF-2 MADS box transcription enhancer factor 2, polypeptide A (myocyte enhancer factor 2A)
MEF-2 MADS box transcription enhancer factor 2, polypeptide A (myocyte enhancer factor 2A)
myogenin/NF-1 Myogenin (myogenic factor 4)/Neurofibromin 1; NEUROFIBROMATOSIS, TYPE I
MZF1 ZNF42; zinc finger protein 42 (myeloid-specific retinoic acid responsive)
MZF1 ZNF42; zinc finger protein 42 (myeloid-specific retinoic acid responsive)
NF-E2 NFE2; nuclear factor (erythroid-derived 2), 45kD
NF-kappaB (p50) nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B- cells p50 subunit
NF-kappaB (p65) nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B- cells p65 subunit
NF-kappaB nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B- cells
NF-kappaB nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B- cells
NRSF NEURON RESTRICTIVE SILENCER FACTOR; REST; RE1- silencing transcription factor
Oct-1 OCTAMER-BINDING TRANSCRIPTION FACTOR 1; POU2F1; POU domain, class 2, transcription factor 1
Oct-1 OCTAMER-BINDING TRANSCRIPTION FACTOR 1; POU2F1; POU domain, class 2, transcription factor 1
Oct-1 OCTAMER-BINDING TRANSCRIPTION FACTOR 1; POU2F1; POU domain, class 2, transcription factor 1
Oct-1 OCTAMER-BINDING TRANSCRIPTION FACTOR 1; POU2F1; POU domain, class 2, transcription factor 1
Oct-1 OCTAMER-BINDING TRANSCRIPTION FACTOR 1; POU2F1; POU domain, class 2, transcription factor 1
P300 E1A (adenovirus E1A oncoprotein)-BINDING PROTEIN, 300-KD
P53 tumor protein p53 (Li-Fraumeni syndrome); TP53
Pax-1 paired box gene 1
Pax-3 paired box gene 3 (Waardenburg syndrome 1)
Pax-6 paired box gene 6 (aniridia, keratitis)
Pbx 1b pre-B-cell leukemia transcription factor
Pbx-1 pre-B-cell leukemia transcription factor 1
RORalpha2 RAR-RELATED ORPHAN RECEPTOR ALPHA; RETINOIC ACID-BINDING RECEPTOR ALPHA
RREB-1 ras responsive element binding protein 1
SP1 simian-virus-40-protein-1
SP1 simian-virus-40-protein-1
SREBP-1 sterol regulatory element binding transcription factor 1
SRF serum response factor (c-fos serum response element binding transcription factor)
SRY sex determining region Y
STAT3 signal transducer and activator of transcription 1, 91kD
Tal-1alpha/E47 T-cell acute lymphocytic leukemia 1/transcription factor 3 (E2A immunoglobulin enhancer binding factors E12/E47)
TATA cellular and viral TATA box elements Tax/CREB Transiently-expressed axonal glycoprotein/cAMP responsive element binding protein
Tax/CREB Transiently-expressed axonal glycoprotein/cAMP responsive element binding protein
TCF1/MafG v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma (avian) oncogene family, protein G TCF11 Transcription Factor 11; TCF11; NFE2L1; nuclearfactor (erythroid-derived 2)-like 1
USF upstream stimulating factor
Whn winged-helix nude
X-BP-1 X-box binding protein 1 oder
YY1 ubiquitously distributed transcription factor belonging to the GLI-Kruppel class of zinc finger proteins
bindet, derart chemisch behandelt würde, daß an der 5-Position unmethylierte Cytosinbasen in Uracil, Thymidin oder eine andere vom Hybridisierungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base verwandelt werden.

In einer weiteren bevorzugten Variante des Verfahrens wird die Amplifikation mittels zweier Oligonukleotide oder zweier Klassen von Oligonukleotiden durchgeführt, von denen eines oder die eine Klasse die vier bis sechzehn Basen lange Sequenz enthält, welche zu einer solchen DNA komplementär ist oder dieser entspricht, wie sie entstehen würde, wenn ein ebenso langes DNA Fragment, welches über seine Sequenz oder Sekundärstruktur die spezifische Lokalisierung von Genom/Chromatinabschnitten innerhalb des Zellkerns herbeiführen kann, derart chemisch behandelt würde, daß an der 5'-Position unmethylierte Cytosinbasen in Uracil, Thymidin oder eine andere vom Hybridisierungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base verwandelt werden.

In einer weiteren bevorzugten Variante des Verfahrens wird die Amplifikation mittels zweier Oligonukleotide oder zweier Klassen von Oligonukleotiden durchgeführt, von denen eines oder die eine Klasse eine der Sequenzen

enthält, welche zu einer solchen DNA komplementär ist oder dieser entspricht, wie sie entstehen würde, wenn ein ebenso langes DNA Fragment, welches über seine Sequenz oder Sekundärstruktur die spezifische Lokalisierung von Genom/Chromatinabschnitten innerhalb des Zellkerns herbeiführen kann, derart chemisch behandelt würde, daß an der 5-Position unmethylierte Cytosinbasen in Uracil, Thymidin oder eine andere vom Hybridisierungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base verwandelt werden.

In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens enthalten die zur Amplifikation verwendeten Oligonukleotide außer den oben definierten Konsensussequenzen mehrere Positionen, an denen entweder irgendeine der drei Basen G, A und T oder irgendeine der Basen C, A und T vorhanden sein kann.

In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens enthalten die zur Amplifikation verwendeten Oligonukleotide außer einer der oben beschriebenen Konsensus sequenzen nur maximal zusätzlich so viele weitere Basen, wie es zur gleichzeitigen Amplifikation von mehr als einhundert verschiedenen Fragmenten pro Reaktion aus der chemisch wie oben behandelten DNA erforderlich ist.

In einem dritten Verfahrensschritt wird nun der Sequenzkontext aller oder eines Teils der in den amplifizierten Fragmenten enthaltenen CpG Dinukleotide oder CpNpG Trinukleotide untersucht.

In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens erfolgt die Analyse durch Hybridisierung der bereits in der Amplifikation mit einem Fluoreszenzmarker versehenen Fragmente an einen Oligonukleotid- Array (DNA Chip). Der Fluoreszenzmarker kann entweder über die verwendeten Primer oder aber durch ein fluoreszenzmarkiertes Nukleotid (z. B. Cy5-dCTP, kommerziell von Amersham- Pharmacia erhältlich) eingeführt werden.

Dabei hybridisieren komplementäre Fragmente an die jeweiligen auf der Chipoberfläche immobilisierten Oligomere, nicht komplementäre Fragmente werden in einem oder mehreren Waschschritten entfernt. Die Fluoreszenz an den jeweiligen Hybridisierungsorten auf dem Chip erlaubt dann den Rückschluß auf den Sequenzkontext der in den amplifizierten Fragmenten enthaltenen CpG Dinukleotide oder CpNpG Trinukleotide.

In einer weiteren bevorzugten Variante des Verfahrens werden die amplifizierten Fragmente auf einer Oberfläche immobilisiert und anschließend eine Hybridisierung mit einer kombinatorischen Bibiliothek von unterscheidbaren Oligonukleotid- oder PNA- Oligomer-Sonden durchgeführt. Wiederum werden nicht komplementäre Sonden durch einen oder mehrere Waschschritte entfernt. Die hybridisierten Sonden werden entweder über ihre Fluoreszenzmarker detektiert oder in einer weiteren besonders bevorzugten Variante des Verfahrens mittels Matrix-assistierter Laser- Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI-MS) anhand ihrer eindeutigen Masse nachgewiesen. Dabei werden die Sondenbibliotheken derart synthetisiert, daß die Masse eines jeden Bestandteils eindeutig seiner Sequenz zugeordnet werden kann.

Die Amplifikate können zudem in einer weiteren bevorzugten Variante des Verfahrens hinsichtlich Ihrer durchschnittlichen Größe durch Veränderung der Kettenverlängerungszeiten im Amplifikationsschritt beeinflußt werden. Da hier vorwiegend kleinere Fragmente (ca. 200-500 Basenpaare) untersucht werden, ist eine Verkürzung der Kettenverlängerungsschritte z. B. einer PCR sinnvoll.

In einer weiteren bevorzugten Variante des Verfahrens werden die Amplifikate durch Gelelektrophorese aufgetrennt, und die Fragmente im gewünschten Größenbereich werden vor Ihrer Analyse ausgeschnitten. In einer weiteren besonders bevorzugten Variante werden die aus dem Gel ausgeschnittenen Amplifikate unter Verwendung des gleichen Satzes an Primern erneut amplifiziert. Dabei können dann nur noch Fragmente der gewünschten Größe entstehen, da andere als Templat nicht mehr verfügbar sind.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit, enthaltend mindestens zwei Primerpaare, Reagenzien und Hilfsstoffe für die Amplifikation und/oder Reagenzien und Hilfsmittel für die chemische Behandlung und/oder eine kombinatorische Sondenbibliothek und/oder einen Oligonukleotid-Array (DNA-Chip), soweit sie für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erforderlich oder dienlich sind.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Verfahren zur parallelen Detektion des Methylierungszustandes von genomischer DNA, dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Schritte ausführt:

a) in einer genomischen DNA-Probe wandelt man durch chemische Behandlung an der 5'-Position unmethylierte Cytosinbasen in Uracil, Thymidin oder eine andere vom Hybridisierungsverhalten her dem Cytosin unähnliche Base um;
b) aus dieser chemisch behandelten genomischen DNA amplifiziert man mehr als zehn unterschiedliche Fragmente, die jeweils weniger als 2000 Basenpaare lang sind, gleichzeitig durch Verwendung von synthetischen Oligonukleotiden als Primer, wobei diese Primer jeweils Sequenzen aus an der Genregulation beteiligten und/oder transkribierten und/oder translatierten genomischen Sequenzen enthalten, wie sie nach einer Behandlung gemäß Schritt a) vorliegen würden;
c) man bestimmt den Sequenzkontext aller oder eines Teils der in den amplifizierten Fragmenten enthaltenen CpG Dinukleotide oder CpNpG Trinukleotide.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die chemische Behandlung mittels einer Lösung eines Bisulfits, Hydrogensulfits oder Disulfits durchführt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eines der in Schritt b) verwendeten Oligonukleotide weniger Nukleobasen enthält als es statistisch für eine sequenzspezifische Hybridisierung an die chemisch behandelte genomische DNA Probe erforderlich wäre.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eines der in Schritt b) des Anspruchs 1 verwendeten Oligonukleotide kürzer als 18 Nukleobasen ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eines der in Schritt b) des Anspruchs 1 verwendeten Oligonukleotide kürzer als 15 Nukleobasen ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) des Anspruchs 1 mehr als 4 verschiedene Oligonukleotide gleichzeitig für die Amplifikation verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt b) des Anspruchs 1 mehr als 26 verschiedene Oligonukleotide gleichzeitig für die Amplifikation verwendet.

8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt b) des Anspruchs 1 mehr als doppelt so viele amplifizierte Fragmente als nach berechnet nach Formel 1 aus an der Regulation von Genen beteiligten Genomabschnitten, wie Promotoren und Enhancern, stammt, als bei einer rein zufälligen Wahl der Oligonukleotidsequenzen zu erwarten wäre, oder aber deren Anteil an den insgesamt nachweisbaren Fragmenten mehr als doppelt so hoch ist wie berechnet nach Formel 1,
wobei man die Berechnung wie folgt durchführt:
bei der mit Bisulfit behandelten DNA kann C nur noch im Kontext CG auftreten, so wird angenommen, daß die primäre DNA eine Zufallsfolge mit Abhängigkeit direkt benachbarter Basen ist (Markov-Kette erster Ordnung); die empirisch aus der Datenbank (vollständig methyliert; mit Bisullfit behandelt) ermittelten paarweisen Basenwahrscheinlichkeiten ergeben sich gleich für beide DNA- Stränge als P_bDNA (von; nach) aus der folgenden Tabelle:
mit
P_bDNA(A) = 0.2811
P_bDNA(C) = 0.0140
P_bDNA(G) = 0.2199
P_bDNA(T) = 0.4850
und für den dazu revers-komplementären Strang (durch entsprechendes Austauschen der Einträge) P_rbDNA(von; nach)
P_rbDNA(A) = 0.4850
P_rbDNA(C) = 0.2199
P_rbDNA(G) = 0.0140
P_rbDNA(T) = 0.2811;
damit hängt die Wahrscheinlichkeit, daß sich für einen Primer PrimE (mit der Basenfolge B₁, B₂, B₃, B₄. . .; z. B. ATTG. . .) eine perfekte Basenpaarung ergibt, von der genauen Abfolge der Basen ab und ergibt sich als das Produkt:
(Bisulfit-DNA-Strang)
(anti-sense-Strang zu einem Bisulfit-DNA-Strang);
für einen Primer Prim auf dem sense-Strang ergeben sich
N.P_s(Prim);
perfekte Basenpaarungen - werden mehrere Primer (PrimU, PrimV, PrimW, PrimX, etc.) gleichzeitig verwendet, ergibt sich als Wahrscheinlichkeit für eine perfekte Basenpaarung auf dem sense-Strang an einer gegebenen Position:
P_s(Primers) = P_s(PrimU)
+ (1-P_s(PrimU))P_s(PrimV)
+ (1-P_s(PrimU))(1-P_s(Primv))P_s(PrimW)
+ (1-P_s(PrimU))(1-P_s(PrimV))(1-P_s(PrimW))P_s(PrimX)
+ . . .
und damit als Anzahl der zu erwartenden perfekten Basenpaarungen mit irgendeinem der Primer
N.P_s(Primers);
für die Bestimmung von P_a(Primers) auf dem anti-sense-Strang werden die analogen Gleichungen verwendet; ein Amplifikat entsteht genau dann, wenn bei einer perfekten Basenpaarung auf dem sense-Strang innerhalb der maximalen Fragmentlänge M ein Primer auf dem Gegenstrang eine perfekte Basenpaarung bildet, die Wahrscheinlichkeit dafür ist
für große M und kleine P_a(Primers) wird dieses durch folgenden Ausdruck berechnet:
für die Gesamtzahl F der Amplifikate, die durch die Amplifikation beider Stränge zu erwarten sind, ergibt sich damit

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt b) des Anspruchs 1 mehr als doppelt so viele amplifizierte Fragmente als berechnet entsprechend Anspruch 8 aus Genomabschnitten stammt, die in mindestens einer Zelle des jeweiligen Organismus in mRNA transkribiert werden, als bei einer rein zufälligen Wahl der Oligonukleotidsequenzen zu erwarten wäre, oder aber deren Anteil an den insgesamt nachweisbaren Fragmenten mehr als doppelt so hoch ist als berechnet entsprechend Anspruch 8.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt b) des Anspruchs 1 mehr als doppelt so viele amplifizierte Fragmente als berechnet entsprechend Anspruch 8 aus nach der Transkription in mRNA gespliceten Genomabschnitten (Exons) stammt, als bei einer rein zufälligen Wahl der Oligonukleotidsequenzen zu erwarten wäre, oder aber deren Anteil an den insgesamt nachweisbaren Fragmenten mehr als doppelt so hoch ist als berechnet entsprechend Anspruch 8.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt b) des Anspruchs 1 mehr als doppelt so viele amplifizierte Fragmente als berechnet entsprechend Anspruch 8 aus Genomabschnitten stammen, welche für Teile einer oder mehrerer Genfamilien kodieren, als bei einer rein zufälligen Wahl der Oligonukleotidsequenzen zu erwarten wäre, oder aber deren Anteil an den insgesamt nachweisbaren Fragmenten mehr als doppelt so hoch ist als berechnet entsprechend Anspruch 8.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt b) des Anspruchs 1 mehr als doppelt so viele amplifizierte Fragmente als berechnet entsprechend Anspruch 8, aus Genomabschnitten stammen, welche für sogenannte "matrix attachment sites" (MARs)- charakteristische Sequenzen enthalten, als bei einer rein zufälligen Wahl der Oligonukleotidsequenzen zu erwarten wäre, oder aber deren Anteil an den insgesamt nachweisbaren Fragmenten mehr als doppelt so hoch ist als berechnet entsprechend Anspruch 8.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt b) des Anspruchs 1 mehr als doppelt so viele amplifizierte Fragmente als berechnet entsprechend Anspruch 8 aus Genomabschnitten stammen, welche als sogenannte "boundary elements" die Verpackungsdichte des Chromatins organisieren, als bei einer rein zufälligen Wahl der Oligonukleotidsequenzen zu erwarten wäre, oder aber deren Anteil an den insgesamt nachweisbaren Fragmenten mehr als doppelt so hoch ist als berechnet entsprechend Anspruch 8.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt b) des Anspruchs 1 mehr als doppelt so viele amplifizierte Fragmente als berechnet entsprechend Anspruch 8 aus "multiple drug resistance gene" (MDR)- Promotoren oder kodierenden Regionen stammen, als bei einer rein zufälligen Wahl der Oligonukleotidsequenzen zu erwarten wäre oder aber deren Anteil an den insgesamt nachweisbaren Fragmenten mehr als doppelt so hoch ist als berechnet entsprechend Anspruch 8.

15. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Amplifkation der in Anspruch 1 beschriebenen Fragmente zwei Oligonukleotide oder zwei Klassen von Oligonukleotiden verwendet werden, von denen eines oder eine Klasse außer im Kontext CpG oder CpNpG zwar die Base C enthalten kann, nicht aber die Base G und von denen das andere oder die andere Klasse außer im Kontext CpG oder CpNpG zwar die Base G, nicht aber die Base C enthalten kann.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die in Anspruch 1 beschriebene Amplifikation mittels zweier Oligonukleotide durchgeführt wird, von denen eines eine vier bis sechzehn Basen lange Sequenz enthält, welche zu einer solchen DNA komplementär ist oder dieser entspricht, wie sie entstehen würde, wenn ein ebenso langes DNA Fragment, an welches einer der Transkriptionsfaktoren
AhR/Arnt aryl hydrocarbon receptor/aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator
Arnt aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator
AML-1a CBFA2; core-binding factor, runt domain, alpha subunit 2 (acute myeloid leukemia 1; aml1 oncogene)
AP-1 activator protein-1 (AP-1); Synonyme: c-Jun
C/EBP CCAAT/enhancer binding protein
C/EBPalpha CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP), alpha
C/EBPbeta CCAAT/enhancer binding protein (CIEBP), beta
CDP CUTL1; cut (Drosophila)-like 1 (CCAAT displacement protein)
CDP CUTL1; cut (Drosophila)-like 1 (CCAAT displacement protein)
CDP CR1 complement component (3b/4b) receptor 1 CDP CR3 complement component (3b/4b) receptor 3 CHOP-C/EBPalpha DDIT; DNA-damage-inducible transcript 3/CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP), alpha
c-Myc/Max avian myelocytomatosis viral oncogene/MYC-ASSOCIATED FACTOR X
CREB cAMP responsive element binding protein
CRE-BP1 CYCLIC AMP RESPONSE ELEMENT-BINDING PROTEIN 2, CREB2, CREBP1; now ATF2; activating transcription factor 2
CRE-BP1/c-Jun activator protein-1 (AP-1); Synonyme: c-Jun
CREB MP responsive element binding protein
E2F E2F transcription factor (originally identified as a DNA- binding protein essential E1A-dependent activation of the adenovirus E2 promoter)
E47 transcription factor 3 (E2A immunoglobulin enhancer binding factors E12/E47)
E47 transcription factor 3 (E2A immunoglobulin enhancer binding factors E12/E47)
Egr-1 early growth response 1
Egr-2 early growth response 2 (Krox-20 (Drosophila) homolog)
ELK-1 ELK1, member of ETS (environmental tobacco smoke) oncogene family
Freac-2 FKHL6; forkhead (Drosophila)-like 6; FORKHEAD-RELATED ACTIVATOR 2; FREAC2
Freac-3 FKHL7; forkhead (Drosophila)-like 7; FORKHEAD-RELATED ACTIVATOR 3; FREAC3
Freac-4 FKHL8; forkhead (Drosophila)-like 8; FORKHEAD-RELATED ACTIVATOR 4; FREAC4
Freac-7 FKHL11; forkhead (Drosophila)-like 9; FORKHEAD- RELATED ACTIVATOR 7; FREAC7
GATA-1 GATA-binding protein 1/Enhancer-Binding Protein GATA1
GATA-1 GATA-binding protein 1/Enhancer-Binding Protein GATA1
GATA-1 GATA-binding protein 1/Enhancer-Binding Protein GATA1
GATA-2 GATA-binding protein 2/Enhancer-Binding Protein GATA2
GATA-3 GATA-binding protein 3/Enhancer-Binding Protein GATA3
GATA-X
HFH-3 FKHL10; forkhead (Drosophila)-like 10; FORKHEAD- RELATED ACTIVATOR 6; FREAC6
HNF-1 TCF1; transcription factor 1, hepatic; LF-B1, hepatic nuclear factor (HNF1), albumin proximal factor
HNF-4 hepatocyte nuclear factor 4
IRF-1 interferon regulatory factor 1
ISRE interferon-stimulated response element
Lmo2 complex LIM domain only 2 (rhombotin-like 1)
MEF-2 MADS box transcription enhancer factor 2, polypeptide A (myocyte enhancer factor 2A)
MEF-2 MADS box transcription enhancer factor 2, polypeptide A (myocyte enhancer factor 2A)
myogenin/NF-1 Myogenin (myogenic factor 4)/Neurofibromin 1; NEUROFIBROMATOSIS, TYPE I
MZF1 ZNF42; zinc finger protein 42 (myeloid-specific retinoic acid responsive)
MZF1 ZNF42; zinc finger protein 42 (myeloid-specific retinoic acid responsive)
NF-E2 NFE2; nuclear factor (erythroid-derived 2), 45kD
NF-kappaB (p50) nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B- cells p50 subunit
NF-kappaB (p65) nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B- cells p65 subunit
NF-kappaB nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B- cells NF-kappaB nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B- cells
NRSF NEURON RESTRICTIVE SILENCER FACTOR; REST; RE1- silencing transcription factor
Oct-1 OCTAMER-BINDING TRANSCRIPTION FACTOR 1; POU2F1; POU domain, class 2, transcription factor 1
Oct-1 OCTAMER-BINDING TRANSCRIPTION FACTOR 1; POU2F1; POU domain, class 2, transcription factor 1
Oct-1 OCTAMER-BINDING TRANSCRIPTION FACTOR 1; POU2F1; POU domain, class 2, transcription factor 1
Oct-1 OCTAMER-BINDING TRANSCRIPTION FACTOR 1; POU2F1; POU domain, class 2, transcription factor 1
Oct-1 OCTAMER-BINDING TRANSCRIPTION FACTOR 1; POU2F1; POU domain, class 2, transcription factor 1
P300 EIA (adenovirus EIA oncoprotein)-BINDING PROTEIN, 300-KD
P53 tumor protein p53 (Li-Fraumeni syndrome); TP53
Pax-1 paired box gene 1
Pax-3 paired box gene 3 (Waardenburg syndrome 1)
Pax-6 paired box gene 6 (aniridia, keratitis)
Pbx 1b pre-B-cell leukemia transcription factor
Pbx-1 pre-B-cell leukemia transcription factor 1
RORalpha2 RAR-RELATED ORPHAN RECEPTOR ALPHA; RETINOIC ACID-BINDING RECEPTOR ALPHA
RREB-1 ras responsive element binding protein 1
SP1 simian-virus-40-protein-1
SP1 simian-virus-40-protein-1
SREBP-1 sterol regulatory element binding transcription factor 1
SRF serum response factor (c-fos serum response element binding transcription factor)
SRY sex determining region Y
STAT3 signal transducer and activator of transcription 1, 91kD
Tal-1alpha/E47 T-cell acute lymphocytic leukemia 1/transcription factor 3 (E2A immunoglobulin enhancer binding factors E12/E47)
TATA cellular and viral TATA box elements
Tax/CREB Transiently-expressed axonal glycoprotein/cAMP responsive element binding protein
Tax/CREB Transiently-expressed axonal glycoprotein/cAMP responsive element binding protein
TCF11/MafG v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma (avian) oncogene family, protein G
TCF11 Transcription Factor 11; TCF11; NFE2L1; nuclearfactor (erythroid-derived 2)-like 1
USF upstream stimulating factor
Whn winged-helix nude
X-BP-1 X-box binding protein 1 oder
YY1 ubiquitously distributed transcription factor belonging to the GLl-Kruppel class of zinc finger proteins
bindet, einer chemischen Behandlung gemäß Anspruch 1 unterzogen würde.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die in Anspruch 1 beschriebene Amplifikation mittels zweier Oligonukleotide durchführt, von denen eines die eine vier bis sechzehn Basen lange Sequenz enthält, welche zu einer solchen DNA komplementär ist oder dieser entspricht, wie sie entstehen würde, wenn ein ebenso langes DNA Fragment, welches über seine Sequenz oder Sekundärstruktur die spezifische Lokalisierung von Genom/Chromatinabschnitten innerhalb des Zellkerns herbeiführen kann, einer chemischen Behandlung gemäß Anspruch 1 unterzogen würde.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die in Anspruch 1 beschriebene Amplifikation mittels zweier Oligonukleotide durchgeführt wird, von denen mindestens eine der Sequenzen (von 5'nach 3')
enthält, welche zu einer solchen DNA komplementär ist oder dieser entspricht, wie sie entstehen würde, wenn ein ebenso langes DNA Fragment, welches über seine Sequenz oder Sekundärstruktur die spezifische Lokalisierung von Genom/Chromatinabschnitten innerhalb des Zellkerns herbeiführen kann, einer chemischen Behandlung gemäß Anspruch 1 unterzogen würde.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Amplifikation verwendeten Oligonukleotide außer den in den Ansprüchen 16 bis 18 definierten Konsensussequenzen mehrere Positionen enthalten, an denen entweder irgendeine der drei Basen G, A und T oder irgendeine der Basen C, A und T vorhanden sein kann.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Amplifikation verwendeten Oligonukleotide außer einer der in den Anspruch 18 beschriebenen Konsensussequenzen nur maximal zusätzlich so viele weitere Basen enthalten, wie es zur gleichzeitigen Amplifikation von mehr als einhundert verschiedenen Fragmenten pro Reaktion aus der chemisch behandelten DNA, berechnet entsprechend Anspruch 8, erforderlich ist.

21. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche dadurch gekennzeichnet, daß die Untersuchung des Sequenzkontextes aller oder eines Teils der in den amplifizierten Fragmenten enthaltenen CpG Dinukleotide oder CpNpG Trinukleotide gemäß Anspruch 1c) durch Hybridisierung der bereits in der Amplifikation mit einem Fluoreszenzmarker versehenen Fragmente an einen Oligonukleotid- Array (DNA Chip) erfolgt.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die amplifizierten Fragmente auf einer Oberfläche immobilisiert und anschließend eine Hybridisierung mit einer kombinatorischen Bibiliothek von unterscheidbaren Oligonukleotid- oder PNA-Oligomer-Sonden durchgeführt wird.

23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Sonden mittels Matrix-assistierter Laser-Desorptions/Ionisations Massenspektrometrie (MALDI-MS) anhand ihrer eindeutigen Masse nachgewiesen werden und damit der Sequenzkontext aller oder eines Teils der in den amplifizierten Fragmenten enthaltenen CpG Dinukleotide oder CpNpG Trinukleotide entschlüsselt wird.

24. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Amplifikation wie beschrieben in Schritt b) des Anspruchs 1 durch eine Polymerase Kettenreaktion ausgeführt wird, in der die Größe der amplifizierten Fragmente mittels auf weniger als 30 s verkürzter Kettenverlängerungsschritte begrenzt wird.

25. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß nach der Amplifikation gemäß Schritt b) des Anspruchs 1 die Produkte durch Gelelektrophorese aufgetrennt werden und die Fragmente, die kleiner als 2000 Basenpaare oder kleiner als ein beliebiger Grenzwert unterhalb von 2000 Basenpaaren sind, durch Ausschneiden von den anderen Produkten der Amplifikation vor der Auswertung gemäß Schritt c) des Anspruchs 1 abgetrennt werden.

26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß nach der Abtrennung von Amplifikaten bestimmter Größe diese vor der Durchführung des Schrittes c) des Anspruchs 1 nochmals amplifiziert werden.

27. Kit, enthaltend mindestens zwei Primerpaare, Reagenzien und Hilfsstoffe für die Amplifikation und/oder Reagenzien und Hilfsmittel für die chemische Behandlung gemäß Anspruch 1a) und/oder eine kombinatorische Sondenbibliothek und/oder einen Oligonukleotid-Array (DNA-Chip), soweit sie für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erforderlich oder dienlich sind.