BR112013001136B1 - Processos de análise para a presença de um marcador de câncer, do estágio da doença ou da eficácia de um tratamento de câncer, e dispositivo para diagnóstico de câncer - Google Patents
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Abstract
processo de análise de uma amostra de sangue de um sujeito para a presença de um marcador de doença. a presente invenção refere-se a um processo de análise de uma amostra de sangue de um sujeito para a presença de um marcador de doença, o dito processo compreendendo as etapas de a) extração de ácido nucléico de células de sangue anucleadas na dita amostra de sangue para prover uma fração de ácido nucléico extraída com células de sangue anucleadas, e b) análise de dita fração de ácido nucléico de células de sangue anucleadas para a presença de um marcador de doença, onde o dito marcador de doença é uma mutação específica de doença em um gene de uma célula do dito sujeito, ou onde o dito marcador de doença é um perfil de expressão específico de doença de genes de uma células do dito sujeito.
Description
[001]A invenção está no campo de diagnósticos médicos, em particular no campo de diagnósticos e monitoramentos de doença. A invenção é direcionada a marcadores para a detecção de doença, a processos para detecção de doença, e a um processo para determinação de eficácia de um tratamento de doença.
[002]Na prática clínica existe uma forte necessidade de se ser capaz de de-tectar doença em seus estágios mais iniciais, para prever progressão de doença, e para implementar terapia talhada para paciente.Detecção inicial de, em particular, doença neoplástica (câncer) é crítica para assegurar tratamento favorável da doença.A despeito de numerosos avanços em pesquisa médica, câncer permanece uma principal causa de morte em todo mundo.Quando pacientes procuram tratamento, eles genericamente estão exibindo sintomas de metástases distantes, significando que muito frequentemente o câncer é detectado muito tarde.
[003]Câncer de pulmão, próstata, mama, e cólon são os tumores mais co-muns, e de modo a facilitar apropriada ação remediadora através de ressecção ci-rúrgica, radioterapia, quimioterapia, ou outros processos de tratamento conhecidos existe uma necessidade de processos rápidos e simples para os diagnósticos iniciais de câncer. A disponibilidade de bons processos diagnósticos para câncer também é importante para avaliação de respostas do paciente para tratamento, ou para avaliar recorrência devida a novo crescimento no sítio original ou metástase.
[004]Vários tipos de marcadores de câncer, tais como, por exemplo, produtos de oncogene, fatores de crescimento e receptores de fator de crescimento, fatores angiogênicos, proteases, fatores de adesão e produtos de gene supressor de tumor, etc., são presentemente conhecidos e não somente são considerados essenciais para diagnóstico inicial, mas também para diagnóstico diferencial de pacientes com anormalidades clínicas incertas como para distinção de anormalidades malignas de benignas; para previsão de probabilidade de resposta em um particular paciente com doença estabelecida para um selecionado processo terapêutico de tratamento; e para provimento de informação com relação a risco, presença, status, ou comportamento futuro da doença em um sujeito humano ou animal. Atualmente, a habilidade para detectar e diagnosticas câncer através de detecção de tumor ou marcadores de câncer é uma área de crescente interesse e como uma conseqüên- cia existe uma necessidade de processos reproduzíveis e confiáveis de identificação de novos e mais úteis marcadores de câncer em espécimes de pacientes.
[005]Glioblastoma é o tipo mais comum e mais agressivo de tumor de cérebro primário em humanos. A doença é difícil de diagnosticar e mesmo mais dura de tratar devido, em parte, à barreira de sangue - cérebro que impede a liberação de agentes terapêuticos e detecção de marcadores diagnósticos potencialmente importantes. Marcadores diagnósticos para glioblastoma são disponíveis, mas são específicos para o próprio tecido de tumor e requerem uma amostra de tumor.
[006]Aperfeiçoados processos de seleção e detecção são necessários de modo a detectar-se câncer em uma fase inicial e seguir a progressão da doença. No caso de câncer nós estamos em um estado onde nós não somente precisamos de-tectar o tumor, mas também precisamos detecta-lo antes dele atingir o ponto sem retorno, onde o tratamento se torna paliativo ao invés de curativo. Pessoas em risco, assim como pacientes com câncer recorrente, devem ser monitoradas extensiva-mente. Além disso, uma vez que tumores podem responder diferentemente para di-ferentes compostos terapêuticos, estratificação de pacientes está tornado-se de im-portância.
[007]Análise genética usando biópsias de tumores permitiu a identificação de muitas mutações que são úteis para diagnóstico do câncer assim como a surgimento de estratégias de estratificação de pacientes. Entretanto, uma desvantagem de atuais análises genéticas de tumores é a necessidade de biópsias de tumor, as quais são frequentemente impossíveis de dissecar de pacientes. Além disso, o uso de biópsias é estático e não permite monitoramento genético de progressão ou recorrência de tumor com o tempo. Além disso, muitos tumores são heterogêneos, resultando em potencial caracterização genética falso - positivo ou falso - negativo de biópsias de tais tumores.
[008]Recentemente, o uso de células circulantes de tumor para diagnóstico e monitoramento de progressão e recorrência de tumor mostrou o uso de sangue como uma fonte de material derivado de tumor, notavelmente fragmentos de tecidos na forma de células. Entretanto, o uso de células de tumor circulantes é ineficiente para maioria dos cânceres.
[009]Em geral, um marcador de doença é definido como um composto do qual a concentração é alterada preferivelmente elevada, em um fluido biológico de um paciente adoentado quando comparada a um sujeito saudável normal, e que po-de ser usado como um composto marcador indicativo de uma doença. Ainda, a iden-tificação de específicos compostos, por exemplo, proteínas, em vários fluidos de corpo como marcadores de doença, tal como câncer, tem sido dificultada pela falta de apropriadas técnicas para a mesma.
[0010]Também no caso de outras doenças que não câncer, marcadores po-dem ser disponíveis que são de difícil detecção.Isto dificulta diagnóstico inicial da doença.
[0011]A presente invenção objetiva superar o problema da técnica anterior de que nem todos os tecidos adoentados ou tipos de doença (por exemplo, tumores) resultam em células de doença circulantes (por exemplo, células de tumor circulan-tes). A presente invenção também objetiva superar o problema de que marcadores de proteína para detecção de doenças como câncer são de difícil detecção. Ainda, a presente invenção objetiva prover processos que não requerem biópsias, e permitam extensivo monitoramento de pacientes.
[0012]A presente invenção em um primeiro aspecto provê um processo de análise de uma amostra de sangue de um sujeito para a presença de um marcador de doença, o dito processo compreendendo as etapas de a) extração de ácido nu- cléico de células de sangue anucleadas, preferivelmente trombócitos, na dita amos-tra de sangue para prover uma fração de ácido nucléico extraído de célula de sangue anucleada, e b) análise da dita fração de ácido nucléico extraída de célula de sangue anucleada para a presença de um marcador de doença, onde o dito marca-dor de doença é uma mutação específica de doença em um gene de uma célula nu- cleada do dito sujeito, ou onde o dito marcador de doença é um perfil de expressão específico de doença de genes de uma célula nucleada do dito sujeito.
[0013]O termo “célula de sangue anucleada” como aqui usado refere-se a uma célula que carece de um núcleo. O termo inclui referência a ambos, eritrócito e trombócito. Realizações preferidas de células anucleadas em aspectos desta inven-ção são trombócitos. O termo “célula de sangue anucleada” preferivelmente não in-clui referência a células que carecem de um núcleo como um resultado de divisão defeituosa de célula.
[0014]O termo “célula nucleada”como aqui usado refere-se a uma célula tendo um núcleo. O termo inclui referência a células somáticas, células germe e cé-lulas troncos, e pode incluir células do cólon, pâncreas, cérebro, bexiga, mama, próstata, pulmão, ovário, útero, fígado, rim, baço, timo, tiróide, tecido de nervo, tecido conjuntivo, sangue, tecido epitelial, nodo linfático, osso, músculo e tecidos de pele. A célula nucleada é preferivelmente uma célula de um tecido adoentado.
[0015]Assim, a presente invenção é genericamente alvejada na análise de ácidos nucléicos que foram transferidos de células que têm um núcleo para células que não têm núcleo, onde as células que não têm núcleo podem ser facilmente iso-ladas a partir da corrente sanguínea e contêm ácido nucléico das células nucleadas.
[0016]O termo “núcleo” refere-se à organela encerrada por membrana en-contrada em células eucarióticas que contem maior parte do material genético da célula organizado na forma de cromossomos. Os genes dentro dos cromossomos são o genoma nuclear da célula. O interior do núcleo contém um número de corpos subnucleares incluindo o nucléolo compreendendo RNA, que está principalmente envolvido na montagem de ribossomas compreendendo RNA. Após serem produzi-dos no nucléolo, ribossomas são exportados para o citoplasma onde eles traduzem mRNA.
[0017]Uma fração de ácidonucléico extraída de célula do sangue anucleada preferivelmente refere-se a uma fração compreendendo DNA cromossômico, RNA ribossômico, RNA de nucléolo, e/ou RNA mensageiro.
[0018]O termo “gene” como aqui usado, e em particular na frase “mutação em um gene de uma célula nucleada” é pretendido referir-se a qualquer seqüência de ácidos nucléicos, ambos, cromossômica e extra-cromossômica, de uma célula nucleada (somática), preferivelmente uma seqüência de ácidos nucléicos nuclear, e pode incluir seqüências transcritas e não-transcritas assim como seqüências de RNA ribossômico, mais preferivelmente seqüências cromossômicas que são transcritas em RNA.
[0019]Em uma realização preferida de um processo da invenção a dita mu-tação específica de doença está em um gene cromossômico.
[0020]Em uma outra realização preferida, o dito gene não é um gene de um célula de sangue anucleada.
[0021]Em uma realização preferida de um processo da invenção o dito perfil de expressão específico de doença é o perfil de expressão de genes cromossômicos.Em particular de genes cromossômicos de uma célula nucleada o mRNA da qual está presente em um trombócito.
[0022]Em uma outra realização preferida de um processo da invenção o dito ácido nucléico é ácido ribonucléico (RNA), mais preferivelmente ácido ribonucléico mensageiro (mRNA).
[0023]Em uma realização preferida de um processo da invenção o dito ácido nucléico não é mtDNA.Portanto, ácido nucléico mitocondrial preferivelmente não é um aspecto da presente invenção.
[0024]Em uma outra realização preferida de um processo de análise de uma amostra de sangue de acordo com a invenção a dita etapa b) de análise da dita fra-ção de ácido nucléico extraída de célula de sangue anucleada para a presença de um marcador de doença compreende a amplificação seletiva de: i)a dita mutação através de amplificação de reação de cadeia de transcrip-tase polimerase reversa usando pelo menos um iniciador ou sonda de amplificação específica de mutação de ácido nucléico, ou ii)uma pluralidade de mRNAs através de amplificação de reação de cadeia transcriptase polimerase reversa para determinar o nível de expressão dos genes cromossômicos codificando os ditos mRNAs para pelo que prover um perfil de ex-pressão para os ditos genes e comparando o dito perfil de expressão a um perfil re-ferência.
[0025]A amostra de sangue está preferivelmente fora do corpo.
[0026]Em uma realização preferida de um processo da invenção a doença é selecionada do grupo consistindo em câncer, doença autoimune, doenças de pele, doença do olho, doenças endócrinas, distúrbios neurológicos, e doenças cardiovas-culares.
[0027]Em uma outra realização preferida de um processo da invenção a dita doença é selecionada do grupo consistindo em doença autoimune, doenças da pele, doença do olho, doenças endócrinas, distúrbios neurológicos, e doenças cardiovas-culares.
[0028]Em uma outra realização preferida de um processo da invenção a dita doença é câncer.
[0029]Ainda em uma outra realização preferida de um processo da invenção o dito câncer é um câncer de tumor sólido, preferivelmente selecionado de cólon, pâncreas, cérebro, bexiga, mama, próstata, pulmão, ovário, útero, fígado, rim, baço, timo, tiróide, tecido de nervo, tecido epitelial, nódulo linfático, osso, músculo e pele.
[0030]Em realizações preferidas de aspectos da invenção a doença autoi- mune é selecionada do grupo consistindo em hepatite crônica ativa autoimune aclo- ridria; encefalomielite disseminada aguda; leucoencefalite hemorrágica aguda; do-ença de Addison; agama globulinemia; Alopecia areata; esclerose lateral amiotrófica; espondilite ancilosante; nefrite anti-GBM/TBM; síndrome antifosfolipídeo; artrite poli- articular; alergia tópica; dermatite atópica; anemia aplástica autoimune; cardiomiopa- tia autoimune; enteropatia autoimune; anemia hemolítica autoimune; hepatite autoi- mune; doença de ouvido interno autoimune; síndrome linfoproliferativa autoimune; neuropatia periférica autoimune; pancreatite autoimune; síndrome poliendócrina au- toimune; dermatite de progesterona autoimune; púrpura trombocitopênica autoimu- ne; uveíte autoimune; doença Balo / esclerose concêntrica Balo; síndrome de Be-chets; doença de Berger; encefalite Bickerstaff; síndrome Blau; penfigóide bulosa; doença de Castleman; doença Celíaca; doença de Chagas; síndrome de disfunção imune de fadiga crônica; polineuropatia desmielinante inflamatória crônica; oste- omielite multifocal recorrente crônica; doença de lyme crônica; doença pulmonar obstrutiva crônica; síndrome de Churg-Strauss; penfigóide cicatricial; doença coelía- ca; síndrome Cogan; doença de aglutinina resfriado; deficiência de componente complemento 2; arterite cranial; síndrome CREST; doença de Crohn; síndrome de Cushing; angiite leucocitoclástica cutânea; doença de Dego; doença de Dercum; dermatite herpetiformis; dermatomiosite; diabetes mellitus tipo 1; esclerose sistêmica cutânea difusa; síndrome de Dressler; lupus eritematoso discóide; eczema; endome- triose; artrite relacionada com entesite; fascite eosinofílica; gastroenterite eosinofí- lica; epidermólise bulosa adquirida; eritema nodosum; crioglobulinemia mista essen-cial; síndrome de Evan; fibrodisplasia ossificante progressiva; fibromialgia / fibromio- site; aveolite fibrosante; gastrite; penfigóide gastrointestinal; arterite de célula gigan-te; glomerulonefrite; sondrome de Goodpasture; doença de Grave; síndrome de Guil- lain-Barré; encefalite de Hashimoto; tiroidite de Hashimoto; anemia hemolítica; púr-pura Henoch-Schonlein; Herpes gestationis; hidradenite supurativa; síndrome Hughes; hipogamaglobulinemia; doenças desmielinantes inflamatórias idiopáticas; fibrose pulmonar idiopática; púrpura trombocitopênica idiopática; nefropatia IgA; mi- osite de corpo de inclusão; polineuropatia desmielinante inflamatória; cistite intersti-cial; síndrome de intestino irritável (IBS); artrite idiopática juvenil; artrite reumatóide juvenil; doença de Kawasaki; síndrome miastênica de Lambert-Eaton; vasculite leu- cocitoclástica; Lichen planus; Lichen sclerosus; doença de IgA linear; doença de Lou Gehrig; hepatite lupóide; lupus eritematoso; síndrome Majeed; doença de Ménière; poliangiite microscópica; síndrome Miller-Fisher; doença de tecido conjuntivo misto; morféia; doença Mucha-Habermann; síndrome Muckle-Wells; mieloma múltiplo; es-clerose múltipla; myasthenia gravis; miosite; narcolepsia; neuromielite ótica; neu- romiotonia; penfigóide cicatricial ocular; síndrome psoclonus myoclonus; tiroidite ord; reumatismo palindrômico; PANDAS; degeneração cerebelar paraneoplástica; hemo- globinúria noturna paroxismal; síndrome Parry Romberg; síndrome Parsonnage- Turner; Pars planitis; pênfigo; pênfigo vulgaris; anemia perniciosa; encéfalomielite perivenosa; síndrome POEMS; poliarterite nodosa; polimialgia reumática; polimiosite; cirrose biliar primária; colangite esclerosante primária; neuropatia inflamatória pro-gressiva; psoríase; artrite psoriática; pioderma gangranosum; aplasia de célula ver-melha pura; encefalite de Rasmussen; fenômeno Raynaud; policondrite recorrente; síndrome de Reiter; síndrome de perna sem descanso; fibrose retroperitoneal; artrite reumatóide; febre reumatóide; sarcoidose; esquizofrenia; síndrome Schmidt; sín- drome Schnitzler; esclerite; escleroderma; síndrome de Sjogren; espôndilo artropa- tia; síndrome de sangue pegajoso; doença de Still; síndrome pessoal Stiff; endocar- dite bacteriana subaguda (SBE); síndrome de Susac; síndrome Sweet; Coréia Syde-nham; oftalmia simpatética; arterite Takayasu; arterite temporal; síndrome Tolosa- Hunt; mielite transversa; colite ulcerativa; doença de tecido conjuntivo não- diferenciada; espondiloartropatia não-diferenciada; vasculite; vitiligo; granulomatose de Wegener; síndrome de Wilson; e síndrome Wiskott-Aldrich.
[0031]Em outras realizações preferidas de aspectos da invenção a doença de pele é selecionada do grupo consistindo em erupções acneiformes; síndromes autoinflamatórias; vesiculação crônica; condições das membranas de mucosa; con-dições de apêndices de pele; condições da gordura subcutânea; anomalias congêni-tas; doenças de tecido conjuntivo (tais como anormalidades de tecido elástico e fi-broso dérmico); crescimentos dérmicos e subcutâneos; dermatite (incluindo dermatite atópica, dermatite de contato, eczema, dermatite pustular, e dermatite seborréica); distúrbios de pigmentação; erupções de droga; doença de pele relacionada- endócrina; eosinofílica; nevi epidérmica, neoplasmas, cistos; eritemas; genoderma- toses; doença de pele relacionada com infecção; erupções Lichenóides; doença de pele relacionada com linfóide; nevi melanocítica e neoplasmas (incluindo melano-ma); doença de pele relacionada com monócito e macrófago; mucinoses; neurocu- tâneas; doença de pele relacionada com imunodeficiência não-infecciosa; doença de pele relacionada com nutrição; papuloescamoso hiperceratótico (incluindo cerato- dermas palmoplantares); doença de pele relacionada com gravidez; prurítica; psorí- ase; neutrofílica reativa; erupções palmoplantares recalcitrantes; resultantes de erros em metabolismo; resultantes de fatores físicos (incluindo induzida por radiação ioni- zante); urticária e angioedema; doença de pele relacionada - vascular.
[0032]Em outras realizações preferidas de aspectos da invenção a doença endócrina é selecionada do grupo consistindo em distúrbios adrenais; distúrbios de homeostase de glicose; distúrbios de tiróide; distúrbios de homeostase de cálcio e doença de osso metabólica; distúrbios de glândula pituitária; e distúrbios de hormô-nio de sexo.
[0033]Em outras realizações preferidas de aspectos da invenção a doença de olho é selecionada do grupo consistindo em distúrbios H00-H06 de pálpebras, sistema lacrimal e órbita; distúrbios H10-H13 de conjuntiva; distúrbios H15-H22 de esclera, córnea, íris e corpo ciliar; distúrbios H25-H28 de lente; distúrbios H30-H36 de coróide e retina (incluindo inflamação corio-retinal H30, outros distúrbios H31 de coróide, distúrbios corio retinais H32 em doenças classificadas em outro lugar, des-colamentos e ruptura de retina H33, oclusões vasculares de retina H34, outros dis-túrbios de retina H35, e distúrbios de retina H36 em doenças classificadas em outro local); glaucoma H40-H42; distúrbios H43-H45 de corpo vítreo e globo; distúrbios de nervo ótico e caminhos visuais H46-H48; distúrbios H49-H52 de músculos oculares, movimento binocular, acomodação e refração; distúrbios visuais e cegueira H53- H54.9; e outros distúrbios H55-H59 de olho e anexos.
[0034]Em outras realizações preferidas de aspectos da invenção o distúrbio neurológico é selecionado do grupo consistindo em Abarognose; afasia epileptiforme adquirida; encéfalomielite disseminada aguda; adrenoleucodistrofia; agênese do corpus callosum; agnosia; síndrome Aicardi; doença Alexandre; síndrome de mão Alien; aloquiria; doença de Alper; hemiplegia alternante; mal de Alzheimer; esclerose lateral amiotrófica (ver Doença de Neurônio Motor); anencefalia; síndrome Angelman; angiomatose; anoxia; afasia; apraxia; cistos aracnóides; aracnoidite; má formação Arnold-Chiari; má formação arteriovenosa; ataxia telangiectasia; distúrbio de hiperatividade de déficit de atenção; distúrbio de processamento auditivo; disfunção autonômica; dor nas costas; doença Batten; doença de Behcet; paralisia de Bell; ble- faroespasmo essencial benigno; hipertensão intracranial benigna; polimicrogiria frontoparietal bilateral; doença de Binswanger; blefaroespasmo; síndrome Bloch- Sulzberger; dano de plexo braquial; abscesso de cérebro; dano de cérebro; tumor de cérebro; síndrome Brown-Séquard; doença Canavan; síndrome de túnel carpal; cau- salgia; síndrome de dor central; mielinolise pontina central; miopatia centronuclear; distúrbio cefálico; aneurisma cerebral; arteriosclerose cerebral; atrofia cerebral; gigantismo cerebral; paralisia cerebral; vasculite cerebral; estenose espinhal cervical; doença Charcot-Marie-Tooth; má formação Chiari; Coréia; síndrome de fadiga crônica; polineuropatia desmielinante inflamatória crônica (CIDP); dor crônica; síndrome Coffin Lowry; coma; síndrome de dor regional complexa; neuropatia de compressão; diplegia facial congênita; degeneração corticobasal; arterite cranial; crânio sinostose; doença Creutzfeldt-Jakob; distúrbios de trauma cumulativo; síndrome de Cushing; doença de corpo de inclusão citomegálico (CIBD); infecção com citomegalovírus; síndrome Dandy-Walker; doneça Dawson; síndrome De Morsier; paralisia Dejerine- Klumpke; doença Dejerine-Sottas; síndrome de fase de sono retardada; demência; dermatomiosite; dispraxia desenvolvimental; neuropatia diabética; esclerose difusa; síndrome Dravet; disautonomia; discalculia; disgrafia; dislexia; distonia; síndrome Empty sella; encefalite; encefalocelo; angiomatose encéfalotrigeminal; encoprese; epilepsia; paralisia de Erb; eritromelalgia; tremor essencial; doença de Fabry; sín- drome de Fahr; debilidade; paralisia espástica familiar; ataques febris; síndrome Fis-her; ataxia de Friedreich; fibromialgia; doença de Gaucher; síndrome de Gerstmann; arterite de célula gigante; doença de inclusão de célula gigante; leucodistrofia de célula globóide; heterotopia de matéria cinza; síndrome de Guillain-Barré; meilopatia associada com HTLV-1; doença Hallervorden-Spatz; dano de cabeça; dor de cabeça; espasmo hemifacial; paraplegia espástica hereditária; heredopatia atática poli- neuritiforme; herpes zoster ótico; herpes zoster; síndrome Hirayama; holoprosence- falia; doença de Huntington; hidranencefalia; hidrocéfalo; hipercortisolismo; hipoxia; encéfalomielite mediada - imune; miosite de corpo de inclusão; incontinência pig- menti; doença de estocagem de ácido ftânico infantil; doença Refsum infantil; es-pasmos infantis; miopatia inflamatória; cisto intracranial; hipertensão intracranial; síndrome Joubert; síndrome Karak; síndrome Kearns-Sayre; doença Kennedy; sín- drome Kinsbourne; síndrome Klippel Feil; doença Krabbe; doença Kugelberg - We-lander; Kuru; doença Lafora; síndrome miastênica Lambert-Eaton; síndrome Landau- Kleffner; síndrome medular lateral (Wallenberg); incapacidades de aprendizado; do-ença de Leigh; síndrome Lennox-Gastaut; síndrome Lesch-Nyhan; leucodistrofia; demência de corpo Lewy; lissencefalia; síndrome de fechado-em; doença de Lou Gehrig (ver doença de neurônio motor); doença de disco lombar; estenose espinhal lombar; doença Lyme; seqüelas neurológicas; doença de Machado-Joseph (ataxia espinocerebelar tipo 3); macrencefalia; macropsia; megalencefalia; síndrome de Melkersson-Rosenthal; doença Menieres; meningite; doença Menkes; leucodistrofia metacromática; microcefalia; micropsia; enxaqueca; síndrome Miller Fisher; mini- acidente vascular cerebral (ataque isquêmico transiente); miopatia mitocondrial; sín- drome Mobius; amiotrofia monomélica; doença de neurônio motor; distúrbio de habi-lidade motora; doença moyamoya; mucopolissacaridoses; demência multi-infarto; neuropatia motora multifocal; esclerose múltipla; atrofia de sistema múltiplo; distrofia muscular; encéfalomielite miálgica; miastenia gravis; esclerose difusa mielinoclásti- ca; encéfalopatia mioclônica de crianças; mioclonus; miopatia; miopatia miotubular; miotonia congênita; narcolepsia; neurofibromatose; síndrome maligna neuroléptica; manifestações neurológicas de AIDS; seqüelas neurológicas de lupus; neuromioto- nia; lipofuscinose ceróide neuronal; distúrbios de migração neuronal; doença Nie-mann-Pick; síndrome sono-acordar não-24 horas; distúrbio de aprendizado não- verbal; síndrome O’Sullivan-McLeod; neuralgia occipital, seqüência disrafismo espi-nhal oculto; síndrome Ohtahara; atrofia olivopontocerebelar; síndrome Opsoclonus mioclonus; neurite ótica; hipotensão ortostática; síndrome de Overuse; palinopsia; parestesia; mal de Parkinson; paramiotonia congênita; doenças paraneoplásticas; ataques paroxismais; síndrome Parry-Romberg; doença de Pelizaeus-Merzbacher; paralisias periódicas; neuropatia periférica; estado vegetativopersistente; distúrbios desenvolvimentais pervasivos; reflexo de espirro fótico; doença de estocagem de ácido fitânico; doença de Pick; nervo beliscado; tumores de pituitária; PMG; pólio; polimicrogiria; polimiosite; porencefalia; síndrome pós-pólio; neuralgia pós-herpética (PHN); encéfalomielite pós-infecciosa; hipotensão postural; síndrome Prader-Willi; esclerose lateral primária; doenças príon; atrofia hemifacial progressiva; leucoencé- falopatia multifocal progressiva; paralisia supranuclear progressiva; pseudotumor cerebri; raiva; síndrome Ramsay-Hunt (Tipo I e Tipo II); encefalite de Rasmussen; distrofia neurovascular de reflexo; doença Refsun; distúrbios de movimento repetiti-vo; dano de tensão repetitiva; síndrome de pernas sem descanso; mielopatia asso-ciada com retrovírus; síndrome Rett; síndrome de Reye; distúrbio de movimento rít-mico; síndrome Romberg; Saint Vitus dance; doença Sandhoff; esquizofrenia; doen-ça de Schilder; esquizencefalia; disfunção de integração sensorial; displasia septo- ótica; síndrome de bebê agitado; herpes zoster; síndrome Shy-Drager; síndrome de Sjogren; apnéia de sono; doença de sono; snatiation; síndrome Sotos; espasticida- de; espinha bífida; dano de cordão espinhal; tumores de cordão espinhal; atrofia muscular espinhal; ataxia espinocerebelar; síndrome Steele-Richardson-Olszewski; síndrome pessoa-Stiff; síndrome Sturge-Weber; panencefalite esclerosante subagu- da; encéfalopatia arteriosclerótica subcortical; siderose superficial; coréia de Syde-nham; síncope; sinestesia; siringomielia; síndrome de túnel Tarsal; discinesia tardia; cisto Tarlov; doença Tay-Sachs; arterite temporal; tétano; síndrome de cordão espi-nhal preso; doença Thomsen; síndrome de saída torácica; Tic Douloureux; paralisia de Todd; síndrome Tourette; encéfalopatia tóxica; ataque isquêmico transiente; en- céfalopatias espongiformes transmissíveis; mielite transversa; dano de cérebro traumático; tremor; neuralgia trigeminal; paraparese espástica tropical; tripanosomí- ase; esclerose tuberosa; doença Von Hippel-Lindau; encéfalomielite Viliuisk; síndro- me de Wallenberg; doença Werdnig-Hoffman; síndrome West; Whiplash; síndrome Williams; doença de Wilson; e síndrome Zellweger.
[0035]Em outras realizações preferidas de aspectos da invenção a doença cardiovascular é selecionada do grupo consistindo em aneurisma; angina; ateroscle- rose; acidente vascular cerebral; doença cérebrovascular; insuficiência cardíaca congestiva; doença de artéria coronária; infartação miocardial (ataque cardíaco); e doença vascular periférica.
[0036]Em um outro aspecto, a presente invenção provê um processo de di-agnóstico de uma doença em um sujeito usando o processo de análise de uma amostra de sangue de acordo com a invenção. Portanto, em uma outra realização preferida de um processo da invenção, o dito processo de análise de uma amostra de sangue de acordo com a invenção é parte de um processo de diagnóstico de doença em um sujeito, e onde a presença de dita marcador de doença na dita fração de ácido nucléico extraído de célula do sangue anucleada é indicativa de que o dito sujeito está sofrendo da dita doença.
[0037]Em um outro aspecto, a presente invenção provê um processo para determinação de eficácia de um tratamento de doença em um sujeito, compreen-dendo as etapas de: -análise de uma amostra de sangue de um sujeito para a presença de um marcador de doença usando o processo de análise de uma amostra de sangue de acordo com a invenção em um primeiro ponto de tempo para através do que prover um primeiro valor para o nível de dito marcador de doença no dito sujeito; -análise de uma amostra de sangue do dito sujeito para a presença de um marcador de doença usando o processo de análise de uma amostra de sangue de acordo com a invenção em um segundo ponto de tempo que é anterior ou posterior, preferivelmente posterior, ao dito primeiro ponto de tempo, para pelo que prover um segundo valor para o nível do dito marcador de doença no dito sujeito, onde o dito sujeito foi submetido a um tratamento de doença entre o dito primeiro e segundo pontos de tempo, e -comparação de ditos primeiro e segundo valores para determinar a eficácia do dito tratamento de doença no dito sujeito.
[0038]Aqueles versados na técnica entenderão que tratamento antes do pri-meiro ponto de tempo e subseqüentes medidas em um segundo, posterior, ponto de tempo sem qualquer tratamento de doença tendo ocorrido entre os ditos pontos de tempo, é incluído em aspectos da invenção para determinação de eficácia de um tratamento de doença.
[0039]Em um outro aspecto, a presente invenção provê um processo para determinação de estágio de doença. De modo a determinar o estágio de doença, é benéfico correlacionar valores de marcador de doença como determinados através de processos desta invenção a estágios de doença. Uma medição simples do mar-cador de doença então pode ser comparada a um ou mais valores de referência para obtenção de uma indicação do estágio da doença.
[0040]Em um outro aspecto, a presente invenção provê um processo para determinação de estágio de doença em um sujeito, compreendendo as etapas de: -análise de uma amostra de sangue em um sujeito para a presença de um marcador de doença usando o processo de análise de uma amostra de sangue de um sujeito para a presença de um marcador de doença de acordo com a presente invenção para pelo que prover um valor teste para o nível de dito marcador de doen-ça no dito sujeito. -provimento de um valor referência para o nível de dito marcador de doença onde o dito valor referência é correlacionado a um particular estágio de doença, e -comparação de dito valor teste e valor referência para determinar o estágio de doença no dito sujeito. Ainda em um outro aspecto, a presente invenção provê um kit de partes adaptado para realização de um processo da invenção como descrito acima, o kit compreendendo um material de embalagem que compreende pelo menos um de: -um recipiente para manter células anucleadas de sangue, preferivelmente trombócitos, separadas de uma amostra de sangue; -um agente para extração de ácido nucléicos das ditas células de sangue anucleadas; -um agente para amplificação seletiva a partir dos ditos ácidos nucléicos ex-traídos das ditas células anucleadas de sangue de um marcador específico de do-ença como aqui descrito acima, tal como uma mutação específica de doença em um gene de uma célula nucleada de um sujeito ou um perfil de expressão específico de doença de ácido nucléico a partir de uma célula nucleada do dito sujeito, por exem-plo, através de amplificação de reação de cadeia polimerase transcriptase reversa, e -instruções impressas ou eletrônicas para realização de um processo da in-venção como descrito acima, o kit ainda compreendendo: -uma referência para o dito marcador de doença, onde a dita referência é indicativa para a presença ou ausência de dito marcador de doença na dita fração de ácido nucléico extraída de células de sangue anucleadas.
[0041]Em uma realização preferida de um kit de acordo com a presente in-venção a dita referência é um valor referência para o nível de ácidos nucléicos com-preendendo a dita mutação específica de doença em células de sangue anucleadas em um sujeito controle saudável ou em um sujeito controle sofrendo de doença, ou onde a dita referência é um perfil de expressão de referência, por exemplo, para uma pluralidade de mRNAs em células de sangue anucleadas de um sujeito controle saudável ou de um sujeito controle sofrendo de doença.
[0042]Em uma outra realização preferida de um kit de acordo com a presente invenção o dito agente ou instrução é selecionado de uma partícula ou anticorpo de célula de sangue anti-anucleada marcada com um marcador fluorescente (prefe-rivelmente um anticorpo anti-trombócito marcado com um marcador fluorescente), uma instrução para isolamento de células de sangue anucleadas baseado em péro-las (preferivelmente isolamento de trombócitos), uma instrução para recuperação de célula anucleada de sangue (preferivelmente tr4ombócito) por centrifugação, ou se-leção negativa de componentes de célula não-anucleada de sangue (preferivelmente componentes não-trombócitos).
[0043]Ainda em um outro aspecto, a presente invenção provê um dispositivo para diagnóstico de doença, o dispositivo compreendendo um suporte e pelo menos um agente para determinação específica de um nível e/ou atividade de pelo menos um ácido nucléico mutante em uma amostra de células anucleadas de sangue do sujeito, o dito agente sendo ligado ao dito suporte, e um meio legível em computador tendo instruções executáveis em computador para realização de um processo da invenção como descrito acima.
[0044]Em uma realização preferida de um dispositivo de acordo com a pre-sente invenção, o dito pelo menos um agente é sonda oligonucleotídeo ou iniciador de sequenciamento.
[0045]Em uma realização preferida de um dispositivo de acordo com a pre-sente invenção, o dispositivo compreende um dispositivo de fluxo lateral, um bastão de imersão (dipstick) ou um cartucho para realização de uma reação de hibridização de ácido nucléico entre um ácido nucléico extraído de células de sangue anucleadas e pelo menos uma sonda de oligonucleotídeo ou iniciador de amplificação específico de mutação de ácido nucléico, ou entre um ácido nucléico extraído de células anu- cleadas de sangue e uma pluralidade de sondas oligonucleotídeos ou iniciadores de amplificação específicos de gene para provimento de um perfil de expressão de gene específico de doença.
[0046]A Figura 1 mostra perfis de RNA como analisados usando um Agilent Bioanalyzer Picochip (Agilent Technologies, Inc.), como comprimento do RNA (em número de nucleotídeos) no eixo-X, e a quantidade de RNA (em unidades de fluo-rescência) sobre o eixo-Y. Aqui mostrado, RNA derivado de microvesículas na fração de soro de sangue (esquerda), RNA derivado de microvesículas na fração de plasma do sangue (meio) ou RNA derivado de trombócitos (direita). É mostrado que 1) RNA está presente em microvesículas em soro e plasma e em trombócitos, 2) microvesículas isoladas de amostras de plasma contêm menos RNA que microvesí- culas isoladas de amostras de soro, e 3) trombócitos isolados de amostras de plasma contêm RNAs de vários tamanhos, incluindo frações importantes de cadeias de RNA relativamente longas (>200 nucleotídeos (nt), e mesmo > 1000 nucleotídeos).
[0047]A Figura 2 mostra as verificações de material genético derivado de tumor encontrado em trombócitos de pacientes com tumores de cérebro.Amostras de sangue de pacientes (P1-14) foram tomadas (tubo de sangue integral (soro (S)) e sangue EDTA-anticoagulante (plasma (P)). Do tubo de plasma, trombócitos (T) foram coletados através de protocolo de centrifugação. Como controles, trombócitos foram coletados de indivíduos saudáveis (C1-6). Alguns pacientes carecem de amostra de soro, indicados por X na figura 2, e alguns têm amostras de plasma e soro reunidos indicados por SP na figura 2. Usando PCR nested para detecção de RNA, o mutante EGFRvIII(V3) pode ser detectado em trombócitos de 4 pacientes de glioblastoma de total de 15 (27%) (P4, P5, P9, P10). Isto está em linha com a literatura publicada onde EGFRvIII mutante é verificado em 20% de gliomas de alto grau (Liu et al., 2005). Estes experimentos provêm a prova de princípio de que trombóci- tos podem ser usados como uma fonte de biomarcador para o diagnóstico de câncer através de identificação de ácidos nucléicos derivados de tumor.
[0048]Figura 3. (A) microvesídulas derivadas de glioma U87 foram marcadas com corante verde fluorescente PKH67 e incubadas com plaquetas isoladas. Após 15 e 60 minutos de incubação na presença e ausência de microvesículas as plaque-tas foram lavadas e submetidas a análise FACS de fluorescência PKH67. Em adição, as plaquetas foram manchadas e analisadas através de microscopia confocal para determinar absorção de microvesícula. RNA foi isolado de plaquetas tratadas com RNase após incubação com microvesículas sob diferentes condições. RT-PCR foi realizada para detectar RNA EGFRvIII. MV/MVEGFRvIII: microvesículas isoladas de células U87/U87-EGFRvIII. (B) RNA foi isolado de plaquetas de sujeitos controles saudáveis ou pacientes de glioma e submetido a análise RT-PCR. Correspondentes biópsias de tecido de glioma serviram como controles. PC = U87-RNA EGFRvIII; NC = H20; nd = não determinado; * indica sinal positivo. (C) RNA como em(B) foi sub-metido a arranjos de expressão de gene. Mapa térmico de biomarcadores de glioma top 30 é mostrado na esquerda. Níveis de expressão individual para os RNAs top-10 mostrados na direita. Linha tracejada = BG (fundo).
[0049]Figura 4. RNA foi isolado de plaquetas de sujeitos controles saudáveis (n = 8) e pacientes de câncer de próstata (n = 12) e submetido a análises PCA3, PSA, e GAPDH RT-PCR. * indica sinal positivo fraco.
[0050]Figura 5 mostra as seqüências sondas usadas para a detecção dos genes mostrados na Figura 3C.
[0051]Como aqui usado, o termo “câncer” refere-se a uma doença ou distúr-bio resultante da proliferação de células oncogenicamente transformadas. “Câncer” deve incluir qualquer um ou mais de uma ampla faixa de tumores benignos ou ma-lignos, incluindo aqueles que são capazes de crescimento invasivo e metástase através de um corpo humano ou animal ou uma sua parte, tal como, por exemplo, via o sistema linfático e/ou a corrente sanguínea. Como aqui usado, o termo “tumor” inclui ambos, tumores benignos e malignos ou crescimentos sólidos, não obstante que a presente invenção é particularmente direcionada ao diagnóstico ou deteção de tumores mali9gnos e cânceres sólidos. Cânceres ainda incluem, mas não são limita-dos a, carcinomas, linfomas, ou sarcomas, tais como, por exemplo, câncer de ovário, câncer de cólon, câncer de mama, câncer pancreático, câncer de pulmão, câncer de próstata, câncer do trato urinário, câncer uterino, leucemia linfática aguda, mal de Hodgkin, carcinoma de célula pequena dopulmão, melanoma, neuroblastoma, glio-ma (por exemplo, glioblastoma), e sarcoma de tecido conjuntivo, linfoma, melanoma, sarcoma, e adenocarcinoma. Em realizações preferidas de aspectos da presente invenção, câncer de trombócito é renunciado.
[0052]O termo “derivado de câncer” como aqui usado refere-se à origem de um câncer ou célula de câncer.
[0053]O termo “ácido nucléico derivado de câncer” deve ser entendido signi-ficar qualquer ácido nucléico que é indicativo de câncer no sujeito, especificamente e em realização mais preferidas um DNA ou RNA mutante indicando a presença no câncer de um gene mutante que é expresso por ou está presente em uma célula de câncer do sujeito, de cujo gene mutante a seqüência de ácido nucléico é alterada em relação ao gene normal de um sujeito controle saudável. O termo “ácido nucléico derivado de câncer” deve ser entendido incluir (i) um ácido nucléico que é produzido por, ou expresso por, ou presente em uma célula de câncer mas não em uma célula saudável (não-cancerosa) normal, ou cuja produção ou expressão é alterada (aper-feiçoada ou reduzida) por ou em uma célula de câncer comparada a uma célula normal; ou (ii) um ácido nucléico que produzido por, expresso por, ou presente em uma célula normal mas não por ou em uma célula de câncer. Portanto, o ácido nu- cléico não precisa ser um ácido nucléico mutante tendo uma seqüência que sofreu mutação mas pode ser um ácido nucléico normal tendo uma seqüência tipo selva-gem (não-câncer), mas cujo perfil ou nível de expressão está alterado em uma célula de câncer em relação a uma célula normal. Em uma realização preferida, o ácido nucléico derivado de câncer é um ácido nucléico (DNA,sDNA, ou RNA) específico para o câncer, preferivelmente um transcrito RNA. Em uma outra realização muito preferida, o ácido nucléico derivado de câncer é um perfil de expressão de ácido nu- cléico indicativo de sendo derivado de câncer ou específico de câncer, como aqui explicado em detalhes.
[0054]Como aqui usado, o termo “marcador de câncer” refere-se em particu-lar a um gene marcador de câncer ou perfil de expressão de gene marcador de cân-cer. Como aqui usado, o termo “gene marcador de câncer” refere-se a um gene cuja seqüência ou nível de expressão, sozinho ou em combinação com outros genes, está correlacionado com câncer ou prognóstico de câncer. A correlação pode referir- se a uma expressão aumentada ou diminuída do gene refletida em uma presença aumentada ou diminuída do produto de expressão de RNA de dito gene na fração de ácido nucléico obtenível de trombócitos. Por exemplo, a expressão do gene pode ser indicativa de câncer, ou falta de expressão do gene pode ser correlacionada com pobre prognóstico em um paciente de câncer. No caso de câncer de próstata AMACR, PCA3 e PSA são apropriados marcadores de câncer. No caso de câncer colo-retal mutações KRAS são apropriados marcadores de câncer. No caso de car-cinoma de pulmão mutações EGFR são apropriados marcadores de câncer. No caso de melanoma mutações BRAF são apropriados marcadores de câncer. No caso de glioma mutações EGFRvIII são apropriados marcadores de câncer. Outros apropria-dos marcadores de câncer podem ser derivados de Tabelas 1 e 2 como aqui providas ou dos Exemplos ou Figuras. Aqueles versados na técnica entenderão que muitos outros marcadores de câncer podem ser empregados em aspectos e realizações desta invenção.
[0055]Como aqui usado, o termo “estágio de câncer” refere-se a uma avalia-ção qualitativa ou quantitativa do nível de avanço de um câncer. Critérios usados para determinar o estágio de um câncer incluem, mas não são limitados a, o tama- nho do tumor, se o tumor espalhou-se para outras partes do corpo e onde o câncer espalhou-se (por exemplo, dentro do mesmo órgão ou região do corpo ou para um outro órgão).
[0056]O termo “câncer” nos termos “derivado de câncer”, “marcador de cân-cer”, “gene marcador de câncer”,, e/ou “estágio de câncer” pode ser generalizado para o termo “doença” quando as definições para câncer são genericamente aplicá-veis a todas as doenças como aqui indicadas.
[0057]O termo “derivado de doença” como aqui usado refere-se a origem de uma doença ou célula adoentada.
[0058]O termo “ácido nucléico derivado de doença” deve ser tomado significa qualquer ácido nucléico que seja indicativo de uma doença no sujeito, especifi-camente e em realizações mais rpeferidas um DNA ou RNA mutante indicando a presença na doença de um gene mutante que é expresso por ou está presente em uma célula adoentada do sujeito, de cujo gene mutante a seqüência de ácido nucléi- co é alterada em relação ao gene normal de um sujeito controle saudável. O termo “ácido nucléico derivado de doença” também de ser tomado para incluir (i) um ácido nucléico que é produzido por, expresso por, ou presente em uma célula adoentada mas não em uma célula normal saudável (não-adoentada), ou cuja produção ou ex-pressão é alterada (aperfeiçoada ou reduzida) por, ou em uma célula adoentada comparada a uma célula normal; ou (ii) um ácido nucléico que é produzido por, ex-presso por , ou presente em uma célula normal mas não por ou em uma célula ado-entada. Portanto, o ácido nucléico não precisa ser um ácido nucléico mutante tendo uma seqüência que sofreu mutação mas pode ser um ácido nucléico normal tendo uma seqüência tipo selvagem (não-câncer), mas cujo perfil ou nível de expressão está alterado em uma célula adoentada em relação a uma célula normal. Em uma realização preferida, o ácido nucléico derivado de doença é um ácido nucléico mu-tante (DNA, cDNA, ou RNA) específico para a doença, preferivelmente um transcritoRNA. Em uma outra realização muito preferida, o ácido nucléico derivado de doença é um perfil de expressão de ácido nucléico indicativo de sendo derivado de doença ou específico de doença, como aqui explicado em detalhes.
[0059]Como aqui usado o termo “marcador de doença” refere-se em particular a um gene marcador de doença ou um perfil de expressão de gene marcador de doença. Como aqui usado, o termo “gene marcador de doença” refere-se a um gene cuja sequência ou nível de expressão, sozinho ou em combinação com outros genes, é correlacionada com doença ou prognóstico da doença. A correlação pode relacionar a uma expressão aumentada ou diminuída do gene refletida em uma presença aumentada ou diminuída do produto de expressão de RNA de dito gene na fração de ácido nucléico obtenível de trombócitos. Por exemplo, a expressão do gene pode ser indicativa de uma doença, ou falta de expressão do gene pode ser correlacionada com pobre prognóstico em um paciente.
[0060]Como aqui usado, o termo “estágio de doença” refere-se a uma avali-ação qualitativa ou quantitativa do nível de avanço de uma doença. Critérios usados para determinar o estágio de uma doença incluem, mas não são limitados a, se a doença espalhou-se para outras partes do corpo e onde a doença espalhou-se (por exemplo, dentro do mesmo órgão ou região do corpo ou para um outro órgão).
[0061]O termo doença como aqui usado refere-se a câncer, doença autoi- mune, doenças da pele, doença do olho, doenças endócrinas, distúrbios neurológi-cos, e doenças cardiovasculares.
[0062]Assim, doenças que em adição a câncer podem ser detectadas usando os meios e processos da presente invenção incluem, por exemplo, as seguintes doenças autoimunes: hepatite crônica ativa autoimune acloridria; encefalomielite disseminada aguda; leucoencefalite hemorrágica aguda; doença de Addison; agama globulinemia; Alopecia areata; esclerose lateral amiotrófica; espondilite ancilosante; nefrite anti-GBM/TBM; síndrome antifosfolipídeo; artrite poliarticular; alergia tópica; dermatite atópica; anemia aplástica autoimune; cardiomiopatia autoimune; enteropa- tia autoimune; anemia hemolítica autoimune; hepatite autoimune; doença de ouvido interno autoimune; síndrome linfoproliferativa autoimune; neuropatia periférica au- toimune; pancreatite autoimune; síndrome poliendócrina autoimune; dermatite de progesterona autoimune; púrpura trombocitopênica autoimune; uveíte autoimune; doença Balo / esclerose concêntrica Balo; síndrome de Bechets; doença de Berger; encefalite Bickerstaff; síndrome Blau; penfigóide bulosa; doença de Castleman; do-ença Celíaca; doença de Chagas; síndrome de disfunção imune de fadiga crônica; polineuropatia desmielinante inflamatória crônica; osteomielite multifocal recorrente crônica; doença de lyme crônica; doença pulmonar obstrutiva crônica; síndrome de Churg-Strauss; penfigóide cicatricial; doença coelíaca; síndrome Cogan; doença de aglutinina resfriado; deficiência de componente complemento 2; arterite cranial; sín- drome CREST; doença de Crohn; síndrome de Cushing; angiite leucocitoclástica cutânea; doença de Dego; doença de Dercum; dermatite herpetiformis; dermatomio- site; diabetes mellitus tipo 1; esclerose sistêmica cutânea difusa; síndrome de Dress- ler; lupus eritematoso discóide; eczema; endometriose; artrite relacionada com ente- site; fascite eosinofílica; gastroenterite eosinofílica; epidermólise bulosa adquirida; eritema nodosum; crioglobulinemia mista essencial; síndrome de Evan; fibrodisplasia ossificante progressiva; fibromialgia / fibromiosite; aveolite fibrosante; gastrite; pen- figóide gastrointestinal; arterite de célula gigante; glomerulonefrite; sondrome de Go-odpasture; doença de Grave; síndrome de Guillain-Barré; encefalite de Hashimoto; tiroidite de Hashimoto; anemia hemolítica; púrpura Henoch-Schonlein; Herpes gesta- tionis; hidradenite supurativa; síndrome Hughes; hipogamaglobulinemia; doenças desmielinantes inflamatórias idiopáticas; fibrose pulmonar idiopática; púrpura trom- bocitopênica idiopática; nefropatia IgA; miosite de corpo de inclusão; polineuropatia desmielinante inflamatória; cistite intersticial; síndrome de intestino irritável (IBS); artrite idiopática juvenil; artrite reumatóide juvenil; doença de Kawasaki; síndrome miastênica de Lambert-Eaton; vasculite leucocitoclástica; Lichen planus; Lichen scle- rosus; doença de IgA linear; doença de Lou Gehrig; hepatite lupóide; lupus eritema- toso; síndrome Majeed; doença de Ménière; poliangiite microscópica; síndrome Miller-Fisher; doença de tecido conjuntivo misto; morféia; doença Mucha-Habermann; síndrome Muckle-Wells; mieloma múltiplo; esclerose múltipla; myasthenia gravis; miosite; narcolepsia; neuromielite ótica; neuromiotonia; penfigóide cicatricial ocular; síndrome psoclonus myoclonus; tiroidite ord; reumatismo palindrômico; PANDAS; degeneração cerebelar paraneoplástica; hemoglobinúria noturna paroxismal; sín- drome Parry Romberg; síndrome Parsonnage-Turner; Pars planitis; pênfigo; pênfigo vulgaris; anemia perniciosa; encéfalomielite perivenosa; síndrome POEMS; poliarte- rite nodosa; polimialgia reumática; polimiosite; cirrose biliar primária; colangite escle- rosante primária; neuropatia inflamatória progressiva; psoríase; artrite psoriática; pi- oderma gangranosum; aplasia de célula vermelha pura; encefalite de Rasmussen; fenômeno Raynaud; policondrite recorrente; síndrome de Reiter; síndrome de perna sem descanso; fibrose retroperitoneal; artrite reumatóide; febre reumatóide; sarcoi- dose; esquizofrenia; síndrome Schmidt; síndrome Schnitzler; esclerite; escleroderma; síndrome de Sjogren; espôndilo artropatia; síndrome de sangue pegajoso; doença de Still; síndrome pessoal Stiff; endocardite bacteriana subaguda (SBE); sín- drome de Susac; síndrome Sweet; Coréia Sydenham; oftalmia simpatética; arterite Takayasu; arterite temporal; síndrome Tolosa-Hunt; mielite transversa; colite ulcera- tiva; doença de tecido conjuntivo não-diferenciada; espondiloartropatia não- diferenciada; vasculite; vitiligo; granulomatose de Wegener; síndrome de Wilson; e síndrome Wiskott-Aldrich.
[0063]Aparte das doenças acima, aspectos da presente invenção também são aplicáveis ao prognóstico e diagnóstico das seguintes doenças de pele: erup-ções acneiformes; síndromes autoinflamatórias; vesiculação crônica; condições das membranas de mucosa; condições de apêndices de pele; condições da gordura subcutânea; anomalias congênitas; doenças de tecido conjuntivo (tais como anorma-lidades de tecido elástico e fibroso dérmico); crescimentos dérmicos e subcutâneos; dermatite (incluindo dermatite atópica, dermatite de contato, eczema, dermatite pus-tular, e dermatite seborréica); distúrbios de pigmentação; erupções de droga; doença de pele relacionada-endócrina; eosinofílica; nevi epidérmica, neoplasmas, cistos; eritemas; genodermatoses; doença de pele relacionada com infecção; erupções Li- chenóides; doença de pele relacionada com linfóide; nevi melanocítica e neoplas-mas (incluindo melanoma); doença de pele relacionada com monócito e macrófago; mucinoses; neurocutâneas; doença de pele relacionada com imunodeficiência não- infecciosa; doença de pele relacionada com nutrição; papuloescamoso hiperceratóti- co (incluindo ceratodermas palmoplantares); doença de pele relacionada com gravi-dez; prurítica; psoríase; neutrofílica reativa; erupções palmoplantares recalcitrantes; resultantes de erros em metabolismo; resultantes de fatores físicos (incluindo induzi-da por radiação ionizante); urticária e angioedema; doença de pele relacionada - vascular.
[0064]À parte das doenças acima, aspectos da presente invenção também são aplicáveis ao prognóstico e diagnóstico das seguintes doenças endócrinas: dis-túrbios adrenais; distúrbios de homeostase de glicose; distúrbios de tiróide; distúrbios de homeostase de cálcio e doença de osso metabólica; distúrbios de glândula pituitária; e distúrbios de hormônio de sexo.
[0065]À parte das doenças acimaaspectos da presente invenção também são aplicáveis ao prognóstico e diagnóstico das seguintes doenças de olho: distúrbios H00-H06 de pálpebras, sistema lacrimal e órbita; distúrbios H10-H13 de conjuntiva; distúrbios H15-H22 de esclera, córnea, íris e corpo ciliar; distúrbios H25-H28 de lente; distúrbios H30-H36 de coróide e retina (incluindo inflamação corio-retinal H30, outros distúrbios H31 de coróide, distúrbios corio retinais H32 em doenças classifi-cadas em outro lugar, descolamentos e ruptura de retina H33, oclusões vasculares de retina H34, outros distúrbios de retina H35, e distúrbios de retina H36 em doenças classificadas em outro local); glaucoma H40-H42; distúrbios H43-H45 de corpo vítreo e globo; distúrbios de nervo ótico e caminhos visuais H46-H48; distúrbios H49- H52 de músculos oculares, movimento binocular, acomodação e refração; distúrbios visuais e cegueira H53-H54.9; e outros distúrbios H55-H59 de olho e anexos.
[0066]À parte das doenças acima, aspectos da presente invenção também são aplicáveis ao prognóstico e diagnóstico dos seguintes distúrbios neurológicos: Abarognose; afasia epileptiforme adquirida; encéfalomielite disseminada aguda; adrenoleucodistrofia; agênese do corpus callosum; agnosia; síndrome Aicardi; doen-ça Alexandre; síndrome de mão Alien; aloquiria; doença de Alper; hemiplegia alter- nante; mal de Alzheimer; esclerose lateral amiotrófica (ver Doença de Neurônio Mo-tor); anencefalia; síndrome Angelman; angiomatose; anoxia; afasia; apraxia; cistos aracnóides; aracnoidite; má formação Arnold-Chiari; má formação arteriovenosa; ataxia telangiectasia; distúrbio de hiperatividade de déficit de atenção; distúrbio de processamento auditivo; disfunção autonômica; dor nas costas; doença Batten; do-ença de Behcet; paralisia de Bell; blefaroespasmo essencial benigno; hipertensão intracranial benigna; polimicrogiria frontoparietal bilateral; doença de Binswanger; blefaroespasmo; síndrome Bloch-Sulzberger; dano de plexo braquial; abscesso de cérebro; dano de cérebro; tumor de cérebro; síndrome Brown-Séquard; doença Ca-navan; síndrome de túnel carpal; causalgia; síndrome de dor central; mielinolise pon- tina central; miopatia centronuclear; distúrbio cefálico; aneurisma cerebral; arterios-clerose cerebral; atrofia cerebral; gigantismo cerebral; paralisia cerebral; vasculite cerebral; estenose espinhal cervical; doença Charcot-Marie-Tooth; má formação Chiari; Coréia; síndrome de fadiga crônica; polineuropatia desmielinante inflamatória crônica (CIDP); dor crônica; síndrome Coffin Lowry; coma; síndrome de dor regional complexa; neuropatia de compressão; diplegia facial congênita; degeneração corti- cobasal; arterite cranial; crânio sinostose; doença Creutzfeldt-Jakob; distúrbios de trauma cumulativo; síndrome de Cushing; doença de corpo de inclusão citomegálico (CIBD); infecção com citomegalovírus; síndrome Dandy-Walker; doneça Dawson; síndrome De Morsier; paralisia Dejerine-Klumpke; doença Dejerine-Sottas; síndrome de fase de sono retardada; demência; dermatomiosite; dispraxia desenvolvimental; neuropatia diabética; esclerose difusa; síndrome Dravet; disautonomia; discalculia; disgrafia; dislexia; distonia; síndrome Empty sella; encefalite; encefalocelo; angioma- tose encéfalotrigeminal; encoprese; epilepsia; paralisia de Erb; eritromelalgia; tremor essencial; doença de Fabry; síndrome de Fahr; debilidade; paralisia espástica famili-ar; ataques febris; síndrome Fisher; ataxia de Friedreich; fibromialgia; doença de Gaucher; síndrome de Gerstmann; arterite de célula gigante; doença de inclusão de célula gigante; leucodistrofia de célula globóide; heterotopia de matéria cinza; sín- drome de Guillain-Barré; meilopatia associada com HTLV-1; doença Hallervorden- Spatz; dano de cabeça; dor de cabeça; espasmo hemifacial; paraplegia espástica hereditária; heredopatia atática polineuritiforme; herpes zoster ótico; herpes zoster; síndrome Hirayama; holoprosencefalia; doença de Huntington; hidranencefalia; hi- drocéfalo; hipercortisolismo; hipoxia; encéfalomielite mediada - imune; miosite de corpo de inclusão; incontinência pigmenti; doença de estocagem de ácido ftânico infantil; doença Refsum infantil; espasmos infantis; miopatia inflamatória; cisto intra-cranial; hipertensão intracranial; síndrome Joubert; síndrome Karak; síndrome Ke-arns-Sayre; doença Kennedy; síndrome Kinsbourne; síndrome Klippel Feil; doença Krabbe; doença Kugelberg - Welander; Kuru; doença Lafora; síndrome miastênica Lambert-Eaton; síndrome Landau-Kleffner; síndrome medular lateral (Wallenberg); incapacidades de aprendizado; doença de Leigh; síndrome Lennox-Gastaut; sín- drome Lesch-Nyhan; leucodistrofia; demência de corpo Lewy; lissencefalia; síndro- me de fechado-em; doença de Lou Gehrig (ver doença de neurônio motor); doença de disco lombar; estenose espinhal lombar; doença Lyme; seqüelas neurológicas; doença de Machado-Joseph (ataxia espinocerebelar tipo 3); macrencefalia; macrop- sia; megalencefalia; síndrome de Melkersson-Rosenthal; doença Menieres; meningi-te; doença Menkes; leucodistrofia metacromática; microcefalia; micropsia; enxaque-ca; síndrome Miller Fisher; mini-acidente vascular cerebral (ataque isquêmico transi-ente); miopatia mitocondrial; síndrome Mobius; amiotrofia monomélica; doença de neurônio motor; distúrbio de habilidade motora; doença moyamoya; mucopolissaca- ridoses; demência multi-infarto; neuropatia motora multifocal; esclerose múltipla; atrofia de sistema múltiplo; distrofia muscular; encéfalomielite miálgica; miastenia gravis; esclerose difusa mielinoclástica; encéfalopatia mioclônica de crianças; mio- clonus; miopatia; miopatia miotubular; miotonia congênita; narcolepsia; neurofibro- matose; síndrome maligna neuroléptica; manifestações neurológicas de AIDS; se- qüelas neurológicas de lupus; neuromiotonia; lipofuscinose ceróide neuronal; distúr-bios de migração neuronal; doença Niemann-Pick; síndrome sono-acordar não-24 horas; distúrbio de aprendizado não-verbal; síndrome O’Sullivan-McLeod; neuralgia occipital, seqüência disrafismo espinhal oculto; síndrome Ohtahara; atrofia olivopon- tocerebelar; síndrome Opsoclonus mioclonus; neurite ótica; hipotensão ortostática; síndrome de Overuse; palinopsia; parestesia; mal de Parkinson; paramiotonia con-gênita; doenças paraneoplásticas; ataques paroxismais; síndrome Parry-Romberg; doença de Pelizaeus-Merzbacher; paralisias periódicas; neuropatia periférica; estado vegetativopersistente; distúrbios desenvolvimentais pervasivos; reflexo de espirro fótico; doença de estocagem de ácido fitânico; doença de Pick; nervo beliscado; tu-mores de pituitária; PMG; pólio; polimicrogiria; polimiosite; porencefalia; síndrome pós-pólio; neuralgia pós-herpética (PHN); encéfalomielite pós-infecciosa; hipotensão postural; síndrome Prader-Willi; esclerose lateral primária; doenças príon; atrofia hemifacial progressiva; leucoencéfalopatia multifocal progressiva; paralisia supranu-clear progressiva; pseudotumor cerebri; raiva; síndrome Ramsay-Hunt (Tipo I e Tipo II); encefalite de Rasmussen; distrofia neurovascular de reflexo; doença Refsun; dis-túrbios de movimento repetitivo; dano de tensão repetitiva; síndrome de pernas sem descanso; mielopatia associada com retrovírus; síndrome Rett; síndrome de Reye; distúrbio de movimento rítmico; síndrome Romberg; Saint Vitus dance; doença Sandhoff; esquizofrenia; doença de Schilder; esquizencefalia; disfunção de integra-ção sensorial; displasia septo-ótica; síndrome de bebê agitado; herpes zoster; sín- drome Shy-Drager; síndrome de Sjogren; apnéia de sono; doença de sono; snatia- tion; síndrome Sotos; espasticidade; espinha bífida; dano de cordão espinhal; tumo-res de cordão espinhal; atrofia muscular espinhal; ataxia espinocerebelar; síndrome Steele-Richardson-Olszewski; síndrome pessoa-Stiff; síndrome Sturge-Weber; pa- nencefalite esclerosante subaguda; encéfalopatia arteriosclerótica subcortical; side-rose superficial; coréia de Sydenham; síncope; sinestesia; siringomielia; síndrome de túnel Tarsal; discinesia tardia; cisto Tarlov; doença Tay-Sachs; arterite temporal; té-tano; síndrome de cordão espinhal preso; doença Thomsen; síndrome de saída to-rácica; Tic Douloureux; paralisia de Todd; síndrome Tourette; encéfalopatia tóxica; ataque isquêmico transiente; encéfalopatias espongiformes transmissíveis; mielite transversa; dano de cérebro traumático; tremor; neuralgia trigeminal; paraparese espástica tropical; tripanosomíase; esclerose tuberosa; doença Von Hippel-Lindau; encéfalomielite Viliuisk; síndrome de Wallenberg; doença Werdnig-Hoffman; síndro- me West; Whiplash; síndrome Williams; doença de Wilson; e síndrome Zellweger.
[0067]Aparte das doenças acima, aspectos da presente invenção também são aplicáveis ao prognóstico e diagnóstico das seguintes doenças cardiovascula-res: aneurisma; angina; aterosclerose; acidente cérebro vascular; doença cérebro vascular; insuficiência cardíaca congestiva; doença de artéria coronária; infartação miocardial (ataque cardíaco); e doença vascular periférica.
[0068]Como aqui usado, “ácido nucléico” inclui referência a um polímero de- soxirribonucléico ou ribonucléico em forma de fita simples ou dupla, e a menos que de outro modo limitado, abrange análogos conhecidos tendo a natureza essencial de nucleotídeos naturais em que eles hibridizam para ácidos nucléicos de fita simples em uma maneira similar a nucleotídeos ocorrendo naturalmente (por exemplo, ácidos nucléicos peptídeos).
[0069]O termo “RNA” refere-se a ácido ribonucléico,uma molécula de RNA codificando um produto proteína ou não codificando um produto proteína (tais como miRNAs mas não excluindo outros RNAs não-codificantes). RNA é transcrito de um molde DNA.
[0070]Como aqui usado o termo “mutante” refere-se a um composto ácido nucléico, proteína, molécula, vetor ou célula resultante da mutação da seqüência codificando tipo selvagem nativo ou suas subunidades.
[0071]Como aqui usado o termo “mutação” refere-se a qualquer mudança que altera a seqüência codificante nativa tanto através de deslocamento, adição, supressão, inserção, reticulação, ou outra destruição ou substituição de um ou mais nucleotídeos da seqüência codificante nativa, incluindo variantes de união ocorrendo naturalmente. Em particular, a mutação provê um gene que faz com que a célula seja uma célula de câncer.Tais mutações incluem mutações herdadas e adquiridas de genes supressores de tumor e/ou oncogenes.
[0072]Por “amplificada” é pretendida a construção de múltiplas cópias de uma seqüência de ácido nucléico ou múltiplas cópias complementares para a se- qüência de ácido nucléico usando pelo menos uma das seqüências de ácido nucléi- co como um molde. Sistemas de amplificação incluem o sistema de reação de cadeia polimerase (PCR), sistema de reação de cadeia ligase (LCR), amplificação baseada em seqüência de ácido nucléico (NASBA, Cangene, Mississauga, Ontário), sistemas replicase Q-Beta, sistemas de amplificação baseados em transcrição (TAS), e amplificação de deslocamento de fita (DAS). Ver, por exemplo, Diagnostic Molecular Microbiology.Principles and Applications, D.H. Persing et al., Ed., American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1993). O produto de amplificação é chamado um amplicon.
[0073]O termo “híbrido” refere-se a uma molécula de ácido nucléico de fita dupla, ou duplex, formada por ligação de hidrogênio entre nucleotídeos complemen-tares. Os termos “hibridizar” ou “anelar” referem-se ao processo através do qual fitas simples de seqüências de ácido nucléico formam segmentos helicoidais duplos atra-vés de formação de ponte de hidrogênio entre nucleotídeos complementares.
[0074]O termo “oligonucleotídeo” refere-se a uma seqüência curta de mo- nômeros nucleotídeos (usualmente 6 a 100 nucleotídeos) ligados por ligações fosfo- rosas (??) (por exemplo, fosfodiéster, fosfato de alquila e arila, fósforotioato), ou li-gações não-fosforosas(??) (por exemplo, peptídeo, sulfamato e outras). Um oligonu- cleotídeo pode conter nucleotídeos modificados tendo bases modificadas (por exemplo, 5-metil citosina) e grupos açúcar modificados (por exemplo, 2’-O-metil ri-bosila, 2’-O-metoxi etil ribosila, 21-flúor ribosila, 2’-amino ribosila, e semelhantes).
[0075]Oligonucleotídeos podem ser de ocorrência natural ou moléculas sin-téticas de DNA de fita dupla ou simples e RNA de fita dupla ou simples com formas circular, ramificada ou linear e opcionalmente incluindo domínio capazes de forma-rem estruturas secundárias estáveis (por exemplo, estruturas haste-e-laço e laço- haste-laço).
[0076]O termo “iniciador” como aqui usado refere-se a um nucleotídeo que é capaz de anelar ao alvo de amplificação permitindo uma DNA polimerase ligar pelo que servindo como um ponto de iniciação de síntese de DNA quando colocado sob condições nas quais síntese de produto de extensão de iniciador que é complemen-tar a uma fita de ácido nucléico é induzida, isto é, na presença de nucleotídeos e um agente para polimerização de uma tal DNA polimerase e pelo menos uma apropriada temperatura e pH. O iniciador (amplificação) é preferivelmente de fita simples para máxima eficiência em amplificação. Preferivelmente, o iniciador é um oligodeoxi ribonucleotídeo. O iniciador tem de ser suficientemente longo para iniciar a síntese de produtos de extensão na presença do agente para polimerização. Os exatos comprimentos dos iniciadores dependerão de muitos fatores, incluindo temperatura e fonte de iniciador. Um “par de iniciadores bidirecionais” como aqui usado refere-se a um iniciador para frente e um reverso como comumente usado na técnica de am-plificação de DNA tal como em amplificação PCR.
[0077]O termo “sonda” refere-se a uma seqüência de oligonucleotídeos de fi-ta simples que reconhecerá e formará um duplex ligado por hidrogênio com uma se- qüência complementar em um analito seqüência de ácido nucléico alvo ou seu deri-vado cDNA.
[0078]Os termos “rigorosidade” ou “condições de hibridização rigorosas” re-ferem-se a condições de hibridização que afetam a estabilidade de híbridos, por exemplo, temperatura, concentração de sal, pH, concentração de formamida e se-melhantes. Estas condições são empiricamente otimizadas para maximizar ligação específica e minimizar ligação não-específica de iniciador ou sonda para sua se- qüência de ácido nucléico alvo. Os termos como usados incluem referência a condi-ções sob as quais uma sonda ou iniciador hibridizará para sua seqüência alvo, para um grau detectavelmente maior que outras seqüências (por exemplo, pelo menos 2 vezes sobre o fundo). Condições rigorosas são dependentes de sequência e serão diferentes em diferentes circunstâncias.Seqüências mais longas hibridizam especificamente em maiores temperaturas. Genericamente, condições rigorosas são selecionadas para serem cerca de 5oC menores que o ponto de fusão térmica ™ para a específica seqüência em uma definida resistência iônica e pH. A Tm é a temperatura (sob definida resistência iônica e pH) na qual 50% de uma seqüência alvo complementar hibridiza para uma sonda ou iniciador perfeitamente emparelhado. Tipicamente, condições rigorosas serão aquelas nas quais a concentração de sal é menos que cerca de 1,0 M de íon Na+, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 Mde concentração de íon Na+, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M de concentração de íon Na+ (ou outros sais) em pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é pelo menos cerca de 30oC para sondas ou iniciadores curtos (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60oC para sondas ou iniciadores longos (por exemplo, maiores que 50 nucleotídeos). Condições rigorosas também podem ser obtidas com a adição de agentes de deses- tabilização como formamida. Condições de baixa rigorosidade exemplares ou “condições de reduzida rigorosidade” incluem hibridização com uma solução tampão de formamida 30%, NaCl 1 M, SDS 1% a 37o C e uma lavagem em 2x SSC a 40oC. Condições de alta rigorosidade exemplares incluem hibridização em formamida 50%, NaCl 1 M, SDS 1% a 37oC, e uma lavagem em 0,1x SSC a 60oC. Procedimentos de hibridização são bem conhecidos na técnica e são descritos em, por exemplo, Ausu- bel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., 1994.
[0079]“Sujeito” como aqui usado inclui, mas não está limitado a, mamíferos, incluindo, por exemplo, um humano, um primata não-humano, um camundongo, um porco uma vaca, uma cabra, um gato, um coelho, um rato, um porquinho da Índia, um hamster, um degu, um cavalo, um macaco, uma ovelha, ou outro mamífero não- humano; e animais não-mamíferos, incluindo por exemplo, um vertebrado não- mamífero, tal como um pássaro (por uma galinha ou pato) ou um peixe, e um inver-tebrado. O sujeito pode ser um animal ou humano saudável sujeito a sofrer um veri-ficação de bem estar de rotina. Alternativamente, o sujeito pode estar em risco de ter uma doença (por exemplo, um sujeito geneticamente predisposto, um sujeito com história médica e/ou familiar de câncer, um sujeito que foi exposto a carcinoma, pe-rigo ocupacional, perigo ambiental) e/ou um sujeito que exibe sinais clínicos suspei-tos de uma doença [por exemplo, sangue em fezes ou melena, dor não-explicada, sudorese, febre não-explicada, perda não-explicada de peso até anorexia, mudanças em hábitos intestinais (constipação e/ou diarréia), tenesmus (sensação de defe- cação incompleta, especificamente para câncer retal), anemia e/ou fraqueza genéri-ca]. De acordo com uma outra realização, o sujeito pode ser um paciente diagnosti-cado com a doença e está realizando uma verificação de rotina, entre tratamentos.
[0080]O termo “trombócito”, como aqui usado, refere-se a plaquetas do san-gue, isto é, os pequenos fragmentos de células de forma irregular não tendo um nú-cleo contendo DNA, e que circulam no sangue de mamíferos. Trombócitos são de 23 micrometros em diâmetro, e são derivados de fragmentação de megacariócitos precursores. A extensão de vida média de um trombócito é de 5 a 9 dias. Trombóci- tos estão envolvidos e desempenham um papel essencial em hemóstase, conduzin-do à formação de coágulos de sangue.
[0081]O termo “sangue” como aqui usado refere-se a sangue integral (inclu-indo plasma e células) e inclui sangue arterial, capilar e venoso.
[0082]O termo “célula nucleada” como aqui usado refere-se preferivelmente a uma célula de glândula de Bartholin; célula de mucosa de glândula salivar; célula serosa de glândula salivar; célula de glândula de Von Ebner; célula de glândula ma-mária; célula de glândula lacrimal. Célula de glândula ceruminosa; célula de glândula de suor ecrina; célula de glândula de suor apocrina; célula Moll de glândula; célula de glânduçla sebácea; célula de glândula de Bowman; célula de glândula de Brunner; célula de vesícula seminal; célula de glândula de próstata; célula de glândula bulbo uretral; célula Littre de glândula; célula de endométrio de útero; célula goblet isolada; célula de mucosa de forro de estômago; célula zimogênica de glândula gástrica; célula oxintica de glândula gástrica; célula acinar pancreática; célula Paneth; pneumócito Tipo II; célula Clara; célula pituitária anterior; célula pituitária intermediária; célula neuro secretória magnocelular; célula de glândula tiróide; células de glândula paratiróide; células de glândula adrenal; célula Leydig; célula interna Theca; células de Corpus luteum; célula justaglomerular; célula densa mácula; célula peripolar; célula mesangial; célula fenestrada endotelial vascular linfática e de vaso de sangue; célula contínua endotelial vascular linfática e de vaso sanguíneo; célula es- plênica endotelial vascular linfática e de vaso sanguíneo; célula sinovial; célula serosal; célula escamosa; célula colunar; célula Dark; célula de membrana vestibular; célula basal vascular Stria; célula marginal vascular Stria; célula de Claudius; célula de Boettcher; célula de plexo coróide; célula escamosa aracnóide-Pia; célula de epi- télio ciliar pigmentado; célula de epitélio ciliar não-pigmentado; célula endotelial de córnea; célula Peg; célula ciliada de trato respiratório; célula ciliada de oviduto; célula ciliada endometrial uterina; célula ciliada de testículos Rete; célula ciliadada Effe- rens Ductulus; célula ependimal ciliada; ceratinócito de epiderme; célula basal de epiderme; ceratinócito; célula mbasal de leito de unha; célula de eixo de cabelo medular; célula de eixo de cabelo cortical; célula de eixo de cabelo cuticular; célula de bainha de raiza de cabelo cuticular; célula de bainha de raiz de cabelo externa; célula matriz de cabelo; célula epitelial de superfície; célula basal; célula de epitélio urinário; célula de cabelo interna auditório; célula de cabelo externo auditório; neurônios sensoriais primários; célula Merkel; neurônio receptor olfativo; células foto- receptoras; célula de corpo de carótida (sensor de pH de sangue); célula mde cabelo; célula broto de sabor; célula neural colinérgica; célula neural adrenérgica; célula neural peptidérgica; célula pilar interna; célula pilar externa; célula falangeal interna; célula falangeal externa; célula Border; célula Hensen; célula suporte de aparelho vestibular; célula suporte de broto de sabor; célula suporte de epitélio olfativo; célula Schwann; célula satélite; célula glial entérica; células neurônios; oligodendrócito; neurônio haste; célula epitelial de lente anterior; célula de fibra de lente contendo cristalino; hepatócito; adipócitos; lipócito de fígado; célula parietal glomérulo de rim; podócito glomérulo de rim; célula de borda de escova de túbulo proximal de rim; célula segmento fino Henle de laço; célula túbulo distal de rim; célula de duto de coleta de rim; pneumócito; célula de duto pancreático; célula de duto não-estriado; célula duto; célula de borda de escova intestinal; célula de duto estriado de glândula exó- crina; célula epitelial de bexiga; célula não-ciliada Ductulus efferens; célula principal epididimal; célula basal epididimal; célula epitelial ameloblasto; célula epitelial smilu- natum planujm; célula epitelial interdental corti de órgão; fibroblastos de tecido con- juntivo solto; fibroblastos de córnea; fibroblastos de tendão; fibroblastos de tecido reticular de medula óssea; outros fibroblastos não-epiteliais; pericito; célula pulposus de núcleo; cementoblasto / cementócito; odontoblasto / odontócito; condrócito de cartilagem hialina; condrócito de fibrocartilagem; condrócito de cartilagem elástica; osteoblasto / osteócito; célula osteoprogenitora; hialócito; célula Stellate; célula stellate hepática; célula stelle pancreática; célula de m'suculo do esqueleto; célula satélite; célula de músculo do coração; célula de músculo liso; célula mioepitelial; mega- cariócito; monócito; macrófago de tecido conjuntivo; célula Langerhans epidérmica; osteoclasto; célula dendrítica; célula microglial; granulócito neutrófilo; granulócito eosinófilo; granulócito basófilo; célula mastro; célula T auxiliar; célula T supressora; célula T citotóxica; célula T assassina natural; célula B; célula assassina natural; re- ticulócito; melanócito; célula epitelial pigmentada retinal; oogônio / oócito; espermati- deo; espermatócito; célula espermatogonio; espermatozoônio; célula de folículo de ovário; célula Sertoli; célula epitelial de timo; e célula de rim intersticial.
[0083]Terapia alvejada e medicamento personalizado são criticamente de-pendentes de formação de perfil de doença e o desenvolvimento de diagnóstico companheiro.Mutações em ácidos nucléicos derivados de doença podem ser alta-mente preditivas para a resposta para tratamento alvejado. Entretanto, obtenção de ácidos nucléicos de alta qualidade facilmente acessíveis permanece um significante obstáculo de desenvolvimento. O sangue genericamente contém 150 000-350 000 trombócitos (plaquetas) por microlitro, provendo uma fonte biomarcadora altamente disponível para pesquisa e uso clínico. Além disso, isolamento de trombócito é rela-tivamente simples e é um procedimento padrão em laboratórios de hematologia / banco de sangue. Uma vez que plaquetas não contêm um núcleo, seus transcritos RNA - necessários para manutenção funcional - são derivados de megacariócitos de medula óssea durante criação de trombócito. Foi agora verificado que trombóci- tos podem absorver RNA durante circulação via vários mecanismos de transferência.Células de tumor liberam uma abundante coleção de material genético, alguns dos quais são secretados por microvesículas na forma de RNA mutante. Durante circula-ção na corrente sanguínea trombócitos absorvem o material genético secretado por células de câncer e outras células adoentadas, servindo como uma plataforma atra-ente para os diagnósticos companheiros de câncer e outras doenças como indicado acima no contexto de medicina personalizada.
[0084]Nos exemplos abaixo é mostrado que plaquetas isoladas de sujeitos controles humanos saudáveis t~em a habilidade de absorver RNA de microvesículas contendo RNA derivadas de células de tumor de cérebro humano (glioma), após o que elas contêm RNA associado com tumor, incluindo, por eemplo, mRNA EGFRvIII mutante no caso de pacientes de glioma. Portanto, foi determinado que plaquetas circulantes isoladas de pacientes de glioma contêm biomarcadores RNA.RT-PCR foi usada para confirmar que mRNA EGFRvIII mutante encontrado nos trombócitos re-flete a presença de tecidos glioma.
[0085]A presença de mensagens de marcadores de tumor não é única para plaquetas de pacientes de glioma mas é mais genericamente aplicável para uma ampla faixa de doenças como aqui identificadas. RNAs mensageiros codificando para marcadores de câncer de próstata PCA3 e PSA podem ser demonstrados em plaquetas de pacientes de câncer de próstata, enquanto estes marcadores estavam ausentes em plaquetas de sujeitos controles saudáveis.
[0086]À parte de detecção de mutações de genes associadas com câncer ou outras doenças, os presentes inventores também verificaram que arranjos de ex-pressão de gene podem ser usados para classificar uma amostra de ácido nucléico de trombócitos como sendo aquela de um sujeito sofrendo de um tipo específico de câncer (tumor sólido) ou outra doença. Foi estabelecido que perfis de expressão de mRNA obtidos com ácidos nucléicos extraídos de plaquetas isoladas de sujeitos controles saudáveis ou extraídos de plaquetas isoladas de pacientes de glioma dife- riram especificamente. Distintos perfis de expressão de mRNA foram obtidos e uma assinatura de biomarcador de glioma mínima pode ser detectada, como mostrado para os hits Top-30 na figura 3C. O perfil distinto como mostrado na Figura 3C com-preende um significante aumento na expressão dos seguintes genes: WFDC1, Kre- men1, DEF4A, ARG1, FKBP5, ACRC, ENST0328043, A_32_P167111, MAP2, ECTL8, UNC13B,TP53I3, FDXR, BX119718, SORT1, PFN4, C1QTNF5, A_24_P237896, PGLYRP1, SEC14L2, BC018626, MAOB, TCN1, AMOTL1, TSP50, CD109, A_24_P927015, THC2325987, C18orf1, e LIN28 (alguns destes nomes de genes são referidos com referência ao número de acesso de microarranjo, por exemplo, a sonda oligonucleotídeo do Agilent Chip). Será entendido que este perfil não é limitante para o escopo da presente invenção, uma vez que aqueles versados na técnica são bem cientes de como obter outros apropriados perfis de expressão de gene usando os processos da presente invenção para outros cânceres, e para outras doenças em geral.
[0087]Os presentes inventores verificaram agora que plaquetas de sangue contêm marcadores de câncer e marcadores de doença na forma de ácidos nucléi- cos derivados de tumor ou associados com tumor ou derivados de doença ou perfis de expressão de ácido nucléico e que estas plaquetas podem servir como uma pla-taforma de diagnóstico para a formação de perfil molecular de câncer e outras doen-ças como aqui identificadas. Isto é altamente útil no contexto de medicina personali-zada.
[0088]A presente invenção provê um novo e de fácil uso, processo para iso-lar material circulante derivado de doença (por exemplo, marcadores de doença como aqui usados) para análise genética. Os presentes inventores isolaram RNA derivado de tumor de trombócitos circulantes, incluindo RNA puro e pelo que provendo um modo fácil para extrair RNA de alta qualidade de baixas quantidades de sangue. Isolamento de ácido nucléico (NA) de trombócito e subsequente análise apresenta um acentuado aumento na sensitividade diagnóstica de NA circulante em sangue.
[0089]Os presentes inventores verificaram que em pacientes adoentados trombócitos circulantes contêm significantes quantidades de RNA derivado de doen-ça.Estes RNAs derivados de doença apresentam informação genética única sobre a doença, que pode ser usada para determinar tipo de doença, extensão de doença e possivelmente a susceptibilidade da doença para tratamento terapêutico. O RNA de trombócito pode ser analisado para a presença de específicos RNAs derivados de doença, como aqui demonstrado para o RNA mutante EGFRvIII derivado de tumores de glioma.
[0090]A presente invenção descreve um processo de verificação de especí-ficos transcritos derivados de células nucleadas de origem de doença dentro de cé-lulas de sangue anucleadas tais como trombócitos extraídas de sangue. Esta abor-dagem é robusta e fácil. Isto é atribuído aos rápidos e diretos procedimentos de ex-tração e a qualidade do NA extraído. Dentrop de instalação clínica, extração de trombócitos (a partir de amostras de sangue) já é implementada em coleta de amostra biológica genérica e por isso é antevisto que a implementação na clínica é relati-vamente fácil.
[0091]A presente invenção provê um processo genérico para análise de sangue de um sujeito para a presença de um ácido nucléico derivado de doença e um processo de diagnóstico de doença em um sujeito usando o dito processo gené-rico. Quando é feita referência aqui a um processo da invenção, ambas realizações são referidas.
[0092]Um processo da invenção pode ser realizado sobre qualquer apropri-ada amostra de corpo compreendendo células anucleadas de sangue, tal como, por exemplo, uma amostra de tecido compreendendo sangue, mas preferivelmente a dita amostra é sangue integral.
[0093]Uma amostra de sangue de um sujeito pode ser obtida através de qualquer processo padrão, por exemplo, através de extração venosa.
[0094]A quantidade de sangue necessária não é particularmente limitada. Dependendo dos processos empregados, aqueles versados na técnica serão capa-zes de estabelecer a quantidade de amostra requerida para realização de várias etapas do processo da presente invenção e obter suficiente NA para análise genéti-ca. Genericamente, tais quantidades compreenderão um volume variando de 0,01 microlitro a 100 mL.
[0095]A amostra de corpo pode ser analisada imediatamente seguindo coleta da amostra. Alternativamente, análises de acordo com o processo da presente invenção podem ser realizadas sobre uma amostra de corpo estocada ou sobre uma fração estocada de suas células anucleadas de sangue, preferivelmente trombócitos. A amostra de corpo para testes, ou a fração de suas células anucleadas de sangue, pode ser preservada usando processos e aparelhagens conhecidas na técnica. Em uma fração de células anucleadas de sangue coletada, os trombócitos são preferi-velmente mantidos em estado inativado (isto é, em um estado não-ativado). Deste modo, a integridade celular e os ácidos nucléicos derivados de doença são preser-vados melhor.
[0096]No caso de fração de células anucleadas de sangue ser uma fração de trombócitos, esta fração isolada de plaquetas preferivelmente não inclui plasma pobre de plaquetas ou plasma rico em plaquetas (PRP). Ainda isolamento das pla-quetas é preferido para ótima resolução.
[0097]A amostra de corpo pode ser apropriadamente processada de outro modo, por exemplo, ela pode ser purificada, ou digerida, ou específicos compostos podem ser extraídos da mesma. Dependendo do processo de caracterização de NA presente nas células anucleadas de sangue na dita amostra, cujo processo preferi-velmente envolve RT-PCR, as células anucleadas de sangue podem ser extraídas da amostra através de processos conhecidos por aqueles versados e serem transfe- ridas para qualquer meio apropriado para extração do NA da mesma se o processo de análise assim requer. A amostra de corpo de sujeito receptor pode ser tratada para remoção de abundantes enzimas de degradação de ácido nucléico (como RNases, DNases) a partir da mesma, de modo a prevenir inicial destruição dos ácidos nucléicos.
[0098]Extração de trombócitos da amostra de corpo do sujeito pode envolver qualquer processo disponível. Em medicina de transfusão, trombócitos são frequen-temente coletados por aférese, uma tecnologia médica na qual o sangue de um do-ador ou paciente é passado através de uma aparelhagem que separa um particular constituinte e retorna o restante para a circulação. A separação de componentes individuais de sangue é feita com uma centrífuga especializada.Plaquetaferese (também chamada tromboferese ou trombocitoferese) é o processo de aférese de coleta de trombócitos.Plaquetaferese automática moderna permite doadores de sangue doarem uma porção de seus trombócitos, enquanto mantendo suas células vermelhas de sangue e pelo menos uma porção de plasma de sangue. Embora seja possível prover a amostra de corpo compreendendo trombócitos como aqui preten-dido através de aférese, é frequentemente mais fácil coletar sangue integral e isolar a fração trombócito do mesmo através de centrifugação. Genericamente, em um tal protocolo, os trombócitos são primeiro separados das outras células de sangue atra-vés de uma etapa de centrifugação de cerca de 120 x g por cerca de 20 minutos em temperatura ambiente para obter uma fração de plasma rica em plaquetas (PRP). Os trombócitos são então lavados (por exemplo, em PBS-EDTA) para remoção de proteínas de plasma e enriquecimento para trombócitos.Etapas de lavagem são ge-nericamente realizadas em 850-1000 x g por cerca de 10 minutos em temperatura ambiente.Ainda enriquecimentos podem ser realizados para renderem frações de trombócitos mais puras.
[0099]Isolamento de plaquetas genericamente envolve coleta de amostra de sangue em tubos Vacutainer contendo anticoagulante citrato dextrose (por exemplo, 36 mL de ácido cítrico, 5 mmoles/L KCl, 90 mmoles/L NaCl, 5 mmoles/L glicose, 10 mmoles/L EDTA pH 6,8). Um protocolo apropriado para isolamento de plaquetas é descrito em Ferreti et al. (J Clin Endocrinol Metab 2002; 87:2180-2184).Este pro-cesso envolve uma etapa de centrifugação preliminar (1300 rpm por 10 minutos) para obter plasma rico em plaquetas (PRP). Plaquetas são então lavadas três vezes em um tampão anti-agragação (Tris-HCl 10 mmoles/L; NaCl 150 mmoles/L; EDTA 1 mmol/L; glicose 5 mmoles/L; pH 7,4) e centrifugadas como acima, para evitar qual-quer contaminação com proteínas de plasma e para remoção de quaisquer eritróci- tos residuais. Uma centrifugação final em 4000 rpm por 20 minutos pode ser então realizada para isolar plaquetas.A pelota de plaquetas pode ser lavada (por exemplo, em solução salina tamponada com fosfato). Para determinação quantitativa de níveis de marcador de doença, a concentração de proteína de membranas de plaquetas pode ser usada como referência interna. Tais concentrações de proteínas podem ser determinadas através do processo de Bradford (Anal Biochem 1976; 72:248-254), usando albumina de soro como padrão.
[00100]Seguindo a provisão da amostra de corpo do sujeito, e a extração a partir da mesma das células anucleadas de sangue, as células anucleadas de san-gue do sujeito são separadas para a presença de ácidos nucléicos específicos de doença. Se ácidos nucléicos específicos de doença são encontrados nas células anucleadas de sangue do sujeito, ou se ácidos nucléicos específicos de doença são encontrados nas células anucleadas de sangue do sujeito em um nível maior que nas células anucleadas de sangue de uma amostra de sangue não afetada de um sujeito controle, cujos ácidos nucléicos específicos de doença são considerados ori-ginarem de uma célula ou tecido doente residindo no sujeito, o dito sujeito é diag-nosticado com doença como aqui definido.
[00101]Ácidos nucléicos específicos de doença (marcadores de doença RNA e/ou DNA)são definidos como originado de células de doença que contêm mutações ou nenhuma mutação nas seqüências de ácidos nucléicos que são associadas com ou específicas para a doença, e também incluem ácidos nucléicos de células anu- cleadas de sangue derivadas de doença que são reguladas ascendentes ou des-cendentes comparados a ácidos nucléicos em células anucleadas de sangue de do-adores saudáveis. Portanto, os termos “ácidos nucléicos específicos de doença” e “ácidos nucléicos derivados de doença” são aqui usados intercambiavelmente.Será apreciado que genes que não sofreram mutação podem ser identificados e usados para diagnósticos de doenças. Se certos genes são superexpressos em certas do-enças, estes ácidos nucléicos podem ser transferidos para células anucleadas de sangue. Entretanto, se estes ácidos nucléicos já estão presentes em células anucle- adas de sangue de sujeitos saudáveis pode-se esperar um aumento no número de cópias de ácidos nucléicos em células anucleadas de sangue de tais pacientes do-entes. Portanto, quantificação do número de copias de certos genes (através de PCR quantitativa ou microarranjos, por exemplo) em células anucleadas de sangue pode ser benéfica em certas realizações de aspectos desta invenção para detecção de presença de uma doença superexpressando tais genes.
[00102]Ainda uma etapa em um processo da invenção é a provisão de uma fração de ácido nucléico extraído de células anucleadas de sangue. Uma tal fração de ácido nucléico é subsequentemente usada para a detecção ali de um marcador de doença. Uma fração de ácido nucléico extraída de células de sangue anucleadas pode ser obtida através de qualquer processo de extração de NA disponível. Usual-mente extração de RNA é realizada através de uso de reagentes caotrópicos. A pri-meira etapa no isolamento de RNA total de células ou tecido é romper as células sob condições desnaturantes. Em 1979, Chirgwin et al. (Biochemistry, 18[24]:5294-9, 1979) imaginou um processo para o isolamento eficiente de RNA total através de homogeneização de uma solução 4 M do potente desnaturante de proteína tiociana- to de guanidinium com 2-mercaptoetanol 0,1 M para quebrar ligações dissulfeto de proteínas. RNA foi então isolado através de extração com etanol ou através de ultra- centrifugação através de cloreto de césio. Em 1987 Chomczynski e Sacchi (Analyti-cal Biochemistry, 162[1]:156-9, 1987) modificou este processo para criar um proce-dimento de extração de etapa única, rápido, usando uma mistura de tiocianato de guanidinium e fenol - clorofórmio, um processo especialmente útil para processa-mento de grandes números de amostras ou para isolamento de RNA de pequenas quantidades de células ou tecidos. Qualquer kit comercial também pode ser usado para a extração de RNA, seus exemplos não-limitantes incluem Ambion's RNAque- ousTM system, Bio101's RNaid Plus kit, Bioline Ltd.'s RNAce kits, CLONTECH’s Nu- cleoSpin® RNA II and NucleoTrap mRNA kits, Invitrogen Corp.’s S.N.A.P. Total RNA Isolation Kit e QIAGEN's RNeasy kits.
[00103]A detecção de um ácido nucléico derivado de doença na amostra de ácido nucléico extraída pode ocorrer através de qualquer técnica de análise genética disponível que seja apropriada para a detecção de mutações de seqüência de ácido nucléico ou perfis de expressão em ácidos nucléicos que são específicos para a do-ença. Usualmente, tais mutações de seqüências podem ser facilmente detectadas através de seletiva hibridização de ácido nucléico, envolvendo a formação de uma estrutura duplex de ácido nucléico formada através de hibridização seletiva uma com a outra de duas seqüências de ácidos nucléicos de fita simples. Hibridização seletiva inclui referência a hibridização, sob condições de hibridização rigorosas, de uma se- qüência de ácido nucléico a uma seqüência alvo de ácido nucléico especificada para um grau detectavelmente maior (por exemplo, pelo menos 2 vezes sobre fundo) que sua hibridização para seqüências de ácido nucléico não-alvos e para a substancial exclusão de ácidos nucléicos não-alvos. Seqüências hibridizando seletivamente tipicamente têm cerca de pelo menos 80% de identidade de seqüência, preferivelmente 90% de identidade de seqüência, e mais preferivelmente 100% de identidade de se- qüência (isto é, complementar) uma com a outra.
[00104]Alternativamente, detecção de um ácido nucléico derivado de doença pode ocorrer através de tecnologias de sequenciamento tais como sequenciamento de DNA e RNA.
[00105]Quando detectando mutações de seqüência em RNA, ou perfis de expressão de RNA, é preferido que o RNA seja transcrito em cDNA antes da detec-ção ali de mutações de seqüência ou quantificação da quantidade expressa.
[00106]RNA pode ser transcrito reverso em cDNA usando DNA polimerases dependentes de RNA tais como, por exemplo, transcriptases reversas de vírus, re- trotransposons, bactérias, etc. Estes podem ter atividade RNase H, ou transcriptases reversas podem ser usadas que são assim submetidas a mutação de modo que a atividade RNase H da transcriptase reversa foi restrita ou não está presente (por exemplo, MMLV-RT RNase H-). Síntese de DNA dependente de RNA (transcrição reversa) também pode ser realizada por enzimas que mostram alterada dependência de ácido nucléico através de mutação ou modificadas condições de reação e assim obtêm a função da DNA polimerase dependente de RNA.Kits comerciais são disponíveis para transcrição reversa de RNA em cDNA.
[00107]Uma vez o RNA seja transcrito reverso em cDNA, a seqüência de DNA pode ser analisada para a presença de mutações específicas de câncer ou per-fis de expressão podem ser determinados usando, por exemplo, hibridização seletiva de ácido nucléico como descrito acima. Tais técnicas são bem conhecidas e podem compreender amplificação seletiva usando iniciadores de amplificação que são específicos para a mutação a ser detectada ou hibridização seletiva para arranjos de ácido nucléico usando sondas específicas para mRNA.Alternativamente, iniciadores genéricos podem ser usados para amplificar o DNA compreendendo a mutação sus-peita e a mutação então pode ser detectada no amplicon através de hibridização de ácido nucléico seletiva usando sondas que são específicas para a mutação. Perfis de expressão são genericamente obtidos usando processos de hibridização quanti-tativa bem descritos na técnica, uma ilustração dos quais é descrita nos Exemplos.
[00108]Processos da invenção podem em princípio ser realizados através do uso de qualquer processo de amplificação de ácido nucléico, tal como a Reação de Cadeia Polimerase (PCR; Mullis 1987, patente U.S. 4 683 195, 4 683 202 e 4 800 159) ou através de uso de reações de amplificação como Reação de Cadeia Ligase (LCR; Barany 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193; EP Appl. No., 320,308), Self-Sustained Sequence Replication (3SR; Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), Strand Displacement Amplification (SDA; U.S. Pat. Nos. 5,270,184, en 5,455,166), Transcriptional Amplification System (TAS; Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-Beta Replicase (Lizardi et al., 1988, Bio/Technology 6:1197), Rolling Circle Amplification (RCA; U.S. Pat. No. 5,871,921), Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA), Cleavase Fragment Length Polymorphism (U.S. Pat. No. 5,719,028), Isothermal and Chimeric Primer-initiated Amplification of Nucleic Acid (ICAN), Ramification-extension Amplification Method (RAM; U.S. Pat.Nos. 5,719,028 e 5,942,391) ou outros processos apropriados para amplificação de DNA.
[00109]De modo a amplificar DNA com um número pequeno de desempare- lhamentos para um ou mais dos iniciadores de amplificação, uma reação de amplifi-cação pode ser realizada sob condições de rigorosidade reduzida (por exemplo, uma amplificação PCR usando uma temperatura de anelamento de 38oC, ou a presença de MgCl2 3,5 mM). Aqueles versados na técnica serão capazes de selecionar condi-ções de apropriada rigorosidade.
[00110]Os iniciadores aqui são selecionados para serem “substancialmente” complementares (isto é, pelo menos 65%, mais preferivelmente pelo menos 80% perfeitamente complementares) para suas regiões alvos presentes sobre as diferen-tes fitas de cada específica seqüência a ser amplificada. É possível usar seqüências iniciadoras contendo, por exemplo, resíduos inositol ou bases ambíguas ou mesmo iniciadores que contêm um ou mais desemparelhamentos quando comparados com a seqüência alvo. Em geral, seqüências que exibem pelo menos 65%, mais preferi-velmente pelo menos 80% de homologia com as seqüências de oligonucleotídeo DNA alvo, são consideradas apropriadas para uso em um processo da presente in-venção. Desemparelhamentos de seqüência também não são críticos quando usan-do condições de hibridização de baixa rigorosidade.
[00111]A detecção dos produtos de amplificação em princípio pode ser reali-zada através de qualquer processo apropriado conhecido na técnica. Os fragmentos de detecção podem ser diretamente manchados ou marcados com marcadores radi-oativos, anticorpos, corantes luminescentes, corantes fluorescentes, ou reagentes enzimas. Manchas de DNA diretas incluem, por exemplo, corantes de intercalação como laranja acridina, brometo de ethidium, ethidium monoazida ou corantes Hoe-chst.
[00112]Alternativamente, os fragmentos de DNA podem ser detectados atra-vés de incorporação de bases dNTP marcadas nos fragmentos de DNA sintetizados. Marcadores de detecção que podem ser associados com bases nucleotídeos inclu-em, por exemplo, fluoresceína, corante cianina ou BrdUrd.
[00113]Quando usando um sistema de detecção baseado em sonda, um apropriado procedimento de detecção para uso na presente invenção pode, por exemplo, compreender um formato de ensaio imune de enzima (EIA) (Jacob set al., 1997, J. Clin. Microbiol.35, 791795). Para realização de uma detecção através do procedimento EIA, tanto o iniciador para frente como reverso usado na reação de amplificação pode compreender um grupo de captura, tal como um grupo biotina para imobilização de amplicons de PCR de DNA alvo sobre, por exemplo, cavidades de uma placa de microtitulação revestida com streptavidina para subseqüente de-tecção EIA de amplicons DNA alvos (ver abaixo). Aqueles versados entenderão que outros grupos para imobilização de amplicons de PCR de DNA alvo em um formato EIA podem ser empregados.
[00114]Sondas úteis para a detecção do DNA alvo como aqui mostrado pre-ferivelmente ligam somente a pelo menos uma parte da região de seqüência de DNA como amplificada através do procedimento de amplificação de DNA. Aqueles versa-dos na técnica podem preparar apropriadas sondas para detecção baseados na se- qüência de nucleotídeos do DNA alvo sem indevida experimentação como aqui mos-trado. Também as seqüências complementares do DNA alvo podem ser apropria-damente usadas como sondas de detecção em um processo da invenção, contanto que uma tal fita complementar seja amplificada na reação de amplificação emprega-da.
[00115]Apropriados procedimentos de detecção para uso aqui podem, por exemplo, compreender imobilização dos amplicons e sondagem de suas seqüências de DNA através de, por exemplo, southern blotting. Outros formatos podem compre-ender um formato EIA como descrito acima. Para facilitar a detecção de ligação, as específicas sondas de detecção de amplicon podem compreender uma metade mar-cadora tal como um fluoróforo, um cromóforo, uma enzima ou um radio - marcador, de modo a facilitar monitoração de ligação das sondas ao produto de reação da rea-ção de amplificação. Apropriados marcadores são bem conhecidos por aqueles ver-sados na técnica e incluem, por exemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), beta - galactosidase, peroxidase de raiz forte, streptavidina, biotina, digoxigenina, 35S ou 125I. Outros exemplos serão aparentes para aqueles versados na técnica.
[00116]Detecção também pode ser realizada através de um assim chamado ensaio de mancha de linha reversa (RLB), tal como, por exemplo, descrito por Van den Brule et al. (2002, J. Clin. Microbiol.40, 779787). Para este propósito sondas RLB são preferivelmente sintetizadas com um grupo 5’ amino para subseqüente imobilização sobre, por exemplo, membranas de nylon revestidas com carboxila. A vantagem de um formato RLB é o caso do sistema e sua velocidade, assim permi-tindo alta produtividade de processamento de amostra.
[00117]O uso de sondas de ácido nucléico para a detecção de fragmentos de DNA é bem conhecido na técnica. Principalmente estes procedimentos compre-endem a hibridização do DNA alvo com a sonda seguido por lavagens pós- hibridização. Especificidade é tipicamente a função de lavagens pós-hibridização, os fatores críticos sendo a resistência iônica e temperatura da solução de lavagem final. Para híbridos DNA-DNA, a Tm (o ponto de fusão térmica, isto é, a temperatura sob resistência iônica e pH na qual 50% de uma seqüência alvo complementar hibridiza para uma sonda perfeitamente emparelhada) pode ser aproximada a partir da equa-ção de Meinkoth and Wahl (Anal. Biochem., 138: 267-284 (1984)): Tm = 81.5 °C + 16.6 (log M) + 0.41 (% GC)-0.61 (% form)-500/L; onde M é a molaridade de cátions monovalentes, % GC é a porcentagem de nucleotídeos guanosina e citosina no DNA, % de forma é a porcentagem de formamida na solução de hibridização, e L é o comprimento do híbrido em pares de bases. A Tm é reduzida por cerca dee 1oC para cada 1% de desemparelhamento; assim, as condições de hibridização e/ou lavagem podem ser ajustadas para hibridizar para seqüências da desejada identidade.Por exemplo, se seqüências com > 90% de identidade são buscadas, a Tm pode ser di-minuída por 10oC. Genericamente, condições rigorosas são selecionadas para serem cerca de 5oC menores que para a Tm para a específica seqüência e seu complemento na definida resistência iônica e pH. Entretanto, condições severamente rigorosas podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem em 1, 2, 3, ou 4oC menor que a Tm; condições moderadamente rigorosas podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem em 6, 7, 8,9, ou 10oC menor que a Tm; condições de baixa rigorosidade podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem em 11, 12, 13, 14, 15, ou 20oC menor que Tm. Usando a equação, hibridização e composições de lavagem, e desejada Tm, aqueles versados na técnica entenderão que variações na rigorosidade de hibridiza- ção e/ou soluções de lavagem são inerentemente descritas. Se o desejado grau de desemparelhamento resulta em uma Tm de menos que 45oC (solução aquosa) ou 32oC (solução de formamida) é preferido aumentar a concentração de SSC de modo que uma maior temperatura pode ser usada. Um guia extensivo para a hibridização de ácidos nucléicos é encontrado em Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier. New York (1993); e Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Au- subel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995).
[00118]Sondas de detecção são preferivelmente selecionadas para serem “substancialmente” complementares para uma das fitas dos amplicons de DNA de fita dupla gerados por uma reação de amplificação em um processo da invenção. Preferivelmente as sondas são substancialmente complementares para as fitas anti- sentido imobilizáveis (por exemplo, marcada com biotina) dos amplicons gerados a partir do DNA alvo.
[00119]É permissível para as sondas de detecção contenham um ou mais desemparelhamentos para sua seqüência alvo. Em geral, seqüências que exibem pelo menos 65%, mais preferivelmente pelo menos 80% de homologia com as se- qüências de oligonucleotídeos de DNA alvo são consideradas apropriadas para uso em um processo da presente invenção.
[00120]A etapa de análise de fração de ácido nucléico extraída de célula anucleada de sangue para a presença de um marcador de doença assim pode ser realizada através de técnicas padrões de análise de ácido nucléico. A etapa de de-terminação de se há uma alteração no nível do dito marcador de ácido nucléico na dita fração de ácido nucléico com relação a uma amostra de sangue não afetada envolverá medições (semi) quantitativas da quantidade de marcador de doença nas células anucleadas de sangue. Um protocolo muito preferido para a detecção de marcadores específicos de doença nos ácidos nucléicos isolados de células anucle- adas de sangue é por isso PCR de transcrição reversa quantitativa (qRT-PCR) (Fre-eman et al., BioTechniques 26:112-125 (1999)).
[00121]Uma “amostra de sangue não-afetada” como referida acima refere-se ao nível do marcador de doença em células anucleadas de sangue de um sujeito controle saudável ou do mesmo sujeito antes do início da doença. Uma vez que ca-racterísticas de célula anucleada de sangue e quantidades de componentes de célu-la anucleada de sangue dependem, entre outras coisas, de espécies e idade, é pre-ferível que as células anucleadas de sangue controles não-adoentadas se originem de um sujeito da mesma espécie, idade e da mesma sub-população (por exemplo, fumante / não-fumante). Alternativamente, dados controles podem ser tomados de bases de dados e literatura. Será apreciado que a amostra controle também pode ser tomada do sujeito adoentado em um particular ponto de tempo, de modo a analisar a progressão da doença.
[00122]Marcadores de doença incluem mutações específicas / câncer e mu-tações específicas de câncer podem incluir uma variedade de mutações conhecidas serem associadas com câncer.Uma lista não-limitante de exemplos de mutações para vários cânceres é provida em http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/Census/ e nas tabela aqui.
[00123]A invenção ainda provê um kit para diagnóstico de doença em um sujeito, o kit compreendendo um material de embalagem que compreende pelo me-nos um agente para determinação específica de um nível e/ou atividade de pelo me-nos um ácido nucléico mutante e/ou perfil de ácido nucléico em uma amostra de cé-lula anucleada de sangue do sujeito. Como aqui usado, o termo “diagnóstico” refere- se à determinação de presença de uma doença, classificação de uma doença, de-terminação de uma severidade de doença (grau ou estágio), monitoração de pro-gressão de doença, previsão de um resultado da doença e/ou perspectivas de recu- peração.
[00124]Será apreciado que as ferramentas necessárias para detecção de ácido nucléico derivado de doença podem ser providas como um kit, tal como um kit aprovado pela FDA, que pode conter uma ou mais formas de dosagem unitária con-tendo o ingrediente ativo para detecção do ácido nucléico derivado de doença em células anucleadas de sangue através de um processo da presente invenção.
[00125]Alternativamente, o kit pode compreender meios para coleta de amostra e específicos iniciadores de amplificação e/ou detecção embalados separa-damente.
[00126]O kit pode ser acompanhado por instruções para realização de um processo da presente invenção.
[00127]Por exemplo, o kit pode ser compreendido em um dispositivo tal como um bastão de imersão ou um cartucho (opcionalmente compreendido em um invólucro) ao qual uma amostra de sangue ou uma amostra de ácido nucléico de célula anucleada de sangue isolada e/ou amplificada pode ser aplicada e que detec-ta um ácido nucléico derivado de doença ou específico de doença ou perfil de ácido nucléico na dita amostra. O dispositivo pode compreender qualquer agente capaz de detectar especificamente o ácido nucléico derivado de doença. Por exemplo, o dis-positivo pode compreender uma ou uma combinação de sondas de hibridização es-pecíficas de mutação imobilizadas que ligam o ácido nucléico derivado de doença e um indicador para detecção de ligação.Em uma realização desta invenção, são pro-vidos suportes no dispositivo ao qual as sondas de hibridização são ligadas removí-vel ou fixamente.
[00128]De acordo com uma realização, o dispositivo pode ser um dispositivo de fluxo lateral compreendendo meios de entrada para fluxo de uma amostra de sangue ou uma amostra de ácido nucléico de célula anucleada de sangue isolado e/ou amplificado em contato com os agentes capazes de detectar o ácido nucléico derivado de doença. O dispositivo teste também pode incluir um meio de controle de fluxo para assegurar que o teste está operando adequadamente. Tais meios de con-trole de fluxo podem incluir ácidos nucléicos controles ligados a um suporte que cap-turam sondas de detecção adicionadas à amostra como um meio de confirmar o próprio fluxo de fluido amostra através de dispositivo teste. Alternativamente, o meio de controle de fluxo pode incluir sondas de captura na região controle que capturam ácidos nucléicos controles naturalmente presentes na dita amostra ou adicionados à mesma como controles, novamente indicando que fluxo adequado está ocorrendo dentro de dispositivo.
[00129]Em um outro aspecto, a presente invenção provê o uso de dispositivo da presente invenção para diagnóstico de doença em um sujeito usando qualquer um dos processos descritos acima. Dispositivos muito apropriados para uso em di-agnóstico de doença em um sujeito usando qualquer um dos processos descritos acima incluem chips Platelet RNA tais como, por exemplo, descritos em Nagalla & Bray (2010) Blood 115 (1):2-3 e Gnatenko et al. Blood 115(1):7-14.
[00130]A invenção será agora exemplificada por meio dos seguintes exem-plos não-limitantes.
[00131]Trombócitos foram isolados de amostras de sangue de 4 pacientes de glioblastoma e 4 doadores saudáveis através de etapas de centrifugação.Os trombócitos foram então submetidos à extração de RNA usando isolamento de RNA Trizol.As amostras de RNA trombocítico purificadas foram então convertidas a cDNA e analisadas através de microarranjos de expressão Agilent 4x44K usando protocolos padrões de microarranjo.Isto permitiu a formação de perfil dos mRNAs nas diferentes preparações de trombócitos.
[00132]Cerca de 8500 transcritos RNA podem ser detectados através de mi- croarranjos de expressão em plaquetas de doadores saudáveis.Estes transcritos estavam presentes em níveis abaixo de limite de detecção do chip Agilent 4x44K em trombócitos de doadores saudáveis. Portanto, tais RNAs podem todos ser potenciais biomarcadores para diagnósticos de câncer. Dos RNAs não detectados através de microarranjos de expressão em trombócitos de doadores saudáveis, um substancial conjunto de RNAs foi detectado em trombócitos de pacientes de glioblastoma. A Ta-bela 1 resume transcritos RNA trombocíticos únicos detectados em trombócitos de pacientes de glioblastoma mas não em trombócitos de doadores saudáveis através de microarranjos de expressão. Transcritos RNA únicos detectados em 4/4 amostras de pacientes (Tabela 1A) ou % amostras de pacientes (Tabela 1B), mas não em qualquer uma das quatro amostras controles são resumidos na Tabela 1.
[00133]Tabela 1.Transcritos RNA trombocíticos únicos detectados em trom- bócitos de pacientes de glioblastoma mas não em trombócitos de doadores saudá-veis através de microarranjos de expressão.
[00134]1A.Transcritos detectados em trombócitos em quatro de quatro amostras de pacientes, mas não detectados em trombócitos de amostras controles.
[00135]1B.Transcritos detectados em trombócitos em três de quatro amostras de pacientes, mas não detectados em trombócitos de amostras controles.
[00136]Plataformas de diagnósticos que são altamente preditivas para diag-nóstico, monitoramento, e estratificação de pacientes de câncer sãoi instrumentos chaves no desenvolvimento de medicina personalizada. Neste exemplo, é demons-trado que células de tumor transferem RNA (mutnte) emplaquetas de sangue in vitro, e é mostrado que plaquetas de sangue isoladas de pacientes de câncer de próstata e glioblastoma contêm os biomarcadores RNA associados com câncer EGFRvIII e PCA3 e PSA, respectivamente. Além disso, arranjos de expressão de gene revelaram uma assinatura distinta em plaquetas de pacientes de glioma como comparados a sujeitos controles. Devidoplaquetas serem facilmente acessíveis e isoladas, elas podem formar uma paltaforma atraente para o diagnóstico companheiro de câncer.
[00137]Plaquetas foram isoladas de sangue integral coletado em Vacutai- ners BD de tampa púrpura contendo anticoagulante EDTA através de centrifugação padrão, e qualidade (ativação e agregação) assim como pureza foram avaliadas através de análise microscópica mostrando menos que 0,1% de contaminação com células vermelhas ou brancas do sangue. A seguir, pelotas de plaquetas isoladas foram congeladas - instantâneas para ainda uso. Ressecção de tecido de glioma e colheita de sangue integral de pacientes de câncer de próstata e glioma foram reali-zadas no centromédico de Universidade VU e Universidade Umea, como descritoem outra parte (J. Skog et al., Nat Cell Biol. 10(12), 1470-6 (2008)).
[00138]Microvesículas foram isoladas de células de glioma U87-EGFRvIII e marcadas como descrito anteriormente (J. Skog et al., Nat Cell Biol. 10(12), 1470-6 (2008)). Após incubação de microvesículça de U87-dEGFR as plaquetas foram la-vadas e tratadas com enzimas RNAse para assegurar que o RNA EGFRvIII foi libe-rado nas plaquetas e por isso protegido de degradação mediada por RNAse.Para análise de microscopia confocal as plaquetas foram manchadas com aglutinina ger-me de trigo conjugada com vermelho texas para indicar estrutura de plaqueta e ana-lisadas para absorção de microvesículas através de presença de PKH67 verde.Puri-ficação de RNA. RNA foi isolado usando protocolos miRvana (Ambion) ou miRNeasy (Qiagen) de acordo com instruções do fabricante. Concentração e qualidade de RNA foram determinadas usando um Bioanalyzer 2100 com chip total RNA Pico (Agilent).
[00139]RT-PCR para EGFRvIII, PCA3, PSA, e GAPDH, foi realizada como descrito anteriormente (J. Skog et al., Nat Cell Biol. 10(12), 1470-6 (2008)) usando os seguintes conjuntos de iniciadores:
[00140]Arranjos de expressão de mRNA foram realizados na instalação de núcleo de microarranjo de centro médico de Universidade VU usando arranjos de expressão de gene Agilent 4x44K. Integridade de RNA de plaqueta foi avaliada usando o Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc.). Amostras de RNA foram marcadas usando o Agilent Low RNA Input Linear Amplification Kit Plus (5188-5340) de acordo com o protocolo do fabricante.
[00141]Em resumo, 25 ng de RNA total foram amplificados e transcritos re-versos para cDNA usando T7-polimerase e subsequentemente marcado com Cy3 ou Cy5. Incorporação de corante foi medida usando um espectrofotômetro Nanodrop ND-1000. Subsequentemente, cRNA foi hibridizado usando o Agilent Gene Expres-sion Hybridization Kit (5188-5242), de acordo com o protocolo do fabricante. Em re-sumo, 825 ng de cRNA marcado com Cy3 foram misturados com 825 ng de cRNA marcado com Cy5, fragmentados por 30 minutos a 60oC no escuro e hibridizdos so-bre um Agilent Hybridization Chamber Gasket Slide (G2534-60011) em um forno rotatório a 65oC por 17 horas. Lâminas escaneadas usando um Agilent Microarray Scanner (G2565BA).Análises de imagens e normalização de arranjo foram realiza-das usando software de extração de característica versão 9.5 (Agilent Technologies, Inc.). O protocolo Agilent GE2-v5_95 foi aplicado usando fixações default.
[00142]O mapa térmico (Fig. 3C) dos dados de expressão de gene foi gerado usando arranjos centrados medianos em Excel (Microsoft Office 2007 package) com a S.A>. analysis plugado, com uma taxa de descoberta de falso conjunto < 0,5%. Os 30 genes superiores expressos significantemente deferencialmente são mostrados usando software Heatmap Buildder v1.1 (King et al., Physiol Genomics. Sep 21 2005;23(1):103-118)).
[00143]Neste exemplo é mostrado que plaquetas isoladas de sujeitos contro-les humanos saudáveis têm a habilidade de absorver microvesículas contendo RNA derivadas de células de tumor de cérebro humano (glioma), e contêm RNA associa- docom tumor, incluindo EGFRvIII mutante. Absorção de microvesículas derivadas de glioma marcadas é demonstrada em plaquetas do sangue através de análise FARCS e microscopia confocal. Em adição, foi mostrado que transferência mediada por microvesícula de RNA EGFRvIII mutante emplaquetas dos sujeitos controles saudáveis por RT-PCR ocorre.Além disso, é determinado que plaquetas circulantes isoladas de pacientes de glioma, contêm biomarcadores de RNA (ver Fig. 3B). RT- PCR foi usada para determinar se mRNA EGFRvIII mutante foi encontrado em teci-dos de glioma de alto grau ressectados (n = 18) e o resultado foi comparado a pla-quetas do mesmo paciente e a plaquetas de sujeitos controles saudáveis (n = 30). As amostras foram codificadas e RT-PCR foi realizada em um ensaio cego. Quatro das 18 amostras de glioma (22,5%) contiveram o transcrito EGFRvIII, como observado antes. Notavelmente, EGFRvIII pode ser amplificado de plaquetas em 3 destes4 pacientes positivos-EGFRvIII (75%), e em nenhuma das plaquetas dos doadores saudáveis (n = 12), enquanto mRNA GAPDH foi detectado em todas as amostras de plaquetas. Um possível sinal negativo falso foi detectado nas plaquetas de somente um paciente, o que pode ser atribuído a inadequado processamento da amostra de sangue. Ao contrário, um paciente com amostra de tecido negativa-EGFRvIII foi po- sitiva-EGFRvIII na amostra de plaqueta, mais provavelmente devido a distribuição heterogênea de foci positivos EGFRvIII em gliomas de alto grau.
[00144]Para demonstrar que a presença de menssagens associadas com tumor não é única para plaquetas de pacientes de glioma nós reportamos a presença de mRNAs codificando para os marcadores de câncer de próstata PCA3 e PSA em plaquetas de pacientes de câncer de próstata (n = 12) e sua ausência em plaquetas de sujeitos controles saudáveis (n = 10) (Ver Figura 4). Finalmente, usando arranjos de expressão de gene foram determinados os perfis de expressão de mRNA de plaquetas isoladas de sujeitos controles saudáveis (n = 12), e pacientes de glioma (n = 8). Distintos perfis de expressão de mRNA foram obtidos e uma assinatura mínima de biomarcador de glioma foi detectada (Fig. 1C, painel esquerdo).Interessantemente, vários dos potenciais biomarcadores forampobremente detectá- veis em amostras controles, enquanto nas amostras de glioma eles foram altamente expressos (Fig. 1C, painel direito).
[00145]Em conclusão, as verificações dos presentes inventores demonstram que as plaquetas de sangue contêm marcadores de câncer na forma de RNA deri-vado de tumor ou associado a tumor e, por isso, podem servir como uma plataforma de diagnóstico para a formação de perfil molecular de câncer no contexto de medici-na personalizada.
Claims (14)
1.Processo de análise de uma amostra de sangue de um indivíduo para a presença de um marcador de câncer, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito processo compreende as etapas de: a)extração de ácido nucleico de trombócitos na dita amostra de sangue para prover uma fração de ácido nucleico extraído de trombócito, e b)análise da dita fração de ácido nucleico extraído de trombócito para a pre-sença de um marcador de câncer, em que o dito câncer é uma mutação específica de câncer em um gene de uma célula nucleada do dito indivíduo, ou em que o dito marcador de câncer é um perfil de expressão específico de câncer de genes de uma célula nucleada do dito indivíduo, em que a dita célula nu- cleada não é um megacariócito.
2.Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito câncer é um câncer de tumor sólido.
3.Processo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito câncer é selecionado a partir de câncer de cólon, pâncreas, cérebro, bexiga, mama, próstata, pulmão, mama, ovário, útero, fígado, rim, baço, timo, tireoide, tecido nervoso, tecido epitelial, nódulo linfático, osso, músculo e pele.
4.Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita mutação específica de câncer está em um gene cromossômico, ou em que o dito perfil de expressão específico de câncer é de genes cromossômicos.
5.Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito ácido nucleico é ácido ribonucleico (RNA).
6.Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito ácido nucleico é mRNA.
7.Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita etapa b) de análise da dita fração de áci- do nucleico extraído de trombócito para a presença de um marcador de câncer com-preende a amplificação seletiva de: i)a dita mutação através de amplificação por reação em cadeia da polimera- se via transcriptase reversa usando pelo menos um iniciador ou sonda de amplifica-ção específica de mutação, ou ii)uma pluralidade de mRNAs através de amplificação por reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa para determinar o nível de expressão dos genes cromossômicos que codificam os ditos mRNAs para, desse modo, prover um perfil de expressão para os ditos genes e comparar o dito perfil de expressão a um perfil de referência.
8.Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito processo é parte de um processo de di-agnóstico de câncer em um indivíduo, e em que a presença do dito marcador de câncer na dita fração de ácido nucleico extraída de trombócito é indicativa do dito indivíduo sofrer do dito câncer.
9.Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito marcador de câncer é uma mutação es-pecífica de câncer em pelo menos um dos genes KRAS, EGFR e BRAF.
10.Processo para análise do estágio da doença ou da eficácia de um trata-mento de câncer em um indivíduo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: -análise de uma amostra de sangue de um indivíduo para a presença de um marcador de câncer usando o processo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em um primeiro ponto no tempo para, desse modo, prover um primeiro valor para o nível do dito marcador de câncer no dito indivíduo, -análise de uma amostra de sangue do dito indivíduo para a presença de um marcador de câncer usando o processo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em um segundo ponto no tempo para, desse modo, prover um segundo valor para o nível do dito marcador de câncer no dito indivíduo, em que o dito indivíduo foi submetido a um tratamento de câncer entre os ditos primeiro e se-gundo pontos no tempo.
11.Processo para análise do estágio de um câncer em um indivíduo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de: -análise de uma amostra de sangue de um indivíduo para a presença de um marcador de câncer usando o processo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, para, desse modo, prover um valor teste para o nível do dito marcador de câncer no dito indivíduo, e-provimento de um valor referência para o nível do dito marcador de câncer em que o dito valor de referência é correlacionado a um estágio particular da doença.
12.Dispositivo para diagnóstico de câncer CARACTERIZADO pelo fato de que o dispositivo compreende um suporte e pelo menos um agente para determina-ção específica de um nível e/ou atividade de pelo menos um mutante de ácido nu- cleico em uma amostra compreendendo trombócitos do indivíduo ligado ao dito su-porte, e um meio legível em computador que tem instruções executáveis em compu-tador para realização do processo, como definido em qualquer uma das reivindica-ções 1 a 9.
13.Dispositivo, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito pelo menos um agente é uma sonda de oligonucleotídeo ou inicia-dor de sequenciamento.
14.Dispositivo, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um dispositivo de fluxo lateral, um bastão de imersão ou um cartucho para realização de uma reação de hibridização de ácido nucleico entre: -um ácido nucleico extraído de trombócitos e pelo menos uma sonda de oli- gonucleotídeo ou iniciador de amplificação específico de mutação, em que a dita sonda de oligonucleotídeo ou iniciador de amplificação específico de mutação é es-pecífica para uma mutação específica de câncer, ou -um ácido nucleico extraído de trombócitos e uma pluralidade de sondas de oligonucleotídeos ou iniciadores de amplificação específicos de genes para fornecer um perfil de expressão de genes específicos de câncer.
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