CN113430264A - 红细胞核酸在鉴定肿瘤的突变类型中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及红细胞核酸在鉴定肿瘤的突变类型中的应用。具体地,本发明提供了一种用于检测红细胞内的一种或多种肿瘤特异性突变的试剂组或试剂盒,以及用于鉴定肿瘤特异性突变的方法。本发明的试剂组或试剂盒或方法可以准确鉴定肿瘤的发生和/或突变的类型从而用于肿瘤诊断,提高临床指导水平和分子分型的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域,具体而言,涉及红细胞核酸在鉴定肿瘤的发生和/或突变类型中的应用。
背景技术
随着基因诊断成本的大幅下降,基因诊断技术逐渐进入临床。临床上越来越多的利用基因诊断的信息进行精准医疗。精准医疗作为下一代诊疗技术,较传统诊疗方法有很大的技术优势。相比传统诊疗手段,精准医疗具有精准性和便捷性的优点,比如通过基因测序可以找出癌症的突变基因,从而迅速确定对症药物,省去患者尝试各种治疗方法的时间,提升治疗效果。基因诊断的样本主要来自组织和体液(包括血液)。临床肿瘤学实践依靠活检切除肿瘤组织以分析与肿瘤相关的遗传改变。虽然肿瘤组织活检是当前癌症诊断的金标准,并且是癌症治疗的重要工具,但近年来已经很清楚,从单个活检组织获得的信息提供了肿瘤在空间和时间上有限的快照,并且往往不能反映疾病的异质性。此外,肿瘤活检的侵入性对重复取样造成限制。
液体活检被认为是无创性肿瘤分析和监测中有前景的工具。几十年来,血液是肿瘤相关基因的丰富来源,包含:1)单核细胞组分:包括白细胞、循环肿瘤细胞(circulatingtumor cells,CTC)和循环内皮细胞(circulatingendothelial cells,CEC);2)血浆和血清:包括细胞外囊泡(extracellular vesicles,EV)、胞外游离DNA(cell-free DNA,cfDNA)和游离RNA(cell-free RNA,cfRNA)、血浆蛋白和代谢物以及肿瘤“教育”的血小板(tumor-educated platelets,TEP)。这些生物分子和生物资源被认为是原发性肿瘤的肿瘤发生和全身性活动的一部分(例如CTC、CEC、EV、cfRNA和TEP),或被认为仅起源于肿瘤细胞凋亡和坏死期间的被动释放(例如cfDNA),而且大部分在血浆中,或者来源于白细胞。但是,一方面上述液体活检技术的对象在血液中的含量非常低;另一方面,cfDNA只有极少数是来源于癌细胞的,大部分来自于免疫细胞及其他正常的细胞,从而导致液体活检的灵敏度和准确性较低。
基于现有液态活检技术的突变检测,主要用于肿瘤的分子分型和临床用药指导。但受制于以上的技术局限,无法提供满足临床需求的高灵敏度检测,在肿瘤发生和复发的早期尤为困难。另外血清来源的cfDNA有来自于非肿瘤凋亡细胞和免疫细胞的突变,亦无法用于肿瘤的鉴别诊断。
因此迫切需要开发新的操作简单、来源丰富,灵敏度和准确性能够满足临床需求的肿瘤特异性突变检测技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于鉴定肿瘤发生和/或突变类型的试剂盒及方法。
为了实现上述目的,本发明提供了如下技术方案:
本发明的第一方面,提供了一种试剂盒,所述试剂盒包括核酸检测试剂组,所述核酸检测试剂组被配置用于检测红细胞中的靶核酸。
在另一优选例中,所述试剂盒被配置为:根据红细胞中的靶核酸检测结果鉴定肿瘤的发生和/或突变类型。
在另一优选例中,所述试剂盒被配置为:
(1)根据鉴定出的肿瘤的突变类型指导临床用药;或者,
(2)根据鉴定出的肿瘤的突变类型判断待测对象的肿瘤分子分型;或者,
(3)根据鉴定出的突变用于肿瘤的阳性鉴别诊断。
在另一优选例中,所述核酸检测试剂组包括红细胞裂解剂。
在另一优选例中,所述核酸检测试剂组还包括红细胞分离试剂。
在另一优选例中,所述核酸检测试剂组还包括核酸提取试剂。
在另一优选例中,所述核酸提取试剂为DNA提取试剂或RNA提取试剂。
在另一优选例中,所述靶核酸为肿瘤特异性基因突变。
在另一优选例中,所述靶核酸起源于肿瘤细胞。
在另一优选例中,所述试剂组包括靶核酸特异性的探针和/或引物。
在另一优选例中,所述试剂组适用于以下一种或多种技术或方法:PCR技术、crisper/cas技术(如crisper/cas12技术)、免疫荧光法、高通量测序(NGS)技术。
在另一优选例中,所述试剂组包括特异性扩增所述靶核酸的引物。
在另一优选例中,所述试剂盒中还包含一说明书,所述说明书注明所述试剂组用于检测红细胞中的核酸,并且注明所述试剂盒用于鉴定肿瘤的突变类型。
在另一优选例中,所述肿瘤为恶性肿瘤。
在另一优选例中,所述恶性肿瘤为恶性实体肿瘤或血液肿瘤。
在另一优选例中,所述恶性实体肿瘤为选自下组的一种或多种:肺癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、甲状腺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、宫颈癌、结直肠癌。
在另一优选例中,所述试剂盒的使用方法包括步骤:
(a)提供待测对象的红细胞来源的核酸样本;和
(b)检测该核酸样本中的一种或多种肿瘤特异性基因突变。
在另一优选例中,步骤(b)中对靶核酸的基因序列进行检测,从而获得靶核酸的序列信息。
在另一优选例中,所述试剂盒的使用方法还包括步骤:
(c)根据步骤(b)测得的靶核酸的序列信息,判断肿瘤的突变类型。
在另一优选例中,所述靶核酸起源于肿瘤细胞。例如,肿瘤细胞中的靶核酸片段通过某种途径进入红细胞内,从而在红细胞内被检测到。
本发明的第二方面,提供了一种核酸样本,所述核酸样本用于鉴定肿瘤的突变类型或用于肿瘤的阳性鉴别诊断(用于鉴定肿瘤的发生),并且,所述核酸样本为红细胞来源的核酸。
在另一优选例中,所述核酸为DNA和/或RNA。
在另一优选例中,所述核酸为红细胞经裂解后提取制得的核酸。
在另一优选例中,所述核酸样本为肿瘤患者的核酸样本。
在另一优选例中,所述核酸样本包含起源于肿瘤细胞的核酸。
在另一优选例中,所述核酸样本中的核酸包含肿瘤特异性基因突变。
本发明的第三方面,提供了一种制备核酸样本的方法,所述核酸样本用于鉴定肿瘤的突变类型,并且,所述方法包括步骤:
(1)从全血中分离红细胞;
(2)从步骤(1)获得的红细胞中提取核酸,从而制得所述核酸样本。
在另一优选例中,所述步骤(1)包括:
(1a)将经抗凝处理的全血离心,去除血浆,获得含红细胞的沉淀;
(1b)使用淋巴细胞分离液处理步骤(1a)获得的含红细胞的沉淀,离心并去除有核细胞,从而获得红细胞。
在另一优选例中,所述步骤(2)中,使用红细胞裂解液裂解步骤(1)获得的红细胞,离心后取上清液,从该上清液中提取核酸,从而制得所述核酸样本。
本发明的第四方面,提供了核酸检测试剂组的用途,用于制造试剂盒,该试剂盒用于鉴定肿瘤的发生和/或突变类型,并且所述核酸检测试剂组被配置用于检测红细胞中的核酸。
在另一优选例中,所述检测包括步骤:
(a)制备待测对象的红细胞来源的核酸样本;和
(b)检测该核酸样本中的一种或多种肿瘤特异性基因突变。
在另一优选例中,步骤(b)中对靶核酸的基因序列进行检测,从而获得靶核酸的序列信息。
在另一优选例中,所述试剂盒的使用方法包括步骤:
根据步骤(b)测得的靶核酸的序列信息,判断肿瘤的发生和/或突变类型。
在另一优选例中,所述核酸为DNA和/或RNA。
在另一优选例中,所述核酸为红细胞经裂解后提取制得的核酸。
在另一优选例中,所述核酸样本为肿瘤患者的核酸样本。
在另一优选例中,所述核酸样本包含起源于肿瘤细胞的核酸。
在另一优选例中,所述核酸样本中的核酸包含肿瘤特异性基因突变。
在另一优选例中,所述肿瘤选自下组:肺癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、甲状腺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、宫颈癌、结直肠癌。
在另一优选例中,所述核酸检测试剂组包括红细胞裂解剂。
在另一优选例中,所述核酸检测试剂组还包括红细胞分离试剂。
在另一优选例中,所述核酸检测试剂组还包括核酸提取试剂。
在另一优选例中,所述核酸提取试剂为DNA提取试剂或RNA提取试剂。
在另一优选例中,所述靶核酸为肿瘤特异性基因突变。
在另一优选例中,所述靶核酸起源于肿瘤细胞。
在另一优选例中,所述试剂组包括靶核酸特异性的探针和/或引物。
在另一优选例中,所述检测通过高通量测序技术完成。
在另一优选例中,所述检测通过PCR技术完成。
在另一优选例中,所述检测通过crisper/cas12技术完成。
在另一优选例中,所述检测通过免疫荧光法完成。
在另一优选例中,所述肿瘤特异性基因突变包括选自下组的基因所发生的突变:
EGFR、KRAS、NRAS、NTRK、BRAF、HER2、MET、ALK、ROS-1、RET、BRAC1/2、PTEN、TP53、PIK3CA、RHBDF2、BLM、PALB2、CTHRC1、ASCC1、MSR1、ALDH2、ADH1B、CYP2E1、和GSTM1。
本发明的第五方面,提供了一种鉴定肿瘤的发生和/或突变类型的方法,所述方法包括步骤:
(a)提供待测对象的红细胞来源的核酸样本;和
(b)检测该核酸样本中的一种或多种肿瘤特异性基因突变。
在另一优选例中,步骤(b)中对靶核酸的基因序列进行检测,从而获得靶核酸的序列信息,然后根据步骤(b)测得的序列信息,判断肿瘤的发生和/或突变类型。
在另一优选例中,所述试剂盒的使用方法包括步骤:
(c)根据步骤(b)测得的靶核酸的序列信息,判断肿瘤的发生和/或突变类型。
在另一优选例中,所述肿瘤选自下组:肺癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、甲状腺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、宫颈癌、结直肠癌。
在另一优选例中,所述检测通过高通量测序技术完成。
在另一优选例中,所述检测通过PCR技术完成。
在另一优选例中,所述检测通过crisper/cas12技术完成。
在另一优选例中,所述检测通过免疫荧光法完成。
在另一优选例中,所述肿瘤特异性基因突变包括选自下组的基因所发生的突变:
EGFR、KRAS、NRAS、NTRK、BRAF、HER2、MET、ALK、ROS-1、RET、BRAC1/2、PTEN、TP53、PIK3CA、RHBDF2、BLM、PALB2、CTHRC1、ASCC1、MSR1、ALDH2、ADH1B、CYP2E1、和GSTM1。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
具体实施方式
目前现有文献均表示,红细胞作为无核细胞,并不具有DNA或不能合成任何RNA,本文中所用“红细胞”和“成熟红细胞”可以互换使用。而本发明人经过长期深入的基础研究和临床实践,意外地发现了来自肿瘤患者红细胞的核酸样本中含有肿瘤特异性的基因突变。基于此,发明人研发出了用于鉴定肿瘤的突变类型的试剂盒及方法。该肿瘤包括肺癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、甲状腺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、宫颈癌、结直肠癌等多种癌症。本发明在鉴定肿瘤的发生和/或突变类型中具有重要的应用价值。
术语
靶核酸
本发明中术语“靶核酸”指检测者(通常为医疗检验人员)计划检测的目标核酸,为本领域常见的肿瘤特异性基因突变。
基因突变
本发明中术语“基因突变”或“突变”包括基因片段的重排、缺失、易位或融合,以及核苷酸的替换等。
阳性鉴别诊断
本发明中术语“阳性鉴别诊断”或“肿瘤阳性鉴别诊断”或“鉴定肿瘤的发生”指通过检测到肿瘤特异性基因突变来确认肿瘤存在,和/或,通过对肿瘤治疗后随访患者的肿瘤特异性基因突变检测来判断肿瘤是否复发并且同时更新肿瘤特异性基因突变等。
待阳性鉴别诊断人群
本发明中术语“待阳性鉴别诊断人群”,包括拟进行肿瘤治疗的肿瘤患者或肿瘤高危人群和/或肿瘤治疗后需要随访的人群。
本发明中,肿瘤特异性基因突变包括但不限于选自下组的一种或多种基因突变:
在另一优选例中,所述多种为至少2种;优选为2-500种;优选为2-300种;优选为2-200种;优选为2-100种;优选为2-50种或2-10种。
在另一优选例中,所述肿瘤为恶性实体肿瘤或血液肿瘤。
在另一优选例中,所述恶性实体肿瘤为选自下组的一种或多种:肺癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、甲状腺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、宫颈癌、结直肠癌。
如本发明所用,术语“红细胞中的核酸”或“红细胞来源的核酸”是指从红细胞中提取获得的核酸。本发明人意外发现,癌细胞中发生的基因突变可以在红细胞中的核酸中检测到,因此说明癌细胞的基因突变能够转移至红细胞中。基于此,可以通过检测红细胞中的肿瘤特异性基因突变鉴定肿瘤的突变类型。
本发明中对红细胞来源的核酸中的靶核酸的基因序列进行检测,从而获得靶核酸的序列信息,然后根据序列信息,判断肿瘤的突变类型。对靶核酸的基因序列进行检测的方式,包括使用测序技术对靶核酸进行测序,获得靶核酸的核苷酸序列;以及,使用其它方式对靶核酸中的基因突变进行特异性检测,判断是否存在特定的基因突变(比如通过特异性扩增基因突变位点的PCR,来检测核酸样本中是否存在基因突变)。因此,本发明中的术语“序列信息”可以指“核苷酸序列”,也可以指“是否存在特定的基因突变”。对靶核酸的基因序列进行检测的方法,包括但不限于高通量测序技术、PCR技术、crisper/cas12技术、免疫荧光法等。
本发明所述高通量测序技术可以是本领域目前已知的任何一种高通量测序技术。
术语“高通量测序技术”(High-throughput sequencing)又称“下一代”测序技术("Next-generation"sequencing technology,缩写为NGS),以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。主要有以下几种:大规模平行签名测序(Massively Parallel Signature Sequencing,MPSS)、聚合酶克隆(PolonySequencing)、454焦磷酸测序(454pyrosequencing)、Illumina(Solexa)sequencing、ABISOLiD sequencing、离子半导体测序(Ion semiconductor sequencing)、DNA纳米球测序(DNA nanoball sequencing)等。
本发明所述PCR技术包括本领域目前已知的任何一种PCR技术,例如RT-PCR、qRT-PCR、ddPCR等等。
PCR是一种体外DNA扩增技术,是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下,依赖于DNA聚合酶的酶促合反应,将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性——低温退火——引物延伸”三步反应的多次循环,使DNA片段在数量上呈指数增加,从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。PCR技术常与其他技术结合起来使用,如RT-PCR、qRT-PCR、数字PCR、梯度PCR、多重PCR、降落PCR、巢式PCR等。
本发明所述crisper/cas12技术可以本领域目前已知的任何一种具体操作方法或步骤。
本发明所述免疫荧光法可以本领域目前已知的任何一种具体操作方法或步骤。
在本发明中,术语“一”、“一个”、“这”、“该”不仅仅指单数的个体,而是包括可以用来说明特定实施方式的通常的一类。
在本发明中,术语“待测对象”或“受试者”是指动物,特别是哺乳动物,例如人(包括肿瘤患者)。
在本发明中,术语“癌症”和“恶性肿瘤”可以互换使用。
在本发明中,术语“癌症患者”是指患有本发明所述癌症的人或其他动物。
在本发明中,术语“对照者”是正常者(或称为健康人)或非癌症患者。
所述正常者(或称为健康人)是指未患有疾病的受试者。
本文被所列举的基因名称,例如EGFR等,具有本领域公知的含义,并且应当按照其最宽泛的含义来理解,并不局限于特定核苷酸序列。例如,人EGFR的cDNA序列,本领域技术人员可以理解,由于基因变异等原因,在不同受试者中,该基因有可能存在一个或几个核苷酸的取代、添加或缺失,并具有与野生型基因基本相同的功能。这些变异体基因仍然被认为是EGFR基因。
本发明的方法中,可以同时检测一个或多个肿瘤特异性基因突变,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个。本领域技术人员可以理解,同时检测多个恶性肿瘤特异性基因突变有助于进一步提高诊断准确率。
除非另有说明,否则本说明书中所使用的科学及技术术语应具有本领域普通技术人员通常所了解的含义。通常,本说明书中所使用的与细胞及组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学及蛋白质与核酸化学有关的命名及其技术是本领域公知和常用的。
除非另有说明,否则本说明书中所使用的方法及技术一般根据本领域公知的和常规的方法和本说明书中所阐述的或引用的各种参考文献中所述的方式来进行。
鉴定肿瘤发生和/或突变类型
根据本发明的试剂盒可以用于检测红细胞中的一种或多种肿瘤特异性基因突变,进而可以根据该特定的基因突变的存在与否用于肿瘤的阳性鉴别诊断和肿瘤的分子类型。
通常,对于已经确诊的肿瘤患者而言,临床上需要对肿瘤的突变类型进行检测,以指导临床用药。因此,可以使用本发明的试剂盒和方法对肿瘤的突变类型进行检测,并且具有极高的高灵敏度和准确性。
本发明所述的红细胞内的核酸包括红细胞内的任何形式的RNA(如mRNA,MicroRNA等)和/或DNA(如cDNA,环状DNA等),本发明中也将其称之为红细胞来源的核酸。
所述核酸可以是现有技术中的任何一种或多种基因对应的RNA(如mRNA等)和/或DNA。
在另一优选例中,所述核酸含有肿瘤特异性突变。
在另一优选例中,所述核酸起源于肿瘤细胞。
核酸检测试剂组及试剂盒
根据本发明的用于检测红细胞中的靶核酸的核酸检测试剂组,可以包括:红细胞分离试剂、核酸提取试剂等。红细胞分离试剂为从全血中分离红细胞所用的试剂,包括但不限于PBS缓冲液、Ficoll淋巴细胞分离液。核酸提取试剂包括但不限于红细胞裂解液、以及本领域常规的DNA或RNA提取试剂。
根据本发明的用于检测红细胞中的靶核酸的试剂盒,包括上述核酸检测试剂组,其中核酸检测试剂组中的各试剂以空间上可区隔的方式分布于试剂盒中。试剂盒还包括说明书,记载了本发明试剂盒的肿瘤诊断的用途,以及,使用核酸检测试剂组从红细胞中制备核酸样本的步骤。
本发明的主要优点在于:
以红细胞中来源于肿瘤组织的核酸(如RNA和/或DNA)为检测对象具有非常大的优势,包括具有采样方便、操作简单、检测成本低的优点,而且针对肿瘤突变进行检测,灵敏度高、准确性高。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
试剂:
RNA酶抑制剂(Takara,货号2313B(A×5))
Trizol(Invitrogen,货号15596026)
设备:
离心机(Thermo Fisher,货号75007204)
PCR仪器(ABI 7300实时荧光定量PCR仪,7300实时PCR系统)
高通量测序仪器(Illumina,HiSeq 4000)
实施例1红细胞(RBC)来源的核酸样本制备
一、试剂
PBS缓冲液(样品数*4ml):PBS缓冲液可以现配现用(DEPC水配制)(Gibco PBS,公司Thermo Scientific,货号10010023,容量500mL)(PBS缓冲液,购自博士德生物工程有限公司,货号AR0030)
Ficoll淋巴细胞分离液(样品数*3ml),(人淋巴细胞分离液,购自达科为生物技术有限公司,商品名:达优,货号7111011/711101X,容量100mL)
DEPC水
干冰
二、仪器及耗材
可低温离心的小型高速离心机(1.5ml EP管离心)
Thermo Scientific Heraeus Multifuge X1R低温高速离心机(15ml离心管)
全套移液枪(eppendorf)1000ul/200ul/100ul/20ul/10ul/2.5ul
整套移液枪配套枪头(DNA/RNase free)1000ul/200ul/10ul
15ml离心管(=样品数),1.5ml EP管(=5*样品数,3个RBC,2个血清)(DNA/RNasefree)
eppendorf管架、15ml离心管架、1.5ml EP管储存盒、送样袋、泡沫盒、封口膜、手套、马克笔
三、实验操作
全血分离步骤:
①将储存全血的抗凝管放入离心机,4℃,150g,离心10min。结束后立即敞开离心机使之恢复室温。
②用1ml枪吸弃离心上清
③向RBC沉淀中加入2ml PBS,用枪轻轻吹打混匀以稀释RBC
④然后将加了3ml Ficoll淋巴细胞分离液的15ml离心管倾斜,沿管壁轻柔地将稀释的RBC加至淋巴细胞分离液面上层(操作要轻,避免RBC沉底)。
⑤800g,25℃常温,离心15min。
⑥用1mL移液枪吸弃RBC以上的所有上清,动作轻柔防止其他有核细胞落至RBC层。
⑦向RBC沉淀中加入等体积PBS(1.5-2ml),用枪轻轻吹打混匀以稀释RBC,待管尖壁上的深红全部吹成鲜红表明已混匀
⑧150g,25℃常温,离心15min,耗时20min
⑨用移液枪吸弃上清,下层沉淀即为较为纯净的RBC,将RBC分装到1.5ml RNase-free EP管中,即为RBC样品,储存于-80℃冰箱待用。
向RBC样品中加入适量红细胞裂解液(只会涨破红细胞,而其它细胞不会涨破),再次离心,取上清即为纯净的红细胞内含物,进一步用DNA或者RNA提取试剂盒(DNA提取试剂盒如QIAGEN的QIAamp Circulating核酸试剂盒;RNA提取试剂盒如天根生化科技(北京)有限公司的高效血液总RNA提取试剂盒(DP443))根据试剂盒说明书进行提取,即可获得红细胞来源的核酸样本。
实施例2肺癌检测
使用本发明的方法和试剂盒,对28例患者进行了肿瘤特异性突变检测,其中包括临床确诊的肺腺癌病例23例、炎性假瘤2例、肺鳞癌2例、胸腺瘤1例。
红细胞(RBC)来源的核酸样本制备方法参考实施例1。
组织来源的核酸样本制备方法为本领域的常规方法,例如可以采用试剂盒(GeneReadTMDNA FFPE Kit,Qiagen)进行制备。
血清来源的核酸样本制备方法为本领域的常规方法,例如可以采用试剂盒(QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit,Qiagen)进行制备。
将上述制备的组织来源的核酸样本通过NGS测序(高通量测序仪器(Illumina,HiSeq4000))进行EGFR基因突变分析。使用Geneseeq杂交富集探针(南京世和基因生物技术有限公司)对已建好的DNA文库进行目标基因靶标富集及扩增,包括:DNA捕获探针与文库杂交;捕获文库产物的清洗和回收;捕获文库与链霉亲和素磁珠结合;磁珠捕获文库清洗,去除非特异结合的文库。捕获后的文库按照Illumina试剂盒说明书的操作步骤,在IlluminaHiSeq 4000高通量测序平台上样,DNA在试剂盒Flow cell上形成DNA簇,测序平台通过单个碱基合成后暂停、荧光检测、合成恢复的循环完成DNA高通量测序。
对红细胞(RBC)来源的核酸样本分别进行NGS测序和qPCR检测,其中NGS测序的步骤如上所述。qPCR检测采用Therascreen EGFR RGQ PCR试剂盒或Therascreen KRAS RGQPCR试剂盒(QIAGEN)进行。
对血清来源的核酸样本进行血清ctDNA的NGS测序(高通量测序仪器(Illumina,HiSeq4000))。
检测结果如下表所示,结果表明,使用NGS测序进行肿瘤特异性突变检测,针对红细胞来源的核酸样本的检测结果和针对肿瘤组织来源的核酸样本检测结果100%一致,且所有非肿瘤样本均未有任何突变检出。而采用血清ctDNA进行NGS测序检测,仅能检测出9%(1/11)的肿瘤特异性突变。因此,本发明的红细胞来源的核酸样本完全能够取代组织来源的核酸样本作为肿瘤诊断的核酸样本使用,而且具有准确度高、灵敏度高、取样方便、安全性更佳的优势。
另外,使用qPCR的方法对红细胞来源的核酸样本进行检测,在所检测的10个阳性样本中,均能够准确检测出肿瘤特异性突变。说明使用本发明方法制备的红细胞来源的核酸样本质量较佳,也能够用于qPCR方法进行肿瘤诊断,从而进一步降低肿瘤诊断的成本。
表1
注备:“NA”为没有分期信息;“-“为没有检测到突变,“N”为没有检测。
现有技术表明,以tDNA(肿瘤组织)为金标准对照,采用ctDNA(血液样本)检测(检测平台:Ion二代测序仪(Life Technologies))EGFR肿瘤突变的灵敏度和一致率均较低,难以满足临床诊断需要。本发明的试剂盒和方法,以红细胞来源的核酸样本进行检测,极大的提高了肿瘤突变检测的灵敏度和一致率,取得了预料不到的技术效果。
实施例3结直肠肿瘤样本检测
对结直肠肿瘤术后患者(包括部分肠镜手术和活检的患者)的血液样本进行了肿瘤特异性突变检测,同时对同一患者的血液样本用普通ctDNA方法进行肿瘤特异性突变检测,并与其肿瘤组织样本的突变检测结果分别对做了对照。其中包括临床确诊的结肠癌病例13例、直肠癌病例5例、良性病变7例(包括结肠腺瘤、炎症性肠息肉、化生性息肉)。
具体检测程序参考实施例2,检测结果如下表2所示。结果表明,使用NGS测序进行结直肠肿瘤特异性突变检测,针对红细胞来源的核酸样本的检测结果和针对肿瘤组织来源的核酸样本检测结果100%一致,且所有非肿瘤样本均未有任何突变检出。因此,本发明的红细胞来源的核酸样本完全能够取代组织来源的核酸样本作为肿瘤诊断的核酸样本使用,而且具有准确度高、灵敏度高、取样方便、安全性更佳的优势。
另外,使用qPCR的方法对红细胞来源的核酸样本进行检测,在所检测的7个阳性样本中,均能够准确检测出肿瘤特异性突变。说明使用本发明方法制备的红细胞来源的核酸样本质量较佳,也能够用于qPCR方法进行肿瘤诊断,从而进一步降低肿瘤诊断的成本。
表2
注备:“NA”为没有分期信息;“-“为没有检测到突变;“N”为没有检测。
实施例4乳腺肿瘤样本检测
对乳腺肿瘤术后患者(包括空心针穿刺患者)的血液样本进行了肿瘤特异性突变检测,同时对同一患者的血液样本用普通ctDNA方法进行肿瘤特异性突变检测,并与其肿瘤组织样本的突变检测结果分别对做了对照。其中包括临床确诊的乳腺癌病例19例、良性病变6例(包括乳腺纤维瘤和乳腺囊性增生)。
具体检测程序参考实施例2,检测结果如下表3所示。结果表明,使用NGS测序进行乳腺肿瘤特异性突变检测,针对红细胞来源的核酸样本的检测结果和针对肿瘤组织来源的核酸样本检测结果100%一致。因此,本发明的红细胞来源的核酸样本完全能够取代组织来源的核酸样本作为肿瘤诊断的核酸样本使用,而且具有准确度高、灵敏度高、取样方便、安全性更佳的优势。
另外,使用qPCR的方法对红细胞来源的核酸样本进行检测,在所检测的9个阳性样本中,均能够准确检测出肿瘤特异性突变。说明使用本发明方法制备的红细胞来源的核酸样本质量较佳,也能够用于qPCR方法进行肿瘤诊断,从而进一步降低肿瘤诊断的成本。
表3
注备:“NA”为没有分期信息;“-“为没有检测到突变;“N”为没有检测。
实施例5食管肿瘤样本检测
对食管肿瘤术后患者(包括部分食管镜镜手术和活检的患者)的血液样本进行了肿瘤特异性突变检测,同时对同一患者的血液样本用普通ctDNA方法进行肿瘤特异性突变检测,并与其肿瘤组织样本的突变检测结果分别对做了对照。其中包括临床确诊的食管上皮癌病例12例,贲门癌3例、食管腺癌1例,食管平滑肌瘤2例(良性)。
具体检测程序参考实施例2,检测结果如下表4所示。结果表明,使用NGS测序进行食管肿瘤特异性突变检测,针对红细胞来源的核酸样本的检测结果和针对肿瘤组织来源的核酸样本检测结果100%一致,且所有非肿瘤样本均未有任何突变检出。因此,本发明的红细胞来源的核酸样本完全能够取代组织来源的核酸样本作为肿瘤诊断的核酸样本使用,而且具有准确度高、灵敏度高、取样方便、安全性更佳的优势。
另外,使用qPCR的方法对红细胞来源的核酸样本进行检测,也能够准确检测出肿瘤特异性突变。说明使用本发明方法制备的红细胞来源的核酸样本质量较佳,也能够用于qPCR方法进行肿瘤诊断,从而进一步降低肿瘤诊断的成本。
表4
注备:“NA”为没有分期信息;“-“为没有检测到突变;“N”为没有检测。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (15)
1.一种试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括核酸检测试剂组,所述核酸检测试剂组被配置用于检测红细胞中的靶核酸;所述试剂盒被配置为:根据红细胞中的靶核酸检测结果鉴定肿瘤的发生和/或突变类型。
2.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒被配置为:
(1)根据鉴定出的突变用于肿瘤的阳性鉴别诊断;或者
(2)根据鉴定出的肿瘤的突变类型判断待测对象的肿瘤分子分型;或者
(3)根据鉴定出的肿瘤的突变类型指导临床用药。
3.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述靶核酸为提取自待阳性鉴别诊断人群。
4.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述鉴定肿瘤的发生和/或突变类型包括鉴定选自下组的基因所发生的突变:EGFR、KRAS、NRAS、NTRK、BRAF、HER2、MET、ALK、ROS-1、RET、BRAC1/2、PTEN、TP53、PIK3CA、RHBDF2、BLM、PALB2、CTHRC1、ASCC1、MSR1、ALDH2、ADH1B、CYP2E1、和GSTM1。
5.一种核酸样本,其特征在于,所述核酸样本用于鉴定肿瘤的发生和/或突变类型,并且,所述核酸样本为红细胞来源的核酸。
6.一种制备核酸样本的方法,其特征在于,所述核酸样本用于鉴定肿瘤的发生和/或突变类型,并且,所述方法包括步骤:
(1)从全血中分离红细胞;
(2)从步骤(1)获得的红细胞中提取核酸,从而制得所述核酸样本。
7.核酸检测试剂组的用途,其特征在于,用于制造试剂盒,该试剂盒用于鉴定肿瘤的发生和/或突变类型,并且所述核酸检测试剂组被配置用于检测红细胞中的核酸。
8.如权利要求7所述的用途,其特征在于,使用所述核酸检测试剂组检测红细胞中的核酸,包括步骤:
(a)制备待测对象的红细胞来源的核酸样本;和
(b)检测该核酸样本中的一种或多种肿瘤特异性基因。
9.如权利要求8所述的用途,其特征在于,步骤(b)中对靶核酸的基因序列进行检测,获得靶核酸的序列信息,然后根据获得的靶核酸的序列信息鉴定肿瘤的发生和/或突变类型。
10.如权利要求7所述的用途,其特征在于,所述核酸样本为肿瘤患者的核酸样本。
11.如权利要求7所述的用途,其特征在于,所述肿瘤特异性基因突变包括选自下组的基因所发生的突变:EGFR、KRAS、NRAS、NTRK、BRAF、HER2、MET、ALK、ROS-1、RET、BRAC1/2、PTEN、TP53、PIK3CA、RHBDF2、BLM、PALB2、CTHRC1、ASCC1、MSR1、ALDH2、ADH1B、CYP2E1、和GSTM1。
12.一种鉴定肿瘤的发生和/或突变类型方法,其特征在于,所述方法包括步骤:
(a)提供待测对象的红细胞来源的核酸样本;和
(b)检测该核酸样本中的一种或多种肿瘤特异性突变。
13.如权利要求12所述的方法,其特征在于,步骤(b)中对靶核酸的基因序列进行检测,从而获得靶核酸的序列信息,然后根据步骤(b)测得的序列信息,判断肿瘤的发生和/或突变类型。
14.如权利要求12所述的方法,其特征在于,所述核酸样本为肿瘤患者的核酸样本。
15.如权利要求12所述的方法,其特征在于,所述肿瘤特异性基因突变包括选自下组的基因所发生的突变:EGFR、KRAS、NRAS、NTRK、BRAF、HER2、MET、ALK、ROS-1、RET、BRAC1/2、PTEN、TP53、PIK3CA、RHBDF2、BLM、PALB2、CTHRC1、ASCC1、MSR1、ALDH2、ADH1B、CYP2E1、和GSTM1。
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