ES2589582T3

ES2589582T3 - Virus de plantas denominado virus del torrado del tomate

Info

Publication number: ES2589582T3
Application number: ES06700425.9T
Authority: ES
Inventors: Johannes Franciscus Johanna M. Van Den Heuvel; Paulus Cornelis Maris; Marinus Verbeek; Annette Maria Dullemans; René Andries Antonius VAN DER VLUGT
Original assignee: Monsanto Invest BV
Current assignee: Monsanto Invest BV
Priority date: 2005-01-07
Filing date: 2006-01-09
Publication date: 2016-11-15
Anticipated expiration: 2026-01-09
Also published as: MX2007008344A; AU2008260731B2; KR20070110287A; IL184473A; BRPI0606260A2; JP2008526224A; RU2411290C2; IL218289A; BRPI0812428A2; AU2008260731A1; US20100146659A1; EP1838847A1; US9080142B2; US20120117680A1; AU2006213170A1; IL218289A0; IL184473A0; EP1838847B1; WO2006085749A1; US20080044427A1

Abstract

Ácido nucleico aislado o recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:1, la SEQ ID NO:2, tal como se define en las figuras 5 y 6, respectivamente, secuencias que tienen una homología de la secuencia de nucleótidos, como mínimo, del 70% con la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:2, en el que las secuencias homólogas son secuencias de nucleótidos de un virus ToTV que codifican una proteína putativa de movimiento y tres proteínas de la cápside, o una helicasa, proteasa y ARN polimerasa dependiente de ARN, respectivamente, y sus cadenas complementarias.

Description

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DESCRIPCION

Virus de plantas denominado virus del torrado del tomate SECTOR DE LA INVENCION

La presente invencion se encuentra en el sector de las enfermedades de plantas. Mas en particular, la presente invencion se refiere a procedimientos para la deteccion de un nuevo virus de plantas aislado de tomate, a procedimientos de deteccion de plantas resistentes y a las utilizaciones del virus de plantas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

El tomate, Solanum lycopersicum (antes Lycopersicon esculentum) es susceptible a gran numero de especies viricas. Algunos de los virus del tomate mas destacados incluyen el virus del bronceado del tomate (TSWV; genero Tospovirus); el virus del mosaico del pepino (PepMV; genero Potexvirus), y el virus del rizado amarillo del tomate (TYLCV; genero Begomovirus). El dano que estas enfermedades causan a la planta varla desde decoloracion de las hojas y lesiones necroticas hasta la perdida grave de cultivos y la muerte de la planta.

La capacidad para proporcionar plantas resistentes es de suma importancia para los cultivadores comerciales, y para algunos de los virus mas daninos desde el punto de vista economico, se han producido variedades de plantas resistentes. Sin embargo, de vez en cuando, surgen nuevos virus que pueden causar un dano considerable en los cultivos.

En 1996, se informo de un nuevo virus del tomate, que habla infectado a plantas de tomate en EE.UU. e Italia desde 1993, y se denomino virus de la clorosis infecciosa del tomate (TICV; genero Crinivirus; Duffus y otros, 1996). Otro nuevo virus del tomate del mismo genero se notifico en 1998. Se demostro que este virus habla infectado a plantas del tomate en EE.UU. desde 1989 y de denomino virus de la clorosis del tomate (ToCV; Wisler y otros, 1998). Se observo que estos dos nuevos virus se diseminaban mediante una mosca blanca, siendo el insecto un vector muy eficaz de la transmision de la enfermedad.

En general se cree que la distribucion geografica de los virus conocidos aumentara y que seguiran apareciendo nuevos virus, en parte como resultado de la recombinacion de diferentes virus para formar nuevas cepas o nuevos virus. El desarrollo de variedades de cultivo resistentes puede desempenar un papel importante en el exito de la gestion de estas enfermedades.

CARACTERISTICAS DE LA INVENCION

Recientemente, se ha descubierto un nuevo virus en plantas de tomate de Espana, que causo sintomas que no se pudieron atribuir a ningun virus conocido. Las plantas mostraron lesiones necroticas en las hojas y anillos marrones en los frutos, y mostraron una reduccion del crecimiento. Las pruebas serologicas (ELISA) indicaron la presencia del virus del mosaico del pepino (PepMV). De hecho, las investigaciones con el microscopio electronico revelaron las particulas similares a varillas tipicas de los potexvirus. Sin embargo, tambien se encontraron particulas viricas de forma esferica en el tejido de la hoja infectada. Los presentes inventores fueron capaces de separar el nuevo virus del complejo con PepMV. El nuevo virus se denomino provisionalmente virus del torrado del tomate (ToTV).

Para poder rastrear su origen, controlar su epidemiologla y evitar la posible propagation de la enfermedad, es de gran importancia poder reconocer la enfermedad en una etapa temprana. Solo entonces se pueden adoptar suficientes medidas para aislar las plantas e iniciar precauciones fitosanitarias. En este momento, no hay herramientas de diagnostico disponibles. En consecuencia, hay una necesidad de desarrollar herramientas de diagnostico para esta enfermedad. Ademas, en la actualidad no se conocen plantas que presenten una resistencia especifica a este nuevo virus, mientras que hay una necesidad para el desarrollo de plantas resistentes de este tipo.

Este virus de plantas se denomino provisionalmente virus del torrado del tomate (ToTV) y se deposito en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) en Braunschweig, Alemania, el 24 de noviembre de 2004 bajo el numero de referencia depositante ToTV-E01 (DSM 16999).

El virus causa los sintomas de la enfermedad en las plantas de tomate, asl como en otras plantas, y puede causar los sintomas por si mismo o en un complejo con otros virus o enfermedades.

Los primeros sintomas sistemicos consisten en manchas necroticas en la parte superior de la planta, comenzando en la base de las hojas de un foliolo. Las manchas necroticas se expanden y se rodean de una zona de color amarillo o verde claro (vease la figura 1). No todas las hojas infectadas sistemicas muestran sintomas, sin embargo, el virus se puede detectar en estas hojas, por ejemplo, mediante microscopia electronica. Los frutos infectados con ToTV muestran anillos necroticos. El crecimiento de las plantas infectadas se puede reducir en comparacion con las plantas no infectadas.

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La descripcion anterior se refiere a las plantas recien infectadas con el virus aislado y no tiene por que reflejar los sintomas exactos encontrados en el campo. Factores, tales como la raza o la variedad de la planta, la etapa de desarrollo, la presion de enfermedades adicionales y los factores abioticos (temperature y humedad relativa, por ejemplo) determinaran en ultima instancia la expresion y las caracterlsticas de los sintomas.

Las particulas viricas tienen una forma esferica (icosaedrica) con un diametro de aproximadamente 28 nm (vease la figura 2). Las particulas viricas se componen, como mlnimo, de tres protelnas de la capside de aproximadamente 23, 26 y 35 kDa (vease la figura 3). Tras la purificacion, el virus muestra, como mlnimo, dos bandas visibles en un gradiente de sulfato de cesio. La banda visible superior (fraccion superior del virus) contiene una molecula de ARN de aproximadamente 5,5 kb (mas precisamente 5,2 kb) y la banda inferior visible (fraccion inferior) contiene una molecula de ARN de aproximadamente 8 kb (mas precisamente 7,7 kb) (vease la figura 4). La inoculacion de ambas bandas combinadas en plantas de tabaco da lugar a una infeccion.

El ToTV es mecanicamente transmisible a varias especies de Nicotiana. Es adecuado un tampon de inoculacion estandar (por ejemplo, un tampon fosfato 0,03 M a pH 7,7). Para la propagacion de ToTV, son preferentes N. glutinosa, N. tabacum y N. benthamina. Las especies de tabaco N. hesperis '67A' y N. occidentalis 'P1' son muy sensibles a ToTV y muestran sintomas sistemicos despues de 3-4 dias. Estas especies de tabaco se vuelven muy necroticas en poco tiempo y, por lo tanto, son mas adecuadas para su utilizacion como planta indicadora que como huesped de propagacion. N. glutinosa reacciona con lesiones locales cloroticas y una clorosis sistemica y deformacion leve de las hojas. N. benthamiana no muestra sintomas locales y reacciona con la clorosis sistemica y la deformacion de las hojas.

Dicho virus ToTV comprende, como mlnimo, una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 y secuencias que tienen una homologla de secuencia de nucleotidos, como mlnimo, del 70%, mas preferentemente, como mlnimo, del 80%, aun mas preferentemente, como mlnimo, del 90%, aun mas preferentemente, como mlnimo, del 95%, aun mas preferentemente, como mlnimo, del 98%, y de la forma mas preferente, como mlnimo, del 99% con la misma. Dichos virus tambien estan abarcados por el termino ToTV, tal como se utiliza en el presente documento.

Un virus que tiene la homologla de secuencia mencionada anteriormente se asocia con enfermedades del tomate conocidos bajo los nombres de "torrado", “marchitez" y/o "enfermedad de las manchas de chocolate" y/o muestra, segun analisis taxonomico numerico de descriptores taxonomicos esencialmente, tal como se define en la tabla 1, que estan mas estrechamente relacionadas con el virus, tal como se define en la reivindicacion 1, que con cualquier otro aislado virico disponible en colecciones publicas y dicho virus tiene una caracterlstica esencial que se asocia con una enfermedad que causa lesiones necroticas en el tomate.

La presente invencion da a conocer un acido nucleico aislado o recombinante que comprende una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, tal como se define en las figuras 5 y 6, respectivamente, secuencias que tienen una homologla de secuencia de nucleotidos, como mlnimo, del 70%, mas preferentemente, como mlnimo, del 80%, aun mas preferentemente, como mlnimo, del 90%, aun mas preferentemente, como mlnimo, del 95%, aun mas preferentemente, como mlnimo, del 98%, y, de la forma mas preferente, como mlnimo, del 99% con la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2, en el que las secuencias homologas son secuencias de nucleotidos de un virus ToTV que codifican una protelna putativa de movimiento y tres protelnas de la capside, o una helicasa, proteasa y ARN polimerasa dependiente de ARN, respectivamente, y sus cadenas complementarias y fragmentos especificos de ToTV-del mismo.

La presente invencion da a conocer, ademas, un vector de expresion que comprende un acido nucleico aislado o recombinante de la presente invencion, tal como se ha descrito anteriormente.

En otro aspecto, la presente invencion da a conocer un polipeptido aislado o recombinante codificado por un marco de lectura abierto (ORF) en la secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en i) SEQ ID NO: 1, ii) SEQ ID NO: 2, y iii) cadenas complementarias de los mismos. En una realization preferente, dicho polipeptido se selecciona del grupo que consiste en las protelnas de la capside de 23, 26 y 35 kDa, la helicasa, la ARN polimerasa dependiente de aRn y la protelna putativa de movimiento (MP) del ToTV.

En otro aspecto, la presente invencion da a conocer un antigeno que comprende un polipeptido, segun con la presente invencion.

En otro aspecto, la presente invencion da a conocer un anticuerpo dirigido especificamente contra un antigeno segun la presente invencion.

En otro aspecto, la presente invencion da a conocer un procedimiento para producir un anticuerpo contra un virus de planta denominado virus del torrado del tomate (ToTV), depositado en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH el 24 de noviembre de 2004, bajo los depositantes con numero de referencia ToTV-E01 (DSM 16999), un virus que comprende, como mlnimo, una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, tal como se define en las figuras 5 y 6, respectivamente, y

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secuencias que tienen una homologia de secuencia de nucleotidos, como minimo, del 70% con las mismas, en el que las secuencias homologas son secuencias de nucleotidos de un virus ToTV que codifican una protelna putativa de movimiento y tres protelnas de la capside, o una helicasa, proteasa y ARN polimerasa dependiente de ARN, respectivamente, comprendiendo el procedimiento las etapas de: a) proporcionar dicho virus ToTV o una protelna (recombinante) o fragmento de peptido de la misma; b) inmunizar un huesped vertebrado adecuado con dicho virus, protelna o fragmento peptidico, y c) recolectar de la sangre (incluyendo suero) o esplenocitos de dicho huesped vertebrado anticuerpos contra dicho virus, protelna o fragmento peptidico. En una realizacion preferente, dicho procedimiento comprende, ademas, las etapas de d) seleccionar un esplenocito productor de anticuerpos, e) la fusion de esplenocitos con una linea celular de hibridoma inmortalizada y f) permitir que dicha fusion de hibridoma produzca anticuerpos monoclonales.

Se describe adicionalmente un anticuerpo obtenible por un procedimiento de produccion de un anticuerpo contra ToTV segun la presente invencion.

En otro aspecto, la presente invencion da a conocer un procedimiento para identificar un aislado virico como el virus ToTV, depositado en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH el 24 de noviembre de 2004, bajo los depositantes con numero de referencia ToTV-E01 (DSM 16999), un virus que comprende, como minimo, una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, tal como se define en las figuras 5 y 6, respectivamente, y secuencias que tienen una homologia de secuencia de nucleotidos, como minimo, del 70% con las mismas, en el que las secuencias homologas son secuencias de nucleotidos de un virus ToTV que codifican una protelna putativa de movimiento y tres protelnas de la capside, o una helicasa, proteasa y ARN polimerasa dependiente de ARN, respectivamente, comprendiendo hacer reaccionar dicho aislado virico o un componente del mismo con un anticuerpo segun la presente invencion.

En otro aspecto, la presente invencion da a conocer un procedimiento para detectar la presencia de un virus de planta denominado virus del torrado del tomate (ToTV), depositado en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH el 24 de noviembre de 2004, bajo los depositantes con numero de referencia ToTV-E01 (DSM 16999), un virus que comprende, como minimo, una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, tal como se define en las figuras 5 y 6, respectivamente, y secuencias que tienen una homologia de secuencia de nucleotidos, como minimo, del 70% con las mismas, en el que las secuencias homologas son secuencias de nucleotidos de un virus ToTV que codifican una protelna putativa de movimiento y tres protelnas de la capside, o una helicasa, proteasa y ARN polimerasa dependiente de ARN, respectivamente, en una muestra que comprende determinar en dicha muestra la presencia del virus o un componente del mismo haciendo reaccionar dicha muestra con un anticuerpo, segun la presente invencion.

En otro aspecto, la presente invencion da a conocer un procedimiento para identificar una planta que es resistente a un virus de planta denominado virus del torrado del tomate (ToTV), depositado en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH el 24 de noviembre de 2004, bajo los depositantes con numero de referencia ToTV-E01 (DSM 16999), un virus que comprende, como minimo, una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, tal como se define en las figuras 5 y 6, respectivamente, y secuencias que tienen una homologia de secuencia de nucleotidos, como minimo, del 70% con las mismas, en el que las secuencias homologas son secuencias de nucleotidos de un virus ToTV que codifican una protelna putativa de movimiento y tres protelnas de la capside, o una helicasa, proteasa y ARN polimerasa dependiente de ARN, respectivamente, comprendiendo las etapas de: a) exponer una planta o parte de planta a una dosis de particulas viricas o de acido nucleico virico capaz de infectar una planta, en el que la infeccion se logra mediante inoculacion mecanica de particulas de virus purificadas o acido nucleico virico del virus, y b) identificar dicha planta como una planta que es resistente al virus cuando, despues de dicha exposicion, ya sea i) los sintomas de enfermedad en dicha planta o parte de la planta permanecen ausentes o se retrasan en la expresion o, como minimo, se reducen en gravedad o se localizan en relacion con una planta control susceptible, y/o ii) dichas secuencias de virus o genomicas no estan presentes en dicha planta o parte de la planta o la presencia de dicho virus se reduce, como minimo, cuantitativamente en dicha planta con relacion a una planta control susceptible. La etapa a) incluye un periodo de incubacion de una duracion suficientemente larga como para permitir el establecimiento de los sintomas de la enfermedad detectables en las plantas de control susceptibles expuestas a una dosis infecciosa comparable de virus. Mediante la realizacion de este procedimiento todas las formas de resistencia, incluyendo la resistencia completa, la resistencia parcial, la hipersensibilidad y la tolerancia pueden identificarse en una planta. Con el fin de confirmar la tolerancia, debe confirmar la presencia (sistemica) del virus en la planta (celulas). La etapa b) implica, preferentemente, la realizacion de un procedimiento para detectar la presencia de dicho virus en dicha planta o parte de la planta, en el que se utiliza un anticuerpo segun la presente invencion en inmunoensayos estandar, bien conocidos por el experto en la tecnica. Como alternativa, la etapa b) puede comprender poner en contacto una parte de dicha planta expuesta con una planta indicadora susceptible. De esta manera, se puede detectar la presencia de una infeccion sistemica o local en dicha planta expuesta a traves de la observacion de la aparicion de la enfermedad en la planta indicadora o incluso una planta indicadora en contacto adicional en contacto con dicha primera planta indicadora con la que se ha puesto en contacto.

Se describe adicionalmente un procedimiento para producir una planta resistente a ToTV, que comprende las etapas de identificar una planta donante resistente a ToTV mediante la realizacion de cualquiera de los procedimientos

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anteriores para la identificacion de una planta resistente a ToTV, segun la presente invencion, cruzar dicha planta donante resistente a ToTV con una planta receptora (en el que la planta receptora puede ser susceptible a ToTV o bien resistente a ToTV, pero es adecuadamente una planta resistente a ToTV en caso de que el fenotipo resistente sea producido por un gen recesivo), y seleccionar de una planta descendiente (por ejemplo, una F1, una F2, y una planta autofecundada) una planta resistente mediante la realizacion de un procedimiento para identificar la resistencia a ToTV en una planta, tal como se ha descrito anteriormente. En el caso de que el rasgo de resistencia sea un rasgo recesivo, las plantas resistentes se pueden encontrar entre las plantas descendientes de la autofecundacion de la F1 o F2 o aun otras generaciones. Dicha planta donante resistente a ToTV y la planta receptora son, preferentemente, plantas de la familia Solanaceae o de la familia Cucurbataceae. Dicha planta receptora es, preferentemente, una planta de tomate, planta de berenjena, planta de pimiento, planta de melon, planta de sandia o planta de pepino, mas preferentemente una planta de la especie Solanum lycopersicum, de la forma mas preferente una linea de S. lycopersicum que posee caracterlsticas comercialmente deseables.

Se describe adicionalmente una planta resistente a ToTV, preferentemente una planta de tomate, planta de berenjena, planta de pimiento, planta de melon, planta sandia o planta de pepino, o parte de la misma, tal como una semilla, que puede obtenerse mediante un procedimiento de produccion de una planta resistente a ToTV.

En otro aspecto, la presente invencion da a conocer un kit de diagnostico para detectar la presencia de ToTV en una muestra segun un procedimiento de la presente invencion, comprendiendo el kit, como mlnimo, un componente seleccionado del grupo que consiste en un virus de plantas denominado virus del torrado del tomate (ToTV), depositado en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH el 24 de noviembre de 2004, bajo los depositantes numero de referencia ToTV-E01 (DSM 16999), un virus que comprende, como mlnimo, una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, tal como se define en las figuras 5 y 6, respectivamente, y secuencias que tienen una homologla de secuencia de nucleotidos, como mlnimo, del 70% con las mismas, en el que las secuencias homologas son secuencias de nucleotidos de un virus ToTV que codifican una proteina putativa de movimiento y tres proteinas de la capside, o una helicasa, proteasa y ARN polimerasa dependiente de ARN, respectivamente, un polipeptido, un antigeno, y/o un anticuerpo segun la presente invencion.

En otro aspecto, la presente invencion da a conocer la utilizacion de un virus de planta denominado virus del torrado del tomate (ToTV), depositado en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH el 24 de noviembre de 2004, bajo los depositantes con numero de referencia ToTV-E01 (DSM 16999), un virus que comprende, como minimo, una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, tal como se define en las figuras 5 y 6, respectivamente, y secuencias que tienen una homologia de secuencia de nucleotidos, como minimo, del 70% con las mismas, en el que las secuencias homologas son secuencias de nucleotidos de un virus ToTV que codifican una proteina putativa de movimiento y tres proteinas de la capside, o una helicasa, proteasa y ARN polimerasa dependiente de ARN, respectivamente, un polipeptido, un antigeno o un anticuerpo segun la presente invencion para la produccion de una composicion de diagnostico.

En otro aspecto, la presente invencion da a conocer una composicion de diagnostico que comprende un virus de planta denominado virus del torrado del tomate (ToTV), depositado en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH el 24 de noviembre de 2004, bajo los depositantes con numero de referencia ToTV-E01 (DSM 16999), un virus que comprende, como minimo, una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, tal como se define en las figuras 5 y 6, respectivamente, y secuencias que tienen una homologia de secuencia de nucleotidos, como minimo, del 70% con las mismas, en el que las secuencias homologas son secuencias de nucleotidos de un virus ToTV que codifican una proteina putativa de movimiento y tres proteinas de la capside, o una helicasa, proteasa y ARN polimerasa dependiente de ARN, respectivamente, un polipeptido segun la presente invencion, un antigeno segun la presente invencion o un anticuerpo segun la presente invencion.

En otro aspecto, la presente invencion da a conocer la utilizacion de un virus de planta denominado virus del torrado del tomate (ToTV), depositado en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH el 24 de noviembre de 2004, bajo los depositantes con numero de referencia ToTV-E01 (DSM 16999), un virus que comprende, como minimo, una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, tal como se define en las figuras 5 y 6, respectivamente, y secuencias que tienen una homologia de secuencia de nucleotidos, como minimo, del 70% con las mismas, en el que las secuencias homologas son secuencias de nucleotidos de un virus ToTV que codifican una proteina putativa de movimiento y tres proteinas de la capside, o una helicasa, proteasa y ARN polimerasa dependiente de ARN, respectivamente, su genoma o partes del mismo que confieren resistencia como agente antiviral.

En otro aspecto, la presente invencion da a conocer la utilizacion de un virus de planta denominado virus del torrado del tomate (ToTV), depositado en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH el 24 de noviembre de 2004, bajo los depositantes con numero de referencia ToTV-E01 (DSM 16999), un virus que comprende, como minimo, una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, tal como se define en las figuras 5 y 6, respectivamente, y secuencias que tienen una

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homologia de secuencia de nucleotidos, como minimo, del 70% con las mismas, en el que las secuencias homologas son secuencias de nucleotidos de un virus ToTV que codifican una protelna putativa de movimiento y tres protelnas de la capside, o una helicasa, proteasa y ARN polimerasa dependiente de ARN, respectivamente, o su genoma o partes del mismo como vector de expresion.

En otro aspecto, la presente invencion se refiere a la utilizacion de una forma atenuada de un virus de planta denominado virus del torrado del tomate (ToTV), depositado en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH el 24 de noviembre de 2004, bajo los depositantes con numero de referencia ToTV-E01 (DSM 16999), un virus que comprende, como minimo, una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, tal como se define en las figuras 5 y 6, respectivamente, y secuencias que tienen una homologia de secuencia de nucleotidos, como minimo, del 70% con las mismas, en el que las secuencias homologas son secuencias de nucleotidos de un virus ToTV que codifican una proteina putativa de movimiento y tres proteinas de la capside, o una helicasa, proteasa y ARN polimerasa dependiente de ARN, respectivamente, o su genoma o partes del mismo, para la premunicion de una planta.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

Definiciones

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresion "parte de la planta" indica una parte de una planta, incluyendo celulas individuales y tejidos de celulas, tales como celulas vegetales que estan intactas en las plantas, grupos de celulas y cultivos de tejidos a partir de los que las plantas pueden regenerarse. Entre los ejemplos de partes de la planta se incluyen, pero sin limitacion a los mismos, celulas individuales y tejidos de polen, ovulos, hojas, embriones, raices, puntas de raices, anteras, flores, frutos, tallos, brotes y semillas; asi como polen, ovulos, hojas, embriones, raices, puntas de raices, anteras, flores, frutos, tallos, brotes, vastagos, rizomas, semillas, protoplastos, callos, y similares.

El termino "muestra" incluye una muestra de una planta, de una parte de la planta o de un vector de transmision, o una muestra de suelo, agua o aire.

La expresion "vector de transmision", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere al agente o sustancia que propaga enfermedades. Los vectores de transmision de ToTV en el campo pueden comprender, pero sin limitation a los mismos, animales, tales como artropodos (en particular, los de las clases Insecta y Arachnids), nematodos (en particular, los de la clase Adenophorea), pero tambien animales mas grandes, tales como, por ejemplo, aves, conejos y ratones, hongos (es decir, el filo Eumycota, en particular, hongos de la clase Phycomycota), plantas (parasitos) (incluidos los miembros de la familia Cuscutaceae), polen, semillas, el agua, particulas del suelo, e incluso manos humanas, equipos y zapatos.

El termino planta “descendiente" se refiere a cualquier planta que es el resultado como progenie de una reproduction vegetativa o sexual de una o mas plantas parentales o descendientes de las mismas. Por ejemplo, una planta descendiente se puede obtener clonando o autofecundando una planta parental o cruzando dos plantas parentales e incluyen autofecundaciones, asi como las F1 o F2 o todavia otras generaciones. Un F1 es una descendiente de primera generation producida a partir de los padres, como minimo, uno de los cuales se utiliza por primera vez como donante de un rasgo, mientras que la descendiente de la segunda generacion (F2) o generaciones posteriores (F3, F4, etc.) son especimenes producidos por autofecundacion de las F1, F2, etc. Por lo tanto, una F1 puede ser (y por lo general es) un hibrido resultante de un cruce entre dos padres de linea geneticamente pura (linea geneticamente pura es homocigota para un rasgo), mientras que una F2 puede ser (y por lo general es) una descendiente resultante de la autopolinizacion de dichos hibridos de F1.

El termino "resistente", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una planta que es capaz de resistir la multiplication en sus celulas y/o el movimiento (sistemico) del virus a otras celulas y/o el desarrollo de sintomas de la enfermedad despues de la infection con dicho virus, en el que el virus es capaz de infectar y multiplicarse en las correspondiente variedades no resistentes o susceptibles de dicha planta. El termino se utiliza para incluir dichas formas identificables por separado de resistencia como "resistencia total", "inmunidad", "resistencia parcial", "hipersensibilidad" y "tolerancia".

“Resistencia total" se refiere a un fallo completo del virus para desarrollarse despues de la infeccion y, puede ser el resultado de un fallo del virus para entrar en la celula (sin infeccion inicial) o bien puede ser el resultado de un fallo del virus para multiplicarse en la celula e infectar las celulas posteriores (sin infeccion subliminal, sin propagation). La presencia de la resistencia total puede determinarse mediante el establecimiento de la ausencia de particulas viricas o ARN virico en las celulas de la planta, asi como la ausencia de sintomas de enfermedad en dicha planta, tras la exposition de dicha planta a una dosis infecciosa de virus (es decir, despues de la "infeccion"). Entre los cultivadores, este fenotipo a menudo se denomina "inmune". Por lo tanto, tal como se utiliza en el presente documento, “inmunidad" se refiere a una forma de resistencia caracterizada por la ausencia de replication virica incluso cuando el virus se transfiere activamente a las celulas mediante, por ejemplo, electroporation.

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Una "dosis infecciosa" se define como una dosis de particuias viricas o acido nucleico del virus capaz de infectar una planta, dicha dosis puede variar entre las piantas y entre ios aisiados de ToTV anaiizados. En teorla, una cantidad desde aproximadamente 1 a 10 hasta una cantidad de aproximadamente 500 - 5000 particuias viricas de dicho virus o ios acidos nucieicos del mismo sera suficiente. La infeccion de esta manera se puede conseguir mediante inocuiacion mecanica de particuias de virus purificadas o acido nucleico del virus en las piantas.

"Resistencia parcial" se refiere a la multiplicacion reducida del virus en la ceiuia, como reduccion del movimiento (sistemico) del virus, y/o como reduccion del desarroiio de sintomas despues de la infeccion. La presencia de la resistencia parcial puede determinarse mediante el estabiecimiento de la presencia sistemica de tituios bajos de particuias viricas o ARN virico en la planta y la presencia de sintomas reducidos o retardados de la enfermedad en dicha planta tras la exposicion de dicha planta con una dosis infecciosa del virus. Los tituios del virus se pueden determinar mediante la utilizacion de un procedimiento de deteccion cuantitativa (por ejempio, un procedimiento de ELISA o una reaccion en cadena de la poiimerasa cuantitativa con transcriptasa inversa [RT-PCR]). Entre ios cultivadores, este fenotipo a menudo se denomina "de resistencia intermedia".

El termino "hipersensible" se refiere a una forma de resistencia por la cuai infeccion permanece iocaiizada y no se propaga de forma sistemica, por ejempio, debido a la necrosis local del tejido infectado o a la faita de movimiento sistemico mas alia del tejido inocuiado. Las piantas hipersensibies muestran sintomas locales, pero graves, de la enfermedad y la presencia local del virus puede estabiecerse en dichas piantas.

Tai como se utiiiza en el presente documento, "tolerante" indica un fenotipo de una planta en la que ios sintomas de la enfermedad permanecen ausentes despues de la exposicion de dicha planta a una dosis infecciosa del virus, por io que se puede estabiecer la presencia de una infeccion virica sistemica o local, la multiplicacion del virus, como mlnimo, la presencia de secuencias genomicas del virus en las celulas de dicha planta y/o la integration genomica de ios mismos. Por io tanto, las piantas toierantes son resistentes a la expresion de ios sintomas, pero portadores asintomaticos del virus. A veces, las secuencias viricas pueden estar presentes, o inciuso muitipiicarse, en piantas sin causar sintomas de la enfermedad. Este fenomeno tambien se conoce como "infeccion latente". Aigunos virus de ADN y ARN pueden iiegar a ser indetectabies despues de una infeccion primaria, solo para voiver a aparecer mas tarde y producir la enfermedad aguda. En las infecciones iatentes, el virus puede existir en una forma ocuita no infecciosa verdaderamente latente, posibiemente como un genoma integrado o un agente episomai (por io que las particuias viricas no se pueden encontrar en el citopiasma, mientras que ios protocoios de PCR pueden indicar la presencia de secuencias de acido nucleico del virus) o como agente infeccioso y agente de replication continua. Un virus reactivado puede extenderse e iniciar una epidemia entre ios contactos susceptibies. La presencia de una "infeccion latente" no se puede distinguir de la presencia de un fenotipo "tolerante" en una planta.

En el presente documento, el termino "susceptible" se utiiiza para hacer referencia a una planta que no tiene resistencia ai virus resuitante en la entrada del virus en las celulas de la planta y la multiplicacion y propagation sistemica del virus, io que da iugar a sintomas de la enfermedad. Por io tanto, el termino "susceptible" es equivaiente a "no resistente". Una planta susceptible muestra tituios normaies del virus en sus celulas tras la infeccion. Por io tanto, la susceptibiiidad puede determinarse mediante el estabiecimiento de tituios normaies (es decir, en relation con otras infecciones viricas en piantas) de particuias viricas o de ARN del virus en las celulas de la planta y la presencia de sintomas normaies de la enfermedad (es decir, en relacion a ios sintomas de la enfermedad, tai como se describen en el presente documento para la planta de la que se aislo primero el ToTV) en dicha planta despues de la exposicion de dicha planta a una dosis infecciosa de virus.

El termino "sensible" refieja la reaccion sintomatica de una planta susceptible tras la infeccion por el virus. La reaccion o ios sintomas pueden ser mas o menos graves en funcion del nivei de sensibiiidad de la planta. Si el virus dana, o inciuso mata, a la planta, dicha planta se clasifica como "sensible".

Las piantas a las que se ha inocuiado artificialmente cepas de virus atenuados estan protegidas posteriormente frente a ios virus viruientos estrechamente reiacionados. Como virus protectores, se pueden utiiizar cepas ieves de origen natural o bien una cepa atenuada (un mutante ieve inducido artificialmente). De forma preferente, con el fin de aicanzar la inmunidad reiativa de una planta contra el ToTV, se puede utiiizar una cepa atenuada de ToTV que sea asintomatica o que muestre una expresion de ios sintomas, como mlnimo, reducida ai en una planta infectada, con relacion a una cepa viruienta de ToTV. Los procedimientos de production de virus atenuados pueden inciuir, por ejempio, mutagenesis aieatoria del genoma del ToTV y cribado de cepas con atenuacion de ios sintomas. Se hace referencia expresa a ios procedimientos para la produccion de virus de piantas atenuados, tai como se describe en ios articuios de Takeshita y otros, 2001; Lu y otros, 2001; Hagiwara, y otros, 2002; y Hirata y otros, 2003.

Tai como se utiiiza en el presente documento, el termino "tomate" significa cuaiquier planta, ilnea o poblacion de Lycopersicon o Solanum que inciuye, pero no se iimita a las mismas, las que se presentan en la iista siguiente. Recientemente, la nomenciatura de Lycopersicon se ha cambiado. La nueva nomenciatura para Lycopersicon se proporciona en el iistado siguiente (de: Peralta, Knapp y Spooner, monografla no pubiicada (vease:
http://www.sgn.corneii.edu "Gula de la nomenciatura revisada de Solanum" (“Guide to revised Solanum nomenclature”))).

Nombre en la monografia del tomate (Peralta y otros, en preparacion para su publicacion en Systematic Botany Monographs): Equivalente en Lyoopersioon

Solanum juglandifolium Dunal: Lycopersicon juglandifolium (Dunal) J.M.H. Shaw

Solanum ochranthum Dunal: Lycopersicon ochranthum (Dunal) J.M.H. Shaw

Solanum sitiens I.M. Johnst.: Lycopersicon sitiens (I.M. Johnst.) J.M.H. Shaw

Solanum lycopersicoides Dunal: Lycopersicon lycopersicoides (Dunal en DC.) A. Child ex J.M.H. Shaw

Solanum pennellii Correll: Lycopersicon pennellii (Correll) D'Arcy

Solanum habrochaites S. Knapp y D.M Spooner: Lycopersicon hirsutum Dunal

Solanum “N peruvianum” pendiente de descripcion por Peralta (4 razas geograficas: humifusum, lomas, Marathon, Chotano-Yamaluc): Parte de Lycopersicon peruvianum (L.) Miller (incl. la var. humifusum y las razas Marathon)

Solanum “Callejon de Huaylas” pendiente de descripcion por Peralta: Parte de Lycopersicon peruvianum (L.) Miller (de Ancash, alogn Rio Santa)

Solanum neorickii D.M. Spooner, G.J. Anderson y R.K. Jansen: Lycopersicon parviflorum C.M. Rick, Kesicki, Fobes y M. Holle

Solanum chmielewskii (C.M. Rick, Kesicki, Fobes y M. Holle) D.M. Spooner, G.J. Anderson y R.K. Jansen: Lycopersicon chmielewskii C.M. Rick, Kesicki, Fobes y M. Holle

Solanum corneliomuelleri J.F. Macbr. (1 raza geografica: Misti nr. Arequipa): Parte de Lycopersicon peruvianum (L.) Miller; tambien conocido como Lycopersicon glandulosum C.F. Mull.

Solanum peruvianum L.: Lycopersicon peruvianum (L.) Miller

Solanum chilense (Dunal) Reiche: Lycopersicon chilense Dunal

Solanum cheesmaniae (L. Riley) Fosberg: Lycopersicon cheesmaniae L. Riley (publicada como cheesmanii)

Solanum galapagense S. Darwin y Peralta: Parte de Lycopersicon cheesmaniae L. Riley (conocida anteriormente como forma o var. minor)

Solanum lycopersicum L.: Lycopersicon esculentum Miller

Solanum pimpinellifolium L.: Lycopersicon pimpinellifolium (L.) Miller

Un "vector de expresion" se define como una molecula de acido nucleico que contiene un gen, por lo general un gen heterologo, que se expresa en una celula huesped. Tipicamente, este gen comprende una secuencia que codifica la protelna. La expresion de genes siempre se coloca bajo el control de un promotor, y se dice que un gen de este tipo 5 esta "unido de forma operativa" al promotor. El termino "heterologo" se refiere a una molecula de ADN, o una poblacion de moleculas de ADN, que no existe de forma natural dentro de una celula huesped dada.

Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "polinucleotido" es intercambiable con el termino "acido nucleico" y se refiere a un multimero de nucleotidos o forma polimerica de nucleotidos que tienen cualquier numero 10 de nucleotidos, por ejemplo, desoxirribonucleotidos o ribonucleotidos, o compuestos producidos de forma sintetica (por ejemplo, PNA, tal como se describe en la Patente de Estados Unidos N.° 5.948.902 y las referencias citadas en la misma) y pueden ser de cadena doble o sencilla. Un polinucleotido que puede hibridar con polinucleotidos de origen natural de una manera especifica de secuencia analoga a la de dos polinucleotidos de origen natural, por ejemplo, pueden participar en las interacciones de apareamiento de bases de Watson-Crick. El termino incluye 15 tambien formas modificadas, por ejemplo, mediante metilacion y/o mediante proteccion con capuchon, y formas no modificadas del polinucleotido.

Tal como se utilizan en el presente documento, los terminos "acido ribonucleico" y "ARN" significan un pollmero compuesto por ribonucleotidos.

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Tal como se utilizan en el presente documento, los terminos "acido desoxirribonucleico" y "ADN" significan un pollmero compuesto por desoxirribonucleotidos.

El termino "oligonucleotido" se refiere a una secuencia corta de monomeros de nucleotidos (por lo general, de 6 a

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100 nucleotidos) unidos por enlaces de fosforo (por ejemplo, fosfodiester, alquil-fosfato y aril-fosfato, fosforotioato), o enlaces sin fosforo (por ejemplo, peptido, sulfamato y otros). Un oligonucleotido puede contener nucleotidos modificados que tienen bases modificadas (por ejemplo, 5-metil citosina) y grupos de azucar modificados (por ejemplo, 2'-O-metilribosil, 2'-O-metoxietilribosil, 2-fluororibosil, 2'-aminoribosil, y similares). Los oligonucleotidos pueden ser moleculas de origen natural o sinteticas de ADN de doble cadena y de cadena sencilla y ARN de doble cadena y de cadena sencilla con formas circulares, ramificadas o lineales, incluidos, opcionalmente, dominios capaces de formar estructuras secundarias (por ejemplo, tallo-bucle, seudonudos y estructuras de bucle, tipo “kissing loop”).

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresion "homologia de secuencia de nucleotidos" indica la presencia de homologia entre dos polinucleotidos. Los polinucleotidos tienen secuencias "homologas" si la secuencia de nucleotidos en las dos secuencias es la misma cuando se alinean para una correspondencia maxima. La comparacion de secuencias entre dos o mas polinucleotidos se realiza generalmente mediante la comparacion de las porciones de las dos secuencias sobre una ventana de comparacion para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. La ventana de comparacion es generalmente de aproximadamente 20 a 200 nucleotidos contiguos. El "porcentaje de homologia de secuencia" de polinucleotidos, tal como 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98, 99 o 100 por ciento de homologia de secuencia puede determinarse mediante la comparacion de dos secuencias alineadas de forma optima sobre una ventana de comparacion, en el que la porcion de la secuencia de polinucleotidos en la ventana de comparacion puede incluir adiciones o deleciones (es decir, huecos) en comparacion con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones ni deleciones) para la alineacion optima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula mediante: (a) determinacion del numero de posiciones en las que se produce la base de acido nucleico identico o residuo de aminoacido en ambas secuencias, para dar el numero de posiciones apareadas, (b) dividiendo el numero de posiciones apareadas por el numero total de posiciones en la ventana de comparacion y (c) multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de homologia de secuencia. La alineacion optima de secuencias para comparacion puede llevarse a cabo mediante implementaciones computerizadas de algoritmos conocidos, o bien mediante inspection visual. Los algoritmos de comparacion de secuencia y de alineacion de secuencia multiple disponibles facilmente son, respectivamente, los programas BLAST, herramienta basica de alineacion local (“Basic Local Alignment Search Tool”) (Altschul y otros, 1990; Altschul y otros, 1997) y ClustalW, ambos disponibles en internet. Otros programas adecuados incluyen, aunque sin limitaciones a los mismos, GAP, BestFit, PlotSimilarity y FASTA en el paquete de software Wisconsin Genetics (Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI, EE.UU.) (Devereux y otros, 1984).

Tal como se utiliza en el presente documento, "sustancialmente complementaria" significa que dos secuencias de acidos nucleicos tienen, como minimo, aproximadamente el 65%, preferentemente aproximadamente el 70%, mas preferentemente aproximadamente el 80%, incluso mas preferentemente el 90%, y de la forma mas preferente aproximadamente el 98%, de complementariedad de las secuencias entre si. Esto significa que los cebadores y las sondas deben mostrar suficiente complementariedad con su molde y el acido nucleico diana, respectivamente, como para hibridar en condiciones rigurosas. Por lo tanto, las secuencias del cebador y la sonda no tienen que reflejar la secuencia complementaria exacta de la region de union en el molde y se pueden utilizar cebadores degenerados. Por ejemplo, un fragmento de nucleotido no complementario puede unirse al extremo 5' del cebador, siendo el resto de la secuencia del cebador complementario a la hebra. Como alternativa, se pueden intercalar bases no complementarias o secuencias mas largas en el cebador, a condition de que el cebador tenga suficiente complementariedad con la secuencia de una de las cadenas que se van a amplificar para hibridar con la misma, y para formar de este modo una estructura duplex que puede extenderse por medio de polimerizacion. Las secuencias de nucleotidos no complementarias de los cebadores pueden incluir sitios de enzimas de restriccion. La adicion de un sitio de enzima de restriction al extremo o extremos de la secuencia diana seria particularmente util para la clonacion de la secuencia diana. Una secuencia de cebador sustancialmente complementaria es una que tiene suficiente complementariedad de secuencia con el molde de amplificacion para dar lugar a la union del cebador y la sintesis de la segunda cadena. El experto en la tecnica esta familiarizado con los requisitos de cebadores que deben tener suficiente complementariedad de secuencia con el molde de amplificacion.

El termino "hibrido" en el contexto de acidos nucleicos se refiere a una molecula de acido nucleico de doble cadena, o duplex, formada por enlaces de hidrogeno entre bases de nucleotidos complementarias. El termino "hibridar" se refiere al proceso por el cual cadenas simples de secuencias de acidos nucleicos forman segmentos de doble helice mediante enlaces de hidrogeno entre bases complementarias.

El termino "hibrido" en el contexto de cultivo de plantas se refiere a una planta que es la descendiente de padres geneticamente distintos producida mediante cruce de plantas de diferentes lineas o razas o especies.

El termino "sonda" se refiere a una secuencia de oligonucleotidos de cadena simple que reconocera y formara un duplex con enlaces de hidrogeno con una secuencia complementaria en una secuencia de acido nucleico diana analito o su derivado de ADNc.

Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "cebador" se refiere a un oligonucleotido que es capaz de hibridar con la diana de amplification permitiendo que se una ADN polimerasa, por lo que sirve como punto de initiation de la sintesis de ADN cuando se coloca en condiciones en las que se induce la sintesis del producto de

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extension del cebador, es decir, en presencia de nucleotidos y un agente para la polimerizacion, tal como ADN polimerasa, y a una temperature y pH adecuados. El cebador (para amplificacion) es, de forma preferente, de cadena sencilla para una maxima eficiencia en la amplificacion. Preferentemente, el cebador es un oligodesoxirribonucleotido. El cebador debe ser lo suficientemente largo para cebar la sintesis de productos de extension en presencia del agente para la polimerizacion. Las longitudes exactas de los cebadores dependeran de muchos factores, incluyendo la temperatura y la composicion (contenido de A/T en G/C) del cebador. Un par de cebadores bidireccionales consiste en un cebador directo y uno inverso como se utilizan habitualmente en la tecnica de amplificacion de ADN, tal como amplificacion por PCR.

Se entendera que "cebador", tal como se utiliza en el presente documento, puede referirse a mas de un cebador, particularmente en el caso en el que hay una cierta ambiguedad en la informacion con respecto a la secuencia o secuencias terminales de la region diana que se va a amplificar. Por lo tanto, un "cebador" incluye una coleccion de oligonucleotidos cebadores que contienen secuencias que representan las posibles variaciones en la secuencia de nucleotidos, o incluye nucleotidos que permiten un apareamiento de bases tipico.

Los cebadores oligonucleotidicos se pueden preparar por cualquier procedimiento adecuado. En la tecnica se conocen procedimientos para preparar oligonucleotidos de secuencia especifica e incluyen, por ejemplo, la clonacion y restriccion de secuencias apropiadas y la sintesis quimica directa. Los procedimientos de sintesis quimica pueden incluir, por ejemplo, el procedimiento fosfodiester o fosfotriester, el procedimiento de dietilfosforamidato y el procedimiento de soporte solido divulgados en, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.° 4.458.066. Los cebadores se pueden marcar, si se desea, incorporando medios detectables, por ejemplo, mediante medios espectroscopicos, de fluorescencia, fotoquimicos, bioquimicos, inmunoquimicos o quimicos.

La extension dependiente del molde del cebador o cebadores oligonucleotidicos se cataliza mediante un agente de polimerizacion en presencia de cantidades adecuadas de los cuatro desoxirribonucleotidos trifosfato (dATP, dGTP, dCTP y dTTP, es decir, dNTP) o analogos, en un medio de reaccion que esta compuesto por las sales, cationes metalicos y el sistema de tamponamiento del pH adecuados. Los agentes de polimerizacion adecuados son enzimas que se sabe que catalizan la sintesis de ADN dependiente de cebador y de molde. Las ADN polimerasas conocidas incluyen, por ejemplo, ADN polimerasa I de E. coli o su fragmento Klenow, ADN polimerasa de T4 y ADN polimerasa Taq. Las condiciones de reaccion para catalizar la sintesis de ADN con estas ADN polimerasas se conocen en la tecnica.

Los productos de la sintesis son moleculas duplex que consiste en las cadenas del molde y las cadenas de extension del cebador, que incluyen la secuencia diana. Estos productos, a su vez, sirven como molde para otra ronda de replicacion. En la segunda ronda de replicacion, la cadena de extension del cebador del primer ciclo hibrida con su cebador complementario; la sintesis da un producto "corto" que esta unido tanto en el extremo 5' como en el extremo 3' por secuencias de cebadores o sus complementarias. Ciclos repetidos de desnaturalizacion, hibridacion y extension del cebador dan como resultado la acumulacion exponencial de la region diana definida por los cebadores. Se realizan ciclos suficientes para lograr la cantidad deseada de polinucleotido que contiene la region diana de acido nucleico. La cantidad deseada puede variar y esta determinada por la funcion que debe tener el polinucleotido producto.

El experto en la tecnica conoce el procedimiento PCR y este esta bien descrito en los manuales.

Despues de la amplificacion por PCR, los polinucleotidos diana pueden detectarse mediante hibridacion con una sonda polinucleotidica que forma un hibrido estable con la de la secuencia diana en condiciones de lavado e hibridacion rigurosas o moderadamente rigurosas. Si se espera que las sondas sean esencialmente complementarias de forma completa (es decir, aproximadamente el 99% o mas) con la secuencia diana, se utilizaran condiciones rigurosas. Si se espera algun apareamiento erroneo, por ejemplo, si se esperan cepas variantes con el resultado de que la sonda no sera completamente complementaria, la rigurosidad de la hibridacion se puede disminuir. Sin embargo, se eligen condiciones que descarten la union inespecifica/accidental. Las condiciones que afectan a la hibridacion y que seleccionan frente a la union inespecifica se conocen en la tecnica y se describen en, por ejemplo, Sambrook y otros, (2001). En general, una concentracion menor de sales y una mayor temperatura aumentan la rigurosidad de la union. Por ejemplo, generalmente se considera que las condiciones rigurosas son incubaciones en soluciones que contienen aproximadamente 0,1 x SSC, SDS al 0,1%, a una temperatura de incubacion/lavado de aproximadamente 65°C y las condiciones moderadamente rigurosas son incubaciones en soluciones que contienen aproximadamente 1- 2 x SSC, SDS al 0,1% y una temperatura de incubacion/lavado de aproximadamente 50°C-65°C. Las condiciones de baja rigurosidad son 2 x SSC y aproximadamente 30°C-50°C.

Los terminos "rigurosidad" o "condiciones de hibridacion rigurosas" se refieren a condiciones de hibridacion que afectan a la estabilidad de los hibridos, por ejemplo, temperatura, concentracion de sal, pH, concentracion de formamida y similares. Estas condiciones se optimizan de forma empirica para maximizar la union especifica y minimizar la union no especifica del cebador o la sonda a su secuencia de acido nucleico diana. Los terminos, tal como se utilizan, incluyen la referencia a condiciones en las que una sonda o cebador hibridara con su secuencia diana en un grado detectablemente mayor que con otras secuencias (por ejemplo, como mlnimo, 2 veces sobre el basal). Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y seran diferentes en circunstancias distintas. Las

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secuencias mas largas hibridan especificamente a temperatures mas altas. Generalmente, las condiciones rigurosas se seleccionan de modo que sean aproximadamente 5°C menor que el punto de fusion termico (Tm) para la secuencia especifica a una fuerza ionica y pH definidos. La Tm es la temperatura (a la fuerza ionica y el pH definidos) a la cual el 50% de una secuencia diana complementaria hibrida con una sonda o cebador perfectamente apareados. Normalmente, las condiciones rigurosas seran aquellas en las que la concentracion de sales es inferior a aproximadamente 1,0 M de ion Na+, normalmente una concentracion del ion Na+ (u otras sales) de aproximadamente 0,01 a 1,0 M a un pH de 7,0 a 8,3 y la temperatura es, como mlnimo, aproximadamente de 30°C para las sondas o cebadores cortos (por ejemplo, de 10 a 50 nucleotidos) y, como mlnimo, aproximadamente de 60°C para las sondas o cebadores largos (por ejemplo, de mas de 50 nucleotidos). Las condiciones rigurosas tambien se pueden conseguir con la adicion de agentes desestabilizantes, tales como formamida. Entre los ejemplos de condiciones de baja rigurosidad o "condiciones de rigurosidad reducida" se incluyen hibridacion con una solucion tampon de formamida al 30%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37°C y un lavado en 2 x SSC a 40°C. Entre los ejemplos de condiciones de rigurosidad alta se incluyen, la hibridacion en formamida al 50%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37°C, y un lavado en 0,1 x SSC a 60°C. Los procedimientos de hibridacion son bien conocidos en la tecnica y se describen, por ejemplo, en Ausubel y otros, 1998 y Sambrook y otros, 2001.

El termino "antigeno" se refiere a una sustancia capaz de desencadenar una respuesta inmunitaria en un vertebrado, lo que da lugar a la produccion de un anticuerpo como parte de la defensa contra dicha sustancia. Los antigenos pueden ser protelnas viricas que pueden provocar la produccion de anticuerpos en, por ejemplo, las celulas de la sangre, las celulas de los ganglios linfaticos y el bazo de los vertebrados.

El termino "anticuerpo" incluye la referencia a los peptidos de union a antlgeno y se refiere a anticuerpos, anticuerpos monoclonales, a una inmunoglobulina o anticuerpo enteros o a cualquier fragmento funcional de una molecula de inmunoglobulina. Entre los ejemplos de dichos peptidos se incluyen moleculas de anticuerpos enteros, fragmentos de anticuerpos, tales como Fab, F(ab')2, regiones determinantes de la complementariedad (CDR), VL (region variable de la cadena ligera), VH (la region variable de la cadena pesada) y cualquier combinacion de estos o cualquier otra porcion funcional de un peptido de anticuerpo. El termino “anticuerpo" se refiere a un polipeptido codificado sustancialmente por un gen de inmunoglobulina o genes de inmunoglobulinas, o fragmentos de los mismos que se unen y reconocen especificamente un analito (antlgeno). Sin embargo, aunque varios fragmentos de anticuerpos pueden definirse en terminos de la digestion de un anticuerpo intacto, un experto apreciara que dichos fragmentos pueden sintetizarse de novo quimicamente o bien mediante la utilizacion de metodologla de ADN recombinante. Por lo tanto, el termino anticuerpo, tal como se utiliza en el presente documento, tambien incluye fragmentos de anticuerpos, tales como Fv de cadena unica, anticuerpos quimericos (es decir, que comprenden regiones constantes y variables de diferentes especies), anticuerpos humanizados (es decir, que comprenden una region determinante de la complementariedad (CDR) que no es de origen humano) y anticuerpos heteroconjugados (por ejemplo, anticuerpos biespecificos).

Las expresiones "sustancialmente puro" y "aislado" se utilizan indistintamente y describen una protelna, peptido o acido nucleico que esta sustancialmente separado de otros componentes (sub)celulares que lo acompanan de forma natural. El termino abarca un acido nucleico o protelna que se ha retirado de su entorno natural e incluye aislados de ADN recombinante o clonado y analogos sintetizados quimicamente o analogos sintetizados biologicamente por sistemas heterologos. En general, la expresion se refiere a una protelna y acido nucleico purificados que tienen una pureza, como mlnimo, aproximadamente de 75%, por ejemplo 85%, 95% o 98% en peso. Las variantes menores o modificaciones quimicas comparten normalmente la misma secuencia de polipeptidos o nucleotidos. Una proteina o acido nucleico sustancialmente puros comprenderan tipicamente aproximadamente de 85 a 100% (p/p) de una muestra de proteina o acido nucleico, mas habitualmente aproximadamente 95%, y, de forma preferente, de mas de aproximadamente 99% de pureza. La pureza u homogeneidad de la proteina o del acido nucleico pueden estar indicados por un numero de medios bien conocidos en la tecnica, tales como electroforesis en gel de poliacrilamida de una muestra de protelna, seguido de visualizacion de una sola banda de polipeptido en un gel de poliacrilamida tras la tincion, o por electroforesis en gel de agarosa de una muestra de acido nucleico, seguido de la visualizacion de una sola banda de polinucleotido en un gel de agarosa tras la tincion. "Tincion" puede hacer referencia a la utilizacion de tinciones especificas de peptidos o acidos nucleicos, tales como tinciones de plata o de Coomassie, o tinciones de bromuro de etidio y SYBR®, o puede hacer referencia a la utilizacion de tinciones especificas de peptidos o acidos nucleicos, tales como poner en contacto el peptido con un anticuerpo y visualizar el anticuerpo utilizando un anticuerpo secundario marcado (por ejemplo, conjugado con fosfatasa alcalina) en el caso de las protelnas o los peptidos, o poner en contacto el acido nucleico con una sonda complementaria marcada para la visualizacion de la presencia de hibridacion entre el acido nucleico y la sonda. Para ciertos fines, se puede proporcionar mayor resolucion mediante la utilizacion de cromatografla de liquidos de alto rendimiento (HPLC) o un medio similar para la purificacion. Dichos procedimientos se encuentran en el area de conocimiento general comun (vease, por ejemplo, Katz, y otros, 1998).

Identification y taxonomia

En el presente documento se describe un virus aislado que comprende, como mlnimo, una secuencia de acido nucleico segun la SEQ ID NO: 1 y/o la SEQ ID NO: 2 y secuencias que tienen una homologia de secuencia de nucleotidos, como minimo, del 70% con las mismas. Tal como se ha indicado anteriormente, los polinucleotidos

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tienen secuencias "homologas" si la secuencia de nucleotidos en las dos secuencias es la misma cuando se alinean para una correspondencia maxima. Las busquedas BLAST utilizando secuencias de nucleotidos obtenidas a partir del aislado del virus ToTV revelaron ausencia de homologlas significativas con cualquiera de las secuencias viricas o no viricas conocidas en las bases de datos GenBank y EMBL. El porcentaje de homologla mas alto encontrado hasta ahora era 46,5% entre los motivos de helicasa en ORF1 en la SEQ ID NO: 2, que corresponde al ARN1 del ToTV con motivos helicasa de otros virus de plantas. (Veanse los ejemplos siguientes).

Se debe entender que las homologlas pueden ser grandes cuando se comparan dos secuencias sobre una ventana de comparacion pequena, ya que las regiones locales de similitud de secuencia a menudo se pueden encontrar cuando se comparan dos secuencias de nucleotidos largas. Sin embargo, el experto en la materia conoce que la homologla de secuencia requiere el establecimiento de motivos comunes entre las secuencias, entre las que la identidad de secuencia puede ser, localmente, tan alto como del 35 a 100%, pero puede ser tan baja como del 10 al 20% en otras partes de la secuencia genomica del mismo ORF. Por lo tanto, cuando en el presente documento se hace referencia a que una secuencia tiene una homologla de secuencia de nucleotidos, como mlnimo, del 70% con la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2, esto puede hacer referencia a la homologla de secuencia entre las regiones entre los motivos comunes, en los que la homologla es mayor, pero tambien entre la secuencia de codificacion de dos protelnas homologas. Observese que las homologlas de secuencia pueden diferir entre los diferentes genes en el genoma (veanse los ejemplos).

Como una indicacion de la relacion entre el aislado de virus ToTV recien identificado y otros virus (incluidos los virus que se van a comparar con el mismo), normalmente se puede realizar un analisis filogenetico sobre la base de (parte de) la informacion de la secuencia genomica de los virus.

En los ejemplos siguientes se presentan varios de estos analisis. La informacion obtenida hasta el momento indica que el ToTV muestra el nivel mas alto de homologla con los virus de los generos Sequivirus y Waikavirus (Sequiviridae) y los generos Cheravirus y Sadwavirus. Los virus de estos generos se distinguen sobre la base de la cantidad de ARn viricos, Sequiviridae tiene 1 ARN, mientras que los generos Cheravirus y Sadwavirus tienen dos ARN, y el numero de protelnas de la capside, el genero Sadwavirus tienen dos CP, el genero Cheravirus tienen tres CP. Estos criterios sugieren que es mas probable que el virus del torrado del tomate se encuadre dentro del genero Cheravirus. Sin embargo, los analisis filogeneticos que utilizan varios motivos diferentes de las protelnas RdRp y las protelnas helicasas, colocan al ToTV claramente separado de los generos Cheravirus y Sadwavirus y, de hecho, sugieren que esta mas estrechamente relacionado con el genero Sequiviridae. Por desgracia, actualmente solo estan disponibles las secuencias completas de un Cheravirus (CRLV) y dos Sadwavirus (SDV y SMOV). Los datos preliminares sobre la transmision vectorial sugieren que el ToTV podria ser transmitido por la mosca blanca, mientras que se desconocen los vectores naturales de CRLV y Sadwavirus. Sobre la base de la informacion disponible actualmente, incluyendo informacion sobre la secuencia, asl como informacion taxonomica adicional, tal como se presenta en la tabla 1, a continuacion, es muy probable que el virus recien descubierto sea un genero nuevo.

Tabla 1: Descriptores taxonomicos para el virus del ToTV recien descubierto (tal como enumeran los procedimientos aceptados internacionalmente del manual "Matthew's Plant Virology" ("Matthew's Plant Virology", cuarta edicion, Roger Hull (ed.) Academic Press, San Diego, pag. 15, tabla 2,1 en el mismo). La enumeracion de la tabla en el texto de Matthews se ha pegado a la tabla 1, a continuacion.

I Propiedades del virion

A. Propiedades morfologicas de los viriones

______1.28 nm de tamano_____________

______2. Forma esferica (icosaedricos)

3. No tienen envoltura

B. Propiedades fisicas de los viriones ______(no investigado)___________

C. Propiedades del genoma___________________________________________________________________

______1. Acido nucleico de tipo ARN____________________________________________________________

______2. ARN monocatenario_________________________________________________________________

3. ARN lineal_________________________________________________________________________

______4. Codification sentido positivo___________________________________________________________

______5. Como minimo, 2 segmentos (ARN 2; SEQ ID NO:1 y ARN 1; SEQ ID NO:2)_____________________

6. 5,5 kb (con mayor precision, 5,2 kb o 5389 nucleotidos, excluyendo la cola de poli(A) y 8 kb (con mayor precision 7,7 kb o 7793 nucleotidos, excluyendo la cola de poli(A))

______7. Capuchon terminal en 5’ desconocido___________________________________________________

______8. Polipeptido unido de forma covalente en el extremo 5’ desconocido____________________________

______9. Tracto de poli(A) presente en ambos segmentos___________________________________________

______10. Comparaciones de la secuencia nucleotidica_____________________________________________

- El ARN 1 contiene un ORF1 con motivos tipicos de helicasa (Hel), proteasa y ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp). El nivel de homologla con los motivos de helicasa y RdRp de otros

_________virus se describe con detalle en los ejemplos.____________________________________________

- El ARN 2 contiene dos ORF, de los que uno tiene en su extremo N un motivo tipico de la protelna putativa de movimiento (MP) y que contiene en el extremo C las secuencias de las tres protelnas de la capside (cubierta) (CP). El nivel de homologla con protelnas de la capside de otros virus se

_________describe con detalle en los ejemplos.__________________________________________________

D. Propiedades de las protelnas______________________________________________________________

______1. 3 x CP; Hel; RdRp; Proteasa; MP putativa_______________________________________________

2. CP: 35, 26 y 23 kDa________________________________________________________________

______3. (Para las actividades funcionales, vease anteriormente y los ejemplos a continuation)____________

4. (Para la comparacion de las secuencias de aminoacidos, veanse los ejemplos a continuacion)

II. Organizacion y replicacion del genoma

1. Organizacion genomica, vease la figura 7

6. Citopatologla: como minimo, la epidermis de celulas mesofilas o celulas acompanantes del floema

III. Propiedades antigenicas

1. No hay relaciones serologicas conocidas

IV. Propiedades biologicas

1a. Gama de huespedes naturales: Tomate;

1b. Gama de huespedes experimentales:

Plantas huespedes alternativas analizadas para el ToTV: Sintomas locales/ Sintomas sistemicos

Chenopodium quinoa: -/-

Gomphrena globosa: -/-

Nicotiana benthamiana: -/c

Nicotiana clevelandii: -/c

Nicotiana glutinosa: -/c

Nicotiana hesperis 67A: nl/c, n, mf

Nicotiana occidentalis P1: nl/c, n, mf

Nicotiana rustica: -/- (la)

Nicotiana tabacum 'White Burley': -/- (la)

Physalis floridana: nl/c, n, mf, do

c= clorosis; n= necrosis; l= lesiones; mf= malformacion; do= muerte; la= infeccion latente, -= sin sintomas.

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2. Patogenicidad

Sintomas en la planta huesped natural: Lesiones necroticas que finalizan en una necrosis completa similar a una quemadura de material vegetal y muerte de la planta; anillos concentricos de puntos necroticos sobre los frutos.

Asociacion con la enfermedad: torrado; posiblemente tambien mancha chocolate; posiblemente tambien marchitez

3. Tropismo del tejido: como mlnimo, la epidermis de celulas mesofilas o celulas acompanantes del

floema

4. Modo de transmision en la naturaleza desconocido

5. Relaciones con el vector: Posiblemente mosca blanca

6. Distribucion geografica: Mediterraneo; America (Centroamerica, Mejico y parte sur de Norteamerica)

Recientemente, los presentes inventores han descubierto que las secuencias genomicas del virus asociado de una enfermedad del tomate en Centroamerica (por ejemplo, Mejico y Guatemala) conocidas con el nombre de “enfermedad de la mancha chocolate”, “chocolate" o “marchitez" eran identicas a las que se describen en el presente documento para el ToTV (vease el ejemplo 2).

A medida que estan disponibles mas secuencias viricas, tanto de virus que no son ToTV que pueden o no estar directamente relacionados con estos, o de virus estrechamente relacionados con el virus ToTv o que se asemejan esencialmente al virus ToTV, el analisis filogenetico resultara una valiosa manera de determinar la amplitud del taxon o clado del ToTV basado en la relacion filogenetica entre los aislados.

La relacion filogenetica puede, por ejemplo, determinarse basandose en una cualquiera o todas las secuencias de nucleotidos de ARN 1 y/o ARN 2 del genoma virico o en los datos de la secuencia de la protelna de la capside (gen). Los analisis filogeneticos son bien conocidos para el experto y pueden comprender, por ejemplo, procedimientos de analisis mediante reconstruction del arbol basado en la distancia (por ejemplo, union al vecino), analisis de la probabilidad o parsimonia mediante la utilization programas, tales como ClustalX (Thompson y otros, 1997), PAUP (Swofford, 2000) o PHYLIP (Felsenstein, 1989).

Con el fin de realizar un analisis de la relacion filogenetica entre un nuevo aislado, la secuencia del ToTV, tal como se da a conocer en el presente documento y las secuencias de referencia de las cepas viricas, por ejemplo, de las bases de datos GenBank, EMBL o DDBJ, el ARN genomico de dicho nuevo aislado se puede extraer directamente de las plantas infectadas y las secuencias genomicas pueden amplificarse a partir del mismo. La transcription inversa con procedimientos de amplification por PCR (RT-PCR) puede llevarse a cabo, por ejemplo, utilizando cebadores de oligonucleotidos degenerados, siendo dichos cebadores, por ejemplo, capaces de actuar como cebador de amplificacion para la amplificacion de las secuencias de acidos nucleicos a partir de los genomas de aislados de ToTV divergentes, asi como de las genomas de especies viricas estrechamente relacionadas. Preferentemente, pero no necesariamente, los productos de amplificacion genomica de longitud completa pueden obtenerse de este modo a partir de cepas de referencia (por ejemplo, aislados divergentes), cepas de ensayo (aislados sospechosos de ToTV) y especies estrechamente relacionadas. Preferentemente, las regiones geneticas especificas de interes se amplifican para la comparacion. Los productos de amplificacion (ADN) pueden secuenciarse despues mediante, por ejemplo, secuenciacion directa de nucleotidos de doble cadena utilizando terminadores de didesoxinucleotidos marcados con fluorescencia (Smith y otros, 1986) con los cebadores de oligonucleotidos degenerados utilizados para la RT-PCR. La edition de secuencias de nucleotidos, el analisis, la prediccion opcional de las secuencias de aminoacidos y las alineaciones se pueden realizar con los paquetes de software disponibles, tal como con el paquete de analisis de secuencia de LaserGene version 5 (DNASTAR, Inc., Madison, Wis.) y el software IntelliGenetics GeneWorks version 2.5.1 (IntelliGenetics, Mountain View, Calif.). A continuation se pueden realizar analisis filogeneticos con analisis filogenetico utilizando, por ejemplo, el software de parsimonia (PAUP) con un algoritmo de union al vecino utilizando distancias absolutas tras una busqueda heuristica y 1.000 repeticiones de arranque, y se puede generar un arbol filogenetico mediante analisis de parsimonia del nucleotido contiguo alineado o las secuencias de aminoacidos, de modo que en dichos arboles los numeros representan generalmente los niveles de confianza de bootstrap. Despues de 1.000 replicas, un nivel de confianza superior al 60%, preferentemente superior al 70%, mas preferentemente superior al 80%, 90%, 95% o 98%, dentro de un arbol filogenetico, han de considerarse prueba suficiente de la correcta inferencia filogenetica (colocation de aislados en un clado determinado), a condicion de que el arbol este suficientemente ramificado, mediante el cual opcionalmente, la ramification puede mejorarse mediante enraizamiento a una especie de grupo de exclusion adecuado. De esta manera se puede determinar que aislado esta mas estrechamente relacionado con las secuencias del ToTV, tal como se da a conocer en el presente documento. La relacion se expresa generalmente en terminos de porcentaje de similitud de secuencia, en el presente documento denominada homologia de secuencia.

Aunque los analisis filogeneticos dan a conocer un procedimiento conveniente de identificacion de un virus en caso de suficiente homologia de acido nucleico, con virus conocidos, en el presente documento tambien se dan a conocer

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varios otros procedimientos posiblemente mas sencillos aunque algo mas burdos para identificar dicho virus o protelnas o acidos nucleicos viricos a partir de dicho virus. Como regla general, un virus ToTV puede identificarse por los porcentajes de homologla de las protelnas viricas o acidos nucleicos que se van a identificar en comparacion con las protelnas o acidos nucleicos viricos identificados en el presente documento por la secuencia. Generalmente, se conoce que las especies de virus, especialmente las especies de virus de ARN, a menudo constituyen una casi especie en la que el cluster de dichos virus muestra heterogeneidad entre sus miembros. Por lo tanto, cabe esperar que cada aislado pueda tener un porcentaje de homologia con las secuencias del aislado algo diferente, tal como se da a conocer en el presente documento. Por lo tanto, se considera que otros aislados viricos que muestran suficiente homologia de secuencia con el ToTV (por ejemplo, mas de 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, o 99% de homologia de secuencia) pertenecen al mismo virus. Por lo tanto, el virus ToTV es un virus que tiene, como minimo, el 70%, mas preferentemente, como minimo, el 80%, aun mas preferentemente, como minimo, el 90%, aun mas preferentemente, como minimo, el 95%, aun mas preferentemente, como minimo, el 98%, y de la forma mas preferente, como minimo, el 99% de homologia con la proteina o secuencias de acidos nucleicos dadas a conocer en el presente documento y causa sintomas de enfermedad inducidos por el ToTV en solanaceae, mas particularmente en Solanum y Nicotiana, cuyos sintomas de la enfermedad pueden o no ser similares a los descritos en el presente documento. En Cucurbitaceae, el virus parece no causar sintomas visibles aunque el virus sea capaz de propagarse en las plantas.

Cuando se desea comparar un aislado de virus separado con las secuencias de protelnas o acido nucleicos descritas en el presente documento, se puede identificar un virus aislado (ToTV) como filogeneticamente correspondiente a ToTV mediante la determination de una secuencia de proteina o de acido nucleico de dicho aislado de virus independiente y la determinacion de que dicha secuencia de proteina o de acido nucleico tiene un porcentaje de homologia de secuencia, como minimo, del 70%, mas preferentemente, como minimo, del 80%, aun mas preferentemente, como minimo, del 90%, aun mas preferentemente, como minimo, del 95%, aun mas preferentemente, como minimo, del 98%, y de la forma mas preferente, como minimo, del 99% con las secuencias que se enumeran en el presente documento.

Los aislados viricos que tienen protelnas o acidos nucleicos individuales con una homologia mayor que estos valores minimos mencionados se consideran filogeneticamente correspondientes y, por lo tanto, taxonomicamente correspondientes al virus ToTV y, en general, las protelnas estaran codificadas por una secuencia de acido nucleico correspondiente estructuralmente con una secuencia enumerada en el presente documento.

Cabe senalar que, de forma similar a otros virus, se puede esperar encontrar un cierto grado de variation entre los virus ToTV aislados de diferentes fuentes.

Asimismo, la secuencia de nucleotidos o de aminoacidos del virus ToTV o fragmentos de los mismos segun se da a conocer en el presente documento muestra, por ejemplo, menos de 70% y de la forma mas preferente menos de 60% de homologia de secuencia de aminoacidos con la respectiva secuencia de nucleotidos o de aminoacidos de cualquier virus que no es ToTV o pariente mas cercano.

La divergencia de las secuencias de las cepas de ToTV en todo el mundo puede ser algo mayor, de forma analoga a lo que ocurre con otros virus de plantas.

Se describe un virus aislado (ToTV) identifiable como filogeneticamente correspondiente al mismo mediante la determinacion de una secuencia de acido nucleico de un fragmento adecuado del genoma de dicho virus y ensayandola en analisis filogeneticos, en los que se generan arboles de probabilidad maxima utilizando, por ejemplo, 1.000 muestreos repetitivos “bootstrap”, tal como se ha descrito anteriormente y encontrando que esta filogeneticamente mas estrechamente relacionado con un aislado de virus que comprende las secuencias de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, que se enumeran en el presente documento para ToTV de lo que esta relacionado con un aislado de virus de una cepa de referencia que no es ToTV o un pariente mas cercano.

Los fragmentos del genoma de acido nucleico adecuados cada uno de ellos util para dichos analisis filogeneticos son, por ejemplo, cualquier portion de las secuencias de acido nucleico de los fragmentos de ARN de 5,5 kb u 8 kb (denominados en el presente documento, respectivamente, ARN2 y ARN1), tal como se describe en el ejemplo.

Con el aporte de information sobre la secuencia de este virus ToTV, se pueden utilizar medios y procedimientos de diagnostico para la detection de virus ToTV en una muestra. Preferentemente, la detection de virus ToTV se lleva a cabo con reactivos que son mas especificos para el virus ToTV. No obstante, esto no excluye de ninguna manera la posibilidad de que se utilicen en su lugar reactivos menos especificos, pero con suficiente reactividad cruzada, por ejemplo, porque son mas faciles de conseguir y abordan suficientemente la tarea en cuestion.

Adicionalmente se describe un procedimiento para detectar la presencia de ToTV en las plantas, preferentemente en plantas de tomate, mas preferentemente, en plantas de S. lycopersicum. Dicho procedimiento puede comprender, por ejemplo, la determinacion en dicha muestra de la presencia de un virus ToTV o componente del mismo mediante la reaction de dicha muestra con un acido nucleico especifico de ToTV, o con un anticuerpo segun la presente invention. No obstante, la infection por contacto de una planta indicadora tambien es un procedimiento adecuado

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para detectar la presencia de virus en una planta de ensayo.

En el presente documento se describe la secuencia de nucleotidos parcial de un nuevo virus aislado (en el presente documento tambien denominado virus ToTV) y componentes especificos de virus ToTV o analogos sinteticos de los mismos. Se pueden determinar otras secuencias genomicas del virus ToTV adicionales a las que se dan a conocer en el presente documento mediante procedimientos de secuenciacion conocidos para el experto en la tecnica. La determinacion de la secuencia genomica esta bien al alcance del experto, ahora que se describe un virus ToTV, asl como las secuencias genomicas parciales del mismo. Estos procedimientos comprenden, por ejemplo, los descritos en el ejemplo siguiente. En general, dichos procedimientos de secuenciacion incluyen el aislamiento de los acidos nucleicos del genoma virico por procedimientos de aislamiento de acidos nucleicos y la determinacion de la secuencia de nucleotidos del acido nucleico aislado, por ejemplo, mediante procedimientos didesoxi de terminacion de cadena (Sanger y otros, 1977) opcionalmente precedidos por transcripcion inversa de ARN a ADN.

La presente invencion da a conocer, entre otras cosas, un acido nucleico aislado o recombinante obtenible de un virus de plantas denominado virus del torrado del tomate (ToTV), depositado en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH el 24 de noviembre de 2004, bajo los depositantes con numero de referencia ToTV-E01 (DSM 16999), un virus que comprende, como mlnimo, una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, tal como se define en las figuras 5 y 6, respectivamente, y secuencias que tienen una homologla de secuencia de nucleotidos, como mlnimo, del 70% con las mismas, en el que las secuencias homologas son secuencias de nucleotidos de un virus ToTV que codifican una protelna putativa de movimiento y tres protelnas de la capside, o una helicasa, proteasa y ARN polimerasa dependiente de ARN, respectivamente. Los acidos nucleicos aislados o recombinantes comprenden las secuencias enumeradas en el presente documento o secuencias de homologos, que son capaces de hibridar con aquellos en condiciones rigurosas. En particular, se describen cebadores y/o sondas adecuados para la identification de un acido nucleico del virus ToTV. Se pueden desarrollar sondas y cebadores adicionales capaces de hibridar con una secuencia de acido nucleico del virus ToTV mediante procedimientos conocidos por el experto en la tecnica.

Vectores de expresion y expresion de genes codificantes viricos

Ademas, la presente invencion se refiere a un vector de expresion que comprende un acido nucleico segun la presente invencion. Para empezar, los vectores de expresion, tales como vectores plasmidicos que contienen (partes de) una secuencia de doble cadena del genoma del virus ToTV, vectores viricos que contienen (partes de) el genoma de ToTV (por ejemplo, pero no limitado a los mismos, virus vacunal, retrovirus, baculovirus), o virus ToTV que contiene (partes de) el genoma de otros virus u otros agentes patogenos son parte de la presente invencion.

El vector de expresion puede comprender una secuencia genomica de ToTV o parte de la misma que esta bajo el control de un elemento regulador, tal como un promotor o unido de forma operativa al mismo. El segmento de ADN al que se refiere como el promotor es responsable de la regulation de la transcripcion del ADN en ARNm. El vector de expresion puede comprender uno o mas promotores adecuados para la expresion del gen, preferentemente para la expresion del gen que codifica la proteina virica, en celulas vegetales, celulas fungicas, celulas bacterianas, celulas de levadura, celulas de insecto u otras celulas eucariotas. Los vectores de expresion de la presente invencion son muy utiles para proporcionar antigenos del virus en sistemas de expresion de genes.

Tambien se describe una celula huesped que comprende un acido nucleico o un vector de expresion segun la presente invencion. El plasmido o vectores viricos que contienen los acidos nucleicos que codifican componentes proteicos del virus ToTV pueden generarse en celulas procariotas para la expresion de los componentes en tipos de celulas competentes (celulas vegetales, celulas fungicas, bacterias, celulas de insecto, celulas vegetales u otras celulas eucariotas). Los vectores plasmidicos o viricos que contienen copias de longitud completa o parcial del genoma del virus ToTV pueden generarse en celulas procariotas para la expresion de acidos nucleicos viricos in vitro o in vivo.

Procedimientos para el aislamiento y purification de ToTV

El virus ToTV puede aislarse de plantas infectadas o de otras fuentes por cualquier procedimiento disponible. El aislamiento puede comprender purificar o purificar parcialmente particulas viricas de ToTV de una fuente adecuada. Una amplia gama de procedimientos esta disponible para el aislamiento y purificacion del virus (por ejemplo, vease Dijkstra y De Jager, 1998). La purificacion de ToTV puede, por ejemplo, analizarse utilizando procedimientos estandar para, por ejemplo, nepovirus o luteovirus (con la ayuda de disolventes organicos) (vease, por ejemplo, Walker, 2004). Aunque dichos protocolos pueden dar lugar a una perdida de infectividad del virus, estos procedimientos pueden todavia ser utiles para obtener material virico para otros fines.

Preferentemente, con el fin de mantener la integridad virica, se utiliza un procedimiento de purificacion suave para purificar el ToTV. Dicho procedimiento de purificacion suave puede comprender, por ejemplo, la homogeneizacion del material infectado de una planta (por ejemplo, hojas) en un tampon de homogeneizacion (que comprende, por ejemplo, tampon Tris-HCl 0,1 M a un pH de aproximadamente 8, aproximadamente 20 mM de sulfito de sodio [Na2SO3], aproximadamente 10 mM de dietilditiocarbamato de sodio [Na-DIECA] y aproximadamente 5 mM de

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etilendiaminotetraacetato de sodio (Na-EDTA)), separando los restos mediante centrifugacion (por ejemplo, durante 30 minutos a 49.000 g), colocando el sobrenadante sobre una cojin adecuado de sacarosa (por ejemplo, 20%) y sedimentacion de las particulas viricas (por ejemplo, mediante centrifugacion durante 1,5 horas a 70.000 g). A continuacion, el sedimento que comprende las particulas viricas puede resuspenderse en un tampon adecuado (por ejemplo, en TRIS-HCl, a pH 8) y la fraccion que contiene el virus puede separarse del resto de la suspension mediante centrifugacion por gradiente de densidad de sacarosa (por ejemplo, sacarosa al 10 - 40% en tampon de homogeneizacion centrifugada durante 2 horas a 110.000 g). La fraccion que contiene el virus se puede determinar mediante la utilizacion de experimentos de infeccion. La purificacion adicional se puede producir mediante la utilizacion de centrifugacion de densidad en un gradiente de sulfato de cesio (por ejemplo, gradiente de sulfato de cesio al 10 - 40% en TRIS-HCl, a pH 8, centrifugado durante 16 horas a 125.000 g). A continuacion, se pueden recoger las bandas viricas enriquecidas del gradiente y concentrar adicionalmente mediante centrifugacion o dialisis (por ejemplo, contra Tris-HCl 0,1 M, pH 8).

La infectividad de ToTV despues de la purificacion puede comprobarse mediante la inoculacion en una planta sensible (por ejemplo, N. hesperis '67A').

Procedimientos para la purificacion de proteinas asociadas a ToTV y secuenciacion de aminoacidos

Despues de haber preparado virus ToTV purificado o parcialmente purificado, es posible preparar una preparation sustancialmente pura de una proteina asociada al virus (por ejemplo, proteinas codificadas por el virus). Aunque en la tecnica se conocen numerosos procedimientos y estrategias para la purificacion de proteinas, lo mas conveniente sera purificar proteinas del virus ToTV, tales como las proteinas de la cubierta virica, mediante electroforesis utilizando, por ejemplo, un gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) o bien mediante cromatografia de afinidad. Cada uno de estos procedimientos se describe a continuacion.

Las proteinas de interes de ToTV se pueden separar mediante electroforesis utilizando, por ejemplo, tricina-SDS- PAGE (Schagger y Von Jagow, 1987) o Glicina-SDS-PAGE (Laemmli, 1970). Por supuesto, tambien pueden utilizarse otros sistemas de electroforesis que pueden resolver las diversas proteinas comprendidas en el aislado de virus o transcritas a partir de su genoma y expresadas en un sistema de expresion adecuado, tales como electroforesis en gel no desnaturalizante. El area del gel PAGE que incluye la proteina diana puede escindirse y se pueden eluir del mismo los polipeptidos diana, por ejemplo mediante la utilizacion de un dispositivo Elutrap® (Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania). Una proteina diana puede identificarse por su movilidad con respecto a los polipeptidos de referencia en un gel. Para aumentar la pureza, la proteina eluida se puede pasar por un segundo gel de SDS-PAGE y eluir una segunda vez. A continuacion, la proteina o peptido contenido en el fragmento de gel escindido se puede eluir de nuevo y es adecuado para su utilizacion en la inmunizacion o en la secuenciacion de proteinas.

Las proteinas de interes de ToTV tambien se pueden purificar mediante cromatografia de afinidad utilizando un anticuerpo (tal como un anticuerpo monoclonal) que se une especificamente a una proteina de ToTV. El anticuerpo puede acoplarse covalentemente a soportes solidos, tales como celulosas, poliestireno, poliacrilamida, dextrano reticulado, agarosa en perlas o de vidrio de poro controlado utilizando agentes de acoplamiento bifuncionales que reaccionan con grupos funcionales sobre el soporte y los grupos funcionales (es decir, cadenas laterales de aminoacidos reactivos) sobre la molecula de anticuerpo. Dichos procedimientos estan facilmente disponibles para el experto. La fase solida portadora del anticuerpo resultante se pone en contacto con el virus purificado o parcialmente purificado en condiciones reductoras utilizando el pH, la fuerza ionica, la temperatura y los tiempos de residencia que permiten que la proteina de interes se una al anticuerpo inmovilizado. El virus o proteina se eluye de la columna haciendo pasar un eluyente que disocia los enlaces de hidrogeno a traves del lecho. Los tampones a un pH especifico o soluciones de NaCl por encima de a aproximadamente 2 M son eluyentes de utilizacion habitual.

Los procedimientos para llevar a cabo la cromatografia de afinidad utilizando anticuerpos, asi como otros procedimientos para la purificacion por inmunoafinidad de las proteinas (tales como las proteinas de la capside virica) son bien conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Harlow y Lane, 1988).

Con las ensenanzas dadas a conocer en el presente documento, el experto es capaz de aislar una proteina especifica de virus del ToTV, determinar la secuencia de aminoacidos de, por ejemplo, la parte N-terminal de dicha proteina, disenar un conjunto de sondas degeneradas (por la degeneration del codigo genetico) para hibridar con el ADN que codifica una region de dicha proteina, utilizar estas sondas en una serie de genes en una biblioteca genomica producida a partir del virus, obtener hibridaciones positivas y localizar los genes correspondientes. Por consiguiente, el experto es capaz de identificar la region estructural del gen y, opcionalmente, las secuencias en direction 5’ y 3’ de la misma. A continuacion, el experto es capaz de establecer la secuencia correcta de los restos de aminoacidos que forman la proteina.

Production de anticuerpos

Se pueden generar anticuerpos, monoclonales o policlonales, frente a una proteina purificada o parcialmente purificada o fragmento peptidico del virus ToTV de diversas formas conocidas por el experto en la tecnica,

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incluyendo la inyeccion de la protelna como un antigeno en los animales, mediante fusion de hibridoma y mediante procedimientos recombinantes que implican bacterias o sistemas de fagos (vease, Marks y otros, 1992a; Marks y otros, 1992b; Lowman y otros, 1991; Lerner y otros, 1992, cada una de estas referencias da a conocer procedimientos adecuados).

Los anticuerpos contra particulas viricas, protelnas o peptidos del virus pueden producirse mediante la inmunizacion de un vertebrado adecuado, preferentemente un huesped mamifero, por ejemplo, conejos, cabras, ratas, pollos y ratones, con las particulas, protelnas o peptidos solos o junto con un adyuvante. Por lo general, estaran involucradas dos o mas inmunizaciones y se cosecharan la sangre o el bazo unos pocos dias despues de la ultima inyeccion. Para los antisueros policlonales, las inmunoglobulinas se pueden precipitar, aislar y purificar (por afinidad). Para los anticuerpos monoclonales, los esplenocitos normalmente se fusionaran con un linfocito inmortalizado, por ejemplo, una linea mieloide, en condiciones selectivas para hibridomas. Despues, los hibridomas se pueden clonar en condiciones de dilucion limite y cribar sus sobrenadantes segun los anticuerpos que tienen la especificidad deseada. Las tecnicas para producir anticuerpos (monoclonales) y procedimientos para su preparacion y su utilizacion en diversos procedimientos son bien conocidas en la literatura (vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.° 4.381.292, 4.451.570 y 4.618.577; Harlow y Lane, 1988; Ausubel, y otros, 1998; Rose y otros, 1997; Coligan y otros, 1997). Tipicamente, un anticuerpo dirigido contra una protelna asociada a virus tendra una afinidad de union, como minimo, de 1 x 105-1 x 107 M-1.

Como antigeno es preferente una protelna recombinante derivada del virus ToTV, tal como se puede obtener mediante la expresion de una secuencia genomica que codifica la protelna del virus en un sistema de expresion adecuado. Sin embargo, tambien se pueden utilizar proteinas purificadas. Los antigenos adecuados para la deteccion de anticuerpos incluyen cualquier proteina de ToTV que se combina con cualquier anticuerpo especifico de ToTV de un mamifero expuesto al virus ToTV o infectado por el mismo. Entre los antigenos preferentes de la presente invention se incluyen los que provocan la respuesta inmunitaria en los mamiferos expuestos a ToTV, que, por lo tanto, normalmente son reconocidos mas facilmente por los anticuerpos de un mamifero. Entre los antigenos particularmente preferidos se incluyen las protelnas de la capside de ToTV. Las protelnas estructurales de virus purificados son las mas preferentes.

Los procedimientos para la clonacion de secuencias genomicas, para la manipulacion de las secuencias genomicas a y desde los vectores de expresion y para la expresion de la protelna codificada por la secuencia genomica en un huesped heterologo son bien conocidos y estas tecnicas se pueden utilizar para proporcionar los vectores de expresion, celulas huesped y las secuencias genomicas clonadas que codifican los antigenos, secuencias que se van a expresar en un huesped para producir anticuerpos para su utilizacion en ensayos de diagnostico (vease, por ejemplo, Sambrook y otros, 2001 and Ausubel, y otros, 1998).

Se pueden utilizar diversos sistemas de expresion para producir antigenos de ToTV. Por ejemplo, se han descrito diversos vectores de expresion adecuados para producir protelnas en E. coli, B. subtilis, levaduras, celulas de insecto, celulas vegetales y celulas de mamifero, cualquiera de los cuales podrian utilizarse para producir un antigeno de ToTV adecuado para producir un anticuerpo anti-ToTV o fragmento del mismo. Por supuesto, el propio ToTV tambien puede utilizarse como un vector de expresion para este fin.

Una de las utilizaciones de los anticuerpos de la presente invencion es el cribado de bibliotecas de expresion de ADNc para la identification de clones que contienen insertos de ADNc que codifican protelnas de interes o protelnas con inmunorreactividad cruzada relacionadas estructuralmente. Dicho cribado de bibliotecas de expresion de ADNc es bien conocido en la tecnica (vease, por ejemplo, Young y Davis, 1983), a la que se hace referencia en este contexto, as! como otras fuentes publicadas. Otra utilization de estos anticuerpos es para su utilization en cromatografla de afinidad para la purification de protelnas de ToTV. Estos anticuerpos tambien son utiles para detectar la infection por ToTV.

Tambien se describe una protelna virica especifica de ToTV o un fragmento de la misma, de aqui en adelante denominada molecula proteinacea. Las moleculas proteinaceas utiles derivan, por ejemplo, de cualquiera de las secuencias genomicas o sus fragmentos que pueden derivar de un virus ToTV. Dichas moleculas proteicas, o fragmentos antigenicos de las mismas, tal como se da a conocer en el presente documento, son, por ejemplo, utiles en procedimientos o kits de diagnosticos y en composiciones de diagnostico. Particularmente utiles son las moleculas proteinaceas que estan codificadas por fragmentos de acido nucleico recombinante que se identifica que producen anticuerpos especificos del virus ToTV, ya sea in vivo (por ejemplo, para proporcionar anticuerpos de diagnostico) o in vitro (por ejemplo, mediante tecnologla de presentation en fagos u otra tecnica util para la generacion de anticuerpos sinteticos o partes de los mismos).

En el presente documento tambien se dan a conocer anticuerpos, ya sea monoclonales o policlonales naturales o sinteticos (por ejemplo, moleculas de union derivadas de la biblioteca (fagos) que reaccionan especificamente con un antigeno que comprende una molecula proteinacea un fragmento de la misma funcional especifico del virus ToTV, tal como una protelna de la capside.

Procedimientos para la identificacion de un aislado virico como un virus ToTV

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Aparte de la deteccion del virus ToTV, que implica procedimientos diagnosticos, la presente invencion tambien se refiere a procedimientos para la identificacion, es decir, confirmacion de que el aislado es un virus de plantas denominado virus del torrado del tomate (ToTV), depositado en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH el 24 de noviembre de 2004, bajo los depositantes con numero de referencia ToTV-E01 (DSM 16999), un virus que comprende, como mlnimo, una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, tal como se define en las figuras 5 y 6, respectivamente, y secuencias que tienen una homologla de secuencia de nucleotidos, como mlnimo, del 70% con las mismas, en el que las secuencias homologas son secuencias de nucleotidos de un virus ToTV que codifican una protelna putativa de movimiento y tres protelnas de la capside, o una helicasa, proteasa y ARN polimerasa dependiente de ARN, respectivamente. Dichos procedimientos pueden basarse en la inferencia filogenetica, tal como se ha descrito anteriormente, y determinar el nivel de homologla de la secuencia de nucleotidos o aminoacidos entre un aislado virico no identificado y una o mas cepas de referencia del virus ToTV confirmado y virus no ToTV. Dichos procedimientos pueden comprender, por ejemplo, la secuenciacion de (parte de) el genoma de un aislado virico o de una proteina de la capside y comparar el nivel de homologla de dicha secuencia con las secuencias, tal como se ha dado a conocer en el presente documento para ToTV. Un aislado que tiene una homologla de secuencia de mas del 70% con la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2, tal como se da a conocer en el presente documento se considera taxonomicamente correspondiente a ToTV o perteneciente al taxon virico de ToTV. Con el fin de identificar un virus como el virus del torrado del tomate (ToTV), tambien se puede utilizar los descriptores taxonomicos, tal como se presenta en la tabla 1 anterior, y encontrar mediante comparacion que un nuevo aislado pertenece al posible nuevo genero, al que se puede asignar la cepa de ToTV identificada por las secuencias de acido nucleico de SEQ ID NOS: 1 y 2 dadas a conocer en el presente documento y depositadas en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH el 24 de noviembre de 2204, bajo los depositantes con numero de referencia ToTV-E01 (DSM 16999), como la especie tipo. Por lo tanto, no es esencial llevar a cabo una comparacion de secuencias, a efecto de evaluar que un virus es ToTV. Mas bien, un procedimiento de identificacion de un virus como un virus del torrado de tomate (ToTV) puede comprender las etapas de evaluar la presencia de la combinacion de descriptores taxonomicos seleccionados del grupo que consiste en

a) descriptores morfologicos, tales como particulas de viriones esfericos, sin envoltura, de aproximadamente 28 nm de diametro;

b) descriptores de las propiedades del genoma, tales como tener propiedades de virus de ARN sentido positivo lineal monocatenario basado en dos segmentos de ARN que comprenden colas de poli (A), que codifican poliproteinas de 5,5 y 8 kDa, respectivamente, y que comprenden regiones codificantes o motivos para 3 protelnas de la capside, helicasa, proteasa, RdRP y proteina putativa de movimiento y que segmentos de ARN y/o poliproteinas y/o motivos tienen homologias segun la comparacion de secuencias esencialmente, tal como se describe en el presente documento, y

c) descriptores de las propiedades biologicas, tales como la produccion de lesiones necroticas y sintomas de tipo quemadura en el tomate, que tiene una gama de huespedes, una relacion del vector y/o una distribucion geografica esencialmente, tal como se describe en el presente documento, y que estan asociados con las enfermedades de las plantas de tomate conocidas localmente con nombres, tales como torrado, marchitez mancha chocolate.

La combinacion de descriptores taxonomicos que da lugar a una identificacion positiva de que un aislado de virus es un virus del torrado del tomate (ToTV) es la combinacion que muestra que el aislado esta mas estrechamente relacionado (basado en procedimientos numericamente taxonomicos bien conocidos por el experto en la tecnica) con el ToTV, tal como se describe en el presente documento, que con otros virus, y en el que dicho aislado produce, preferentemente, los sintomas de la enfermedad en el tomate tipicas del torrado, tal como se describe en el presente documento.

Por lo tanto, un virus que, basado en el analisis taxonomico numerico de los descriptores taxonomicos esencialmente, tal como se define en la tabla 1, muestra estar mas estrechamente relacionado con el virus de planta denominado virus del torrado del tomate (ToTV), depositado en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH el 24 de noviembre de 2004 bajo los depositantes con numero de referencia ToTV-E01 (DSM 16999), un virus que comprende, como mlnimo, una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, tal como se define en las figuras 5 y 6, respectivamente y secuencias que tienen una homologla de secuencia de nucleotidos, como mlnimo, del 70% con las mismas, en el que las secuencias homologas son secuencias de nucleotidos de un virus ToTV que codifican una proteina putativa de movimiento y tres protelnas de la capside, o una helicasa, proteasa y ARN polimerasa dependiente de ARN, respectivamente, que con cualquier otro virus conocido en el momento de la presentacion de la presente solicitud, y que el virus esta asociado con una enfermedad que causa lesiones necroticas en el tomate, en el presente documento se considera que es un ToTV.

Dependiendo de la relacion filogenetica, o la distincion con otros taxones viricos, el taxon virico del ToTV puede ser un aislado, una especie, un genero o incluso una familia de virus.

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Como alternativa, los procedimientos para identificar un aislado como un virus de planta denominado virus del torrado del tomate (ToTV), depositado en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH el 24 de noviembre de 2004, bajo los depositantes con numero de referencia ToTV-E01 (DSM 16999), un virus que comprende, como mlnimo, una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, tal como se define en las figuras 5 y 6, respectivamente, y secuencias que tienen una homologla de secuencia de nucleotidos, como mlnimo, del 70% con las mismas, en el que las secuencias homologas son secuencias de nucleotidos de un virus ToTV que codifican una protelna putativa de movimiento y tres protelnas de la capside, o una helicasa, proteasa y ARN polimerasa dependiente de ARN, respectivamente, se pueden basar en la sintomatologla, es decir en el reconocimiento del virus por sus sintomas de enfermedad.

No obstante, en una realization preferida, los anticuerpos de la presente invention se utilizan en un procedimiento para identificar un aislado virico como un virus de planta denominado virus del torrado del tomate (ToTV), depositado en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH el 24 de noviembre de 2004, bajo los depositantes con numero de referencia ToTV-E01 (DSM 16999), un virus que comprende, como mlnimo, una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, tal como se define en las figuras 5 y 6, respectivamente, y secuencias que tienen una homologla de secuencia de nucleotidos, como mlnimo, del 70% con las mismas, en el que las secuencias homologas son secuencias de nucleotidos de un virus ToTV que codifican una protelna putativa de movimiento y tres protelnas de la capside, o una helicasa, proteasa y ARN polimerasa dependiente de ARN, respectivamente, a condition de que la reactividad cruzada de dichos anticuerpos con cepas que no son ToTv relacionadas se haya descartado eficazmente. Dichos procedimientos comprenden la etapa de hacer reaccionar dicho aislado virico o un componente del mismo, con un anticuerpo, tal como se da a conocer en el presente documento. En el presente documento, se hace referencia a la reaction como que permite la aparicion de la union antigeno-anticuerpo. Esto puede conseguirse, por ejemplo, mediante la utilization del virus ToTV, o partes del mismo (protelnas, peptidos), purificados o no purificados. Preferentemente, se utilizan celulas infectadas o cultivos de celulas para identificar antigenos viricos utilizando cualquier procedimiento inmunologico adecuado Especialmente utiles en este sentido son los anticuerpos producidos contra las protelnas de la capside virica del ToTV.

Otros procedimientos para la identification de un aislado virico como un virus ToTV comprenden hacer reaccionar dicho aislado virico o un componente del mismo con un polinucleotido especifico de virus, en el que el polinucleotido es capaz de hibridar en condiciones rigurosas con una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, secuencias que tienen una homologla de secuencia de nucleotidos, como mlnimo, de un 70% con la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:2, y sus cadenas complementarias. Dicha reaccion de hibridacion puede realizarse en cualquier formato disponible para el experto en la tecnica y, en general, implicara la impresion de tejidos, procedimientos de transferencia puntual, transferencia o hibridacion Northern/Southern, hibridacion in situ, PCR, RT-PCR y similares.

Procedimientos de detection inmunologicos

Los procedimientos de la presente invencion en los que los antigenos se detectan pueden, en principio, llevarse a cabo mediante la utilizacion de cualquier procedimiento inmunologico, tal como, por ejemplo, inmunofluorescencia clasica (IF), tecnicas inmunohistoquimicas o formatos de ensayo de deteccion de antigenos comparables. Los procedimientos de deteccion de ToTV preferentes basados en la deteccion de la protelna de la cubierta virica pueden, por ejemplo, comprender procedimientos, tales como pruebas de precipitation y aglutinacion, radioinmunoensayo (RIA), marcaje inmuno-oro, microscopia electronica inmunoadsorbente (ISEM), ensayo de inmunoadsorcion ligado a enzimas (ELISA), transferencia Western e inmunotransferencia. Los ejemplos de tipos de inmunoensayos que pueden utilizar anticuerpos de la presente invencion son inmunoensayos competitivos y no competitivos en un formato directo o indirecto. Los anticuerpos pueden utilizarse en inmunoensayos en fase liquida o unirse a un soporte en fase solida. Ademas, los anticuerpos en estos inmunoensayos pueden marcarse de forma detectable de varias maneras. Los expertos en la tecnica conoceran, o pueden discernir facilmente, formatos de inmunoensayo adecuadas sin experimentation indebida. Los formatos de ensayo son bien conocidos en la literatura y se describen, por ejemplo, en Harlow y Lane (1988).

Se pueden utilizar diversos formatos de inmunoensayo para seleccionar anticuerpos especificamente reactivos con un polipeptido particular segun la presente invencion, tales como protelnas de la cubierta del virus ToTV. Por ejemplo, los inmunoensayos ELISA en fase solida se utilizan habitualmente para este proposito. Vease en Harlow y Lane (1988), una description de formatos y condiciones de inmunoensayo que pueden utilizarse para determinar la union selectiva.

Los anticuerpos se pueden unir a muchos vehiculos diferentes y utilizarse para detectar la presencia de las moleculas diana. Como alternativa, los antigenos se pueden unir a muchos vehiculos diferentes y utilizarse para detectar la presencia del anticuerpo. Los ejemplos de vehiculos bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nylon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. La naturaleza del vehiculo puede ser soluble o insoluble para los propositos de la presente invencion. Los expertos en la tecnica conoceran otros vehiculos adecuados para unir anticuerpos o seran capaces de determinarlos

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utilizando experimentacion de rutina.

Los ensayos de transferencia Western se describen, en general, en Harlow y Lane (1988). Segun este procedimiento, las protelnas viricas (y otras protelnas en la preparacion de virus) se separan mediante electroforesis en gel y se transfieren a una fase solida (es decir, una membrana, tal como nitrocelulosa). El antigeno inmovilizado se hace reaccionar despues con un anticuerpo y un sistema de deteccion (por ejemplo, un segundo anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina). Tal como sera evidente para los expertos, sera ventajoso incluir materiales de control positivos y negativos apropiados (tales como el antigeno sustancialmente purificado o virus ToTV) en el ensayo.

Los ensayos de inmunoadsorcion ligada a enzimas (ELISA) se describen generalmente en Harlow y Lane (1988). El ensayo implica la reaccion de un componente virico (por ejemplo, una protelna de la capside) con un anticuerpo. En una realization, la muestra puede comprender un tejido de la planta que se muele y se hace reaccionar con el anticuerpo que se ha recubierto sobre una fase solida, tal como una placa de ensayo. Si el virus esta presente en la muestra, un anticuerpo especifico marcado con una enzima se unira al complejo anticuerpo-virus y se detectara mediante una reaccion con el sustrato de la enzima que produce una reaccion de color. Los procedimientos preferentes de analisis ELISA son ELISA directo de tipo sandwich con doble anticuerpo (DAS) (Clark y Adams, 1977), ELISA indirecto DAS (Vela y otros 1986), o TAS-ELISA. Sera evidente para los expertos en la tecnica que en un ELISA o cualquier otro tipo de ensayo a veces sera deseable determinar la presencia de mas de una protelna de la capside virica en una sola reaccion, por ejemplo, mediante la mezcla de dos o mas anticuerpos con diferentes especificidades y analizar cualquiera o todas las protelnas de protection asociadas a la capside de la presente invencion.

Procedimientos de deteccion basados en acidos nucleicos

ToTV esta compuesto, como minimo, por dos acidos ribonucleicos (ARN). Hay fuertes indicios de la presencia de tres protelnas de la capside de proteccion. Los procedimientos descritos anteriormente se centran en la deteccion inmunologica de las protelnas viricas para la deteccion del virus. Mediante tecnologia de ADN recombinante, es posible producir sondas que directa o indirectamente hibriden con los ARN viricos (o su complementaria) o el ADNc producido a partir de ellos por transcription inversa y que se pueden utilizar en ensayos para la deteccion del virus. Las tecnicas de amplification de acidos nucleicos permiten la amplification de fragmentos de acidos nucleicos viricos, que pueden estar presentes en cantidades muy bajas.

Con el fin de desarrollar procedimientos de deteccion basados en acidos nucleicos, deben determinarse las secuencias especificas del virus para las que se pueden desarrollar cebadores o sondas. Para detectar el ToTV mediante amplificacion de acidos nucleicos y/o hibridacion de la sonda, la protelna de la capside del ToTV puede secuenciarse o, de forma alternativa, se puede aislar el ARN genomico virico del virus purificado, realizar transcripcion inversa para obtener el ADNc y clonarse y/o secuenciarse directamente. Mediante la utilization del acido nucleico clonado como sonda de hibridacion, la utilizacion de la informacion sobre la secuencia derivada del clon o el diseno de cebadores degenerados basados en la secuencia de aminoacidos de la protelna del ToTV, se pueden disenar sondas de hibridacion de acidos nucleicos y/o cebadores de amplificacion de acidos nucleicos y utilizarlos en un ensayo de deteccion para detectar la presencia del virus en una muestra, tal como se define en el presente documento.

Los procedimientos en los que se detectan acidos nucleicos pueden, en principio, llevarse a cabo mediante cualquier procedimiento de amplificacion de acidos nucleicos, tal como la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR; Mullis y Faloona, 1987; Patente de Estados Unidos n.° 4.683.195; 4.683.202; y 4.800.159) o bien mediantereacciones de amplificacion, tal como la reaccion en cadena de la ligasa (LCR; Barany, 1991; documento EP 0 320 308), replication de secuencia autosostenida (3SR; Guatelli y otros, 1990), amplificacion mediante desplazamiento de cadena (SDA; Walker y otros, 1992; Patentes de Estados Unidos n.° 5.270.184 y 5.455.166), sistema de amplificacion transcripcional (TAS; Kwoh y otros, 1989), Q-Beta Replicasa (Lizardi y otros, 1988), amplificacion por circulo rodante (RCA; Patente de Estados Unidos n.° 5.871.921), amplificacion basada en la secuencia de acido nucleico (NASBA; Compton, 1991), polimorfismo de longitud por fragmentos de restriction (Patente de Estados Unidos n.° 5.719.028), amplificacion de acido nucleico iniciada por cebador quimerico e isotermico (ICAN), procedimiento de amplificacion por ramification-extension (RAM; Patentes de Estados Unidos n.° 5.719.028 y 5.942.391) u otros procedimientos adecuados para la amplificacion de acidos nucleicos.

Dado que el virus es un virus de ARN (es decir, las secuencias de las figuras 5 y 6 son el equivalente de ADN del genoma de ARN virico), un procedimiento de deteccion adecuado puede comprender el aislamiento de los acidos nucleicos viricos a partir de una muestra, por ejemplo, de una planta infectada, mediante la utilizacion de procedimientos conocidos per se por el experto (por ejemplo, Chomczynski y Sacchi, 1987; Boom y otros, 1990) o sistemas disponibles comercialmente (por ejemplo, el kit de aislamiento de aRn total RNeasy o kit de aislamiento de ARN vegetal RNeasy de QIAGEN GmbH, Hilden, Alemania, o el kit High-Pure-RNA-Isolation-Kit® (Roche Diagnostics, una division de F. Hoffmann-la Roche Ltd., Basilea, Suiza).

El ARN total, por ejemplo, se puede extraer de material de hojas o protoplastos de celulas vegetales y el ARN total,

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o especificamente el ARN genomico del virus, o una parte del mismo, puede someterse a transcripcion inversa para obtener el ADNc mediante la utilizacion de, por ejemplo, transcripcion inversa del virus de la mieloblastosis aviar (AMV) o transcripcion inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (M-MuLV). Un procedimiento adecuado puede incluir, por ejemplo, la mezcla en un sistema tampon acuoso adecuado (por ejemplo, un tampon de RT disponible comercialmente) una cantidad adecuada de ARN totales (por ejemplo, de 1 a 5 gg), una cantidad adecuada (por ejemplo, l0 pmol) de un cebador de transcripcion inversa, una cantidad adecuada de dNTP y la transcriptasa inversa, la desnaturalizacion de los acidos nucleicos por ebullicion durante 1 minuto y su enfriamiento en hielo, seguido por transcripcion inversa a, por ejemplo, 45°C durante 1 hora, tal como se recomienda para la transcriptasa inversa especifica utilizada, para obtener copias de ADNc de las secuencias viricas.

Como cebador de transcripcion inversa se puede utilizar un polinucleotido, por ejemplo, un oligonucleotido 18 - 25 unidades, que comprende una secuencia de nucleotidos complementaria a la secuencia genomica del ToTV o, preferentemente, como mlnimo, capaz de hibridar en condiciones rigurosas con la secuencia de acido nucleico de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2 o un fragmento especifico de ToTV del mismo. Como alternativa, se puede utilizar un cebador de poliT especifico de a (cebador oligo dT) con el fin de iniciar la transcripcion inversa a partir de los motivos de ARN poliA.

Despues de la etapa de RT, el ADNc obtenido puede amplificarse mediante PCR a traves de la utilizacion de, por ejemplo, ADN polimerasas de Pfu y Taq, y cebadores de amplificacion especificos para las secuencias del ADNc genomico virico. Asimismo, se pueden utilizar sistemas disponibles comercialmente para la RT-PCR (por ejemplo, los sistemas Access y AccessQuick™ RT-PCR de Promega [Madison WI, USA], o el sistema Titan™ One Tube RT- PCR o los sistemas de dos etapas RT-PCR facilitados por Roche Diagnostics [una division de F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basilea, Suiza]).

Con el fin de amplificar un acido nucleico con un pequeno numero de apareamientos erroneos de uno o mas de los cebadores de amplificacion, se puede realizar una reaccion de amplificacion en condiciones de rigurosidad reducida (por ejemplo, una amplificacion por PCR utilizando una temperatura de hibridacion de 38°C, o la presencia de MgCl2 3,5 mM). El experto en la tecnica sera capaz de seleccionar las condiciones de rigurosidad adecuadas.

Los cebadores en el presente documento se seleccionan de modo que sean "sustancialmente" complementarios (es decir, como minimo, 65%, mas preferentemente, como minimo, 80% perfectamente complementarios) con sus regiones diana presentes en las diferentes cadenas de cada secuencia especifica que se va a amplificar. Es posible utilizar secuencias de los cebadores que contienen, por ejemplo, restos de inositol o bases ambiguas o incluso cebadores que contienen uno o mas apareamientos erroneos en comparacion con la secuencia diana. En general, las secuencias que presentan, como minimo, 65%, mas preferentemente, como minimo, 80%, de homologia con las secuencias oligonucleotidicas de ADN o ARN diana, se consideran adecuadas para su utilizacion en un procedimiento tal como se describe. Los apareamientos erroneos en la secuencia no son cruciales cuando se utilizan condiciones de hibridacion de rigurosidad baja.

La deteccion de los productos de amplificacion puede, en principio, llevarse a cabo mediante cualquier procedimiento adecuado conocido en la tecnica. Los fragmentos amplificados se pueden tenir o marcar directamente con marcadores radiactivos, anticuerpos, colorantes luminiscentes, colorantes fluorescentes o reactivos enzimaticos. Las tinciones directas de ADN incluyen, por ejemplo, colorantes de intercalado, tales como naranja de acridina, bromuro de etidio, monoazida de etidio o colorantes Hoechst.

Como alternativa, los fragmentos de ADN o de ARN se pueden detectar mediante la incorporation de bases dNTP marcadas en los fragmentos sintetizados. Los marcadores de detection que pueden asociarse con las bases nucleotidicas incluyen, por ejemplo, fluoresceina, colorante de cianina, digoxigenina (DIG) o bromodesoxiuridina (BrdUrd).

Cuando se utiliza un sistema de deteccion basado en sondas, un procedimiento de deteccion adecuado para su utilizacion puede comprender, por ejemplo, un formato de inmunoensayo enzimatico (EIA) (Jacobs y otros, 1997). Para llevar a cabo una deteccion mediante el procedimiento de EIA, el cebador directo o el inverso utilizados en la reaccion de amplificacion pueden comprender un grupo de captura, tal como un grupo biotina para la inmovilizacion de los amplicones diana para la PCR de ADN en, por ejemplo, pocillos de placas de microtitulacion revestidos con estreptavidina o Dynabeads® recubiertas con estreptavidina (Dynal Biotech, Oslo, Noruega) para la posterior deteccion mediante EIA de los amplicones de ADN diana. El experto en la materia comprendera que se pueden utilizar otros grupos para la inmovilizacion de los amplicones por PCR del ADN diana en un formato EIA.

Las sondas utiles para la deteccion de las secuencias de acidos nucleicos diana, tal como se describe en el presente documento, se unen, preferentemente, solo, como minimo, a una parte de la region de la secuencia de acido nucleico, tal como se amplifica mediante el procedimiento de amplificacion del acido nucleico. Los expertos en la tecnica pueden preparar sondas adecuadas para la deteccion basada en la secuencia de nucleotidos del acido nucleico diana sin experimentacion indebida, tal como se establece en el presente documento. Asimismo, las secuencias de nucleotidos complementarias, ya sea ADN o ARN o analogos sintetizados quimicamente, del acido nucleico diana se pueden utilizar adecuadamente como sondas de deteccion especificas de tipo en un

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procedimiento tal como se ha descrito, siempre que una hebra complementaria de este tipo se amplifique en la reaccion de amplificacion empleada.

Los procedimientos de deteccion adecuados para su utilization en el presente documento pueden comprender, por ejemplo, la inmovilizacion de los amplicones y la aplicacion de sondas a las secuencias de acidos nucleicos de los mismos mediante, por ejemplo, transferencia Northern y Southern. Otros formatos pueden comprender un formato de EIA, tal como se ha descrito anteriormente. Para facilitar la deteccion de la union, las sondas de deteccion de amplicones especificas pueden comprender un resto marcador, tal como un fluoroforo, un cromoforo, una enzima o un radiomarcador, a fin de facilitar el control de la union de las sondas al producto de reaccion de la reaccion de amplificacion. Dichos marcadores son bien conocidos para los expertos en la tecnica e incluyen, por ejemplo, isotiocianato de fluoresceina (FITC), P-galactosidasa, peroxidasa de rabano, estreptavidina, biotina, digoxigenina, 35S, 14C, 32P o 125I. Otros ejemplos seran evidentes para los expertos en la tecnica.

La deteccion tambien puede realizarse mediante el denominado ensayo de transferencia inversa de linea (RLB), tal como, por ejemplo, se describe en Van den Brule y otros (2002). Para este fin, las sondas de RLB se sintetizan, preferentemente, con un grupo amino en 5’ para su posterior inmovilizacion sobre, por ejemplo, membranas de nylon recubiertas con carboxilo. La ventaja de un formato de RLB es la facilidad del sistema y su velocidad, lo que permite el procesamiento de muestras de alto rendimiento.

La utilizacion de sondas de acido nucleico para la deteccion de fragmentos de ARN o ADN es bien conocida en la tecnica. La mayoria de estos procedimientos comprenden la hibridacion del acido nucleico diana con la sonda, seguida de lavados posteriores a la hibridacion. Normalmente, la especificidad es funcion de los lavados posteriores a la hibridacion, siendo los factores criticos la fuerza ionica y la temperatura de la solution de lavado final. Para los hibridos de acidos nucleicos, la Tm se puede aproximar a partir de la ecuacion de Meinkoth y Wahl (1984): Tm = 81,5°C + 16,6 (log M) + 0,41 (% GC) -0,61 (% forma) -500/L; en la que M es la molaridad de los cationes monovalentes, % GC es el porcentaje de los nucleotidos guanosina y citosina en el acido nucleico, la % forma es el porcentaje de formamida en la solucion de hibridacion y L es la longitud del hibrido en pares de bases. La Tm es la temperatura (a la fuerza ionica y el pH definidos) a la cual el 50% de una secuencia diana complementaria hibrida con una sonda perfectamente apareada. La Tm se reduce en aproximadamente 1°C por cada 1% de apareamiento erroneo; por lo tanto, las condiciones de hibridacion y/o de lavado se pueden ajustar para hibridar con secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con una identidad > 90%, la Tm se puede reducir 10°C. En general, las condiciones rigurosas se seleccionan de modo que sea 5°C menor que el punto de fusion termica (Tm) para la secuencia especifica y su complementaria a una fuerza ionica y pH definidos. Sin embargo, condiciones intensamente rigurosas pueden utilizar una hibridacion y/o lavado a 1, 2, 3 o 4°C menos que el punto de fusion termica (Tm); las condiciones moderadamente rigurosas pueden utilizar una hibridacion y/o lavado a 6, 7, 8, 9 o 10°C menos que el punto de fusion termica (Tm); las condiciones poco rigurosas pueden utilizar una hibridacion y/o lavado a 11, 12, 13, 14, 15 o 20°C menos que el punto de fusion termica (Tm). Utilizando la ecuacion, las composiciones de hibridacion y lavado, y la Tm deseada, los expertos entenderan que las variaciones en la rigurosidad de las soluciones de hibridacion y/o lavado se describen inherentemente. Si el grado deseado de resultados de apareamientos incorrectos en una Tm inferior a 45°C (solucion acosa) o 32°C (solucion de formamida), Es preferente incrementar la concentration de SSC de modo que se pueda utilizar una temperatura superior. Se puede encontrar una extensa guia para la hibridacion de acidos nucleicos en Tijssen, 1993; Ausubel y otros, 1998.

Las sondas de oligonucleotidos se describen en el presente documento para la deteccion de ARN o ADNc de ToTV. Las sondas de deteccion en el presente documento se seleccionan de modo que sean "sustancialmente" complementarias a una molecula de ARN monocatenario o a una de las hebras de los acidos nucleicos de doble cadena generadas por una reaccion de amplificacion. Preferentemente, las sondas son sustancialmente complementarias a las cadenas antisentido inmovilizadas opcionalmente (por ejemplo, marcadas con biotina) de los amplicones generados a partir del ARN o el ADN diana.

Se permite que las sondas de deteccion contengan uno o mas apareamientos erroneos a su secuencia diana. En general, las secuencias que presentan, como minimo, 65%, mas preferentemente, como minimo, 80%, de homologia con las secuencias oligonucleotidicas diana, se consideran adecuadas para su utilizacion en un procedimiento tal como se describe.

Plantas resistentes al ToTV

Tambien se describe un procedimiento para identificar una planta que es resistente a un virus de planta denominado virus del torrado del tomate (ToTV), depositado en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH el 24 de noviembre de 2004, bajo los depositantes con numero de referencia ToTV-E01 (DSM 16999), un virus que comprende, como minimo, una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, tal como se define en las figuras 5 y 6, respectivamente, y secuencias que tienen una homologia de secuencia de nucleotidos, como minimo, del 70% con las mismas, en el que las secuencias homologas son secuencias de nucleotidos de un virus ToTV que codifican una proteina putativa de movimiento y tres proteinas de la capside, o una helicasa, proteasa y ARN polimerasa dependiente de ARN, respectivamente. Hay varias posibilidades de identificar plantas resistentes a ToTV. En una primera serie de ejemplos de dicho

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procedimiento, se pueden utilizar virus activos/infecciosos o clones infecciosos de longitud completa, mientras que en un ejemplo alternativo solo se utilizan medios de deteccion de virus.

Una primera etapa de un procedimiento para identificar una planta resistente a ToTV utilizando virus activo/infeccioso comprende exponer una planta o parte de la planta, tal como un segmento de la hoja o el tallo, a una dosis infecciosa de ToTV, cuyo objetivo es lograr una infeccion. La exposition puede, en muchos casos, implicar el establecimiento de contacto fisico. Una dosis infecciosa puede variar entre las plantas y entre los aislados de ToTV analizados. En teorla, una cantidad de aproximadamente 1 a 10 a una cantidad de aproximadamente 500 - 5.000 particulas viricas de dicho virus o los acidos nucleicos del mismo sera suficiente. La infeccion de esta manera se puede conseguir mediante inoculation mecanica de particulas de virus purificadas o acido nucleico del virus en las plantas sanas.

Como alternativa, la infeccion se puede lograr mediante, por ejemplo:

- el cultivo de un esqueje sano en un rizoma infectado por ToTV, o al contrario;

- la exposicion de una planta sana a los vectores de transmision que contienen el virus; (incluyendo las plantas infectadas, por ejemplo plantas parasitas como Cuscuta spp.);

- la introduction en una planta sana de un vector de expresion que alberga una region de codification del genoma del virus ToTV;

- la utilization de clones agroinfecciosos, tales como cepas de Agrobacterium tumefaciens que contienen un vector de expresion que alberga una region de codificacion del genoma del virus ToTV.

Los procedimientos para la exposicion de una planta o parte de la planta a una dosis infecciosa de ToTV no se limitan a ningun procedimiento en particular.

Tal como se ha indicado, la infeccion puede comprender la inoculacion mecanica del virus en las plantas sanas. Por ejemplo, una portion de una hoja enferma se puede frotar directamente sobre una hoja de una planta que se va a infectar. En un procedimiento alternativo, un inoculo puede prepararse, por ejemplo, moliendo tejido de la planta que contiene el virus, preferentemente hojas jovenes que muestran sintomas, con un mortero y una mano de mortero, o cualquier otro tipo adecuado de homogeneizador en, por ejemplo, un tampon adecuado para la inoculacion (por ejemplo, un tampon fosfato 0,03 M, a pH 7,7). Despues de la molienda, el homogeneizado obtenido (la savia) se filtra, preferentemente, por ejemplo, mediante una estamena. A continuation, la savia se puede inocular, por ejemplo, poniendo en contacto suavemente las hojas con una cantidad de savia. Preferentemente, las hojas se tratan previamente con el fin de danar la epidermis inferior y mejorar la entrada del virus. Esto puede lograrse, por ejemplo, espolvoreando previamente las hojas con polvo de carburo de silicio. Preferentemente se evitan los danos excesivos. Preferentemente, se utiliza un polvo de carburo de silicio que tenga particulas angulares microscopicamente pequenas de carburo de silicio (malla de 400-500). El polvo de carburo de silicio tambien se puede anadir directamente a la savia, en cuyo caso se omite el pretratamiento. La savia puede aplicarse, por ejemplo, con el dedo Indice, una almohadilla de espuma o tela empapada con savia, o incluso con la mano del mortero utilizada para moler, una espatula de vidrio, un cepillo duro o una pistola de pulverization. Despues de la inoculacion, las hojas se lavan, preferentemente, inmediatamente con agua.

Una segunda etapa de un procedimiento para identificar una planta resistente a ToTV comprende la identification de dicha planta como una planta resistente a ToTV cuando, despues de dicha exposicion, i) los sintomas de enfermedad en dicha planta o parte de la planta permanecen ausentes o se retrasa su expresion o, como mlnimo, tienen su gravedad reducida o estan localizados en relacion con una planta de control susceptible y/o sensible, y/o ii) virus ToTV o secuencias genomicas de ToTV no estan presentes en dicha planta o parte de la planta o la presencia del virus ToTV esta, como mlnimo, reducida cuantitativamente en dicha planta con relation a una planta control susceptible. Tal como se utiliza en el presente documento, localizado significa limitado a la hoja inoculada.

La determination del desarrollo de sintomas de enfermedad inducidos por el ToTV en las plantas infectadas se puede realizar por procedimientos cuantitativos, por ejemplo, en los que se observa el tiempo necesario para el desarrollo de sintomas de enfermedad discernibles (por ejemplo, visibles), o por procedimientos cualitativos en los que, despues de transcurrido un perlodo determinado, se inspecciona la planta para detectar expresion de sintomas y se indica la presencia o la gravedad de los sintomas.

Ademas de determinar el desarrollo de sintomas de enfermedad inducidos por ToTV o, como una alternativa a ello, dependiendo del tipo de resistencia a ToTV que se va a detectar, se detecta la presencia del virus en la planta o parte de la planta. Con el fin de detectar la ausencia de virus en las plantas de ensayo, en principio se puede utilizar cualquier procedimiento. Por ejemplo, se puede utilizar un procedimiento en el que se utilizan un anticuerpo especifico de ToTV, un conjunto de cebadores o sondas. Como alternativa, se puede poner en contacto una parte de la planta de ensayo con una planta indicadora susceptible (por ejemplo, N. hesperis '67A') para establecer si el virus esta presente o ausente en la planta de ensayo. El experto en la tecnica comprendera que para dichos procedimientos es importante descontaminar la superficie de la planta de ensayo, a fin de distinguir entre un vector de transmision, una planta de ensayo tolerante y una planta de ensayo resistente, ya que solo tiene que

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establecerse la presencia de virus en las celulas vegetales.

En la realization de la segunda etapa de un procedimiento para identificar una planta resistente al ToTV, se pueden obtener los siguientes resultados. Si, despues de la inoculation con exito (por ejemplo, despues del establecimiento de un contacto planta-virus en condiciones que darlan lugar a una infection en una planta control susceptible y sensible):

i) los sintomas de enfermedad permanecen ausentes; o no se pueden detectar particulas viricas o ARN virico: la planta es resistente;

ii) los sintomas de enfermedad se retrasan o se reduce su gravedad; o se pueden detectar titulos bajos sistemicos de particulas viricas o de ARN virico: la planta es parcialmente resistente;

iii) los sintomas de enfermedad son graves, pero son de caracter local, limitados a la hoja inoculada y no se extienden sistemicamente mas alla del tejido inoculado por via sistemica; o las particulas viricas o el ARN virico solo pueden detectarse a nivel local: la planta es hipersensible;

iv) los sintomas de enfermedad permanecen ausentes; y se pueden detectar particulas viricas o ARN virico: la planta es tolerante;

v) si la planta desarrolla sintomas de enfermedad y tiene titulos altos de virus sistemicos, la planta es susceptible y sensible. Ejemplos de dichas plantas son las plantas de las que se aislo el virus. Estas plantas pueden servir como plantas control adecuadas en los procedimientos de la presente invencion.

Para el fin de producir plantas resistentes, y desde un punto de vista de higiene fitosanitaria, solo los resultados i), ii) y iii) pueden considerarse de interes. Para el fin de obtener plantas adecuadas para la production de cosechas y productos asintomaticos, el resultado iv) tambien pueden ser de particular interes comercial.

En una realizacion alternativa de un procedimiento para identificar una planta resistente a ToTV, solo se utilizan medios de detection de virus. Por ejemplo, una planta resistente a ToTV puede identificarse en el campo mediante la observation o la identification de una planta asintomatica entre plantas sintomaticas y la determination de la ausencia de virus en dicha planta mediante la realizacion de cualquiera de los procedimientos de deteccion de virus. De hecho, esto corresponde a un procedimiento para identificar una planta resistente a ToTV, en el que la etapa a) de exposition de una planta o parte de la planta a una dosis infecciosa de ToTV, se realiza de forma pasiva (por ejemplo, de forma natural). Cuando se realiza un procedimiento de este tipo, es preferente utilizar un procedimiento para detectar la presencia de ToTV en una muestra, en la que la presencia de un virus ToTV o un componente de la misma se lleva a cabo mediante la reaction de dicha muestra con un polinucleotido, o con un anticuerpo segun la presente invention. Preferentemente, un procedimiento de identificacion de una planta resistente a ToTV requiere la utilization del virus o un polinucleotido o un anticuerpo segun la presente invencion.

Tambien se describe un procedimiento para producir una planta resistente a ToTV, o parte de la misma. Una vez que se ha identificado la planta resistente a ToTV, esta planta puede servir como planta donante de material genetico que se debe transferir desde dicha planta donante a una planta receptora con el fin de proporcionar a dicha planta receptora el material genetico. La transferencia de material genetico desde una planta donante a una planta receptora se puede producir por cualquier procedimiento adecuado conocido en la tecnica. El material genetico sera, en la mayoria de los casos, material genomico. No obstante, es importante que se transfieran, como minimo, las partes que confieren resistencia del genoma de la planta donante. En ausencia de procedimientos para determinar que partes del genoma de la planta donante confieren la resistencia a ToTV, la transferencia puede producirse adecuadamente mediante la transferencia de cromosomas completos. Preferentemente, la planta resistente a ToTV sirve como planta parental macho o hembra en un cruce para la produccion de plantas descendientes resistentes, de modo que la planta descendiente recibe el material genomico del donante resistente y actua como planta receptora. Aunque un padre susceptible en los cruces no es en sentido estricto necesariamente una planta receptora, un padre de este tipo tambien se incluira, en el presente documento, el termino planta receptora.

En un procedimiento para producir una planta resistente a ToTV, tambien se puede utilizar fusion de protoplastos para la transferencia del material genomico que confiere resistencia desde una planta donante a una planta receptora, es decir, como una manera de cruzar dichas plantas. La fusion de protoplastos es una union inducida o espontanea, tal como una hibridacion somatica, entre dos o mas protoplastos (celulas cuyas paredes celulares se eliminan mediante tratamiento enzimatico) para producir una celula con uno, dos o varios nucleos. La celula fusionada, que incluso puede obtenerse con las especies de plantas que no pueden cruzarse en la naturaleza, es tejido cultivado en una planta hibrida que muestra la combination deseable de rasgos. Mas especificamente, se puede obtener un primer protoplasto de una planta de tomate u otra linea de planta que muestra resistencia a la infeccion por ToTV. Por ejemplo, se puede utilizar un protoplasto de una linea resistente a ToTV (tomate, berenjena, pimiento, melon, sandia o pepino). Se puede obtener un segundo protoplasto a partir de una segunda linea de planta susceptible, opcionalmente de otra especie o variedad de planta, preferentemente de la misma especie o variedad de planta, que comprende caracteristicas comercialmente deseables, tales como, pero sin limitarse a las

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mismas, resistencia a enfermedades, resistencia a insectos, caracterlsticas valiosas de la fruta, etc. A continuation, los protoplastos se fusionan utilizando procedimientos de fusion de protoplastos tradicionales, que en la tecnica se sabe que producen el cruce.

Como alternativa, se puede utilizar rescate de embriones en la transferencia de material genomico que confiere resistencia desde una planta donante a una planta receptora, es decir, como una manera de cruzar dichas plantas. Se puede utilizar el rescate de embriones como procedimiento para aislar embriones de cruzamientos en los que las plantas no producen semillas viables. En este proceso, el ovario fertilizado o la semilla inmadura de una planta es tejido cultivado para crear nuevas plantas (este procedimiento se describe con detalle en Pierik, 1999).

Un procedimiento para producir una planta resistente a ToTV comprende, por lo tanto, las etapas de identificar una planta donante resistente a ToTV, tal como se ha descrito anteriormente en el presente documento y cruzar dicha planta donante resistente a ToTV con una planta receptora, tal como se ha descrito anteriormente, produciendo de este modo plantas descendientes resistentes.

Un procedimiento para producir una planta resistente a ToTV comprende, ademas, la etapa de seleccionar a partir de las plantas descendientes una planta resistente mediante la realization de un procedimiento para identificar una planta resistente a ToTV, tal como se ha descrito anteriormente.

Preferentemente, dicha planta donante resistente a ToTV es una planta de las familias Solanaceae o Cucurbitaceae, incluso mas preferentemente una planta de tomate, una planta de berenjena, una planta de pimiento, una planta de melon, una planta de sandia o una planta de pepino.

Preferentemente, dicha planta receptora es una planta de las familias Solanaceae o Cucurbitaceae, incluso mas preferentemente una planta de tomate, una planta de berenjena, una planta de pimiento, una planta de melon, una planta de sandia o una planta de pepino. Aun mas preferentemente, dicha planta receptora es una planta de tomate de la especie Solanum lycopersicum, mas preferentemente una planta de S. lycopersicum que posee caracterlsticas comercialmente deseables. La planta receptora puede ser una planta susceptible a ToTV, una planta sensible a ToTV o una planta receptora resistente a ToTV. Tal como se ha explicado anteriormente, la election de la planta se determinara principalmente mediante el hecho de si el rasgo de resistencia es dominante o recesivo. El experto en la tecnica conoce las diversas metodologlas disponibles para resolver estos problemas.

Tal como se ha indicado, un procedimiento para producir una planta resistente a ToTV comprende, preferentemente, la transferencia mediante introgresion de dicha secuencia de acido nucleico que confiere resistencia desde una planta donante resistente a ToTV a una planta receptora mediante el cruzamiento de dichas plantas. Las plantas resistentes desarrolladas de acuerdo a este procedimiento pueden obtener, ventajosamente, la mayoria de sus rasgos de la planta receptora, y obtener resistencia a ToTV de la planta donante.

En un procedimiento, que se conoce como cruzamiento de razas puras, una planta donante que muestra resistencia a ToTV se cruza con una planta receptora que preferentemente muestra caracterlsticas deseables comercialmente, tales como, pero no limitado a las mismas, resistencia a enfermedades, resistencia a insectos, caracterlsticas valiosas de las frutas, etc. La poblacion de plantas resultante (que representa los hibridos Fi) se autopoliniza y se deja que las semillas germinen (semillas F2). A continuacion, las plantas de la F2 cultivadas a partir de semillas de la F2 se criban segun la resistencia a ToTV. La poblacion se puede cribar de muchas maneras diferentes, preferentemente mediante la realizacion de un procedimiento para la inspection visual.

Ademas, se describen procedimientos de prevention de la propagation de la infection por ToTV en plantas de tomate, proporcionando plantas de tomate resistentes, asi como mediante la elimination de las plantas portadoras del virus ToTV. Estas medidas pueden formar parte de una estrategia general para mejorar la fitosanidad en relation con el virus ToTV. Por lo tanto, las plantas tolerantes pueden identificarse y eliminarse con el fin de eliminar dichas fuentes del virus ToTV.

Un procedimiento para producir una planta resistente a ToTV, o parte de la misma, incluye un procedimiento para producir una planta tolerante a ToTV. Una planta tolerante puede proporcionar una cosecha, frutos y semillas valiosos, ya que, aunque la planta puede albergar el virus, no muestra sintomas de la enfermedad. Dicho procedimiento implicara la identification de las plantas tolerantes y la utilization de dichas plantas tolerantes como fuentes o donantes de material genetico deseado. El objetivo no es proporcionar una planta capaz de resistir la entrada o la multiplication del virus en sus celulas, sino proporcionar una planta que no sufra los sintomas.

Por lo tanto, la presente invention se refiere a un procedimiento para identificar una planta que es resistente a un virus de planta denominado virus del torrado del tomate (ToTV), depositado en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH el 24 de noviembre de 2004, bajo los depositantes con numero de referencia ToTV-E01 (DSM 16999), un virus que comprende, como minimo, una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, tal como se define en las figuras 5 y 6, respectivamente, y secuencias que tienen una homologia de secuencia de nucleotidos, como minimo, del 70% con las mismas, en el que las secuencias homologas son secuencias de nucleotidos de un virus ToTV que codifican una

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protelna putativa de movimiento y tres protelnas de la capside, o una helicasa, proteasa y ARN polimerasa dependiente de ARN, respectivamente, comprendiendo las etapas de:

a) exponer una planta o parte de la planta a una dosis de particulas viricas o de acido nucleico virico capaz de

infectar una planta, en la que se logra la infeccion mediante inoculacion mecanica de particulas de virus

purificadas o acido nucleico virico del virus, y

b) identificar dicha planta como una planta que es resistente al virus cuando, despues de dicha exposicion,

- los sintomas de enfermedad en dicha planta o parte de la planta se mantienen ausentes o su expresion se retrasa o, como minimo, se reduce la gravedad o estan localizados en relacion con una planta control susceptible, y/o

- dichas secuencias de virus o genomicas de los mismos no estan presentes en dicha planta o parte de la planta o la presencia de dicho virus, como minimo, se reduce cuantitativamente respecto a una planta control susceptible. La determinacion del desarrollo de sintomas de enfermedad inducidos por el ToTV en las plantas infectadas se puede realizar por procedimientos cuantitativos, por ejemplo, en los que se observa el tiempo necesario para el desarrollo de sintomas de enfermedad discernibles (por ejemplo, visibles), o por procedimientos cualitativos en los que, despues de transcurrido un periodo determinado, se inspecciona la planta para detectar la ausencia de expresion de sintomas o se indica la reduction de la gravedad de los sintomas.

La presencia de ToTV en dicha planta o parte de la planta se determina, preferentemente, en la etapa b) mediante la realization de un procedimiento que comprende determinar en dicha planta o parte de la planta la presencia de un virus ToTV o componente del mismo mediante la reaccion de dicha planta o parte de la planta con un polinucleotido, o con un anticuerpo segun la presente invention.

Kits de diagnostico

Los procedimientos y medios dados a conocer en el presente documento son particularmente utiles en un kit de diagnostico para el diagnostico de una infeccion por el virus ToTV mediante diagnostico virologico. Dichos kits o ensayos pueden comprender, por ejemplo, un virus, un acido nucleico, una molecula proteinacea o fragmento de la misma y/o un anticuerpo segun la presente invencion.

La presente invencion tambien da a conocer un kit de diagnostico para realizar un procedimiento de la presente invencion, comprendiendo el kit, como minimo, un componente seleccionado del grupo que consiste en un virus de plantas denominado virus del torrado del tomate (ToTV), depositado en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH el 24 de noviembre de 2004 bajo los depositantes numero de referencia ToTV-E01 (DSM 16999), un virus que comprende, como minimo, una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, tal como se define en las figuras 5 y 6, respectivamente, y secuencias que tienen una homologia de secuencia de nucleotidos, como minimo, del 70% con las mismas, en el que las secuencias homologas son secuencias de nucleotidos de un virus ToTV que codifican una proteina putativa de movimiento y tres proteinas de la capside, o una helicasa, proteasa y ARN polimerasa dependiente de ARN, respectivamente, un polipeptido, un antigeno, y un anticuerpo segun la presente invencion. Dicho kit comprende, preferentemente, un medio para detectar dicho virus ToTV, acido nucleico especifico del virus ToTV, molecula proteinacea o fragmento de la misma y/o un anticuerpo, comprendiendo dicho medio, por ejemplo, un grupo excitable, tal como un fluoroforo o un sistema de detection enzimatica utilizado en la tecnica (ejemplos del formato de kit de diagnostico adecuados comprenden IF, ELISA, ensayo de neutralization, ensayo de RT-PCR, ensayos de hibridacion). Entre los ensayos de deteccion adecuados se incluyen ensayos directos e indirectos, ensayos de tipo sandwich, ensayos de fase solida, tales como los que utilizan placas o perlas entre otros, y ensayos en fase liquida. Entre los ensayos adecuados se incluyen los que utilizan anticuerpos primarios y secundarios, y los que utilizan reactivos de union al anticuerpo, tales como la proteina A. Por otra parte, se pueden utilizar diversos procedimientos de deteccion, incluyendo procedimientos colorimetricos, fluorescentes, fosforescentes, quimioluminiscentes, luminiscentes y radiactivos.

Para determinar si un componente de virus todavia no identificado, tal como acido nucleico, molecula proteinacea o fragmento de la misma, puede identificarse como especifico del virus ToTV, es suficiente analizar la secuencia de acido nucleico o de aminoacidos de dicho componente, por ejemplo, para un tramo de dicho acido nucleico o aminoacidos, preferentemente, como minimo, de 10, mas preferentemente, como minimo, de 25, mas preferentemente, como minimo, de 40 nucleotidos o aminoacidos (respectivamente), mediante la comparacion de la homologia de secuencia con las secuencias del virus ToTV proporcionadas y con las secuencias viricas que no son del virus ToTV conocidas (preferentemente se utiliza el pariente filogenetico mas cercano de ToTV) utilizando, por ejemplo, analisis filogeneticos, tal como se dan a conocer en el presente documento. Dependiendo del grado de relacion con dichas secuencias viricas de ToTV o no ToTV, pueden identificarse el componente o analogo sintetico.

Un kit para detectar un virus ToTV puede incluir, dependiendo del formato de ensayo, uno o mas anticuerpos especificos de una proteina, preferentemente especificos, como minimo, de una proteina de la capside de ToTV, y, preferentemente, tambien incluye una proteina ToTV sustancialmente purificada o anticuerpo anti idiotipo para

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utilizar como control positivo.

Agentes antivirales

Tambien se describen procedimientos para obtener un agente antiviral util en el tratamiento de la infeccion por ToTV en plantas, que comprenden el establecimiento de un cultivo celular o de la planta experimental que comprende un virus, tal como se ha descrito en el presente documento anteriormente, el tratamiento de dicho cultivo o planta con un agente antiviral candidato, y la determinacion del efecto de dicho agente sobre dicho virus o su infeccion de dicho cultivo o planta. Un ejemplo de dicho agente antiviral comprende un anticuerpo neutralizante frente a ToTV o un componente funcional del mismo, segun se da a conocer en el presente documento, pero tambien se pueden obtener agentes antivirales de otra naturaleza.

Existen diferentes agentes antivirales para su utilizacion en las plantas, tales como productos quimicos, bacterias, hongos, insectos y virus. La mayorla de ellos estan relacionados con la resistencia sistemica adquirida (SAR). En el presente documento se contempla la utilizacion del genoma de ToTV o una parte del mismo como inductor de la resistencia sistemica adquirida en plantas. La resistencia sistemica adquirida puede estar dirigida al ToTV o a otras enfermedades. En este aspecto, el ToTV, su genoma, o las partes de los mismos que confieren resistencia se pueden utilizar como agente antiviral.

Tambien se describe la utilizacion de un agente antiviral para la preparacion de una composicion de tratamiento, en particular para el tratamiento de la infeccion por ToTV en plantas, y una composicion farmaceutica que comprende un agente antiviral, util en un procedimiento para el tratamiento o prevention de una infeccion por el virus ToTV, comprendiendo dicho procedimiento proporcionar una composicion de tratamiento a una planta individual.

Se describe adicionalmente un modelo de planta utilizable para analizar procedimientos y/o composiciones de tratamiento. Se ha observado que varias especies de Nicotiana pueden infectarse con el virus ToTV, mostrando de ese modo sintomas de enfermedad diferentes a los encontrados en las plantas de tomate que sufren el virus ToTV. Someter a las plantas de Nicotiana a un tratamiento antiviral, antes o durante la infeccion con el virus puede tener valor predictivo para la aplicacion de dicho agente antiviral en las plantas de tomate.

La presente invention tambien se refiere a la utilizacion de un virus de plantas denominado virus del torrado del tomate (ToTV), depositado en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH el 24 de noviembre de 2004, bajo los depositantes con numero de referencia ToTV-E01 (DSM 16999), un virus que comprende, como mlnimo, una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, tal como se define en las figuras 5 y 6, respectivamente, y secuencias que tienen una homologla de secuencia de nucleotidos, como mlnimo, del 70% con las mismas, en el que las secuencias homologas son secuencias de nucleotidos de un virus ToTV que codifican una protelna putativa de movimiento y tres protelnas de la capside, o una helicasa, proteasa y ARN polimerasa dependiente de ARN, respectivamente, como vector de expresion para, por ejemplo, su utilizacion en el silenciamiento de genes inducido por virus (VIGS). El VIGS es una tecnologla que explota un mecanismo de defensa antiviral mediado por ARN en las plantas. En las plantas infectadas con virus sin modificar, el mecanismo esta dirigido especificamente contra el genoma virico. Mediante la utilizacion de vectores de expresion viricos portadores de insertos derivados de genes del huesped, el mecanismo tambien se puede utilizar para apuntar contra los ARN de las plantas correspondientes. El VIGS se ha utilizado ampliamente en las plantas para el analisis de la funcion genica y se ha adaptado para la genomica funcional de alto rendimiento. Hasta ahora, la mayorla de las aplicaciones de VIGS se han realizado en Nicotiana benthamiana. Sin embargo, se describe la utilizacion de ToTV como nuevos sistemas de vectores de expresion que permite el analisis de la funcion genica en otras plantas, tales como tomates y otras especies de la familia Solanaceae, tal como el pimiento y la patata, y especies de la familia Cucurbataceae.

La presente invencion se explica adicionalmente en el ejemplo, sin limitarla al mismo.

EJEMPLOS

Ejemplo 1 Aislamiento y caracterizacion de ToTV de plantas de tomate Procedimientos

Introduccion

Se recibieron muestras de plantas de tomate de Espana para investigation en diagnostico. Los sintomas en las plantas de tomate consistieron en manchas necroticas y clorosis en las hojas y anillos marrones en los frutos. Los ensayos serologicos (ELISA) senalaron la presencia del virus del mosaico del pepino (PepMV), pero, teniendo en cuenta los sintomas, era probable que estuviera presente otro agente todavia sin definir.

En los estudios de microscopia electronica de tejido foliar infectado se encontraron particulas viricas esfericas.

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Posteriormente se llevo a cabo un ensayo de infeccion y se encontro que multiples accesos de tomate eran susceptibles al ToTV, varios de los cuales reaccionaron con claros sintomas (necrosis de las hojas, comenzando en la base de los foliolos individuales (vease la figura 1).

Transmision y propagation del virus

El ToTV se aislo, tal como se describe a continuacion de una planta enferma obtenida en Espana. El ToTV era mecanicamente transmisible a varias especies de Nicotiana. Se demostro que un tampon de inoculacion estandar (por ejemplo, un tampon fosfato 0,03 M a pH 7,7) era adecuado. A lo largo de este ejemplo, se inoculo el ToTV mecanicamente y se propago en N. glutinosa o N. benthamiana. La purificacion del virus se llevo a cabo aproximadamente 14 dias despues de la inoculacion.

Purification del virus

Se hicieron varios intentos para purificar el ToTV segun protocolos estandar para, por ejemplo, nepovirus o luteovirus (con la ayuda de disolventes organicos). Estos protocolos dieron como resultado siempre perdida de infectividad del virus. Ademas, el ToTV tendio a agregarse cuando se utilizaron temperaturas bajas en las etapas de centrifugacion (por debajo de 5°C).

En ultima instancia, un procedimiento de purificacion muy suave dio lugar a preparaciones de virus limpias sobre las que pudieron realizar experimentos adicionales.

El siguiente procedimiento se utilizo para purificar el ToTV (todas las etapas de centrifugacion se realizaron a 6°C). Las hojas infectadas de N. glutinosa o N. benthamiana se homogeneizaron en 5 partes de Tris-HCl 0,1 M (pH 8) mas Na2SO3 20 mM, Na-DIECA 10 mM en Na-EDTA 5 mM (tampon de homogeneizacion) y el homogeneizado se centrifugo durante 30 minutos a 49.000 x g. El sobrenadante se coloco en un cojin de sacarosa al 20% y se centrifugo durante 1,5 horas a 70.000 x g. El sedimento se resuspendio en 2 ml de TRIS-HCl, a pH 8, y la suspension se coloco en un gradiente de sacarosa (sacarosa al 10 - 40% en tampon de homogeneizacion) y se centrifugo durante 2 horas a 110.000 x g. Dado que no se vio una banda de virus, el gradiente se dividio en alicuotas en fracciones discretas y la presencia de virus en cada fraccion se determino por inoculacion de una parte de dicha fraccion en hojas de N. hesperis '67A', tal como se describe en el presente documento y la observacion de la aparicion de infeccion. La fraccion que contenia el virus se coloco sobre un gradiente de sulfato de cesio al 10-40% (en Tris-HCl, a pH 8) y se centrifugo durante 16 horas a 125.000 x g. Las bandas de virus se recogieron y se concentraron por centrifugacion o se dializaron frente a TRIS-HCl 0,1 M a pH 8.

La infectividad del ToTV despues de cada etapa de purificacion se comprobo mediante la inoculacion en N. hesperis '67A' (las fracciones de gradiente de sulfato de cesio se dializaron frente a TRIS-HCl, a pH 8, antes de la inoculacion).

Microscopia de electrones

Las suspensiones de virus se "montaron" en una rejilla recubierta con Formvar®, tambien conocido como polivinilformal, tenida con acetato de uranilo al 2% y se examinaron en un microscopio electronico Philips CM12.

Analisis PAGE

Las proteinas viricas se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante al 12% (SDS- PAGE, Laemmli, 1970) y se tineron con plata.

Aislamiento y evaluation de acidos nucleicos

El virus purificado se concentro mediante centrifugacion (2 horas a 115.000 g). Los sedimentos se sometieron a extraccion de ARN segun el procedimiento Qiagen RNeasy MinElute Cleanup (Qiagen, Hilden, Alemania). La concentration del ARN se determino en un espectrofotometro UV (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, EE.UU).

La integridad del ARN se verifico mediante electroforesis en gel de agarosa. Despues de la electroforesis durante 2 horas a 60 V, el ARN se tino utilizando azul la ortotoluidina.

Sintesis y donation de ADNc

El ADNc se sintetizo utilizando el sistema de Invitrogen Superscript Choice (Invitrogen, Breda, Paises Bajos) para la sintesis de ADNc segun las instrucciones del fabricante. La primera cadena del ADNc se cebo utilizando oligo-d (T) o cebadores hexameros aleatorios. Despues de la sintesis de la segunda cadena, los adaptadores de EcoRI se ligaron para facilitar la donation. Tras la fosforilacion del ADNc adaptado a EcoRI, se retiraron los enlazadores no ligados mediante cromatografia en columna. El ADNc resultante se ligo en el vector de expresion en pBluescript II EcoRI previamente digerido (Stratagene, La Jolla, EE.UU.) y la mezcla de ligacion se transformo en celulas

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competentes Top10 (Invitrogen).

El extremo terminal 5' de la secuencia del ToTV se determino utilizando el sistema 5'RACE para la amplificacion rapida de los extremos de ADNc (Life Technologies) utilizando dCTP segun las instrucciones del fabricante.

Analisis del ADNc

Tras la transformacion se analizaron los clones recombinantes para determinar la presencia de insertos mediante PCR utilizando los cebadores especificos tanto de T3 como de T7. El tamano de los productos de PCR se analizo en un gel de agarosa al 1%. Los clones que contenlan insertos de aproximadamente 1.500 nucleotidos se utilizaron para su posterior analisis de la secuencia. Los datos de secuencia resultantes se analizaron utilizando el paquete de programas DNASTAR.

Determinacidn de las secuencias de aminoacidos de las tres proteinas de la capside de ToTV

Las particulas del ToTV purificadas se cargaron en un gel de desnaturalizacion PAGE y se separaron las proteinas de la capside. Las bandas de las proteinas de la capside separadas se aislaron del gel, se trataron con tripsina y las fracciones digeridas se analizaron utilizando un espectrometro de masas en tandem (MSMS) utilizando esencialmente el procedimiento descrito por Kinter y Sherman, 2000. Esto dio lugar a secuencias de aminoacidos (AA) de peptidos pequenos, cada uno de los cuales mostro homologia con la secuencia de aminoacidos predicha de la secuencia de nucleotidos del ARN2 del ToTV. La comparacion con otros datos de la secuencia del virus se realizo con el paquete de programas PHYLIP.

Resultados

Transmision y propagacion del virus

Para la propagacion del ToTV se pudieron utilizar N. glutinosa y N. benthamina. Las especies de tabaco N. hesperis '67A' y N. occidental's 'P1' son muy sensibles a ToTV y mostraron sintomas despues de 3-4 dias. Estas especies de tabaco se hicieron muy necroticas en poco tiempo y, por lo tanto, se consideraron mas adecuadas como plantas indicadoras que como huesped de propagacion. N. glutinosa y N. benthamiana reaccionan con lesiones locales cloroticas y una clorosis sistemica y deformacion leve de las hojas.

Purification del virus

La purificacion de los viriones de tejido infectado de la hoja resulto ser bastante dificil. El ToTV no puede aguantar los disolventes organicos y tiende a agregarse cuando se centrifuga a temperaturas bajas. El protocolo de purificacion utilizado (vease 1.2.) dio como resultado dos bandas visibles que contienen el virus en el gradiente de sulfato de cesio. Las bandas aparecieron en la parte inferior del gradiente, lo que indica una densidad de flotation en Cs2SO4 bastante alta, igual o mayor que 1,4 g/cm2.

La infectividad del ToTV se ve afectada por el sulfato de cesio, pero no se pierde completamente cuando la concentration de virus en el material de partida fue alta. Las fracciones del gradiente de sulfato de cesio que contenian ambas bandas del virus eran infecciosas. No se determino la infectividad de las bandas individuales.

Microscopia de electrones

Las dos bandas se examinaron mediante microscopia electronica y ambas contenian particulas viricas de aproximadamente 28 nm de diametro (figura 2).

Analisis PAGE

La electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) de las fracciones de virus purificadas, seguida de tincion con plata del gel mostro tres proteinas de la capside (CP) de aproximadamente 23, 26 y 35 kDa (vease la figura 3, lo que indica fracciones superior (TAgV-T) e inferior (TAgV-B) del virus purificado).

Aislamiento de acidos nucleicos y analisis del ADNc

El aislamiento del ARN de las dos bandas de virus juntas revelo dos ARN: de aproximadamente 5,5 kb y 8 kb (vease la figura 4). El aislamiento del ARN de la banda superior dio como resultado solo un fragmento de ARN de 5,5 kb.

El ARN de 5,5 kb de la banda superior se utilizo como molde para la sintesis y donation del ADNc. Las reacciones de secuencia se realizaron utilizando cebadores de la secuencia directos e inversos (T3/T7 o M13F/M13R) en diferentes clones. La amplificacion rapida en 5’ de los extremos del ADNc (RACE) se realizo para determinar el extremo 5' exacto del ARN. El analisis de los datos de secuencia resultantes, utilizando el paquete de software Lasergene® (DNASTAR, Inc., Madison, WI, EE.UU.), dio como resultado la secuencia completa del ARN2 del virus

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(SEQ ID NO: 1; vease la figura 5). El tamano del ARN es 5.389 nucleotidos, excluyendo la cola de poliA. En el ARN se encuentran dos marcos de lectura abierta (ORF). El ORF1 se localiza desde el nucleotido 182 al 742, tiene 561 nucleotidos de longitud y codifica una protelna de 187 aminoacidos. No se encontraron homologlas para esta secuencia en las bases de datos del NCBI a nivel de protelnas y de nucleotidos.

El ORF2 se extiende desde el nucleotido 702 al 4298, tiene 3597 nucleotidos de longitud y codifica una protelna de 1.199 aminoacidos. Despues de una busqueda BLAST en la base de datos del NCBI, se encontraron homologlas bajas con varias poliprotelnas viricas. Para las homologlas encontradas, los numeros de acceso de la base de datos del NCBI se dan a conocer junto con el nombre del virus y el tipo de protelna. Tanto las secuencias de acidos nucleicos como las secuencias de aminoacidos derivadas en los tres marcos de lectura se utilizaron en un analisis BLAST. Se utilizo MAPDRAW del paquete de software Lasergene® para identificar los ORF.

Mapas de los ORF de ambos ARN:

ARN1

El ARN1 contiene un ORF (ORF1) con motivos tipicos de helicasa, ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp). Ademas, se observo un nivel bajo de homologla de la secuencia de aminoacidos (aa) con un cofactor de proteasa (Pro-Co) del virus del mosaico suave del pachuli (PatMMV) (NP647592,1), para las posiciones de aminoacidos 106338, con una identidad de 22%.

Los motivos tipicos de la helicasa A (GKS), B (D), C (N) se identificaron en las posiciones de aa 398 - 400, 444 y 495 del polipeptido putativo.

Para la region de la helicasa se encontraron identidades mas cercanas con el virus esferico del tungro del arroz (RTSV; 42% de identidad en solapamiento de 140 aa), virus del enanismo clorotico del malz (MCDV; 43% de identidad en solapamiento de 137 aa), virus del moteado de la fresa (SMoV; 42% de identidad en solapamiento de 135 aa) y el virus de la mancha amarilla de la chirivia (PYFV; 42% en el solapamiento 138 aa). En la region putativa de VPG no se encontro ninguna similitud de secuencia con otros virus.

La mayor similitud de la proteasa se encuentra para los aa 1000 - 1100, el 25% de identidad se encuentra con el virus de la patata V (PW; NIa proteasa en solapamiento de 86 aa).

La region RdRp entre los motivos I (KDE) a VII (FLSR) se encontro entre los aa 1303 - 1554 (Koonin 1991).

Las identidades mas cercanas de la secuencia de poliprotelna se encontraron con: virus esferico del tungro del arroz (RTSV) con una identidad del 29% en un solapamiento de 751 aa, virus del enanismo clorotico del malz (MCDV) con una identidad del 28% en un solapamiento de 742 aa, virus de la mancha amarilla de la chirivia (PYFV) con una identidad del 33% en 501 aa, virus esferico latente de la manzana (ALSV) con una identidad del 32% en 472 aa, virus del moteado de la fresa (SMoV) con una identidad del 30% en 680 aa y virus de la hoja aspera del cerezo (CRLV) con una identidad del 33% en 465 aa.

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Tabla 2. Niveles generales de homologla (en %) entre los motivos de RdRp en el ORF1 en el ARN1 del ToTV

con motivos de RdRp de otros virus de plantas.

: NIMV PYFV RTSV SDV SMoV ToTV ALSV CRLV MCDV

NIMV: 100 32,7 33,9 88,6 49,4 33,1 39,6 39,6 35,1

PYFV: 100 43,7 33,2 32,0 35,2 36,4 36,0 42,9

RTSV: 100 34,3 32,7 35,1 37,5 35,1 69,4

SDV: 100 50,2 33,1 38,4 38,4 36,7

SMoV: 100 35,7 40,6 38,5 38,5

ToTV: 100 38,1 38,1 33,7

ALSV: 100 79,5 35,5

CRLV: 100 35,1

MCDV: 100

NIMV= virus del moteado infeccioso de la naranja navel (Sadwa);

PYFV= virus de la mancha amarilla de la chirMa (Sequivirus);

RTSV= virus esferico del tungro del arroz (Waikavirus);

SDV= virus del enanismo Satsumae (Sadwavirus);

SMoV= virus del moteado de la fresa (Sadwavirus);

ToTV virus del torrado del tomate (genero propuesto);

ALSV= virus esferico latente de la manzana (Cheravirus);

CRLV= virus de la hoja aspera del cerezo (Cheravirus);

MCDV= virus del enanismo clorotico del ma'iz (Waikavirus)

Tabla 3. Niveles generales de homologla (en %) entre los motivos de helicasa en el ORF1 en el ARN1 del ToTV

con motivos de helicasa de otros virus de plantas.

: SDV SMoV ToTV ALSV CRLV MCDV PYFV RTSV

SDV: 100 42,5 37,2 31,9 33,6 39,8 39,8 38,1

SMoV: 100 42,5 31,0 31,9 32,7 33,6 32,7

ToTV: 100 36,0 34,2 46,5 40,4 44,7

ALSV: 100 86,7 34,5 31,0 30,1

CRLV: 100 34,5 30,1 31,0

MCDV: 100 39,8 69,0

PYFV: 100 42,5

RTSV: 100

PYFV= virus de la mancha amarilla de la chirMa (Sequivirus); RTSV= virus esferico del tungro del arroz (Waikavirus);

SDV= virus del enanismo Satsumae (Sadwavirus);

SMoV= virus del moteado de la fresa (Sadwavirus);

ToTV virus del torrado del tomate (genero propuesto);

ALSV= virus esferico latente de la manzana (Cheravirus); CRLV= virus de la hoja aspera del cerezo (Cheravirus); MCDV= virus del enanismo clorotico del ma'iz (Waikavirus)

ARN2:

El ARN2 contiene dos potenciales ORF (figura 7). El ORF1 codifica una protelna predicha de 187 aa con un peso molecular de 20 kDa. El analisis de la secuencia no revelo homologlas con ninguna protelna de las bases de datos EMBL. No se sabe si este ORF codifica una protelna real.

El segundo ORF que se superpone parcialmente con el ORF1 comienza con tres codones de iniciacion ATG en el marco. Codifica una proteina putativa de 1.198 aa con un peso molecular predicho de 134 kDa. La identification de proteinas mediante espectrometria de masas de las proteinas de la cubierta aisladas produce claramente un mapa de los tres cistrones de proteinas de cubierta en el extremo C del ORF2 del ARN2.

La region N-terminal de la poliproteina del ORF2 del ARN2, es muy probable que codifique la proteina putativa de movimiento (MP), ya que se encontro un motivo LRVPML altamente similar a la secuencia consenso de las proteinas de movimiento propuesta LxxPxL (Mushegian, 1994) en la position aa 262-267. No se encontraron otras homologlas de secuencia en el extremo N del ORF2 del ARN2.

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El ORF2 codifica supuestamente cuatro protelnas que se escinden a partir del precursor de la poliprotelna mediante escision proteolltica. Sin embargo, no se pudo identificar ninguna homologla aparente con sitios de escision de la poliprotelna conocidos. Las posiciones exactas de estos sitios de escision todavla estan pendientes de determinar.

Para la secuencia de la poliprotelna CP1, los presentes inventores solo encontraron alguna homologla con parechovirus humanos (HPeV) con un 21% de identidad en 103 aa.

Las identidades mas cercanas de la secuencia de la poliprotelna CP2 se encontraron con: virus de Rhopalosiphum padi (RhPV) con una identidad del 25% en 168 aa, virus de la encefalomielitis aviar (AEV) con una identidad del 33% en 74 aa, virus celular de la reina negra (BQCV) con una identidad del 43% en 37 aa y virus de Solenopsis invicta (SINV-1) con una identidad del 30% en 51 aa. Con la secuencia de la poliprotelna CP3 no se encontraron homologlas.

Regiones no traducidas (UTR)

Las 3'UTR del ARN1 y el ARN2 tienen 1210 nt y 1092 nt respectivamente. Hay una identidad del 98% en los ultimos 988 nucleotidos de ambos ARN. Para confirmar que las regiones 3’ de las UTR de ambos ARN son identicas, se realizaron RT-PCR en el ARN virico total, con un cebador inverso derivado de la region 3'-UTR identica y dos cebadores directos especificos de ARN. Los productos resultantes de la PCR se secuenciaron.

A partir de estos resultados, se concluyo lo siguiente: el virus aislado de plantas de tomate y denominado provisionalmente virus del torrado del tomate (ToTV) tiene particulas esfericas (icosaedricas) de aproximadamente 28 nm de diametro. Tras la purification, el virus muestra, como mlnimo, dos bandas en un gradiente de sulfato de cesio. Ambas bandas combinadas son infecciosas cuando se inoculan en plantas de tabaco. Las particulas viricas parecen estar compuestas, como minimo, por tres proteinas de la capside de aproximadamente 23, 26 y 35 kDa.

La fraction superior del gradiente de sulfato de cesio del virus contiene una molecula de ARN de aproximadamente 5,5 kb (ARN 2; SEQ ID NO: 1) y la fraccion inferior una molecula de ARN de aproximadamente 8 kb (ARN 1; SEQ ID NO: 2).

La sintesis y donation del ADNc, utilizando el ARN de 5,5 kb a partir de la fraccion superior virica, y el posterior analisis de la information de la secuencia dieron lugar a la recopilacion de varios contigos en la SEQ iD NO: 1. Dos contigos contenian claramente una cola de poli-A que sugiere que el ARN virico tiene una cola de poli-A. El analisis BLAST de las secuencias de nucleotidos y de aminoacidos derivadas no revelo ninguna homologla significativa con ningun virus conocido a partir de la base de datos EMBL.

La informacion anterior indica que el ToTV es un virus nuevo y hasta ahora no descrito. La informacion obtenida hasta el momento aun no permite agrupar el virus en una familia o genero de virus en particular.

Para los fines de detection e identification de virus se han disenado dos conjuntos de cebadores para RT-PCR (tabla 4) sobre la base de la secuencia de SEQ ID NO: 1.

Tabla 4. Cebadores para RT-PCR para la deteccion del ToTV.

Conjunto de cebadores A:: Longitud/temp. Secuencia SEQ ID No.

Cebador directo: 17 unidades 5 '-GAGAGCC G G CATT CACA-3' SEQ ID NO:3

Cebador inverso: 17 unidades 5'-GCACAGCTT GGCGACAC-3' SEQ ID NO:4

Longitud del producto: 493 pb

Temp. de hibridacion optima: 54,8°C

Conjunto de cebadores B:

Cebador directo: 24 unidades 5'-CCCAT CAT CACCCT CCT CTT CGTA- 3' SEQ ID NO:5

Cebador inverso: 22 unidades 5'-TT CCAGT AAT GAT CCAACCAAT-3' SEQ ID NO:6

Longitud del producto: 585 pb

Temp. de hibridacion optima: 54,9°C

Un protocolo de RT-PCR adecuado comprenderia lo siguiente. El ARN total se aisla y se purifica a partir de aproximadamente 100 pg de material de hoja infectada utilizando un kit de purificacion de ARN, tal como por

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ejemplo Qiagen RNA-Easy. De este ARN total, se utiliza una cantidad de aproximadamente 1 pg en una mezcla de reaccion de 50 pl de la reaccion Superscript One-Step RT-PCR (Invitrogen), en la que la mezcla de reaccion comprende, ademas, una mezcla de reaccion de 25 pl 2x, 1 pl (100 ng) de los cebadores superior e inferior, 1 gl de la mezcla RT/Taq y 22 pl de agua Milli-Q. Con el fin de realizar la transcripcion inversa del ARN en ADNc y amplificar este ADNc se puede utilizar el siguiente programa de RT-PCR: Etapa 1: 30 minutos a 50°C (reaccion de transcripcion inversa); etapa 2: 3 minutos a 94°C (activacion de la Taq Polimerasa); etapa 3: 30 segundos a 94°C; etapa 4: 30 segundos a 55°C; etapa 5: 1 minuto a 72°C; etapa 6: repeticion de las etapas (3 a 5) 40x; etapa 7: 10 minutos a 72°C; etapa 8: 10°C el tiempo que sea necesario. Los productos de PCR pueden analizarse en un gel de agarosa al 1% en tampon TAE o TBE.

2.6. Determination de las secuencias de aminoacidos de las tres protelnas de la capside de ToTV

Los fragmentos de la protelna de la cubierta mas grande (CP1: aproximadamente 35 kDa) pudieron alinearse con partes de una zona en el ORF2 del ARN2 (aa 487 - 729). Los fragmentos de la banda de protelna de la cubierta intermedia (CP2: aprox. 26 kDa) pudieron alinearse con una zona en el ORF2 del ARN2 entre los aa 730 y 983.

Los fragmentos de la protelna de la cubierta mas pequena (CP3: aprox. 23 kDa) pudieron alinearse con el extremo C del ORF2 del ARN2 (aa 984 - 1195). A partir de estos resultados se puede concluir que las secuencias de codificacion de las tres protelnas de la capside se encuentran en el ORF2 del ARN2 (5,5 kb) del ToTV, y, por lo tanto, que las moleculas de ARN virico aisladas son parte de las particulas del virus ToTV.

Ejemplo 2. Aislamiento y caracterizacion del agente causal de la marchitez

En 2003, se encontraron plantas de tomate cultivadas en Centroamerica (Mexico y Guatemala) con sintomas similares a los sintomas del ToTV. Se sospecho que el agente causal era virico. La enfermedad se conoce localmente con los nombres "Chocolate", "Marchitez (virus)" o "enfermedad de las manchas chocolate". Las plantas susceptibles que crecen en el campo pasan a estar muy infectadas a partir de 2003 en adelante.

El objetivo de la presente investigation fue comparar la secuencia del virus hasta ahora desconocido que causa la "enfermedad de las manchas chocolate" con la secuencia del ToTV, tal como se aislo en el ejemplo 1.

Procedimientos

Se aislo el ARN de aproximadamente 100 pg de material de hoja infectada por la “enfermedad de las manchas chocolate" utilizando el sistema de aislamiento de ARN total (Promega SV 96). Se utilizaron dos pl del ARN total en una mezcla de reaccion de 50 pl de la reaccion Superscript One-Step RT-PCR (Invitrogen), en la que la mezcla de reaccion comprende, ademas, una mezcla de reaccion de 25 pl 2x, 1 pl (100 ng) del cebador directo y el cebador inverso, 1 gl de la mezcla RT/Taq y 22 pl de agua Milli-Q. Con el fin de realizar la transcripcion inversa del ARN en ADNc y amplificar este ADNc se utilizo el siguiente programa de RT-PCR: etapa 1: 30 minutos a 50°C (reaccion de transcripcion inversa); etapa 2: 3 minutos a 94°C (activacion de la Taq Polimerasa); etapa 3: 30 segundos a 94°C; etapa 4: 30 segundos a 55°C; etapa 5: 1 minuto a 72°C; etapa 6: repeticion de las etapas (3 a 5) 40x; etapa 7: 10 minutos a 72°C; etapa 8: 10°C el tiempo que sea necesario. Los productos de PCR se analizaron en un gel de agarosa al 1% en tampon TAE o TBE.

En la RT-PCR se utilizaron diferentes conjuntos de cebadores, que se sabia que hibridaban en lugares diferentes con el ARN1 o el ARN2 del genoma del ToTv.

Tabla 5. Cebadores para RT-PCR basados en la secuencia de ARN-2 del ToTV utilizada para la caracterizacion del virus causante de la enfermedad de las manchas chocolate, tal como se utiliza en el ejemplo 2 y tal como se indica ____________________________en la figura 7____________________________

Conjunto de cebadores P1048/1049:: Secuencia SEQ ID No.

cebador directo: 5'-CAAGCCATCACGGAACCTAC-3' SEQ ID NO:7

cebador inverso: 5'-AGCATCTTCTTCCTCCGCT-3' SEQ ID NO:8

longitud del producto: Desde la base 36 - 544= 508 bases

Conjunto de cebadores P1056/1057:

cebador directo: 5'-TGCTGAGGTGCTATCACTGG-3' SEQ ID NO:9

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cebador inverso: 5'-CACACTTTCCACGATTTCCA-3' SEQ ID NO:10

longitud del producto: Desde la base 2422 - 2955 = 523 bases

Conjunto de cebadores P1060/1061:

cebador directo: 5 '-AAAG GAAAGAAG CAGCCACA-3' SEQ ID NO:11

cebador inverso: 5'-GGAAAT CTTGGT CAAGCCAG-3' SEQ ID NO: 12

longitud del producto: Desde la base 3599 - 4170 = 571 bases

Conjunto de cebadores P1056/1065:

cebador directo: 5'-GCAAT GCCAGT GGTTCAGAG-3' SEQ ID NO:13

cebador inverso: 5'-GGT CAAAT GGATACTCGGGA-3' SEQ ID NO: 14

longitud del producto: Desde la base 4820 - 5327 = 507 bases

Resultados

Los conjuntos de cebadores utilizados estimularon la amplificacion de parte de la secuencia del ToTV, tal como se esperaba, pero la utilizacion de cuatro conjuntos de cebadores diferentes basados en la secuencia del ARN2 (P1048/1049, P1056/1057, P1060/1061 y P1064/1065) en la RT-PCR dio como resultado tambien la amplificacion de parte del genoma de la "enfermedad de las manchas chocolate". El sitio de hibridacion de estos conjuntos de cebadores se ilustra en la figura 1. Se secuencio el producto de la RT-PCR de los cuatro conjuntos de cebadores que amplifican fragmentos de la "enfermedad de las manchas chocolate" y mostro una identidad del 100% con las partes correspondientes de la secuencia del genoma virico del virus, tal como se describe en el ejemplo 1.

LEYENDAS DE LAS FIGURAS

La figura 1 muestra una fotografia de los sintomas de la enfermedad del ToTV sobre las hojas de una planta de tomate.

La figura 2 muestra una micrografia electronica de particulas de ToTV purificadas. Las particulas tienen un diametro de 28 nm.

La figura 3 muestra el resultado de un gel PAGE tenido con plata de las fracciones superior (TAgV-T) e inferior (TAgV-B) purificadas del virus ToTV, que indican las tres proteinas de la capside de aproximadamente 23, 26 y 35 kDa.

La figura 4 muestra el resultado de la electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante. Los tamanos de los segmentos estan indicados en kilobases (kb). El gel se tino con azul de ortotoluidina. M: patron del tamano molecular. TAgV: 1 gg del ARN del ToTV aislado.

La figura 5 muestra la secuencia completa de la molecula de ARN2 del ToTV 2 (SEQ ID NO: 1).

La figura 6 muestra la secuencia completa de la molecula de ARN1 del ToTV 1 (SEQ ID NO: 2).

La figura 7 muestra la estructura general del virus ToTV, que indica el sitio de hibridacion de los diversos conjuntos de cebadores utilizados en el ejemplo 2 con el ARN 2.

REFERENCIAS

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REIVINDICACIONES

1. Acido nucleico aislado o recombinante que comprende una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:1, la SEQ ID NO:2, tal como se define en las figuras 5 y 6, respectivamente, secuencias que tienen una homologla de la secuencia de nucleotidos, como mlnimo, del 70% con la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:2, en el que las secuencias homologas son secuencias de nucleotidos de un virus ToTV que codifican una protelna putativa de movimiento y tres protelnas de la capside, o una helicasa, proteasa y ARN polimerasa dependiente de ARN, respectivamente, y sus cadenas complementarias.
2. Vector de expresion que comprende un acido nucleico segun la reivindicacion 1.
3. Polipeptido aislado o recombinante codificado por un marco de lectura abierto (ORF) en la secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en i) SEQ ID NO: 1, ii) SEQ ID NO: 2, y iii) cadenas complementarias de los mismos.
4. Polipeptido, segun la reivindicacion 3, en el que dicho polipeptido se selecciona del grupo que consiste en las protelnas de la capside de 23, 26 y 35 kDa, la helicasa, la ARN polimerasa dependiente de ARN y la protelna putativa de movimiento (MP) del ToTV.
5. Antigeno que comprende un polipeptido segun la reivindicacion 3 o 4.
6. Anticuerpo dirigido especificamente contra el antigeno segun la reivindicacion 5.
7. Procedimiento para producir un anticuerpo contra un virus de planta denominado virus del torrado del tomate (ToTV), depositado en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH el 24 de noviembre de 2004, bajo los depositantes con numero de referencia ToTV-E01 (DSM 16999), un virus que comprende, como minimo, una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, tal como se define en las figuras 5 y 6, respectivamente, y secuencias que tienen una homologia de secuencia de nucleotidos, como minimo, del 70% con las mismas, en el que las secuencias homologas son secuencias de nucleotidos de un virus ToTV que codifican una protelna putativa de movimiento y tres protelnas de la capside, o una helicasa, proteasa y ARN polimerasa dependiente de ARN, respectivamente, comprendiendo el procedimientos las etapas de

a) proporcionar dicho virus, o una proteina o fragmento peptidico de la misma;

b) inmunizar un huesped vertebrado adecuado con dicho virus, proteina o fragmento peptidico; y

c) recoger de la sangre o los esplenocitos de dicho huesped vertebrado anticuerpos contra dicho virus, protelna o fragmento peptidico.
8. Procedimiento, segun la reivindicacion 7, que comprende, ademas, las etapas de seleccionar un esplenocito productor de anticuerpos, fusionar dicho esplenocito a una linea celular de hibridoma inmortalizada y permitir la fusion de dicho hibridoma para producir anticuerpos monoclonales.
9. Procedimiento para identificar un aislado virico como un virus de planta denominado virus del torrado del tomate (ToTV), depositado en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH el 24 de noviembre de 2004, bajo los depositantes con numero de referencia ToTV-E01 (DSM 16999), un virus que comprende, como minimo, una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, tal como se define en las figuras 5 y 6, respectivamente, y secuencias que tienen una homologia de secuencia de nucleotidos, como minimo, del 70% con las mismas, en el que las secuencias homologas son secuencias de nucleotidos de un virus ToTV que codifican una proteina putativa de movimiento y tres protelnas de la capside, o una helicasa, proteasa y ARN polimerasa dependiente de ARN, respectivamente, comprendiendo el procedimiento hacer reaccionar dicho aislado virico o un componente del mismo con un anticuerpo segun la reivindicacion 6.
10. Procedimiento para detectar la presencia de un virus de planta denominado virus del torrado del tomate (ToTV), depositado en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH el 24 de noviembre de 2004, bajo los depositantes con numero de referencia ToTV-E01 (DSM 16999), un virus que comprende, como minimo, una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, tal como se define en las figuras 5 y 6, respectivamente, y secuencias que tienen una homologia de secuencia de nucleotidos, como minimo, del 70% con las mismas en una muestra, en el que las secuencias homologas son secuencias de nucleotidos de un virus ToTV que codifican una proteina putativa de movimiento y tres protelnas de la capside, o una helicasa, proteasa y ARN polimerasa dependiente de ARN, respectivamente, comprendiendo determinar en dicha muestra la presencia del virus o un componente del mismo haciendo reaccionar dicha muestra con un anticuerpo segun la reivindicacion 6.
11. Procedimiento para identificar una planta que es resistente a un virus de planta denominado virus del torrado del

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tomate (ToTV), depositado en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH el 24 de noviembre de 2004, bajo los depositantes con numero de referencia ToTV-E01 (DSM 16999), un virus que comprende, como mlnimo, una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, tal como se define en las figuras 5 y 6, respectivamente, y secuencias que tienen una homologla de secuencia de nucleotidos, como mlnimo, del 70% con las mismas, en el que las secuencias homologas son secuencias de nucleotidos de un virus ToTV que codifican una protelna putativa de movimiento y tres protelnas de la capside, o una helicasa, proteasa y ARN polimerasa dependiente de ARN, respectivamente, comprendiendo las etapas de:

a) exponer una planta o parte de la planta a una dosis de particulas viricas o de acido nucleico virico capaz de infectar una planta, en la que se logra la infeccion mediante inoculacion mecanica de particulas de virus purificadas o acido nucleico virico del virus, e

b) identificar dicha planta como una planta que es resistente al virus cuando, despues de dicha exposicion,

- los sintomas de enfermedad en dicha planta o parte de la planta se mantienen ausentes o su expresion se retrasa o, como mlnimo, se reduce la gravedad o estan localizados en relacion con una planta control susceptible, y/o

- dichas secuencias de virus o genomicas de los mismos no estan presentes en dicha planta o parte de la planta o la presencia de dicho virus, como mlnimo, se reduce cuantitativamente respecto a una planta control susceptible.
12. Procedimiento, segun la reivindicacion 11, en el que en la etapa b) la presencia de dicho virus en dicha planta o parte de la planta se determina mediante la realization de un procedimiento segun la reivindicacion 10.
13. Kit de diagnostico para realizar un procedimiento, segun la reivindicacion 10, comprendiendo el kit, como minimo, un componente seleccionado del grupo que consiste en un virus de plantas denominado virus del torrado del tomate (ToTV), depositado en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH el 24 de noviembre de 2004 bajo los depositantes numero de referencia ToTV-E01 (DSM 16999), un virus que comprende, como minimo, una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, tal como se define en las Figuras 5 y 6, respectivamente, y secuencias que tienen una homologia de secuencia de nucleotidos, como minimo, del 70% con las mismas, en el que las secuencias homologas son secuencias de nucleotidos de un virus ToTV que codifican una protelna putativa de movimiento y tres protelnas de la capside, o una helicasa, proteasa y ARN polimerasa dependiente de ARN, respectivamente, un polipeptido segun la reivindicacion 3 o 4, un antigeno segun la reivindicacion 5 y un anticuerpo segun la reivindicacion 6.
14. Utilization de un virus de planta denominado virus del torrado del tomate (ToTV), depositado en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH el 24 de noviembre de 2004, bajo los depositantes con numero de referencia ToTV-E01 (DSM 16999), un virus que comprende, como mlnimo, una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, tal como se define en las figuras 5 y 6, respectivamente, y secuencias que tienen una homologia de secuencia de nucleotidos, como mlnimo, del 70% con las mismas, en el que las secuencias homologas son secuencias de nucleotidos de un virus ToTV que codifican una protelna putativa de movimiento y tres protelnas de la capside, o una helicasa, proteasa y ARN polimerasa dependiente de ARN, respectivamente, un polipeptido segun la reivindicacion 3 o 4, un antigeno segun la reivindicacion 5 o un anticuerpo segun la reivindicacion 6, para la production de una composition de diagnostico.
15. Composicion de diagnostico que comprende un virus de planta denominado virus del torrado del tomate (ToTV), depositado en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH el 24 de noviembre de 2004, bajo los depositantes con numero de referencia ToTV-E01 (DSM 16999), comprendiendo un virus, como minimo, una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, tal como se define en las figuras 5 y 6, respectivamente, y secuencias que tienen una homologia de secuencia de nucleotidos, como minimo, del 70% con las mismas, en el que las secuencias homologas son secuencias de nucleotidos de un virus ToTV que codifican una protelna putativa de movimiento y tres protelnas de la capside, o una helicasa, proteasa y ARN polimerasa dependiente de ARN, respectivamente, un polipeptido segun la reivindicacion 3 o 4, un antigeno segun la reivindicacion 5 o un anticuerpo segun la reivindicacion 6.
16. Utilizacion de un virus de planta denominado virus del torrado del tomate (ToTV), depositado en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH el 24 de noviembre de 2004, bajo los depositantes con numero de referencia ToTV-E01 (DSM 16999), un virus que comprende, como mlnimo, una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, tal como se define en las figuras 5 y 6, respectivamente, y secuencias que tienen una homologia de secuencia de nucleotidos, como mlnimo, del 70% con las mismas, en el que las secuencias homologas son secuencias de nucleotidos de un virus ToTV que codifican una protelna putativa de movimiento y tres protelnas de la capside, o una helicasa, proteasa y ARN polimerasa dependiente de ARN, respectivamente, su genoma o partes del mismo que confieren resistencia, como agente antiviral.
17. Utilization de un virus de planta denominado virus del torrado del tomate (ToTV), depositado en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH el 24 de noviembre de 2004, bajo los depositantes con numero de referencia ToTV-E01 (DSM 16999), un virus que comprende, como mlnimo, una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, tal como se define en las 5 figuras 5 y 6, respectivamente, y secuencias que tienen una homologla de secuencia de nucleotidos, como mlnimo, del 70% con las mismas, en el que las secuencias homologas son secuencias de nucleotidos de un virus ToTV que codifican una protelna putativa de movimiento y tres protelnas de la capside, o una helicasa, proteasa y ARN polimerasa dependiente de ARN, respectivamente, su genoma o partes del mismo, como vector de expresion.

10 18. Utilization de una forma atenuada de un virus de planta denominado virus del torrado del tomate (ToTV),

depositado en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH el 24 de noviembre de 2004, bajo los depositantes con numero de referencia ToTV-E01 (DSM 16999), un virus que comprende, como mlnimo, una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, tal como se define en las figuras 5 y 6, respectivamente, y secuencias que tienen una homologla de secuencia de

15 nucleotidos, como mlnimo, del 70% con las mismas, en el que las secuencias homologas son secuencias de nucleotidos de un virus ToTV que codifican una protelna putativa de movimiento y tres protelnas de la capside, o una helicasa, proteasa y ARN polimerasa dependiente de ARN, respectivamente, su genoma o partes del mismo, para la premunicion de una planta.

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