JP2008526224A - トマトトラードウイルスと称される植物ウイルス - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、植物病の分野にある。特に、本発明は、トマトから単離された新しい植物ウイルス、該ウイルスを検出するための方法、抵抗性植物を検出する方法、および抵抗性植物を産生するための方法に関する。
トマト ソラヌム リコペルシクム(Solanum lycopersicum)(かつてはリコペルシコン エスクレントゥム(Lycopersicon esculentum))は、多数のウイルス種に対して易罹患性である。最も著名なトマトウイルスの中には、トマト黄化壊疽ウイルス(TSWV;トスポウイルス属);ペピーノモザイクウイルス(PepMV;ポテクスウイルス属)、およびトマト黄化巻葉ウイルス(TYLCV;ベゴモウイルス属)が含まれる。これらの病気が植物に与える被害は、葉の変色および壊死病変から、深刻な作物の損失および植物の死にまで至る。
最近、任意の公知のウイルスに帰することができない症状を引き起こす、新しいウイルスが、スペイン産のトマト植物で発見された。植物は、葉に壊死病変および果実に褐色環を呈し、かつ成長の低下を示した。血清学的検査(ELISA)により、ペピーノモザイクウイルス(PepMV)の存在が示唆された。電子顕微鏡的研究によって、実際にポテクスウイルスに典型的な桿様粒子が明らかにされた。しかしながら、球状の形をしたウイルス粒子もまた、感染した葉組織で発見された。本発明者らは、PepMVとの複合体から新しいウイルスを分離することができた。新しいウイルスを仮にトマトトラード(Tomato torrado)ウイルス(ToTV)と命名した。
定義
本明細書において用いられる場合、「植物部分」という用語は、そこから植物が再生することができる植物、細胞塊、および組織培養においてインタクトである植物細胞などの単一の細胞および細胞組織を含む、植物の一部を指す。植物部分の例として、花粉、胚珠、葉、胚、根、根端、葯、花、果実、茎、シュート、および種子由来の単一の細胞および組織;同様に、花粉、胚珠、葉、胚、根、根端、葯、花、果実、茎、シュート、接ぎ穂、根茎、種子、プロトプラスト、カルス、およびそれらと同様のものが含まれるが、これらに限定されない。
ポリヌクレオチド間の相同性の存在を示す。最大限の一致を求めてアラインした時、2つの配列中のヌクレオチドの配列が同じならば、ポリヌクレオチドは「相同な」配列を有する。2つまたはそれより多くのポリヌクレオチド間の配列比較は、比較ウィンドウの全体にわたって2つの配列の部分を比較し、配列が類似している局所領域を同定および比較することによって通常行われる。比較ウィンドウは、通常約20〜200の連続したヌクレオチドである。50、60、70、80、90、95、98、99、または100パーセントの配列相同性などの、ポリヌクレオチドについての「配列相同性のパーセンテージ」を、比較ウィンドウの中のポリヌクレオチド配列の部分が、2つの配列の最適アラインメントのための(付加または欠失を含まない)参照配列と比べて、付加または欠失(すなわち、ギャップ)を含み得る、比較ウィンドウの全体にわたって2つの最適にアラインされた配列を比較することによって決定してもよい。パーセンテージを以下によって計算する:(a)同一の核酸塩基が両方の配列で生じる位置の数を決定して、一致した位置の数を得;(b)一致した位置の数を比較のウィンドウ中の位置の総数で割り;および(c)結果に100を掛け、配列相同性のパーセンテージを得る。比較のための配列の最適アラインメントを、公知のアルゴリズムのコンピュータ化した装置によって、または目視点検によって実行してもよい。すぐに利用可能な配列比較アルゴリズムおよび多重配列アラインメントアルゴリズムは、それぞれ基本局所アラインメント検索ツール(BLAST)(Altschulら、1990;Altschulら、1997)プログラムおよびClustalWプログラムであり、両方ともインターネット上で利用可能である。その他の好適なプログラムには、Wisconsin Genetics Software Package(Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI, USA)(Devereuxら、1984)の中のGAP、BestFit、PlotSimilarity、およびFASTAが含まれるが、これらに限定されない。
本発明は、少なくとも1つのSEQ ID NO:1および/またはSEQ ID NO:2による核酸配列ならびにそれに対して少なくとも30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、または好ましくは65%のヌクレオチド配列相同性を有する配列を含む単離されたウイルスを提供する。上で述べられたように、最大限の一致を求めてアラインした時、2つの配列中のヌクレオチドの配列が同じならば、ポリヌクレオチドは「相同な」配列を有する。ToTVウイルス単離体から得られたヌクレオチド配列を用いたBLAST検索は、GenBankデータベースおよびEMBLデータベース中の公知のウイルスまたは非ウイルス配列のいずれとも顕著な相同性を示さなかった。これまでに発見された最高のパーセンテージの相同性は、ToTV RNA1に対応するSEQ ID NO:2上のORF1中のヘリカーゼモチーフとその他の植物ウイルスのヘリカーゼモチーフとの間の46.5%であった。(以下の実施例参照)。
さらに、本発明は、本発明による核酸を含む発現ベクターに関する。まず始めに、2本鎖配列のToTVウイルスゲノム(の一部)を含むプラスミドベクター、ToTVのゲノム(の一部)を含むウイルスベクター(例えば、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、バキュロウイルスであるが、これらに限定されない)、またはその他のウイルスもしくはその他の病原体のゲノム(の一部)を含むToTVウイルスなどの発現ベクターが本発明の一部である。
ToTVウイルスを、任意の利用可能な方法によって、感染した植物またはその他の源から単離してもよい。単離には、好適な源からToTVウイルス粒子を精製する工程または部分精製する工程が含まれてもよい。広範な方法がウイルスの単離および精製に利用可能である(例えば、DijkstraおよびDe Jager、1998を参照)。例えば、ToTVの単離を、(有機溶媒の助けを借りて)例えば、ネポウイルスまたはルテオウイルスのための標準手順を用いるによって行ってもよい(例えば、Walker、2004参照)。そのようなプロトコルはウイルスの感染性の損失をもたらす可能性があるが、これらの手順は、その他の目的のためのウイルス物質を得るのに依然として有用である可能性がある。
精製または部分精製したToTVウイルスを調製したならば、ウイルス関連タンパク質の実質的に純粋な調製物(例えば、ウイルスにコードされたタンパク質)を調製することが可能性ある。タンパク質精製に関する多数の方法および戦略が当技術分野において公知であるが、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル(SDS-PAGE)を用いる電気泳動によるか、または親和性クロマトグラフィーによるかのいずれかによって、ウイルス外被タンパク質などの、ToTVウイルスタンパク質を精製するのが最も簡便であると考えられる。これらの方法のそれぞれを下に記載する。
モノクローナルかまたはポリクローナルかのいずれかの、抗体を、動物における抗原としてのタンパク質の注射を含む当技術分野の当業者に公知の様々な方法で、ハイブリドーマ融合によって、および細菌系またはファージ系が関与する組換え法によって、精製もしくは部分精製したToTVウイルスのタンパク質またはペプチド断片に対して作製することができる(その参照のそれぞれが好適な方法を開示している、Marksら、1992a; Marksら、1992b; Lowmanら、1991; Lernerら、1992を参照されたい)。
診断法に関わる、ToTVウイルスの検出は別として、本発明はまた、同定、すなわち単離体がToTVであるという確認のための方法に関する。そのような方法を、上で記載されたような系統発生学的推論、ならびに未同定のウイルス単離体とToTVウイルスおよび非ToTVウイルスと確認された1つもしくは複数の参照系統との間のヌクレオチド配列相同性またはアミノ酸配列相同性のレベルを決定することに基づいてもよい。そのような方法は、例えば、ウイルス単離体またはカプシドタンパク質のゲノム(の一部)をシークエンスする工程、ならびにToTVについて本明細書において提供されたような配列に対するその配列の相同性のレベルを比較する工程を含んでもよい。本明細書で提供されたようなSEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:2との50%を上回る配列相同性を有する単離体を、分類学的にToTVに対応する、またはToTVウイルス分類群に属すると考える。そのようなウイルスは本発明の一部である。
a)直径およそ28nmの球状で、エンベロープを持たないビリオン粒子などの、形態学的記述子;
b)ポリ(A)尾部を含み、それぞれ、5.3および8kDaのポリタンパク質をコードし、ならびに3つのカプシドタンパク質、ヘリカーゼ、プロテアーゼ、RdRP、および推定移動タンパク質に対するコード領域またはモチーフを含む2つのRNA部分に基づく1本鎖線状ポジティブセンスRNAウイルス特性を有する、ならびにRNA部分および/またはポリタンパク質および/またはモチーフは本質的に本明細書において記載されたような配列比較に基づくホモロジーを有するなどの、ゲノム特性記述子;ならびに
c)トマトにおいて壊死病変および焼け焦げたような症状を産生する、本質的に本明細書において記載されたような宿主範囲、ベクター関係および/または地理的分布を有する、ならびにトラード、マルチテス、および/またはチョコレート斑点のような名前で現地では公知のトマト植物の病気と関連しているなどの、生物学的特性記述子。
抗原を検出する本発明の方法を、原則的に、例えば古典的な免疫蛍光(IF)、免疫組織化学的技術、および同等の抗原検出アッセイ形式などの、任意の免疫学的方法を用いることによって行うことができる。ウイルスの外被タンパク質の検出に基づく好ましいToTV検出方法は、例えば、沈殿試験および凝集試験、放射免疫アッセイ(RIA)、免疫金標識、免疫吸着剤電子顕微鏡法(ISEM)、酵素結合免疫吸着剤アッセイ(ELISA)、ウェスタンブロッティング、ならびに免疫ブロッティングのような方法を含んでもよい。本発明の抗体を利用する免疫アッセイの種類の例は、直接的な形式か、または間接的な形式かのいずれかでの、競合免疫アッセイおよび非競合免疫アッセイである。抗体は、液相での免疫アッセイ、および固相担体に結合させる免疫アッセイにおいて利用することができる。さらに、これらの免疫アッセイにおける抗体は、様々な方法で検出できるように標識することができる。当業者は、過度の実験をすることなく、好適な免疫アッセイ形式を知り、または容易に識別することができる。アッセイ形式は文献において周知であり、および例えば、HarlowおよびLane(1988)に記載されている。
ToTVは少なくとも2つのリボ核酸(RNA)から構成される。3つの保護的カプシドタンパク質の存在についての強い兆候がある。上で記載された方法は、ウイルスの検出のためにウイルスタンパク質の免疫学的検出に焦点が当てられている。組換えDNA技術により、ウイルスRNA(もしくはそれらの相補体)、または逆転写によってそれから産生されるcDNAに、直接的にまたは間接的にハイブリダイズし、およびウイルスの検出のためのアッセイに使用することができるプローブを産生することが可能である。核酸増幅技術により、非常に少量で存在し得る、ウイルス核酸の断片の増幅が可能になる。
本発明はさらに、ToTV抵抗性植物、またはその部分を同定するための方法に関する。ToTV抵抗性植物を同定する様々な可能性がある。そのような方法の1組目の態様において、活性のある/感染性のウイルスまたは全長の感染性クローンを使用してもよく、その一方、別の態様において、ウイルス検出手段のみを使用してもよい。
−健康な接ぎ穂をToTVが感染した台木の上で成長させること、またはその逆のこと;
−健康な植物を(感染した植物、例えば、ネナシカズラ属の数種類(Cuscuta spp.)のような寄生植物、を含む)ウイルスを含む伝播ベクターに曝露させること;
−健康な植物にToTVウイルスゲノムのコード領域を持つ発現ベクターを導入すること;
−ToTVウイルスゲノムのコード領域を持つ発現ベクターを含むアグロバクテリウム トゥメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)系統などの、アグロ感染性クローンの使用。
i)病気-症状が存在しないままであり;またはウイルス粒子、もしくはウイルスRNAを検出することができなければ:植物は抵抗性であり;
ii)病気-症状が遅延し、もしくは病気-症状の重症度が低下し;または全身の低力価のウイルス粒子もしくはウイルスRNAを検出することができれば:植物は部分抵抗性であり;
iii)病気-症状は重症ではあるが、局所に留まり、接種した葉に限定され、および接種した組織を超えて全身には拡大せず;またはウイルス粒子、もしくはウイルスRNAを局所的にのみ検出することができるならば:植物は超感受性であり;
iv)病気-症状が存在しないままであり;かつウイルス粒子、またはウイルスRNAを検出することができるならば:植物は寛容性である。
v)植物が病気-症状を進行させ、かつ高い全身のウイルス力価を有するならば、植物は易罹患性および感受性である。そのような植物の例は、本発明のウイルスが単離される植物である。これらの植物は、本発明の方法において好適な対照植物として役立つ可能性がある。
本明細書において提供された方法および手段は、ウイルス学的診断によってToTVウイルス感染を診断するための診断キットにおいて特に有用である。そのようなキットまたはアッセイは、例えば、本発明によるウイルス、核酸、タンパク質性分子もしくはその断片、および/または抗体を含んでもよい。
本発明はまた、植物におけるToTV感染の治療において有用な抗ウイルス薬剤を得るための方法であって、本発明によるウイルスを含む細胞培養または実験植物を樹立する工程、該培養または植物を候補の抗ウイルス薬剤で治療する工程、および該薬剤の該ウイルスまたは該培養もしくは植物のその感染に対する効果を判定する工程を含む方法を提供する。そのような抗ウイルス薬剤の例として、本明細書において提供されたような、ToTV中和抗体、またはその機能断片が含まれるが、その他の性質の抗ウイルス薬剤を同様に得てもよい。
実施例1 トマト植物からのToTVの単離および特性解析
方法
序論
スペインからのトマト植物の試料を診断研究のために入手した。トマト植物の症状は、葉の上の壊死斑点および退緑ならびに果実の上の褐色環からなっていた。血清学的検査(ELISA)によって、ペピーノモザイクウイルス(PepMV)の存在が指摘されたが、症状を考慮すると、別の、不明確な、作用物質が存在する可能性が高かった。
下に記載したようにToTVをスペインから入手した罹患した植物から単離した。ToTVは幾つかのニコティアナ種に機械的に伝播することできる。標準的な接種緩衝液(例えば、0.03Mリン酸緩衝液、pH 7.7)が好適であることが分かった。この実施例を通して、ToTVをN.グルティノサまたはN.ベンタミアナに機械的に接種し、およびN. グルティノサまたはN.ベンタミアナで繁殖させた。接種後およそ14日目に、ウイルス精製を実行した。
幾つかの試みを行い、(有機溶媒の助けを借りて)例えば、ネポウイルスまたはルテオウイルスのための標準的プロトコルに従ってToTVを精製した。これらのプロトコルは常にウイルスの感染性の損失をもたらした。さらに、遠心分離工程で低温を用いた場合(5℃未満)、ToTVは凝集する傾向にあった。
ウイルス懸濁液を、別名ポリビニルホルマルとして公知の、Formvar(登録商標)でコーティングした格子状のスライドに「載せ」、2%ウラニルアセテートで染色し、およびPhilips CM12電子顕微鏡で調べた。
ウイルスタンパク質を12%変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE、Laemmli、1970)によって分離し、および銀染色した。
精製したウイルスを(2時間、115,000gでの)遠心分離によって濃縮した。ペレットをQiagen RNeasy MinElute Cleanup処置(Qiagen, Hilden, Germany)によるRNA抽出に供した。RNA濃度をUV分光光度計(Beckman Coulter社, Fullerton, USA)で決定した。
製造元の取扱説明書に従い、cDNA合成用のInvitrogen Superscript Choise系(Invitrogen, Breda, The Netherlands)を用いて、cDNAを合成した。オリゴd(T)プライマーかまたはランダムヘキサマープライマーかのいずれかを用いて、第1鎖cDNAを用意した。第2鎖合成後、クローン化を容易にするためにEcoRIアダプターをライゲーションした。EcoRIを適合させたcDNAのリン酸化に続いて、ライゲーションされなかったリンカーをカラムクロマトグラフィーによって除去した。結果として得られたcDNAをpBluescript II EcoRI前消化発現ベクター(Stratagene, La Jolla, USA)中にライゲーションし、および本ライゲーション混合物をTop10コンピテント細胞(Invitrogen)に形質転換した。
形質転換のすぐ後に、T3およびT7の両方の特異的プライマーを使用するPCRによって、組換えクローンをインサートの存在について解析した。PCR産物を1%アガロースゲル上でサイズについて解析した。約1500ヌクレオチドのインサートを含むクローンをさらなる配列解析用に使用した。結果として得られた配列データを、DNASTARプログラムパッケージを用いて解析した。
精製したToTV粒子を変性PAGEゲル上に充填し、およびカプシドタンパク質を分離した。分離したカプシドタンパク質バンドをゲルから単離し、トリプシンで処理し、および本質的にKinter & Sherman、2000によって記載されたような方法を用いたタンデムマススペクトロメーター(MSMS)を使用して、消化物を解析した。これによって、小さいペプチドのアミノ酸(AA)配列がもたらされ、その各々はToTVのRNA2ヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列との相同性を示した。その他のウイルス配列データとの比較は、PHYLIPパッケージからのプログラムで行った。
ウイルスの伝播および繁殖
ToTV繁殖用に、N.グルティノサおよびN.ベンタミナを使用することができた。N.エスペリス「67A」およびN.オッキデンタリス「P1」というタバコ種は、ToTVに対して非常に易罹患性であり、かつ3〜4日後に症状を示した。これらのタバコ種は短期間で極めて壊死性になり、およびそれゆえに繁殖宿主よりも指示植物として好適であると考えられた。N. グルティノサおよびN.ベンタミアナは退緑局所病変および全身退緑ならびに葉の中度の変性を伴って反応する。
感染した葉組織からのビリオンの精製はかなり難しいことが分かった。ToTVは有機溶媒に耐えることができず、および低温で遠心分離した場合に凝集する傾向がある。使用した精製プロトコル(1.2.参照)により、硫酸セシウム勾配中に2本の目に見えるウイルス含有バンドが結果として得られた。バンドは勾配の最下層部に見られ、Cs2SO4中での1.4g/cm2と等しいまたは1.4g/cm2を上回るかなり高い浮遊密度を示した。
2本のバンドを電子顕微鏡法によって調べ、および両方が直径約28nmのウイルス粒子を含んでいた(図2)。
精製したウイルス分画のポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)、その後のゲルの銀染色によって、およそ23、26、および35kDaの3つのカプシドタンパク質(CP)が示された(精製したウイルスの最上層の(TAgV-T)分画および最下層の(TAgV-B)分画を示す、図3参照)。
両ウイルスバンドを合わせたRNA単離により:およそ5.5kbおよび8kbという2つのRNAが明らかになった(図4参照)。上のバンドのRNA単離により、5.5kb RNA断片のみが結果として得られた。
RNA1
RNA1は、ヘリカーゼに典型的なモチーフのある1つのORF(ORF1)、RNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRp)を含む。さらに、アミノ酸位置106〜338について、22%の同一性がある、パチョリ微斑モザイクウイルス(PatMMV)(NP647592.1)のプロテアーゼ補助因子(Pro-Co)との低レベルのアミノ酸(aa)配列相同性が観察された。
NIMV=ネーブルオレンジ感染性斑紋形成ウイルス(サドワ);PYFV=パースニップ黄色斑点ウイルス(セキウイルス);RTSV=イネツングロスペリカルウイルス(ワイカウイルス);SDV=温州ミカン萎縮ウイルス(サドワウイルス);SMoV=イチゴ斑紋ウイルス(サドワウイルス);ToTV-トマトトラードウイルス(提案されている属);ALSV=リンゴ潜在球状ウイルス(チェラウイルス);CRLV=サクランボラスプ葉ウイルス(チェラウイルス);MCDV=トウモロコシ退緑萎縮ウイルス(ワイカウイルス)
PYFV=パースニップ黄色斑点ウイルス(セキウイルス);RTSV=イネツングロスペリカルウイルス(ワイカウイルス);SDV=温州ミカン萎縮ウイルス(サドワウイルス);SMoV=イチゴ斑紋ウイルス(サドワウイルス);ToTV-トマトトラードウイルス(提案されている属);ALSV=リンゴ潜在球状ウイルス(チェラウイルス);CRLV=サクランボラスプ葉ウイルス(チェラウイルス);MCDV=トウモロコシ退緑萎縮ウイルス(ワイカウイルス)
RNA2は2つの潜在的ORFを含む(図7)。ORF1は20kDaという分子量を持つ187aaの予測タンパク質をコードしている。配列解析により、EMBLデータベース由来の任意のタンパク質と相同性がないことが明らかとなった。このORFが実際のタンパク質をコードしているかどうかは不明である。
RNA1およびRNA2の3'UTRはそれぞれ、1210ntおよび1092ntである。両RNAの最後の988ヌクレオチドにおいて98%の同一性がある。両RNAのUTRの3'-領域が同一であることを確認するために、トータルウイルスRNAに対して、同一の3'-UTR領域由来の1つのリバースプライマーおよび2つのRNA特異的フォワードプライマーで、RT-PCRを行った。結果として得られたPCR産物をシークエンスした。
最も大きい外被タンパク質(CP1:およそ35kDa)の断片を、RNA2のORF2(AA487〜729)における領域の部分とアラインすることができた。真ん中の外被タンパク質バンド(CP2:およそ26kDa)の断片を、AA730〜983間のRNA2のORF2の領域とアラインすることができた。
2003年、中央アメリカ(メキシコおよびグアテマラ)で成長した、ToTVの症状に類似した症状があるトマト植物が発見された。原因となる作用物質はウイルスであると疑われた。この病気は、「チョコレート」、「マルチテス(ウイルス)」、または「チョコレート斑点病」という名で現地では公知である。野外で成長する易罹患性植物は、2003年以降、ひどく感染するようになった。
トータルRNA単離系(Promega SV96)を用いて、約100μgの「チョコレート斑点病」に感染した葉物質からRNAを単離した。2μlのトータルRNAを、50μl のSuperscript 1-工程RT-PCR反応(Invitrogen)の反応混合液中で使用し、反応混合液はさらに25μl 2×反応混合物、1μl(100ng)のフォワードプライマーおよびリバースプライマーの両方、1μlのRT/Taq混合物、ならびに22μlのミリQ水を含んでいた。RNAをcDNAに逆転写し、およびこのcDNAを増幅するために、以下のRT-PCRプログラムを用いてもよい:工程1:30分@50℃(逆転写反応);工程2:3分@94℃(Taqポリメラーゼの活性化);工程3:30秒@94℃;工程4:30秒@55℃;工程5:1分@72℃;工程6:工程(3〜5)を繰り返す 40×;工程7:10分@72℃;工程8:必要な限り10℃。TAE緩衝液またはTBE緩衝液中の1%アガロースゲル上で、PCR産物を解析した。
使用したプライマーセットは期待した通りにToTV配列の部分の増幅を促進したが、RT-PCRにおけるRNA-2配列(P1048/1049、P1056/1057、P1060/1061、およびP1064/1065)に基づく4つの異なるプライマーセットの使用によって、「チョコレート斑点病」ゲノムの部分の増幅ももたらされた。これらのプライマーセットのアニーリングの部位を図1に図示する。
Claims (31)
- ToTV-E01(DSM16999)という寄託者参照番号で、2004年11月24日にDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbHに寄託された、トマトトラード(Tomato torrado)ウイルス(ToTV)と命名された植物ウイルス。
- SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:2からなる群より選択される少なくとも1つの核酸配列、ならびにそれに対して少なくとも50%のヌクレオチド配列相同性を有する配列を含むウイルス。
- 「トラード」、「マルチテス(Marchitez)」、および/もしくは「チョコレート斑点病」という名前で公知のトマトの病気と関連し、ならびに/または本質的に表1で定義されたような分類学的記述子の数量分類学的解析に基づいて、任意のその他のウイルスよりも請求項1で定義されたウイルスとより近縁関係にあることが示され、ならびにトマトで壊死病変を引き起こす病気と関連する、請求項2記載のウイルス。
- SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:1もしくはSEQ ID NO:2に対して少なくとも50%のヌクレオチド配列相同性を有する配列、およびそれらの相補鎖、ならびにそれらのToTV特異的断片からなる群より選択される核酸配列を含む、単離された核酸もしくは組換え核酸またはそれらのToTV特異的断片。
- 請求項4記載の核酸を含む発現ベクター。
- ストリンジェントな条件下で請求項4記載の核酸にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド。
- 請求項1〜3のいずれか一項記載のウイルスから得られる単離されたポリペプチドもしくは組換えポリペプチド、またはそれらのToTV特異的断片。
- ToTVの23、26、および35kDaのカプシドタンパク質、ヘリカーゼ、RNA依存性RNAポリメラーゼ、および推定移動タンパク質(MP)、ならびにそれらのToTV特異的断片からなる群より選択される、請求項7記載のポリペプチド。
- 請求項7または8記載のポリペプチドを含む抗原。
- 請求項9記載の抗原を特異的に対象とする抗体。
- ToTVに対する抗体を産生するための方法であって、以下の工程を含む方法:
a)ToTVウイルス、またはタンパク質もしくはそのペプチド断片を提供する工程、
b)適切な脊椎動物宿主を該ウイルス、タンパク質、またはペプチド断片で免疫する工程、ならびに
c)脊椎動物宿主の血液または脾細胞から、該ウイルス、タンパク質、またはペプチド断片に対する抗体を採取する工程。 - 1つの抗体産生脾細胞を選択し、該脾細胞を、不死化したハイブリドーマ細胞株に融合させ、ハイブリドーマ融合体にモノクローナル抗体を産生させる工程をさらに含む、請求項11記載の方法。
- 請求項11または12記載の方法によって得られる抗体。
- ウイルス単離体をToTVウイルスであると同定するための方法であって、ウイルス単離体またはその構成要素を請求項10または13記載の抗体と反応させる工程を含む方法。
- ウイルス単離体をToTVウイルスであると同定するための方法であって、ウイルス単離体またはその構成要素を請求項6記載のポリヌクレオチドと反応させる工程を含む方法。
- 試料におけるToTVの存在を検出するための方法であって、試料を請求項6記載のポリヌクレオチドまたは請求項10もしくは13記載の抗体と反応させることによって、試料におけるToTVウイルスまたはその構成要素の存在を判定する工程を含む方法。
- ToTV抵抗性植物を同定するための方法であって、以下の工程を含む方法:
a)植物または植物部分を感染量のToTVに曝露する工程、および
b)曝露後、
−易罹患性の対照植物と比較して、植物もしくは植物部分における病気-症状が存在しないままである、もしくは発現が遅延する、もしくは少なくとも重症度が低下する、もしくは局在化する、および/または
−ToTVウイルスもしくはToTVゲノム配列が植物もしくは植物部分に存在しない、または易罹患性の対照植物と比較して、ToTVウイルスの存在が少なくとも量的に低下している
のいずれかである場合に、植物をToTV抵抗性植物であると同定する工程。 - 工程b)において、植物または植物部分におけるToTVの存在を、請求項16記載の方法を実行することによって判定する、請求項17記載の方法。
- ToTV抵抗性植物を産生する方法であって、以下の工程を含む方法:
a)請求項17または18記載の方法を実行することによって、ToTV抵抗性ドナー植物を同定する工程、
b)ToTV抵抗性ドナー植物をレシピエント植物と交配する工程、および
c)請求項17または18記載の方法を実行することによって、子孫植物から抵抗性植物を選択する工程。 - ドナー植物がナス科(Solanaceae)またはウリ科(Cucurbitaceae)の植物である、請求項19記載の方法。
- ドナー植物が、トマト植物、ナス植物、コショウ植物、メロン植物、スイカ植物、またはキュウリ植物である、請求項19記載の方法。
- レシピエント植物がナス科またはウリ科の植物である、請求項19〜21のいずれか一項記載の方法。
- レシピエント植物が、トマト植物、ナス植物、コショウ植物、メロン植物、スイカ植物、またはキュウリ植物である、請求項19〜21のいずれか一項記載の方法。
- レシピエント植物がトマト(Solanum lycopersicum)種のトマト植物、より好ましくは商業的に望ましい特徴を保有するトマト株である、請求項19〜21のいずれか一項記載の方法。
- 請求項19〜24のいずれか一項記載の方法によって得られる、ToTV抵抗性植物、またはその部分。
- 請求項1〜3のいずれか一項記載のウイルス、請求項6記載のポリヌクレオチド、請求項7または8記載のポリペプチド、請求項9記載の抗原、および請求項10または13記載の抗体からなる群より選択される少なくとも1つの構成要素を含む、請求項16記載の方法を実施するための診断キット。
- 診断組成物の産生のための、請求項1〜3のいずれか一項記載のウイルス、請求項6記載のポリヌクレオチド、請求項7もしくは8記載のポリペプチド、請求項9記載の抗原、または請求項10もしくは13記載の抗体の使用。
- 請求項1〜3のいずれか一項記載のウイルス、請求項6記載のポリヌクレオチド、請求項7もしくは8記載のポリペプチド、請求項9記載の抗原、または請求項10もしくは13記載の抗体を含む診断組成物。
- 請求項1〜3のいずれか一項記載のウイルス、そのゲノム、または抵抗性を付与するそれらの部分の抗ウイルス剤としての使用。
- 請求項1〜3のいずれか一項記載のウイルス、もしくはそのゲノム、またはそれらの部分の発現ベクターとしての使用。
- 植物の相関免疫のための、弱毒型の請求項1〜3のいずれか一項記載のウイルス、もしくはそのゲノム、またはそれらの部分の使用。
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