DD233853A5

DD233853A5 - Verfahren zur herstellung von eglin-verbindungen

Info

Publication number: DD233853A5
Application number: DD26966884A
Authority: DD
Inventors: Hans Rink; Manfred Liersch; Peter Sieber; Werner Rittel; Francois Meyer; Ursula Seemueller; Hans Fritz; Walter Maerki; Sefik Alkan
Original assignee: Ciba-Geigy Ag,Ch
Priority date: 1983-11-21
Filing date: 1984-11-20
Publication date: 1986-03-12
Also published as: ZA849023B

Abstract

Die Erfindung betrifft fuer ein Eglin kodierende DNA-Sequenzen, solche DNA-Sequenzen enthaltende Expressionsplasmide, mit solchen Expressionsplasmiden transformierte Wirte, von solchen transformierten Wirte produzierte neue Eglin-Verbindungen, monoklonale Antikoerper gegen Egline, Hybridoma-Zellen, die solche Antikoerper produzieren, und Test-Kits fuer Immunoassays, die solche Antikoerper enthalten, ferner die Verfahren zu ihrer Herstellung und ein Verfahren zur Herstellung von Eglinen mit Hilfe der transformierten Wirte. Die erfindungsgemaess herstellbaren Egline weisen wertvolle pharmakologische Eigenschaften auf.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Verfahren zur Herstellung von Eglinen mit Hilfe von transformierten Mikroorganismen.

Bekannte technische Lösungen

Aus der DE-OS 2808396 sind zwei aus Blutegeln (Hirudo medicinalis) isolierte Protease-Inhibitoren, die als Eglin B und Eglin C bezeichnet werden, bekannt. Diese Polypeptide bestehen aus je 70 Aminosäuren, haben ein Molekulargewicht von ca. 8100 und sind starke Inhibitoren für Chymotrypsin, Subtilisin, für die tierischen und menschlichen Granulozyten-Proteasen Elastase und Cathepisin G sowie für die Mastzell-Protease Ghymase (1). Weniger stark gehemmt werden Trypsin-ähnliche Proteasen.

Eglin Chat die folgende Primärstruktur (2):

ThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrVal

AspGlnAlaArgGluTyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAspValTyrPheLeu

ProGluGlySerProValThrLeuAspLeuArgTyrAsnArgValArgValPheTyr

AsnProGlyThrAsnValValAsnHisValProHisValGly

Eglin C enthält im Gegensatz zu den meisten bekannten Proteinase-Hemmern k"" e Disulfid-Brücke, es erweist sich auch für ein Miniprotein als ungewöhnlich stabil gegenüber Denaturierung durch Säure, Lauge oder \/Värme und gegenüber proteolytischem Abbau. Die Primärstruktur von Eglin B unterscheidet sich von derjenigen von Eglin C durch Ersatz der Aminosäure 35, Tyrosin, durch Histidin.

Die Egline gehören zu den stärksten heute bekannten Hemmern von humaner und tierischer Granulozyten-Elastase, sowie von humanem Granulozyten-Cathepsin G und von bakteriellen Proteasen vom Typ des Subtilisins. Unkontrollierte bzw. übermäßige Freisetzung dieser zellulären Proteasen im Organismus kann einen Entzündungsvorgang verstärken und Gewebeabbau durch unspezifische Proteolyse hervorrufen. Dies insbesondere des' alb, da diese für die intrazelluläre Verdauung zuständigen Enzyme im physiologischen (neutralen bis schwach alkalischen) Milieu optimal wirksam sind und native Gewebesubstanzen (z. B.

Elastin) und humorale Faktoren (z. B. Blutgerinnungs- und Komplementfaktoren) rasch zu zerstören und zu inaktivieren vermögen. Auf Grund ihrer bis anhin bekannten Eigenschaften sind die Egline daherfür die Anwendung in der medizinischen Therapie (Antiinflammation,Antiphlogistik, septischer Schouv Lungenemphysen, Mucoviscidose etc.) von großem Interesse.

Im Blutegel werden die Egline nur in sehr geringen Mengen (ca. 16/xg/Egel) gebildet. Die Isolierung und Reinigung der Egline aus Blutegeln gestaltet sich daher sehr zeit- und kostenaufwendig und ist im kommerziellen Maßstab nicht durchführbar.

Auf Grund der großen Fortschritte in der sogenannten gekombinierten DNA-Technologie (oder Gentechnologie) ist es neuerdings möglich, die unterschiedlichsten physiologisch aktiven Polypeptide unter Verwendung dieser Technologie herzustellen.

Ziel der Erfindung

Es ist Ziel der Erfindung, Egline für die therapeutische Anwendung bereitzustellen.

Wesen der Erfindung

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, mit Hiife von gentechnologischen Mitteln Expressionssysteme zur Verfügung zu steilen, das die mikrobielle Herstellung von Eglirien im industriellen Maßstab erlaubt. Diese Aufgabe wird in der vorliegenden Erfindung gelöst durch die Bereitstellung von Hybridvektoren, die eine für ein Eglin kodierende DNA-Sequenz enthalten, welche von einer Expressionskontrollsequenz derart reguliert wird, daß ein Eglin in einem mit diesen Hybridvektoren transformierten Wirt exprimiert wird.

Herstellung von DNA-Sequenzen, die für ein Eglin kodieren

Die Erfindung betrifft DNA-Sequenzen, welche für ein Eglin, z. B. Eglin B und insbesondere Eglin C, oder für ein modifiziertes Eglin, z. B. modifiziertes Eglin B oder insbesondere modifiziertes Eglin C, kodieren, wobei die Modifizierung in einer Verkürzung der Primärstruktur des Eglins unter Aufrechterhaltung der Eglin-Aktivität besteht, und Fragmente davon. Unter der allgemeinen Bezeichnung „Egline" werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung, wenn nicht spezifischer definiert, Polypeptide mit Proteinaseinhibitor-Aktivität verstanden, deren Primärstruktur mit den Primärstrukturen von Eglin B oder C weitgehend (Strukturhomologie im allgemeinen bis zu 80%) übereinstimmen, die aber auch N-terminal abgeändert, z. B. am Threonin N^a-acetyliert, №- methionyliert oder N^a-aeetylmethionyliert sein können.

Bei modifizierten Eglinen besteht die Modifizierung vorzugsweise in einer Verkürzung der Primärstruktur der natürlichen Egline, z.B. um 1 bis 10, insbesondere 1 bis 6, Aminosäurebausteine am N-Terminus und/oder um 1 bis 6, insbesondere 2, Aminosäurebausteine am C-Terminus, wobei auch hier am N-Terminus abgeänderte, z. B. acetylierte und methionylierte oder N-acetylmethionylierte Derivate einbezogen sind.

Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur Herstellung von DNA-Sequenzen, die für ein Eglin, z.B. Eglin Bund insbesondere Eglin C, oder für ein modifiziertes Eglin, z.B. modifiziertes Eglin B oder insbesondere modifiziertes Eglin C, kodieren, und von Fragmenten davon, gekennzeichnet dadurch, daß man aus genomischer Egel-DNA das Eglin-Strukturgen isoliert, oder aus Eglin-mRNA eine komplementäre doppelsträngige Eglin-DNA (Eglin-ds cDNA) herstellt, und zur Herstellung von DNA-Sequenzen, die für ein modifiziertes Eglin kodieren, das genomische Eglin-Strukturgen oder die Eglin-ds cDNA mit geeigneten Nucleasen behandelt, oder daß man ein entsprechendes (modifiziertes) Eglin-Strukturgen oder Fragment davon mittels chemischer und enzymatischer Verfahren herstellt.

Die Gewinnung von genomischer Eglin-DNA und von Eglin-ds cDNA erfolgt beispielsweise nach an sich bekannten Methoden. So gewinnt man genomische Eglin-DNA beispielsweise aus einer Egel-Genbank, welche das Eglin-Gen enthält, indem man die Egel-DNA-Fragmente in einem Mikroorganismus kloniert und Klone, die Eglin-DNA enthalten, identifiziert, beispielsweise durch Kolonie-Hybridisierung unter Verwendung eines radioaktiv markierten Eglin-DNA spezifischen Oligodesoxynucleotids, welches mindestens 15, vorzugsweise 15 bis 30, Desocynucleotide enthält. Die so erhaltenen DNA-Fragmente enthalten nebem dem Eglin-Gen in der Regel weitere unerwünschte DNA-Bestandteile, welche durch Behandlung mit geeigneten Exo- oder Endonucleasen abgespalten werden können.

Doppelsträngige Eglin-cDNA kann beispielsweise hergestellt werden, indem man aus geeigneten, vorzugsweise zur Eglin-Bildung induzierten Egelzellen mRNA gewinnt, das so erhaltene mRNA-Gemisch in an sich bekannter Weise an Eglin-mRNA anreichert, diese mRNA als Templat für die Herstellung von einsträngiger cDNA verwendet, daraus mit Hilfe einer RNA-abhängigen DNA-Polymerase die ds cDNA synthetisiert und diese in einen geeigneten Vektor kloniert. Klone, die Eglin-cDNA enthalten, werden beispielsweise, wie oben beschrieben, durch Koloniehybridisierung unter Verwendung eines radioaktiv markierten, Eglin-DNA spezifischen Oligodesoxynucleotids identifiziert.

Zur Herstellung von DNA-Sequenzen, die für modifizierte Egline kodieren, kann die erhältliche genomische Eglin-DNA oder Eglin-cDNA mit geeigneten Exo- und/oder Endonucleasen behandelt werden, welche die für die N- bzw. C-terminalen Eglin-Aminosäuren kodierenden DNA-Abschnitte abspalten.

Die auf diese Weise gewonnene genomische Eglin-DNA oder die Eglin-cDNA werden vorzugsweise am 5'- und am З'-Ende mit chemisch synthetisierten Adapter-Oligodesoxynucleotiden verknüpft, welche die Erkennungssequenz für eine oder verschiedene Restriktionsendonuclease(n) enthalten und damit den Einbau in geeignete Vektoren erleichtern. Zusätzlich muß das Adaptermolekül für das 5'-Ende der Eglin-DNA bzw. -cDNA noch das Translationsstartsignal (ATG) enthalten. Das Translationsstartsignal muß derart angeordnet sein, daß ihm dasCodonfür die erste Aminosäure des Eglins direkt folgt. Da die Struktur des natürlichen Eglin-Gens nicht bekannt ist und die chemische Synthese eines Eglins-Gens auf Grund der modernen Synthesemöglichkeiten Vorteile, insbesondere in zeitlicher Hinsicht, bietet, stellt letztere eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar.

Chemische Synthese eines Eglin-Gens

Die Erfindung betrifft insbesondere ein Vtrfahren zur Herstellung eines Strukturgens für ein Eglin oder für ein modifiziertes Eglin oder von Fragmente,: davon, dadurch г ^kennzeichnet, daß man Segmente des kodierende und des komplementäre , Stranges eines Eglin- oder modifizierten Eglin-Gens chemisch synthetisiert und erhältliche Segmente enzymatisch in ein Strukturgen des Eglins oder des modifizierten Eglins oder in Fragmente davon überführt.

Die Erfindung betrifft ferner doppelsträngige DNAs, die für Egline, beispielsweise Eglin B oder Eglin C, modifizierte Egline, beispielsweise modifiziertes Eglin B oder modifiziertes Eglin C, oder Fragmente davon kodieren.

Die erfindungsgemäßen DNAs enthalten zusätzlich zu den Codons für die Egline bzw. modifizierten Egjine-Translations-Startsignale und Translations-Signale, die eine Expression in geeigneten Wirtszellen, beispielsweise in E.coli, ermöglichen, ferner Nukleotidsequenzen an den Enden, die für einen Einbau in einen Vektor geeignet sind.

In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung umfaßt die DNA am 5'-Ende eine durch ein Restriktionsenzym schneidbare Nu kleotidsequenz gefolgt vom Translations-Startsignal, Codons für ein Eglin oder für ein modifiziertes Eglin, die gegebenenfalls an einer oder mehreren Stellen das Schneiden durch ein Restriktionsenzym ermöglichen, ein Translations-Stopsignal u^d am З'-Ende eine durch ein Restriktionsenzym schneidbare Nukieotidsequenz. Erfindungsgemäß anwendbare Restriktionsenzyme sind beispielsweise EcoRI, BamHI, Hpall, Pstl, Aval oder Hindlll.

Insbesondere umfaßt die Erfindung eine für ein Eglin kodierende, doppelsträngige DNA bestehend aus einer Nukleotidsequenz der Formel I und der komplementären Nukleotidsequenz 5' Met B

(X)_n ATG D

VaI GTX

His CAY

Pro CCX

Arg LGN

Pro CCX

worin die Nukleotidsequenz beginnend mit dem 5'-Ende dargestellt und zum besseren Verständnis die Aminosäuren, für die jedes Triplett kodiert, angegeben sind, und worin D für eine direkte Bindung oder für eine für N-terminale Aminosäuren des Eglins kodierende Nucleotidsequenz und B für eine direkte Bindung oder für die entsprechenden N-terminalen Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe

Ser Phe Leu Lys Ser Phe Ser GIu Leu Lys

QRS TTY, YTZ AAM QRS TTY, QRS GAM YTZ AAM

Pro CCX	GIu GAM	VaI GTX	VaI GTX
AIa GCX	Arg LGN	GIu GAM	Tyr TAY
GIn CAM	Tyr TAY	Asp GAY	VaI GTX
Ser QRS	Pro CCX	VaI GTX	Th r ACX
Arg LGN	VaI GTX	Arg LGN	VaI GTX
As η AAY	VaI GTX	VaI GTX	Asn AAY

GIy GGX	Lys AAM	Thr ACX
Phe TTY	Thr ACX	Leu YTZ
W YAY	Phe TTY	Leu YTZ
Leu YTZ	Asp GAY	Leu YTZ
Phe TTY	Tyr TAY	Asn AAY
B' D'	NON TMK	(X)_m

Asp GAY	GIn CAM
Tyr TAY	Pro CCX
GIu GAM	GIy GGX
Tyr TAY	Asn AAY
GIy GGX	Thr ACX

Ser	Phe	Phe	GIy	Ser	GIu	Leu	Lys	Ser	Phe
QRS	TTY,	TTY	GGX	QRS	GAM	YTZ	AAM	QRS	TTY

oder

Thr GIu Phe GIy Ser GIu Leu Lys Ser Phe

ACX GAM TTY GGX QRS GAM YTZ AAM QRS TTY

steht und D'für eine direkte Bindung oder für eine für C-terminale Aminosäuren des Eglins kodierende Nucleotidsequenz und B' für eine direkte Bindung oder für die entsprechenden C-terminalen Aminosäuren ausgewählt aus der Gruppe

His VaI His VaI Pro His

CAY GTX, CAY GTX CCX CAY oder

His	VaI Pro His	VaI	GIy
CAY	GTX CCX CAY	GTX	GGX
steht,	und worin bedeuten
A	Desoxyadenosyl,
T	Thymidyl,
G	Desoxyguanosyl,
C	Desoxy cytidyl,
X	A, T, C oder G,
Y	ToderC,
Z	A, T, C oder G, wenn Y = C,
oder	Z = A oder G, wenn Y = T,
Q	Toder A,
R	C und S = A, T, C oder G, wenn Q = T,
oder	R = G und S = T oder C, wenn Q = A,
M	AoderG,
L	AoderC,
N	AoderG,wenn L = A,
oder	N = A,T,CoderG,wennL = C,
K	AoderG, wenn M=A,
oder	K = A, wenn M = G,
W	Tvr oder His.

und (X)_n und (X)_m je beliebige Nukleotidsequenzen mit η und m größer als 3 und kleiner als 100, insbesondere größer als 5 und kleiner als 12, bedeuten, welche durch ein Restriktionsenzym erkannt und geschnitten werden können, und Fragmente einer solchen doppelsträngigen DNA der Formel I.

Die Erfindung betrifft insbesondere für ein Eglin kodierende doppelsträngige DNA der Formel I, worin D für eine Nucleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe YTZ AAM QRS TTY, QRS GAM YTZ AAM QRS TTY und ACX GAM TTY GGX QRS GAM YTZ AAM QRS TTY und D' für die Nucleotidsequenz der Formel CAY GTX CCX CAY GTX GGX steht, und die übrigen Symbole die unter Formel I angegebenen Bedeutungen haben.

-A-

In erster Linie betrifft die Erfindung eine für ein Eglin kodierende doppelsträngige DNA der Formel I, worin D für die Nucleotidsequenz ACX GAM TTY GGX QRS GAM YTZAAM QRS TTY und D' für die Nucleotidsequenz CAY GTX CCX CAY GTX GGX steht und die übrigen Symbole die unter Formel I angegebenen Bedeutungen haben.

In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die DNA-Sequenz am 5'-Ende eine durch EcoRI spaltbare, in der Mitte eine durch Hpall spaltbare und am З'-Ende eine durch BamHI spaltbare Nukeotidsequenz.

In erster Linie umfaßt die Erfindung eine doppelsträngige DNA, welche von E. coli bevorzugte Tripletts, die für die Aminosäuren von Eglinen bzw. modifizierten Eglinen kodieren, enthält. Solche Tripletts sind

für Glycin (GIy) GGT

Alanin (Ala) GCT

VaMn(VaI) GTT

Leucin (Leu) CTG

Serin (Ser) TCT

Threonin (Thr) ACT

Phenylalanin (Phe) TTC

Tyrosin (Tyr) TAC

Methionin (Met) ATG

Asparaginsäure (Asp) GAC

Glutaminsäure (GIu) GAA

Lysin (Lys) AAA

Arginin (Arg) CGT

Histidin (His) CAT

Prolin (Pro) CCG

Glutamin (Gin) CAG

Asparagin (Asn) AAC

In der vorliegenden Erfindung wird für Phenylalanin auch das Codon TTT und für Prolin CCA oder CCT verwendet, damit neben der Schnittstelle für EcoRI am 5'-Ende, für BamHI am З'-Ende und einer Schnittstelle für Hpall keine weiteren Schnittstellen für die genannten Restriktionsenzyme enthalten sind. Bevorzugtes Stopsignal (NON) ist der Codon TAG. Eine bevorzugte Ausführungsform eines Gens für Eglin C in der oben dargestellten Weise ist die DNA der Formel Ma, MetThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrVal CTG G AATTCATG ACTG AATTTG GTTCTG AACTG AAATCTTTCCCAG AAGTTGTTG GTAAAACTGTT GACCTTAAGTACTGACTTAAACCAAGACTTGACTTTAGAAAGGGTCTTCAACAACCATTTTGACAA (EcoRI)

AspGlnAlaArgGluTyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAspValTyrPheLeuProGluGly G ACCAG G CTCGTGAATACTTCACTCTGCATTACCCGCAGTACGACGTTTACTTCCTG CCG G AAG GT CTGGTCCGAGCACTTATGAAGTGAGACGTAATGGGCGTCATGCTGCAAATGAAGGACGGCCTTCCA (Hpall)

SerProValThrLeuAspLeuArgTyrAsnArgValArgValPheTyrAsnProGiyThrAsnVal TCTCCTGTTACTCTGGACCTGCGTTACAACCGTGTTCGTGTTTTCTACAACCCAGGTACTAACGTT AGAGGACAATGAGACCTGGACGCAATGTTGGCACAAGCACAAAAGATGTTGGGTCCATGATTGCAA

ValAsnHisValProHisValGlyNON

GTTAACCATGTTCCGCATGTTG GTTAG G ATCCTG CAATTGGTACAAGGCGTACAACCAATCCTAGGAC (BamHI)

(Ha),

eine bevorzugte Ausführungsform eines Gens für Eglin B ist die DNA der Formel Il b)

MetThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrVal CTGGAATTCATGACTGAATTTGGTTCTGAACTGAAATCTTTCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT GACCTTAAGTACTGACTTAAACCAAGACTTGACTTTAGAAAGGGTCTTCAACAACCATTTTGACAA (EcoRI)

AspGlnAlaArgGluTyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAspValHisPheLeuProGluGly GACCAGGCTCGTGAATACTTCACTCTGCATTACCCGCA⁰T^CGACGTTCATTCCTGCCGGAAGGt CTGGTCCGAGCACTTATGAAGTGAGACGTAATGGGCGTCATGCTGCAAGTAAAGGACGGCCTTCCA (Hpall)

SerProValThrLeuAspLeuArgTyrAsnArgValArgValPheTyrAsnProGlyThrAsnVal TCTCCTGTTACTCTGGACCTGCGTTACAACCGTGTTCGTGTTTTCTACAACCCAGGTACTAACGTT AGAGGACAATGAGACCTGGACGCAATGTTGGCACAAGCACAAAAGATGTTGGGTCCATGATTGCAA

ValAsnHisValProHisValGlyNON

GTTAACCATGTTCCGCATGTTGGTTAGGATCCTG CAATTGGTACAAGGCGTACAACCAATCCTAGGAC (BamHI)

(Mb),

und bevorzugte Ausführungsform von Genen für modifizierte (N-terminai verkürzte) Eglin C-Polypeptide sind die DNAs der Formeln Mc und Md

MetSerGluLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrVal CTGGAATTCATGTCTGAACTGAAATCTTTCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT GACCTTAAGTACAGACTTGACTTTAGAAAGGGTCTTCAACAACCATTTTGACAA (EcoRI)

AspGlnAlaArgGluTyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAspValTyrPheLeuProGluGly gaccaggctcgtgaatacttcactctgcattacccgcagtacgacgtttacttcctgccggaaggt ctggtccgagcacttatgaagtgagacgtaatgggcgtcatgctgcaaatgaaggacggccttcca (Hpall)

ValAsnHisValProHisValGlyNON

GTTAACCATGTTCCGCATGTTGGTTAGGATCCTG CAATTG GTACAAG GCGTACAACCAATCCTAG G AC (BamHI)

(lic),

MetLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrVal CTGGAATTCATGCTGAAATCTTTCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT GACCTTAAGTACGACTTTAGAAAGGGTCTTCAACAACCATTTTGACAA (EcoRI)

ValAsnHisValProHisValGlyNON

GTTAACCATGTTCCGCATGTTGGTTAGGATCCTG CAATTGGTACAAGGCGTACAACCAATCCTAGGAC (BamHI)

(lld),

worin A, T, G, C die unter Fomel I angegebenen Bedeutungen haben und zum besseren Verständnis die Aminosäuren, für die jedes Triplett kodiert, und die Schnittstellen für die Restriktionsenzyme angegeben sind.

Weiterhin umfaßt die Erfindung doppelsträngige DNA-Fragmente von Eglin-Genen, deren Enden durch Restriktionsenzyme geschnitten und die zu vollständigen Eglin- oder modifizierten Eglin-Genen zusammengesetzt werden können. Solche doppelsträngigen DNA-Fragmente von Eglin-Genen haben insbesondere 30 bis 70 Basenpaare.

Beispielsweise umfaßt die Erfindung die DNA-Fragmente der Formel lila [F₁(C)LdIe DNA der Formel lila' [F₁(C)], die DNA der Formel IHa" [F₁(C")], die DNA der Formel III b [F₁(B)] und die DNA der Formel IV (F₂):

MetThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrVal CTGGAATTCATGACTGAATTTGGTTCTGAACTGAAATCTTTCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT GACCTTAAGTACTGACTTAAACCAAGACTTGACTTTAGAAAGGGTCTTCAACAACCATTTTGACAA

AspGlnAlaArgGluTyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAspValTyrPheLeuPro GACCACGCTCGTGAATACTTCACTCTGCATTACCCGCAGTACGACGTTTACTTCCTGCCGG CTGGTCCGACCACTT ATGAAGTGAGACGTAATGGGCGTCATGCTGCAAA^CWAGGACGGCC F₁(C)(IIIa)

MetSerGluLeuLysSerPheProGiuValValGlyLysThrVAI CTGGAATTCATGTCTGAACTGAAATCTTTCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT GACCTTAAGTACAGACTTGACTTTAGAAAGGGTCTTCAACAACCATTTTGACAA

AspGlnAlaArgGluTyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAspValTyrPheLeuPro GACCAGGCTCGTGAATACTTCACTCTGCATTACCCGCAGTACGACGTTTACTTCCTGCCGG CTGGTCCGAGCACTTATGAAGTGAGACGTAATGGGCGTCATGCTGCAAATGAAGGACGGCC F₁(C)(IIIa')

MetLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrVal CTGGAATTCATGCTGAAATCTTTCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT GACCTTAAGTACGACTTTAGAAAGGGTCTTCAACAACCATTTTGACAA

AspGinAlaArgGluTyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAspValTyrPheLeuPro GACCAGGCTCGTGAATACTTCACTCTGCATTACCCGCAGTACGACGTTTACTTCCTGCCGG CTGGTCCGAGCACTTATGAAGTGAGACGTAATGGGCGTCATGCTGCAAATGAAGGACGGCC F₁(C)(IIIa")

MetThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrVal

CTG G AATTC ATG ACTG AATTTG GTTCTG AACTG AAATCTTTCCC AG AAGTTGTTG GTAAAACTGTT GACCTTAAGTACTGACTTAAACCAAGACTTGACTTTAGAAAGGGTCTTCAACAACCATTTTGACAA

AspGlnAlaArgGluTyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAspValHisPheLeuPro

gaccaggctcgtgaatacttcactctgcattacccgcagtacgacgttcatttcctgccgg ctggtccgagcacttatgaagtgagacgtaatgggcgtcatgctgcaagtaaaggacggcc F₁(B)(IIIb)

ProGluGlySerProValThrLeuAspLeuArgTyrAsnArgValArgValPheTyrAsnProGly CCGGAAG GTTCTCCTGTTACTCTG G ACCTG CGTTACAACCGTGTTCGTGTTTTCTAC AACCCAG GT GGCCTTCCAAGAGGACAATGAGACCTGGACGCAATGTTGGCACAAGCACAAAAGATGTTGGGTCCA

ThrAsnValValAsnHisValProHisValGlyNON ACTAACGTTGTTAACCATGTTCCGCATGTTGGTTAGGATCCTG TGATTG CAACAATTGGTACAAG G CGTACAACCAATCCTAG G AC F₂ (IV)

Die Erfindung umfaßt auch einsträngige DNA-Fragmente von Eglin- und modifizierten Eglin-Genen, insbesondere solche, die sich durch chemische und/oder enzymatische Methoden zu Eglin- bzw. modifizierten Eglin-Genen zusammenfügen lassen. In erster Linie betrifft die Erfindung einsträngige DNA-Fragmente mit mehr als zwanzig Nukleotiden, insbesondere mit 20 bis 70 Nukleotiden.

In allererster Linie betrifft die Erfindung die in den Beispielen beschrieben einsträngigen und doppelsträngigen DNA-Fragmente.

Methoden der Synthese von DNA sind von S.A. Narang (11) zusammenfassend dargestellt worden. Die bekannten Synthesetechniken erlauben die Herstellung von Polynukleciiden mit einer Länge von gegen 20 Basen in guter Ausbeute, hoher Reinheit und in verhältnismäßig kurzer Zeit. Geeignet geschützte Nukleotide werden durch die Phsophodiestermethode (12), die noch effizientere Phosphotriestermethode (13) oder Phosphit-Triestermethode (14) miteinander verknüpft. Eine Vereinfachung der Synthese der Oligo- und Polynukleotide wird mit der der Festphasen-Methode ermöglicht, bei der die Nukleotidketten an ein geeignetes Polymer gebunden sind. Itakura et al. (15) verwenden bei der Festphasen-Synthese anstelle einzelner Nukleotide durch Phosphotriester-Methode geknüpfte Trinukleotide, die so in kurzer Zeit und guten Ausbeuten beispielsweise zu einem Polynukleotid mit 31 Basen kondensiert werden können. Die eigentliche doppelsträngige DNA kann aus chemisch hergestellten kurzen Segmenten enzymatisch aufgebaut werden. Khorana et al. (16) verwenden dazu überlappende Polynukleotid-Sequenzen aus beiden DNA-Strängen, die durch Basen-Paarung in richtiger Anordnung zusammengehalten und dann durch das Enzym DNA-Ligase verknüpft werden. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, je eine Polynukleotid-Sequenz aus den beiden DNA-Strängen mit einem kurzen überlappenden Segment in Gegenwart der vier benötigten Desoxynukleosid-Triphosphate mit einer DNA-Polymerase, z. B. DNA-Polymerase I, Klenow-Fragment der Polymerase I, T₄ DNA-Polymerase, oder mit AMV (avian myeloblastosis virus) reverse Transcriptase, zu inkubieren. Dabei werden durch Basenpaarung die beiden Polynukleotid-Sequenzen in der richtigen Anordnung zusammengehalten und durch das Enzym mit den benötigten Nukleotiden zu einer vollständigen doppelsträngigen DNA ergänzt (17). Itakura et al. (18) beschreiben, wie basierend auf diesem Prinzip in Gegenwart von DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) aus 4 chemisch synthetisierten Fragmenten einer Länge von 39 bis 42 Basen ein 132 Basen-Paare langes Segment des humanen Leukozyten-Interferon a₂-Gens aufgebaut werden kann, wobei 40% Einsparung an chemischer Synthese gegenüber der Methode, die nur Ligase verwendet, erzielt werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft vor allem ein Verfahren zur Herstellung von DNAs, welche für Egline oder modifizierte Egline kodieren, die für eine Expression in Wirtszellen geeignet sind und deren Enden einen Einbau in Vektoren ermöglichen, und von Fragmenten davon, dadurch gekennzeichnet, daß

a) ein geeignet geschütztes Desoxynukleosid an einen festen Träger gebunden wird,

b) geeignet geschützte Di-, Tri-oder Tetranukleotide nach der Phosphotriester-oder Phosphit-Methode hergestellt werden,

c) ein an den Träger gebundenes Desoxynukleosid oder Oligodesoxynukleotid mit geeignet geschützten Mono- oder (gemäß b) hergestellten) Di-, Tri- oder Tetranukleotiden г - h der Phosphotriester- oder der Phosphit-Methode verknüpft wird,

d) nach c) erhältliche, an Träger gebundene Oligodesoxynukleotide mit einer Länge zwischen etwa 20 und etwa 70 Basen vom Träger abgespalten, gegebenenfalls gereinigt, von Schutzgruppen befreit und die freien 5'-terminalen Hydroxygruppen phosphoryliert werden,

el) 2 Oligodesoxynukleotide einer Länge von je etwa 20 bis etwa 70 Basen aus dem kodierenden und aus dem komplementären Strang und mit mindestens3, vorzugsweise 8bis 15, überlappenden Basenpaaren annelliert und mit einer DNA-Polymerase in Gegenwart der vier Desoxynukleos d-Triphosphatezu doppelsträngigen DNA-Segmenten (Fragmenten des Eglin-oder modifizierten Eglin-Gens) erganztwerden,

und gegebenenfalls 2 doppelsträngige DNA-Segmente mit geeigneten gemäß d) phosphorylierten Enden mit einer Ligase zum Strukturgen des Eglins oder des modifizierten Eglins verknüpft werden, oder 2 erhältliche doppelsträngige DNA-Segmente in geeignete Vektoren subkloniert, anschließend gemäß d) phosphoryliert und mit einer Ligase zum Strukturgen des Eglins oder modifizierten Eglins verknüpft werden, oder

e2) alternativ je 2 Oligodesoxynukleotide aus dem kodierenden und aus dem komplementären Strang mit einer Länge von z. B. 20 bis 70 Basen und mit je mindestens 3, vorzugsweise 8 bis 15, überlappenden Basenpaaren annelliert, mit einer

DNA-Polymerasein Gegenwart der vier Desoxynukleosid-Triphosphate aufgefüllt und mit Ligase zum Strukturgen des Eg I ins oder des modifizierten Eg I ins verknüpft werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist an sich bekannt, ermöglicht aber erst durch geeignete Kombination der Bedingungen und erfindungswesentliche Verbesserungen die Herstellung von für Eglin kodierenden DNAs.

In Schritt a) können eine Vielzahl von festen Trägermaterialien, wie Polystyrol verschiedener Vernetzung und Quellfähigkeit, Polyacrylamide, Polyacrylamid-Copolymere, auf anorganisches Material wie Kieseiguhr, Kieselgel oder Alox aufgezogene Polyamide oder funktionalisierte Silane, verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden als feste Trägermaterialien quervernetzte Polystyrole eingesetzt, die über „Spacer", wie Alkylen-Gruppen mit 2 bis 12 C-Atomen unterbrochen von 1 bis 5 polaren zweiwertigen funktionellen Gruppen, wie Imino, Oxo, Thio, Oxocarbonyl oder Amidocarbonyl, auf an sich bekannte Weise mit der 5'-OH-Gruppe geeignet geschützter Desoxynukleoside verknüpft werden. Besonders bevorzugt ist die Reaktion von in 5'-Stellung und gegebenenfalls im Basenteil geschützten Nukleosiden der Formel V, worin R¹ eine durch Säure abspaltbare Schutzgruppe, wie eine Triarylmethylschutzgruppe, beispielsweise eine 4-Methoxytrityl-oder eine 4,4'-Dimethoxytritylgruppe, oder eine Triniederalkylsilylschutzgruppe, beispielsweise eine tert.-Butyldimethylsilylgruppe, und worin B eine gegebenenfalls geschützte Base ausgewählt aus Thymyl, Cytosyl, Adenyl oder Guanyl bedeutet, mit Bernsteinsäureanhydrid, gegebenenfalls in Gegenwart von Basen, wie Pyridin. Triethylamin oder Dimethylaminopyridin, gefolgt von der Reaktion mitaminomethyliertem Polystyrol, das durch 0,5 bis 2% Divinylbenzol quervernetzt ist, mit Hilfe von den Carbonsäure-Rest aktivierenden Reagentien, vorzugsweise N-Hydroxysuccinimid, oder p-Nitrophenol und wasserentziehenden Mitteln, wie Carbodiimiden, beispielsweise Dicyclohexylcarbodimid (Schema 1). Die Umsetzung erfolgt in einem inerten nicht-protischen Lösungsmittel, z. B. Pyridin, Tetrahydrofuran, Dioxan, Essigsäureethylester, Chloroform, Methylenchlorid, Dimethylformamid oder Diethylacetamid oder in Mischungen davon, bei Raumtemperatur oder leicht erhöhter oder erniedrigter Temperatur, z. B. in einem Temperaturbereich von ca. — 10°C bis ca. 5O⁰C, bevorzugt bei Raumtemperatur, die Umsetzung in Gegenwart des wasserentziehenden Mittels auch bei niedrigerer Temperatur, z.B. bei ca. O⁰C.

Schema 1

R¹O

-OCCEL CH₀COOH

(V)

1. HO-N

/ \ 2. H₀NCH₀-* »-Polystyrol

^{2 2} \ /

RO

-OCCH₀CH₀CNHCh,,-*

-Polystyrol

Bei der erfindungsgemäßen Herstellung von Di-, Tri- oderTetranukleotiden gemäß Schritt b) werden in 5'-Stellung und gegebenenfalls im Basenteil geschützte Nukleoside der Formel V, worin R¹ und B die oben angegebenen Bedeutungen haben, mit aktivierten Phosphorestern der Formel VII, worin X¹ und X² unabhängig voneinander Hydroxy oder davon abgeleitete Salze, Halogen, Imidazolyl, i^^-Triazol-i-y^Tet^azolyl oder 1-Benztriazolyioxy und X² zusätzlich auch 2-Cyanoethyloxy, 2-Trihalogenethyloxy, 2-Arylsulfonylethyloxy, 2-Niederalkylthioethyloxy, 2-Arylthioethyloxy oder 2-(4-Nitrophenyl)-ethyloxy und R² eine durch Base oder Nukleophile, wie Ammoniumhydroxid, Thiophenolat oder ein Arylaldoximat, abspaltbare Schutzgruppe, wie gegebenenfalls durch Halogen, Nitro und/oder Niederalkyl substituiertes Phenyl, Methyl oder gegebenenfalls durch Nitro substituiertes Benzyl, oder eine durch Metallionen abspaltbare Schutzgruppe, wie 8-Chinolyl oder Б-СЫого-в-сЫпоІуІ, bedeutet, gegebenenfalls in Gegenwart von wasserentziehenden Mitteln oder in Gegenwart von Basen umsetzt.

Anschließend wird eine dermaßen gebildete Verbindung der Formel VIII, worin R¹, X² und R² die oben angegebenen Bedeutungen haben, zuerst gegebenenfalls mit einem 2-substituierten Ethanol umgesetzt, das den Rest X² in eine Gruppe OR³ umwandelt, worin R³ Cyanoethyl, 2-Trihalogenethyl, 2-Arylsulfonylethyl, 2-Niederalkylthioethyl, 2-Arylthioethyl oder 2-(4-Nitrophenyl)-ethy! bedeutet, und dann die Schutzgruppe R¹ abgespalten, und die dermaßen hergestellte Verbindung der Formel IX mit einer andern Verbindung der Formel VIII, gegebenenfalls in Gegenwart von wasserentziehenden Mitteln oder in Gegenwart von Basen, zu einem Dinukleotid X umgesetz (Schema 2). Gegebenenfalls wird eine Verbindung der Formel VIII durch Reaktion mit Basen und Wasser in eine andere Verbindung der Formel VIII, worin X² Hydroxy oder davon abgeleitete Salze bedeutet, umgewandelt.

Die Umsetzungen erfolgen in einem der oben genannten inerten Losungsmittel bei Raumtemperatur oder leicht erhöhter oder erniedrigter Temperatur, z. B. bei Raumtemperatur.

Die Abspaltung der Schutzgruppe R¹ wird z. B. mit Hilfe von Säuren, wie Mineralsäuren, z. B. Salzsäure oder Schwefelsäure, Carbonsäure^. B. Essigsäure, Trichloressigsäure oder Ameisensäure, Sulfonsäuren. B. Methan-oder p-Toluolsulfonsäure, oder insbesondere Lewis-Säure, z. B. Zinkchlorid, Zinkbromid, Aluminiumchlorid, Dialkylaluminiumhalogenid, z. B. Dibutyl- oder Diethylaluminiumchlorid, oder Bortrifluorid, bei 10°C bis 5O⁰C, insbesondere bei Raumtemperatur, durchgeführt. Bei Verwendung eines Dialkylaluminiumhalogenid erfolgt die Abspaltung in einem lipophilen Lösungsmittel, insbesondere in Toluol, und bei Verwendung einer anderen der genannten Lewis-Säuren in einem Lösungsmittelgemisch, bestehend aus einem Halogenkohlenwasserstoff, z. B. Methylenchlorid, und einem Niederalkanol, z. B. Ethanol oder Isopropanol.

Schema 2

RO

-OH + X-P-X-

• OR²

r VII

RO

-0-P-X I 2

OR

VIII

HO

-O-P-OR"

OR

IX

VIII + IX

RO

-O-P

RO 0

-0-P-OR³

I 2 OR

Die erfindungsgemäße Herstellung von Dinukleotiden der Formel X umfaßt auch die Reaktion von Nukleosiden der Formel V, worin R¹ und B die oben angegebenen Bedeutungen haben, mit Phosphiien der Formel VIIA, worin X¹ Halogen, insbesondere L-nior, X² Halogen, insbesondere Chlor, oder Diniederalkylamino, in^cb sondere Dimethylamino oder Diisopropylamino, cder Morpholino, Piperidino oder Pyrrolidino, bedeuten und R² die für VII oben angegebene Bedeutung, insbesondere Methyl, hat, gegebenenfalls in Gegenwart einer geeigneten Base. Die erfindungsgemäß erhältlichen Verbindungen der Formel VIII A werden einerseits mit einem 2-substituierten Ethanol umgesetzt, das den Rest X² in eine Gruppe OR³ umwandelt, worin R³ die oben angeführten Bedeutungen hat, dann mit einem Oxidationsmittel, beispielsweise Jod in Gegenwart einer Base, zum Phosphat oxidiert und die Schutzgruppe R¹ abgespalten, wobei eine Verbindung der Formel IX entsteht, andererseits mit einer Verbindun der Formel IX umgesetzt, dann mit einem Oxidationsmittel, beispielsweise Jod in Gegenwart einer Base, zu einer Verbindung der Formel X oxidiert (Schema 3).

Schema 3 В

R¹O

т-ОН +

(V)

OR

(VIIA)

R¹O

-O-P-X I 2

\ (VIIIA)

OR

1. R OH

2. Oxidation

3. R entfernen

(IX)

1. IX

2. Oxidation

(X)

Zur erfindungsgemäßen Herstellung von Trinukleotiden wird in Dinukleotiden der Formel X, worin R¹, R² und R³ die oben angegebenen Bedeutungen haben und worin B¹ und B² unabhängig voneinander Thymyl, Cytosyl, Adenyl oder Guanyl bedeuten, die Schutzgruppe R¹ abgespalten und die erhaltene Verbindung mit einer Verbindung der Formel VIII, gegebenenfalls in Gegenwart von wasserentziehenden Mitteln oder in Gegenwart von Basen, oder mit einer Verbindung der Formel VIIIA und nachfolgender Oxidation umgesetzt, wobei eine Verbindung der Formel Xl entsteht (Schema 4). Die Abspaltung der Schutzgruppe R¹ und die Kondensation zu den Trinukleotiden der Formel Xl erfolgt in gleicher Weise, wie bei der Herstellung der Dinukleotide der Formel X beschrieben.

Schema 4

HO

-O-P

RO 0

VIII

-O-P-0R"

I 2 OR^

oder 1. VIIA

2. Oxidation

B"

R¹O

—0-P

₂I\

RO 0

-O-P

₂I\

RO 0

-0-P-OR

OR

(XI)

Zur erfindungsgei .4en Herstellung von Tetranukleotiden werden Trinukleotide der Formel XI so zur Reaktion gebracht, wie

oben für Dinukleotide der Formel X beschrieben.

In einer bevorzugten Ausfuhrung der Erfindung wird als Schutzgruppe R¹ die 4-Methoxytritylgruppe, als Schutzgruppe R² eine durch Chlor substituierte Phenylgruppe, insbesondere 2-Chlorphenyl, und als Schutzgruppe R³ die 2-Cyanoethylgruppe

verwendet. Bevorzugter Rest X¹ und X² in der Verbindung der Formel VII ist der 1-Benztriazolyloxy-Rest.

Trinukleotide der Formel Xl werden vorzugsweise hergestellt, indem in Dinukleotiden der Formel X die Schutzgruppe R¹

abgespalten und die erhaltene Verbindung mit Verbindungen der Forme! VIII, worin X² Hydroxy! oder davon abgeleitete Salze jedeutet, in Gegenwart eines wasserentziehenden Mittels umgesetzt wird (Schema 4). Erfindungsgemäße wasserentziehende Mittel sind beispielsweise 2,4,6-Trimethyl- oderTriisopropylbenzolsulfonyl-chlorid,-imidazolid, -tetrazolid oder-1,2,4-triazolid gegebenenfalls substituiert durch Nitro. Bevorzugtes wasserentziehendes Mittel ist2,4,6-Trimethylbenzolsulfonyl-3-nitro-1,2,4-

triazolid der Formel XII

N N0„

Λ/

-SO₂-N

(XII)

CH-

/ ³

си-/ ^Хч

CH₃

Vorzugsweise werden Nukleoside eingesetzt, deren freie Aminogruppe im Basenteil geschützt ist. Bevorzugte Schutzgruppen sind Benzoyl für Adenin, Benzoyl oder 4-Methoxybenzoyl für Cytosin, Isobutyryl oder Diphenylacetyl für Guanin. Thymin wird vorzugsweise ohne Schutzgruppe eingesetzt.

Bei der erfindungsgemäßen Herstellung von Oligonukleotiden gemäß Schritt c) wird eine an sich bekannte Apparatur mit halbautomatischem oder vollautomatischem, mikroprozessorgesteuertem Zuführungssystem für Lösungsmittel und Reagentien verwendet. In einer gemäß Schritt a) hergestellten Verbindung der Formel Vl wird die Schutzgruppe R¹, wie oben beschrieben, abgespalten und anschließend entweder mit einer Verbindung der Formel VIII, oder mit einer Verbindung der Formel VIIIA, oder mit einer Verbindung der Formel X oder Xl, in der vorgängig die Schutzgruppe R³ mit Basen abgespalten worden ist {eine Gruppe 2-Cyanoethyl als R₃ beispielsweise mit einem Triniederalkylamin, z. B. Triethylamin, in einem der oben genannten inerten Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische bei 10°C bis 4O⁰C, insbesondere bei Raumtemperatur), gegebenenfalls in Gegenwart eines wasserentziehenden Mittels oder in Gegenwart einer Base umgesetzt. Die Erfindung umfaßt auch Reaktionen, bei denen anstelle eines Dinukleotids der Formel X oder eines Trinukleotids der Formel Xl ein gemäß Schritt (b) hergestelltesTetranukleotid eingesetzt wird. Wird ein Phosphit der Formel VIIIA verwendet, so wird anschließend mit einem Oxidationsmittel, beispielsweise Jod in Gegenwart einer Base, nachbehandelt. Die dermaßen hergestellte Verbindung der Formel XIII, worin R¹, R² und B die oben angegebenen Bedeutungen haben und η eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist, wird so oft den für die Verbindung der Formel Vl beschriebenen Reaktionsschritten (Abspaltung von R¹, Reaktion mit VIII, VIIIA, X, Xl oder dem entsprechenden Tetranukleotid, gegebenenfalls mit oxidativer Nachbehandlung) unterworfen, bis eine Verbindung der Formel XIII entsteht, in der η eine beliebige ausgewählte Zahl zwischen etwa 19 und etwa 69 ist.

R¹O

-O-P R²O 0

-OCCh₀CH₀CNHCH₀

Il ^{2 2}Ii ²

Polystyrol

XIII

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird als Schutzgruppe R¹ 4-Methoxytrityl verwendet und die Abspaltung mit Zinkbrom id in Gegenwart einer CH-oder NH-aciden Verbindung, insbesondere 1,2,4-Triazol oder Tetrazol, durchgeführt. Die Verwendung von z. B. 1,2,4-Triazol bei der Abspaltung der 4-Methoxytrity!-Schutzgruppe ist neu und führt überraschenderweise dazu, daß die Abspaltung schnell, mit hohen Ausbeuten und ohne Nebenreaktionen abläuft. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von Zinkbromid und 1,2,4-Triazol in einem molaren Verhältnis zwischen 20:1 und 100:1 in einem Lösungsmittelgemisch bestehend aus einem aprotischen Losungsmittel und einem Alkohol, beispielsweise Methylenchlorid und 2-Propanol.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine Verbindung der Formel Vl oder der Formel XlII, in der dib Schutzgruppe R¹ abgespa ,en worden ist, mit einem Tnr.ukleotid der Forme: Xl, in dem die Schutzgruppe R³ abgesps'+e 'worden ist, umgesetzt in Gegenwart eines wasserentziehenden Mittels, wie beispielsweise 2,4,6-Trimethyl- oder Triisopropylbenzolsulfonyl-chlorid, -imidazolid, -tetrazolid oder-1,2,4-triazolid gegebenenfalls substituiert durch Nitro. Besonders bevorzugt ist 2,4,6-Trimethylbenzolsulfonyl-3-nitro-1,2,4-triazolid der Formel XII.

Die besonders bevorzugte Kombination, darin bestehend, daß als Schutzgruppe R¹ die 4-Methoxytritylgruppe verwendet, zur Abspaltung von R¹ Zinkbromid in Gegenwart von 1,2,4-Triazol eingesetzt und als wasserentziehendes Mittel für die Reaktion von entschütztem Oligonukleotid-Polystyrol-Harz der Formel XIU mit einem entschütztem Trinukleotid der Formel Xl das Triazolid der Formel XlI verwendet wird, ermöglichtes, daß überraschenderweise auch lange Nukleotidketten mit etwa 40 bis etwa 70 Basen in kurzerZeit, in hohen Ausbeuten und mit hoher Reinheit hergestellt werden können.

Zur erfindungsgemäßen Abspaltung der Oligodesoxynukleotide vom Träger und zur Entfernung der Schutzgruppen gemäß Schritt d) werden an sich be'-.nnte Verfahren verwendet. Besonders bevorzugtes Reagens zur Abspaltung vom Träger und zur Entfernung der bevorzugten 2-Chlorphenyl-Schutzgruppe ist ein Arylaldoximat, beispielsweise das 1,1,3,3-Tetramethylguanidinium-2-nitrobenzaldoximat. Die Reaktion erfolgt in einem der oben genannten inerten Lösungsmittel, dem

etwas Wasser beigefügt wird, ζ. B. in 95%igem Pyridin, bei Raumtemperatur. Anschließend wira mit wäßrigem Ammoniak bei Raumtemperatur oder erhöhter Temperatur/z. B. bei 2O⁰C bis 70⁰C, insbesondere bei 50°C, umgesetzt. Zur Ligation der erfindungsgemäßen Oligodesoxynukleotide wird an der 5'-terminalen Hydroxygruppe ein Phosphatrest eingeführt. Die Einführung des Phosphatrestes (Phosphorylierung) erfolgt in an sich bekannter Weise mit Hilfe von T₄ Polynucleotid-Kinase in Gegenwart von ATP.

Erfindungsgemäß hergestellte Oligodesoxynukleotide aus dem kodierenden und aus dem komplementären DNA-Strang enthalten überlappende Sequenzen, bestehend aus mindestens 3, vorzugsweise 8 bis 15 überlappende Basenpaaren. Solche Oligodesoxynukleotid-Paare werden beim Mischen durch Wasserstoffbrückenbindung zusammengehalten. Die überhängenden einsträngigen Enden dienen gemäß Schritt el) und e2) als Matrix (Templat) für den Aufbau des zweiten (komplementären) Stranges durch eine DNA-Polymerase, z.B. DNA-Polymerase I, Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I oderT₄ DNA-Polymerase oder mit AMV reverse Transcriptase, in Gegenwart der vier Desoxynukleosid-Triphosphate (dATP, dCTP, dGTP und TTP). Die bei der Komplementierung entstehenden Duplex-DNAs, bei denen es sich insbesondere um Fragmente des (modifizierten) Eglin-Gens (Verfahren el) oder um das komplette (modifizierte) Eglin-Gen (Verfahren e2) handelt, besitzen flache Enden.

Die gemäß Verfahrensschritt el) erhältlichen Fragmente des (modifizierten) Eglin-Gens erhalten an den Enden Nukleotidsequenzen, die von Restriktionsendonucleasen erkannt und gespalten werden können. Je nach Wahl der Nukleotidsequenzen und dementsprechend der Restriktionsendonucleasen entstehen bei der Spaltung vollständig basengepaarte (flache) Enden („blunt ends") oder Enden mit einem überhängenden DNA-Strang („staggered ends"). Die Restriktions-Erkennungssequenzen werden so gewählt, daß die Ligation der DNA-Fragmente, die mit einer flache Enden bildenden Restriktionsendonuclease behandelt worden sind, bzw. die Basenpaarung der kohäsiven Enden und die anschließende Ligation von DNA-Fragmenten mit überhängenden DNA-Strängen das vollständige (modifizierte) Eglin-Strukturen ergibt. Die Ligierung zweier doppeisträngiger DNA-Fragmente erfordert eine 5'-terminale Phosphatgruppe am Donor-Fragment und eine freie З'-terminale Hydroxygruppe am Akzeptor-Fragment. Die anfallenden DNA-Fragmente sind bereits 5'-terminal phosphoryliert und werden in an sich bekannter Weise mit einer Ligase, insbesondere T₄ DNA-Ligase, verknüpft.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden auf dem beschriebenen Wege zwei Fragmente des Eglin C-oder G-Gens, im Falle des Eglin C-Gens insbesondere die Fragmente F₁(C) und F₂ gemäß Formel IM a bzw. IV, und im Falle des Eglin B-Gens insbesondere die Fragmente F₁(B) und F₂ gemäß Formel IHb bzw. IV, hergestellt. Die Fragmente, welche erforderlichenfalls in einem geeigneten Vektor subkloniert werden können, enthalten vorzugsweise an den Verknüpfungsenden jeweils die Erkennungssequenz für eine Restriktionsendonuklease, insbesondere Hpall, weswegen nach Spaltung mit besagtem Restriktionsenzym und Ligation der beiden Fragmente die korrekt kodierende Eglin-DNA-Sequenz entsteht. Zusätzlich enthält das Teilstück 1 vor dem Translationsstartsignal (ATG) und das Teilstück 2 nach dem Translationsstopsignal (z.B. TAG) zusätzlich „terminale" Restriktionsstellen, die den Einbau des (modifizierten) Eglin-Gens bzw. der (modifizierten) Eglin-Gen-Teilstücke in einen geeigneten Vektor erlauben.

Insbesondere betrifft die Erfindung die Herstellung des Eglin C-Gens in zwei Teilstücken F₁(C) und F₂ der Formel IMa bzw. IV, welche nach Schneiden mit dem Restriktionsenzym Hpall und Ligation die korrekte Eglin C-DNA-Sequenz ergeben und worin F₁(C) vor dem Translationsstartsignal eine EcoRI-Restriktionsstelle und F₂ nach dem Translationsstopsignal eine BamHI-Restriktionsstelle aufweist.

In einer anderen Ausführungsform (Schritt e2) werden je zwei Oligodesoxynukleotide, die alternativ aus dem kodierenden und aus dem komplementären Strang stammen, mittels mindestens 3, vorzugsweise 8 bis 15 komplementären Basen annelliert, mit einer DNA-Polymerase, z. B. eine der oben genannten, aufgefüllt und mit T₄ DNA-Ligase zum (modifizierten) Eglin-Strukturgen ligiert.

Herstellung von Expressionsvektoren, welche ein Eglin-Gen enthalten

Die Erfindung betrifft weiterhin Expressionsvektoren, welche eine für ein Eglin oder für ein modifiziertes Eglin kodierende DNA-Sequenz enthalten, die von einer Expressionskontrollsequenz derart reguliert wird, daß in einem mit diesen Expressionsvektoren transformierten Wirt Polypeptide mit Eglin-Aktivität exprimiert werden.

Die Expressionsvektoren gemäß vorliegender Erfindung enthalten eine für Eglin B, modifiziertes Eglin B, modifiziertes Eglin C oder insbesondere Eglin C kodierende Sequenz.

Die Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung werden z. B. hergestellt, indem man in eine Vektor-DNA, welche eine Expressionskontrollsequent enthält, eine für ein Eglin oder ein modifiziertes Eglin kodierende DNA-Sequenz derart einfügt, daß die Expressionskontrollsequenz besagte DNA-Sequenz reguliert.

Die Wahl eines geeigneten Vektors ergibt sich aus den zur Transformation vorgesehenen Wirtszellen. Geeignete Wirte sind beispielsweise Mikroorganismen, wie Hefen, z. B. Saccharomyces cerevisiae, und insbesondere Bakterienstämme, die über kein Restrikions- oder Modifikationsenzym verfugen, vor allem Stämme von Escherichia coli, z. B. E.coli X1776, E.coli HB101, E.coli W310, E.coli HB101/LM1035, E.coli JA22K37) oder E.coli KI2 StS- η 294, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus,Pseudomonas, Haemophilus, Streptococcus und andere, ferner Zellen höherer Organismen, insbesondere etablierte humane oder tierische Zellinien. Bevorzugt als Wirtsmikroorganismus sind die genannten Stämme von E.coli, z.B. E.coli HB101 und

E. coli JA221, ferner Saccharomyces cerevisiae.

Grundsätzlich sind alle Vektoren geeignet, welche die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen in dem gewählten Wirt replizieren und exprimieren.

Beispiele für Vektoren, die zur Expression eines Eglin- oder modifizierten Eglin-Gens in einem E.coli-Stamm geeignet sind, sind Bacteriophagen^. B. Derivate des Bacteriophac m λ, oder Plasmide, wie insbesondere das Plasmid colEI und seine Derivate, z. B.

pMB9, pSF2124, pBR317 oder pBR322. Die bevorzugten Vektoren der vorliegenden Erfindung leiten sich von Plasmid pBR322 ab.

Geeignete Vektoren beinhalten ein vollständiges Replicon und ein Markierungsgen, welches die Selektion und Identifizierung der mit den Expressionsplasmiden transformierten Wirte auf Grund eines phänotypischen Merkmals ermöglicht. Geeignete Markierungsgene verleihen dem Wirt beispielsweise Resistenz gegenüber Schwermetallen, Antibiotika und dergleichen.

Weiterhin enthalten bevorzugte Vektoren der vorliegenden Erfindung außerhalb der Replicon- und Markierungsgen-Regionen Erkennungssequenzen für Restriktionsendonucleasen, so daß an diesen Stellen das Eglin-Gen und gegebenenfalls die Expressions-Kontroüsequenz eingefügt werden können. Der bevorzugte Vektor, das Plasmid pBR322, enthält ein intaktes

Repiicon, gegen Tetracyclin und Ampicillin Resistenz verleihende Markierungsgene (tet^R und amp") und eine Reihe von nur einmal vorkommenden Erkennungssequenzen für Restriktionsendonucleasen, z. B. Pstl (schneidet im amp^R-Gen, das tet^R-Gen bleibt intakt), BamHI, Hindill, Sail (schneiden alle im tet^R Gen, das amp^R-Gen bleibt intakt), Nrul und EcoRI. Mehrere Expressionskontrollsequenzen können zur Regulation der Genexpression eingesetzt werden. Insbesondere werden Expressionskontrollsequenzen stark exprimierter Gene des zu transformierenden Wirtes verwendet. Im Falle von pBR322 als hybridvektor und E.coli als Wirtsmikroorganismus sind beispielsweise die Expressionskontrollsequenzen (welche unter anderem den Promotor und die ribosomale Bindungsstelle enthalten) des Lactoseoperons, Tryptophanoperons, Arabinoseoperons und dergleichen, des /3-Lactamasegens, die entsprechenden Sequenzen des Phage λΝ-Gens oder des Phage fd-Schichtproteingens und andere geeignet. Während der Promotor des /3-Lactamasegens (ß-lac-Gen) bereits im Plasmid pBR322 enthalten ist, müssen die übrigen Expressionskontrollsequenzen in das Plasmid eingeführt werden. Bevorzugtals Expressionskontrollsequenz in der vorliegenden Erfindung ist diejenige des Tryptophanoperons (trp po). Zur Replikation und Expression in Hefe geeignete Vektoren enthalten einen Hefe-Replikationsstart und einen selektiven genetischen Marker für Hefe. Hybridvektoren, die einen Hefe-Replikationsstart enthalten, z.B. das chromosomale autonom replizierende Segment (ars), bleiben nach der Transformation innerhalb der Hefezelle extrachromosomal erhalten und werden bei der Mitose autonom repliziert. Ferner können Hybridvektoren, die der Ηβίβ-2μ-Ρΐ33ηηία-0ΝΑ homologe Sequenzen enthalten, verwendet werden. Solche Hybridvektoren werden durch Rekombination innerhalb der Zelle bereits vorhandenen 2/j.-Plasmiden einverleibt oder replizieren autonom. 2/x-Sequenzen sind besonders für Plasmide mit großer Transformationshäufigkeit geeignet und gestatten eine hohe Kopienzahl. Geeignete Markierungsgene für Hefe sind vor allem solche, die dem Wirt antibiotische Restistenz verleihen oder, im Fall von auxotrophen Hefemutanten, Gene, die Wirtsdefekte komplementieren. Entsprechende Gene verleihen z. B. Resistenz gegen das Antibiotikum Cycloheximid oder sorgen für Prototrophie in einer auxotrophen Hefemutante, z.B. das URA3-, L.EU2-, HIS3- oder vor allem dasTRPI-Gen. Vorzugsweise enthalten Hefe-Hybridvektoren weiterhin einen Replikationsstart und ein Markierungsgen für einen bakteriellen Wirt, insbesondere E. coli, damit die Konstruktion und die Kionierung der Hybridvektoren und ihrer Vorstufen in einem bakteriellen Wirt erfolgen kann. Für die Expression in Hefe geeignete Expressionskontrollsequenzen sind beispielsweise diejenigen des TRP1-, ADHI-, ADHlI-, PHO3- oder PHO5-Gens, ferner im glykolytischen Abbau involvierte Promoter, z. B. der PGK- und der GAPDH-Promoter.

Insbesondere betrifft die Erfindung zur Replikation und phänotypischen Selektion befähigte Expressionsvektoren, welche eine Expressionskontrollsequenz und eine für ein Eglin oder ein modifiziertes Eglin kodierende DNA-Sequenz enthalten, wobei besagte DNA-Sequenz mitsamt Transkriptionsstartsignal und -terminationssignal sowieTranslationsstartsignal und -stopsignal in besagtem Expressionsplasmid unter Regulation besagter Expressionskontrollsequenz so angeordnet ist, daß in einem mit besagtem Expressionsplasmid transformierten Wirt Polypeptide mit Eglin-Aktivität exprimiert wird. Um eine effektive Expression zu erreichen, muß das Strukturgen richtig (in „Phase") mit der Expressionskontrollsequenz angeordnet sein. Es ist vorteilhaft, die Expressionskontrollsequenz in den Bereich zwischen dem Haupt-mRNA-Start und dem ATG der Genkodiersequenz, welche natürlich mit der Expressionskontrollsequenz verknüpft ist (z. B. die ß-lac-Kodiersequenz bei Verwendung des ß-lac-Promotors), mit dem Eglin-(bzw. modifiziertes Eglin-)-Gen, welches vorzugsweise sein eigenes Translationsstartsignal (ATG) und Translationstopsignal (z. B TAG) mitbringt, zu verknüpfen. Dadurch wird eine effektive Transkription und Translation gewährleistet.

Beispielsweise wird ein Vektor, insbesondere pBR322, mit einer Restriktionsendonuclease geschnitten und, gegebenenfalls nach Modifikation des so gebildeten linearisierten Vektors, eine mit entsprechenden Restriktionsenden versehene Expressionskontrollsequenz eingefügt. Die Expressionskontrollsequenz enthält am З'-Ende (in Translationsrichtung) die Erkennungssequenz einer Restriktionsendonuclease, so daß der die Expressionskontrollsequenz bereits enthaltende Vektor mit besagtem Restriktionsenzym verdaut und das mit passenden Enden versehene Eglin- (oder modifizierte Eglin-) Strukturgen eingesetzt werden kann. Dabei entsteht ein Gemisch von zwei Hybridplasmiden, welche das Gen in richtiger bzw. in falscher Orientierung enthalten. Vorteilhaft ist es, den die Expressionskontrollsequenz bereits enthaltenden Vektor noch mit einer zweiten Restriktionsenduclease innerhalb der Vektor-DNA zu spalten und in das entstandene Vektor-Fragment das mit richtigen Enden versehene Strukturgen einzusetzen. Alle Operationen am Vektor erfolgen vorzugsweise in einer Weise, daß die Funktion des Replicons und zumindest eines Markierungsgens nicht beeinträchtigt wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein von pBR322 abgeleiteter Vektor, welcher ein Expressionskontrollsequenz, insbesondere diejenige vom Tryptophan-Operon (trp po), enthält, die am З'-Ende (zwischen dem Haupt-mRNA-Start und dem ersten ATG) die Erkennungssequenz für eine, vorzugsweise kohäsive Enden bildende, Restriktionsendonuclease, z. B. EcoRI, trägt, mit der genannten Restriktionsendonuclease und im Vektor-DNA-Teil mit einer zweiten Restriktionsendonuclease, welche flache oder bevorzugt kohäsive Enden bildet, z. B. BamHI, verdaut, wonach der so linearisierte Vektor mit dem entsprechende Enden aufweisenden Eglinfoder modifzierten Eglin-)Gen (z. B. mit einem EcoRI-Ende vor dem ATG-Start und einem BamHI-Ende nach dem Translations-Codon) verknüpft. Die Verknüpfung erfolgt in bekannter Weise durch Paarung der komplem ^ntären (kohäsiven) Enden und Ligierung, z. B. mit T^DNA-Ligase.

Das über den rrRNA-Weg, aus genomischer DNA oder synthetisch gewonnene, mit entsprechenden kohäsiven (insbesondere EcoRI- und BamHI-) Enden versehene Eglin-(oder modifizierte Eglin-)Gen kann vor dem Einbringen in ein Expressionsplasmid auch in einen Vektor, z. B pBR322, kloniert werden, um größere Mengen an Strukturgen, beispielsweise für die Sequenzanalyse, zu gewinnen. Die Isolierung der Klone, welche das Hybridplasmid enthalten, wird beispielsweise mit einer Eglin-spezifischen, radioaktiv-markierten Oligodesoxy-nucleotid-Probe (siehe oben) durchgeführt. Die Charakterisierung des Eglin-(bzw. modifizierten Eglin-)Gens erfolgt beispielsweise nach dem Verfahren von Maxam und Gilbert (3).

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden zwei Teilstücke eines Eglin- oder modifizierten Eglin-Gens, beispielsweise zwei Teilstücke des Eglin C-Gens, synthetisiert. Teilstück 1, welches den 1 .Teil des Gens umfaßt, ent, lält vor dem ATG und am Ende jeweils die Erkennungssequenz für kohäsive Enden bildende Restriktionsendonucleasan, z. B. vor dem ATG EcoRI und am Ende Hpall. Teilstück 2, welches den hinteren Teil des Gens umfaßt, besitzt entsprechende Erkennungssequenzen, am Anfang z. B Hpall und nach dem Translationsstopsignal (z. B. TAG) BamHI. Die Teilstücke werden an den äußeren Erkennungssequenzen gespalten (Teilstück 1 z.B. mit EcoRI und Teilstück 2 entsprechend mit BamHI) und in einen entsprechend zugeschnittenen Vektor (z. B. pBR322) subkloniert. Die Identifizierung der Klone, welche die Teilstücke enthalten, und die Charakterisierung der Teilstücke erfolgt wie oben beschrieben. Die Teilstücke werden dann mit den entsprechenden

Restriktionsendonucleasen aus den Hybridvektoren herausgeschnitten (Teilstück 1 z. B. mit EcoRI und Hpall und Teilstücke 2 z. B. mit Hpall und BamHI) und über ihre kohäsiven Enden, insbesondere Hpall-Enden, ligiert, wobei das komplette Eglin-(bzw. modifizierte Eglin-)Gen entsteht, das wie angegeben in eine Vektor-DNA eingefügt wird.

Transformation der Wirtszellen

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines transformierten Wirtes, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Wirt mit einem Expressionsplasmid, das eine von einer Expressionskontrollsequenz regulierte, für ein Eglin oder für ein modifiziertes Eglin kodierende DNA-Sequenz enthält, transformiert.

Geeignete Wirte sind beispielsweise die oben genannten Mikroorganismen, wie Stämme von Saccaromyces cerevisiae. Bacillussubtilis und insbesondere Escherichia coli. Die Transformation mit den erfingungsgemäßen Expressionsplasmiden erfolgt beispielsweise wie in der Literatur beschrieben, so für S.cerevisiae (4), B.subtilis (5) und E.coli (6). Die Isolierung des transformierten Wirtes erfolgt vorteilhaft aus einem selektiven Nährmedium, dem das Bioeid zugesetzt wird, gegen welches das im Expressionsplasmid enthaltene Markierungsgen Resistenz verleiht. Wenn, wie bevorzugt, die Expressionsplasmide das amp^R-Gen enthalten, wird dem Nährmedium demgemäß Ampicillin zugesetzt. Zellen, welche das Expressionsplasmid nicht enthalten, werden in einem solchen Medium abgetötet.

Die Erfindung betrifft ebenfalls den auf dem genannten Weg erhältlichen transformierten Wirt.

Kultivierung des transformierten Wirtes und Gewinnung von Eglinen

Der transformierte Wirt kann zur Herstellung von Eglinen und modifizierten Eglinen verwendet werden. Das Verfahren zur Herstellung von Eglinen und modizierten Eglinen ist dadurch gekennzeichnet, daß der transformierte Wirt kultiviert und das Produkt aus den Wirtszellen freigesetzt und isoliert wird.

Überraschenderweise wurde jetzt gefunden, daß die erfindungsgemäßen, transformierten Wirte Gemische von Polypeptiden mit Eglin-Aktivität produzieren. Aus den Gemischen lassen sich natürliche Egline, Methionyl-egline und N-terminal acetylierte Egline isolieren. Transformierte Stämme von E.coli produzieren insbesondere Polypeptide mit Eglin-Aktivität, welche sich von den natürlichen Eglinen B und C durch einen N-Acetylrest an der N-terminalen Aminosäure Threonin unterscheiden, andere transformierte Wirte überwiegend die natürliche Egline und dritte drücken vor allem Polypeptide aus, welche exakt den in den Wirt eingeführten Eglin-DNAs entsprechen, d. h. als N-terminale Aminosäure Methionin aufweisen. Insbesondere ist die Produktion №-acetylierter Produkte überraschend. Die Produktion derartiger Polypeptide mittels gen-technologischer Methoden ist nämlich bisher noch nicht beobachtet worden. So wird selbst a-Thymosin, welches natürlich N-terminal acetyliert ist, von entsprechenden genetisch modifizierten Wirten in nichtacetylierter Form exprimiert (35).

Die Produktion N-terminal acetylierter Egline ist von großem Vorteil, weil solche Verbindungen eine erhöhte Stabilität gegenüber den in den Wirtszellen vorhandenen Aminopeptidasen besitzen, wodurch der (partielle) proteolytische Abbau ausgehend vom N-Terminus verhindert und infolgedessen die Ausbeute erhöht wird. Weiterhin wird dadurch das Reinigungsverfahren erheblich vereinfacht, weil die gewünschten Produkte nicht mit durch proteolytischen Abbau entstandenen Fragmenten verunreinigt sind.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Eglin-Verbindungen der Formel (Met)-B-ProGluValValGlyLysThrValAspGlnAlaArgGlu

TyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAspValWPheLeuProGluGlySerProValThrLeuAsp LeuArgTyrAsnArgValArgValPheTyrAsnProGlyThrAsnValValAsn-B'

(XIV),

worin B für eine direkte Bindung oder für einen Peptidrest steht, der 1-10 Aminosäurebausteine vom N-Terminus der natürlichen Egline umfaßt, z. B. ein solcher ausgewählt aus der Gruppe SerPhe-, LeuLysSerPhe-, SerGluLeuLysSerPhe-, PheGlySerGluLeuLysSerPhe-oderThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPhe-, und B'für keinen oder für einen Peptidrest steht, der 1-6 Aminosäurebausteine vom C-Terminus der natürlichen Egline umfaßt, z. B. ein solcher ausgewählt aus der Gruppe -HisVal, -HisValProHis oder -HisValProHisValGly, W Tyr oder His bedeutet, und r 0 oder 1 ist, wobei in Verbindungen der Formel XIV, worin rO ist, die N-terminale Aminosäure gegebenenfalls N-acetyliert ist, und von Salzen solcher Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß ein mit einem Expressionsplasmid, welches eine von einer Expressionskontrollsequenz regulierte, für ein Eglin kodierende DNA-Sequenz enthält, transformierter Wirt in einem flüssigen Nährmedium, welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, kultiviert wird und das Produkt aus den Wirtszellen freigesetzt und isoliert wird, oder zur Herstellung von Verbindungen der Formel XIV, worin r 0 ist und die N-terminale Aminosäure N-acetyliert ist, eine Verbindung der Formel XIV mit freier N-terminaler Aminogruppe acetyliert wird, und, falls gewünscht, eine erhältliche Eglin-Verbindung der Formel XIV in eine andere Eglin-Verbindung der Formel XIV überführt wird, und, falls erforderlich, ein verfahrensgemäß erhältliches Gemisch von Verbindungen der Formel XIV in die einzelnen Komponenten aufgetrennt wird, und/oder, falls gewünscht, ein erhaltenes Salz in das freie Polypeptid und ein erhaltenes Polypeptid in ein Salz desselben überführt wird. Die Erfindung betrifft bevorzugt ein Verfahren zur Herstellung von Eglin-Verbindungen der Formel VGIuPheGlySerGluLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrValAspGlnAlaArqGlu TyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAspValWPheLeuProGluGlySerProValThrLeuAsp LeuArgTyrAsnArgValArgValPheTyrAsnProGlyThrAsnValValAsnHisValProHis VaIGIy

(XIV),

worin VfürThr, N-Acetyl-Thr oder für Met-Thr steht und W Tyr oder His bedeutet, und von Salzen solcher Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß ein mit einem Expressionsplasmid, welches eine von einer Expressionskontrollsequenz regulierte, für ein Eglin kodierende DNA-Sequenz enthält, transformierter Wirtsmikroorg. nismus in einem flüssigen Nährmedium, welches assimilierbare Kohlenstoff-und-Stickstoffquellen enthält, kultiviert und das Eglin aus den Mikroorganismen-Zellen freigesetzt und isoliert wird, und falls gewünscht, ein erhältliches Eglin, worin V für N-Acetyl-Thr oder für Met-Thr steht und W obige Bedeutung hat, in ein Eglin überführt wird, worin V Thr bedeutet, und, falls erforderlich, ein verfahrensgemäß erhältliches Gemisch von Verbindungen der Formel XIV in die einzelnen Komponenten auTgetrennt wird, und/oder, falls gewünscht, ein erhaltenes Salz in das freie Polypeptid oder ein erhaltenes Polypeptid in ein Salz desselben überführt wird. Die Erfindung betrifft insbesondere Verfahren zur Herstellung von Eglin C-Verbindungen der Formel XIV, worin B für einen Peptidrest ausgewählt aus der Gruppe LeuLysSerPhe-, SerGluLeuLysSerPhe- oder Thr GluPheGlySerGluLeuLysSerPhe- und B' für den Rest

-HisValProHisValGly steht, W Туг ist und г 0 oder 1 ist, fernerauch Verfahren zur Herstellung von Eglin B-Verbindungen der Formel XIV, worin Bfür den Peptidrest ThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPhe- und B' für den Peptidrest-HisValProHisValGly steht, W His bedeutet und r 0 oder 1 ist, wobei in Verbindungen der Formel XIV, worin r 0 ist, die N-terminaie Aminosäure gegebenenfalls N-acetyliert ist, und von Salzen solcher Verbindungen.

In den Verbindungen der Formel XIV hat W bevorzugt die Bedeutung Tyr (Eglin C-Verbindungen).

In erster Linie betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Eglin C-Verbindungen der Formel XIV, worin B für den N-Acetyl-SerGluLeuLysSerPhe-.ThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPhe-oder N-Acetyl-ThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPhe-Rest und B' für den Rest -HisValProHisValGly steht, W Tyr ist und r 0 ist, und von Salzen solcher Verbindungen. Die Erfindung betrifft speziell ein Verfahren zur Herstellung von Eglin C, Eglin B, N°-Acetyl-Eglin C und der modifizierten Eglin C-Verbindungen Eglin C und Eglin C".

Für die Kultivierung der erfindungsgemäßen, transformierten Wirte können verschiedene Kohlenstoffquellen verwendet werden. Beispiele bevorzugter Kohlenstoffquellen sind assimilierbare Kohlenhydrate, wie Glucose, Maltose, Mannit oder Lactose, oder ein Acetat, das entweder allein oder in geeigneten Gemischen verwendet werden kann. Geeignete Stickstoffquellen sind beispielsweise Aminosäuren, wie Casaminosäuren, Peptide und Proteine und ihre Abbauprodukte, wie Trypton, Pepton oder Fleischextrakte; weiterhin Hefeextrakte, Malzextrakt, wie auch Ammoniumsalze, z. B. Ammoniumchlorid, -sulfat oder-nitrat, die entweder allein oder in geeigneten Mischungen verwendet werden können. Anorganische Salze, die ebenfalls verwendet werden können, sind z. B. Sulfate, Chloride, Phosphate und Carbonate von Natrium, Kalium, Magnesium und Calcium.

Weiterhin enthält das Medium z. B. wachstumsfördernde Substanzen, wie Spurenelemente, z. B. Eisen, Zink, Mangan und dergleichen, und vorzugsweise Substanzen, die einen Selektionsdruck ausüben und das Wachstum von Zellen, die das Expressionsplasmid verloren haben, verhindern. So wird dem Medium beispielsweise Ampicillin zugesetzt, wenn das Expressionsplasmid ein amp^R-Gen enthält. Ein solcher Zusatz von antibiotisch wirksamen Substanzen bewirkt auch, daß kontaminierende, Antibiotika-empfindliche Mikroorganismen abgetötet werden.

Die Kultivierung erfolgt nach an sich bekannten Verfahren. Die Kultivierungsbedingungen, wie Temperatur, pH-Wert des Mediums und Fermentationszeit, werden so ausgewählt, daß maximale Eglin-Titer erhalten werden. So wird ein E. coli-Stamm bevorzugt unter aeroben Bedingungen in submerser Kultur unter Schütteln oder Rühren bei einer Temperatur von etwas 20 bis 40⁰C, vorzugsweise etwa 3O⁰C, und einem pH-Wert von 4 bis 9, vorzugsweise bei pH 7, während etwa 4 bis 20 h, vorzugsweise 8 bis 12 h, kultiviert. Dabei sammelt sich das Expressionsprodukt (Eglin) intrazellulär an.

Wenn die Zelldichte einen ausreichenden Wert erreicht hat, wird die Kultivierung abgebrochen und das Eglin aus den Zellen des Wirtes freigesetzt. Zu diesem Zweck werden die Zellen zerstört, z. B. durch Behandlung mit einem Detergens, wie SDS oder Triton, oder mit Lysozym oder einem gleichartig wirkenden Enzym lysiert. Alternativ oder zusätzlich kann man mechanische Kräfte, wie Scherkräfte (z. B. X-Presse, French-Presse, Dyno-Mill) oder Schütteln mit Glasperlen oder Aluminiumoxid, oder abwechselndes Einfrieren, z. B. in flüssigem Stickstoff, und Auftauen, z. B. auf 30° bis 4O⁰C, sowie Ultraschall zum Brechen der Zellen anwenden. Die resultierende Mischung, die Proteine, Nucleinsäuren und andere Zellbestandteile enthält, wird nach der Zentrifugation in an sich bekannter Weise an Proteinen, inklusive Eglin, angereichert. So wird z. B. der größte Teil der NichtProtein-Bestandteile durch Polyethylenimin-Behandlung abgetrennt und die Proteine einschließlich Eglin z. B. durch Sättigen der Lösung mit Ammoniumsulfat oder mit anderen Salzen ausgefällt. Bakterielle Proteine können auch mittels Ansäuern mit Essigsäure (z.B. 0,1%, pH 4-5) ausgefällt werden. Eine weitere Anreicherung an Eglin kann durch Extraktion des essigsauren Überstandes mit n-Butanol erreicht werden. Weitere Reinigungsschritte umfassen beispielsweise Gelektrophorese, chromatographische Verfahren, wie lonenaustauschchromatographie, Größen-Exklusionschromatographie, HPLC, Umkehrphasen-HPLC und dergleichen, Auftrennung der Mischungsbestandteile nach Molekülgrößen mittels einer geeigneten Sephadex-Säule, Dialyse, Affinitätschromatographie, z. B. Antikörper-, insbesondere monoklonale Antikörper-Affinitätschromatographie oder Affinitätschromatographie an einer Anhydrochymotrypsinsäule, und weitere, insbesondere aus der Literatur, bekannte Verfahren.

Beispielsweise umfaßt die Isolierung des exprimierten Eglins die folgenden Stufen:

Abtrennung der Zellen aus der Kulturlösung mittels Zentrifugation; Herstellung eines Rohextrakts durch Zerstören der Zellen, z. B. durch Behandlung mit einem lysierenden Enzym und/oder abwechselndem Einfrieren und Wiederauftauen; Abzentrifugieren der unlöslichen Bestandteile, Ausfällen der DNA durch Zugabe von Polyäthyleninim; Fällung der Proteine einschließlich Eglin durch Ammoniumsulfat;

Affinitätschromatographie des gelösten Niederschlags an einer monoklonalen Anti-Eglin-Antikörper-Säule oder einer Anhydrochymotrypsin-Säule;

Entsalzung der so gewonnen Lösung mittels Dialyse oder Chromatographie an Sephadex G25.

Alternativ können nach Abtrennen der DNA die bakteriellen Proteine mittels 0,1%iger Essigsäure ausgefällt werden, aus dem sauren Überstand das Eglin mit n-Butanol extrahiert oder der saure Überstand direkt der lonenaustausch-Chromatographie (z. B. г η Carboxymethylcellulose) unterworfen weiden. Weitere Reir'gungssschritte schließen Gelfiltration an Sephade·; G50 (oder G75), und Umkehrphasen-HPLC ein. Entsalzung erfolgt wieder an Sephadex G25.

Zum Nachweis der Eglin-Aktivität kann der Test mit Anti-Eglin-Antikörpern (z. B. aus Kaninchen erhältliche, oder aus Hybridomazellen erhältliche monoklonale Antikörper) oder die Hemmung der Proteasen Humanleukozyten-Elastase (HLE) oder Cathepsin G (Cat G) (1) durch Eglin herangezogen werden.

Die Überführung einer Verbindung der Formel XIV, worin r 0 ist und die N-terminale Aminogruppe in freier Form vorliegt, in eine entsprechende Verbindung der Formel XIV, worin die N-terminale Aminosäure N-acetyliert ist, erfolgt insbesondere auf enzymatischem Weg. So kann die Einführung der Acety!gruppe beispielsweise mit Hilfe einer №-Acetyl-transferase (in reiner Form, als Extrakt oder Lysat eines geeigneten Mikroorganismus oder als Organextrakt), beispielsweise aus E. coli, aus Kaninchen-Retikulozyten oder Weizenkeimlingen (8), in Gegenwart von Acetyl-Coenzym A erfolgen.

Verfahrensgemäß erhältliche Verbindungen der Formel XIV können in an sich bekannter Weise in andere Verbindungen der Formel XIV überführt werden.

So kann in erhältlichen Verbindungen der Formel XIV mit Methionin als N-terminale Aminosäure oder mit einer N-terminal acetylierten Aminogruppe Methionin oder der Acetylrest abgespalten werden. Beispielsweise können erfindungsgemäß erhältliche Eglin-Verbindungen mit einem N-terminalen Metionylrest in Egline ohne einen derartigen Rest übergeführt werden,

indem man den terminalen Methionylrestin üblicherweise mittels Bromcyan abspaltet. Die Reaktion mitBromcyanerfolgtz.B. in einem wäßrig-sauren Medium, ζ. B. in stark verdünnter Salzsäure, beispielsweise in 0,1-0,3 N Salzsäure, oder in einer starken organischen Säure, z. B. in 50-70%iger Ameisensäure, bei Raumtemperatur oder geringfügig erhöhter und erniedrigter Temperatur, z. B. bei ca. 15° bis etwa 25°C über einen Zeitraum von etwa 24 Stunden. Entsprechend kann in verfahrensgemäß erhältlichen Verbindungen der Formel XlV mit einer N-terminal acetylierten Aminogruppe der Acetylrest abgespalten werden. Die Abspaltung des Acetylrestes kann beispielsweise enzymatisch erfolgen, wie mit geeigneten Acylasen, z. B. aus Schweinenieren oder aus geeigneten Mikroorganismen, oder mit geeigneten Acetyltransferasen in Gegenwart von Coenzym A, wobei anstelle reiner Enzympräparate auch Extrakte oder Lysate von Mikroorganismen bzw. Organextrakte verwendet werden können, die solche Enzyme enthalten (bei Verwendung von E. coli HB 101 als №-Acetyl-Eglin B oder C produzierenden Stamm beispielsweise ein E. coli HB101-Lysat).

Ein verfahrensgemäß erhältliches Gemisch von Verbindungen der Formel XIV, beispielsweise bestehend aus Verbindungen der Formel XIV, worin V entweder Thr oder Acetyl-Thr bedeutet, kann in an sich bekannter Weise in die einzelnen Komponenten aufgetrennt werden. Geeignete Trennverfahren sind beispielsweise chromatographische Verfahren, z. B. Adsorptions-Chromatographie, lonenaustauschchromatographie, HPLC oder reversed-phase HPLC, ferner multiplikative Verteilung oder elektrophoretische Methoden, z. B. Elektrophorese an Celluloseacetat oder Gelektrophorese, insbesondere Polyacrylamid-Gelelektrophorese („PAGE").

Die Erfindung betrifft auch die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen neuen Peptide mit Eglin-Aktivität, Mischungen von solchen Peptiden und Salze von solchen Verbindungen

Die Erfindung betrifft weiterhin die neuen Verbindungen der Formel (Met)_r-B-ProGluValValGlyLysThrValAspGlnAlaArgGlu

TyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAspVAIWPheLeuProGluGlySerProValThrLeuAsp LeuArgTyrAsnArgValArgValPheTyrAsnProGlyThrAsnValValAsn-B'

(XIV)

worin r 1 ist, B für eine direkte Bindung oder für einen Peptidrest steht, der 1-10 Aminosäurebausteine vom N-Terminus der natürlichen Egline umfaßt, z.B. ein solcher ausgewählt aus der Gruppe SerPhe-, LeuLysSerPhe-, SerGluLeuLysSerPhe-, PheGlySerGluLeuLysSerPhe-oderThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPhe-, und B'für keinen oder für einen Peptidrest steht, der 1-6 Aminosäurebausteine vom C-Terminus der natürlichen Egline umfaßt, z. B. ein solcher ausgewählt aus der Gruppe -HisVal, -HisValProHis oder -HisValProHisValGly, und W Tyr oder His bedeutet, oder worin r 0 ist, B für einen N-terminal acetylierten Peptidrest steht, z.B. ausgewählt aus der Gruppe N-Acetyl-SerPhe—, N-Acetyl-LeuLysSerPhe-, N-Acetyl— SerGluLeuLysSerPhe-, N-Acetyl-PheGlySerGluLeuLysSerPhe- oder N-Acetyl-ThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPhe-, und B' die angegebene Bedeutung hat, und W Tyr oder His ist, und Salze von solchen Verbindungen. Die Erfindung betrifft insbesondere Verbindungen der Formel XIV, worin r 0 ist, B für den Peptidrest N-Acetyl— SerGluLeuLysSerPhe- oder N-Acetyl-ThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPhe- und B' für den Peptidrest -HisValProHisValGly steht und W Tyr ist, und Salze von solchen Verbindungen

Die Erfindung betrifft bevorzugt Eglin-Verbindungen der Formel VGIuPheGlySerGluLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrValAspGlnAlaArgGlu TyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAspValWPheLeuProGluGlySerProValThrLeuAsp LeuArgTyrAsnArgValArgValPheTyrAsnProGlyThrAsnValValAsnHisValProHis VaIGIy

(XIV),

worin V für N-Acetyl-Thr oder Met-Thr steht und W Tyr oder His ist, und Salze von solchen Verbindungen. Die Erfindung betrifft insbesondere №-Acetyl-Eglin C und Salze davon.

Die erfindungsgemäß herstellbaren Verbindungen bzw. die neuen Verbindungen der Formel XIV können nicht nur in freier Form, sondern auch in Form ihrer Salze, insbesondere ihrer pharmazeutisch annehmbaren Salze, vorliegen. Da sie mehrere Aminosäurereste mit freien Aminogruppen bzw. Guanidinogruppen enthalten, können die erfindungsgemäßen Verbindungen z. B. in Form von Säureadditionssalzen vorliegen. Als Säureadditionssalze kommen insbesondere physiologisch verträgliche Salze mit üblichen, therapeutisch anwendbaren Säuren in Betracht; als anorganische Säuren sind die Halogenwasserstoffsäuren (wie die Chlorwasserstoffsäure), aber auch Schwefelsäure und Phosphor- bzw. Pyrophosphorsäure zu nennen; als organische Säuren sind in erster Linie Sulfonsäuren (wie die Benzol- oder p-Toluolsulfonsäure oder Niederalkansulfonsäuren, wie Methansulfonsäure) sowie Carbonsäuren, wie Essigsäure, Milchsäure, Palmitin- und Stearinsäure, Apfelsäure, Weinsäure, Ascorbinsäure und Citronensäure, geeignet. Da die Eglin-Verbindungen auch Aminosäurereste mit freien Carboxylgruppen enthalten, die dem ganzen Peptid sauren Charakter verleihen, können sie auch als Metallsalz, insbesondere als Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalz, z. B. Natrium-, Kalium-, Calcium- oder Magnesiumsalz, oder auch als Ammoniumsalz, abgeleitet von Ammoniak oder einer physiologisch verträglichen, organischen stickstoffhaltigen Base, vorliegen. Da sie aber zugleich freie Carboxylgruppen und freie Amino (und Amidino)-Gruppen enthalten, können sie ai ch als inneres Salz vorliegen. Je nach Aroc. swe^:se erhält man die erfindungsgemäßen Verbindungen in freier Form oder in Form von Säureadditionssalzen, inneren Salzen oder Salzen mit Basen. Aus den Säureadditionssalzen können in an sich bekannter Weise die freien Verbindungen gewonnen werden. Von letzteren wiederum lassen sich durch Umsetzen mit Säuren oder Basen, z. B. mit solchen, die die obengenannten Salze bilden, und Eindampfen oder Lyophilisieren therapeutisch annehmbare Säureadditionssalze oder Metallsalze gewinnen. Die inneren Salze können durch Einstellen des pH auf einen geeigneten Neutralpunkt gewonnen werden.

Monoklonale Antikörper gegen Egline und Test-Kits, die solche Antikörper enthalten.

Die Eigenschaft von Antikörpern, spezifische Antigene zu binden, findet außerhalb des Körpers praktische Anwendung bei der quantitativen Bestimmung (Immuno-Assay) und bei der Reinigung der Antigene (Immunoaffinitätschromatographie). Serum immunisierter Tiere enthält normalerweise eine Vielzahl verschiedener Antikörper, die mit dem gleichen Antigen an verschiedenen Bindungsstellen mit verschiedener Affinität reagieren, dazu aber auch Antikörper gegen andere Antigene, die die früheren Erfahrungen des Individuums widerspiegeln. Die erfolgreiche Anwendung von Antikörpern zur Bestimmung und Reinigung von Antigenen erfordert aber hohe Spezifität und Reproduzierbarkeit.

Homogene Antikörper, die diese Anforderungen erfüllen, sind durch die von Köhler und Milstein (26) beschriebene Hybridomatechnik zugänglich geworden. Prinzipiell besteht die Technik darin, daß Antikörper ausscheidende B-Lymphozyten, z. B. aus der

MiIz, immunisierter Tiere mit Tumorzellen verschmolzen („fusioniert") werden. Die gebildeten Hybridomazellen kombinieren die Fähigkeit zur unbegrenzten Vermehrung durch Teilung mit der Fähigkeit, einen einheitlichen Typ Antikörper zu bilden und auszuscheiden. Durch Kultivierung in einem selektiven Medium, in dem nicht fusionierte Tumorzellen absterben, Hybridomazellen sich aber vermehren, und durch geeignete Manipulationen können Klone, d. h. Zellpopulationen, die sich von einer einzigen Hybridomazelle ableiten und genetisch identisch sind, gewonnen und kultiviert und die durch die Zellen produzierten monoklonalen Antikörper isoliert werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft monoklonale Antikörper gegen Egiine oder modifizierte Egiine, Hybridomazellen, die solche Antikörper produzieren und Verfahren zu ihrer Herstellung. Bevorzugt sind Hybridomazellinien und die von diesen ausgeschiedenen monoklonalen Antikörper, die spezifisch mit Eglin B oder Eglin C oder Derivaten davon, z. B. №—Acetyl-Eglin C oder B, oder N°-Methionyl—Eglin C oder B, reagieren. Das Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Anti-Eglin-Antikörpern ist dadurch gekennzeichnet, daß man Mäuse mit einem Eglin oder modifiziertem Eglin immunisiert, B-Lymphozyten derart immunisierter Tiere mit Myelomazellen fusioniert, die gebildeten Hybridomazellen kloniert, dann in vitro oder durch Injektion in Mäusen kultiviert und aus den Kulturen Antikörper isoliert.

Die Erfindung betrifft ferner Immuno-Affinitätschromatographie-Säulen und Test-Kits für Immunoassays, die diese Antikörper enthalten.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden Mäuse, z.B. Balb/c-Mäuse, auf an sich bekannte aber spezifische Weise immunisiert. Überraschenderweise gelingt die Immunisierung, obwohl Egiine verhältnismäßig kleine Proteinmoleküle sind. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Lösung von 50 bis 500, bevorzugt ЮОцд Eglin B oder C, insbesondere in komplettem und inkomplettem Freund's Adjuvans und in gepufferter Salzlösung, etwa wöchentlich oder auch in größeren Abständen während mehreren Wochen, beispielsweise 5 bis 12 Wochen, subcutan injiziert, bis sich eine genügende Zahl Antikörper-produzierender B-Lymphozyten gebildet hat.

B-Lymphozyten enthaltende Organe, z. B. Milzzellen, der immunisierten Mäuse werden entnommen und mit solchen Myelomazellen fusioniert, die aufgrund einer Mutation in einem selektiven Kulturmedium nicht wachsen. Solche Myelomazellen sind bekannt und sind beispielsweise jene mit der Bezeichnung X63-Ag8, X63-Ag8.6.5.3, MPC-11, NS1-Ag4/1, MOPC-21 NS/1 oder insbesondere SP2/0. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Milzzellen immunisierter Mäuse mit Myelomazellen der Zellinie SP2/0 fusioniert.

Die Fusion wird nach an sich bekannten Verfahren durch Mischen der B-Lymphozyten und der Myelomazellen unter Zugabe eines Zeilfusionsagens, wie Polyethylenglykol, Sendai-Virus, Calciumchlorid oder Lysolecithin durchgeführt. Vorzugsweise wird in Gegenwart von Polyethylenglykol, beispielsweise mit einem Molekulargewicht von 500, fusioniert. Nach der Fusion werden die entstandenen Hybride nach einem an sich bekannten Verfahren in einem selektiven Kulturmedium, das mit Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT-Medium) komplementiert ist, kultiviert. Nicht fusionierte Myelomazellen können in diesem Medium nicht wachsen und sterben ebenso wie normale Lymphozyten.

Die Überstände der Hybridomakuituren können nach an sich bekannten Verfahren auf ihren Gehalt an spezifischen Antikörpern geprüft werden, beispielsweise mit einem Radio-Immunoassay oder durch Agglutinierung. Dabei wird überraschenderweise festgestellt, daß mit dem beschriebenen Verfahren Hybridomazellen gewonnen werden können, die Antikörper spezifisch gegen Eglin B oder Eglin C ausscheiden. Diese Antikörper reagieren auch mit№-AcetyleglinCund Bund №-Methionyl-eglinCund B. Die Hybridomazellen, die Antikörper der gewünschten Spezifität produzieren, werden aus dem aus der Fusionierung hervorgegangenen Gemisch verschiedenster Hybridomazellen durch Klonieren herausselektioniert. Dazu werden nach einem an sich bekannten Verfahren, das „limiting dilution" genannt wird, Kulturen ausgehend von einer einzigen wachsenden Zelle angesetzt.

Auf diese Weise können die drei Hybrodomazellinien gewonnen werden, die am Institut Pasteur, Paris, Frankreich, unter der Bezeichnung 299S18-20, 299S22-1 und 299S22-10 hinterlegt wurden.

Zur Massenproduktion werden die Hybridomazellklone, die Antikörper der gewünschten Spezifität produzieren, entweder in an sich bekannten Medien in vitro kultiviert oder zur Vermehrung in Mäuse injiziert. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Hybridomazellen in mit Pristan vorbehandelte Mäuse injiziert, Aszitesflüssigkeit entnommen und daraus durch Fällung mit Ammoniumsulfatlösung Antikörper isoliert.

Die mit Hilfe dieser Hybridomazellen gewonnenen monoklonalen Antikörper können auf an sich bekannte Weise für die Herstellung von Immuno-Affinitätschromatographie-Säulen verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein geeignetes Trägermaterial (suspendiert in einer Pufferlösung) mit einer Antikörperlösung versetzt, ungebundene Anteile werden anschließend ausgewaschen und unbesetzte Stellen des Trägermaterials blockiert. Die mit Hilfe der Hybridomazellen gewonnenen monoklonalen Antikörper können auf an sich bekannte Weise für die Herstellung von Test-Kits verwendet werden. Diese Test-Kits können auf verschiedenen Methoden beruhen, beispielsweise auf Radio-Immunodiffusion, Latex-Agglutinierung, Tüpfel-Tests, Kompetitive oder Sandwich-Radio-Immunoassay, Enzym-Immunoassay, Immuno-Fluoreszenz oder immunochemischen Enzym-Tests, z. B. ELISA oder Tandem ELISA. Solche Kits können neben gewöhnlichen Antikörpern verschiedener Herkunft Antikörper-Konjugate mit Enzymen oder Fluoreszenzträgern enthalten, dazu ein Eglin oder modifiziertes Eglin, z. B. Eglin B, Eglin C oder N^a-Acetyleglin C, markiert mit radioaktiven Isotopen wie J¹²⁵, oder konjugiert mit Enzymen, beispielsweise mit Meerrettich-Peroxidase oder alkalischer Phosphatase, ferner Enzymsubstrate, geeignete Puffer, Gele, Latex, Polystyrol oder andere Füllmaterialien und Träger. Die serologischen Tests können beispielsweise wie folgt ausgeführt werden:

Neben einem kompetitiven RIA kann ein direkter Bindungstest benutzt werden, um anti-Eglin C Antikörper-Aktivität festzustellen. Zu diesem Zweck wird Eglin C durch Inkubation über Nacht an Mikrotiterplatten-Vertiefungen fixiert (200 ng/Vertiefung), dann mit Hybridoma-Kulturflüssigkeit inkubiert und entweder mit radioaktiv markiertem [¹²⁵J]-(Festphasen RIA) oder mit durch alkalischer Phosphatase markiertem (Festphasen ELISA) Ziegen anti-Maus Ig-Antikörper sichtbar gemacht. Die ausgewählten drei monoklonalen Antikörper eignen sich für einen nichtradioaktiven Tandem ELISA, mit dessen Hilfe Egiine in Körperflüssigkeiten quantitativ bestimmt werden können.

Die geeigneten Paare an Antikörpern wurden mittels eines kompetitiven RIA wie folgt ausgewählt: Die monoklonalen Antikörper 299S18-20,299S22-1 und 299S22-10 (200-300ng/Vertiefung erhalten durch Ammoniumsulfat-Ausfällung aus Ascitesflüssigkeit) und ein polyklonales Kaninchen anti-Eglin C Antikörper (200-300 ng/Vertiefung, erhalten aus Serum) werden in Vertiefungen von Mikrotiterplatten fixiert. Die Inhibierung der Bindung von ¹²⁵J-markiertem Eglin C wurde kreuzweise untersucht.

Die Versuche ergaben, daß sich die monoklonalen Antikörper 299S18-20 und 299S22-10 gegenseitig beim Binden an Eglin C inhibieren, woraus geschlossen wird, daß beide an die gleichen Epitope am Eglin C Molekül binden.

Die monoklonalen Antikörper 299S18-20 und 299S22-1 inhibieren sich gegenseitig nicht. Das bedeutet, sie binden an verschiedene Epitope des Eglin C-Moleküls.

Die relative Bindungskapazität, bestimmt durch die Menge an fixiertem radioaktiv markiertem Eglin C, die von fixierten Antikörpern gebunden wird, ist am größten bei 299S22-10 und am kleinsten bei 299S18-20.

Aufgrund von Tandem ELISA-Experimenten, in denen die monoklonalen Antikörper paarweise getestet wurden, wobei immer ein Antikörper als Festphase auf Mikrotiterplatten fixiert war und der andere als Flüssigphase mit einem Enzym, z. B. alkalischer Phosphatase, markiert war, wurde festgestellt, daß sich die nichtkreuzreaktiven Paare 299S18-20/299S22-1 und 299S22-1/ 299S22-10 für einen derartigen quantitativen Assay am besten eignen, wobei jeweils der erste der genannten monoklonalen Antikörperpaare, der schwach an Eglin C bindet, als Festphase benutzt werden muß.

Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper, als Festphase, können auch mit einem polyklonalen anti-Eglin C Antikörper,

z. B. vom Schaf, als Flüssigphase, zur quantitativen Bestimmung von Eglin C benutzt werden.

Die Empfindlichkeit des Tandem ELISA liegt bei etwa 1-10ng Eglin C/ml einer Probe.

Pharmazeutische Präparate

Die gemäß der vorliegenden Erfindung erhältlichen bekannten (z. B. Eglin B und Eglin C) und neuen (z. B. №-Acetyl-Eglin B und -Eglin C, Methionyl-Eglin C und -Eglin B) Egline und modifizierten Egline weisen wertvolle pharmakologische Eigenschaften auf und können, wie die aus Blutegeln extrahierten Egline (vgl. DE-OS 2808396), prophylaktisch oder insbesondere therapeutisch angewendet werden.

Die erfindungsgemäßen neuen Eglin-Verbindungen, wie N"-Acetyl-eglin B und NP-Acetyl-eglin C, zeichnen sich durch eine sehr starke und spezifische Hemmung von Humanleukozyten-Elastase (HLE), Leukozyten-Cathepsin G (H.Cat. G) und Chymotrypsin aus. In der folgenden Tabelle sind die Assoziations-Geschwindigkeitskonstanten (k_ass) und die Gleichgewichts-Konstanten (K₁) der gebildeten Enzym-Inhibitor-Komplexe für die Reaktionen von N"-Acetyl-eglin C und zweier natürlich vorkommender Proteaseinhibitoren, α,-Proteinase-lnhibitor (<*iPI, früher a_rAntitrypsin genannt) und a₂-Makroglobulin (a₂M), mit HLE und H. Cat. G zusammengestellt:

Tabelle: Kinetische Parameter für die Wechselwirkung ausgewählter Proteinasen mit den Inhibitoren №-Acetyl-eglin C, α,ΡΙ und

Proteine	Inhibitor	к M »sec ass¹- ^J	h См] .
HLE	α PI	1.5·1Ο⁷	irreversibel
	J.	l.OlO⁷	irreversibel
	N -Acetyl-eglin C	1.4·1Ο⁷	8.10"¹¹
H.Cat.G	O₁PI	1.0*10^	irreversibel
		3.5«10^b	irreversibel
	№-Acetyl-eglin C	2.0·10⁶	5.10-¹¹

Bedingungen: Die Bestimmung derAssoziations-Geschwindigkeitskonstanten erfolgte nach Bieth et al. (36). DieKj-Wertefürdie Wechselwirkung von N"-Acetyl-eglin C mit HLE und H. Cat. G. wurden aus „steady state" Reaktionsgeschwindigkeiten unter der Annahme errechnet, daß diese Wechselwirkungen reversibel sind. Alle Werte wurden bei 37°C und pH 7,4 bestimmt. Die Daten zeigen, daß die Assoziations-Geschwindigkeitskonstanten für die Reaktion von N^a-Acetyl-eglin C sowie der natürlichen Inhibitoren α,ΡΙ und a₂M mit HLE bzw. H. Cat. G. in der gleichen Größenordnung liegen. Die hohe Stabilität der №-Acetyl-eglin—Enzym-Komplexe (Κ,-Werte!), die erwiesene, äußerst geringe Toxizität der Egline, sowie deren Spezifität (signifikante Wechselwirkungen mit anderen Säugetier-Proteinasen, insbesondere mit solchen der Blutgerinnungs-, Fibrinolyse- und Komplement-Systeme, werden nicht beobachtet), ihre auf Grund der N-terminalen Acetylgruppe erhöhte Stabilität gegenüber proteolytischem Abbau durch Aminopeptidasen und die im Vergleich zu den körpereigenen Faktoren Ot₁PI und a₂M leichte Zugänglichkeit grc°- -er Mengen mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens empfehlen diese Verbindungen für die pharmakologische Evaluierung bei Krankheitsbildern, die durch von HLE verursachte Gewebe^erstörungen charakterisiert sind.

Die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen erweist sich beispielsweise im experimentellen Emphysem-Modell. Eine Stunde vor Emphysem-Induktion durch intratracheale Applikation von 0,3 mg HLE im Hamster wurden 0,5 mg bzw. 2 mg IST-Acetyl-eglin C (in je 8 Tieren) ebenfalls intratracheal appliziert. Bei nicht geschützten (nicht mit №-Acetyl-eglin C vorbehandelten) Tieren zeigten die nach zwei Monaten durchgeführten Lungenfunktiontests und histologischen Untersuchungen schwere Lungenobstruktionen und Emphysema. Im Gegensatz dazu wiesen alle mit N^a-Acetyl-eglin vorbehandelten Tiere normale Lungenfunktionen auf. Die histologische Untersuchung der Lungen ergab lediglich bei zwei der acht Tiere aus der Niedrigdosis-Gruppe (0,5mg №-Acetyl-eglin C) geringfügige, lokale emphysematische Veränderungen; die übrigen Tiere zeigten keine Veränderungen, wodurch die Schutzwirkung des intratracheal applizierten N"-Acetyi—eglin C und gleichzeitig dessen geringe Toxizität bewiesen sind.

Die erfindungsgemäßen neuen Eglin-Verbindungen, insbesondere die N^a-Acetyl-eglin-Verbindungen, können demgemäß zur Prophylaxe und für die therapeutische Behandlung von Lungenerkrankungen, z. B. durch Leukocyten-Elastase hervorgerufenen Lungenerkrankungen, wie Lungenemphysem und ARDS („acute respiratory distress syndrome"), Mucoviscidose, ferner bei

septischem Schock sowie als Antiphlogistika und Antiinflammatorika verwendet werden. Die Verwendung der erfindungsgemäßen neuen Eglin-Verbindungen und ihrer pharmazeutisch annehmbaren Salze bei der prophylaktischen und therapeutischen Behandlung der genannten Krankheitsbilder ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Die Erfindung betrifft ebenfalls pharmazeutische Zusammensetzungen, welche wenigstens eine der erfindungsgemäßen Verbindungen oder deren pharmazeutisch annehmbaren Salze, gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger und/oder Hilfsstoffen, enthalten.

Diese Zusammensetzungen können insbesondere bei den oben angegebenen Indikationen Verwendung finden, wenn sie z. B.

parenteral (wie intravenös oder intrapulmonal) oder topisch verabreicht werden. Die Dosierung hängt in erster Linie von der spezifischen Verarbeitungsform und vom Zweck der Therapie bzw. Prophylaxe ab.

Die Verabreichung erfolgt durch intravenöse Injektion oder intrapulmonal, durch Inhalation, z. B. mit einem Bird-Gerät.

Dementsprechend enthalten pharmazeutische Präparate zur parenteralen Verabreichung in Einzeldosis-Form in Abhängigkeit von der Applikationsart pro Dosis etwa 10 bis 50 mg der erfindungsgemäßen Verbindungen. Neben dem Wirkstoff enthalten diese pharmazeutischen Zusammensetzungen üblicherweise noch Natriumchlorid, Mannit oder Sorbit zur Einstellung der Isotonie. Sie können in gefriergetrockneter oder gelöster Form vorliegen, wobei Lösungen mit Vorteil ein antibakteriell wirkendes Konservierungsmittel, z. B. 0,2 bis 0,3% 4-Hydroxybenzoesäur-methylester oder-ethylester, enthalten können.

Ein Präparat für die topische Anwendung kann als wäßrige Lösung, Lotion oder Gelee, ölige Lösung oder Suspension, oder fetthaltige oder insbesondere Emulsions-Salbe vorliegen. Ein Präparat in Form einer wäßrigen Lösung erhält man beispielsweise dadurch, daß man die erfindungsgemäßen Wirkstoffe oder ein therapeutisch annehmbares Salz davon in einer wäßrigen Pufferlösung von pH4 bis 7,5 löst und gewünschtenfalls einen weiteren Wirkstoff, z.B. ein Antiinflammatorikum, und/oder ein polymeres Haftmittel, z. B. Polyvinylpyrrolidon, und/oder ein Konservierungsmittel zufügt. Die Konzentration des Wirkstoffs beträgt etwa 0,1 bis etwa 5mg, vorzugsweise 0,25 bis 1,0mg, in 10ml einer Lösung bzw. 10g eines Gelees.

Eine ölige Applikationsform für die topische Verabreichung erhält man beispielsweise durch Suspendieren der erfindungsgemäßen Wirkstoffe oder eines therapeutisch annehmbaren Salzes davon in einem OeI, gegebenenfalls unter Zusatz von Quellmitteln, wie Aluminiumstearat, und/oder grenzflächenaktiven Mitteln (Tensiden), deren HLB-Wert („hydrophiliclipophilic-balance") unter 10 liegt, wie Fettsäuremonoester mehrwertiger Alkohole, z. B. Glycerinmonostearat, Sorbitanmonolaurat, Sorbitanmonostearat oder Sorbitanmonooleat. Eine fetthaltige Salbe erhält man z. B. durch Suspendieren der erfindungsgemäßen Wirkstoffe oder deren Salze in einer streichbaren Fettgrundlage, gegebenenfalls unter Zusatz eines Tenside vom HLB-Wert unter 10. Eine Emulsionssalbe erhält man durch Verreiben einer wäßrigen Lösung der erfindungsgemäßen Wirkstoffe oder deren Salze in einer weichen, streichbaren Fettunterlage unter Zusatz eines Tensids, dessen HLB-Wert unter 10 liegt. Alle diese topischen Applikationsformen können auch Konservierungsmittel enthalten. Die Konzentration des Wirkstoffes beträgt etwa 0,1 bis etwa 5mg, vorzugsweise 0,25 bis 1,0mg, in etwa 10g der Grundmasse.

Inhalationspräparate für die Behandlung der Atemwege durch intrapulmonale Verabreichung sind z. B. Aerosole oder Sprays, welche den pharmakologischen Wirkstoff in Form von Tropfen einer Lösung oder Suspension verteilen können. Präparate, in welchen der pharmakologische Wirkstoff in Lösung vorliegt, enthalten außer diesem ein geeignetes Treibmittel, ferner, falls notwendig, ein zusätzliches Lösungsmittel und/oder einen Stabilisator. Anstelle des Treibgases kann auch Druckluft verwendet werden, wobei diese mittels einer geeigneten Verdichtungs-und Entspannungsvorrichtung nach Bedarf erzeugt werden kann.

Besonders geeignet für die Verabreichung sind Bird-Beatmungsgeräte, welche in der Medizin eingeführt und bekannt sind; dabei wird eine Lösung des Wirkstoffs ins Gerät gegeben und mit leichtem Überdruck vernebelt und in die Lunge des beatmeten Patienten gebracht.

Je nach Alter, individuellem Zustand und Art der Erkrankung beträgt bei einem Warmblüter (Mensch oder Tier) von etwa 70kg Gewicht die Dosierung bei intrapulmonaler Verabreichung etwa 10 bis etwa 30 mg pro Inhalation (ein- bis zweimal täglich) und bei intravenöser Verabreichung, z.B. auch durch Dauerinfusion, bei etwa 10 bis etwa 1000mg pro Tag.

Therapeutisch wirksame Sputum- und Plasmakonzentrationen, welche mittels immunologischer Verfahren, wie ELISA, bestimmt werden können, liegen zwischen 10 und ΙΟΟμ/ml (ca. 1 bis 10μ.ΜοΙ/Ι).

Insbesondere betrifft die Erfindung die in den Beispielen beschriebenen, für ein Eglin oder modifiziertes Eglin kodierenden DNA-Sequenzen, solche DNA-Sequenzen enthaltende Expressionsplasmide, mit solchen Expressionsplasmiden transformierte Mikroorganismen, monoklonale Antikörper gegen Egline, Hybridoma-Zellen, die solche Antikörper produzieren, und Test-Kits für Immunoassays, die solche Antikörper enthalten, die in den Beispielen beschriebenen Verfahren zu ihrer Herstellung und das in den Beispielen beschriebene Verfahren zur Herstellung von Eglinen mit Hilfe der transformierten Mikroorganismen, sowie die in den Beispielen genannten neuen Eglin-Verbindungen.

Einige Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, die im nachfolgenden Experimentellen Teil beschrieben sind, werden anhand der begleitenden Zeichnungen veranschaulicht.

In Figur 1 ist die Synthese der Teilstücke Fi(C) und F₂ des Eglin C-Gens schematisch dargestellt.

Figur 2 zeigt die Herstellung des Plasmids pML87, des Klonierungsvektors für das Teilstück F₁(C) des Eglin C-Gens.

Figur 3 zeigt dementsprechend die Herstellung des Plasmids pML 136, des Klonierungsvektors für das Teilstück F₂ des Eglin C- bzw. Eglin B-Gens.

In Figur 4 ist die Konstruktion des Klonierungsvektors pML 141, welcher die F₁(C)-F₂-DNA enthält, erläutert.

In Figur 5 ist die Herstellung des Vektors pHRi 148, welcher den trp-Promoter enthält, schematisch dargestellt.

Figur 6 zeigt schematisch die Herstellung des Expressionsplasmids pML 147, welches das Eglin C-Gen [F₁(C)-F₂-DNA] unter der Kontrolle des trp-Promoters enthält.

Die folgenden Beispiele dienen zur Illustration der Erfindung und sollen sie in keiner Weise einschränken.

Experimenteller Teil

Die in den Beispielen verwendeten Abkürzungen haben die folgende Bedeutung:

TNE Lösung, die 100 mM NaCI, 50 mM Tris-HCI pH 7,5 und 5 mM EDTAenthält,

SDS Natriumdodecylsulfat

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

DTT 1,4-Dithiothreitol (1,4-Dimercapto-2,3-butandiol)

BSA Rinder-Serumalbumin

EtBr Ethidiumbromid

Tris Tris-(hydroxymethyl)—aminomethan

TrisHCI Monohydrochlorid von Tris

Beispiel 1: Herstellung des geschützten Nucleosid-Polystyrol-Harzes

Bz /"\

MMT-O-C-O-COCH₀CH₀Co-NHCH₀—· ·—(P)

2 2 ²\/

3,1 g (5mMol) 5'—(4-Methoxytrityl)—N-benzoyl-deoxycytidin in 20ml abs. Pyridin werden mit 750mg Bernsteinsäureanhydrid und 910 mg 4-Dimethylaminopyridin versetzt und 16 Stunden bei Raumtemperatur belassen. Nach Einengen der Pyridin-Lösung wird in 200 ml Essigsäureethylester aufgenomen, zweimal mit je 200 ml 0,1 M Phosphatpuffer unter Zusatz von 10 ml gesättigter Kochsalz-Lösung ausgeschüttelt, nochmals mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet, eingeengt und Hexan zugetropft. Das ausgefallene Produkt wird abgetrennt und zweimal mit Äther zerrieben, dann in 300ml Essigsäureethylester gelöst und bei 0⁰C mit 180ml 0,1 M Kaliumhydrogensulfat von pH 2,5 ausgeschüttelt. Nach zweimaligem Waschen mit Wasser wird die Essigesterlösung mit Natriumsulfat getrocknet, filtriert, mit 0,5ml Pyridin versetzt, eingeengt und tropfenweise mit Hexan verdünnt. Das ausgefallene Bernsteinsäurederivat wird abfiltriert.

1,17g dieser Verbindung werden zusammen mit 190mg N-Hydroxysuccinimid in 4ml Essigsäureethylester und 2ml Dimethylformamid gelöst und bei 0⁰C mit 370mg N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nach Stehen über Nacht im Kühlschrank wird der ausgefallene N,N'-Dicyclohexylhamstoff abfiltriert, das Filtrat mit Essigsäureethylester verdünnt, mit kaltem 0,1 M Natriumhydrogencarbonat und Wasser extrahiert, getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit Essigsäureethylester an Kieselgel chromatographiert. DC: R_f 0,58 in Dichlormethan-Methanol (9:1). 88mg dieses N-Succinimidoyl-bemsteinsäureesters werden mit 1 g Aminomethyl-polystyrol (Amingehalt 11ΟμΜοΙ/g) in 2 ml Dichlormethan und 4ml Dimethylformamid 20 Stunden gerührt. Das Polymer-Harz wird abfiltriert und mit Dimethylformamid, Methanol, Dichlormethan und Methanol ausgewaschen. Nach dem Trocknen werden die nicht umgesetzten Aminogruppen acetyliert, indem das Harz in 6ml Pyridin mit 1 ml Essigsäureanhydrid und 100 mg 4-Dimethylaminopyridin 30 min. gerührt wird. Das Polymer-Harz wird mit Dichlormethan, Dimethylformamid, Methanol und Dichlormethan ausgewaschen und bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Die spektroskopische Methoxytrityl (MMT)-Bestimmung ergibt eine Beladung von 85/i.Mol/g.

Beispiel 2: Analog Beispiel 1 werden folgende geschützte Nucleosid-Polystyrol-Harze hergestellt:

·—·

MMT-O-T-OCOCH CH CONHCH—· ·—(P) aus 5'-(4-Methoxytrityl)-

thymidin, Beladung 92 uMol/g

ib ^^X

MMT-O-G -OCOCH₂Ch₂CONHCH₂^—· ·—(P) aus 5 ' -(4-Methoxytrityl)-

·=· N-isobutyryl-deoxyguanosin, Beladung 75 uMol/g.

Beispiel 3: Synthese des Trinukleotids

a) Synthese des Dinukleotids:

7,73g (15mMol) 5'-(4-Methoxytrityl)-thymidin (MMT-O-T-OH) werden zweimal mit abs. Pyridin eingedampft. Der Rückstand wird in 20 ml abs. Tetrahydrofuran gelöst und zu 80 ml einer 0,2 M Lösung von 2-Chlorphenyl-di-(1-benzotriazolyl)-phosphat in Tetrahydrofuran unter Rühren und Feuchtigkeitsausschluß getropft und das Reaktionsgemisch 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die erhaltene Lösung des 2-Chlorphenyl-1-benzotriazolyl-544-methoxytrityl)-thymidin-3'-phosphats wird in drei Teile geteilt.

a) Hydrolyse zu Triethylammonium^-chlorphenyl-SM^methoxytrityl)-thymidin-3'-phosphat:

Zu einem Drittel der obigen Lösung von 2-Chlorphenyl-i-benzotriazolyl—5M4-methoxytrityl)-thymidin-З'-phosphat werden unter Kühlung 100ml 0,5 M Triethylammoniumbicarbonat gegeben. Nach 15min. wird mitDichlormethan-Lösung extrahiert. Die Dichlormethan-Lösung wird mit Wasser gewaschen, eingeengt und tropfenweise mit Petrolether versetzt. Die erhaltene Fällung wird abgenutscht, mit Ether-Petrolether 1:1 ausgewaschen und im Vakuum getrocknet. DC: Rf 0,35 in Dichlormethan-Methanol— Wasser (75:22:3)

ß) Veresterung zu 2-Cyanoethyl-2-chlorphenyl-5'-(4-methoxytrityl)-thymidin-3'~phosphat und Abspaltung der 4-Methoxytrityl—Schutzgruppe:

Zu einem Drittel der Lösung von 2-Chlorphenyl-i-benzotriazolyl—5'-(4-methoxytrityl)-thymidin-phosphat werden 1,3ml 2-Cyanoethanol und 2ml Pyridin gegeben. Das Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur belassen. Die Lösungsmittel werden im Vakuum abdestilliert und der Rückstand in Essigsäureethylester gelöst und mehrmals mit 0,1 M Phosphatpuffer pH7 und Wasser ausgeschüttelt. Die organische Phase wird getrocknet, eingeengt und in Hexan eingetropft. Der Niederschlag wird abfiltriert, in 50ml Dichlormethan-Methanol 7:3 gelöst und bei 0⁰C mit einer Lösung von 3,8g p-Toluolsulfonsäuremonohydrat in 75ml Dichlormethan-Methanol 7:3 versetzt. Nach 2 Stunden wird die Reaktionslösung mit Dichlormethan verdünnt und mit einer kalten Natriumhydrogencarbonat-Lösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wird eingeengt und mit Hexan versetzt. Das ausgefallene 2-Cyanoethyl-2-chlorphenyl-thymidin-3'-phosphat wird an Kieselgel mit Dichlormethan-Methanol 96:4 chromatographiert. DC: R_fvon 0,45 in Dichlormethan-Methanol (9:1)

y) Kondensation zum 5'44-Methoxytrityl)—3'-cyanoethyl)-bis-thymidin-dinukleotid:

2,2g 2-Cyanoethyl-2-chlorphenyl-thymidin-3'-phosphat werden zweimal durch Eindampfen mit abs. Pyridin entwässert, in 20ml abs. Tetrahydrofuran gelöst und zum restlichen Drittel der Lösung von 2-Chlorphenyl-1-benzotriazolyl-5'-(4— methoxytrityl)-thymidin—З'-phosphat gegeben. Nach 18 Stunden bei Raumtemperatur werden zur Reaktionslösung unter Eiskühlung 10ml Wasser und 200ml Essigsäureethylester zugegeben. Die organische Phase wird mehrmals mit Natriumhydrogencarbonat und Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und auf ein kleines Volumen eingeengt. Das im Phosphat-Teil und am 5'-bzw. З'-Ende geschützte Dinukleotid wird durch Eintropfen in Ether-Hexan 1:1 gefällt. DC: R_f 0,48 in Dichlormethan-Methanol (9:1).

b) Synthese des Trinukleotids:

1,17g (1 mMol) des oben beschriebenen vollgeschützten Dinukleotids werden in 30ml Dichlormethan-Methanol 7:3 gelöst und unter Eiskühlung mit einer Lösung von 1,9g p-Toluolsulfonsäuremonohydrat in 20ml Dichlormethan-Methanol 7:3 versetzt. Nach 2 Stunden wird eiskalte Natriumhydrogencarbonat-Lösung zugegeben und mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wird getrocknet, eingeengt und in Hexan eingetropft. Das ausgefallene rohe Dinukleotid mit freier 5'-Hydroxygruppe wird an Kieselgel mit einem Gradienten von 2-8% Methanol in Dichlormethan chromatographiert. DC: Rf 0,33 in Dichlormethan-Meth9P">l(9:1).

850mg dieses 5'-Hydroxy-dinukleotids und 1,06g Triethyiammonium-2-ch;orphenyl-5'-(4-methoxytrityl)-thymidin-3'-phosphat [vgl. Abschnitt a) α)] werden zweimal mit Pyridin eingedampft, dann in 10ml abs. Pyridin gelöst und mit 560mg Mesitylensulfonyl-3-nitro-1,2,4-triazolid (MSNT) versetzt. Nach 2 Stunden werden 2ml eiskaltes Wasser zugegeben und nach einer weiteren Stunde mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wird mit gesättigtem Natriumhydrogencarbonat und Wasser gewaschen, getrocknet, eingeengt und mit Ether versetzt. Das ausgefallene Trinukleotid wird durch Chromatographie an Kieselgel gereinigt. Rf 0,45 in Dichlormethan-Methanol (9:1).

-21- Beispiel 4: Analog Beispiel 3 werden folgende geschützte Trinukleotide der allgemeinen Formel

MMT—0—Б —0—P—0—B —0—P—0—B —0—P—OCH₂CH₂ CN

Cl Cl Cl

abgekürzt B¹B²B³, hergestellt. Für die Nukleoside B¹, B², B³ werden folgende Abkürzungen verwendet: A = N-Benzoyl-deoxyadenosin C = N-Benzoyl-deoxycytidin G = N-lsobutyryl-deoxyguanosin T = Thymidin

Verbindung R_f ^al Verbindung R_f ^a)

TTT 0,45 ATG 0,48

TTC 0,55 ACT 0,53

TCT 0,46 ACC 0,48

TAC 0,56 AAT 0,49

TAA 0,53 AAC 0,46

TAG 0,60 AAA 0,51

TGT 0,42 AGT 0,45

TGG 0,43 AGA 0,49

CTG 0.46 GTT 0,45

CCT 0,45 GCT 0,55

CCG 0,47 GCA 0,49

CAT 0,55 GCG 0,48

CAA 0,52 GAT 0,44

CAG 0,44 GAC 0,48

CGT 0,49 GAA 0,50

GGA 0,44 GGT 0,46 a) Dünnschichtchromatogramm auf Kieselgel in Dichlormethan—Methanol 9:1.

Beispiel 5: Synthese des DNA-Fragments einer Länge von 61 Basen von Base Nr. 172 bis Base Nr. 232 des komplementären DNA-Stranges (172/61 Komplementär)

a) Abspaltung der 2-Cyanethylschutzgruppe der Trinukleotide:

15μΜοΙ der Trinukleotide aus Beispiel 3 und 4 werden unter Feuchtigkeitsausschluß in 60μΙ Pyridin-Acetonitri!-Triethylamin 1:1:1 gelöst. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur werden 0,7 ml peroxidfreier Ether zugetropft und der Niederschlag abzentrifugiert. Das rohe Triethylammoniumsalz wird in 50μΙ Pyridin gelöst und nochmals mit 0,5 ml Ether ausgefällt, abzentrifugiertund 15 Stunden am Hochvakuum getrocknet.

b) Kupplung der teilgeschützten Trinukleotide mit der an Polystyrol-Harz gebundenen Oligonukleotidkette: Alle Operationen werden unter Feuchtigkeitsausschluß in einem Reaktionsgefäß mit 280μΐ Inhalt und mikroprozessorgesteuerter Lösungsmittel- und Reagens-Zugabe durchgeführt. 17,6mg (1,5/xMol) des Cytidin-Polystyrol-Harzes (Beispiel 1) werden im Reaktionsgefäß vorgelegt und folgenden Operationen unterworfen:

1. Methylenchlorid, 2ml/min., 5min.

2. Methylenchlorid-Isopropanol (85:15), 2ml/min., 2min.

3. Zinkbromid 1 M und 1,2,4—Triazol 0,02M in Methylenchlorid-Isopropanol (7:3), 1 ml/min., 2-3,5min.

4. Methylenchlorid-Isopropanol (85:15), 2ml/min., 3min.

^r TriethylammoniumacetatO,5M in DMF, 2ml/min., 10min.

6. Moiekularsieb-getrocknetes Pyridin, 2 ml/min., bmin.

7. Tetrahydrofuran (Peroxid-frei, Molekularsieb-getrocknet), 2ml/min., 5min.

8. Stickstoffstrom, 10 min.

9. Injektion 15/*MolTrinukleotid AAA(Trimethylammoniumsalzaus Abschnitta)) und 13,3mg (45μ.ΜοΙ) Mesitylensulfonyl-3-nitro-1,2,4-triazolid (MSNT) gelöst in 160μΙ Pyridin

10. 40⁰C, 30min.

11. Pyridin, 2ml/min., 5min.

12. Acetanhydrid 5% und 4-Dimethylaminopyridin 2,5% in Pyridin, 2ml/min., 5 min.

13. Pyridin, 2ml/min., 5min.

14. Pyridin-Isopropanol (1:1),2ml/min.,3min.

Alle 14 Operationen werden 19mal wiederholt, wobei bei der 9. Operation anstelle von AAA jeweils folgende Trinukleotide in Form ihrer Triethylammoniumsalze (Abschnitt a)) eingesetzt werden: AGA, TGT, GGT, CTG, TAC, TAG, CGT, CAA, TAA, GGT, CAT, GAA, GCG, CAT, CAA, AAC, CCT, GAT, CAG. Die mittlere Kupplungsausbeute beträgt 96%. Das Endprodukt hat folgende Struktur: MMT-CAGGATCCTAACCAACCATGCGGAACATGGTTAACAACGTTAGTACCTGGGTTGTAGAAAAC-Polystyrol

c) Abspaltung des DNA-Fragments vom Träger und Abspaltung der Schutzgruppen:

40,2 mg (ca. 0,66μΜοΙ) DNA-Syntheseharz/172/61 komplementär werden mit 66mg (0,4OmMoI) o-Nitrobenzaldoxim und50/d (0,4OmMoI) 1,1,3,3-Tetramethylguanidin in 400μΙ 95%igem Pyridin während 3 Stunden bei 50⁰C und während 12 Stunden bei Raumtemperatur gehalten. Nach dem Abblasen des Pyridins mit Stickstoff wird der Rückstand mit 1,6ml wäßrigem Ammoniak (33%) versetzt und im geschlossenen Gefäß während 24 Stunden bei 50⁰C gehalten.

Die abgetrennte flüssige Phase wird im Vakuum vom Ammoniak befreit und 3mal mit je 3 ml peroxidfreiem Diethylether gewaschen. Nach dem Abtrennen der niedermolekularen Bestandteile an einer Biogel P6 Säule (100-200mesh, 3 χ 66cm, 0,01 Molar Thrimethylammoniumhydrogencarbonat ph7,5,1,5ml/min.) werden 285ODs (260nm) DNA isoliert.

Insgesamt 60ODs werden an einer HPLC-Säule aufgetrennt (PRP-1/Hamilton, 250 χ 4,6mm). Gradient (Lösung A: 0,05M Triethylammoniumacetat pH7,0; Lösung B: Lösung A: Acetonitril 1:1): 30% B in A -» 60% B in A in 20 min. bei 50⁰C in 2 ml/min.

Der lipophiie Hauptpeak C Retentionszeit ca. 14min.) wird gesammelt, an einer DE52-Cellulose (Whatman) Säule auf konzentriert, eluiert und mit Ethanol gefällt. Zur Abspaltung der 4-Methoxytrityl-Schutzgruppe wird der Niederschlag in 50μΙ Essigsäure/H₂O (4:1) gelöst und 45min. bei Raumtemperatur gehalten. Das Reaktionsprodukt wird lyophilisiert, mit Ethanol gefällt und zur Reinigung auf einem 8% Polyacrylamidgel (7 M Harnstoff) elektrophoretisch aufgetrennt. Die der erwarteten DNA-Größe entsprechende Bande wird ausgeschnitten und das Produkt elektroeluiert, an DE52-Cellulose aufkonzentriert und die DNA der Struktur

5'-CAGGATCCTAACCAACATGCGGAACATGGTTAACAACGTTAGTACCTGGGTTGTAGAAAAc-S' mit Ethanol gefällt.

Beispiel 6: Analog Beispiel 5 werden folgende DNA-Fragmente (5'-3') hergestellt:

CTGGAATTCATGACTGAATTTGGTTCTGAACTGAAATCTT

30/37 komplementär

AACAGTTTTACCAACAACTTCTGGGAAAGATTTCAGT

GACCAGGCTCGTGAATACTTCACTCTGCATTACC

91/37 komplementär (C)

CCGGCAGGAAGTAAACGTCGTACTGCGGGTAATGCAG

91/37 komplementär (B)

CCGGCAGGAAATGAACGTCGTACTGCGGGTAATGCAG

CCGGAAGGTTCTCCTGTTACTCTGGACCTGCGTTACAACCGTGTTCGTGTTTTCTACAACC Ferner werden die folgenden verkürzten Fragmente hergestellt:

1/40 (Δ12) (C)

CTGGAATTCATGTCTGAACTGAAATCTT

und 1/40 (Δ18) (C")

CTGGAATTCATGCTGAAATCTT

Beispiel 7: Phosphorylierung der Fragmente 30/37,67/34,124/61 und 172/61

Die Phosphorylierung und die radioaktive Markierung an den 5'-Enden erfolgt mit [7^-³²P]ATP und T₄ Polynukleotid-Kinase (Boehringer) wie beschrieben (19).

Beispiel 8: Polymerisation zu Duplex III (Teilstück F₂ des Eglin C und Eglin B-Gens)

Je 5OpMoI Fragment 124/61/kinasiert und Fragment 172/61/kinasiert werden in 24μΙ Wasser gelöst, die Lösung während 3min.

auf 90⁰C erwärmt und innerhalb von 5 min. auf 12°C abgekühlt. Nach Zugabe von 4μΙ Endo-R Puffer (0,1 Molar Tris-HCI pH 7,5, 66mM MgCI₂,66mM 0-Mercaptoethanol, 0,6M NaCl), 10μΙ Deoxynucleosidtriphosphat-Gemisch (dATP, dCTP, dGTP, TTP, je 2 · 10~³ Molar, mit NH₃ auf pH 7,0 eingestellt) und2/xl (10 Einheiten) DNA-Polymerase I, Klenow-Fragment (Boehringer) wird während 30 min. bei 12°C inkubiert. Die Reaktion wird durch 3minütiges Erhitzen auf 90°C gestoppt und das Gemisch bis zur Weiterverarbeitung bei -8O⁰C aufbewahrt.

In analoger Weise werden die Fragmente 1/40 und 30/37,67/34 und 91/37 (C) bzw. 67/34 und 91/37 (B) zu den Duplexen I, Il (C) bzw. Il (B) polymerisiert.

Die Duplexe MII haben die folgenden Strukturen:

Duplex I

CTGGAATTCATGACTGAATTTGGTTCTGAACTGAAATCTTTCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT GACCTTAAGTACTGACTTAAACCAAGACTTGACTTTAGAAAGGGTCTTCAACAACCATTTTGACAA Duplex Il (C)

GACCAGGCTCGTGAATACTTCACTCTGCATTACCCGCAGTACGACGTTTACTTCCTGCCGG CTGCTCCGAGCACTTATGAAG^GAGACGTAATGGGCG fCAl GCTGCAAATGAAGGACGGCC Duplex Il (B)

GACCAGGCTCGTGAATACTTCACTCTGCATTACCCGCAGTACGACGTTCATTTCCTGCCGG CTGGTCCGAGCACTTATGAAGTGAGACGTAATGGGCGTCATGCTGCAAGTAAAGGACGGCC Duplex IM (Teilstück F₂ des Eglin C- und Eglin B-Gens)

CCGGAAGGTTCTCCTGTTACTCTGGACCTGCGTTACAACCGTGTTCGTGTTTTCTACAACCCAGGTAC GGCCTTCCAAGAGGACAATGAGACCTGGACGCAATGTTGGCACAAGCACAAAAGATGTTGGGTCCATG TAACGTTGTTAACCATGTTCCGCATGTTGGTTAGGATCCTG

ATTGCAACAATTGGTACAAGGCGTACAACCAATCCTAGGAC

In gleicher Weise werden die Fragmente 1/40 (Д12) (C) und 30/37 sowie die Fragmente 1/40 (Λ18) (C") und 30/37 zu den Duplexen I (C) und I (C") polymerisiert.

Die Duplexe I (C) und I (C") haben die folgenden Strukturen:

Duplexl(C')

CTGGAATTCATGTCTGAACTGAAATCTTTCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT GACCTTAAGTACAGACTTGACTTTAGAAAGGGTCTTCAACAACCATTTTGACAA Duplex I (C")

CTGGAATTCATGCTGAAATCTTTCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT

GACCTTAAGTACGACTTTAGAAAGGGTCTTCAACAACCATTTTGACAA

Beispiel 9: Ligation von Duplex I mit Duplex Il (C), Herstellung des Teilstücks F₁ (C) des Eglin C-Gens Je 6OpMoI Duplex I und Duplex Il (vgl. Beispiel 8; nur an den A und G5'-Enden kinasiert) werden in 54/J Ligase-Puffer (66 mM TrisHCI pH7,5,6,6mM MgCI₂,1OmM Dithiothreitol, 5mM ATP) gelöst, mit 6μΙ (= 6 Einheiten) T₄-DNA-ügase (Boehringer) versetzt und während 21 Stunden bei 2O⁰C inkubiert. Die Reaktion wird durch 5minütiges Erhitzen auf 7O⁰C gestoppt und die DNA nach Phenol/Chloroform-Extraktion durch Ethanolfällung isoliert.

Nach Auftrennung des Gemisches aus einem 8% Polyacrylamidgel (nativ) durch Elektrophorese werden die Ligationsprodukte mit 122-132 Basenpaaren elektroeluiert, an einer DE52-Cellulose-Säule aufkonzentriert und nach Elution durch Ethanolfällung isoliert.

Das Teilstück F₁ (C) des Eglin C-Gens hat die folgende Struktur:

ctggaattcatgactgaatttggttctgaactgaaatctttcccagaagttgttggtaaaactgtt gaccttaagtactgacttaaaccaagacttgactttagaaagggtcttcaacaaccattttgacaa gaccaggctcgtgaatacttcactctgcattacccgcagtacgacgtttacttcctgccgg ctggtccgagcacttatgaagtgagacgtaatgggcgtcatgctgcaaatgaaggacggcc In analoger Weise werden je 6OpMoI Duplex I (C) bzw. i (C") und Duplex Il zu den Teilstücken F₁ (C) bzw. Fi (C") des verkürzten Eglin C-Gens verknüpft.

Die Teilstücke F₁ (C) und F₁ (C") haben die folgenden Strukturen:

ctggaattcatgtctgaactgaaatctttcccagaagttgttggtaaaactgtt gaccttaagtacagacttgactttagaaagggtcttcaacaaccattttgacaa gaccaggctcgtgaatacttcactctgcattacccgcagtacgacgtttacttcctgccgg ctggtccgagcacttatgaagtgagacgtaatgggcgtcatgctgcaaatgaaggacggcc

F₁ (C)

CTGGAATTCATGCTGAAATCTTTCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT GACCTTAAGTACGACTTTAGAAAGGGTCTTCAACAACCATTTTGACAA GACCAGGCTCGTGAATACTTCACTCTGCATTACCCGCAGTACGACGTTTACTTCCTGCCGG CTGGTCCGAGCACTTATGAAGTGAGACGTAATGGGCGTCATGCTGCAAATGAAGGACGGCC

F₁ (C")

Beispiel 10/ Ligation von Duplex I mit Duplex Il (B), Herstellung des Teilstücks F₁ (B) des Eglin B-Gens

In analoger Weise, wie in Beispiel 9 beschrieben, werden je 6OpMoI Duplex I und Duplex Il (B) miteinander ligiert.

Das Teilstück F₁ (B) des Eglin (B)-Gens hat die folgende Struktur:

CTGGAATTCATGACTGAATTTGGTTCTGAACTGAAATCTTTCCCAGAAGTTGTTGGTAAAACTGTT GACCTTAAGTACTGACTTAAACCAAGACTTGACTTTAGAAAGGGTCTTCAACAACCATTTTGACAA GACCAGGCTCGTGAATACTTCACTCTGCATTACCCGCAGTACGACGTTCATTTCCTGCCGG CTGGTCCGAGCACTTATGAAGTGAGACGTAATGGGCGTCATGCTGCAAGTAAAGGACGGCC

Beispiel 11: Herstellung des Plasmids pML 87, enthaltend die F₁ (C)-DNA des Eglin C-Gens (Fig. 2)

a) Herstellung des linearisierten Vektors pBR322/EcoRI/Ball.

30/xg pBR322 Plasmid-DNA werden mit 5 Einheiten Ball Restriktionsendonuclease (Biolabs) in 200 ml einer Lösung aus 100дд/тІ Gelatinefür5 Stunden bei37°C verdaut. Anschließend wirddiese Lösung auf 10OmM TrisHCI (pH 7,5), 5OmM NaCI eingestellt und die DNAmit30 Einheiten EcoRI-Restriktionsendonuclease(Biolabs)für2 Stunden bei 37"Cverdaut. Dann wird die Lösung auf TNE eingestellt, mit 1 Volumen Phenol und Chloroform extrahiert und die verdaute DNAmit 2 Volumen Alkohol bei -20⁰C über Nacht ausgefällt.

Der aus der pBR322 DNA herausgeschnittene Vektor (рВРЗгг/ЕсоРІ/ВаІІ, 2916 Basenpaare) wird durch Dichtegradientenzentrifugation in Sucrose (5-23%) in 5OmMTrJs-HCI (pH8) und 1 mM EDTAvom kleinen DNA-Fragment (1445 Basenpaare) abgetrennt. DieZentrifugation wird bei 36000upm in einem TST41 Rotor (Kontron AG) für 16 Stunden bei 15°C durchgeführt. Anschließend werden von der zentrifugierten Lösung Fraktionen ä 0,2ml mit einem ISCO Gradienten-Sammler gewonnen. Diejenigen Fraktionen, welche das große DNA-Fragment (2916 Basenpaare) enthalten, werden vereinigt und die DN A mit Alkohol ausgefällt. DerNiederschlag wird in lOO^MOmMTrisHCKpHS), 0,1 mMEDTAgelöstundbiszuseinerVerwendungalsKlonier-Vektor bei-20°C aufgehoben. 5,1 ^д(=10,5рМоІ Enden) DNA werden erhalten.

b) Herstellur 3 der F₁ (O-DNA/EcoRi

16ng (= 0,84pMol Enden) der chemisch synthetisierten F₁ (C)-DNA (siehe Beispiel 9) werden mit5 Einheiten EcoRI Restruktionsendonuclease(Biolabs)in50/Al100mMTrisHCI(pH7,5),50mMNaClund100Mg/mlGelatinefür1 Stundebei37°Cverdaut. Danach werden derLösungO,5/j.g(=1pMolEnden)desiinearisiertenVektorspBR322/EcoRI/Ball (Beispiel 11a)zugesetzt. Anschließend wird das Enzym durch Erhitzen auf 65⁰C nach 10min inaktiviert, die Lösung auf TNE eingestellt und mit Phenol/Chloroform extrahiert. Die DNA wird mit Alkohol präzipitiert. Die ausgefällte DNA wird unter Alkohol bei -20⁰C zur Weiterverarbeitung gelagert.

c) Ligierung der pBR322/EcoRI/Ball Vektor-DNA mit der F₁ (O-DNA/EcoRI und Konstruktion des Plasmids pML87.

Der in Beispiel 11b) erhaltene DNA-Niederschlag, welcher die beiden genannten DNA-Bruchstücke enthält, wird in 30μΙ einer Lösung von 50mMTris-HCI(pH7,8), 1OmM MgCI₂,1OmM DTT, 0,5mM ATP, 100/xg/MI Gelatine gelöst und mit 25 Einheiten^lT₄DNA-ügase (Biolabs) bei 15°C für 16 Stunden behandelt. Auf diese Weise entsteht in der Lösung das rekombinierte PlasmidpML87, welches die F₁ (C)-DNA enthalt.

d) Transformation von E. coli HB101 mit dem Plasmid pML87

Die für die Transformation notwendigen mit Calcium vorbehandelten E. CoIi HB101 Zellen werden, wie von Mandel et. al. (6) beschrieben, hergestellt.

Die untere) erhaltene Lösung, welche das reekombinierte Plasmid pML87 enthält, wird für 10min auf 65°C erhitzt, um die T₄-DNA Ligase zu inaktivieren und anschließend auf 37°C abgekühlt. 10μΙ dieses Reaktionsgemisches werden zu 150μΙ Calciumbehandelten E. coli HB101-Zellen in 10 mM MgCI₂ und 10 mM Tris · HCI (pH 7.5) in einem Gesamtvolumen von 200μΙ gegeben. Danach wird diese Mischung für 30 min in Eisgekühlt, 2 min auf 42 °C erwärmt und dann 50 min in 1 ml L-Medium (vgl. Beispiel 21) bei 37⁰C stehen lassen. Darauf wird die Mischung in Aliquoten ä 0,2ml auf 5 Agarplatten (McConkey-Agar, Difco), welche 60μg/ml Ampicillin (Serva) enthalten, ausgestrichen. Die Agarplatten werden hernach bei 37⁰C 16-18 Stunden gehalten. 470 Ampicillin-resistente Kolonien des transformierten E. coli HB 101 werden erhalten.

e) Screening der Kolonien, die F₁ (C)-DNA enthalten

470 tranformierte Kolonien (Beispiel 11 d) werden auf Nitrozellulosefilter B85 (Schleicher und Schüll) abgedrückt. Nach Grunstein und Hogness (24) werden die Kolonien lysiert und ihre denaturierte DNA auf dem Filter fixiert. Anschließend erfolgt eine Vorhybridisierung der Filter in 20 ml (pro Filter) 4 χ SET [= Lösung von 30 mM Tris · HCL (pH 8), 150 mM NaCI, 1 mM EDTA], 0,1 % (g/v) Ficoll 400 (Pharmacia), 0,5% SDS, 50дд/тІ denaturierte Kalbsthymus-DNA für 4 Stunden bei 64°C. Danach werden die Nitrozellulosefilter in 20 ml (pro Filter) 5 x SET (g/v) Ficoll 400,0,2% SDS und 50 дд/ті denaturierter Kalbsthymus-DNA für 16 Stunden bewi 64°C mit der ³ⁱP-radioaktiv markierten Probe (ca. 10³—10⁴ Cerencov cpm pro Filter) behandelt. Als Probe wird das Oligonucleotid 91/37 komplementär (C) (vgl. Beispiel 6) verwendet.

Anschließend werden die Filter in 2 χ SET, 0,2% SDS bei Raumtemperatur zweimal gewaschen, danach zweimal in 2 χ Set, 0,5 %SDS bei 60⁰C (zuerst 30 min, dann 60 min lang). Dann werden die Filter zwischen 3MM Papier (Whatman) getrocknet und bei -8O⁰C auf ein Röntgen-Film (Fuji) mit einer Verstärkerfolie (Intensifying screen, llford) für 1-2 Tage gelegt.

Das erhaltene Autoradiogramm zeigt 71 positive Kolonien (Klone), die zur Weiterarbeit verwendet werden können, eine davon erhält die Bezeichnung pML87.

In analoger Weise wird die chemisch synthetisierte F₁ (C)-DNA bzw. F₁(C)-DNA(VgI. Beispiel 9) mit EcoRI verdaut und mit dem linearisierten Vektor pBR322/EcoRI/Bali ligiert, wobei das Plasmid pML87 (C), enthaltend die F₁ (C)-DNA, bzw. das Plasmid pML87 (C"), enthaltend die F₁ (C)-DNA, entsteht. E. coli HB101-Zellen werden mit dem Plasmid pML87 (C) bzw. pML87 (C") transformiert und auf Ampicillin-haltigen Agarplatten kultiviert. 95 bzw. 120 Ampicillinresistente Kolonien werden erhalten. Das Screening der transformierten Kolonien mit dem Oligonucleotid 91 /37 komplementär (C) führt zur Identifizierung von 37 Kolonien, die F₁ (C)-DNA enthalten, bzw. von 58 Kolonien, die F₁ (C)-DNA enthalten.

Beispiel 12: Herstellung des Plasmids pML90, enthaltend die F₁(B)-DNA des Eglin B-Gens

In analoger Weise, wie in Beispiel 11b) beschrieben, werden 16/xg der chemisch synthetisierten F₁ (B)-DNA mit 5 Einheiten EcoRI-Restriktionsendonuclease verdaut und mit dem linearisierten Vektor pBR322/EcoRI/Ball gemischt. Das Enzym wird inaktiviert und die DNA mit Alkohol präzipitiert. Der DNA-Niederschlag wird gemäß Beispiel 11 c) mit T₄ DNA-Ligase behandelt, wobei ein Plasmid entsteht, welches die F₁(B)-DNA enthält.

Die rekombinierte Plasmide enthaltende Lösung wird entsprechend Beispiel 11 d) zur Transformation von Calcium-behandelten E. coli HB101-Zellen verwendet. 310 Ampicillin-resistente Kolonien des transformierten E. coli HB101 werden erhalten. Die 310 Kolonien werden, in Analogie zu Beispiel 11 e), auf das Vorhandensein von F₁ (B)-DNA geprüft, wobei als Probe das Oligonucleotid 91/37 komplementär (B) verwendet wird. Im erhaltenen Autoradiogramm sind 55 positive, zur Weiterarbeit verwendbare Klone erkennbar. Einer davon erhielt die Bezeichnung pML90.

Beispiel 13: Herstellung des Plasmids pML136, welches die F₂-DNA enthält (Fig.3)

a) Herstellung des linearisierten Vektors pBR322/ßamHI/Nrul

15jug pBR322 Plasmid-DNA werden mit 30 Einheiten BamHI Restriktionsendonuclease 30min bei 37°C in einer Lösung von 10OmM NaCI, 6mM Tris · HCI (pH 7,9), 6mM MgCI₂ und 100/ug/ml Gelatine verdaut.

Anschließend werden der Lösung 15 Einheiten Nrul Restriktionsendonuclease zugefügt und 2 Stunden bei 37⁰C verdaut. Das Reaktionsgemisch wird für 10min auf 70⁰C erwärmt, um die Enzyme zu inaktivieren. Danach werden die beiden DNA-Fragmente durch Gelelektrophorese an 1%iger niedrigschmelzender Agarose in Tris-Acetat EDTA Puffer pH8 voneinander getrennt. Nach Anfärben der DNA im Agarosegel mit EtBr wird die Stelle des Gels, welche die DNA-Bande des pBR322/BamHI/ Nrul Vektors (= 3766 Basenpaare) enthält, aus dem Gel ausgeschnitten und bei 65°C 10 min verflüssigt. Anschließend werden zu dem verflüssigten Agarosegelstück 2 Volumen 100 mM Tris · HCI (pH8,7) gegeben und die Mischung auf 37⁰C abgekühlt. Diese DNA-Mischung wird mit 0,5 Einheiten alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (Boehringer) für 30min bei 37X verdaut. Durch Erhitzen der Lösung auf 65⁰C für 60min wird das Enzym inaktiviert.

Zu dieser phosphatasebehandelten DNA-Lösung werden 20 Volumina TNE hinzugefügt und die DNA nach Mueller et al. (23) durch DE -52 Chromatographie gereinigt, mit Phenol/Chloroform extrahiert und die DNA bei -2O⁰C über Nacht mit Alkohol ausgefüllt. Der DNA-Niederschlag wird in 50μΙ 0,01 M Tris · HCI (pH 8), 0,1 mM EDTA gelöst und bis zur Verwendung bei -20°C aufbewahrt, 1,5/^g (= 2,4pMol Enden) DNA werden erhalten.

b) Herstellung der F₂-DNA/BamH!

1,6/xg (= 9OpMoI Enden) der chemisch synthetisierten F₂-DNA (Beispiel 8) werden mit 16 Einheiten BamHI Restriktionsendonuclease (Biolabs! in 20 μΐ 150 mM NaCl, 6 mM Tris · HCl (pH7,9), 6 mM MgCl₂ und 100 цд/ті Gelatine für 30 min bei 37⁰C verdaut. Anschließend werden der Lösung 60 ng (= 96nMol Enden) des linearisierten Vektors pBR?22/BamHI/Nrul (Beispiel 13a) zugesetzt, die ganze Lösung auf TNE eingestellt und mit Phenol/Chloroform extrahiert und die DNA mit 2 Volumen Alkohol ausgefällt. Die ausgefällte DNA wird bis zur Weiterverarbeitung unter Alkohol bei -20°C gelagert.

c) Ligierung der pBR322/BamHI/Nrul Vektor-DNA mit der F₂-DNA/BamHI und Konstruktion des Plasmids pML136

Der unter Beispiel 13 b) erhaltene DNA-Niederschlag, der die beiden genannten DNA-Bruchstücke enthält, wird in 20μΙ einer Lösung von 5OmMTHs · HCI (pH 7,8), 1OmM MgCI₂JOmM DTT, 0,5 mM ATP, 100μg/ml Gelatine gelöst und mit 15 Einheiten/μΙ T₄ DNA-Ligase (Biolabs) bei 15°C für 3 Stunden behandelt. Auf diese Weise entsteht in der Lösung das rekombinierte Plasmid pML136, welches die F₂-DNA enthält.

d) Transformation von E. coli HB101 HB101 mit dem Plasmid pML136

Die Transformation der mit Calcium behandelten E. coli HB101 Zellen erfolgt wie in Beispiel 11 d) beschrieben. Es werden 10μΙ des in Beispiel 13c) erhaltenen Reaktionsgemisches verwendet. 65 Ampicillin-resistente Kolonien werden erhalten.

e) Screening der Kolonien, die F₂-DNA enthalten

65 transformierte Kolonien (Beispiel 13d) werden auf F₂-DNA geprüft, wie in Beispiel 11e) beschrieben. Als radioaktive Probe wird das Oligonucleotid 172/61 komplementär (vgl. Beispiel 5) verwendet. Im Autoradiogramm werden 2 positive Kolonien erhalten, eine davon erhält die Bezeichnung pML136.

Beispiel 14: Charakterisierung der Klone pML87, pML90 und pML136

Die DNAs der rekombinierten Plasmide pML87, pML90 und pML136 werden nach Ish-Horowitz isoliert (25). Die Nucleotidsequenzen des F₁(C)-DNA-, F₁(B)-DNA- und F₂-DNA-Inserts werden nach Maxam und Gilbert bestimmt (3). Zu diesem Zweck werden je Юдд Plasmid-DNA von pML87 und pML90 mit EcoRI-Restriktionsendonuclease und Юдд Plasmid-DNAvon pML136 mit BamHI-Restriktionsendonuclease gespalten und die linearisierten DNAs durch Gelelution aus Agarosegel isoliert [vgl. Beispiele 11a) bzw. 13a)]. Anschließend werden die isolierten DNAs mit alkalischer Phosphatase verdaut und über DE-52 chromatographiert (vgl. Beispiel 13a). Danach werden die DNAs am 5'-Ende mit [7-³²P]ATP (spezifische Aktivität >5000Ci/ mmol, Amersham) undT₄-Polynucleotid-Kinase (P-L-Biochemicals) radioaktiv markiert. Die radioaktiv markierten DNAs werden dann mit einer zweiten Restriktionsendonuclease (Pvull) gespalten. Die entstandenen DNA-Fragmente werden durch Gelelution aus Agarose isoliert. Im Falle von pML87 und pML90 wird dann vom PvUII-EcoRI* Fragment (ca. 2190 Basenpaare) die Nucleotidsequenzder F₁ (C)-bzw. F₁ (B)-DNA, im Fall vom pML136 die der F₂-DNA im Pvull-BamHI*-Fragment (ca. 1815 Basenpaare) bestimmt. (* gibt das DNA-Ende an, das radioaktiv markiert ist). Die Nucleotidsequenzen, welche für die F₁ (C)-DNA, F₁ (B)-DN A und F₂-DNA bestimmt werden, sind identisch mit den in den Beispielen 8-10 dargestellten.

Beispiel 15: Herstellung des Plasmids pML141, enthaltend die F₁ (C)-F₂-DNA (Fig.4)

a) Herstellung des linearisierten Vektors pBR322/EcoRI/BamHI

10/u.g pBR322 Plasmid-DNA werden mit je 10 Einheiten EcoRI- und BamHI-Restriktionsendonuclease (Biolabs) in 100μΙ einer Lösung von 5OmMTHs · HCI (pH 7,5), 5OmM NaCI, 6 mM MgCI₂ und 100μg/ml Gelatine für 1 Stunde bei 37°C verdaut. Anschließend wird diese Lösung auf TNE eingestellt, mit 1 Volumen Phenol und Chloroform extrahiert und die DNA mit 2 Volumen Alkohol bei -20°C über Nacht ausgefällt.

Der aus der pBR322-DNA herausgeschnittene Vektor (pBR322/EcoRI/Ball, 3986 Basenpaare) wird durch Dichtegradientenzentrifugation in Sucrose (5—23%) in 50mMTris · HCI (pH8) und 1 mM EDTA vom kleineren DNA-Fragment (376 Basenpaare) abgetrennt. Die Zentrifugation wird bei 30000 upm in einem TST 41 Rotor (Kontron AG) für 15 Stunden bei 15⁰C durchgeführt. Anschließend werden von der zentrifugierten Lösung Fraktionen ä 0,2ml mit einem ISCO Gradienten-Sammler gewonnen. Diejenigen Fraktionen, die das große DNA-Bruchstück (3986 Basenpaare) enthalten werden vereinigt und die DNA mit Alkohol ausgefällt. Der Niederschlag wird in 100 μΙ 50 mM Tris · HCI (pH 8) mit 0,3 Einheiten alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (Boehringer) für 30 min bei 37°C verdaut. Durch Erhitzen der Lösung auf 65°Cfür 1 Stunde wird das Enzym inaktiviert. Anschließend wird die Lösung mit Phenol/CHCI₃ extrahiert und die DNA über Nacht bei —20°C mit Alkohol ausgefällt. Der Niederschlag wird in 50μΙ 1OmM Tris · HCI (pH 8—,0,1 mM EDTA gelöst und bis zu seiner Verwendung als Klonier-Vektor bei -20°C aufbewahrt. 3,75μg DNA (= 5,7pMol Enden) wurden erhalten.

b) Herstellung der F₁ (O-DNA/EcoRI/Hpall und der F₂-DNA/BamHI/Hpall I. Herstellung der F₁ (O-DNA/EcoRI/Hpall

10μg Plasmid DNA vom pML87 werden zuerst mit 20 Einheiten Hpall Restriktionsendonuclease in 100μΙ einer Lösung von 1OmM Tris · HCI (pH7,4), 6mM KCI, 1OmM MgCI₂, mM DTT und 100μg/ml Gelatine verdaut. Es folgt eine Phenol/Chloroform Extraktion der Lösung und Ausfällung der entstandenen DNA-Fragmente mit Alkohol bei —20°C. Das DNA-Fragmentgemisch wird anschließend durch Elektrophorese an einem 6% Polyacrylamidgel in Tris-acetat-EDTA Puffer pH8 aufgetrennt. Das größte DNA-Fragment (= 586 Basenpaare) wird durch Gelelution isoliert und anschließend mit EcoRI-Restriktionsendonuclease gespalten (vgl. Beispiel 11 a). Das entstandene DNA-Fragmentgemisch wird abermals einer Elektrophorese an 8% Polyacrylamid unterworfen. Daraus werden 40 ng von F-ilO-DNA/EcoRI/Hpall (127 Basenpaare) isoliert.

II) Herstellung der F₂-DNA/BamHI/Hpall

20μg Plasmid DNA vom pML136 werden mit 20 Einheiten BamHI Restriktionsendonuclease gespalten. Ein Aliquot (1 μg) dieser linearisierte Plasmid DNA/BamHI wird durch Gelelution aus einem Agarosegel isoliert (vgl. Beispiel 13a) und mit Iy-³²P]ATP radioaktiv markiert (vgl. Beispiel 14). Die Hauptmenge der Plasmid DNA/BamHI wird dann mit dieser radioaktiv markierten DNA vermischt, mit Pvull Restriktionsendonuclease verdaut und das Pvull-BamHI* DNA Fragment (1203 Basenpaare) nach Gelelektrophorese an 1 % Agarose isoliert. 14μg des Pvul-BamHI* Fragments werden mit Hpall Restriktionsendonucleas" verdaut (siehe obei,), anschließend das DNA-Gemisch durch 8% Polyacrylamidgelelektrophorese aufgetrennt und 150ng der F₂-DNA/BamHI*/Hpall (109 Basenpaare) durch Gelelution isoliert.

c) Ligation der F₁ (C)-DNA mit der F₂-DNA und Konstruktion des Plasmids pML141

10ng (= 473nMol Enden) F^O-DNA/EcoRi/Hpall und 9ng (= 495nMol Enden) F₂-DNA/BamHI/Hpall werden in einem Volumen von 20μΙ mit T₄-DNA Ligase, wie bereits unter Beispiel 13c) beschrieben, behandelt. Anschließend wird die Mischung mit Phenol/Chloroform extrahiert und die DNA mit Alkohol präzipitiert. Der DNA-Niederschlag wird dann wie in Beispiel 13a) beschrieben gelöst und mit EcoRI- und BamHI-Restriktionsendonuclease verdaut. Die Lösung wird dann auf TNE eingestellt und 30ng (= 5OnMoI Enden) der Vektor-DNA pBR322/EcoRI/BamHI (vgl. Beispiel 15a) zugegeben. Anschließend wird die Lösung abermals mit Phenol/Chloroform extrahiert und die DNA mit Alkohol ausgefällt. Die präzipitierte DNA-Mischung wird wie in Beispiel 13c) angegeben mit T₄-DNA Ligase (Biolabs) behandelt. Auf diese Weise entstehen in der Löp'jng rekombinierte Plasmide, welche die F₁ (C)-F₂-DNA (Eglin C-Gen) als Insert enthalten.

d) Transformation von E. coli HB101 mit dem Plasmid pML141

Die Transformation der mit Calcium behandelten E. coli HB101 Zellen erfolgt wie in Beispiel 11 d) beschrieben. Es werden 10μΙ des in Beispiel 15c) erhaltenen Reaktionsgemisches verwendet. 2586Ampicillinresistente Kolonien werden erhalten.

e) Screening der Kolonien, die F₁ (C)-F₂-DNA enthalten

18 transformierte Kolonien (Beispiel 15d) werden auf ihren F₁ (C)-F₂-DNA-Gehalt geprüft, wie in Beispiel 11e) beschrieben. Als radioaktive Probe wird eine Mischung der in den Beispielen 5 und 6 beschriebenen Oligonucleotide verwendet. Im Autoradiogramm werden 13 positive Kolonien erhalten, vier davon erhalten die Bezeichnung pML141, pML143, pML144, pML145.

In analoger Weise wird das Plasmid pML87 (C) bzw. pML87 (C") mit den Restriktionsendonucleasen Hpall und EcoRI gespalten, die entstandene F, (O-DNA/EcoRI/Hpall bzw. F₁ (C")-DNA/EcoRI/Hpall mit der F₂-DNA/BamHI/Hpall ligiert und die entstandene F-, (C')-F₂-DNA/EcoRI/BamHI bzw. F₁ (C")-F₂-DNA/EcoRI/BamHI mit dem linearisierten Vektor pBR322/EcoRI/BamHI ligiert. Die erhaltenen Plasmide, welche die F₁ (C)-F₂-DNA bzw. die F₁ (C)-F₂-DNA enthalten, werden zur Transformation von Calciumbehandelten E. coli HB101-Zellen verwendet. Die Kultivierung der transformierten Zellen ergibt 850 bzw. 585 Ampicillinresistente Kolonien. Die transformierten Kolonien werden mit dem Oligonucleotid 91 /37 komplementär (C) auf das Vorhandensein von F₁ (C)-F₂-DNA bzw. F₁ (C)-F₂-DNA geprüft. Es werden 18 Kolonien, die F₁ (C)-F₂-DNA enthalten, und 31 Kolonien, die F₁ (C)-F₂-DNA enthalten, identifiziert. Jeweils eine Kolonie wird ausgewählt und erhält die Bezeichnung pML141 (C) bzw. pML141 (C").

Beispiel 16: Herstellung des Plasmids pML 160, enthaltend die F₁ (B)-F₂-DNA

a. Herstellung der F₁ (B)-DNA/EcoRI/HPall

In analoger Weise, wiefür die F₁ (O-DNA/EcoRI/Hpall beschrieben (Beispiel 15Ы), werden 10^g Plasmid-DNA von pML90 zuerst mit Hpall und danach mit EcoRI gespalten. Das Fragmentgemisch wird, wie beschrieben, durch PAGE gereinigt.

b. Ligation der F₁ (B)-DNA mit der F₂-DNA und Konstruktion eines rekombinierten Plasmids

Die Ligation erfolgt, wie in Beispiel 15c beschrieben, ausgehend von 10/u,g F₁ (B)-DNA/EcoRI/Hpall (s.o.) und 9дд F₂-DNA/ BamHI/Hpall (Beispiel 15ЫІ). Die gebildete F₁ (B)-F₂-DNA/EcoRI/BamHI wird, wie beschrieben, mit 30^g der Vektor-DNA pBR322/EcoRI/BamHI (vgl. Beispiel 15a) ligiert.

Die entstandene, rekombinierte Plasmide enthaltende Lösung wird zur Transformation von mit Calcium-behandelten E. coli HB101-Zellen verwendet. 15 transformierte Klone werden auf ihren F₁ (B)-F₂-DNA-Gehalt geprüft, wie in Beispiel 11e) beschrieben. Als radioaktive Probe wird wieder eine Mischung der in den Beispielen 5 und 6 beschriebenen Oligonucleotide benutzt. In Autoradiogramm werden 6 positive Kolonien erhalten, eine davon erhält die Bezeichnung pML160.

Beispiel 17: Charakterisierung der Klone pML141und pML160

Je Юдд der Plasmid-DNAs von pML141 und pML160 werden jeweils mit EcoRI-bzw. BamHI-Restriktionsendonuclease verdaut (vgl. Beispiel 11 a bzw. 13a). Die Charakterisierung von pML141 und pML160 erfolgt wie bereits in Beispiel 14 beschrieben. Die für die F₁ (C)-F₂-DNA und F-i (B)-F₂-DNA ermittelten Nucleotid-Sequenzen sind mit denjenigen der oben dargestellten synthetischen Eglin C- und Eglin B-Gene identisch.

Beispiel 18: Herstellung des Expressionsplasmids pML147

a) Konstruktion des linearisierten Vektors pHRi148/EcoRI/BamHl, welcher den trp-Promotor-Operator enthält (Fig. 5 und Fig. 6)

A. Konstruktion des Plasmids p159

Юдд Plasmid pBRH_trp (21) werden mit 50 Einheiten EcoRI (Biolabs) gespalten während 60min bei37°C, und das Verdauungsgemisch wird nach Phenolextraktion durch einen Saccharose-Dichtegradienten (5-23%) in 5OmM Tris · HCI (pH 8,0), 1 mM EDTA in einem TST41 (Kontron AG) Rotor fraktioniert. Die Zentrifugation dauert 14 Stunden bei 40000upm und 15°C. 0,3ml Fraktionen werden mit einem ISCO-Gradientkollektor bei 1 ml/min gesammelt. Die Fraktionen, welche das kleinere Fragment enthalten, werden vereinigt, die Lösung wird auf TNE eingestellt und mit 2 Volumen Ethanol bei -20°C gefällt. Die DNA wird nach Zentrifugation in ener Eppendorf-Zentrifuge in 100μΙ 1OmM Tris · HCI pH7,5,0,5mM EDTA gelöst, 5^g dieses DNA-Fragmentes werden mit 5 Einheiten BgIII (Biolabs) 60min bei 37⁰C gespalten. Das Reaktionsgemisch wird mit Phenol und Chloroform extrahiert und die DNA wird mit 2 Volumina Ethanol bei —80⁰C während 10min inkubiert und die DNA durch Zentrifugation gesammelt und erneut in 50μΙ 5OmM Tris · HCI (pH 8,0) gelöst. 2μΙ von dieser Lösung werden entnommen (0,2/xg DNA) und bei einer DNA-Konzentration von Юпд/μΙ in 5OmM Tris · HCI (pH8,0) mit 1 Einheit intestinaler alkalischer Kälber-Phosphate (Boehringer) während 30 min bei 37⁰C inkubiert. Das Enzym wird durch Erhitzen der Lösung während 60 min bei 65⁰C inaktiviert. 0,04μg DNA wird entnommen und5'-terminal mit ΙΟμΰί Iy-³²P]-ATP (>5000Ci/mmol, Amersham) und 5 Einheiten (T₄Polynucleotid-Kinase (P-LBiochemicals) in 20μΙ Reaktionsvolumen in 5OmMTHs HCI (pH9,5), 1OmM MgCI₂, und 5mM DTT, während ЗОтігі b-i 37°C inkubiert. Die radioaktive Probe wird mit der nichtmarkierten Probe (siehe oben) gemischt und die DNA-Fragmente werden durch einen 5-23% Saccharose-Dichtegradienten in 5OmM Tris · HCI (pH 8,0), 1 mM EDTA in einem TST60 Rotor fraktioniert. Die Zentrifugation erfolgt während 5 Stunden bei 60000upm und 15°C. Es werden 0,2ml Fraktionen gesammelt. Die Radioaktivität jeder Fraktion wird durch Messung der Cerencov-Strahlung bestimmt und die Fragmente damit identifiziert. Die gewünschten Fraktionen, welche das kleine DNA-Fragment enthalten, werden vereinigt, die DNA mit 2 Volumina Ethanol gefällt und nach Zentrifugation wieder in 20μΙ 1OmM Tris · HCIpH7,5,0,5mM EDTA gelöst. Das ³²P-markierte EcoRl-BglU DNA-Fragment wird mit 0,2 Einheiten Taql (Biolabs) in 50 μΙ Volumen während 10min bei 37°C partiell gespalten. Das Reaktionsgemisch wird auf 0,2% SDS, 10% Glycerin, 1OmM EDTA, 0,05% Bromphenol-Blau eingestellt und die DNA-Fragmente auf einem 6% Polyacrylamidgel in Tris-Borat-EDTA (22) aufgetrennt. Auf dem Autoradiogramm wird die das gewünschte EcoRI-Taql enthaltende Bande (das größte Teilfragment) identifiziert. Dieses Fragment (L, siehe Fig. 5) wird aus dem Gel extrahiert und gereinigt (23) und in 10μΙ 1OmMTHs · HCl pH 7,5,1 mM EDTA gelöst. Als Akzeptor-Plasmid wird pBR322, welches CIaI und EcoRI gespalten ist, verwendet: 2μg pBR322 werden mit 4 Einheiten CIaI (Biolabs) in 20μΙ Reaktionsvolumen während 60min bei 37⁰C verdaut. Das Protein wird mit Phenol extrahiert und die DNA anschließend mit 2 Volumina Ethanol bei -80⁰C während 10 min gefällt. Die DNA wird durch Zentrifugation gesammelt und dann mit 10 Einheiten EcoRI (Biolabs) während 30 min bei 37°C in 20μΙ Reaktionsvolumen verdaut. Anschließend wird die

Lösung mit 2 Volumina 0,1 M Tris · HCI (pH 8,7) versetzt und mit 1 Einheit alkalischer Kälber-Phosphatase (Boehringer) während 30 min bei 37°C inkubiert. Die Phosphatase wird anschließend durch Inkubation bei 65⁰C während 60 min inaktiviert. 100ng des Akzeptor-Plasmids werden ιπΓίδμΙ Fragment L-DNA in 15μΙ Reaktionsvolumen in 1OmM MgCI₂,2OmMTHs · HCI (pH7,8), 1OmM DTT, 0,5mM ATP mit 30 Einheiten pro μΙ Reaktionsvolumen T₄ DNA-Ligase (Biolabs) während 2 Stunden inkubiert.

5μΙ dieser Lösung werden zu einem Gemisch gegeben, das 150 ml mit Calciumchlorid behandelte E. coliHBI 01-Zellen (6) in 1OmM MgCI₂,1OmM CaCI₂ und 1OmM Tris HCI (pH7,5) in einem Gesamtvolumen von 200μΙ enthält. Das Gemisch wird 20min in Eisgekühlt, 1 min auf 42°Cerhitzt und 10min bei 20⁰C inkubiert. 1 ml Trypton-Medium [Trypton-Medium enthält 10g Bacto-Trypton (Difco); 1 g Hefeextrakt (Difco); 1 g Glucose; 8g NaCI und 294 mg CaCI₂ · 2 H₂O in 11 destilliertem Wasser] wird zugesetzt und das Gemisch 30 min bei 37°C unter Schütteln bei 300 U/min inkubiert. Die Mischung wird auf zwei Agarplatten (McConkey Agar, Difco; 0,6ml/Platte), supplementiert mit 50μg/ml Ampicillin (Sigma), plattiert. Die Platten werden 12 bis 17 Stunden bei 37⁰C inkubiert.

Die Plasmid-DNAvon 10 verschiedenen Kolonien wird wie folgt isoliert:

Die Kolonien werden zur Inokulierung von 10ml Trypton-Medium, supplementiert mit 50μg/ml Ampicillin, wie oben, in einem 25 ml Erlenmeyerkolben verwendet. Die Kulturen werden 15 bis 18 Stunden bei 37°C und 300 U/min geschüttelt. Die Zellen werden durch Zentrifugieren (Sorval, HS-4 Rotor, 10 min bei 4000 U/min, 4°C) geerntet. Man erhält etwa 0,1 g Zellen, und diese werden in 1 ml 5OmM Tris · HCI (pH8,0) resuspendiert. 0,25ml Lysozymlösung [10mg/ml in 5OmM Tris HCI (pH8,0); Lysozym wird von Sigma vertrieben] werden zugesetzt und nach lOminütiger Inkubation bei 0⁰C werden 0,15ml 0,5m EDTA (pH7,5) zugegeben. Nach weiteren 10min bei O⁰C werden in 60μΙ 2%iges Triton X-100 (Merck) zugegeben. Nach 30min bei 0°C wird die Probe 30 min bei 15 000 U/min und 4°C in einem Sorval SA-600 Rotor zentrifugiert. Der Überstand wird mit 1 Vol. Phenol (gesättigt inTNE)deproteinisiert. Die Phasen werden durch Zentrifugieren (Sorval HB-4 Rotor) während 10min bei 5000U/min. und4°C getrennt. Die obere Phase wird zweimal mit 1 Vol. Chloroform extrahiert. Pankreatische RNAse A (Sigma; 10 mg/ml in TNE 10min bei 85°C vorerhitzt) wird bis zu einer Endkonzentration von 25μg/ml zugegeben und das Gemisch 40min bei37°C inkubiert. Die Lösung wird dann auf 1M NaCI und 10% Polyethylenglykol 6000 (Fluka, 20min bei 12O⁰C im Autoklaven behandelt) eingestellt und 2 Stunden bei -1O⁰C inkubiert. Das Präzipitat wird in einem Sorval HB-4 Rotor (20min bei 10000U/min, O⁰C) gesammelt und erneut in 100μΙ TNE gelöst. Die DNA-Lösung wird mit 1 Vol. Phenol extrahiert und die DNA wird mit 2 Vol. Ethanol 10 min bei -80⁰C präzipitiert. Das Präzipitat wird durch Zentrifugieren in einer Eppendorf-Zentrifuge gesammelt und die DNA erneut in 20μ110 mM Tris · HCI (pH 7,5) und 0,5 mM EDTA gelöst. Aus einer 10 ml Kultur gewinnt man 8 bis 10μg Plasmid-DNA. Die Plasmid-DNAs werden nach Verdauung mit den folgenden Restriktionsenzymen analysiert:

Je 0,5μg Plasmid-DNA wird mit Hpal (Biolabs) sowie mit Hpal (Biolabs) und EcoRI (Biolabs) mit CIaI (Biolabs) nach Standard-Vorschriften, gemäß Angaben des Enzym-Herstellers, gespalten. Die DNAs werden auf einem 1 % Agarose-Gel in 4OmM Tris · Acetat (pH 7,8) 1 mM EDTA und 0,5μg/гг^\ Ethidiumbromid fraktioniert. Die gewünschten Plasmide enthalten eine Hpal-Stelle und ergeben nach der 3fachen Verdauung neben dem großen DNA-Fragment 2 kleinere Fragmente, welche größer sind als das kleine EcoRI-Clal-Fragment von pBR322. Eines dieser Plasmide wird mit p159 bezeichnet (siehe Fig. 5).

B. Konstruktion des Plasmids pHRi145

2μς pi 59-DNA werden mit 10 Einheiten EcoRI (Biolabs) während 30 min bei 37°C verdaut. Die DNA wird mit Phenol extrahiert, mit Ethanol gefällt und nach Zentrifugation in 10μΙ 1OmM Tris · HCI (ph 7,5), 0,5mM EDTA gelöst. Die mit EcoRI verdaute DNA wird weiterhin mit 5 Einheiten DNA-Polymerase (Klenow-Fragment) (Boehringer) in 1OmM MgCI₂,1OmM /JMercaptoethanol, 5OmM NaCI, 0,1 mM dATP (P&L Biochemicals), 0,1 mM dTTP (P&L Biochemicals) während 15min bei 12⁰C behandelt. Die Polymerase wird anschließend durch Inkubation bei 85⁰C während 5min inaktiviert. Das Reaktionsgemisch wird in 2OmM Tris HCI (pH 7,8), 1OmM MgCI₂,1OmM DTT, 0,5 mM ATP (Sigma) auf das 10fache verdünnt und mit 30 Einheiten T₄ DNA-Ligase ρΓΟμΙ Reaktionsgemisch während 1 Stunde bei 15⁰C inkubiert.

50 ng der DNA werden in E. coli transformiert (wie oben beschrieben) und auf McConkey-Agarplatten supplementiert mit 50μg/ml Ampicillin, ausplattiert.

Die Plasmid-DNAs von 10 verschiedenen Kolonien wird, wie oben beschrieben, isoliert. Die Plasmid-DNAs werden analysiert durch Verdauung mit EcoRI. Die gewünschten Plasmide sind EcoRI-resistent. Die Analyse erfolgt wie oben beschrieben. Eines der gewünschten Plasmide wird als HRi145 bezeichnet (Fig. 5).

C. Konstruktion des Plasmids pHRi148

2μ9 pHRi145-DNA werden mit 5 Einheiten CIaI (Boehringer) während 60min bei 37°C behandelt, dann mittels Phenol-Extraktion deproteiniert. Die DNA wird mit Ethanol gefällt und dann in 20μΙ 1OmM Tris · HCL(pH7,5), 0,5mM EDTA gelöst. Die überhängenden Enden werden, wie oben beschrieben, mit DNA Polymerase I (Klenow-Fragment) aufgefüllt, mit der Änderung, daß dATP und dTTP ersetzt werden durch dCTP (P&L Biochemicals) und dGTP (P&L Biochemicals). Die Polymerase wird inaktiviert durch Inkubation bei 85°C während 5min. Das Reaktionsgemisch wird mit 2 Volumina 0,1 MTris · HCI (pH 8,7) versetzt und mit 0,3 ' 'nheiten Kälber-Phosphatase (Boehringer) während 30min bei 37°C inkubiert. Das Reaktionsgemisch wird deproteiniert durch Phenol-Extraktion. Die DNA wird mit Ethanol gefällt und ίη3μΐ 1OmM Tris · HCl (pH7,5), 0,5 mM EDTA gelöst.

Ein chemisch synthetisierter DNA-Linker der Formel

5'-GAATTCCATGGTACCATGGAATTc-S'

wird am 5'-Ende phosphoryliert, indem 8pMol des Linkers mit 5μΟ'\ [-у—³²P)-ATP (5500СІ ттоГ¹ Amersham) in 8μΙ Reaktionsvolumen, welches 0,1 mM rATP (Sigma), 5OmM Tris · HCI (pH 9,5), 1OmM MgCI₂, 5 mM DTT und 2 Einheiten-T₄ Polynucleotid-Kinase (P&L Biochemicals) enthält, während 30 min bei 37 °C inkubiert werden. Die Redaktion wird gestoppt durch Einfrieren bei -8O⁰C.

Der radioaktiv markierte Linker wird anschließend mit 1 μg Claiund Phosphatase behandelt und mit pHRi145-DNA (siehe oben) in einem 20 μΙ Reaktionsvolumen ligiert, welches 0,5 mM rATLP (Sigma), 10 mM DTT (Calbiochem), 2OmM Tris · HCI (pH7,8), 1 mM MgCI₂ und 800 Einheiten T₄ DNA-Ligase (Biolabs) enthält. Die Inkubation erfolgt bei 15°C während 2 Stunden. Die Ligase wird inaktiviert durch Inkubation bei 85⁰C während 10 min. Anschließend werden 2 Volumina Wasser hinzugegeben, die Kochsalz-Konzentration auf 1OmM eingestellt und 20 Einheiten Kpnl (Biolabs) hinzugegeben während 30 min bei 37⁰C. Nach der Extraktion mit Phenol und Chloroform wird die Mischung durch ein 0,9% niedrigschmelzendes Agarose-Gel (Biorad) in 4OmM

Tris · Acetat (pH 7,8), 1 mM EDTA und O,5/Kj/ml Ethidiumbromid fraktioniert. Die durch UV-Bestrahlung sichtbare Bande, welche die gleiche Mobilität wie eine Marker-DNA gleicher Größe aufzeigt, wird mit einem Skalpell herausgeschnitten. Das Gelstück wird 5min bei 65^CC geschmolzen und dann auf 37⁰C abgekühlt. Man erhält ein Volumen von ca. 20μΙ. 5μΙ dieser Lösung werden entnommen und mit400 EinheitenT₄-ügase(Biolabs)in 10μΙ Reaktionsvolumen, weichesauf 0,5mM ATP, 1OmMDTT, 1OmM MgCI₂,20mMTris HCI (pH7,8) eingestellt wird, während 12 Stunden bei 15⁰C inkubiert. Vio Volumen einer Lösung mitiOOmM Tris · HCI (pH7,5), 10OmM CaCI₂ und 10OmM MgCl₂ werden zum Ligase-Gemisch (solifidiziert bei 15°C) hinzugegeben und bei 65⁰C während 5min inkubiert. Die Lösung wird dann verwendet, um mit Calcium behandelte E.coli НВЮІ-Zellen, wie oben beschrieben, zu transformieren. Es wird auf McConkey-Agarplatten, supplementiert mit 50μ/ηηΙ Ampicillin, ausplattiert. Die Plasmid-DNAs von 10 verschiedenen Kolonien werden isoliert, wie oben beschrieben, und die DNA wird der folgenden Restriktionsenzymanalyse unterworfen: ϋβΟ,δμς Plasmid DNA wird nacheinander mit Kpnl (Biolabs), Ncol (Biolabs) und EcoRI (Biolabs) nach den Vorschriften des Enzym-Herstellers gespalten. Die Spaltprodukte werden auf 1 % Agarose-Gelen in 4OmM Tris · Acetat (pH 7,8), 1 mM EDTA, 0,5мд/тІ Ethidiumbromid fraktioniert. Alle Plasmide zeigen je eine dieser Enzymspaltstellen, wie gewünscht. Eines wird als HRi148 bezeichnet.

Das Plasmid HRM48 enthält einen Tryptophan-Promoter-Operator und eine ribosomale Bindungsstelle bis und mit ATG. Eglin C als auch andere heterologe Gene können direkt über die einmalig im Plasmid vorhandenen EcoRI, Ncol, Kpnl-Stellen angekoppelt werden. Des weiteren ermöglicht diese Konstruktion das direkte Koppeln und Exprimieren von heterologen Genen, ohne daß das für die Initiation der Translation notwendige ATG auf dem entsprechenden Gen vorhanden sein muß. Dies kann leicht erreicht werden durch Spaltung mit Ncol und Auffüllen der überhängenden Enden mit DNA-Polymerase I, wie beschrieben, oder durch Spalten mit Kpnl und Entfernen der überhängenden Enden durch Nuklease S₁. Das Plasmid HRi148 ist somit ein breit anwendbares Expressionsplasmid.

D. Herstellung des linearisierten Vektors pHRiUe/EcoRI/BamHI

5мд Plasmid-DNAvon pHRi148 werden mit den Restriktionsendonucleasen EcoRI und BamHI, wie in Beispiel 15a beschrieben, verdaut. Der herausgeschnittene Vektor pHRi148/EcoRI/BamHI wird mittels Dichtegradientenzentrifugation (vgl. Beispiel 15a) isoliert.

b) Herstellung der F₁ (O-Fz-DNA/EcoRI/BamHI Fig. 6)

5мд Plasmid-DNAvon pML141 werden mit EcoRI-und BamHI-Restriktionsendonucleasewiein den Beispielen 11a) und 13a) beschrieben verdaut. Nach Phenol/Chloroform-Extraktion und Alkoholfällung wird die F₁ (C)-F2-DNA/EcoRI/BamHI vom Plasmid (pBR322/EcoRI/BamHI) durch Gelelektrophoresean 1%iger niedrigschmelzender Agarose (Biorad) (Beispiel 13a) abgetrennt und mit EtBr sichtbar gemacht. Anschließend wird die Stelle des Gels, welche die DNA Bande der F₁ (C)-F₂-DNA (= 236 Basenpaare) enthält, aus dem Gel geschnitten und bei 65°C 10min. verflüssigt.

c) Ligierung der pHRi148/EcoRI/BamHI Vektor-DNA mit der F₁ (CMVDNA/EcoRI/BamHI und Konstruktion des Plasmids pML147(Fig.6)

100ng (ca. 10OnMoI Enden) Plasmid DNA pHRi148/EcoRI/BamHI und 28ng (713nMol Enden) der F₁ (CM^-DNA/EcoRI/BamHI (gelöst in ΙΟμΙαβεϊη Beispiel 18 b) erhaltenen flüssigen Gels) werden bei 37°C in einem Volumen von 20μΙ miteinander gemischt und wie in Beispiel 13c) beschrieben, mit T₄-DNA Ligase bei 15°Cfür 16 Stunden behandelt. Auf diese Weise entsteht in dieser Mischung das Expressionsplasmid pML147, welches das Eglin C-Gen (F₁ (C)-F₂-DNA) enthält.

d) Transformation von E. coli HB101 mit dem Plasmid pML147

10/xl des das Plasmid pML147 enthaltenden Gemisches (Beispiel 18c) werden für 10 min. bei 65"C verflüssigt und für die Transformation der Calcium-behandelten E. coli HB101 Zellen verwendet. Ca. 6000 Ampicillin-resistente Kolonien werden erhalten.

e) Screening der Kolonien, die F₁ (C)-F₂-DNA enthalten

Transformierte Kolonien (Beispiel 18d) werden auf das Vorhandensein von F₁ (C)-F₂-DNA geprüft, wie in Beispiel 15e) angegeben.

Es werden sieben positive Kolonien erhalten, welche die Bezeichnung pML147-pML153 erhalten. In analoger Weise wird die F₁ (O-Fz-DNA/EcoRI/BamHI bzw. F₁ (C'MV-DNA/EcoRI/BamHI, hergestellt aus den Plasmiden pML147 (C) bzw. pML147 (C"), mit der pHRi148/EcoRI/BamHI ligiert. Auf diese Weise entstehen Plasmide, die das Eglin C'-Gen [F₁ (C)-F₂-DNA] bzw. das Eglin C"-Gen [F₁ (C)-F₂-DNA] enthalten. Die Plasmide werden zur Transformation von Calciumbehandelten E. coli HB101 -Zellen verwendet. Die Kultivierung der transformierten Zellen ergibt 940 bzw. 1 080 Ampicillinresistente Kolonien. Die Kolonien werden mit dem Oligonucleotid 91/37 komplementär (C) auf das Vorhandensein von F₁ (C)-F₂-DNA bzw. F₁ (C)-F₂-DNA geprüft. 9 Kolonien, enthaltend die F₁ (C)-F₂-DNA (Eglin C-Gen), und 17 Kolonien, enthaltend die F₁ (C)-F₂-DNA (Eglin C-Gen), werden identifiziert. Jeweils eine Kolonie wird ausgewählt und erhält die Bezeichnung pML147 (C) bzw. pML147 (C").

Beispiel 19: Herstellung des Expressionsplasmids pML 199

a. Herstellung der F₁ (BHV-DNA/EcoRI/BamHI

Analog Beispiel 18 b) werden 5μg Plasmid-DNAvon pML 160 mit den Restriktionsendonucleasen EcoRI und BamHI verdaut. Die F₁ (B)-F2-DNA/EcoRI/BamHI wird, wie beschrieben, mittels Gelelektrophorese abgetrennt.

b. Ligation der pHRi148/EcoRI/BamHI-Vektor-DNA mit der F₁ (BJ-Fjr-DNA/EcoRI/BamHI und Konstruktion von rekombinierten Plasmiden

100μg Plasmid-DNApHRiMS/EcoRI/BamHI (vgl. Beispiel 18aD) wird тк28дд F₁ (Bf-F^DNA/EcoRI/BamHI gemäß Beispiel 18c) ligiert. Die entstandene Lösung, welche rekombinierte Plasmide enthält, wird benutzt, um Calcium-behandelte E. coli HB101-Zellen zu transformieren. Transformierte Kolonien werden auf das Vorhandensein von F₁ (B)-F₂-DNA geprüft, wie in Beispiel 15e) beschrieben.

Es werden sechs positive Kolonien erhalten, welche die Bezeichnung pML199-204 erhalten.

Beispiel 20: Charakterisierung der Klone pML147 und pML199

Die Charakterisierung der F₁ (C)-F₂- bzw. F₁ (BHVDNA-Sequenzen in den rekombinierten Plasmiden pML147 und pML199 erfolgt durch Sequenzierung der F₁ (C)-F₂- bzw. F₁ (B)-F₂-DNA nach Maxam und Gilbert (3), wie in Beispiel 17 beschrieben. 10/u.g Plasmid-DNA werden geprüft. Die Nucleotidsequenz der F₁ (C)-F₂-DNA ist mit der für das synthetische Eglin C-Gen beschriebenen, diejenige der F₁ (B)-F₂-DNA mit der für das synthetische Eglin B-Gen beschriebenen identisch.

Beispiel 21: Synthese von Polypeptiden mit Eglin-Aktivität durch E. coli-Zellen, die Plasmide mit rekombinierten Eglin-Genen enthalten

a. Synthese von Polypeptiden mit Eglin C-Aktivität Jeder der 7 Klone, die das rekombinierte Eglin C-Gen enthalten, nämlich E.coliHB101pML147 E.coliHB101pML148 E.coliHB101pML149

E. СОІІНВ101 pML150

E. СОІІНВ101 pML151 E.coliHB101pML152 E.coliHB101pML153 E.coliHB101pML147(C) E.coliHB101pML147(C") wird auf die Bildung von Eglin C-Aktivität getestet.

Zu diesem Zweck werden die oben genannten Klone in 5ml L-Medium über Nacht (16 Stunden) bei 37°C und 250 upm kultiviert.

L-Medium ist wie folgt zusammengesetzt:

BactoTryptone 10 g

Bacto Hefe-Extrakt 5 g

NaCI 5 g

Glucose 5 g

Ampicillin 0,1 g

1 ml dieser Übernachtkultur wird am nächsten Tag in 25 ml M9-Medium übertragen. M9-Medium ist wie folgt zusammengesetzt:

Na₂HPO₄-7 H₂O 13,25 g

KH₂PO₄ 3,0 g

NaCI 0,5 g

NH₄CI 1,0 g

CaCI₂-2 H₂O 0,015 g

MgSO₄-7 H₂O 0,25 g

Casaminosäuren 2,5 g

Vitamin B₁ 0,0099 g

Glucose 5,0 g

Ampicillin 0,1 g

Es wird bei 37°C und 250 upm solange kultiviert, bis die Bakteriensuspension eine optische Dichte (OD₆₂₃) von ca. 0,9-1,0 erreicht hat. Anschließend erntet man dieZellen (5ml der wachsenden Kultur) und resuspendiert die Bakterien in 0,5ml einer Lösung von 5OmM Tris · HCI (pH8) und 3OmM NaCI. Danach wird die Suspension auf 1 mg/ml Lysozym (Boehringer) eingestellt und 30min in Eis gestellt. Durch abwechselndes Einfrieren der Suspension in flüssigem Stickstoff und Auftauen bei 37"C werden die Bakterien zerstört. Dieser Vorgang wird 5mal wiederholt, anschließend wird die Mischung 30min bei 16000upm bei 4°C zentrifugiert. Die Überstände werden auf Eglin C-Aktivität untersucht, indem die Hemmung der Humanleukocyten-Elastase (1) gemessen wird.

Folgende Aktivitäten werden erhalten:

Bakterienextrakt	Eglin C-Aktivität
	/tg/ml Kultur
E.coliHB101pML147	3,3
E.coliHB101pML148	3,3
E. co« HBIO^-LpML 149	3,4
E.coliHB101pML150	3,3
E.coliHB101pML151	3,3
E.coliHB101pML152	3,5
E.coliHB101pML153	3,3
E.coliHB101pML147(C)	3,0
E.coliHB101pML147(C)	3,1

b. Synthese von Polypeptiden mit Eglin B-Aktivität In analoger Weise, wie in Beispiel 21 a) beschrieben, werden jeder der 6 Klone, die das rekombinierte Eglin B-Gen enthalten, nämlich

Е.СОІІНВ101 pML199 Е.СОІІНВ101 PML200 Е.СОІІНВ101 pML201 Е.СОІІНВ101 pML202 Е.СОІІНВ101 pML203 E.coliBB101pML204 auf die Bildung von Eglin B-Aktivität getestet.

Die genannten Klone werden, wie beschrieben, in L-Medium kultiviert und dann auf M9-Medium übertragen. Nach Erreichen einer optischen Dichte (OD₆₂₃) von ca. 0,9-1,0 werden die Zellen geerntet, lysiert und durch abwechselndes Einfrieren und Auftauen zerstört. Die Mischungen werden zentrifugiert, und die Überstände durch Messung der Hemmung der Humanleukocyten-Elastase (1) auf Eglin B-Aktivität geprüft

Folgende Aktivitäten werden erhalten: Bakterienextrakt Eglin B-Aktivität

дд/ті Kultur

E.coliHB101pML199 3,2

E.coliHB101pML200 3,1

E.coliHB101pML201 3,8

E-CoIiHBIOIpML 202 3,5

E.coliHB101pML203 3,3

E.coliHB101pML204 3,3

Beispiel 22: Kultivierung des Stammes E.coli HB101 pML147

20 ml L-Medium (siehe Beispiel 21)werdenmitdenE.coliHB101 pML147-Zellen von einer gut gewachsenen Agarplatte beimpft und im Schüttelkolben auf einem Rundschüttler bei 150upm bei 37 ⁹C für 12 Stunden geschüttelt. 5 ml dieser Vorkultur werden in 120ml M9 Nährmedium übertragen. Diese Kultur wird bei 250upm und 37⁰C geschüttelt. Nach ca. 8-10 Stunden hat die Kultur den höchsten Titer an Polypeptiden mit Eglin C-Aktivität erreicht und wird geerntet.

Beispiel 23: Nachweis der Eglin C-Aktivität

Ca. 5-1 ΟμΙ einer Probe, welche Polypeptide mit Eglin C-Aktivität enthält (vgl. Beispiele 21 und 22), werden auf 1 cm² Nitrocellulosepapier (NZ) (BlQRAD) aufgetropft und 30 min bei Raumtemperatur getrocknet. Danach wird das NZ für 1 Stunde bei 37⁰C in einer Lösung von 3% Serumalbumin in 0,01 M Tris · HCI (pH8) und 0,9% NaCI inkubiert.

Anschließend wird das NZ in einer Lösung von 0,01 M Tris · HCI (pH8) und 0,9% NaCI für 30min gewaschen. Dabei wird die Lösung 5mal gewechselt. Danach wird das gewaschene NZfür 2 Stunden bei 25°C in einer Lösung von 3% Serumalbumin in 0,01 M Tris HCI (pH 8) und 0,9% NaCI, die 2/хд/т1 Antikörper (aus Kaninchen hergestellte, oder monoclonale Antikörper) gegen Eglin C enthält, behandelt. Danach wird das NZ, wie oben beschrieben gewaschen.

Anschließend wird das NZ für 2-3 Stunden bei 25⁰C mit einer Lösung von 3% Serumalbumin in 0,01 M Tris HCI (pH 8) und 0,9% NaCI, die 0,2/xCi/ml ¹²⁵l-Protein A (sp. Aktivität 89,8дСі/тд) (NEN) enthält, behandelt. Danach wird abermals das NZ, wie oben beschrieben, gewaschen, getrocknet und in einem γ-Zähler (Multi-Gramma, 1260 gamma counter, LKB, Wallace) die gebundene Radioaktivität bestimmt, welche ein Maß für das auf dem NZ vorhandene Polypeptid mit Eglin C-Aktivität ist.

In einem alternativen Verfahren wird obige Probe einer SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (PAGE) unterworfen [vgl. (7)]. Das PAGE Elektropherogramm wird durch Elektro-Blotting auf NZ übertragen. Danach wird die NZ wie oben beschrieben behandelt und/oder über Nacht zusammen mit einem Röntgenfilm (Fuji) autoradiographiert. Stellen auf dem NZ, welche Polypeptide mit Eglin C-Aktivität enthalten, erscheinen auf dem Film als schwarze Flecken.

Beispiel 24: Isolierung und Reinigung von №-Acetyl-eglin C mit Hilfe einer monoklonalen Antikörper-Säule

a. Herstellung der Polypeptidlösung für die monoklonale Antikörpersäule

150ml Kulturbrühe (erhalten gemäß Beispiel 22) werden auf 4⁰C abgekühlt und die Zellen durch Zentrifugation (5000upm, 15min, Sorvall RC 3B) abgetrennt. Der klare Überstand enthält keine Eglin C-Aktivität.

Anschließend werden die Zellen in 12ml Lyse Puffer (5OmMTHs HCI pH8,3OmM NaCI) suspendiert. Dieser Mischung werden 15mg Lysozym (Boehringer) zugesetzt und diese dann 30min bei 4°C aufbewahrt. Anschließend werden die Zellen durch 4maliges Einfrieren in flüssigem Stickstoff und anschließendem Auftauen bei 37⁹C zerstört. Danach wird 30min bei 16000upm, 4°C zentrifugiert. Der Überstand enthält die N"-Acetyl-eglin C-Aktivität. In dem Überstand (15ml) werden dann 7,7g festes Ammoniumsulfat aufgelöst. Die trübe Mischung wird bei 4⁰C für 30 min stehengelassen und dann zentrifugiert (s. oben). Das nasse Sediment wird in 1 ml 0,05 mM Tris · HCI pH 8 Puffer gelöst und man erhält die gewünschte Polypeptidlösung.

b. Reinigung von N^-Acetyl-eglin C auf einer monoklonalen Antikörper-Säule

Die monoklonale Antikörper-Säule 1K-F299-22-10 (Bettvolumen 0,8ml, siehe unten) ist mit 0,05M Tris · HCI (pH 8) äquilibiert. 0,5 ml-Portionen der oben erhaltenen Polypeptid-Lösung werden bei 4°C auf die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 7ml/Stunde aufgetragen. Gewaschen wird dann mit 10ml 0,05M Tris HCI pH8. Die ersten Fraktionen erhalten die nicht adsorbierten Polypeptide, welche verworfen werden. Anschließend wird die Säule mit 5 ml 5 M Natriumthiocyanat (Merck) in 0,05 M Tris · HCI (pH 8) gewaschen und die erhaltenen Fraktionen auf №-Acetyl-eglin C-Aktivität mit dem HLE Test (1) geprüft. Die Fraktionen, welche die Polypeptide enthalten, werden durch Messung der СЮгадит bestimmt. Fraktionen 19 und 20 enthalten die N^a-Acetyi-eglin C-Aktivität; sie werden bei -20°C aufbewahrt oder bis zur Weiterverarbeitung im Eisbad. Die №-Acetyl-eglin C-Aktivität beträgt in Fraktion 19 61 /xg/ml und in Fraktion 20 49дд/тІ. Danach werden die Fra'· 'ionen dialysiert oder über Sephadex-G25 (Pharmacia) entsalzt. Die SDS-rOlyacrylamidgel-Elektrophorese (7) ergibt ein Molekulargewicht für N^-AcetyleglinCvonca. 8100 Dalton.

In analoger Weise können N^a-Acetvl-eglin B, Eglin C und Eglin B mittels der monoklonalen Antikörper-Säule 1K-F299-22-10 gereinigt werden.

с Herstellung der monoklonalen Antikörper-Säule 1K-F299-22-10 A) Immunisierung von Mäusen

Reines natürliches Eglin C (6mg) in lyophiiisierter Form wird in wenig 0,1 % Essigsäure gelöst und dann mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung ergänzt und der pH wird auf 7,2 eingestellt, so daß die Endkonzentration 2 mg/ml beträgt. Portionen dieser Antigen-Lösung werden mit gleichen Mengen komplettem Freund's Adjuvans, inkomplettem Freund's Adjuvans oder phosphatgepufferter Salzlösung gemischt und emulgiert.

Weibliche Balb/c Mäuse (8-14 Wochen alt, erhalten von der Tierfarm Sisseln, Schweiz) werden durch Injektion einer solchen Emulsion, enthaltend 100/ig Eglin, in die Fußpfoten immunisiert. Während den folgenden sechs Wochen werden jede Woche weitere 100/xg Eglin emulgiert wie zuvor, aber in inkomplettem Freund's Adjuvans subcutan und schließlich 200^g Eglin in phosphatgepufferter Salzlösung intravenös injiziert. Vier Tage später wird die Milz für die Fusion entnommen.

B) Herstellung der Hybridoma und Antikörper-Test

Die Herstellung der Hybridomazellen erfolgt durch Verschmelzung der erhaltenen Milzzellen mit der Myeloma-Zellinie SP 2/0. Dabei werden 10⁸ Milzzellen und 10⁷ Myelomazellen eingesetzt. Die Fusion wird wie beschrieben (9,26) durchgeführt. Die Bestimmung deranti-Eglin C-Aktivität in den Hybridoma-Überständen erfolgt mit Hilfe eines kompetitiven Radioimmunoassays [RIA, (10)].

Zu diesem Zwecke wird Eglin C mit radioaktivem ¹²⁶Jod nach der üblichen Chloramin T-Methode markiert (ЗООООсрт). Durch Inkubieren über Nacht wird ein polyklonaler Kaninchen anti-Eglin C-Antikörper in den Vertiefungen einer Polystyrol-Mikrotiterplatte fixiert. Etwa 50-70% des radioaktiven Eglins C werden an diesen Festphasen-Antikörper gebunden. Von 45 erhaltenen Hybridoma-Kulturen inhibierten 32 Überstände diese Bindung zu mehr als 50% signifikant. Zwei der stark inhibierenden Überstände, bzw. ihre Hybridoma-Zellen, werden als299S18und 299S22 bezeichnet und zur weiteren Charakterisierung ausgewählt. Sie werden zunächst durch die begrenzende Verdünnungsmethode kloniert, wobei 299S18 vier und 299S22 neun positive Klone ergibt, von denen die Klone 299S18-20,299S22-1 und 299S22-10 ausgewählt und näher charakterisiert werden. Die genannten Hybridoma-Zellinien produzieren monoklonale Antikörper (mit dergleichen Bezeichnung) vom Subtyp Ig^appa.

C) Isolierung und Reinigung der Anti-Eglin C-Antikörper aus Aszites

Balb/c Mäuse werden intraperitoneal mit 0,4 ml Pristan (Carl Roth) vorbehandelt. Nach einer Woche werden 2 bis 5 χ 10⁶ klonierte Hybridoma-Zellen intraperitoneal injiziert. Aszitische Flüssigkeit wird von jeder Maus wiederholt genommen und bei —80⁰C gefroren. Die gesammelte Flüssigkeit wird aufgetaut und 30 min bei4°C mit 16000upm zentrifugiert. Das Fett wird abgesaugt und zum verbleibenden Debri-freien Überstand langsam unter Rühren bei 0°C 0,9 Volumenäquivalente einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung zugetropft. Die erhaltene rohe Immunoglobulin-Fraktion wird unter Verwendung von 0,1 m Tris · HCI (pH8.2) durch Sephacryl G 200 (Pharmacia), gemäß den Angaben des Herstellers, gegeben. Aktive Fraktionen werden vereinigt und mit Amicon XM50-Filter (Amicon) konzentriert. Man erhält auf diese Weise die monoklonalen anti-Eglin C-Antikörper 299S18-20,299S22-1 und 299S22-10.

D) Herstellung der Antikörper-Säule 1K-F299-22-10

Affi-Gel1O (Bio-Rad) wird nach den Angaben des Herstellers mit kaltem destilliertem Wasser und Kupplungspuffer pH 8,0 (0,1 M NaHCO₃-Lösung) gewaschen. Eine 50%ige Suspension des Gels in Kupplungspuffer (1 ml) wird in ein Plastikrohr übertragen, mit der gleichen Menge gereinigter Antikörperlösung (19mg monoklonale anti-Eglin-C-Antikörper 299S22-10) vermischt und 4 Stunden bei Zimmertemperatur rotiert. Danach wird das Gel mit Kupplungspuffer gewaschen. Zur Blockierung der noch freien aktiven Stellen wird das Gel mit 0,1 ml 1 M Ethanolamin-HCI (pH8,0) pro ml Gel äwhrend2 Stunden bei Raumtemperatur behandelt, dann mit phosphatgepufferter Salzlösung, enthaltend 1OmM Natriumazid pro ml Gel gewaschen und darin bei 4°C gehalten. Der Kupplungsgrad wird durch Messung der Extinktion bei 280 nm bestimmt und beträgt 15 bis 30mg Antikörper pro ml Gel. 0,8ml des entstandenen Immunogels werden verwendet, um die monoklonale Antikörpersäule 1K-F299-22-10 herzustellen.

Beispiel 25: Isolierung und Reinigung von N"-Acetyl-egIin C mit Hilfe einer Anhydrochymotrypsin-Säule

a. Herstellung der Polypeptidlösung für die Anhydrochymotrypsin-Säule.

150ml Kulturbrühe (erhalten gemäß Beispiel 22) werden auf 4°C abgekühlt und die Zellen durch Zentrifugation (5000upm, 15min, Sorvall RC 3B) abgetrennt. Der klare Überstand enthält keine Eglin C-Aktivität. Anschließend werden die Zellen in 12ml Lyse Puffer (5OmM Tris · HCI pH8,3OmM NaCI) suspendiert. Dieser Mischung werden 15mg Lysozym (Boehringer) zugesetzt und diese dann 30min bei 4°C aufbewahrt. Anschließend werden die Zellen durch 4maliges Einfrieren in flüssigem Stickstoff und anschließendem Auftauen bei 37⁰C zerstört. Danach wird 30min bei 16000upm 4°C zentrifugiert. Der Überstand enthält die N^a-Acetyl-eglin C-Aktivität. In dem Überstand (15 ml) werden dann 7,7g festes Ammoniumsulfat aufgelöst. Die trübe Mischung wird bei 4°C für 30 min stehengelassen und dann zentrifugiert (s. oben). Das nasse Sediment wird in 1 ml 0,05 mM Tris · HCI pH 8 Puffer gelöst und man erhält die gewünschte Polypeptidlösung.

b. Reinigung von №-Acetyl-eglin C auf einer Anhydrochymotrypsin (AnCht)-Säule.

Die AnCht-Säule (Bettvolumen 4ml) ist mit 0,05 M Tris-HCI pH 8 äquilibriert. 2.5ml-Portionen der oben erhaltenen Polypeptid-Lösung werden bei 4°C auf die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 7 ml/Stunde aufgetragen. Gewaschen wird dann mit 25ml 0,05MTris-HCI (pH8). Die ersten Fraktionen enthalten die nicht adsorbierten Polypeptide, welche verworfen werden. Anschließend wird die Säule mit 10ml 5 M Natriumthiocyanat (Merck) in 0,05M Tris-HCI (pH8) gewaschen und die erhaltenen Fraktionen auf N^a-Acetyl-eglin C-Aktivität mit dem HLE Test (1) geprüft, die Fraktionen, welche die Polypeptide enthalten, werden durch Messung der OD₂SoOm bestimmt. Fraktionen 30 und 31 enthalten die N"-Acetyl-eglin C-Aktivität; sie werden bei —20⁰C aufbewahrt oder bis zur Weiterverarbeitung im Eisbad. Die N^a-Acetyl-eglin C-Aktivität beträgt in Fraktion 30 ЗО/гд/тІ und in Fraktion 31 64μg/ml. Danach werden die Fraktionen dialysiert oder über Sephadex-G25 (Pharmacia) entsalzt. Die SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (7) ergibt ein Molekulargewicht fßr N"-Acetyl-eglin C von ja. 8100 Dalton.

с Herstellung der Anhydrochymotrypsin-Säule A. Herstellung von Anhydrochymotrypsin (AnCht)

Die Herstellung von AnCht erfolgt wie in Ako et al. (27) beschrieben:

500mg Chymotrypsin (Merck) werden in 50ml 0,1 M Tris-HCI (pH8)-Puffer, der 0.1 M NaCI, 0.12M CaCI₂ und 13% (v/v) Methanol enthält, gelöst. Zu dieser Lösung werden siebenmal 0.1 ml Aliquote von Phenylmethylsulfonylf luorid (PMSF) (Fluka, Lösung von 7 mg/ml in Aceton) unter Rühren zugegeben und jeweils die Abnahme der Chymotrypsinaktivität bestimmt (28). Nachdem die Chymotrypsinaktivität unter 1 % gesunken ist, wird die Lösung gegen 1 mM HCI über Nacht bei 4°C dialysiert (3x10 Liter) und anschließend lyophilisiert. Das entstandene Phenylmethylsulfonyl-Chymotrypsin (PMS-Cht) wird in 100ml eiskalter 0.1 M KOH gelöst, 1 Stunde in Eis stehen lassen und anschließend mit 6 N HCI auf pH 3 eingestellt. Die erhaltene Lösung wird über Nacht bei 4⁰C gegen 1 mM HCI dialysiert (3 χ 10 Liter) und anschließend lyophilisiert. AnCht fällt als weißes Pulver an (120mg).

B. Herstellung der AnCht-Säule

Affi-Gel 10 (Bio Rad) wird nach Angaben des Herstellers mit kaltem destilliertem Wasser und Kupplungspuffer pH8,5 (0.1 Μ NaHCO₃ZNa₂CO₃-LoSUnQ) gewaschen. Eine 50%ige Suspension der Gels in Kupplungspuffer (4ml) wird in ein Plastikrohr übertragen, mit dergleichen Menge Anhydrochymotrypsinlösung (120mg in 4ml Kupplungspuffer) vermischt und über Nacht bei 4°C rotiert. Danach wird das Gel mit Kupplungspuffer gewaschen. Zur Blockierung der noch freien aktiven Stellen wird das Gel mit 0.1 ml 1 M Aethanolamin-HCI (pH8.0) pro Gel während 3 Stunden bei 4°C behandelt dann mit phosphatgepufferter Salzlösung, enthaltend 1OmM Natriumazid pro ml Gel gewaschen und darin bei 4°C gehalten. Der Kupplungsgrad wird durch Messung der Extinktion bei 280nm bestimmt und beträgt 15 bis 30mg AnCht pro ml Gel. 4ml des entstandenen AnCht-Gels werden verwendet, um die Affinitätssäule herzustellen. In gleicherweise können auch N"-Acetyl-eglin B, Eglin C und Eglin B gereinigt werden.

Beispiel 26: Alternative Reinigungsverfahren für №-Acetyl-eglin C

Alternativ oder zusätzlich zu den vorstehenden Reinigungsverfahren (vgl. Beispiele 24 und 25) können folgende Reinigungsschritte verwendet werden:

a. Butanol-Extraktion des Lysats

Die nach der Lyse durch viermaliges Einfrieren und Auftauen zerstörten Zellen (vgl. Beispiel 24a) werden mit Essigsäure (Endkonzentration 0.1 %; pH4.5) versetzt. Die ausfallenden bakteriellen Proteine werden mittels Zentrifugation abgetrennt. N^a-Acetyl-eglin C verbleibt im Überstand.

Das Zweiphasengemisch n-Butanol-Eisessig-Wasser 5:1:4 (25ml) wird kräftig vorgemischt. Man läßt es dann 2 Stunden bei Zimmertemperatur äquilibrieren, wobei sich das Gemisch in zwei Phasen trennt. 0.5ml der 0.1 % Essigsäure-Lysat-Probe (s.o.) werden mit 250μΙ Unterphase verdünnt und N"-Acetyl-eglin C mit 750 μΙ Oberphase extrahiert (5 min Vortex, Fa. Bender Hobein). Anschließend trennt man die Phasen durch 60 min Zentrifugation (5400 upm) bei Raumtemperatur. (Hettich Tischzentrifuge EBA 3S). Die Probe wird mit einem Gerät der Fa. Savant (Speed Vac Concentrator) am Hochvakuum zur Trockene eingedampft. Der Nachweis von N^a-Acetyl-eglin C gelingt mittels HLE-Test, RP-HPLC und SDS-Gelelektrophorese.

b. Gelfiltration an Sephadex G50

31 mg des so erhaltenen Materials werden in 600μ130% Essigsäure suspendiert, 5min bei Raumtemperatur bei 5000upm zentrifugiert und der klare Überstand wird auf die Sephadex-Säule G50 fine (Pharmacia) aufgetragen (Säulendimension: 1.5cm χ 30cm; Detektion: LKB8300 Uvicord II; 254nm,Transmission 50OmV; Fluß: 0,4ml/min). Eluiert wird mit 50ml 2% Essigsäure. N^a-Acetyl-eglin C ist in den Fraktionen 6-8 (2.5 ml) enthalten. Ausbeute: 3mg reines Lyophilisat, Reinheit ca. 95%.

c) Anionenaustauschchromatographie an DEAE-Cellulose zur Gewinnung von №-Acetyl-eglin C und Eglin C. 100ml eines Überstands nach der Proteinfällung mittels Essigsäure (vgl. Beispiel 26a) wird konzentriert und einer Anionenaustausch-Chromatographie an DEAE-53 (Fa. Whatman) bei pH6.6 unterworfen (Chromatographiebedingungen: Säule: 1,5 x 80cm,Elutionspuffer: 3OmM Ammoniumacetat, pH6,6, Fluß 15ml/h. Fraktionsvolumen 3,5ml). Die Säule wird mit dem Elutionspuffer äquilibriert und entwickelt, bis der erste Peak (Eglin C) zwischen Fraktionen 18-25 eluiert ist. Ab Fraktion 50 wird ein linearer Saizgradient aus je 300ml Elutionspuffer und 0,06M Amoniumacetat/0,4M NaCI pH4,5 ausgeschlossen. №-Acetyl-eglin C eluiert zwischen Fraktionen 70-85. Der Nachweis gelingt mittels RP-HPLC, PAGE and HLE-Test. Die Reinheit der Produkte beträgt ca. 90% bezüglich Proteingehalt

IP (pool Frakt. 18-25): 6.5 IP (pool Frakt. 70-85): 5.4.

Auf diese beschriebene Weise können auch №-Acetyl-eglin B, Eglin B und andere Eglin-Verbindungen (Methionin-eglin C u.a. aus der Biosynthese) abgetrennt und gereinigt werden.

Beispiel 27: Strukturbeweis und physikalisch-chemische Charakterisierung von N^a-Acetyl-eglin C

a. Bestimmung der Aminosäurezusammensetzung

200/xg N°-Acetyl-eglin C werden mit6N HCI bei 110°C während 24h hydrolysiert und dann nach S. Moore et al. (29) analysiert. Das Hydrolysat weist die folgende Zusammensetzung auf:

Aminosäure Hydrolysat Aminosäure Hydrolysat

5.3(5) 4.9(6) 4.9(5) 2.3(2) 2.5(3)

0(0) 4.5(4)

(70)

b. Peptid-Mapping von N^a-Acetyl-eglin C

Im folgenden Schema sind die Aminosäuresequenz von N"-Acetyl-eglin C und die Spaltstellen für Trypsin und Staphylococcus aureus-Protease (V8) markiert (vgl. Zitat 31):

As η	7.2(7)	Met
Th r	4.6(5)	Leu
Ser	3.5(3)	Tyr
GIn	7.8(7)	Phe
Pro	5.4(6)	Lys
GIy	5.7(5)	His
AIa	1.6(1)	Trp
VaI	10.1(11)	Arg
		Total

T T

10 20

[AcjThrGluPheGlySerGluLeul Lys [SerPheProGluValValGlyjLys |ThrValAspGln

-Tl-

-T2-

T V8 V8 T

11 11

30 40

GIu TyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAsp ValTyr PheLeuProGluGly

-T4-

V8 1

SerProValThiLeuAsp Leu^Ar

VaII ArgIValPheTyrAsn I—T6—

-Т4а-

60 70

ProGlyThrAsnValValAsnHisValProHisValGly

T7 -I

T: Spaltstellen für Trypsin; V8: Spaltstellen für Staphylococcus aureus-Protease (V8)

I) Tryptischer Abbau von N"-Acetyl-eglin C

N^-Acetyl-eglin C (9,6mg, 1,18μΜοΙ) werden in 2ml 0,1 N Ammoniumacetat-Puffer; 10"³M CaCI₂ suspendiert, der pH mit

verdünntem Ammoniak wird auf 7,5 eingestellt und mitTPCK-Trypsin (Worthington, 500μg) während 90 Stunden bei 37⁰C

inkubiert. Die Enzymreaktion wird durch Zugabe von 50μΙ Eisessig gestoppt. Durch Zentrifugation entfernt man ein tryptisches Fragment (Тд) und trennt anschließend mittels Umkehrphasen-HPLC den klaren Überstand in die übrigen tryptischen Fragmente

(T₁-T₇) auf (vgl. obiges Schema). Die Analyse erfolgt mittels FAB-Mapping (30).

Der tryptische Abbau von INT-Acetyl-eglin C (200pMol) und die mikropräparative RP-HPLC-lsolierung von DABTC-Peptiden nach der Methode von R. Knecht et al. (32), sowie der Vergleich mit natürlichem Eglin C bestätigt die Identität der tryptischen Peptide

T2, T3, T4, T₅, T₆ und T7 (vgl. obiges Schema).

Das Peptid Ti (Threonin am N-Terminus) weist in beiden Experimenten eine im Vergleich zum natürlichen Eglin C verschiedene Retentionszeit in einer HPLC-Analyse auf (Nucleosil 5/C18,4,6 χ 120mm; 1,2ml/min.; Elutionsmittel: 0,1 %Trifluoressigsäure;

Acetonitril-Wasser 8:2 mit 0,07% Trifluoressigsäure):

R,9,44min. (zum Vergleich Peptid T₁ bei natürlichem Eglin C: R,7,34min).

II. Staphylococcus aureus-Protease V8-Abbau des tryptischen Fragments T₄ von №-Acetyl-eglin C

Der Abbau von ca. 100/ng destryptischen Fragments T₄ von N"-Acetyleglin C (siehe oben) durch Staphylococcus aureus-Protease V8 wird in 100μΙ 0,1 M Ammoniumacetat pH8,0 bei 37⁰C während 4h durchgeführt. Der Abbau ergibt die erwarteten Fragmente (vgl. obiges Schema; Gemischanalyse mittels FAB-MS).

с Partielle Sequenzanalyse

I) Edman-Abbau

Das Misslingen der klassischen Secjuenzanalyse nach Edman unter Standardbedingungen (33) (keine N-terminalet

Aminosäurereste werden identifiziert) weist auf einen modifizierten (blockierten) N-Terminus beim №-Acetyl-eglin Chin.

II) Sequenzierung mittels FAB-MS

Das N-terminale tryptische Fragment „T," hat laut FAB („fast atom bombardment")-MS ein nominales Molekulargewicht von

951. Dieses liegt damit um 42 höher als im korrespondierenden T-pFragment aus natürlichem Eglin C (909). Auf Grund der

Massendifferenzen muß die Modifikation an der N-terminalen Aminosäure Threonin vorliegen.

Die Molekulargewichte der übrigen tryptischen Fragmente aus obigem Experiment (Beispiel 27 bl) entsprechen den

Erwartungen.

d) Molekulargewichtsbestimmung von №-Acetyl-eglin C (Vergleich mit natürlichem Eglin C)

Probe 1 (NT-Acetyl-eglin C) Probe 2 (natürliches Eglin C aus Blutegeln)

Summenformel: Summenformel:

C375H522N96O108 C373H₅₅oN9eOi07

chemisches Molekulargewicht chemisches Molekulargewicht

gefunden: 8133,1 gefunden: 8 091,4

berechnet: 8133,06 berechnet: 8091,03

Die chemischen Molekulargewichte sind gemittelt aus 3 verschiedenen Messungen (C 12,011; H 1,0079; N14,0067; 015,9994).

Experimentelle Bedingungen: ca. 30^g Probe wird direkt in Thioglycerin als Matrix auf dem Probengeber gelöst, und mit einem ZAB-HF (Auflösung 1000)-Massenspektrometer der Fa. VG-Analytical Ltd. Manchester gemessen: Xenon bombardment; lon energy ЗкеѴ; scanning linear mode; Eichung: Csl/Rbl-Referenz Mischung

e. Isoelektrische Fokussierung:

Isoelektrischer Punkt IP N'-Acetyl-eglinCö^

IP natürliches Eglin C 6,5

Bedingungen: Je 20дд Probe in 20μ\ H₂O aufgetragen. PAGplate LKB-Ampholine pH3,5-9,5; 5% PAG 1 mm. Elektrolyt:

Anode(+) IM H₃PO₄, Kathode(-) 1N NaOH, 2OmA, 700V, 2,5Std. Färbung mittels 10% (wt/vol.) Trichloressigsäure-Lösung oder Coomassie Brilliant Blue R-250 in üblicherweise.

f. Celluloseacetat-Elektrophorese (steigend)

№-Acetyl-eglin C: 4,7cm vom Start Richtung Kathode Eglin C: 5,8cm vom Start Richtung Kathode Bedingungen: Je 2/i.g Probe in 2μΙ H₂O aufgetragen auf Cellogel 8 x 17cm Folie (Chemetron, Milano): Horiphor Flachbettelektrophoresekammer (Innovativ Labor), Elektrolyt pH 1,9,250 Volt 1 Stunde; Nachweis mit den üblichen Färbereagentien, wie TDM. Ninhydrin, Ponceau S-Lösung (Biotec-Fischer).

g. Nachweis der N-Acetyl-Gruppe in N"-Acetyl-eglin C

I) 100/Ag N^a-Acetyl-eglin C werden in 100μ\ 0,03N Salzsäure für 16 Stunden bei 110⁰C partiell hydrolysiert und am Hochvakuum getrocknet. Mittels Gaschromatographie werden mehr als 0,5 Äquivalente Essigsäure identifiziert (34).

II) Die Acetylfunktion wird eindeutig mittels seOMHz-Protonenresonanzspektroskopie im tryptischen Fragment „Ti" (vgl. Beispiel 27Bl) identifiziert: 400мд Fragment ,,T₁" aus N°-Acetyl-eglin C werden am Hochvakuum während 2 h getrocknet und in 1 ml D₂O gelöst. Das 360MHz Ή-NMR-Spektrum wird bei 297 ⁰K mit 4000 SW über Nacht gemessen. Referenz H₂O (84,95 ppm).

δ 2,15ppm Singulett (3H) CH₃ aus N-Acetyl-Gruppe δ 1,2 ppm Dublett(3H, J = 7HzJy-CH₃ aus Threonin.

Beispiel 28: Transformation verschiedener E. coli-Stämme mit dem Plasmid pML147und Kultivierung der transformierten Wirtszellen.

In analoger Weise, wie in Beispiel 18d beschrieben, werden die Stämme E. coli LM1035, E. coli JA221 und E. coli W3110 trpR, trp AED24(vgl. Referenz 38) mit dem Plasmid pML147 transformiert. Transformierte Kolonien werden auf das Vorhandensein von F₁(C)-F₂-DNA geprüft, wie in Beispiel 15e beschrieben. Es werden 3,5 bzw. 3 positive Kolonien erhalten, die die folgenden Bezeichnungen erhalten: E.C0HLMIO35/PMLI47/I E. coli LM1035/pML147/2 E.coliLM1035/pML147/3 E.coliJA221/pML147/1 E.coliJA221/pML147/2 E.coliJA221/pML147/3 E. coli JA221/pML147/4 E.coliJA221/pML147/5 E. coli W3110trpR, Δ trpED24/pML147/1 E. coli W3110trpR, Δ trpED24/pML147/2 E. coli W3110trpR, Δ trpED24/pML147/3 Die genannten Klone werden in einem modifizierten M9-Medium kultiviert, welches die folgende Zusammensetzung aufweist: Na₂HPO₄-7H₂O 9,0 g

KH₂PO₄ 3,0 g

NaCI 0,5 g

NH₄CI 3,5

CaCI₂ -2H₂O 0,015 g

MgSO₄-7H₂O 0,25 g

Casaminosäuren 7,0 g

Hefeextrakt 5,0 g

Vitamin B₁ 0,0099 g

Fisen-ll-citrat 0,006 g

MOPS (3-Morpholinopropan-i-sulfonsäure) 34,0 g

Glucose 20,0 g

Ampicillin 0,1 g

bs wird bei 37°C und 180upm solange kultiviert, bis die Bakteriensuspension eine optische Dichte (OD₆₂₃) von ca. 13,0 erreicht hat. Anschließend erntet man die Zellen (5ml der wachsenden Kultur) und resuspendiert die Bakterien in 0,5 ml einer Lösung von 5OmM Tris · HCI (pH8) und 3OmM NaCI. Danach wird die Suspension auf 1 mg/ml Lysozym (Boehringer) eingestellt und 30min. in Eis gestellt. Durch abwechselndes Einfrieren der Suspension in flüssigem Stickstoff und Auftauen bei 37°C werden die

Bakterien zerstört. Dieser Vorgang wird 5mal wiederholt. Anschließend wird die Mischung 30min. bei 16000upm bei 4"C zentrifugiert.

Jeder der Klone wird auf die Bildung von Eglin C-Aktivität getestet, wie in Beispiel 21 beschrieben. In den Bakterienextrakten werden Eglin C-Aktivitäten von 3,0-13jug/ml Kultur erhalten. Beispielsweise werden die folgenden Aktivitäten erhalten:

Stamm Eglin C-Aktivität

(/ig/ml Kulturlösung)

E.coliLMIOSö/pML^/i 3,0

E.coliJA221/pML147/1 6,0

E.coliW3110trpR,trpAED24/pML147/1 11,0

Beispiel 29: Fermentation des transformierten Stammes E. coli W3110trpR,trpAED24/pML147/1 und Aufarbeitung der Kulturbrühe

In analoger Weise, wie in Beispiel 28 beschrieben, werden in einem 5000I Fermenter E. coli W3110trpR,trpAED24/pML147/1-Zellen in 3000I modifiziertem M9-Medium kultiviert, bis die Suspension eine optische Dichte (СЮ₆₂з) von ca. 10-13 erreicht hat. Die Kulturbrühe (pH 7,4) wird auf 10⁰C abgekühlt, und die Zellen werden mit einer Alfa-Laval BRPX-207 Entschlammvorrichtung behandelt. Der klare Überstand enthält keine Eglin-Aktivität und wird verworfen. Während der Entschlammung wird der Schlammraum fortwährend mit Lysepuffer A (5OmM Tris HCI, 3OmM NaCI, eingestellt mit HCI auf pH 8,0) teilentschlammt und am Schluß der Inhalt der Zentrifugenschale (7 1) unter voller Entschlammung mit Lysepuffer A ausgestoßen. Die erhaltene Zellmasse wird mit Puffer A auf 3751 eingestellt und besitzt einen pH-Wert von 7,6. Nach dem Kühlen auf 5-10⁰C wird die Suspension durch eine Dyno-Mühle (Typ KD5) geleitet, welche mit 4,21 Glasperlen mit einem Durchmesser von 0,5-0,75 mm ausgerüstet ist. Dabei werden die Zellen zerstört. Die so erhaltene Suspension wird mit Essigsäure auf einen Essigsäuregehalt um 2% (v/v) eingestellt und über Nacht bei 10⁰C gerührt. Die Suspension mit einem pH von 3,9 wird mit der oben beschriebenen Technik entschlammt. Der klare Überstand von 300I wird in einem Fallfilmverdampfer (Stundenleistung 601 Wasser) auf 351 auf konzentriert. Das leicht trübe Konzentrat wird zentrifugiert und der so erhaltene klare Überstand auf einer Ultrafiltrationsanlage DDS = Lab35, welche mit GR 81 PP Membrane bestückt ist (Fläche 2,5 m²), gegen 2% Essigsäure diafiltriert. Das Endvolumen beträgt 311.

Ein aliquoter Test von 21 dieser klaren Proteinlösung wird auf eine Sephadex G-50 F-Säule (KS 370 Pharmacia) mit einem Bettvolumen von 961 aufgetragen, wobei die Säule mit 2% Essigsäure äquilibriert ist. Die in 151 Eluat enthaltene Hauptfraktion wird mittels Ultrafiltration eingeengt und anschließend gegen Wasser diafiltriert. Die so erhaltene klare wäßrige Lösung wird lyophilisiert. Der Rückstand besteht aus reinen Eglin C-Verbindungen.

Beispiel 30: Analyse des Produktgemisches aus der Fermentation von E. coli W3110trpR,trpAED24/pML147/1

Der in Beispiel 29 erhaltene, aus Eglin C-Verbindungen bestehende Rückstand wird einer HPLC-Analyse unterworfen. Experimentelle Bedingungen: Vydac 218TP510-RP-HPLC-Säule, 10 χ 250mm; 1 mg Eglin-Verbindungen pro Trennung; AUFC: 2,0 bei 220nm; Durchflußgeschwindigkeit: 2ml/min; Eluent: A: 0,1 % Trifluoressigsäure, B: Acetonitril/Wasser 8:2 + 0,07% Trifluoressigsäure, 1 min. 40% B, dann während 30min. auf 60% B steigern.

Ergebnis: Es werden sieben Produkte identifiziert, die fraktioniert und einzeln dem HLE-Test unterworfen werden. Außerdem werden die isoelektrischen Punkte (IP; isoelektrische Fokussierung wie in Beispiel 27e beschrieben, LKB-Ampholine pH4,0-6,5) bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt:

Fraktion	Retentionszeit (min)	IP.	HLE
FO	28,2	6,5	+
Fl	29,1	/ 6,4 \ 6,3	+
FlA	30,0	5,3
F2	31,2	5,4	+
F3	33,8	4,8	+
F4 F4A	34,6 35,4	} -	+

Beim Hauptprodukt (Fraktion F2) handelt es sich auf Grund des gemessenen isoelektrischen Punktes, des HPLC-Wertes und der zur Kontrolle durchgeführten Molekulargewichtsbestimmung (gefundenes Molekulargewicht: 8133,2) um N^a-Acetyl-eglin C. Die Substanz in Fraktion 0 (FO) ist natürliches Eglin C, wie der isoelektrische Punkt, der HPLC-Wert und die zur Kontrolle durchgeführten Molekulargewichtsbestimmung (gefundenes Molekulargewicht: 8091,2) beweisen.

Beispiel 31: Synthese von modifizierten Eglin C-Verbindungen durch E. coli НВЮІ-Zellen, die mit dem Plasmid pML147 (C) bzw. pML147 (C) transformiert wurden

Die Stämme E. coli HB101 pML147 (C) und E. coli HB101 pML147 (C") werden, wie in Beispiel 22 beschrieben, kultiviert, und nach dem Zellaufschluß wird die Kulturbrühe durch Chromatographie an einer Anhydrochymotrypsin-Säule (vgl. Beispiel 25) gereinigt.

Durch HPLC-Trennung (Bedingungen: siehe Beispiel 30) werden aus der Kulturbrühe von E.coli HB 101 pML147 (C) zwei Produkte (A und B) isoliert. Produkt A bei der Disk-Elektrophorese (pH8,9,15%iges Gel; entsprechend einem Maurer-System Nr. 2) einen R_rWert von 0,42 auf. Der Abbau mit Trypsin ergibt 7 Fragmente, von denen 6 mit den durch Abbau von N^a-Acetyleglin C gewonnenen Fragmenten (vgl. Beispiel 27 b) identisch sind. Das 7. Fragment, entsprechend den N-Terminus des Peptids, besteht laut Aminosäure-Sequenzanalyse nach Edman (33) aus der Sequenz Ser-Clu-Leu-Lys. Produkt A hat damit die für Eglin C erwartete Struktur:

SerCluLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrVal

AspGlnAlaArgGluTyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAspVaiTyrPheLeuPro

GluGlySerProValThrLeuAspLeuArgTyrAsnArgValArgValPheTyrAsnProGly

ThrAsnValValAsnHisValProHisValGly.

Produkt B ergibt beim tryptischen Abbau ebenfalls 7 Fragmente. Ein Unterschied zu Produkt A besteht nur im N-terminalen Fragment, welches eine zusätzliche N-Acetylgruppe am Serin-Rest trägt und somit die Sequenz N-Acetyl-Ser-Clu-Leu-Lys aufweist. Produkt B ist damit als IST-Acetyl-eglin C zu bezeichnen.

Aus dem Aufschluß der kultivierten E.coli HB101pML147 (C')-Zellen läßt sich nach Chromatographie an einer Anhydrochymotrypsin-Säule und Feinreinigung mit HPLC nur ein Produkt identifizieren (Produkt C). Produkt C weist bei der Disk-Elektrophorese (Bedingungen wie oben) einen R_rWert von 0,30 auf. Dertryptische Abbau ergibt als N-terminales Fragment das Dipeptid Leu-Lys; die übrigen Fragmente sind mit den entsprechenden, beim tryptischen Abbau von NT-Acetyleglin C isolierten Fragmenten identisch. Produkt C hat damit die für Eglin C" erwartete Struktur:

LeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrVal

AspGlnAlaArgGluTyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAspValTyrPheLeuPro

GluGlySerProValThrLeuAspLeuArgTyrAsnArgValArgValPheTyrAsnProGly

ThrAsnValValAsnHisValProHisValGly.

Beispiel 32: Enzymatische Synthese von №-Acetyl-eglin C

8mg (1 μΜοΙ) Eglin C (gewonnen gemäß Beispiel 26c mit anschließender Feinreinigung durch HPLC) werden in einem 0,06M Phosphatpuffer pH7,5 mit 0,5/xMol Acetyl-Coenzym A und ca. 200^g eines N^a-Acetyltransferase enthaltenden E.coli HB101-Extraktes versetzt. Die Inkubation wird bei 37⁰C durchgeführt. Nach 3 Stunden wird das Enzym durch Erhitzen auf 60⁰C inaktiviert und die Mischung der HPLC-Reinigung unterworfen. Das abgetrennte №-Acetyl-eglin C ist mit dem biosynthetischen Produkt (vgl. Beispiel 26c) identisch.

Beispiel 33: Test-Kit mit monoklonalen anti-Eglin C-Antikörpern zur Bestimmung von Eglin C, kompetitiver Radio-Immunoassay

Eine nach Beispiel 24c C) hergestellte Lösung von anti-Eglin C-Antikörpern wird mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS-Lösung) auf eine Konzentration von 1 /*g pro ΙΟΟμΙ verdünnt. 100 μΙ dieser Lösung werden 2 Stunden bei 37°C in Plastik-Röhrchen oder auf Plastik-Mikrotiterplatten inkubiert, wobei Antikörper unspezifisch auf die Plastikoberfläche adsorbiert werden. Zur Absättigung der noch freien aktiven Stellen auf der Plastikoberfläche wird mit einer Bovinserum-Albumin-Lösung (BSA-Lösung) nachbehandelt.

Verdünnungsreihen einer Probelösung oder der Standardlösung in BSA-Lösung werden mit je 50μΙ einer Lösung von nach bekannter Weise (20) mit radioaktivem ¹²⁵Jod markiertem Eglin C der Aktivität 10000cpm pro 50μΙ versetzt und dann auf der Plastikoberfläche 2 Stunden bei 37°C und anschließend 12 Stunden bei 4⁰C inkubiert. Die Röhrchen oder Mikrotiterplatten werden mit phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen und die Radioaktivität gemessen. Die Konzentration von Eglin C in der Probelösung wird durch eine mit Standardlösung gemessene Eichkurve bestimmt. Ein Test-Kit für den beschriebenen Radio-Immunoassay enthält:

2 ml Lösung von anti-Eglin-Antikörpern aus Beispiel 24c C) mit einer Konzentration von 1 bis 10mg pro ml, 100ml phosphatgepufferte Salzlösung (PBS-Lösung) 100ml 0,3 % Bovinserum-Albumin und 0,1 % Natriumazid in PBS-Lösung (BSA-Lösung), 2ml Lösung von radiaktivem Eglin C der AHivität 200000cpm/mi,

2 ml Standardlösung enthaltend lOOng/ml Eglin C,

1 ml-Röhrchen oder Mikrotiterplatten aus Plastik.

Beispiel 34: Test-Kit für Tandem ELJSA mit monoklonalen anti-Eglin C Antikörpern

Auf Mikrotiterplatten werden 300 ng/Vertiefung monoklonale Antikörper 299S18-20, gelöst in Natriumkarbonat-Fixierungspuffer (pH9,6), durch Inkubation über Nacht bei 4^OOC fixiert. Die Platten werden dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, enthaltend 0,005% Tween 20 (H 7,2) gewaschen und die Vertiefungen anschließend über Nacht bei 4°C mit 200Ail/Vertiefung phosphatgepufferter Kochsalzlösung enthaltend 0,2% Gelatine und 0,02% Natriumazid (PBS + Gelatine + A) behandelt. Wie zuvor wird dreimal gewaschen. Verschiedene Konzentrationen von Eglin C verdünnt in PBS + Gelatine + A werden zugefügt und 4Std. bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dreimaligen Waschen wie zuvor wird mit ΙΟΟμΙ/Vertiefung einer Mischung vom zweiten monoklonalen Antikörper (299S22-1) gekuppelt an alkalische Phosphatase bei optimalem Titer (0,5 mg/ml Konjugat, für den Test 1:200 verdünnt mit PBS + Gelatine + A) versetzt und 2 Std. bei Raumtemperatur inkubiert, worauf nach Zugabe von 150μΙ p-Nitrophenylphosphat in Diethanolaminpuffer (pH9,8) die Farbe entwickelt wird. Die Farbintensität (OD₄₀₅) wird während einer Stunde alle 15 Minuten mit einem Multiscan ELISA Ablesegerät festgestellt.

Anhand einer Eichkurve mit bekannten Mengen natürlichem Eglin C, z. B. von 10¹ bis 10³ng/ml, wird durch Vergleich der gemessenen OD₄₀₅ der Gehalt an Eglin C in der zu untersuchenden Probe festgestellt.

Die Methode ist auch anwendbar zur Bestimmung von Eglin B oder einem anderen Eglin, z.B. N"-Acetyl-eglin C, und ist auch anwendbar, wenn die zu bestimmenden Egline sich im Plasma, z. B. in Ratten-, Katzen- oder Kaninchen-Plasma, befinden. Ein Test-Kit für diesen Tandem EUSA umfaßt die dafür notwendigen Reagentien, insbesondere monoklonal anti-Eglin Antikörper, z. B. 299S18-20 und 299S22-1, gegebenenfalls als Lösung in dem zu benutzenden Puffer, die zu benutzenden Puffer, inklusive den Substratpuffer, Waschlösungen, p-Nitrophenylphosphat als Substrat, eine Standardlösung enthaltend das zu bestimmende Eglin, z. B. Eglin C, eine Plastikmikrotiterplatte, und/oder gegebenenfalls eine Tabelle oder Eichkurve, z. B. die folgende; erhalten gemäß vorstehend beschriebenem Tandem ELISA:

Natürliches Eglin C OD₄₀S

(ng/ml)

10¹ 0.18

10² 0.73

10³ 1.23

hT-Acetyleglin C OD₄₀₅

(ng/ml)

10¹ 0.32

10² 1.00

10³ 1.26

Beispiel 35: Pharmazeutisches Präparat enthaltend N^a-Acetvl-eglin C für parenterale Applikation Eine gemäß Beispiel 24 oder 25 hergestellte, N^a-Acetyl-eglin C enthaltende Lösung wird gegen eine 0,9%ige NaCI-Lösung dialysiert. Die Konzentration der Lösung wird danach durch Verdünnen mit der gleichen NaCI-Lösung auf 1 mg/ml oder 10 mg/ml eingestellt. Diese Lösungen werden durch Ultrafiltration (Membranen mit 0,22/*m Poren) sterilisiert.

Die sterilisierten Lösungen sind direkt verwendbar für die intravenöse Verabreichung, für die Dauertropfinfusion, sowie zur Vernebelung in einem Inhalationsgerät (z.B. Bird).

Die erfindungsgemäß erhaltenen monoklonale anti-Eglin Antikörper produzierenden Hybridomzellen wurden am Oktober 1984 in der „Collection Nationale de Cultures de Microorganismes" des Institut Pasteur, Paris, Frankreich unter den folgenden Nummern hinterlegt:

Hinterlegung am 06.November 1984, hinterlegte Hybridomzellen und Hinterlegungs-Nummem: 299s18-20 nr.i-361,299s22-1 nr.i-362,299s22-10 nr.i-363.

Beispiel 36: Expression von Eglin in Hefe

Ein für die Expression von fremden Genen in Hefe geeignetes System erfordert einen starken Hefepromoter, vorzugsweise einen induzierbaren Promoter, und ein Hefe-Transkriptions-Stopsignal, welche hintereinander geschaltet sind und durch für die Einfügung von fremden Genen geeigneten, einmalig vorkommenden Restriktionsstellen getrennt sind. Ein Expressionsvektor enthält außerdem DNA Sequenzen aus Hefe, welche die autonome Replikation in Hefe erlauben und zu einer hohen Kopienzahl des Plasmids führen. Bei diesen Sequenzen handelt es sich vorzugsweise um Ηθίβ-2μ-5βρυβηζβη. Der Vektor enthält weiterhin ein Hefe-Selektionsgen, vorzugsweise des LEU2-Gen der Hefe, sowie pBR322-DNA Sequenzen mit dem Replikationsursprung und dem Ampicillin-Resistenzgen für eine Vermehrung in E.coli.

Ein geeignetes Expressionssystem, das die beschriebenen Anforderungen erfüllt, ist der Europäischen Patentanmeldung Nr. 100,561 beschrieben worden und hat sich als sehr leistungsfähig in Hefe herausgestellt. Fremde Gene werden unter der Kontrolle des induzierbaren PHO5 Promoters der sauren Phosphatase der Hefe exprimiert. PHO5 Promoter, fremdes Gen und PHO5 Transkriptions-Stopsignale sind nacheinander im Plasmid pJDB207 angeordnet. Das Plasmid enthält Hefe-2^-Sequenzen, das LEU2-Gen der Hefe, und den Replikationsursprung und das Ampicillin-Resistenzgen von E.coli. Das Expressionsplasmid pJDB207R/PHO5-EGL wird wie folgt hergestellt:

a) Isolierung des pJDB207 Vektorfragmentes:

6 ^g des Plasmids pJDB207R/IF (a-3) (EP 100,561) werden vollständig mit der Restriktionsendonuklease BamHI verdaut. Die resultierenden DNA-Fragmente einer Größe von 6,85kb und 1,15kb werden mit Ethanol gefällt und in 400/LtI 5OmM Tris-HCI pH8.0 resuspendiert. 4,5 Einheiten Kälberdarm- alkalische Pl" ihatase (Boehringer, Mannheim) werden hinzugefügt. Die Mischung wird 1 Stunde bei 37⁰C inkubiert. Anschließend wird die Phosphatase durch 1,5stündige Inkubierung bei 65⁰C inaktiviert. Die Lösung wird auf 15OmM NaCI eingestellt. Die DNA-Lösung wird auf einen DE 52 (Whatman) Anionenaustauscher ΠΟΟμΙ-Bett), welcher mit 1OmM Tris-HCI pH7,5 enthaltend 15OmM NaCI und 1mM EDTA äquilibrieit worden ist, aufgetragen. Nach dem Waschen mit dem gleichen Puffer wird die DNA mit 400μΐ 1,5 M NaCI, 1OmM Tris-HCI pH 7,5,1 mM EDTA eluiert und mit Ethanol gefällt. Das große 6,85 kb BamHI-Fragment wird auf einem 0,6%igen niedrigschmelzenden Agarosegel in Tris-Borat-EDTA Puffer pH 8.3 von dem kleinen Fragment abgetrennt.

b) Isolierung des 534 bp PHO5 Promoterfr^gmentes

10/xg des Plasmids p31/R (EP 100,561) werden mit den Restriktionsendonuklearen EcoRI und BamHI verdaut. Die3 resultierenden Fragmente werden auf einem 0,6%igen niedrigschmelzenden Agarosegel in Tris-Borat-EDTA Puffer pH 8,3 getrennt. Das 534bp BamHI-EcoRI-Fragm«*· t, welches den PHO5-Promoter anschließend des mRNA-Starts enthält, wird isoliert.

c) Isolierung eines 221 bp DNA-Fragmentes, welches die Eglin-Kodiersequenz enthält

8jug des Plasmids pML 147 werden mit den Restriktionsendonukleasen BamHI und EcoRI verdaut. Die 2 resultierenden DNA-Fragmente werden auf einem 0,6%igen niedrigschmelzenden Agarosegel in Tris-Borat-EDTA-Puffer pH 8,3 getrennt. Das 221 bp Fragment wird isoliert.

d) Ligierung der DNA-Fragmente

Die drei oben beschriebenen und passende kohäsive Enden aufweisenden DNA-Fragmente werden in einer Reaktion ligiert. 0,1 pmol (0,45^g) des 6,85kb BamHI-Vektorfragmentes, 0,1 pmol (70 ng) des 534bp BamHI-EcoRI-PHOS-Promoterfragmentes und 0,2pmol (29ng) des 221 bp EcoRI-BamHI-Fragments von pML 147 werden ligiert. Die 3 DNA-Fragmente sind in kleinen Gel blocken von niedrigschmelzender Agarose enthalten. Die drei Agarosegelblöcke werden vereinigt, bei 65 ⁰C verflüssigt und 2fach verdünnt. Die Ligierung wird in einem Volumen von 270μΙ von 6OmM Tris-HCI pH7,5,1OmM MgCI₂,1OmM DTT, 1 mM ATP mit 16 Einheiten T4 DNA-Ligase (Boehringer, Mannheim) bei 15°C während 16 Stunden durchgeführt. Ein Aliquot der Ligiermischung (10μΙ) wird zu 100μΙ Kalzium- behandelten, Transformationskompetenten E.coli HB101-Zellen hinzugefügt. 24 transformierte, amp" Kolonien werden separat in LB Medium, welches 100мд/тІ Ampicillin enthält, kultiviert. Das Plasmid DNA wird nach der Methode von Holmes et al. (Anal. Biochem. 114,193 [1981]) gewonnen und wird durch einen Hindlll/EcoRI-Doppelverdau analysiert. Das Auffinden eines бООЬр-EcoRI-Hindlll-Fragments beweist, daß der Einbau des PHOS-Promoter-Eglin C-DNA-Fragments in den Expressionsvektor in der richtigen Orientierung erfolgt ist. Wie erwartet besitzen ungefähr 50% der Klone den Einschub in der richtigen Orientierung. Einer dieser Klone wird isoliert und als pJDB207/PHO5-EGL bezeichnet.

e) Transformierung von Saccharomyces cerevisiae GRF18

Das Plasmid pJDB207R/PHO5-EGL wird in den Saccharomyces cerevisiae-Stamm GRF18 (a, his 3-11, his 3-15, leu 2-3, leu 2-112, can") gemäß der Transformationsvorschrift von Hinnen et al. (4) eingebracht. Transformierte Hefezellen werden auf Hefe-Minimalmediumplatten (ohne Leucin) selektiert. Einzelne transformierte Hefekolonien werden isoliert und als Saccharomyces cerevisiae GRF 18/pJDB207R/PHO5-EGL bezeichnet.

f) Fermentierung von S.cerevisiae GRF18/pJDB20 R/PHO5-EGL

Zellen von S.cerevisiae GRF18/pJDB207R/PHO5-EGL werden in 300ml Hefe Minimalmedium (Difco Yeast Nitrogen Base ohne Aminosäuren, dem 2% Glukose und 20mg/l L-Histidin zugegeben wurde) unter Schütteln bei 30⁰C während 24 Stunden in einem 11 Erlenmeyer-Kolben bis zu einer Dichte von 3 x 10⁷ Zellen/ml kultiviert. Die Zellen werden mit 0,9% NaCI gewaschen und dazu verwendet, 31 eines niedrig P_rMinimalmediums, welches nach der Vorschrift des Difco Yeast Nitrogen Base-Mediums (ohne Aminosäuren)—mit0,03g/l KH₂PO₄,1 g/l KCI, 10g/l L-Asparagin an Stelle von (NH₄)₂SO₄,2% Glukose und 1 g/l L-Histidin hergestellt wurde. Das Medium wird auf eine optische Dichte (ODe₀₀) von 0,25 eingestellt. Die Zellen werden in einem MBR Mini-Bioreaktor während 24 Stunden unter Rühren (500 rpm) bei 30°C kultiviert und bei einer optischen Dichte (OD₆Oo) von 1,9 geerntet.

Beispiel 37: Gewinnung von Eglin C und N^a-Acetyl-Eglin C aus transformiertem Saccharomyces cerevisiae GRF 18/pJDB 207R/PHO5 EGL

Eglin C und №-Acetyl-Eglin C werden aus einem Saccharomyces cerevisiae-Stamm, der mit einem Plasmid, welches das Eglin C Strukturen enthält, isoliert. Die Produkte werden in einem Verhältnis von 2:1 (w/w) und gemäß reversed phase HPLC in einer Ausbeutevon 15-20 mg Kulturbrühe exprimiert. Die S. cerevisiae-Zellen werden bis zu einer Zelldichte (O. D. bei 600 nm) von 1,9 kultiviert, wie in Beispiel 36f beschrieben.

Die Kulturbrühe (3I) der transformierten Hefezellen wird auf 4°C abgekühlt und zentrifugiert. Die Zellen im Zentrifugationsniederschlag werden in 150 ml Puffer (5OmM Phosphat pH7,4,4mM Zwittergent [Calbiochem.]) resuspendiert und mit Glaskugeln zerschlagen. Die homogenisierte Lösung wird zentrifugiert und der Überstand mit dem gleichen Volumen 2%iger Essigsäure verdünnt. Die Suspension wird 15 Min. bei 4000 upm zentrifugiert, der Niederschlag abgetrennt und der trübe Überstand erneut 60Min. bei 1200upm zentrifugiert. Der klare Überstand wird durch eine kationische Austauschersäule (Carboxymethylcellulose, Bettvolumen 32ml) bei pH4 gegeben (1 Bettvolumen als Startpuffer). Die Elution wird mit einem linearen Salzgradienten von 5 Bettvolumen Puffer A und 5 Bettvolumen Puffer B durchgeführt (Puffer A: 2OmM Ammoniumacetat, pH4,0; Puffer B: 20OmM Ammoniumacetat, pH6,5; 43ml Durchfluß pro Stunde; Fraktionsgröße 14ml).

N"-Acetyl-Eglin C wird in den Fraktionen 29—31 (15mg) gewonnen und, wie beschrieben, weiter durch semipräparative reversed phase HPLC gereinigt (Ausbeute: 8mg).

Eglin C wird in den Fraktionen 32-33 (24mg) gewonnen, lyophilisiert und weiter durch Chromatographie an einer Diethylaminoethylcellulose-Kolonne (DE 53, Whatman, 32ml Bettvolumen) gereinigt. Das Produkt wird in 15ml Startpuffer (pH7,6) gelöst, auf die Säule gebracht und mit einem Bettvolumen Puffer A gewaschen. Mehr als 90% (bezogen auf den Gesamtproteingehalt) reines Eglin C eluiert mit den Fraktionen 48-54, wobei man einen linearen Salzgradienten benutzt (Puffer A: 2OmM Ammoniumacetat pH7,6,5 Bettvolumen:

Puffer B: 20OmM Ammoniumacetat pH 5,0,5 Bettvolumen; Durchfluß 42 ml/Stunde, Fraktionsgröße 3,8ml [5 Min.]). Reine Fraktionen (gemäß isoelektrischer Focussierung) werden vereinigt und dreimal lyophilisiert (Ausbeute 18mg).

Die beiden gewonnenen Egline werden untersucht und chemisch charakterisiert, wie in den Beispielen 27-30 beschrieben.

Ergebnisse:

Eglin C isoelektrischer Punkt 6.F

Molekulargewicht (FAB-MS) 8091

N-terminal Aminosäure Thr

HLE Inhibierung +

N^a-Acetyl-Eglin C Isoelektrischer Punkt 5,4

Molekulargewicht (FAB-MS) 8133

N-terminale Aminosäure N^a-Acetyl-Thr

HLE-Inhibierung +

Das aus transformierten Hefezellen gewonnene Eglin C hat die gleichen Retentionszeiten im HPLC wie das natürliche Eglin C aus Blutegeln. N^a-Acetyl-Eglin C aus transformierten Hefezellen hat die gleichen Retentionszeiten wie sein Gegenstück aus E.coli. Die Aminosäure-Zusammensetzungen und die übrigen Daten entsprechen den Erwartungen.

Beispiel 38: Fermentation von Saccharomyces cerevisiae GRF 18/pJDB 207/PHO5-EGL in einem 301 Fermenter

Der Stamm Saccharomyces cerevisiae GRF 18/pJDB 207 R/PHO5-EGL wird im folgenden Nährmedium (niedrig P,) bis zu einer Zelldichte (O. D. ЬеібООпт) von 1,87 kultiviert (Konzentrationen in g oder mg pro 11 Lösung):

L-Aspa rag i η H₂O 10g

L-Histidin 1,0 g

KH₂PO₄ 0,03 g

MgSO₄-7 H₂O 0,5 g

NaCI 0,1 g

KCI 1,0 g

CaCI₂-2 H₂O 0,1g

Cerelose (separat sterilisiert) 20g

Borsäure 50 mg

CuSO₄ 5 mg

Kaliumiodid 10 mg

FeCI₃ 20 mg

MnSO₄ 40 mg

Natriummolybdat 20 mg

ZnSO₄ 40 mg

Kalziumpantothenat 40 mg

Folsäure 5 mg

Inositol 200 mg

Nikotinsäure 40 mg

Paraaminobenzoesäure 20 mg

Pyridoxalphosphat 40 mg

Riboflavin 20 mg

Thiamin 40 mg

Biotin-Lösung (10 mg/100 ml 50 % Ethanol)

Bedingungen: pH-Kontrolle mit NaOH; niedere Grenze pH4,6; Temperatur 30⁰C. Testproben (insgesamt 8, jeweils 100ml Kulturbrühe) werden alle 6 Stunden genommen. Die Zellen werden mechanisch zerschlagen und die klaren Überstände werden nach der Behandlung mit Essigsäure mittels RP-HPLC, PAGE und HLE-Inhibierung untersucht.

Nach einer Fermentationszeit von 36 Stunden werden optimale Ausbeuten erhalten (4,4mg N^a-Acetyl-Eglin C und 13,6 mg Eglin C pro 11 Kulturbrühe). Die scheinbaren Molekulargewichte auf PAGE entsprechen den Erwartungen.

Durch pH-Kontrolle mit einem niederem Limit von pH 5 und eine Fermentationsdauer von 30 Stunden unter den gleichen Bedingungen wird das Verhältnis zwischen den beiden Produkten zugunsten von Eglin C verschoben (Ausbeute: 6,4mg/l; Ausbeute an N^a-Acetyl-Eglin C: 0,1 mg/l). Hefe-Eglin C und Hefe-N^a-Acetyl-Eglin C werden gewonnen und bis zur Homogenität gereinigt, wie in Beispiel 29 beschrieben.

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Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Eglin-Verbindungen der Formel
(Met)-B-ProGluValValGlyLysThrValAspGlnAlaArgGlu

TyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAspValWPheLeuProGluGlySerProValThrLeuAsp LeuArgTyrAsnArgValArgValPheTyrAsnProGlyThrAsnValValAsn-B'

(XIV),

worin B für eine direkte Bindung oder für einen Peptidrest steht, der 1-10 Aminosäurebausteine vom N-Terminusder natürlichen Egline umfaßt, z. B. ein solcher ausgewählt aus der Gruppe SerPhe-, LeuLysSerPhe-, SerGluLeuLysSerPhe-, PheGlySerGluLeuLysSerPhe—oderThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPhe-, und B'für keinen oder für einen Peptidrest steht, der 1-6 Aminosäurebausteine vom C-Terminus der natürlichen Egline umfaßt, z. B. ein solcher ausgewählt aus der Gruppe -HisVal.-HisValProHisoder-HisValProHisValGly, WTyroder His bedeutet, und rOoder 1 ist, wobei in Verbindungen der Formel XIV, worin г 0 ist, die N-terminale Aminosäure gegebenenfalls N-acetyliert ist, Salzen solcher Verbindungen und von pharmazeutischen Präparaten, die solche Verbindungen enthalten, gekennzeichnet dadurch, daß ein mit einem Expressionsplasmid, welches eine von einer Expressionskontrollsequenz regulierte, für ein Eglin kodierende DNA-Sequenz enthält, transformierter Wirt in einem flüssigen Nährmedium, welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, kultiviert wird und das Produkt aus den Wirtszellen freigesetzt und isoliert wird, oder zur Herstellung von Verbindungen der Formel XIV, worin rO ist und die N-terminale Aminosäure N-acetyliert ist, eine Verbindung der Formel XIV mit freier N-terminaler Aminogruppe acetyliert wird, und, falls gewünscht, eine erhältliche Eglin-Verbindung der Formel XIV in eine andere Eglin-Verbindung der Formel XIV überführt wird, und, falls erforderlich, ein verfahrensgemäß erhältliches Gemisch von Verbindungen der Formel XIV in die einzelnen Komponenten aufgetrennt wird, und/oder, falls gewünscht, ein erhaltenes Salz in das freie Polypeptid oder ein erhaltenes Polypeptid in ein Salz desselben überführt wird, und, falls gewünscht, eine erhältliche Verbindung der Formel XIV oder ein Salz davon zu einem pharmazeutischen Präparat verarbeitet wird.
2. Verfahren gemäß Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man Verbindungen der Formel XIV herstellt, worin B für einen Peptidrest ausgewählt aus der Gruppe LeuLysSerPhe-, SerGluLeuLysSerPhe- oder ThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPhe- und B'für den Rest-HisValProHisValGly steht, WTyr ist und rO ist, wobei in Verbindungen der Formel XIV, worin r 0 ist, die N-terminale Aminosäure gegebenenfalls N-acetyliert ist, und von Salzen solcher Verbindungen.
3. Verfahren gemäß Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man Verbindungen der Formel XIV herstellt, worin B für N-Acetyl-SerGluLeuLysSerPhe-, ThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPhe- oder N-Acetyl-ThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPhe- und B' für -HisValProHisValGly steht, WTyr ist und r 0 ist, und von Salzen solcher Verbindungen.
4. Verfahren nach Punkt !,gekennzeichnetdadurch, daß man Eglin C oder N^a-Acetyl-eglin C herstellt.
5. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Überführung einer Verbindung der Formel XIV, worin r 0 ist und die N-terminale Aminogruppe in freier Form vorliegt, in eine entsprechende Verbindung der Formel XIV, worin die N-terminale Aminosäure N-acetyliert ist, auf enzymatischem Weg erfolgt.
6. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man in einer erhältlichen Verbindung der Formel XIV, die einen N-terminalen Methionyl-Rest besitzt, den Methionyl-Rest mit Bromcyan abspaltet.
7. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man in einer erhältlichen Verbindung der Formel XIV, die eine N-terminale acetylierte Aminogruppe besitzt, den Acetylrest enzymatisch abspaltet.

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