JPH02119792A - デスルファトヒルジン変異体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野） 本発明は変更された蛋白質、その製造方法、該蛋白質を
含有する医薬組成物及び酵素の阻害のためのその使用に
関する。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕水蛭ヒ
ルド・メディシナリス（ＬｉＬ！！血ｍｅｄｉｃｉｎａ
道ｕ中に天然に存在する抗凝固成分であるヒルジン（ｈ
ｉｒｕｄｉｎ）は６５個のアミノ酸から成り３個のジス
ルフィド橋を有するポリペプチドである。このものは、
１９８４年における水蛭の唾液についての最初の研究及
びＭａｒｋｗａｒｄｔ　　［Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓ
ｃｈａｆｔｅｎ　　４２，５９７（１９５５）：Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１５４９２４　（１９７
０）の先駆的研究以来長い間知られていたが、ヒルジン
の構造がＤｏｄ　を等（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　１６５
−１８０（１９８４）　）により解明されたのは最近の
ことである。最も新しい知見によれば、ヒルジンはヒル
ジン変形体（ｖａｒｉａｎｔ）　　１　（ｌＩＶｎ　、
ヒルジン変形体２　（ｌＩＶ２）　、ヒルジンＰＡ、及
び他の１（Ｉｕ体として記載される幾つかの変形体とし
て存在する。

ヒルジンは知られている最も強）ｊなスロンビン阻害物
質であって、凝固カスケードの他の酵素には影響を与え
ない。従来の抗凝固療法において好ましい抗凝固剤であ
るヘパリンとは対照的に、ヒルジンはその作用をスロン
ビンに対して発揮し、ヘパリンのようにアンチスロンビ
ン■を介して・用するのではない。ヒルジンとスロンビ
ンとの間の相互作用は非常に高い能力をもって起こり、
この能力はフィブリノーゲンへの、血小板への又はアン
チスロンビン■へのスロンビンの結合よりも多オーダー
大である。従って、ヒルジンは低濃度においてさえ、ス
ロンヒンのすべての相互作用及びそれらの生物学的結果
を克服することができる。

さらに、ヒルジンは低い毒性を有し、非抗原性であり、
そし゛Ｃ腎臓を介しての生物学的に活性な形でのほとん
ど完全なりリアランスを示す。

最近、ヒルジン又はヒルジン変形体をコートするｃＤＮ
Ａ及び合成遺伝子がクローン化され、そして大腸菌（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｊｉ−）及びザッカロミ
セス・セレヒシェー遵剋醜吐９Ｊμ臣　刻基丈ｊ１肥）
のごとき微生物宿主において発現されている（ヨーロッ
パ特許出願Ｎｏ、１５８５６４及びＮｏ、１６８３４２
を参照のこと）。

発現生成物ばＴｙｒ６：ｌにおける硫酸モノエステル基
を欠き、そしてそれ故に「デスルファトヒルジン」（ｄ
ｅｓｕｌｐｈａｔｏｈｉｒｕｄｉｎ）　　と称されるが
、これらはチロシン残−＋、５が硫酸モノエステルとし
て存在する天然ヒルジンとおよそ同じ生物活性を示す。

ヒルジンは静脈内経路及び皮下経路の両方によりヒトに
投与されている。静脈内経路により平均除去半減期は０
．８４時間でありそして投与された量の約５０％がその
ままの形で尿に排出されることが見出された。皮下投与
の後、ヒルジンの阻害レベルは少なくとも４時間血漿中
に見出された。従って、ヒルジンはヘパリンに類似する
保持時間をもって非常に短時間イ乍用すると考えられる
。この欠点を考慮して、生体内で一層長い半減期を示し
選択的抗スロンビン活性を有するポリペプチドが強く要
求されている。対応するポリペプチドは、日常治療に使
用できれば、深部静脈及び動脈の血栓症において既存の
療法を超える利点を有するであろう。この様な抗スロン
ビン活性ポリペプチドを提供するのが本発明の目的であ
る。

低下した抗スロンビン活性を有するヒルジン化合物に対
する強い要求も存在する。抗スロンビン活性の低下は、
スロンビンがその最も強い親和性リガンド特に血小板受
容体と相互作用するのを防止するヒルジン化合物の活性
の低下をもたらす。

しかしながら、ヒルジンの抗スロンビン活性の慎重な選
択により、それはフィブリノーゲン凝固、スロンビンの
低い親和性、を阻害するその活性を保持する。この様な
ヒルジン化合物は、フィブリンにより支配される事象で
ある血栓症に対して阻害効果を有するがしかし血小板に
支配される効果である止血に対してほとんど影響を与え
ないという利点を有する。低下した抗スロンビン活性を
有するこの様なヒルジン化合物を提供するのが本発明の
更なる目的である。

〔課題を解決するだめの手段〕

驚くべきことに、Ｃ−末端に存在する酸性アミノ酸残基
（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）が親脂性アミノ酸により置き換えら
れ、そして／又はＣ−末端が他の態様で、例えばＰｒｏ
のごときプロテアーゼ耐性アミノ酸残基の付加により変
更された場合に生ずるヒルジンの疎水性の上昇が抗スロ
ンビン活性の低下及び／又は生体内での半減期の延長を
導くことが見出された。

従って、本発明は、次のアミノ酸配列（Ｉ）：Ｈ−Ｖａ
ｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−八５ｐ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ
−Ｇｌｕ−５ｅｒ−ＧｌｙＧＩｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｃ
ｙｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−八ｓ
ｎＶａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−八５ｎ−
Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−１１ｅ−ＬｅｕＧｌｙ−３ｅｒ−Ａｓ
ｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｉｎ−Ｃｙｓ
−Ｖａ１Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐ
ｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−３ｅｒＨｉｓ−Ａｓｎ
−Ｙｌ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｙ２−Ｙ３４１ｅ−
Ｐｒ。

Ｙ４−Ｙｓ−Ｙ６−Ｌｅｕ−Ｙ７−０１１（配列中、Ｙ
、はＡｓｐ又は遺伝的にコートされた中性アミノ酸の基
であり、Ｙ２及びＹ３は相互に独立にＧｌｕ、　Ａｓｎ
又は遺伝的にコードされた親脂性アミノ酸の基であり、
Ｙ４及びＹ、ば相互に独立にＧｌｕ又は遺伝的にコード
された中性アミノ酸の基であり、Ｙ６はＴｙｒ又は遺伝
的にコードされた酸性アミノ酸の基であり、そしてＹ７
はＧｉｎ又はジペプチド基Ｇｌｎ−Ｐｒｏであり；但し
、Ｙ、がＡｓｐであり、Ｙ６がＴｙｒであり、Ｙ７がＧ
ｌｎであり、Ｙ２及びＹ３がそれぞれＧｌｕであり、且
つ恭Ｙ４及びＹ５の一方がＧｌｎであって他方がＧｌｕ
である場合を除く） を有するデスルファトヒルジンの新規な変異体、及びそ
の塩を提供する。

〔具体的な説明］ 本発明の変異体は天然のデスルファトヒルジン（ｙ＋が
Δｓｐであり、Ｙ２　、Ｙ３　、Ｙ４及びＹ５がそれぞ
れＧｌｕであり、Ｙ６がＴｙｒであり、そしてＹ７がＧ
ｉｎである）から、１〜４個のアミノ酸残基、特に１個
又は２個のアミノ酸残基において異る。

遺伝的にコードされた中性アミノ酸は次のアミノ酸：Ａ
ｌａ、　Ｓｅｒ、　Ｔｈｒ、　Ｖａｌ、　Ｌｅｕ、　ｌ
ｉｅ、　Ａｓｒ＋＋　ＧｌｎＭｅｔ、　Ｐｈｅ、　Ｔｒ
ｐ及びＰｒｏであり、さらにはアミノ酸Ｇａｙである。

遺伝的にコードされた親脂性アミノ酸は次のアミノ酸：
　Ａｌａ、　Ｖａｌ、　Ｌｅｕ、　Ｉｃｅ、　Ｐｈｅ及
びＧｌｙである。

遺伝的にコードされた酸性アミノ酸はＡｓｐ及びＧｌｕ
である。

本発明は特に、Ｙ、がＡｓｐ、　Ａｌａ、　Ｌｅｕ又は
八ｓｎであり、￥２及びＹ３が相互に独立にＧｌｕ、　
Ｌｅｕ又はＡｓｎであり、Ｙ４及びＹ、が相互に独立に
Ｇ　Ｉ　ｕＧｌｎ、　Ａｓｎ又はＬｅｕであり、Ｙ６が
Ｔｙｒ、八ｓｐ又はＧｌｕであり、そしてＹ７がＧｌｎ
又はジペプチド基Ｇｉｎ−Ｐｒｏであり；但し、Ｙｌが
Ａｓｐであり、Ｙ６がＴｙｒであり、Ｙ７がＧｉｎであ
り、Ｙ２及びＹ３がそれぞれＧｌｕであり、且つ基Ｙ４
及びＹ５の一方がＧｌｎであって他方がＧｌｕである場
合を除く式（１）のデスルファトヒルジン変異体、及び
その塩に関する。

この様なデスルファトヒルジンの例として、（Ｇｉｎ”
・６２］−デスルファトヒルジン、（Ｌｅｕ’山６２］
−デスルファトヒルジン、（Ａｓｎ”・６２〕−デスル
ファトヒルジン、［Ｌｅｕ５７’　５ｆｌ−６１−６２
〕−デスルファトヒルジン、（Ａｓｎ５７・５８・６１
・６２〕−デスルファトヒルジン、（ΔＩａ５３：］−
デスルファトヒルジンデスルファトヒルジン、（Ｇｌｕ
６１）　−デスルファトヒルジン、及び（Ｐｒｏ６６）
−デスルファトヒルジンが挙げられる。

本発明の化合物は遊離の形で存在し得るが、しかしさら
にそれらの塩の形でも存在し得る。これらは幾つかのア
ミノ酸残基中に遊離アミノ基を含有するので、本発明の
化合物は酸イ」加塩として存在し得る。適当な酸イ」加
塩は特に、常用の医薬として許容される塩との薬理学的
に許容される塩である。代表的な無機酸は、ハロゲン化
水素酸（例えば塩酸）、そしてさらに硫酸、リン酸及び
ビロリン酸である。代表的な有機化合物は特にアレンス
ルボン酸（例えばヘンゼンスルホン酸又はｐトルエンス
ルボン酸）、又は低級アルカンスルホン酸（例えばメタ
ンスルホン酸）、さらにはカルボン酸、例えば酢酸、乳
酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リンゴ酸、酒石酸、
アスコルビン酸、及びクエン酸である。しかしながら、
本発明の化合物はまた幾つかのアミノ酸残基中に遊離カ
ルホキシル基を含有し、該カルボキシル基はペプチド全
体に酸性を付与するから、これらはまた、無機塩基又は
有機塩基との塩、例えばすｌ−リウム塩、カリウム塩、
カルシウム塩もしくはマグネシウム塩、又はアンモニア
もしくは薬理学的に許容される窒素含有有機塩基由来の
アンモニウム塩の形で存在するごともできる。しかしな
がら本発明の化合物は遊離カルボキシル基及び遊離アミ
ノ基を同様に含有するから、これらはまた内部塩の形で
も存在し得る。薬理学的に許容される塩が好ましい。

本発明のデスルファトヒルジン変異体の製造方法は、プ
ロモーター、シグナルペプチドをコートする第一Ｄ　Ｎ
　Ａ配列（該プロモーターは該第一ＤＮＡ配列に作用可
能に連結されている）、デスルファトヒルジン変異体を
コードする第二ＤＮＡ配列（該第一ＤＮＡ配列と該第二
Ｉ）　Ｎ　Ａ配列とは適切なリーディングフレーム中に
連結されている）、及び転写停止シグナルを含有するＤ
ＮＡ配列から成る発現カセットを含んで成るハイブリド
ヘクターにより形質転換されている微生物宿主株を培養
し、該デスルファトヒルジン変異体を単離し、そして所
望により遊離カルボキシ基及び／又はアミノ基を有する
得られたポリペプチドを塩に、又は得られた塩を遊離化
合物に転換することを含んで成る。

適当な微生物宿主株には、例えばハンルス　ズブチリス
（Ｂａｃｉｌｌｕ旦　５ｕｂｔｉｌｊｓ）の株、大腸菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）の株及びサツ
カロミセス・セレビシェ−（Ｓａｃｃｈａｒ恨践競ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉ−ａｅ）の株が含まれる。

形質転換された微生物宿主株は、当業界において知られ
ている方法を適用しながら、資化性の炭素源、窒素源及
び無機塩を含有する液体培地中で培養される。

種々の炭素源を使用することができる。好ましい炭素源
の例として資化性炭水化物、例えばグルコース、マルト
ース、マンニトール、フラクトースもしくはラクト−ス
、又は酢酸塩、例えば酢酸すトリウＪ、か挙げられ、こ
れらは単独で又は適当な混合物として使用することがで
きる。適当な窒素源には例えばアミノ酸、例えばカザミ
ノ酸、ペプチド並びに蛋白質及びその分解生成物、例え
ばトリプＩ−ン、ペプトン又は肉エキス、さらには酵母
エキス、マルトエキス、コーンスディープリ力、並びに
アンモニウム塩、例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモ
ニウム又は硝酸アンモニラＪ、が包含され、これらは単
独で又は適当な混合物として使用することができる。使
用し得る無機塩には例えばナトリウム、カリウム、マグ
ネシウム及びカルシウムの硫酸塩、塩化物、リン酸塩及
び炭酸塩が包含される。さらに、栄養培地はまた増殖促
進物質を含有することができる。増殖を促進する物質に
は例えば微量元素、例えば鉄、亜鉛、マンガン等、又は
個々のアミノ酸が包含される。

ハイブリドヘクターにより形質転換された微生物宿主細
胞は該ヘクターを喪失する傾向を有する。

この様な細胞は選択条件下で、すなわち、ハイブリドヘ
クターにコードされた遺伝子の発現が増殖のために必要
であるような条件下で増殖せしめなければならない。現
在使用されておりそして本発明のハイブリトヘクター（
後記）中に存在するほとんどの選択マーカーはアミノ酸
１合成又はプリン生合成の酵素をコードする遺伝子であ
る。これば、対応するアミノ酸又はプリン塩基を欠く合
成最少培地の使用を必要とする。しかしながら、適当な
殺生物剤に対する耐性を付与する遺伝子（例えばアミノ
−グリコシド６４１８に対する耐性を付与する遺伝子）
を同様に使用することもできる。抗生物質耐性遺伝子を
含有するヘクターにより形質転換された宿主は対応する
抗生物質を含有する複合培地中で増殖せしめ、これによ
り一層速い増殖速度及び−層高い細胞密度が達成される
。

構成的プロモーターを有するハイブリＦヘクターを含有
する宿主細胞は該プロモーターにより制御される変異体
遺伝子を、誘導を必要としないで発現する。しかしなが
ら、デスルファトヒルジン変異体遺伝子が制御されるプ
ロモーターの制御のものにある場合には、ｍＲＮＡ転写
物の最大レヘルが得られるように増殖培地の組成を適合
させなければならない。すなわち、酵母においてＰＨ０
５プロモーターを使用する場合、このプロモーターの抑
制解除のためには低濃度の無機塩を含有しなければなら
ない。

培養は常法により行われる。培養条件、例えば培地のｐ
ｌ＋、及び発酵時間は最高レヘルのデスルファトヒルジ
ンが生産されるように選択される。選択された酵母又は
大腸菌株は好ましくは好気的条件下で、液中培養により
、振とう又は撹拌しながら、約２５°Ｃ〜３５°Ｃ８好
ましくは約２８°Ｃの温度において、４〜７のｐＨにお
いて、例えば約ｐＨ５において、そして１２時間〜３日
間、好ましくはデスルファトヒルジン変異体の満足すべ
き収量が得られる期間にわたり培養される。

使用される宿主株、プロモーター及びシグナルペプチド
に関係なく、生産されたデスルファトヒルジン変異体の
ほとんどが培地又はペリプラズム空間に分泌され、わず
かな部分のみが細胞内に結合して残る。分泌される化合
物と細胞結合化合物との正確な比率は発酵の条件に依存
する。

デスルファトヒルジン変異体は常用手段により単離され
得る。例えば、最初の段階で遠心分離により培養液から
細胞を分離する。ポリエチレンアミンでの処理によるほ
とんどの非蛋白質性物質の除去及び硫酸アンモニウムで
溶液を飽和することによる蛋白質の沈澱により、前記の
得られる−に清を分泌されたデスルファトヒルジン変異
体について濃縮することができる。宿主の蛋白質は、も
し存在するとすれば、酢酸で酸性化する（例えば０．１
％、ｐＨ４〜５）ことによって沈澱ゼしめることもでき
る。ｎ−ブタノールによって酢酸上清を抽出することに
より、デスルファトヒルジン変異体の更なる濃縮を達成
することができる。他の精製段階には、例えば脱塩、り
Ｌ１７Ｉ・グラフ法、例えばイオン交換クロマトグラフ
ィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、分配クロマトグラ
フィー、ＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃ１逆相１１ＰＬｃ等が含まれ
る。蛋白質混合物の成分の分離はまた、透析により、ゲ
ル電気泳動もしくはキ中すャーーーフリー電気泳動によ
り電荷に従って、適当なセファデックスカラムにより分
子サイズに従って、例えば抗体特にモノクローナル抗体
又は適当なアフィニティークロマトグラフィー用キャリ
ヤーに連結されたスロンビンを用いるアフィニティーク
ロマ１−グラフィーにより、あるいは他の方法、特に文
献から知られる方法により、行うこともできる。

ペリプラズム空間に蓄積したデスルファトヒルジン変異
体を単離することが好ましい場合には、幾つかの補完的
精製段階が必要である。すなわち、デスルファトヒルジ
ン変異体は、該生成物の放出を可能にする細胞壁の破壊
を生しさせる手段により、すなわち細胞壁の酵素的除去
により、化学薬物、例えばチオール試薬もしくはＥＤＴ
Ａによる処理により、又は細胞壁を浸透圧ショックにか
けることにより、回収される。

精製工程において得られる両分中のデスルファトヒルジ
ン変異体活性を検出するために、抗−ヒルジン抗体又は
抗−デスルファトヒルジン抗体（例えばハイブリドーマ
細胞から得られるモノクローナル抗体）を用いる試験、
スロンヒン試薬［Ｍ、Ｕ、Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ（Ｗ集）
　、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥｎｚｙｍａｔｉｃＡｎａ
ｌｙｓｉｓ、νｏＩＩＩ　、ｐ３１４−３１６．Ｖｅｒ
ｌａｇ　Ｃｈｅｍｉｅ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ（ＦＲＧ）１
９８３　：ｌ　、又は血液凝固試験（Ｆ、Ｍａｒｋｗａ
ｒｄｔ等、Ｔｈｒｏｍｂ、ｌｌａｅｍｏｓｔ、　４７，
２２６（１９８２）　：ｌを用いることができる。

用いる方法に依存して、本発明の化合物は′Ｍ離の形で
、酸付加塩の形で、内部塩の形で、又は塩基との塩の形
で得られる。遊離化合物は既知の方法で酸付加塩又は塩
基との塩から得ることができる。医薬として許容される
酸付加塩は遊離化合物から酸との反応により、例えば上
記の塩を形成する酸との反応により、そして１発又は凍
結乾燥により得られる。内部塩はｐｌ＋を適当な中性点
に調整することにより得られる。

本発明の形質転換された微生物宿主は、◎　プロモータ
ー、シグナルペブチＩＳをコートする第一ＤＮＡ配列（
該プロモーターは該第一ＤＮＡ配列に作用可能に連結さ
れている）、デスルファトヒルジン変異体をコードする
第二ＤＮＡ配列（該第一ＤＮＡ配列と該第二ＤＮＡ配列
とは適切なリーディングフレーム中に連結されている）
、及び転写停止シグナルを含有するＤＮＡ配列から成る
発現カセットを含んで成るハイブリドーマ細胞を用意し
； ◎　該ハイブリドベクターにより微生物宿主株を形質転
換し；そして ◎　未形質転換細胞から形質転換された微生物宿主細胞
を選択する； 段階を含んで成る組換ＤＮＡ技法により調製することが
できる。

発１Ｅ）３仁ター二 本発明のハイブリドベクターは、プロモーターシグナル
ペプチドをコードする第一ＤＮＡ配列（該プロモーター
は該第一ＤＮＡ配列に作用可能に連結されている）、デ
スルファトヒルジン変異体をコートする第二ＤＮＡ配列
（該第一Ｉ）　Ｎ　Ａ配列と該第二ＤＮＡ配列とは適切
なリーディングフレーム中に連結されている）、及び転
写停止シグナルを含有するＤＮＡ配列から成る発現カ七
ソトを含んで成る。

適当なベクターの選択は、形質転換のために与えられる
微生物宿主細胞により決定される。適当な宿主は上に記
載したもの、特にザッカロミセスセレビシエーの株、並
びに細菌株、特に大腸菌の株及びハシルス・ズブチリス
の株である。

大腸菌の株でのデスルファトヒルジン変異体遺伝子の発
現のために適当なベクターは、例えば、ハタテリオファ
ージ、例えばハタテリオファーシλの誘導体、又はプラ
スミド、例えばプラスミドｃｏｌＥ及びその誘導体、例
えば９Ｍ１１９．　ｐｓＦ２１２４ｐＢＲ３１７もしく
はｐＢＲ３２２である。適当なベクターは完全なレプリ
コン及びマーカー遺伝子を含有し、このマーカー遺伝子
は発現プラスミドにより形質転換された微生物の単離及
び同定を表現型性質により可能にする。適当なマーカー
遺伝子は微生物に例えば重金属、抗生物質、例えはアン
ピシリン又はテトラザイクリン等に対する耐性を付与す
る。

大腸菌において発現カ七ソ１−を制御するために幾つか
のプロモーターを使用することができる。

特に、強力に発現される遺伝子のプロモーターが使用さ
れる。適当なプロモーターばｌａｃブロモター、ｔａｃ
プロモーター、ｔｒｐプロモータ及びｌｐｐプロモータ
ー、さらにはファージスＮプロモーター又はファージλ
ｐＬプロモータ、等である。本発明において、大腸菌で
使用するだめの好ましいプロモーターはＩｐｐブロモタ
ー又はＩａｃプロモーターである。

Ｓ、セレビシェ−中での複製及び発現のために適当なベ
クターは酵母複製起点及び酵母用選択遺伝子マーカーを
含有する。酵母複製起点、例えば染色体自律複製セグメ
ン１−（ａｒｓ）を含有するハイブリドベクターは形質
転換の後酵母細胞内に染色体外に保持され、そして有糸
分裂の間に自律的に複製する。さらに、酵母２μプラス
ミドＤＮＡに対して相同な配列を含有するハイブリドベ
クターを用いることができる。この様なハイブリドベク
ターは細胞内にすでに存在する２μプラスミド中に組換
により組み込まれ、又は自律的に複製する。酵母用のマ
ーカー遺伝子は特に、宿主に抗生物質耐性を付与する遺
伝子、又は栄養要求性酵母変異株の場合には宿主の欠陥
を補完する遺伝子である。対応する遺伝子は、例えば、
抗生物質シクロへキシミドに対する耐性を付与し、又は
栄養要求性酵母変異株において原栄養性を提供するもの
であり、例えば朋２朋、肛鉗又はＴＲｊ”ｌ遺伝子であ
る。

好ましくは、酵母ハイブリドベクターはさらに細菌宿主
、特に大腸菌用の複製起点及びマーカー遺伝子を含有し
、その結果ハイブリドベクター及びその前駆体の作製及
びクローニングを大腸菌中で行うことが可能となる。酵
母中での発現のために適当なプロモーターは例えばＡＤ
ｊｊｌ　、　　ＡＤ北ル又はＰ　１１０５遺伝子のプロ
モーター、そしてさらに解糖に関与するプロモーター、
例えばＰ　Ｇ　Ｋプロモーターである。

シグナルペプチドをコー１゛するＤＮＡ配列（「シフナ
ル配列」）は通常分泌されるポリペプチドをコードする
微生物宿主の遺伝子に由来する。

宿主微生物として大腸菌が使用される場合、ｏｍｐＡＩ
ｐｐ　、マルトース結合蛋白質、λ受容体、ロイシン結
合蛋白質又はβ−ラクタマーゼシグナル配列を選択する
ことができる。酵母において使用するために、水蛭のケ
ノムＤＮＡから得られるヒルジンシグナル配列を選択す
ることができる。酵母において使用するための一層好ま
しいシグナル配列は例えば、酵母インへルターゼ、β−
ファクタフェロモンペプチダーゼ（ＫＥＸＩ）、「キラ
ー・トキシン」及び抑制性酸性ホスファターゼ（皿頭）
の各遺伝子のシグナル及びプレプロ配列、並びにアスペ
ルギルス・アワモリ（Ａ７ｓ−ａｗａｍｏｒｉ）からの
グルコアミラーゼシグナル配列である。あるいは、使用
されるプロモーター（例えば旦脹−）に天然に連結され
ているシグナル配列（もし存在するなら）の部分とヒル
ジンシグナル配列の部分との連結により融合シグナル配
列を作製することができる。ジグプル配列とデスルファ
トヒルジン変異体のアミノ酸配列との間の正確な開裂を
可能にする組み合わせが好ましい。追加の配列、例えば
、特異的プロセシングシグナルを担持するか又は担持し
ないプロ配列又はスペーサー配列を構成物中に含有せし
めるごとにより前駆体分子の正確する選択された微生物
宿主用来の３′−フランキング配列である。適当な３′
−フランキング配列は、例えば、使用されるプロモータ
ーに天然ニリンクしている遺伝子のそれである。

本発明のハイブリドヘクターは、当業界において知られ
ている方法により、例えばプロモータシグナルペプチド
をコーｌする第一・Ｄ　Ｎ　Ａ配列（該プロモーターは
該第一ＤＮＡ配列に作用可能に連結されている）、デス
ルファトヒルジン変異体をコードする第二ＤＮＡ配列（
該第一ＤＮＡ配列と該第二ＤＮＡ配列とは適切なリーデ
ィングフレーム中に連結されている）、及び転写停止シ
グナルを含有するＩ）　Ｎ　Ａ配列から成る発現カ七ノ
ドを含んで成るハイブリトヘクター、又は該バイブＩＪ
　Ｉ’ヘクターの前記構成要素を、選択遺伝マーカー及
び選択された微生物宿主用の複製起点を含有するＤＮＡ
断片に、所定の順序に連結することを含んで成る方法に
より製造することができる。

本発明のデスルファトヒルジン変異体をコードするＤＮ
Ａは当業界において知られている方法により製造するこ
とができる。このＤＮＡの製造方法は、親デスルファト
ヒルジン遺伝子から不所望のアミノ酸残基のコードンを
含んで成るＤＮＡの部分を切除し、そしてこれを、前記
コードンが所望のアミノ酸残基をコードするデオキシリ
ボヌクレオチドトリプレノトで置き換えられているＤＮ
Ａセグメントにより置き換えることを含むか、あるいは
部位特定変異誘発により変異を行うことを含む。

デスルファトヒルジン変異体をコードするＤＮＡの調製
のため、デスルファ１〜ヒルジンＤＮＡの部分の切除は
制限酵素を用いて行うことができる。

この方法の曲折条件は、変更されるべきコードンの近傍
で適当な制限部位が利用できることである。

例えば、不所望のアミノ酸のコードンを含有する小制限
断片をエンドヌクレアーゼによる開裂によって除去する
。対応する二本鎖ＤＮＡ配列を例えば化学合成により調
製し、この場合に所望のアミノ酸をコードするトリプレ
ットを使用する。ＤＮＡ断片を残りの長い断片に適切な
方向に連結して変異体をコードする二本鎖ＤＮＡ配列を
得る。この得られた二本鎖ＤＮＡは、便宜上及び該変異
体遺伝子の取り扱を容易にするため、クローニングベク
ターへの挿入及びクローニングを可能にする適当なリン
カ−を備えたより大きなりＮＡ断片中に含まれているの
が好ましい。

本発明の好ましい態様において、デスルファトヒルジン
変異体をコードするｌ）　Ｎ　Ａの調製ば部位特定変異
誘発により行われる。この方法はインビトロ変異誘発法
であって、この方法によりクローン化Ｄ　Ｎ　Ａの領域
中の定められた部位を変えることができるＣＭ、Ｊ、Ｚ
ｏｌｌｅｒ及びＭ、Ｓｍ１ｔｈ、ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚ
ｙｍｏｌ、１００．４６８（１９８３）；Ｄ、Ｂｏｔｓ
ｔｅｉｎ及びり。

５ｈｏｒｔｌｅ、５ｃｉｅｎｃｅ、２２９．１１９３（
１９８５）を参照のこと〕。

変異誘発は、完全なデスルファトヒルジン遺伝子に対し
て、又は不所望のアミノ酸のコードンを含有する該遺伝
子の機能的部分に対して行うことができる。変異誘発の
後、変異した機能的部分をデスルファトヒルジン遺伝の
他の部分に連結して完全なデスルファトヒルジン変異体
ＤＮＡを得る。

デスルファトヒルジン遺伝子又はその機能的部分を変異
せしめる方法は、デスルファトヒルジン遺伝子又はその
部分を含んで成る単鎖ＤＮＡ又は単鎖遺伝子を、変異を
指令するミスマツチを除くほか変異されるべきバイブリ
ド遺伝子の領域に対して相補的であるオリコブオキシリ
ボヌクレオチドプライマーにハイブリダイズセしめ、こ
のハイブリダイズしたオリゴデオキシリボヌクレオチド
をプライマーとして用いて相補的Ｄ　Ｎ　Ａ　鎖の合成
を開始し、生ずる（部分的）二本鎖ＤＮＡを受容体微生
物株に形質転換し、この微生物を培養し、そして変更さ
れた（変異体）デスルファトヒルジン遺伝子を有するＤ
ＮＡを含有する形質転換体を選択することを特徴とする
。

形ｌ圭ｍ用、１住脣■土 本発明はさらに、プロモーター、シグナルペプチドをコ
ートする第一ＤＮＡ配列（該プロモーターは該第一ＤＮ
Ａ配列に作用可能に連結されている）、デスルファトヒ
ルジン変異体をコードする第二ＤＮＡ配列（該第一ＤＮ
Ａ配列と該第二ＤＮＡ配列とは適切なリーディングフレ
ーム中に連結されている）、及び転写停止シグナルを含
有するＤＮＡ配列から成る発現カセットを含んで成るノ
＼イブリトヘクターにより形質転換された微生物宿主株
；並びに該ハイブリドベクターにより微生物宿主を形質
転換することを特徴とする前記形質転換された微生物宿
主株の製造方法に関する。

微生物宿主株は前記のものである。本発明のノ＼イブリ
ドヘクターによる形質転換は例えば文献に記載されてい
る方法により、例えばＳ、セレビシェ−についてばＡ、
Ｈｉｎｎｅｎ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｉ。

ＵＳ八、□７じ５□、　１９２９　（１９７８）に記載
されているようにして、Ｂ、ズブチリスについてばＡｎ
ａｇｎｏｓ　ｔｏｐｏｕｌｏｓ等、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ、、　８Ｌ７４Ｈ１９６１）に記載されているよう
にして、そして大腸菌についてはＭ、Ｍａｎｄｅｌ等、
Ｊ、Ｍｏ１．旧０１１間、　１５９　（１９７０）に記
載されているようにして行われる。形質転換された宿主
細胞の単離は、例えば、発現プラスミド中に含まれてい
るマーカー遺伝子がそれに対して耐性をイ」与する殺生
物剤が添加された選択栄養培地から有利に行われる。例
えば、ハイブリドベクターがａｍｐ１１遺伝子を含有す
る場合、栄養培地にアンピシリンを添加する。ハイブリ
ドベクターを含有しない細胞はこの様な培地中で破壊さ
れる。

医梁■城勝 本発明に従って得られるデスルファトヒルジンの新奇な
変異体は価値ある薬理学的性質を有し、そして水蛭から
抽出されたヒルジンと同様に、予防的に又は特に治療法
に使用され得る。

本発明のデスルファトヒルジン変異体は、天然ヒルジン
と同様に、スロンビンの強力な阻害剤である。例えば、
ごれらは１０−９Ｍ〜１０−”　ＭのＫｉ値（デスルフ
ァトヒルジン変異体−スロンヒン複合体解離定数）を有
する。これらのデスルファトヒルジン変異体はスロンビ
ンに対して完全に特異的であり、そして血液凝固系の他
のプロテイナーゼと相互作用を示さない。毒性は極めて
低い。同様に、過敏反応又はアレルギー反応は観察され
ない。さらに、本発明の変異体は天然デスルファトヒル
ジンに匹敵するか又はそれより良好な生体内作用持続性
を有する。

従って、本発明の新規なデスルファトヒルジン変異体は
天然ヒルジンと同様にして、術後血栓症の予防を含む血
栓症及び血栓塞栓症の治療及び予防のため、象、性ショ
ック（例えば敗血性ショック又は多外傷性ショック）の
療法のため、消費凝血異常症の療法のため、血液透析に
おいて、血液分離において、及び体外血液循環において
使用することができる。

本発明はまた、本発明の化合物の少なくとも１種類又は
その塩を、場合によっては医薬として許容されるキャリ
ヤー及び／又は助剤と一緒に含んで成る医薬組成物に関
する。

これらの組成物は、それが例えば非経口的に、例えば静
脈内に、皮肉に、皮下にもしくは筋肉内に、又は局所的
に投与される場合、特に上記の症状において使用され得
る。

本発明はまた、ヒ１−又は動物体の予防的又は治療的処
置のため、特に前記の臨床症状に対して、特にヒト又は
動物の体内又は体外での血液の凝固を阻害するための、
本発明の新規化合物の使用及び該化合物を含有する医薬
組成物に関する。

投与量は特に、特定の投与形態及び治療又は予防の目的
に依存する。個々の投与量のサイズ及び投与方法は病気
の特定の症例の個々の判断により最もよく決定される。

この目的のために必要な関連ある血液因子の決定方法は
当業者によりよく知られている。通常、注射の場合、本
発明の化合物の療法的有効量は約０．００５〜約０．１
■／ｋｇ体重の範囲である。約０．０１〜約０．０５ｍ
ｇ／ｋｇ体重の範囲が好ましい。投与は静脈内注射、筋
肉内注射又は皮下注射により行われる。従って、単位形
の非経口投与用医薬組成物は投与形態に依存して約０．
４〜約７．５■の本発明の化合物を含有する。活性成分
に加えて、これらの医薬組成物は通常、緩衝剤、例えば
約３．５〜７のｐｌ＋を維持することが意図されるリン
酸緩衝剤、そしてさらに等張性を調整するための塩化ナ
トリウム、マンニトール又はソルビトールを含有する。

これらは凍結乾燥形でも溶解した形でもよく、溶液は有
利には抗細菌活性防腐剤、例えば０．２〜０．３％の４
−ヒドロキシ安息香酸メチルエステル又はエチルエステ
ルを含有していてもよい。

局所投与用組成物は水溶液、ローション又はゲル、油性
溶液もしくは懸濁液、又は油を含有するかもしくは乳化
した軟こうの形であることができる。水溶液の形の組成
物は例えば、本発明の活性成分又はその医薬として許容
される塩をｐＨ４〜６．５の水性緩衝液に溶解し、そし
て所望により追加の活性成分、例えば抗炎症剤及び／又
はポリマー結合剤、例えばポリビニルピロリドン、及び
／又は防腐剤を添加するごとにより得られる。活性成分
の濃度は、１０ｍ！の溶液又は］、Ｏｇのゲル当り約０
．１〜約１．５■、好ましくは０．２５〜１．０■であ
る。

局所投与のための油状投与形は、例えば、本発明の活性
成分又はその医薬として許容される塩を、油中に、場合
によっては湿潤剤、例えばステアリン酸アルミニウム及
び／又は１０未高のＨＬ　Ｂ値（「親水性−親脂性」バ
ランス）を有する界面活性剤、例えば多価アルコールの
脂肪酸モノエステル、例エバクリセリンモノエステル、
ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノステアレー
ト又はソルビタンモノオレエ−１・を添加して懸濁する
ことにより得られる。脂肪含有軟こうは例えば、本発明
の活性成分又はその塩を伸展性脂肪基剤中に、場合によ
っては１０未満のＨＬ　１３値を有するテンシト（ｔｅ
ｎｓｉｄｅ）を加えながら懸濁することにより得られる
。活性成分の濃度は約１０ｇの基剤中に約０．１〜約１
．５　ｍｇ、好ましくは０．２５〜１．０　ｍｇである
。

ヒト又は動物の体での直接医療用に意図される前記の組
成物に加えて、本発明はまたヒト又は動物の生体外での
医療的使用のための医薬組成物に関する。この様な組成
物は特に、体外での循環又は処理（例えば、体外循環又
は人工腎臓での透析）、保存又は修飾（例えば血液分離
）にかけられるべき血液への抗凝固添加剤として使用さ
れる。これらの組成物、例えばストック溶液又は単位投
与形の組成物は前記の注射用組成物の組成に類似する。

しかしながら、活性成分の量又は濃度は有利には処理さ
れるべき血液の体積に基き、さらに正確にばスロンビン
含量に基く。これに関して、本発明の活性成分（遊離形
）は約５倍重量のスロンビンを完全に不活性化し、比較
的多量でも生理的に無害であり、そして高濃度において
さえ循環血から迅速に除去され、それ故に例えば輸注の
間でも過剰投与の危険がないことを心に留めるべきであ
る。

特定の目的に依存して、適当な投与量は血液Ｐ当り約０
．０１〜約１．０　ｍｇの活性成分であるが、上限を超
えても危険はない。

本発明は特に、例に記載するデスルファトヒルジン変異
体、ハイブリドヘクター、該ハイブリトヘクターにより
形質転換された微生物宿主株、及びこれらの製造方法に
関する。

次に、図面に言及しながら本発明の種々の態様を記載す
る。

実Ｍ勿−耶 鮭　ブラー衣−主上已は囮−ｑ作製（第１図参照）等、
ＥＭＢＯ−Ｊ、　　３．２４３７（１９８４）　）を２
５ｐｌの１００ｍＭＴｒｉｓ−１１ｃ＃　　（ｐＨ７、
５）　、５０ｍ１ｌ　ＮａＣｌ！及び１００μｇ／成ゼ
ラチンに溶解し、そして制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ
ＲＩ及びＢａｍＨＩにより消化する。この溶液をＴＮＥ
に調整し、そしてフェノール／クロロホルムにより抽出
する。ＤＮＡをエタノールにより沈澱せしめる。ベクタ
ーＤＮＡ　ｐＩＮ−１１１−ｏｍｐＡ−２／ＩｊｃｏＲ
ｌ　／　ｌｌａｍｌｌ　Ｉをアガロ−ス中の電気泳動後
にゲルン容出により単洲（する。

ｂ）ブラ□入冬」」朋町阪仄痺Ｎ（２）請孔−２０鱈の
プラスミドｐＭＬ３１０　（ヨーロッパ特許出願Ｎｏ、
１６８３４２を参照のこと）を５０ｔｔｌの１００ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−ＩＬｃ７！（ｐＨ７，５）　、５０ｍＭ　
ＮａＣｌ！及び１００ｇ／ｍｆｆ１ゼラチン中で制限エ
ンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＪにより消化
する。溶液をＴＨＥに調整し、そしてフェノール／クロ
ロホルムにより抽出する。ＤＮＡをエタノールにより沈
澱せしめる。アガロース中でのゲル電気泳動の後ゲル溶
出によりＦＩ　　Ｆ２　　ＤＮＡ（ヒルジン遺伝子）を
単離する。

ｃ）　　ＭＬ３１０　　’のＦ　−Ｉｔ−ＤＮＡ　ヒ）
Ｉｙジン゛１μｇのＦ、−１ン２−ＤＮＡ（ヒルジン遺
伝子）／ＥｃｏＲＩ／Ｂａｍ１ｌｌ及び３０ｕｇのベク
ターＤＮＡ　ｐｌＮ−Ｉｌｌ−ｏｍｐＡ−２／ＩＥｃｏ
！目／Ｂａｍ１冊を５０ｕｌの１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−
１１Ｃｊ！　　（ｐＨ７、５）　、５０ｍＭ　ＮａＣ７
ｆ及び１００μｇ／ｄゼラチンニ溶解し、そしてＴＨＥ
に調整する。溶液をフェノル／クロロボルムで抽出し、
そしてＤＮＡをエタノールで沈澱せしめる。ＤＮＡ沈澱
物を５０ｍＭ　ＴｒｉｓｔｌｃＪ２　　（ｐｉ（７，８
）　、１０ｍＭ　ｈｃｆｆｉ　ｚ　、１０ｍＭ　ＤＴＴ
、０、５　ｍＭ　ＡＴＰ及び１００ｘｒ／ｆｆセラチン
の？容ｖ夜２０ｔｒｌに？容解し、そして２５ユニット
／μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）により
１５゛Ｃにて３時間処理する。こうして、ＰＩ　　ＦＺ
　　ＤＮＡ（ヒルジン遺伝子）が挿入された組換プラス
ミドｐＭ＋、３５０を形成する。

ｄ）プラスミドＪＩＭＬ３５０による　　　ＩＩＢＩＯ
Ｉ　の転換 Ｍａｎｄｅｌ等（Ｊ、Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ、　５３，１５
９（１９７０）により記載されているよ・うにして、カ
ルシウムにより処理された大腸菌１１ＢＩＯＩを調製す
る。組換プラスミドｐＭＬ３５０を含有するＣ）で得ら
れた溶液を６５°Ｃにて１０分間加熱してＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを不活性化し、そして次に３７°Ｃに冷却した。

１０μｌの得られる反応混合物を１０ｍＭ　ＭｇＣＩ！
２及び１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１ｉｃβ　（ｐＨ７，５）
中の大腸菌ＨＢＩＯＩ細胞１５０ｕｌに加えて全容量２
００Δとする。

次に、この混合物を３０分間冷却し、４２°Ｃにて２分
間加熱し、そして次に１　ｍｌの１−一培地（ハタレト
リブトン１０ｇ、＃！、バクト酵母エキス５ｇ／！、Ｎ
ａＣ１５ｇ　／　ｌ、グルコース５ｇ／！、アンピシリ
ン０．１ｇ／ｆｆ１）中で３７°Ｃにて５０分間放置す
る。

次に、この混合物を、６０μｇ　／　ｒｄのアンピシリ
ン（セルバ）を含有する５枚の寒天プレート（マツコン
キー寒天、デイフコ）上に０．２　ｍｆｌずつ撒く。

次に、この寒天プレートを３７°Ｃにて１６〜１８時間
保持する。形質転換された大腸菌ＨＢ　１０１細胞のア
ンピシリン耐性コロニー１８５個を得る。

］・ロセルロースフィルターＢ８５（Ｓｃｈｌｅｃｉｃ
ｈｅｒ及び５ｃｈｕｌｌ）に押し付げる。Ｇｒｕｎｓｔ
ｅｉｎ及び）ｌｏｇｎｅｓｓ（Ｐｒｏｃ、ＮａＬｌ、八
ｃａｄ、ｓｃｉ、１ＩｓＡ、　　７２．３９６１（１９
７９）　　）　　の方法に従ってコロニーを溶解しそし
てそれらの変性されたＤＮＡをフィルター上に固定する
。次に、フィルターのプレハイブリダイゼーションを２
０ｍ１（フィルター当り）の４　Ｘ５ＥＦ　　［３０ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ４１（ｊ！（ｐＨ８）　　、　　１５０ｍ
Ｍ　　Ｎａ（ＩＪ！　　、　１　ｍＭ　　ＥＤＴＡ　　
のン容液〕　、０、１％（ｗ／ｖ）フィコール４００（
ファルマシア）、０．５％ＳＤＳ、５（Ｊｔｒｇ／ｍｆ
ｌ変性ウシ胸腺ＤＮＡつで６４゛Ｃにて４時間行う。次
に、ニトロセルロースフィルターを２０ｍ１（フィルタ
ー当り）の５　ＸＳＩ’ｉＴ　（ｗ／ｖ）０．１％（ｗ
／ｖ）フィコール４００．０．２％ＳＤＳ及び５０　ｔ
ｔｌ　／　ｍｌ変性ウシ胸腺ＤＮＡ中で６４°Ｃにて１
６時間３２ｐ放射性標識プローブ（フィルター当り約Ｉ
Ｏ３〜１０’　Ｃｅｒｅｎｃｏｖ　ｃｐｍ）により処理
する。オリゴヌクレオチド４６／６４相補的、１１５８
．９６／６１及び１５４／６４相補的から成る混合物（
ヨーロッパ特許出願Ｎｏ、　１６８３４２を参照のこと
）をプローブとして使用する。

次に、フィルターを２　Ｘ５ＦＦ　、０．２％ＳＯ５中
で室温にて２回（最初３０分間、次に６０分間）洗浄す
る。次に、フィルターを３）１Ｍペパー（ワットマン）
の間で乾燥し、そして−８０゛Ｃにて強化スクリーン（
イルフォード）と共にＸ−綿フィルム（フジ）上に１〜
２日間置く。

得られるオートラジオダラムは５個の陽性コロニー（ク
ローン）を示し、これらは更なる処理のために使用する
ことができ、その１つをｐＭＬ３５０と命名する。

例Ｉ　ブラフ−旦ｐＢＨ１０刊月Ｙ製 プラスミドｐＭＬ３５０はマルチクローニングリンカ（
ＥｃｏＲＩ　、　１ｌｉｎｄｌｌ　、　Ｂａｍ１ｌ　１
部位）を含有するプラスミドｐｌＮ−ｍ−ｏｍｐＡ−２
に由来するため、成熟ヒルジン遺伝子の前にＡｌａ、　
ＧＩｎ＋　Ｐｈｅ、　Ｍｅｔをコードする１２個の追加
の塩基対を含有する。成熟デスルファトヒルジンを発現
せしめるため、２７ｍａｒオリゴヌクレオチドを用いる
インビトロ変異誘発によりこれらの１２塩基対をループ
アウトする。

ａ）Ｃ±声曵／］刈ヒ±７８ａ、ｍ１ｊ−１（乳、、−
１）　−（Ｄ調−製５■のプラスミドｐ　Ｍ　Ｌ　３５
０をエンドヌクレアーゼＸｂａ　Ｉ及びＢａｍ１１１に
より消化する。２個のＸｂａ　ｌＢａｍ１ｌ　Ｉ断片（
Ｓｌ）の大きい方をアガロース上での電気泳動の後ゲル
溶出により単離しそして１ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＩＩｃＪ！
　　（ｐＨ７、５）　、０．１　ｍＭ　ＥＤＴＡに？容
解する。

ｂ　）　ＭＬ３５０　　Ｐｖｕ　Ｉ　（Ｓ　Ｈ）の５屑
のプラスミドｐ　Ｍ　Ｌ　３５０をエンドヌクレアーゼ
Ｐｖｕ　Ｉにより消化する。次に、線状化されたＤＮＡ
ｐＭＬ３５０／　Ｉ）νｕｌを３ユニツトの腸アルカリ
ホスファターセ（ヘーリンガー）により３７°Ｃにて３
０分間消化する。この溶液を６５°Ｃにて６０分間加熱
することにより酵素を不活性化する。線状ｐＭ１．．３
５０／　Ｐｖｕｌ　（Ｓ　Ｉ［）ＤＮＡをアガロース上
での電気泳動の後ゲル溶出により単離し、そして１　ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−ｌｉＣ７！　　（ｐＨ７、５）　、０．
１ｍＭ　ＥＤＴＡに？容解する。

Ｃ）オリゴヌクレオチド　２７ｍｅｒ）　Ｉ　２７のヨ
ーロッパ特許出願Ｎｏ、　１６８３４２に記載されてい
る方法と同様にして、次のＤＮＡ断片（■２７と称する
）： ５　　’　　−ＧＴＡ　　Ｇ（１，Ｇ　　ＣＡＧ　　Ｇ
ＣＣＧＴＴ　　ＧＴＴ　　ＴＡＣＡＣＣＧＡＣ−３’＋
２７ を合成する。

５′−末端のリン酸化を、Ｃｒ　−”Ｐ　］−ＡＴＰ及
び１゛４ボリヌクレオチドキナーセ（ヘーリンガー）を
用いて、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ　（Ｔ、Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ等１ｉｄ）　、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒ
ｂｏｒＬａｂ、　（１９８２）、１２５頁に記載されて
いるようにして行った。

ｄ）ブ」じ（え士□ｐＢ壮叫ｑ作製 ０．３鱈ずつの５ＩＤＮＡ及びＳＩＩ　ＤＮＡを４０ｐ
ｍｏｌのリン酸化ＤＮＡ断片１２７と、２７ｔｄの１　
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１Ｇ７！（ｐＨ７，５）　、０．１
　ｍＭ　ＥＤＴＡ中で混合する。この混合物に３μｌの
ＩＯＸポリメラーゼ−リガーゼ緩衝液（Ｌ　Ｍ　　Ｎａ
Ｃ１１！　　、６５ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−Ｉｆ（Ｊ！　　
（ｐＨ７，５）　　、８０ｍＭＭｇＣｊ２２及び］、Ｏ
ｍＭ　　β−メルカプトエタノール）を加える。この混
合物を沸騰水浴中で３分間加熱してＤＮＡ断片を変性す
る。次に、この混合物を徐々に冷却しく約１°Ｃ／分）
で３０°Ｃとし、そしてこの温度で３０分間インキユヘ
ートする。さらに、この混合物を４°Ｃにて３０分間イ
ンキユヘートしそして次に水中で１０分間インキユヘー
トする。

４種類のデオキシリホヌクレオチドホスフェト（各７．
５　ｍＭ）　■２ｕ１．６　ｐｌの１０ｍＭ　ＡＴＰ、
６　μｉのＴ４ＤＮΔリガーゼ（２，５Ｕ　／　ｔｉｔ
　）及び１．２　ＩＩｌのＫｌｅｎｏｗＤＮ八ポリメラ
ーゼへヘーリンガー、５Ｕ／μｌ）を加え、そしてこの
ＤＮＡ混合物（合計容量５５ＩＪ１）を１２．５°Ｃに
て１６時間インギュヘートする。

このＤＮＡ混合物を２ユニソＩ〜のエンドヌクレアーゼ
ＥｃｏＲＩにより３７°Ｃにて１時間消化することによ
り未変化の出発プラスミドｐＭＬ３５０を破壊する。

ごの方法によりプラスミドｐＢＨ１０９が形成される。

プラスミドｐＢＩ＋１０９は、ｏｍｐＡ−２シグナル配
列に作用可能に連結されたＩａｃプロモーター／オペレ
ーター及びｌｐｐプロモーター並びに該シグナル配列と
フレームを合わせて連結された成熟デスルファトヒルジ
ンをコードする遺伝子を含有する。

ｅ）プラスミド１１８１０９による　　　ＨＢＩＯＩの
Ｕ カルシウム処理された大腸菌ＨＢＩＯＩ細胞を用いる形
質転換を例１、ｄ）に記載したようにして行う。使用し
た合計反応混合物は５５μｌである。

ｆ）プラスミド　ＢＩ＋１０９を１　するコロニーのス
クリーニング １００個の形質転換されたコロニーを培養し、各コロニ
ーからプラスミＦＤＮＡを調製しそしてＥｃｏＲｌによ
り消化する。ＥｃｏＲＩにより消化されないすべてのプ
ラスミＦＤＮＡは、ＥｃｏＲ１部位を欠く、可能性ある
プラスミＦ’ｐＢｌ＋１０９である。２個の同一のコロ
ニーが同定された。これらの内の１つを選択し、そして
ｐＢ１１１０９と称する。

ｏｍｐＡ−２リ一ダー配列に続＜Ｆ＋−Ｆｚ　　ＤＮＡ
の正しい配列が配列分析により確認される。

例−叛 ＭＬ３ｍ　　１９ ヒルジン いてのヒルジ 変異 変異したコ　５’−ＴＴＣＧＡＡ　　ＧＡＡ　　ＡＴＣ
ＣＣＧ　　ＣＡＡ　　ＣＡＡ　　ＴＡＣＣＴＧ　　ＣＡ
Ｇ　　３’Ｆ鎖Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｐｒ
ｏ　Ｇｌｎ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ変異原プ
ライマーはアプライド・ハイオシステムス（モデル３８
０Ｂ）合成機においてホスホルアミダイト法［Ｍ」、Ｇ
ａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｅｎｚ
ｙｍａｔｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｆ
ｒａｇｍｅｎｔｓ（Ｉｌ、Ｇ、Ｇａ５５ｅｎ及び八。

Ｌａｎｇ編）ＶｅｒｌａｇＣｈｅｍｉｅ、Ｗｃｉｎｈｅ
ｉｍ、西独〕を用いて合成する。

５パのＭ１３ｍｐ１９二木鎖ＤＮＡ二本ｄｓ−ＤＮＡ；
　０．１　ｐｇ／　ｍ；Ｂ　ｌ？　Ｌ　）に２ＩのＲｅ
ａｃｔ２　（５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆｆ　　（ｐ
Ｈ８，０）、１００ｍＭ　ＭｇＣｆｆｚ、５００ｍＭ　
Ｎａ１ｌ！　）　（ＢＲＬ）　、１．　ｔｔｌのＸｂａ
ｌ　　（ＩＯＵ／μｌ）　、０．５ｍのＢａｍＨＩ　　
（１０Ｕ　／　ｕｌ　）、及び１２ハの水を加える。３
７°Ｃにて１．５時間のインキュベーソヨンの後、０．
５　ｐｌのＢａｍ１ｌ　Ｉ　、　２．５　ｕｌのＲｅａ
ｃｔ３　［：　５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１ｃｆ！、（
ｐＨ８，Ｏ）　、１００ｍＭＭｇＣｆｚ　、１０００ｍ
Ｍ　ＮａＣｅ　）　（ＢＲＬ）　、及び２　ｕｌの水を
加え、そして３７°Ｃにて１時間インキュヘーションを
続ける。容量を水で１００μｌにする。ｄｓ−ＤＮＡを
フェノール抽出及びエタノール沈澱により単離し、そし
て３０ｕｌのＴＥ緩衝液（１０＋＋＋）Ｉ　Ｔｒｉｓ−
１１ｃｇ、１ｍＭＥＤＴＡ、　ｐＨ８，０）に？容量す
る。

Ｂ、旦Ｎへ久且入 ５鴻のプラスミドｐＢＩ１１０９を前記のようにしてＸ
ｂａ　Ｉ及びＢａｍ１ｌ　Ｉにより切断し、そして消化
物を１５０■にて３時間３．５％ポリアクリルアミドゲ
ル及びＩＸＴＢＥ緩衝液（１０Ｘ　ＴＢＥ緩衝液＝１ｐ
当り１０８ｇ　Ｔｒｉｓ　、５５ｇ硼酸、９．３　ｇ　
ＥＤＴＡ　　・２＋１２０）を用いて電気泳動する。ヒ
ルジン遺伝子（２５０ｂｐ）を含有するＸｂａ　Ｉ　−
１１ａｍＨＩ断片を、１０〃の臭化エチジウム溶液（水
中１０■／　ｍｌ　）を含有する４　００　ｍｌのＩＸ
ＴＢＥ緩衝液にゲル浸漬した後、ＵＶ光のもとて可視化
する。制限断片を含有するゲル部分をゲルから切り出し
、そして５００μｌの０．５　ＸＴＢＥと共に透析ハン
グに入れ、そして移行緩衝液として０、５　ＸＴＢＥを
用いてＢＩＯ−Ｒ２Ｏミニゲル電気泳動装置において１
７０■で３０分間ＤＮＡを電気泳動する。

ＤＮＡを、０．５　ＸＴＢＨにより平衡化されたエルチ
ップ−ｄカラム（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕ
ｌｌ）上に負荷する。カラムを２　ｍｌの０．５　ＸＴ
ＢＥで洗浄し、そしてＤＮＡを０．５　ＸＴＢＥ（１ｍ
１）中Ｉ　Ｍ　ＮａＣｆｆにより？容量する。ＤＮＡを
エタノールで沈澱セしめそして１０　ｐｉのＴＥ緩衝液
に再溶解する。

５　ｐｉのＸｂａ　Ｉ　−Ｂａｍｌｌ　Ｉヒルジン挿入
部、２　ｐｉのＸｂａ　Ｉ　　Ｂａｍ１ｌ　Ｉ切断旧３
ｍｐｌ、９．１　ｔｔｌの１０×リガゼ緩衝液［：５０
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１−１（Ｊ！　　（ｐＨ７，５）　、
１０ｍＭＭｇＣ４２２、ｌｏｍＭジチオスレイトール］
、１　ｔｔｌの八ＴＰ、及び１．５μ！のＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ（ＢＲＬ　：　Ｉ　Ｕ／μｌ）を混合し、そして
１４°Ｃにて一夜インキュヘーＩ〜する。５μｌの連結
混合物を用いて、Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇ（Ｍｅｔｈｏｄｓ
　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、■Ｌ、２ｌ−７８（１
９８３））の方法に従って大腸菌ＪＭＩＯＩを形質転換
する。１２個の透明なプラークを拾い、そして各プラー
クからＪ、Ｍｅｓｓｉｎｇ（前掲）により記載されてい
るようにして単鎖ＤＮＡ（ｓｓ−ＤＮＡ）を８周製する
。旧３ｍｐ１９　／ヒルレジンと命名されたＤＮＡを５
０μＦのＴ　Ｅ　緩衝液に再溶解する（０．１〜０．５
）！ｇ／μＦ）。

２００ｐｍｏ　Ｉ　（２３ｐｉ　）の変異原プライマー
１　（前記を参照のこと）を、１０×キナーゼ緩衝液（
Ｉ　Ｍ　ＴｒｉｓＩＩＣ４’　、　０．１　Ｍ　ＭｇＣ
，ｉ！　２．０．１　Ｍシヂオスレイト一ル、ｐ）１８
．３）、３μｆの１０ｍＭ　ＡＴＰ及び１μＦのＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼ（ＢＲＩ７．１０Ｕ／μｍ）の
添加によりリン酸化する。３７°Ｃにて１時間のインキ
ュベーションの後、６５°Ｃにて１０分間加熱すること
により反応を停止する。

６７ｚ／（０，５Ｍｇ）の単鎖Ｍ１３ｍｐ１９　／ヒル
ジン（セクタ９７＋−Ｃ）を３　μｌ（２０μｍｏｌ）
のリン酸化変異原オリゴデオキシリボヌクレオチド（６
，６Ｍｍｏｌ／ｐｌ）及び１　／ＩＩの緩衝液△［０，
２Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　　（ｐＨ７，５）　、０．　
Ｉ　Ｍ　ＭｇＣｆｆｚ　、、　０．５Ｍ　ＮａＣｌ！、
　０．０ｌＭＤＴＴ　）と共に７０°Ｃにて５分間イン
キユヘートし、そして３０分間にわたり徐々に室温に冷
却する。

Ｃ９列Ｊ４二］Ｌ侍−反応 前記のアニールされた混合物に、１μＦの緩衝液Ｂ　（
０，２Ｍ　Ｔｒｉｓ−１１（Ｊ！　　（ｐＨ７，５）　
、ｏ、　Ｉ　Ｍ　ＭｇＣｆｆ２．０、ＯＩＭ　ＤＴＴ）
　、ｉ　ｐｌの１０ｍＭ　ＡＴＩ’、４μ！の２　ｍＭ
　ｄＮＴＰ混合物、５μｍ０’）Ｔ４　ＤＮＡポリメラ
ーゼ（ヘーリンガ、ＩＵ／μｌ）、及び５μ！のＴ４　
ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ、１１Ｊ／μｌ）を加える。こ
の混合物を１６°Ｃにて３時間インキユヘートする。６
５°Ｃにて１０分間インキュヘーＩ・するごとにより反
応を停止する。

Ｄ、　　　　　　　　び　　　　　　ＤＮＡの連結混合
物を無菌水により】：２０に稀釈し、その稀釈物］、　
ｕｌ及び５μ！、並びに未稀釈混合物１μｌを用いてコ
ンピテント大腸菌ＢＭＨ７１−８１，ｍｕｔ　Ｓ細胞［
Ｂ、Ｋｒａｍｅｒ、Ｗ、Ｋｒａｍｅｒ及びＨ，−Ｊ　Ｆ
ｒ１ｔｚ、Ｃｅ１ｌ　３８８７９−８８７（１９８４）
　）を形質転換する。細胞を、“Ｍ１３ｃ、ｌｏｎｉｎ
ｇ　ａｎｄ　５ｅｑｕｅｎｃｉＢ　ｔｉａｎｄｂｏｏｋ
″（アメルシャムより発行）に記載されているようにし
てプレートする。１２個の無色のプラークを拾い、そし
てセクションＩ−Ｃに記載されているようにして５ＳＤ
Ｎ八を調製する。

Ｅ、　　　　についての　　ＤＮＡのスクリーニング 変異した単鎖ＤＮＡをスクリーニングするため、１２個
の５ｓ−ＩＩＮＡサンプルのそれぞれをジデオキシヌク
レオチ［・チエインターミネーション法ＣＦ。

Ｓａｎｇｅｒ、Ｓ、Ｎ１ｃｋｌｅｒ及びＡ、Ｒ，Ｃｏｕ
ｌｓｏｎ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

八ｃａｄ、ｓｃｉ、１ＪｓＡ　　７４．５４６３−５４
６７（１９７７）　）により配列決定した。まず、予想
される変異した塩基に相補的なジデオキシヌクレオチド
のみを反応に用いる。

次に、幾つかの陽性変異体からの５ｓ−ＤＮＡを、Ｔａ
ｂｏｒ及びＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ　［Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　８４４７６７−４７
７１（１９８７）　）の方法に従ってＴ７　ＤＮＡポリ
メラーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、　ＵＳＢ）を用いて配
列決定して変異体の十分なりＮＡ配列を確立する。組換
ヒルジンの６１位及び６２位におけるＧｌｕ→Ｇｌｎ変
異をコードする予想通りの塩基変化がＤＮＡ配列中に観
察される。予想通りの配列を有するファージＤＮＡをＭ
１３ｍｐ１９　／ヒルジンＥ６１．６２０と命名する。

コンピテント大腸菌ＪＭＩＯＩ細胞を１０〜２０ｎｇの
単鎖ヒルジンＥ６１’、　６２Ｑ変異体ＤＮＡにより形
質転換し、そして”Ｍ１３　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　
５ｅｑｕｅｎｃｉＢ　１ｌａｎｄｂｏｏｋ″（アメルシ
ャムにより発行）に記載されているようにしてｄｓ−Ｄ
ＮＡを調製する。１００ｍｆｆ１の培養物から４０〜５
０μｇのｄｓ−ＤＮＡが得られる。

Ｇ、　　　　ヒルジンＸｂａ　Ｉ　−Ｂａｍｔｌ　Ｉ　
　　　の固［ ２５μｇのｄｓ−ＤＮＡから変異したヒルジンＸｂａ　
ＩＢａｍＨＩ挿入部を切り出し、そしてセクションＩＢ
に記載されているようにして精製する。ＤＮＡを２０μ
ｌの無菌水に溶解する。

日　のＸｂａ　Ｉ、１　ｕｌのＢａｍＨＩ　　（１０ユ
−ッｈ）　、１μｌのＥｃｏＲＩ　　（１０ユニツト）
及び３７μ！の水（合計容量５０μりを加えそして３７
°Ｃにて３時間インキユヘートするごとにより約１．５
　ｐｇのｐＩＮ−ＴＩＩ−ｏｍｐＡ−２プラスミｌの消
化物を調製する。１ｍ（１０ユニツト）のＢａｍＨＩ、
１ｍ（１０ユニット）　の１ＥｃｏＲＩ、５　ｐｉのＲ
ｅａｃｔ　３　（ＢＲＬ）及び１２ｔｔｌの水を添加し
、そして３７°Ｃにて１時間インキュー＼−ジョンを続
ける。

９　ｕｌのヒルジンＥ６１．６２０　Ｘｂａ　Ｔ　−１
１ａｍｌｌ　Ｉ挿入部１）　Ｎ　Ａ、２　ｕｌのＸｂａ
　Ｉ　−１１ａｍｌｌ　Ｉ切断ｐｌＮ−ＩＩＩ　−ｏｍ
ｐＡ−２ベクターＤＮＡ、３μｌの１０×連結緩衝液（
ＢＲＬ）及び１μ１（ＩＵ／μｍ）　Ｔ４　ＤＮＡリガ
ーゼ（ＢＲＬ）を混合し、そして１４°Ｃにて１６〜２
０時間インキユヘートする。

■、　　　　、団１０１での　　　　に１ｎ６１−６２
　−デスルファし具四ター乙９発現 Ａ、入ＪＭＩＯＩへのトランスフェクシヨン５　ｐｉの
連結混合物を用いて、Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇ（前掲）の方
法に従って、０．３　ｍｌの大腸菌ＪＭＩＯＩコンピテ
ント細胞を形質転換する。３　ｍｌの２ｘＹＴ／アンピ
シリン（５０■アンピシリン／　ｍｆｌ　２　Ｘ　Ｙ　
Ｔ　）をザンプルに加え、そして細胞を室温にて１時間
増殖せしめる。次に、培養物のサンプル１滅を取り、そ
してＬＢ／アンピシリン（５０μｇアンピシリン／ｍｆ
ｌＬＢ−寒天）プレートに性別し、そして３７°Ｃにて
一夜増殖せしめる。

ＬＢ／アンピシリンプレートから１０個の細菌コロニー
を拾い、そして５　ｍｌのり、　Ｂ　／アンピシリン（
５０ｐｇアンピシリン／　ｍｌ　Ｉ−Ｂ　）中で３７°
Ｃにて５時間別々に増殖せしめる。各培養チプ、−ブか
ら１　ｍｌの１ナンプルを採取し、そして遠心分離（３
０００Ｘｇにて５分間）により細胞を回収する。細胞の
各すンプルを１００μｆの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１Ｃ
！　（ｐＨ８，１）によりＯ′Ｃにて３０分間処理する
ことにより浸透圧ショックをかけて、細菌のペリプラズ
ム空間中の物質を放出せしめる。前記のようにして遠心
分離により細胞を回収し、そしてセクションＶ−Ｂに記
載したようにして上清のヒルジン活性を試験する。

最も高い阻害活性を与えるザンプルを回分培養のために
選択する。

最も活性なザンプルからの残りの細胞（４ｍｊりを１ｒ
のＬＢ／アンピシリン（５０Ｉ１ｇアンピシリン／　ｍ
ｌ　Ｌ　Ｂ　）に接種する。培養物を３７°Ｃにて一夜
増殖せしめ、そして遠心分離（３０００Ｘｇ、１５分間
）により細胞を回収する。細胞を５０ｍｊ！の１０ｍＭ
　ＴｒｉｓＨＣｌｆ　　（ｐＨ８，１）中ニｏ　’ｃに
て１時間再懸濁することにより該細胞に浸透圧ショック
を与える。６０００×ｇにて１０分間の遠心分離により
ペリプラズム画分から細胞を除去する。

Ｄ、　　　Ｇｌｎ””　　−−゛スルフｙトヒルジ７（
Ｄ製 ペリプラズム画分のｐｉｔを０．１　Ｍ　　ＨＣＪ！に
より６．５に言周整し、そして０．４５ｎフィルター（
Ｎａｌｇｅｎ）を通して濾過する。蛋白質を、５０ｍＭ
　ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ＩＣ／（ｐＨ６，５）緩衝液によ
り平衡化されたＭｏｎｏ−ＱカラムＦＰＬＣ系（Ｆａｓ
ｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏ
ｇｒａｐｈｙ　。

ファルマシアーＬ　Ｋ　Ｂ　）に負荷する。デスルファ
トヒルジン変異体を、カラムから、ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−
１１Ｃｆｆ（ｐｉｔ　６．５　）中０〜３００ｍＭ　　
ＮａＣｊ！の４５分間にわたる直線塩グラジェントによ
り溶出する。カラム溶出液の０．８　ｍＱ、ずつの両分
を集め、そしてセクションＩｎ−Ｂに記載したようにし
てヒルジン活性を試験する。デスルファトヒルジン変異
体を含有する画分をプールし、上記のようにして濾過し
、そして水中０．０９％（ｖ／ν）ｌ・リフルオロ酢酸
により平衡化されたＢｒｏｉｖ、ｎ１ｅｅ　Ｌａｂｓ　
Ｃ８逆＋旧Ｉ　Ｐ　＋、、Ｃカラムを用いるミリボアー
−ウォーターズＩＩＰＬｃ系でクロマトグラフ処理する
。水中０．０９％（ν／ｖ）ｔ・リフルオロ酢酸中７〜
２８％（ｖ／ｖ）アセトニトリルの直線グラシエントに
よりカラムからヒルジン変異体を溶出する。

約９８％以上の純度を存する（Ｇｌｎ”・６２］−デス
ルファトヒルジンが２８分における単一ピークとして溶
出する。

Ｅ、３政」÷ＩＪでヌ不１引ユ当（ｐす１与］牧イ引−
キナ−精製された［ＧＩｎ”’　６２］−デスルファト
ヒルジンを、そのアミノ酸組成、Ｎ−末端配列、及びペ
プチドマツピングにより特徴付けた。

２〜５鱈の蛋白質をガラス管中で６ＮＩＩＣＪ！の蒸気
中１１０°Ｃにて加水分解する（１７．ｌ、１１６ｎｒ
ｉｋｓｏｎ、及びＳ、Ｃ，Ｍｅｒｅｄｉｔｈ、Ａｎａｌ
、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１３６　＋６５−７４（１９８４）
　）。アミノ酸を真空乾燥し、フェニルイソチオシアネ
ートにより誘導体にし、そして逆相カラム上で分離する
（Ａ、Ｂ、Ｂｉｄｌｉｎｇｍｅｙｅｒ、Ｓ、八、Ｃｏｈ
ｅｎ及びＴ、Ｌ、Ｔａｒｕｉｎ、Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔｏ
ｇｒａｐｈｙ、３３６　＋９３−１０４（１９８４）　
）。分子量６８８９　Ｄを用いてアミノ酸組成を計算す
る。

約５０ｐｍｏ１の［：ＧＩｎｂ１６２）−デスルファト
ヒルジンを八ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４
７０八気相シーケンサ−ＣＭ、讐、１Ｉｕｎｋａｐｉｌ
ｌｅｒ及びり、ＩＥ、ＩＩｏｏｄ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ
ｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　９１．４８６−４９４（１
９８３））を用いて５ザイクルの自動化された工１マン
分解にかけてＮ−末端アミノ酸配列を確立する。生ずる
フェニルチオヒダントインアミノ酸を、１八ｐｐｌｉｅ
ｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓタイプ１２０オンライン分析
機を用いて、逆相ＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃ系（Ｒ，Ｍ、Ｉｌｅ
ｗｉｃｋ、Ｍ、Ｗ、１ｌｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ、Ｌ、Ｅ
、１Ｉｏｏｄ及び匈Ｊ、Ｄｒｅｙｅｒ、Ｊ、Ｂｉｏ１．
Ｃｈｅｍ、　２５６．７９９０−７９９７　（１９８１
）　’１上で分離する。

［ＧＩｎｂｌ”Ｉ″〕−デスルファトヒルジンのペプチ
ドマツプを得るため、５０μｇの蛋白質を真空乾燥し、
そして３７゛Ｃで１時間、過蟻酸で処理する（Ｃ，１１
，Ｗ。

Ｈｉｒｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ　　ｎ、１９７−１９９（１９６７）’］。

この反応混合物に４５μｌの冷水を加え、凍結し、そし
て真空乾燥する（２回）。酸化されたヒルジン変異体を
５０ｐｌの５０ｍＭ　ＮＨ４１１ＣＯ３に溶解し、そし
て１鱈のサーモライシン（ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ）　
（ヘーリンガー）により３７゛Ｃにて４時間消化する。

分画に先立って、この消化物を真空乾燥し、そして水中
０．１％トリフルオロ酢酸（ν／ｖ）に熔解する。水中
０．１％Ｉ・リフルオロ酢酸により平衡化されたＶｙｄ
ａｃ　Ｃ１８カラムを用いて逆相ＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃによ
りペプチドを精製する。

１ｍｆｌ／分の流速で９０分間にわたる０〜２８％アセ
トニトリルの直線グラジェントによりペプチドを溶出す
る。

変異を含有するペプチドのアミノ酸配列を前記のように
して決定し、アミノ酸置換Ｇｌｕ６］、　ＧＩｕ６２−
＋Ｇ］ｎ６１．　Ｇ１ｎ６２が確認された。

れていることがアミノ酸組成及びＮ−末端配列分析（例
３；セクションＥ）により確認され、その阻害性が決定
される（例１４）。この変異体を［Ｌｅｕ”・′・２〕
−デスルファトヒルジンと称する。

１１５、　　ヒルジンの　　Ｇｌｕ６１，６２の八５ｎ
６１　、６２への異 変異原プライマー２と例３（セクションＩ及び■）に記
載した旧３ｍｐ１９　／ヒルジンＥ６１．６２０を用い
て部位特定変異誘発を行う。変異体蛋白質をＥ。

コリ中で発現せしめそして例３（セクション■）に記載
したようにして精製する。この変異体蛋白質においてＧ
Ｉｎ６１．６２がＬｅｕ６１，６２により置き換えら変
異原プライマー３を用いて例３及び４に記載した方法を
反復し、ＧＩｕ６１，６２がΔｓｎ６］　、　６２に置
き換えられた目的の変異体蛋白質を得、そして特徴付け
る。この変異体を（Ａｓｎ”・６２〕−デスルファトヒ
ルジンと称する。

併進　ヒルジンの ＧＩｕ５７，５８．６］、６２のＬｅｕ５７５８した方
法を反復し、Ｇ１ｕ５７，５８，６１．６２が八５ｎ５
７５８６Ｌ６２により置き換えられた目的の変異体蛋白
質を得、そして特徴付ける。この変異体蛋白質を〔八５
ｎ５７”Ｓｌ＋＋６１°６２〕−デスルファトヒルジン
する。

変異原プライマー４を用いて例３及び４に記載した方法
を反復し、Ｇｌｕ５７，５８，６１．６２がＬｅｕ５７
，５８６１、６２に置き換えられた目的の変異体蛋白質
を得、そして特徴付ける。この変異体を（Ｌｅｕ５７”
５８・６１６２］−デスルファトヒルジンと称する。

変異したコ５’　ＴＣＴ　ＣＡＣ　ＡＡＣ　ｊ四ＧＧＴ
　ＧＡＣ　ＴＴＣ　ＧＡＡード鎖　　　　　　　Ｓｅｒ
　ｌｌｉｓ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ
　Ｇｌｕ変異原プライマー６を用いて例３及び４に記載
した方法を反復しく，　Ａｓｐ５３がＡＩａ５３により
置き換えられた変異原蛋白質を得、そして特徴付ける。

この変異体を（Ａｌａ”　）−デスルファトヒルジンと
称する。

３′ ７ｙｒ６３のコードンＴＡＣがＡｓｐをコート′するＧ
ＡＣ又はＧｌｕをコードするＧＡＡに置き換えられてい
るオリボヌクレオチドリンカーをコード配列に挿入する
ことにより、デスルファトヒルジンのアミノ酸残基Ｔｙ
ｒ６３のΔｓｐ又はＧｌｕへの変異を行う。得られるポ
リペプチドをそれぞれ（Ａｓｐａｉ　）−デスルファト
ヒルジン及び（Ｇｌｕ６３）−デスルファトヒルジンと
称する。

酵母発現プラスミドｐＪＤＢ２０７　／ＧＡＰＦＬ−１
１１Ｒ（第２図を参照のこと；ヨーロッパ特許出願Ｎｏ
．２　２　５　６　３　３　）を制限エンドヌクレアー
ゼＳａｌｌ及び［ｃｏＲ　Ｉにより消化する。４７８ｂ
ｐのＳａｌ　Ｉ　−ｎｃｏＲ　Ｔ断片を、ＴＢＥ緩衝液
（９０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−塩基、９０ｍＭ硼酸、２．５ｍ
Ｍ　ＥＤＴＡ　、　ｐＨ１８．　３　）中０．　８％分
取用アガロースゲル上で分離する。臭化エチジウムによ
り染色された断片をゲルから単離する。ＤＮＡを０．２
ＸＴＢＥ緩衝液中で１００ｍＡにて４５分間電気溶出し
、そしてＤＥ５２　（ワットマン）イオン交換クロマト
グラフィーにより精製する。ＤＮＡをＤＥ５２カラムか
ら高塩緩衝液日．　５　Ｍ　ＮａｌＪ　、ｌＯｍＭ　Ｔ
ｒｉｓ−ＩＩＣＡ　　（ｐＨ８．　０　）、１ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡ　）により溶出し、エタノールで沈澱せしめ、そ
して０．　１　ｐｍｏｌ／Δの濃度で水に再溶解する。

この４７８ｂｐのＳａｌ　Ｉ　−ＥｃｏＲ　Ｉ断片は、
ＢｇｌＴＩＥｃｏＲ　Ｉ　　ＧＡＰＦＬプロモーター断
片に融合したｐＢＲ３２２のＳａｌ　Ｉ　−Ｂａｍｌｌ
　Ｉ配列を含有する。

プラスミドｐＪＤＢ２０７　／ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲをＢ
ａｍＨＩ及びＳａｌ　Ｉで消化する。６．７ｋｂの大ヘ
クター断片を前記のようにして単離する。７４０ｂｐの
小断片も単離する。このものは、デスルファトヒルジン
のコード配列にフレムを合わせて融合したＰＩ＋０５シ
グナル配列のほかに４７８ｂｐ　Ｓａｌ　Ｉ　−Ｅｃｏ
Ｒ　Ｉ断片（上記）の配列を含存する。この７４０ｂｐ
断片をＡｓｕ　ＩＩで消化する。ＤＮＡをフェノール／
クロロボルムで抽出し、エタノールで沈澱せしめ、そし
て水に再溶解する。

次の式： ％式％ で表わされる合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ４０Ｉ
Ｉｌの６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＩＣ＋２　　（ｐＨ７，５
）　、１０ｍＭ　ＭｇＣｆｆ　２．５ｍＭＤＴＴ、０．
５　ｍＭ　ＡＴＰ及び２７ＵのＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼ（ヘーリンガー）中で３７°Ｃにて４５分間キナ
ーゼ処理する。オリゴヌクレオチド（１）及び（２）の
反応混合物を一緒にし、同様にオリゴヌクレオチド（３
）及び（４）の反応混合物を一緒にし、両温合物を７５
°Ｃにて１０分間加熱し、そして室温に放冷する。アニ
ールされたオリゴヌクレオチドリンカー（１＋２）及び
（３＋４　）を２０°Ｃにて貯蔵する。

０．８５ｇ　（３，８ｐｍｏｌｅ）のＡｓｕ　ＩＩ消化
ＤＮＡを１５°Ｃにて１６時間、キナーゼ処理されそし
てアニールされたオリゴヌクレオチドリンカー１００倍
量と共に１５０μＺの６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１ｃ２　
　（ｐＨ７，５）　、１０ｍＭ　ＭｇＣｆｆ１　ｚ、５
ｍＭＤＴＴ、３．５　ｍＭ　ＡＴＰ及び１２００ＵのＴ
４　ＤＮＡリガゼ（バイオラプス）中でインキュベート
する。８５°Ｃにて１０分間Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを不
活性化した後、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、３００ｍＭ酢酸す
ｌ−リウム　（ｐ＋＋　６．０　）及び０．５４容量の
イソプロパツールの存在下でＤＮＡを沈澱せしめること
により過剰のリンカ−を除去する。ＤＮＡをＥｃｏＲＩ
及びＢａｍＨＩにより消化する。

生ずる断片をＴＢＥ緩衝緩衝液中２収 エタノール沈澱によりゲルから回収する。このＤＮＡを
０．　１　ｐｍｏｌ　／μｌの濃度で再溶解する。ごの
ＥｃｏＲ　Ｉ　−Ｂａｍｌｌ　Ｉ断片は、それぞれＡｓ
ｐ６３又はＧＩｕ６３をコードするＧＡＣ又はＧＡＡ　
　トリプレットを有するデスルファトヒルジンのコード
配列を含有する。

上記のようにして単離された３個のＤＮＡ断片を次の反
応により連結する。すなわち、０．　２　ｐｍｏｌの４
７８ｂｐ　Ｓａｌ　］　−ＥｃｏＲ　Ｉ断片、０．２ｐ
ｍｏｌの２６２ｂｐＩミｃｏＲ　Ｉ−ｌ−１ｌａ　Ｉ断
片（それぞれ配列ＧＡＣ又はＧＡＡを含有する）及び０
．　１　ｐｍｏｌの６．７ｋｂヘクク一断片を１ｏｕｔ
の６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ｔｌｃＡ　　（ｐＨ７、　５　
）　、１０ｍＭ　ｈＣｐ．２、５ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＡ
ＴＰ及び２００ＵのＴ４　［］ＮＡリガーゼ中で１５°
Ｃにて６時間連結する。各連結混合物の１μ！のアリコ
ートを１００μｌのカルシウム処理された形質転換コン
ピテント大腸菌ＨＢＩＯＩ細胞に添加する。

１２個の形質転換されたアンピシリン耐性コロニーを、
１００ｍｇ／ｆｆのアンピシリンを含有する■，Ｂ培地
中で増殖せしめる。プラスミドＤＮＡを調製しくｌｌｏ
ｌｍｅｓ等、八ｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１１４　（
１９８１）、１９３）、そしてＢａｍｔｌｌ及びＥｃｏ
Ｒ　Ｉによる二重消化によって分析する。ＤＮＡ中の変
異の存在をＤＮＡ配列決定（Ｓａｎｇｅｒ等、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．八ｃａｄ．ｓｃｉ．ＵｓＡ，　７４（１９
７７）５４６３　）により確認する。ヒルジン構造遺伝
子中にＧＡＣコードンを有する１つのクローンをｐＪｌ
）Ｂ２０７　／ＧＡＰＦＬ−旧Ｒ　（Ａｓｐ６３）と称
する。ヒルジンの６３位にＧｌｕをコードするＧＡＡ配
列を有する１つのクローンをｐＪＤＢ２０７　／ＧＡＰ
ＦＬ−ＨＩＲ（Ｇｌｕ６３）と称する。

デスルファトヒルジンをコードするＤＮＡ配列を、プロ
リンをコードするオリゴヌクレオチドＣＣＡにより延長
する。生ずる新規なデスルファトヒルジンは酵母中で発
現される。このものは６６個のアミノ酸を含み、そのＣ
−末端にプロリンを有する。

このポリペプチドを（Ｐｒ’ｏ６６）−デスルファトヒ
ルジンと称する。

例９に記載したのと同様にして、但し次のオリゴデオキ
シヌクレオチド Ｐｒ。

（５）　　　５’−ＣＧＡＡＧＡＡＡＴＣＣＣＧＧＡＡ
ＧＡＡＴＡＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡＴＡＧ（６）　　　３
’　　−　　　ＴＴＣＴＴＴＡＧＧＧＣＣＴＴＣＴＴＡ
ＴＧＧＡＣＧＴＣＧＧＴＡＴＣＣＴＡＧを用いて、プラ
スミドｐＪＤＢ２０７　／ＧＡＩ］Ｆｌ、−　Ｉｔ　Ｉ
Ｒ　（Ｐｒｏ６６）を作製する。ヒルジンコ＝１・配列
にＣＣＡの延長を有する単一のＩ）ＮＡクローンをｐＪ
ＤＢ２０７　／　ＧＡＰＦＬｌｌｌＲ（Ｐｒｏ６６）と
称する。

サツカロミセス・セレビシェ−邪ａｃｃｈａｒｏｇル並
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＦＲ１８株（ＤＳＭ　３６６
５；α，　　ｈｉｓ　３−ＩＬｈｉｓ　３−１５，　Ｉ
ｅｕ２−３，　Ｉｅｕ　２−１１２，ｃａｎ’　）　、
及び＋１Ｔ２４６株（ａ，　］ｅｕ２−３，　］；］ｑ
２ー１１２，ｐｒｂ（０５Ｍ４０８４）を、１ｌｉｎｎ
ｅｎ等（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＬＩ
ＳＡ７５、１．９２９（１９７８）　）に記載されてい
る形質転換法を用いて次のプラスミド： ｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＦＬ−１１１Ｒ（八ｓｐ　　６
３）ｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＦＬ−ＨＩＲ（Ｇｌｕ　６
３）ｐＪＤＢ２０７／ＧＡＰＦＬ−１１１Ｒ（Ｐｒｏ　
　６６）により形質転換する。形質転換された酵母を、
ロイシンを欠く酵母最少培地プレート」二でスクリーニ
ングする。形質転換された単一酵母コロニーを単離し、
そして次のように命名する： （例１１）の細胞を１０雁の酵母最少培地（アミノ酸を
含有しないデイフコ・イースＩ・・二１〜ロゲン・ヘー
スに２％グルコース、１０ｍｇ／ＩＩ−−アスパラギン
及びＬＯｍｇ／　ｌ　Ｔ、、−ヒスチジンを添加したも
の）の中で２８°Ｃにて撹拌しながら２回前培養し、そ
して３Ｘ１０’細胞／成の細胞密度まで培養する。次に
、これらの細胞を５０ｍ１の完全培地に接種する。

この完全培地は次の組成を有する：ディフコ酵母エキス
１０ｇ／ｐ！、ハクト−ペプトン５．０ｇ／ｊ２、グル
コース２０ｇ／ｌ、Ｄ　（＋）ザソカロース４０ｇ／！
、（Ｎ）１４）２ＳＯ４３，Ｏｇ／１．　　Ｘｌｌ２Ｐ
Ｏ４２，Ｏｇ／ｌ、、　Ｍｇ５Ｏ４ｏ、　５　ｇ／　１
．、Ｎａ（Ｊ！　Ｏ，Ｉ　ｇ　／　ｌ、及びＣａＣｆｆ
、、　　−２１ｈＯ０，１ｇ、＃２゜前記の培養物を完
全培地に４Ｘ１０６細胞／　ｍｆｌの細胞密度に接種し
、そして２８°Ｃにて４Ｂ時間、２５０回／分で撹拌す
る。

ａ）形１１光換斗４弓剖養 Ｓ、セレビシェ−ＧＲＦ１８及びＨＴ２４６形質転換体
発酵の後培養液１１を収得し、そして遠心分離（１００
ＯＸ　ｇ、３０分間）して上清から細胞を分離する。上
清にアセトニトリル５％（ｖ／ｖ）を添加し、そして得
られる溶液を２４ｍＲ１分の速度で半分成用Ｃ１８ＲＰ
−１（ＰＩ、Ｃカラムに適用する。カラムを９０％溶出
緩衝液Ａ／１０％溶出緩衝液Ｂにより１０分間洗浄し、
そしてグラジェントを開始する（条件Ｎ０１）。

グラジェントの３０〜６５分で両分を集める。スロンビ
ン阻害アッセイ　（Ｇｒｉｅｓｓｂａｃｈ、Ｕ、等、Ｔ
ｈｒｏｍｂ。

Ｒｅｓ、２４．２２１−２２４（１９８４））　、分析
的１？　Ｐ　Ｌ　Ｃ分析（条件Ｎ０２）及び分析的ＨＰ
ＬＣ分析（条件Ｎｏ、　３　）により同定して目的のヒ
ルジン変異体を含有する両分を凍結乾燥する。

得られる固体を水に溶解し、濾過（０，２／７ｍ）した
後、強陰イオン交換体（Ｍｏｎｏ４）上でｐｌ＋グラジ
ェント　（条件Ｎｏ、　２　）により溶出する半分成用
ＰＰＬＣにより分離する。蛋白質の大部分を含有するピ
ークを単一画分として集め、そして水から２回凍結乾燥
する。

最終精製及び脱塩工程において、凍結乾燥された物質を
水に溶解し、半分成用ＣＩ８　ＲＰ−ＨＰＬＣカラムに
注入し、そして溶出する（条件Ｎｏ、　１　）。純粋な
デスルファトヒルジン変異体を単一ピークとして手作業
で集め、そして凍結乾燥して白色固体を得る。

尖狂条止り 方　法：グラジエント溶出を用いる半分取用逆相高速液
体りロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）カラムのタイ
プ：　ＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ　ＲＰ−１８（Ｅ、メルク
、ダルムスタット、西独） 粒子リイズ：１０μｍ 寸法：　１６Ｘ２５０　ｍｍ ザンブル容量：　１０１００Ｏ 蛋白質負荷／注入：５〜５０ｍｇ 流速：２４ｄ／分 逆圧：１００〜１２０ｂａｒ 検　出：　２１５ｎｍにて 溶離剤Ａ　：　０．１％（ｖ／ｖ））リフルオロ酢酸（
ＴＦＡ）を含む水（分析されたＨＰＬＣ試薬、ＢＡＫＥ
Ｒケミカルス、Ｄｅｖｅｎｔｅｒ、オランダ）溶離剤Ｂ
：０．０７％（ｖ／ｖ）　ＴＦ八を含むアセトニトリル
（ｌｉＰＬＣ用、Ｆｌｕｋａ　Ｃｈｅｍｉｅ　ＡＧ、Ｂ
ｕｃｈｓスイス） 溶出条件： ザンプル容量：４滅（半分数州） ２００μ！（分析用） 蛋白質負荷／注入＝２〜３ｍｇ（半分数州）５００〜６
００μｇ／ｍ１　２５〜２００μｇ（分取用）１２５〜
１０００μｇ　／　ｍｌ 流速：２．Ｏｄ／分 逆圧：　３Ｏ−２５ｂａｒ 検　出：　２８０ｎｍにて 溶離剤Ａ　：　５０ｍＭ　ｌＩｃ０ＯＮ１１４　　ｐＨ
＝　４．５ン容離剤Ｂ　　：　５０ｍＭ　　ｌｌＣＯＯ
ＮＨ４ｐｔｌ−＝　３．５溶出条件； 方　法：ｐＨ−グラジェント溶出と共に強陰イオン交換
体固定相上でのイオン交換クロ マトグラフィーを用いるファスト・プ ロティン液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）カラムの
タイプ：　Ｍｏｎｏ４］（ファルマシア、ウプザラ、ス
エーデン） 寸法：　５　Ｘ５０ｍｍ ５．０ １９．５ ２２．０ ２２．１ ２５．０ 賜ＩＬ羅這− 方　法：グラジエント溶出を用いる分析用逆相高速液体
クロマトグラフィ＝（ＲＰ−１１ＰＬｃ）カラムのタイ
プ：　Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ　１００−５　Ｃ＋８（Ｍａ
ｃｈｅｒｅｙ−Ｎｕｇｅｌ、　Ｄｉｉｒｅｎ、西独）粒
子サイズ：５側 寸法：　４　Ｘ１２０　ｍｍ サンプル容量＝５０μ！ 蛋白質負荷／注入：２．５〜１０μｇ（５０〜２００μ
ｇ／ｍｌ） 流　速：１．５ｍｊ！／分 逆圧：　１２０〜］５０ｂａｒ 検　出：　２１５ｎｍにて 溶離剤Ａ　：　０．１％（ｖ／ｖ））リフルオロ酢酸（
ＴＦＡ）を含む水（分析された１１円、Ｃ試薬、ＩＩＡ
ＫＥＲケミカルス、Ｄｅｖｅｎ　ｔｅｒ、オランダ）溶
離剤Ｂ：０．０７％（ｖ／ｖ）　ＴＦＡを含むアセｌ−
ニトリル（ＨＰＬＣ用、Ｆｌｕｋａ　Ｃｈｅｍｉｅ　Ａ
Ｇ、Ｂｕｃｈｓスイス） ？容量条件： 時　　　　） ２１．６ 什す 組換デスルファトヒルジン（化合物１）、（Ｐｒｏ６３
）−デスルファトヒルジン（化合物２）、及び（Ｇｌｕ
”　）−デスルファトヒルジン（化合物３）をスロンヒ
ン阻害試験１発色基質としてＣｈｒｏｍｏｚｙｍｅ−Ｔ
Ｉを使用：　Ｇｒｉｅｓｓｂａｃｈ、　１１．等、Ｔｈ
ｒｏｍｂ、Ｒｅｓ、　２４．’２２１−２２４（１９８
４）、及び１種又は複数種の分析法（例１２の実験条件
を参照のこと）にかける。比較のため結果を次の表にま
とめる。

約２．５Ｎｇの純粋なデスルファトヒルジンを１１０°
Ｃにて６Ｎ　　＋＋ｃ７！の蒸気により加水分解し、そ
してＫｎｅｃｈｔ及びＣｈａｎｇ　　（Ａｎａｌ、Ｃｈ
ｅｍ、５８．２３７５（１９８６）　　）により記載さ
れているようにして分析する。加水分解物は次の組成を
有する。

Ｐｒｏ”６−ゾスルフアトヒルジン へｓｘ　　　　　　　８．９５　　　（９）　　　　　
　　ｌｉｅ　　　　　　　２．１　　　　（２）Ｇｌｘ
　　　１２．７７　（１３）　　　　Ｌｅｕ　　　　４
．４９　　（４）Ｓｅｒ　　　　４．１４　　（４）　
　　　Ｐｈｅ　　　　１．２３　　（１）Ｔｈｒ　　　
　４．２０　　（４）　　　　Ｌｙｓ　　　　３．３１
　　（３）Ｇｌｙ　　　　９．１１　　（９）　　　　
ｌ１ｉｓ　　　　１．０９　　（１）Ｐｒｏ　　　　４
．４６　　（４）　　　　Ｔｙｒ　　　　２．２９　　
（２）Ｖａｌ　　　　２．４４　　（４）　　　　Ｃｙ
ｓ　　　　４．７　　（６）合計　　　　　（６６） １個のプロリン残基が付加されている点を除き、分析値
は組換デスルファトヒルジン（Ｇｒｏｓｓｅｎｂａｃｈ
ｅｒ、１１．等、Ｔｈｒｏｍ、Ｒｅｓ、５ｕｐｐ１．７
．３３（１９８７）　）と同じである。

Ｇｌｕ’″３　−−゛スルフ　トヒルジンへｓｘ　　　
　　　　８．７９　　　（９）　　　　　　　ｌｉｅ　
　　　　　　１．９５　　　（２）Ｇｌｘ　　　１３．
３１　（１４）　　　　Ｌｅｕ　　　　４．２６　　（
４）Ｓｅｒ　　　　３．８６　　（４）　　　　Ｐｈｅ
　　　　１．１７　　（１）Ｔｈｒ　　　　４．１９　
　（４）　　　　Ｌｙｓ　　　　３．３６　　（３）Ｇ
ｌｙ　　　　８．４２　　（９）　　　　ｌ１ｉｓ　　
　　１．３２　　（１）Ｐｒｏ　　　　３．１１　　（
３）　　　　Ｔｙｒ　　　　１．２９　　（Ｌ）Ｖａｌ
　　　　２．７３　　（４）　　　　Ｃｙｓ　　　　５
．８２　　（６）合計　　　　　（６５） １個のグルタミン酸残基が付加されておりそして１個の
チロシン残基が存在しない点を除き、分析値はデスルフ
ァトヒルジンと同じである。

ｂ）振分り死分捉 Ｎ−末端アミノ酸配列を確立するため、純粋なデスルフ
ァ１−ヒルジン変異体を自動システムを用いて常用のＥ
ｄｍａｎ分解にかけ、そしてＮ−末端フェニルチオヒダ
ントインアミノ酸を逆相ＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃにより分離す
る。

！−１伎 ｎ、ｄ、−未決定 上に示されるように、デスルファトヒルジン変異体のＮ
−末端アミノ酸配列は真正なデスルファトヒルジンのそ
れと同一である。

Ｃ）旦二沫止 純粋なデスルファ１−ヒルジン変異体を室温にてカルボ
キシペプチダーゼＹにより消化する。放出されるアミノ
酸をＤＡＢＳ−ＣＩにより誘導体化し、そしてアミノ酸
分析機により決定する（Ｃｈａｎｇ、　ＹＪ等、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、Ｊ、２ｉＹ、８０３−８０６（１９８２））
。

懇Ｌ５朋 Ｃ−末端アミノ酸： Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−［Ｔｙｒ−
Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ｐｒｏ］Ｇｌｕ”　　−デスルファト
ヒルジン Ｃ−末端アミノ酸： Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−［１１ｅ−Ｐｒｏｌ　−Ｇｌｕ−Ｇｌ
ｕ−Ｇｌｕ−［Ｌｅｕ−Ｇｌｎｌ犬カッコ内のアミノ酸
配列の正確な順序は決定できなかった。

ｄ）分子ｌｐ次足 ファスト・アトム・ボンバードメント（ｆａｓｔ　ａｔ
ｏｍｂｏｍｂａｒｔｍｅｎｔ　ｐｒｅｒｉｔｉｖｅ）陽
イオンマススペクトル法（ＦＡＢ−ＭＳ）による決定。

装置：局Ｂ−肝マススベクＩ・ル計（ＵＣ−Ａｎａｌｙ
ｔｉｃａ１社、マンチェスター）；マトリクス：チオグ
リセロール；キセノンボンバードメント；イオンエネル
ギー１０ｋｅＶ　０鞄−来 （Ｐｒｏ６６）−デスルファトヒルジン実験式　　　　
　：　Ｃｚｑ□Ｈａａ７ＮＢｏＯ＋　ｌ　ｌｓ６分子量
（計算値）　　ニア０６０．６４分子量（測定値）　　
ニア０６４．２ フライト・スペクトル法（ｆｌｉｇｈｔ　ｓｐｅｃｔｒ
ｏｍｅｔｒｙ）の２５２ｃｒプラズマ脱差時間による測
定（２５２ＣｆＰＤＴ叶−ＭＳ）　（Ｓｕｎｇｕｉｓ　
ｔ、　Ｂ、及びＭａｃｆａｒｌａｎｅ、Ｒ，Ｄ、　（１
９８５）Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍ、Ｒｅｖ、＋　　
４　＋４２１）　、装置：旧ｏ−Ｉｏｎ（Ｎｏｒｄｉｃ
　ＡＧ、ウプサラ、スエーデン）：マトリクス：水；加
速電圧１０ｋｅＶ　０ 実験式　　　　　：　Ｃ２９２＋１４４７ＮＩ１００１
　ｌ＋Ｓｂ分子量（計算値）　　ニア０６０．６４分子
量（測定値）　　ニア０６０．７ Ｇｌｕ”　　−デスルファトヒルジン 実験式　　　　　：　Ｃｚｅ：＋ｔＬｚｎＮｅｏ（Ｌ　
＋　＋Ｓｂ分子量（計算値）　　：６９２９．４６分分
子（測定値）　　：６９２９．８ 例３〜９に記載したデスルファトヒルジン変異体も同様
にして特徴付けた。

汎用、動功」１月１１仕り− ５，Ｒ，５ｔｏｎｅ及びＪ、Ｈｏｆｓｔｅｅｎｇｅ　（
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ胚、　４６２２−４６２８　
（１９８６）　：ｌにより記載されているようにしてス
ロンビンを精製しそして特徴付ける。活性スロンビンの
濃度を４−メチル−ウムヘリフエリルｐ−グアニシノヘ
ンヅエートによる活性部位のタイトレージョンにより決
定する［Ｊａｍｅｓｏｎ、Ｇ。

Ｗ、、Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｄ、Ｖ、、八ｄａｍｓ、Ｒ，Ｗ
、、Ｋｙｌｅ、Ｗ、Ｓ、Ａ、及びＥｌｍｏｒｅ、Ｄ、Ｔ
、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、　１３１．１０１−１１７
（１９７３））。

Ｂ、Ｍ案ヱヱ丸不 ペプチジルＰ−ニトロアニリド基質の加水分解から生ず
るｐ−ニトロアニリンの放出を、島津ＵＶ　２４０分光
光度計を用いる４０５ｎｍでの吸光の増加によって追跡
する。０．１％ポリエチレングリコール６０００．０．
１　Ｍ　ＮａＣ７！及びｐ　−＝　ｌ−Ｄアニリド基質
を含有する０、０５Ｍ　Ｔｒｉｓ−１−ＩＣｊ！緩衝液
（ｐＨ７，８）中３７°Ｃにてポリエチレンキュベツト
中で測定を行う。基質Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−八ｒｇ−ｐ
−ニトロアニリド（Ｓ−２２６６；Ｋａｂｉ　Ｖｉｔｒ
ｕｍ）を３００汁の濃度において、変異体ヒルジンの濃
度の測定に用いられるタイト・バインディング・タイト
レージョン（ｔｉｇｈｔ−ｂｉｎｄｉｎｇｔｉｔｒａｔ
ｉｏｎ）実験において用いる。各アッセイのため１．Ｏ
ｎＭのスロンビン濃度を用いる。　１００ｄの濃度での
基質Ｄ−Ｐｈｅ−ビペコリル−Ａｒｇ−ｐ−二ｌ・ロア
ニリド（Ｓ−２２３８；Ｋａｂｉ　Ｖｉｔｒｕｍ）及び
２０〜５０ｐＭのスロンビン濃度を、ヒルジン変異体の
動力学的特性（下記参照のこと）を決定するだめのスロ
ーイング・バインディング（ｓｌｏｗｉｎ（Ｈ−ｂｉｎ
ｄｉｎｇ）阻害実験において使用する。スロンビンの添
加によりアッセイを開始する。生成物の量ば４０５ｎｍ
でのｐ−ニトロアニリンについての９，９２０Ｍ−’ｃ
ｍ−’の吸光係数を用いて計算し、そして基質の濃度は
８．２７０　Ｍ　−’　ｃｍの吸光係数を用いて３４２
ｎｍにおいて吸光光度計により決定する（Ｌｏｔｔｅｎ
ｂｅｒｇ、Ｒ，＆　Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｃ，ＭＢｉｏｃｈ
ｅｍ、Ｂｉｏｐｂｙｓ、Ａｃｔａ　　７４２　．５５Ｂ
−５６４（１９８３））　　。

キー１．ｌ）： １！１ により表わすことができる。阻害剤の解離に、はに２７
に＋　に等しい。酵素への阻害剤の結合が遊離阻害剤の
濃度の有意な消耗を生じさせる場合には、全阻害剤濃度
（Ｉ、）による定常状態速度（■、）の変化は、次の等
式（１）： ％式％（１） １２１．３２１−３３３（１９７２）：ｌにより記載さ
れるであろう。

この式中、ＶＱは阻害剤の非存在下で観察される速度で
あり、Ｅｔは全酵素濃度であり、そしてＫｌ’は見かけ
阻害定数である。阻害剤と基質とが活性部位に対しＣ競
する場合、Ｋｌ′は次の等式（２）： ％式％（２） により阻害剤の解離定数（Ｋ１）と関連付けられる。ご
の等式中、Ｓは基質濃度であり、そしてに１はミバエリ
ス定数である。酵素又は阻害剤の濃度が正確に知られて
いない場合には、この事実を許容するために追加の因子
を導入することができる（Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｊ、Ｗ、
及びＭｏｒｒｉｓｏｎ、　Ｊ、Ｆ、　、　Ｍｅｔｈｏｄ
ｓＥｎｚｙｍｏｌ、６３．４３７−４６７（１９７９）
　）　、ヒルジンによるスロンビンの阻害については、
スロンビンの濃度は活性部位タイトレーソヨンから知ら
れるが、ヒルジンの濃度は重量によってのみ知られ、そ
してデーターは次の等式（３）： ％式％） によって解析することができる。この等式において、■
８は容積当り重量によって表わされる阻害剤の濃度であ
り、そしてＩ８に乗じた場合に阻害剤のモル濃度をもた
らす定数である。

タイト−バインディング・タイ１〜レーシヨン実験にお
いて、ヒルジン及びその濃度についての解離定数は、ス
ロンビンの濃度を一定に維持し、そしてヒルジンの濃度
を、スロンビンの濃度より低い幾種類かの濃度及びスＩ
コンピンの濃度より高い幾種類かの濃度を含む、範囲に
わたってヒルジンの濃度を変えることによって決定され
る。測定点の合計数は通常７〜１０である。次に、各濃
度において得られた定常状態速度を、ウェイ１−を付け
た非線形回帰により等式（３）に適合せしめる。回帰の
ため、定常状態速度について観察された値をそれらの値
の逆数に従ってウェイト付げする。このタイプのウェイ
ト付けが最良の結果を与えることが経験的に見出されて
いる（Ｓｔｏｎｅ、　Ｓ、Ｒ，、及びＨｏｆｓｔｅｅｎ
ｇｅ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５．４６２２
−４６２８（１９８６）　〕。

阻害剤と酵素との相互作用の速度が遅く、その結果阻害
された定常状態速度が遅く達成される場合、スキーム（
１）についての生成物の生成の進行曲線が次の等式（４
）； ％式％ （１９７９）　）により記載されよう。この等式におい
て、Ｐは時点ｔにおいて生成される生成物の量であり、
ｄはＥｔ　、１．及びに１の関数であり、そしてに′は
これらのパラメーター及び阻害剤と酵素との間の相互作
用についての観察される二次会合速度定数（ｋ＋’　）
　（Ｃｈａ等、前掲）の関数である。変異体ヒルジンに
ついての動力学的パラメーターを得るため、少なくとも
６種類の異るヒルジン濃度において得られた進行曲線デ
ーターを非線形回帰により等式（４）に適合せしめる。

この解析がＫ　＋　’に１′及び観察される解離速度定
数（ｋｚ’　）の概算をもたらす。ｋ１′の値が活性部
位におりる基質の結合と独立であること、しかしながら
真の価に２及びに、を得るためにはに２′及びＫＩ′の
観察された値はＣ１−１−［：Ｓ）／に□）によって除
されるべきことがすでに示されている（Ｓ、Ｒ，５ｔｏ
ｎｅ及びＪ、）ｌｏｆｓｔｅｅｎｇｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ　２５，４６２２−４６２８（１９８６）　
；５ｔｏｎｅ、　Ｓ、Ｒ，、Ｂｒａｕｎ、　Ｐ、Ｊ、、
及びｌｌｏｆｓｔｅｅｎｇｅＪ、、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ　１２，４６］７−４６２４（１９８７））　。

これらの計算のため、Ｄ−Ｐｈｅ−ピペコリルーＡｒｇ
−ｐ−ニトロアニリドのに０についてのすでに得られて
いる稙３．６岸を使用する（ｌＩｏｆｓｔｅｅｎＨｅ、
　Ｊ、　、　Ｔａｇｕｃｈｉ、　Ｉｌ、、及び５ｔｏｎ
ｅ、Ｓ、Ｒ，、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、　２３ニー、２４
３−２５１（１９８６））。

これらの動力学的方法を用いて、Ｋ、及びに１について
の下記の値が得られる。

ｎ、ｄ、−未決定 ±■、　　　　　　　−１スルフ　ｌ・ヒルジン倉有−
医薬２組−成吻 前記の例のいずれかによるデスルファｌ−ヒルジン変異
体を含有する溶液を０．９％ＮａＣｆｆ　？＠液に対し
て透析する。次に、溶液の濃度を、同しＮａＣＪ！溶液
により０．２■／ｄ又は２　ｍｇ　／　ｍｉに稀釈する
ことにより調整する。これらの溶液を限外濾過（０，２
２１ｔｍ孔の膜を用いる）により無菌化する。

この無菌化された溶液を、例えば静脈内投与のために直
接用いることができる。

ン・ミクロオルガニスメン（Ｄｅｕｔｓｈｅ　Ｓａｍｍ
ｌｕｎｇ　ｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ；Ｄ
ＳＭ）、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ　Ｗｅｇ　ｌｂ、Ｄ−
３３００Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ（西独）に寄託され
てしする。

サツカロミセス・セレビシェ （Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）　ＧＲＦ１８寄託日　１９８６年３月４日 寄託番号　ＤＳＭ　３６６５ サツカロミセス・セレビシェ− （Ｓａｃｃｈａｒｏ町μ狙ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　Ｈ
Ｔ２４６寄託日　１９８７年４月１５日 寄託番号　ＤＳＭ　４０８４

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐ　ｌ’ｌ　ｔ、３５０の作製過程
を模式的に示す。 第２図はプラスミドｐＪＤＢ２０７　／ＧＡＰＦＬ−１
＋１Ｒのプラスミドマツプを模式的に示す。 第３図はプラスミドｐＪＤＢ２０７　／ＧＡＰＦＬ−Ｈ
ＴＲ（Ａｓｐ”）の作製過程を模式的に示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次のアミノ酸配列（ I ）： 【遺伝子配列があります】 （ I ） （配列中、Ｙ＿１はＡｓｐ又は遺伝的にコードされた中
   性アミノ酸の基であり、Ｙ＿２及びＹ＿３は相互に独立
   にＧｌｕ、Ａｓｎ又は遺伝的にコードされた親脂性アミ
   ノ酸の基であり、Ｙ＿４及びＹ＿５は相互に独立にＧｌ
   ｕ又は遺伝的にコードされた中性アミノ酸の基であり、
   Ｙ＿６はＴｙｒ又は遺伝的にコードされた酸性アミノ酸
   の基であり、そしてＹ＿７はＧｌｎ又はジペプチド基Ｇ
   ｌｎ−Ｐｒｏであり；但し、 Ｙ＿１がＡｓｐであり、Ｙ＿６がＴｙｒであり、Ｙ＿７
   がＧｌｎであり、Ｙ＿２及びＹ＿３がそれぞれＧｌｕで
   あり、且つ基Ｙ＿４及びＹ＿５の一方がＧｌｎであって
   他方がＧｌｕである場合を除く） を有するデスルファトヒルジンの変異体、及びその塩。 ２、Ｙ＿１かＡｓｐ、Ａｌａ、Ｌｅｕ又はＡｓｎであり
   、Ｙ＿２及びＹ＿３が相互に独立にＧｌｕ、Ｌｅｕ又は
   Ａｓｎであり、Ｙ＿４及びＹ＿５が相互に独立にＧｌｕ
   、Ｇｌｎ、Ａｓｎ又はＬｅｕであり、Ｙ＿６がＴｙｒ、
   Ａｓｐ又はＧｌｕであり、そしてＹ＿７がＧｌｎ又はジ
   ペプチド基Ｇｌｎ−Ｐｒｏであり；但し、Ｙ＿１がＡｓ
   ｐであり、Ｙ＿６がＴｙｒであり、Ｙ＿７がＧｌｎであ
   り、Ｙ＿２及びＹ＿３がそれぞれＧｌｕであり、且つ基
   Ｙ＿４及びＹ＿５の一方がＧｌｎであって他方がＧｌｕ
   である場合を除く、請求項１に記載の式（ I ）のデス
   ルファトヒルジン変異体、及びその塩。 ３、請求項１に記載の〔Ｇｌｎ＾６＾１＾，＾６＾２〕
   −デスルファトヒルジン。 ４、請求項１に記載の〔Ｌｅｕ＾６＾１＾、＾６＾２〕
   −デスルファトヒルジン。 ５、請求項１に記載の〔Ａｓｎ＾６＾１＾、＾６＾２〕
   −デスルファトヒルジン。 ６、請求項１に記載の〔Ｌｅｕ＾５＾７＾、＾５＾８＾
   、＾６＾１＾、＾６＾２〕−デスルファトヒルジン。 ７、請求項１に記載の〔Ａｓｎ＾５＾７＾、＾５＾８＾
   、＾６＾１＾、＾６＾２〕−デスルファトヒルジン。 ８、請求項１に記載の〔Ａｌａ＾５＾３〕−デスルファ
   トヒルジン。 ９、請求項１に記載の〔Ａｓｐ＾６＾３〕−デスルファ
   トヒルジン。 １０、請求項１に記載の〔Ｇｌｕ＾６＾３〕−デスルフ
   ァトヒルジン。 １１、請求項１に記載の〔Ｐｒｏ＾６＾６〕−デスルフ
   ァトヒルジン。 １２、請求項１に記載のデスルファトヒルジン変異体を
   含んで成る医薬組成物。 １３、請求項１に記載のデスルファトヒルジン変異体の
   製造方法であって、プロモーター、シグナルペプチドを
   コードする第一ＤＮＡ配列（該プロモーターは該第一Ｄ
   ＮＡ配列に作用可能に連結されている）、デスルファト
   ヒルジン変異体をコードする第二ＤＮＡ配列（該第一Ｄ
   ＮＡ配列と該第二ＤＮＡ配列とは適切なリーディングフ
   レーム中に連結されている）、及び転写停止シグナルを
   含有するＤＮＡ配列から成る発現カセットを含んで成る
   ハイブリドベクターにより形質転換されている微生物宿
   主株を培養し、該デスルファトヒルジン変異体を単離し
   、そして所望により遊離カルボキシ基及び／又はアミノ
   基を有する得られたポリペプチドを塩に、又は得られた
   塩を遊離化合物に転換する、ことを含んで成る方法。 １４、プロモーター、シグナルペプチドをコードする第
   一ＤＮＡ配列（該プロモーターは該第一ＤＮＡ配列に作
   用可能に連結されている）、請求項１に記載のデスルフ
   ァトヒルジン変異体をコードする第二ＤＮＡ配列（該第
   一ＤＮＡ配列と該第二ＤＮＡ配列とは適切なリーディン
   グフレーム中に連結されている）、及び転写停止シグナ
   ルを含有するＤＮＡ配列から成る発現カセットを含んで
   成るハイブリドベクター。 １５、請求項１４に記載のハイブリドベクターの製造方
   法であって、プロモーター、シグナルペプチドをコード
   する第一ＤＮＡ配列（該プロモーターは該第一ＤＮＡ配
   列に作用可能に連結されている）、デスルファトヒルジ
   ン変異体をコードする第二ＤＮＡ配列（該第一ＤＮＡ配
   列と該第二ＤＮＡ配列とは適切なリーディングフレーム
   中に連結されている）、及び転写停止シグナルを含有す
   るＤＮＡ配列から成る発現カセットを含んで成るハイブ
   リドベクター、又は該ハイブリドベクターの前記構成要
   素を、選択遺伝マーカー及び選択された微生物宿主用の
   複製起点を含有するＤＮＡ断片に、所定の順序に連結す
   ることを含んで成る方法。 １６、プロモーター、シグナルペプチドをコードする第
   一ＤＮＡ配列（該プロモーターは該第一ＤＮＡ配列に作
   用可能に連結されている）、請求項１に記載のデスルフ
   ァトヒルジン変異体をコードする第二ＤＮＡ配列（該第
   一ＤＮＡ配列と該第二ＤＮＡ配列とは適切なリーディン
   グフレーム中に連結されている）、及び転写停止シグナ
   ルを含有するＤＮＡ配列から成る発現カセットを含んで
   成るハイブリドベクターにより形質転換されている微生
   物宿主株。 １７、請求項１４に記載のハイブリドベクターにより微
   生物宿主株を形質転換することを含んで成る、請求項１
   ６に記載の形質転換された微生物宿主の製造方法。