FI96116B - Menetelmä proteaasi-inhibiittoriaktiivisuutta omaavien egliinimutanttien valmistamiseksi - Google Patents

Description

- 96116

Menetelmä proteaasi-inhibiittoriaktiivisuutta omaavien egliinimutanttien valmistamiseksi

Keksintö koskee proteaasieninhibiittorien eglii-ni B ja egliini C mutantteja, tällaisten mutanttien valmistukseen sopivia yhdistelmävektoreita ja tällaisilla yhdistelmävektoreilla transformoituneita isäntäorganis-meja sekä menetelmiä mainittujen yhdistelmävektorien, transformoituneiden isäntäorganismien ja egliinimutant-tien valmistamiseksi.

Saksalaisessa hakemusjulkaisussa no. 2808396 selostetaan kahta verijuotikkaasta (Hirudo medicinalis) eristettyä proteaasieninhibiittoria, joista käytetään nimiä egliini B ja egliini C. Nämä molemmat polypeptidit koostuvat 70 aminohaposta, niiden molekyylipainot ovat noin 8100 ja ne inhiboivat voimakkaasti kymotrypsiiniä, subtilisiinia, eläinten ja ihmisen granuiosyyttiprote-aaseia elastaasi ja katepsiini G sekä syöttösolujen pro-teaasia kymaasi. Sitävastoin ne eivät estä trypsiimn-kaltaisia proteiineja lainkaan tai ne estävät niitä vain vähäisessä määrin.

Egliini C:n primäärirakenne on seuraava: H-ThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrVal

AspGlnAlaArgGluTyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAspValTyrPheLeuProGluGly

SerProValThrLeuAspLeuArgTyrAsnArgValArgValPheTyrAsnProGlyThrAsnVal

ValAsnHisValProHisValGly-OH

Egliini C:ssä ei ole lainkaan disulfidisiltoja, toisin kuin useimmissa ennestään tunnetuissa proteaa- sieninhibiittoreissa. Se osoittaa suhteellisen pientä molekyylikokoa ajatellen epätavallista stabiilisuutta happojen, emästen ja lämmön aiheuttamaa denaturoitumista vastaan ja proteolyyttistä hajoamista vastaan. Egliini . B:n primäärirakenne eroaa egliini C:n vastaavasta si- • .

ten, että aminohappo 35, tyrosiini, on korvattu histi- 96116 2 diinillä.

Egliinit kuuluvat voimakkaimpiin nykyisin tunnetuista ihmisen ja eläinten granulosyyttielastaasin sekä ihmisen granulosyyttikatepsiini G:n estäjiin. Näiden soluproteaasien säätelemätön tai liiallinen vapautuminen saattaa vahvistaa tulehdusilmiötä ja saada aikaan kudosten hajoamista epäspesifisen proteolyysin seurauksena. Nämä solujensisäisestä hajottamisesta vastaavat entsyymit toimivat fysiologisessa ympäristössä (neutraalin ja heikosti emäksisen välillä) optimaalisesti ja kykenevät nopeasti tuhoamaan ja inaktivoimaan luontaisia kudoksen aineita (esim. elastiini) ja humoraalisia tekijöitä (esim. verenjuoksu- ja komplementtitekijöitä). Tähän mennessä tunnettujen ominaisuuksiensa perusteella ovat egliinit erittäin mielenkiintoisia lääketieteellisen hoidon kannalta (tulehdusten torjunta ja hoito, septinen shokki, keuhkolaajentuma, mucoviscidosis jne.).

Äskettäin on egliinien saanti tullut mahdolliseksi yhdistelmä-DNA-tekniikan menetelmien avulla (vrt. eurooppalainen patenttihakemus no. 146785).

Nyt esillä olevan keksinnön tarkoituksena on tuottaa egliini B:stä tai egliini C:stä lähtien uusia proteaasien inhibiittoreita.

Tehtävä on keksinnönmukaisesti ratkaistu valmistamalla egliinimutantteja, jotka eroavat luonnonegliineistä B ja C siten, että aktiivisen keskuksen alueella (aminohapot 45 ja 46, Leu-Asp) on yksi, kaksi tai kolme aminohappoa korvattu muilla aminohapoilla. Näin keksinnönmukaisesti saadut egliinimutantit osoittavat yllättäviä ominaisuuksia: Niinpä ne osoittavat egliini B:hen ja egliini C:hen verrattuina suurempaa spesifisyyttä tiet-' tyjen proteaasien inhiboinnissa tai sellaisten prote aasien inhiboinnissa, joita egliinit B ja C tuskin inhiboivat, kuten trypsiinin tai trombiinin inhiboinnissa.

Erityisesti esillä q<leva keksintö koskee kaavan (I) mukaisia egliinimutantteja « ·

II

96116 3 R-ThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrVal AspGlnAlaArgGluTyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAspVal-W-PheLeuProGluGly SerProVal-X-Y-Z-LeuArgTyrAsnArgValArgValPheTyrAsnProGlyThrAsnVal ValAsnHisValProHisValGly-OH (I), jossa kaavassa R tarkoittaa vetyä tai asetyyliä, W on Tyr tai His, X on Thr, Ser tai Pro, Y on Leu, Met, Arg,

Lys, Phe, Tyr tai Trp ja Z on Asp, Glu, Gin, Asn, Ala,

Ser tai Thr edellyttäen, että X on muu kuin Thr, kun Y on Leu ja Z on Asp, edelleen esillä oleva keksintö koskee näiden yhdisteiden suoloja.

Keksintö koskee ennen kaikkea kaavan I mukaisia yhdisteitä, joissa R on asetyyli, W on Tyr ja joko X on Thr, Y on Arg tai Lys ja Z on Asp, Glu, Gin, Asn, Ala,

Ser tai Thr tai X on Pro, Y on Met ja Z on Asp tai X on Thr, Y on Phe, Tyr, Trp tai Met ja Z on Asp, sekä näiden suoloja.

Keksintö koskee pääasiassa kaavan I mukaisia yhdisteitä, joissa R on asetyyli, W on Tyr, X on Thr, Y on Arg ja Z on Asp tai Ser, sekä näiden suoloja.

Erityisesti keksintö koskee kaavan I mukaisia yhdisteitä, joissa R on asetyyli, W on Tyr, X on Thr, Y on Arg ja Z on Asp, sekä näiden suoloja.

• Kaavan I mukaiset uudet yhdisteet voivat olla pait si vapaassa muodossa myös suolamuodossa. Koska keksinnön-mukaiset yhdisteet sisältävät useita aminohappotähteitä, joissa on vapaita aminoryhmiä tai guanidinoryhmiä, voivat ne olla esimerkiksi happoadditiosuolamuodossa. Happoad-ditiosuoloina tulevat kysymykseen erityisesti fysiologisesti siedetyt suolat, jotka ovat muodostuneet tavallisten terapeuttiseen käyttöön soveltuvien happojen kanssa. Sopivia epäorgaanisia happoja ovat mm. halogeenivetyhapot (kuten kloorivetyhappo), rikkihappo, fosforihappo ja pyro-fosforihappo ja sopivia orgaanisia happoja ovat mm. ensisijassa sulfonihapot (kuten bentsoehappo, p-tolueenisul- 96116 4 fonihappo ja alempialkaanisulfonihapot, kuten metaanisul-fonihappo) sekä karboksyylihapot, kuten etikkahappo, maitohappo, palmitiinihappo ja steariinihappo, omenahappo, viinihappo, askorbiinihappo ja sitruunahappo. Koska eg-liiniyhdisteet sisältävät myös sellaisia aminohappotähteitä, joissa on vapaita karboksyyliryhmiä, voivat ne olla myös metallisuoloina, erityisesti alkalimetalli-tai maa-alkalimetallisuoloina, esimerkiksi natrium-, kalium-, kalsium- tai magnesiumsuoloina tai ammoniumsuoloina, jotka on johdettu ammoniakista tai fysiologisesti siedetystä, orgaanisesta, typpipitoisesta emäksestä. Koska yhdisteet sisältävät samanaikaisesti vapaita karboksyyliryhmiä ja vapaita aminoryhmiä (ja guanidinoryhmiä), ne voivat olla myös sisäisten suolojen muodossa.

Keksinnönmukaisia egliinimutantteja ja niiden-suoloja voidaan valmistaa sinänsä tunnetuilla menetelmillä, esimerkiksi geeniteknologisilla menetelmillä, esimerkiksi siten, että transformoitunutta isäntäorganismia, joka sisältää yhtä mainituista egliinimutanteista kooditta-van DNA:n, kasvatetaan ja egliinimutantti tai sen suola eristetään. Erityisesti valmistetaan keksinnönmukaiset egliinimutantit ja niiden suolat siten, että a. valmistetaan kyseistä egliinimutanttia koodittava ··. DNA, b. tämä DNA sijoitetaan vektoriin, c. saatu yhdistelmävektori siirretään transformoinnilla isäntämikro-organismiin, d. transformoitunutta isäntämikro-organismia kasvatetaan olosuhteissa, jotka sallivat egliinimutantin ilmentymisen, : ja e. egliinimutantti tai sen suola eristetään.

Egliinimutantteja koodittavat DNA:t

Keksintö koskee DNA-laatuja, jotka sisältävät egliinimutanttia, erityisesti jotakin edellä erityisen edulli- li 5 rnie seksi mainittua egliinimutanttia koodittavan nukleotidi-sekvenssin.

Keksinnönmukaiset DNA:t sisältävät mielellään reunoissaan restriktiokohtia sisältäviä sekvenssejä, jotka mahdollistavat DNA:n sijoittamisen vektoriin.

Keksinnönmukaiset DNA:t voidasnvalmistaa sinänsä tunnetuilla menetelmillä. Niinpä voidaan DNA:t valmistaa esimerkiksi kemiallisesti tai niiden osia voidaan syntetisoida kemiallisesti ja liittää nämä yhteen entsymaattisesti tietyllä tavalla tai egliini B:tä tai eglii-ni C:ta koodittava DNA voidaan mutatoida yhdessä tai useammassa vaiheessa.

DNA-laatujen kemiallinen synteesi suoritetaan sinänsä tunnetuilla menetelmillä. Sopivia menetelmiä on selostettu julkaisuissa S.A. Narang, Tetrahedron 3_9, 3 (1983) ja eurooppalaisessa patenttihakemuksessa no.

146785.

Keksinnönmukaisten DNA-laatujen valmistus voidaan suorittaa myös mutatoimalla egliini B:tä tai egliini C:tä koodittava DNA. Etusijalle asetetaan"paikkaan kohdennettuna mutatointina" tunnettu menetelmä (vrt. M.J. Zoller et ai., Meth. Enzym. 100, 468 (1983)). Tätä varten kloonataan yksisäikeinen egliini-DNA Ml3-bakteriofaagiin, emäspariutetaan komplementaarisen oligonukleotidin kanssa, . joka sisältää mutaatiota(oita) ohjaavan(t) nukleotidin(t), emäspariutumistuote täytetään kaksisäikeiseksi, saatu kaksisäikeinen bakteriofaagi siirretään transformoinnilla sopivaan Escherichia coli-isäntään ja transformoitujen E. coli-solujen kasvatuksen jälkeen tunnistetaan egliinimutanttia koodittavan DNA:n sisältävät solut suoritta-. maila hybridisointi edellä mainitun oligonukleotidin kanssa.

Sellaisten ilmentämisvektorien valmistus, jotka sisältävät egliinimutanttia koodittavan DNA:n · 6 96116

Esillä oleva keksintö koskee lisäksi ilmentämisvektoreita, jotka sisältävät egliinimutanttia koodittavan DNA-sekvenssin, joka on sillä tavoin ilmentymisenohjaus-sekvenssin säätelyssä, että egliinimutantti ilmentyy tällaisella ilmentämisvektorilla transformoituneessa isän-täsolussa.

Keksinnönmukaiset ilmentämisvektorit valmistetaan esimerkiksi siten, että vektori-DNA, joka sisältää ilmenty-misenohjaussekvenssin, liitetään sillä tavoin egliinimutanttia koodattavaan DNA-sekvenssiin, että ilmentymisen-ohjaussekvenssi säätelee mainittua DNA-sekvenssiä.

Sopivan vektorin valinta riippuu transformoitavaksi tarkoitetusta isäntäsolusta. Sopivia isäntiä ovat esimerkiksi mikro-organismit, kuten hiivat, esimerkiksi Saccha-romyces cerevisiae, ja erityisesti bakteerikannat, joista ennen kaikkea Escherichia coli-kannat ja myös Bacillus subtilis-kannat, ja korkeampien organismien solut, erityisesti vakiintuneet ihmisen tai eläimen solulinjat. Etusijalle asetettavia isäntäsoluja ovat EL coli-kannat.

Periaatteessa ovat sopivia kaikki vektorit, jotka toisintavat ja ilmentävät egliinimutantteja koodittavia DNA-sekvenssejä valitussa isännässä.

Esimerkkejä vektoreista, jotka soveltuvat egliini-mutanttien ilmentämiseen E^ coli-kannassa, ovat bakterio-. faagit, esimerkiksi bakteriofaagi \:n johdannaiset, ja plasmidit, kuten erityisesti colEl-plasmidi ja sen johdannaiset, esimerkiksi pMB9, pSF2124, pBR317 tai pBR322.

Esillä olevan keksinnön kannalta etusijalle asetettavat vektorit ovat plasmidin pBR322 johdannaisia. Sopivat vektorit sisältävät täydellisen replikonin ja merkkigeenin, joka mahdollistaa ilmentämisplasmidilla transformoitunei-* ' den mikro-organismien valinnan ja tunnistamisen fenotyyp- pisen merkin perusteella. Sopivat merkkigeenit antavat mikro-organismille esimerkiksi vastustuskyvyn raskasmetallien, antibioottien tms. suhteen. Esillä olevassa keksinnössä etusijalle asetettavat vektorit sisältä-

II

96116 7 vät replikoni- ja merkkigeenialueiden lisäksi tunnistus-sekvenssejä restriktioendonukleaaseille, jotta näihin kohtiin voidaan liittää egliinimutanttia koodittava DNA-sekvenssi ja mahdollisesti ilmentymisenohjaussekvenssi.

Ilmentymisen säätelyyn voidaan käyttää useampia ilmentymisenohjaussekvenssejä. Erityisesti käytetään transformoitavan isäntäsolun voimakkaasti ilmentyvien geenienilmentymisenohjaussekvenssejä. Siinä tapauksessa, että pBR322 on yhdistelmävektorina ja Jh coli isäntä-soluna, ovat esimerkkejä sopivista ilmentymisenohjaus-sekvensseistä (jotka sisältävät mm. promoottorin ja ribo-sominsitoutumiskohdan) laktoosioperonille, tryptofaani-operonille, arabinoosioperonille tms. kuuluva, /3-laktamaa-sigeenille kuuluva, faagin λΝ-geenin tai faagin fd-kerros-proteiinigeenin vastaavat sekvenssit ym. Plasmidi pBR322 sisältää /3-laktamaasigeenin (β-lac-geeni) promoottorin, mutta muut ilmentymisenohjaussekvenssit pitää liittää plasmidiin. Esillä olevassa keksinnössä asetetaan etusijalle tryptofaanioperonin ilmentymisenohjaussekvenssi (trp po).

Hiivassa tapahtuvaan toisintamiseen ja ilmentämiseen sopivat vektorit sisältävät hiivan replikoitumisen alkukohdan ja geneettisen valintamerkin hiivaa varten. Yhdisti telmävektorit, jotka sisältävät hiivan replikoitumisen aloituskohdan, esimerkiksi kromosomaalisen autonomisesti replikoituvan segmentin (ars), pysyvät transformoinnin jälkeen hiivasolun sisällä ekstrakromosomaalisesti ja replikoituvat mitoosissa autonomisesti. Voidaan myös käyttää hybridivektoreita, jotka sisältävät hiivan 2μ-._· plasmidi-DNA:lie homologisia sekvenssejä. Tällaiset yhdis- telmävektorit integroituvat rekombinaation avulla solun sisällä jo ennestään oleviin 2ju-plasmideihin tai replikoituvat autonomisesti. Sopivia merkkigeenejä hiivalle ovat ennen kaikkea sellaiset, jotka antavat isännälle antibioottiresistenssin tai auksotrofisten hiivamutanttien ollessa kyseessä geenit, jotka korjaavat isännän puutteet. Vastaavat geenit antavat esimerkiksi resistenssin syklo- 96116 8 heksimidiantibiootin suhteen tai antavat prototrofian auksotrofiselle hiivamutantille, esimerkiksi URA3-, LEU2-, HIS3- tai ennen kaikkea TRPl-geeni, Hiivojen yhdistelmä-vektorit sisältävät mielellään vielä replikoitumisen aloituskohdan ja merkkigeenin bakteeri-isäntää varten, erityisesti E^_ colia varten, jotta yhdistelmävektorien ja niiden esivaiheiden kloonaus voidaan suorittaa bakteeri-isännässä. Hiivassa käytettäviksi sopivia ilmentymisenohjaus-sekvenssejä ovat esimerkiksi TRP1-, ADHI , ADHII- tai PH05-geenin ilmentymiseohjaussekvenssit tai glykolyyt-tiseen hajoamiseen osallistuvat promoottorit, esimerkiksi PGK- ja GAPDH-promoottori.

Erityisesti koskee esillä oleva keksintö sellaisia replikaation ja valinnan mahdollistavia ilmentämisvektoreita, jotka sisältävät ilmentymisenohajussekvenssin ja egliinimutanttia koodittavan DNA-sekvenssin niin, että mainittu DNA-sekvenssi sekä transkriptionaloitussignaali ja -lopetussignaali sekä luennanaloitussignaali ja -lope-tussignaali ovat mainitussa ilmentämisplasmidissa mainitun ilmentymisenohjaussekvenssin säätelyssä niin, että eglii-nimutantti ilmentyy mainitulla ilmentämisplasmidilla transformoituneessa isäntäsolussa.

Jotta saavutettaisiin tehokas ilmentyminen, pitää egliinimutanttia koodittavan geenin olla oikein ("lukuvaiheistukseen") sijoitettuna ilmentymisenohjaussekvenssin suhteen. On edullista liittää ilmentymisen-ohjaussekvenssi alueella, joka on pää-mRNA:n alun ja sen ATG-kodonin välissä, joka kuuluu koodattavalle geenisekvenssille, joka on luonnostaan liittyneenä ilmentymisenoh-: : jaussekvenssiin (esim. koodittava β-lac-sekvenssi, kun käytetään β-lac-promoottoria), egliinimutanttigeeniin, joka mielellään sisältää oman luennanaloitussignaalinsa (ATG) ja luennanlopetussignaalinsa (esim. TAG). Tällä tavoin voidaan taata tehokas transkriptio ja luenta.

li 96116 9

Mikro-organismien transformointi

Esillä oleva keksintö koskee myös menetelmää transformoituneiden isäntäsolujen valmistamiseksi siten, että transformoidaan isäntäsolu ilmentämisvektorilla, joka sisältää ilmentymisenohjaussekvenssin säätelyn alaisena olevan, egliinimutanttia koodittavan DNA-sekvenssin.

Sopivia isäntäsoluja ovat esimerkiksi edellä mainitut mikro-organismit, kuten Saccharomyces cerevisiae-, Bacillus subtilis- ja erityisesti Escherichia coli-kan-nat. Transformointi keksinnönmukaisilla ilmentämisplasmi-deilla voidaan suorittaa esimerkiksi kirjallisuudessa selostetulla tavalla: S. cerevisiae (A. Hinnen et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75,1929 (1978)), B. subtilis (Anagnostopoulos et ai., J. Bacteriol. 81, 741 (1961)) ja L coli (M. Mandel et ai., J. Mol. Biol. jj3, 159 (1970)). Transformoituneiden isäntäsolujen eristäminen on edullista suorittaa selektiivisestä ravintoalustasta, johon on lisätty biosidiä, jota vastaan ilmentämisplas-midin sisältämä merkkigeeni antaa resistenssin. Solut, jotka eivät sisällä ilmentämisplasmidia, kuolevat tällaisessa ravintoalustassa.

Keksintö koskee myös mainitulla tavalla saatavissa olevia transformoituneita isäntäsoluja.

Transformoituneiden isäntäsolujen kasvatus ja egliini-mutanttien talteenotto

Transformoituneita isäntäsoluja käytetään egliinimutant-tien tuottamiseen. Egliinimutanttien valmistusmenetelmälle on ominaista se, että mainittuja transformoituneita '> isäntäsoluja kasvatetaan ja tuote vapautetaan isäntä- soluista ja eristetään.

Esillä oleva keksintö koskee ennen kaikkea menetelmää kaavan I mukaisten egliinimutanttien ja tällaisten yhdisteiden suolojen valmistamiseksi siten, että ilmentä-misplasmidilla, joka sisältää ilmentymisenohjaussekvens- *· 96116 10 sin säätelyssä olevan, kaavan I mukaista egliinimutant-tia koodittavan DNA-sekvenssin, transformoituneita isäntä-soluja kasvatetaan nestemäisessä ravintoalustassa, joka sisältää assimiloituvia hiili- ja typpilähteitä, vapautetaan tuote isäntäsoluista ja eristetään se ja, jos halutaan, erotetaan menetelmässä saatu kaavan I mukaisten yhdisteiden seos yksittäisiksi komponenteiksi ja, jos halutaan, muutetaan saatu suola vapaaksi polypeptidiksi tai muutetaan saatu polypeptidi suolaksi.

Keksinnönmukaisesti transformoitujen isäntäsolujen kasvatus suoritetaan sinänsä tunnetulla tavalla. Näin ollen voidaan keksinnönmukaisten, transformoituneiden isäntäorganismien kasvatukseen käyttää erilaisia hiili-lähteitä. Esimerkkejä edullisista hiililähteistä ovat assimiloituvat hiilihydraatit, kuten glukoosi, maltoosi, mannitoli tai laktoosi tai asetaatit, joita voidaan käyttää joko yksin tai sopivina seoksina. Sopivia typpilähteitä ovat esimerkiksi aminohapot, kuten kasaminohapot, peptidit ja proteiinit ja näiden hajoamistuotteet, kuten tryptoni, peptoni tai lihaUutteet ja edelleen hiivauutteet, mallasuute ja ammoniumsuoiat, esimerkiksi ammoniumklori-di, -sulfaatti tai -nitraatti, joita voidaan käyttää joko yksin tai sopivina seoksina. Epäorgaanisia suoloja, joita yhtä lailla voidaan käyttää, ovat esim. natriumin, kaliu-• min, magnesiumin ja kalsiumin sulfaatit, kloridit, fosfaa tit ja karbonaatit.

Lisäksi sisältää ravintoalusta esimerkiksi kasvua edesauttavia aineita, kuten hivenaineita, esimerkiksi rautaa, sinkkiä, mangaania tms., ja mielellään aineita, jotka saavat aikaan valintapaineen ja estävät sel-, laisten solujen kasvun, jotka ovat menettäneet ilmentämis- 9 plasmidin. Niinpä ravintoalustaan lisätään esimerkiksi £ ampisilliiniä, kun ilmentämisplasmidi sisältää amp -geenin. Tällainen antibioottisesti vaikuttavien aineiden lisäys saa aikaan myös sen, että kontaminoivat, antibiooteille herkät mikro-organismit kuolevat.

9 9

II

96116 11

Kasvatus tapahtuu sinänsä tunnetuilla menetelmillä. Kasvatusolosuhteet, kuten lämpötila, ravintoalustan pH-arvo ja fermentointiaika, valitaan niin, että eglii-nimutanteille saadaan maksimaalinen tiitteri. Niinpä E. coli- tai hiivakantaa on edullista kasvattaa aerobisissa olosuhteissa pinnanalaisviljelmänä ravistellen tai sekoittaen lämpötilassa, joka on välillä noin 20 - 40°C, mielellään noin 30°C:ssa, pH-arvossa 4-9, mielellään pH-arvossa 7, noin 4-20 tuntia, mielellään 8-12 tuntia. Tällöin ilmentymistuote kertyy solujen sisään.

Kun solutiheys on saavuttanut riittävän arvon, kasvatus keskeytetään ja tuote vapautetaan mikro-organismin soluista. Tätä tarkoitusta varten solut rikotaan, esimerkiksi käsittelemällä pinta-aktiivisella aineella, kuten SDSrllä tai Tritonilla, tai lysotsyymillä tai vastaavasti vaikuttavalla entsyymillä. Vaihtoehtoisesti tai lisäksi voidaan käyttää mekaanisia voimia, kuten leik-kausvoimia (esim. X-puristin, French press, Dyno-Mill) tai ravistelua lasihelmien tai alumiinioksidin kanssa tai vuorottaista jäädytystä, esim. nestetypessä, ja sulatusta, esim. 30 - 40°C:seen, sekä ultraääntä solujen rikkomiseen. Näin saatu seos, joka sisältää proteiineja, nukleiinihappoja ja muita solunosia, rikastetaan sentrifugoinnin jälkeen sinänsä tunnetulla tavalla pro-. teiinien suhteen. Näin voidaan esimerkiksi suurin osa • a ei-proteiiniaineosista erottaa polyetyleeni-imiinikä-sittelyllä ja proteiinit, egliiniyhdisteet mukaanluettuina, saostaa esimerkiksi kyllästämällä liuos ammoniumsulfaatilla tai muilla suoloilla. Bakteeriproteiinit voidaan saostaa myös tekemällä liuos happamaksi etikka-hapolla (esim. 0,1 %, pH 3 - 5). Lisärikastuminen eglii-nimutanttien suhteen voidaan saada aikaan uuttamalla etik-kahapolla happamaksi tehty emäliuos n-butanolilla. Muita puhdistusvaiheita ovat esim. kromatografiset menetelmät, kuten ioninvaihtokromatografia, geelisuodatus, gee-lipermeaatiokromatografia, partitiokromatografia, HPLC, *. käänteisfaasi-HPLC tms. Näin ollen tapahtuu seoksen 12 96116 aineosien erottaminen dialyysillä, geeli- tai kantajattomal-la elektroforeesilla, molekyylikoon mukaan sopivassa Sepha-dex-pylväässä, affiniteettikromatografialla, esim. vasta-aineiden, erityisesti monoklonaalisten vasta-aineiden avulla, tai anhydrokymotrypsiinillä tai trombiinilla liitettyinä sopivaan kantaja-aineeseen affinitettikromatografiaa varten, tai käyttämällä jotakin muuta, erityisesti kirjallisuudesta tunnettua menetelmää.

Ilmentyneiden egliinimutanttien erottaminen sisältää esimerkiksi seuraavat vaiheet:

Erotetaan solut kasvatusliuoksesta sentrifugoimalla, valmistetaan raakauute rikkomalla solut, esimerkiksi Dyno-Mill-laitteella, sentrifugoidaan liukenemattomat aineosat pois, saostetaan bakteeriproteiinit 1-prosentti-sella-etikkahapolla ja suoritetaan geelisuodatus Sepha-dex G50:llä (tai G75:llä) ja mahdollisesti myös käänteis-faasi-HLPC. Suolanpoisto tapahtuu esimerkiksi Sephadex G25:ssä.

Egliinimutantit voidaan osoittaa egliinin vasta-aineilla, kuten kaneista saaduilla polyklonaalisilla vasta-aineilla tai hybridoomasoluista saaduilla monoklonaa-lisilla vasta-aineilla, esimerkiksi hybridoomasolulinjöistä 299S18-20 (CNCM 1-361), 299S20-1 (CNCM 1-362) tai ··, 299S20-10 (CNCM 1-363) erittyneillä monoklonaalisilla vasta-aineilla, tai kohdeproteaasien toiminnan estymisellä, joita kohdeproteaaseja ovat mm. ihmisen leukosyyttien elastaasi (HLE) tai katepsiini G (Cat G) (vrt. u. Seemuller et ai., Hoppe-Seyler's Z. physiol. Chem. 358, 1105 (1977); U. Seemuller et ai., Meth. Enzym. 80, 804 : (1981)).

Menetelmällä saatava seos, jossa on kaavan I mukaisia yhdisteitä, esimerkiksi kaavan I mukaiset yhdisteet, joissa R on joko H tai asetyyli, voidaan erottaa yksittäisiin komponentteihinsa sinänsä tunnetulla tavalla. Sopivia erotusmenetelmiä ovat esimerkiksi kromatografiset menetelmät, esimerkiksi adsorptiokromatografia,

II

96116 13 ioninvaihtokromatografia, HPLC tai käänteisfaasi-HPLC, moninkertaiset fraktiointimenetelmät tai elektroforeetti-set menetelmät, esimerkiksi eletkroforeesi selluloosa-asetaatissa tai geelielektroforeesi, erityisesti polyak-ryyliamidigeelielektroforeesi ("PAGE").

Työskentelytavasta riippuen saadaan keksinnönmukai-set yhdisteet vapaina tai happoadditiosuoloina, sisäisinä suoloina tai emästen kanssa muodostuneina suoloina. Happo-additiosuoloista voidaan sinänsä tunnetulla tavalla saada vapaita yhdisteitä. Viimeksimainituista voidaan puolestaan reaktioilla happojen tai emästen kanssa, esimerkiksi sellaisten, jotka muodostavat edellämainittuja suoloja, ja sen jälkeen haihduttamalla tai lyofilisoimal-la saada terapeuttisesti hyväksyttäviä happoadditiosuoloja tai metallisuoloja. Sisäisiä suoloja voidaan saada säätämällä pH sopivaan neutraalipisteeseen.

Farmaseuttiset valmisteet

Uusilla, kaavan I mukaisilla egliinimutanteilla on arvokkaita farmakologisia ominaisuuksia ja niitä voidaan käyttää sellaisten sairaustilojen ennaltaehkäisyssä tai hoidossa, jotka vaativat proteaasi—inhibiittorien käyttöä.

Uudet egliinimutantit osoittavat proteaasi—inhibiittoreina vaikutusprofiilia, joka poikkeaa luontaisten egliini B:n ja C:n vastaavista siten, että tiettyjä pro-teaaseja inhiboiva vaikutus voimistuu ja tietyt proteaasi t, joita luonnonegliinit eivät inhiboi, inhiboituvat nyt, ja toisaalta joitakin egliinien luontaisia kohde-proteaaseja, kuten esim. granulosyyttielastaasia, inhiboiva vaikutus heikkenee tai häviää. Niinpä esimerkiksi kaavan I mukaiset yhdisteet, joissa R on vety tai asetyyli, W on Tyr tai His, X on Pro, Y on Met ja Z on Asp, osoittavat luonnonegliineihin verrattuina voimakkaampaa esto-vaikutusta ihmisen ja eläinten granulosyyttielastaasia 96116 14 kohtaan ja niitä voidaan samoin kuin luonnonegliinejä käyttää esimerkiksi keuhkolaajentuman, ARDS:n ("acute respiratory distress syndrome"), septisen shokin, nivelreuman ja mucoviscidosiksen hoidossa. Kaavan I mukaisilla yhdisteillä, joissa R ja W ovat kaavan I yhteydessä määriteltyjä, X on Thr, Y on Arg tai Lys ja Z on Asp, on päinvastoin kuin luonnonegliineillä voimakas tryp-siiniä inhiboiva vaikutus ja vain vähäinen vaikutus granulosyyttielastaasiin ja katepsiini G:hen. Tämä koskee erityisesti kaavan I mukaista yhdistettä, jossa R on asetyyli, w on Tyr, X on Thr, Y on Arg ja Z on Asp. Tällaisia yhdisteitä voidaan samoin kuin aprotiniinia käyttää esimerkiksi haimatulehduksen hoitoon ja vammasta johtuvan, pankreatogeenisen ja verenvuotoisen shokin hoidossa. Kaavan I mukaisilla yhdisteillä, joissa R, W ja X ovat kaavan I yhteydessä määriteltyjä, Y on Arg tai Lys ja Z on Asp, on voimakas trombiinia inhiboiva vaikutus ja niitä voidaan käyttää, mielellään antitrombiini III:n kanssa yhdessä, esimerkiksi verisuoni-tukosten, tromboembolioiden, septisen tai tapaturmanjälkeisen shokin ja kulutuskoagulopatioiden hoidossa.

Esillä oleva keksintö koskee myös farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisältävät vähintään yhtä tämän kek-• sinnönmukaista yhdistettä tai sen farmaseuttisesti hy väksyttävää suolaa sekä haluttaessa myös tavanomaista, farmaseuttisesti hyväksyttävää kantaja-ainetta ja/tai apuaineita.

Näille koostumuksille saattaa löytyä käyttöä erityisesti edellä mainittujen hoidonaiheiden ollessa kyseessä, kun niitä annetaan esimerkiksi parenteraalisesti, kuten intravenoosisesti, intrakutaanisesti, subkutaanisesti tai intramuskulaarisesti, tai paikallisesti.

Edelleen koskee esillä oleva keksintö keksinnön-mukaisten uusien yhdisteiden ja niitä sisältävien farmaseuttisten koostumusten käyttöä ihmisten ja eläinten sairauksien ennaltaehkäisyyn ja hoitoon, erityisesti edellä 11 96116 15 mainittujen sairauksien hoitoon.

Annostus riippuu ensi sijassa kyseisestä antotavasta ja hoidon tai profylaksian tarkoituksesta. Yksittäisten annosten suuruus ja antoaikataulu voidaan parhaiten määrittää kunkin sairaustapauksen yksilöllisen arvioinnin perusteella; alan ammatti-ihmisen käytössä ovat relevanttien tekijöiden, kuten veritekijöiden, määrittämiseen tarvittavat menetelmät.

Kun kyseessä ovat trombiinia inhiboivat egliinimu-tantit, on injektoinnissa terapeuttisesti tehokas määrä annosalueella noin 0,005 - noin 0,1 mg painokiloa kohti. Etusijalle asetetaan alue noin 0,01 - noin 0,05 mg painokiloa kohti. Anto tapahtuu intravenoosisella, intra-muskulaarisella tai subkutaanilla injektiolla. Näin ollen sisältävät parenteraalista antoa varten tarkoitetut valmisteet yksikköannosmuodossa aplikaatiotavasta riippuen annosta kohti noin 0,4 - 7,5 mg keksinnönmukaista yhdistettä. Vaikuttavan aineen lisäksi sisältävät nämä farmaseuttiset koostumukset tavallisesti vielä puskuria, esimerkiksi fosfaattipuskuria, jonka tulee pitää pH-arvo välillä noin 3,5 - 7, ja lisäksi natriumkloridia, mannitolia tai sorbitolia isotonian aikaansaamiseksi. Valmisteet voivat olla pakkaskuivatussa muodossa tai liuos-muodossa, jolloin liuosten saattaa olla edullista sisältää antibakteerisesti vaikuttavaa säilöntäainetta, esi- • · merkiksi 0,2 - 0,3 % 4-hydroksibentsoehapon metyylieste-riä tai etyyliesteriä.

Preparaatti, jonka avulla trombiinia inhiboivia egliinimutatteja voidaan käyttää paikallisesti, voi olla liuoksen, pesunesteen tai geelin, öljyliuoksen tai -suspension tai rasvapitoisen tai erityisesti emulsiovoiteen muodossa. Vesiliuoksen muodossa oleva valmiste saadaan esimerkiksi siten, että keksinnönmukainen vaikuttava aine tai sen terapeuttisesti hyväksyttävä suola liuotetaan vesipitoiseen puskuriliuokseen, jonka pH on 4 - 6,5, ja haluttaessa lisätään muuta vaikuttavaa ainetta, esi- • 16 96116 merkiksi tulehduksia estävää ainetta ja/tai polymeeristä kiinnitysainetta, esimerkiksi polyvinyylipyrrolidonia, ja/tai säilöntäainetta. Vaikuttavan aineen pitoisuus on noin 0,1 - noin 1,5 mg, mielellään 0,25 - 1,0 ml 10 ml:ssa liuosta tai 10 g:ssa geeliä. Paikallisesti käytettäväksi tarkoitettu öljypitoinen applikointimuoto saadaan esimerkiksi suspendoimalla keksinnönmukainen vaikuttava aine tai sen terapeuttisesti hyväksyttävä suola öljyyn ja lisäämällä samalla turvotusainetta, kuten alu-miinistearaattia, ja/tai pinta-akviivista ainetta (ten-sidiä), jonka HLB-arvo ("hydrophilic-lipophilic-balance") on alle 10, kuten monenarvoisen alkoholin rasvahappo-monoesteriä, esimerkiksi glyseriinimonostearaattia, sorbi-tolimonolauraattia, sorbitolimonostearaattia tai sorbi-tolimono-oleaattia. Rasvapitoinen voide saadaan esimerkiksi suspendoimalla keksinnönmukainen vaikuttava aine tai sen suola levitettävään rasvapohjaan ja mahdollisesti lisäämällä samalla tensidiä, jonka HLB-arvo on alle 10. Emulsiovoide saadaan sekoittamalla keksinnönmukaista vaikuttavaa ainetta tai sen suolaa sisältävä vesiliuos pehmeään, levitettävään rasvapohjaan lisäämällä samalla tensidiä, jonka HLB-arvo on alle 10. Kaikki nämä paikalliset applikaatiomuodot voivat myös sisältää säilöntäainetta. Vaikuttavan aineen pitoisuus on noin 0,1 - noin , 1,5 mg, mielellään 0,25 - 1,0 mg noin 10 g:ssa perusmas- • · 4 saa.

Elastaasia inhiboivien egliinimutanttien anto tapahtuu intravenoosisena injektiona tai intrapulmonaa-lisesti hengittämällä, esim. Bird-laitteella. Näin ollen sisältävät parenteraaliseen antoon tarkoitettujen farmaseuttisten valmisteiden yksikköannosmuodot applikaatio-tavasta riippuen annosta kohti noin 10 - 50 mg keksinnön-mukaisia yhdisteitä. Vaikuttavan aineen ohella sisältävät nämä farmaseuttiset valmisteet tavallisesti natrium-kloridia, mannitolia tai sorbitolia isotonian aikaansaamista varten. Valmisteet voivat olla pakkaskuivatussa

II

96116 17 muodossa tai liuosmuodossa, jolloin saattaa olla edullista, että liuos sisältää antibakteerisesti vaikuttavaa säilöntäainetta, esimerkiksi 0,2 - 0,3 % 4-hydroksibent-soehapon metyyliesteriä tai etyyliesteriä.

Elastaasia inhiboivien egliinimutanttien paikalliseen käyttöön tarkoitetut valmisteet vstaavat pitkälle edellä selostettuja valmisteita.

Inhalaatiovalmisteet, joilla hengitysteitä käsitellään intrapulmonaarista antotapaa käyttäen, ovat esimerkiksi aerosoleja tai suihkeita, joissa farmakologinen vaikuttava aine voi olla liuoksen tai suspension pisaroihin jakautuneena. Valmisteet, joissa farmakologinen vaikuttava aine on liuosmuodossa, sisältävät tämän lisäksi sopivaa ponneainetta ja tarvittaessa myös lisäliuotinta ja/tai stabilointiainetta. Ponnekaasun tilalla voidaan käyttää myös paineilmaa, joka voidaan tarpeen mukaan tuottaa sopivalla paineistus- ja paineenpäästölaitteella. Erityisen sopivia tähän antotapaan ovat Bird-hengityslait-teet, jotka tunnetaan lääketieteessä. Näissä laitteissa sijoitetaan vaikuttavan aineen liuos laitteeseen, sumutetaan heikolla ylipaineella ja viedään keuhkoihin potilaan hengityksen avulla.

Elastaasia inhiboivilla egliinimutanteilla on annos-·· tus iästä, yksilöllisestä tilasta ja sairauden laadusta riippuen lämminverisillä (ihminen tai eläin), joiden paino on noin 70 kg, intrapulmonaarisesti annettaessa noin 10 - noin 30 mg hengityskertaa kohti (kerran tai kahdesti vuorokaudessa) ja intravenoosisessa annossa esim. jatkuvassa infusoinnissa, noin 10 - noin 1000 mg vuorokau-: dessa. Terapeuttisesti tehokkaat yskös- ja plasmapi toisuudet, jotka voidaan määrittää immunologisilla menetelmillä, kuten ELISA-menetelmällä, ovat välillä 10 -100 ^ig/ml (noin 1-10 pmol/l).

Trypsiiniä inhiboivien egliinimutanttien anto tapahtuu esim. parenteraalisella, kuten intravenoosisella, intramuskulaarisella tai subkutaanisella, injektoinnilla.

18 96116 terapeuttisesti tehokas määrä on annosalueella noin 1 - 20 mg vaikuttavaa ainetta painokiloa kohti. Farmaseuttiset valmisteet sisältävät vaikuttavaa ainetta pitoisuutena noin 0,1 - noin 100 mg/ml liuosta. Vaikuttavan aineen lisäksi sisältävät nämä farmaseuttiset valmisteet vielä puskuria, esimerkiksi fosfaattipuskuria (ks. edellä), sekä natriumkloridiä, mannitolia tai sorbitolia iso-tonian säätöä varten.

Tuholaistentorjunta-aineet

Kaavan I mukaisille uusille egliinimutanteille saat-• taa myös löytyä käyttöä proteaasieninhibiittoreina haluttaessa torjua kasvientuholaisia. Eri kasvilajeissa luonnostaan esiintyvien seriiniproteaasien inhibiittorien perusteella voidaan olettaa, että ne tarjoavat tehokkaan suojan kasveille patogeenisiä hyönteisiä, sieniä ja muita mikro-organismeja vastaan estämällä seriiniproteaaseja mainituissa organismeissa. Lisäksi voidaan sekä yksi-sirkkaiset että kaksisirkkaiset kasvit transformoida DNA: 11a, joka koodittaa heterologista proteaasieninhibiit-toria, kuten esimerkiksi egliini B:tä tai C:ta tai kaavan I mukaista egliinimutanttia. Vastaavien aktiivisten proteaasieninhibiittorien ilmentyminen antaa transformoituneille kasveille suojan kasvipatogeenien hyökkäyksiä vastaan.

Kun kasvit halutaan transformoida sopivilla ilmentä-misvektoreilla, jotka sisältävät keksinnönmukaista yhdistettä koodittavan DNA:n sekä ilmentymisenohjaussekvens-:* sejä, on käytettävissä sinänsä tunnettuja menetelmiä, kuten esimerkiksi protoplastien tai eristettyjen kudos-palojen kasvatus yhdessä agrobakteerien kanssa, jotka sisältävät vastaavan vektorin, ja senjälkeinen kokonaisten kasvien regenerointi tai vektorien siirto käyttämällä apuna sopivia, mahdollisesti modifioituja viruksia, kuten esimerkiksi TMV- (tupakkamosaiikkivirus) tai CaMV-virusta

II

96116 19 ("kukkakaalimosaiikkivirus"). Muita menetelmiä ovat esimerkiksi eristetyn DNA:n suora siirto (erityisesti, kun kyseessä ovat yksisirkkaiset kasvit, kuten maissi, kaura, ohra, riisi, durra, vehnä, sokeriruoko ym). PEG:n avulla, elektroporaatiolla, mikroinjektoimalla DNA eristettyihin protoplasteihin, kasvin kallussolukkoon tai alkioihin tai käyttämällä "microprojectile bombardment"-tekniikkaa ym.

Kasvien transformointiin sopivat DNA-molekyylit, jotka koodittavat keksinnönmukaisia yhdisteitä. Etusijalle asetetaan sellaiset DNA-molekyylit, jotka koodittavat kaavan I mukaisia egliinimutantteja, joissa R on ase-tyyli, W on Tyr, X on Thr, Y on Arg ja Z on Asp: Vastaa van edullisen egliinimutantin proteaaseja inhiboiva vaikutus voidaan testata kokeilla, joissa käytetään maissille patogeenistä Diabrotica virgiferaa ("western corn root worm"). Kun tämän patogeenin suolikudoshomogenaat-tiin lisätään edullista egliinimutanttia, saadaan aikaan proteolyyttisen aktiivisuuden voimakas estyminen.

Esillä oleva keksintö koskee erityisesti esimerkeissä kuvattuja egliinimutantteja, niitä koodittavia DNA-sekvenssejä, tällaisia DNA-sekvenssejä sisältäviä ilmentämisplasmideja, tällaisia ilmentämisplasmideja sisältäviä isäntämikro-organismeja ja kuvattuja niiden valmistusmenetelmiä.

«

Seuraavilla esimerkeillä valotetaan, mutta ei rajoiteta esillä olevaa keksintöä.

Esimerkki 1: Eqliini C-geenin M13-kloonaus 10 /ig:sta plasmidia pML 147 eristetään katkaisemalla restriktioendonukleaaseilla EcoRI ja BamHI ja suorittamalla sen jälkeen elektroforeesi 1,5-prosenttisessa matalalla sulavassa agaroosissa noin 0,5 pg 230 ep:n suuruista EcoRI-BamHI-fragmenttia (sisältää täydellisen eg-liini C-geenin). Tähän DNA-fragmenttiin (10 ng) sekoi- » 4 96116 20 tetaan 40 ng M13mp8-DNA:ta (esikatkaistu EcoRI:llä ja BamHI:llä) ja inkuboidaan 15 μ!:η tilavuudessa liuoksessa, jossa on 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl2, 10 mM ATP, 10 mM ditiotreitolia ja 0,125 yksikköä T4-DNA-ligaasia (Zoller et ai., Methods Enzym. 100, 468 - 500 (1983)). Näin saadulla liuoksella transformoidaan E. coli-kanta JM101 (Zoller et ai., ks. edellä). Trans-formointiseos levitetään X-Gal (IPTG-indikaattori)-agar-maljoille (Zoller et ai., ks. edellä). Näin saadaan 40 sinistä (villityyppi) ja 650 väritöntä plakkia.

Esimerkki 2: M13mp8-yksisäe-DNA:n valmistus 2 ml EL_ coli JMlOl-viljelmää (kasvatettu L-alus-tassa: 10 g Bacto-tryptonia, 5 g Bacto-hiivauutetta, 5 g NaCl, 5 g glukoosia, 0,1 g ampisilliinia 1 litrassa, kasvatus tiheyteen ODg22 = noin 0,5) ympätään värittömällä plakilla (poimittu agarmaljasta, ks. esimerkki 1) ja kasvatetaan 4-5 tuntia 37°C:ssa kierrosnopeudella 180 min Sitten näin kasvatettua viljelmää sentrifugoidaan 5 minuuttia Eppen-dorf- sentrifugissa. Emäliuos siirretään puhtaaseen sent-rifugiputkeen, sentrifugoidaan uudestaan 200 μ1:η kanssa 20-prosenttista polyetyleeniglykolia, lisätään . 1,5 M natriumkloridia, pidetään 20 minuuttia huo neenlämpötilassa ja sentrifugoidaan uudestaan. Emäliuos heitetään pois ja pelletti liuotetaan 100 plraan liuosta, jossa on 50 mM Tris-HCl, pH 7,8 ja 1 mM EDTA (TE). Seokseen sekoitetaan 50 μΐ fenoli/TE-seosta, sekoitetaan 15 minuuttia huoneenlämpötilassa ja sen jälkeen sentrifugoi-j daan 5 minuuttia Eppendorf-sentrifugissa. 100 μ1:33η emäliuosta lisätään 10 μΐ natriumasetaattia, pH 6, ja 3 tilavuutta absoluuttista etanolia (250 jil), pidetään yön yli -20°C:ssa ja sen jälkeen sentrifugoidaan 10 minuuttia samoin kuin edellä. Pelletti pestään 1 ml:11a 80 % etanolia ja sentrifugoidaan uudestaan. Pellettiä kuiva-·.: taan 10 minuuttia huoneenlämpötilassa ja sen jälkeen se liuotetaan 50 μΐ:aan TE-liuosta. Liuos sisältää noin 5 μg yksisäikeistä M13mp8-DNA:ta.

Il 96116 21

Esimerkki 3: (Arg45)-eqliini C.-tä koodattavan geenin valmistus a. Mutaqeenisen oligonukleotidin kinasointi

Mutatointiavarten valmistetaan kemiallisella synteesillä seuraava oligonukleotidi: 5'-dCTCCTTGTTACTCGGGACC-3' 10 μΐ oligonukleotidia (1 OD/ml = 500 ng) kinasoi-daan 20 μl:ssa liuosta, jossa on C,C7 M Tris-HCl, 7,6, 0,01 M MgC^, 50 mM ditiotreitolia, ( jf-^P) ATP: tä ja T4-polynukleotidikinaasia (Boehringer) (vrt. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, toim. T. Maniatis et al., s. 125). Kinasoitu oligonukleotidi liuotetaan 10 :aan TE-puskuria (50 ng/ul).

b. Eqliini C-qeenin mutatointi 3'-GA GGA CAA TGA GAC CTG G-5' + 5’-CT CCT GTT ACT CGG GAC C-3’ ^ (oligoaluke) ·*. * 5'-CT CCT GTT ACT CGG GAC C-3' (II) 3'-GA GGA CAA TGA GAC CTG G-5* mutatointi " 7 Pro Val Thr Arg Asp 5'-CT CCT GTT ACT CGG GAC C-3’ (III) .* 3'-GA GGA CAA TGA GCC CTG G-5' 1 μg yksisäikeistä M13mp8-DNA:ta inkuboidaan 50 ng:n kanssa kinasoitua oligonukleotidialuketta 45°C:ssa (30 minuuttia) ja sen jälkeen huoneenlämpötilassa (5 minuuttia) 10 pltssa liuosta, jossa on 50 mM Tris-HCl, pH 7,8, ja 100 mM MgC^. Sitten tähän seokseen lisätään: 96116 22 dATP-, dGTP-, dCTP ja dTTP-liuosta, 1 μΐ kutakin pitoisuutena 10 γπΓ·1 1 μΐ T4-DNA-ligaasia

2 μΐ 50 mM ditiotreitolia 1 μΐ 10 mM ATP

1 μΐ 5 mg/ml liivatetta 1 μΐ väkevyydeltään 10-kertaista Klenow-puskuria (0,66 M Tris-HCl, pH 7,6, 50 mM MgC^, 50 mM ditiotreitolia) 1 μΐ DNA-polymeraasia (Klenow-fragmentti) = 2,5 yksikköä.

Saatua seosta inkuboidaan 5 minuuttia 22°C:ssa ja sen jälkeen 16 tuntia 15°C:ssa ja lopuksi suoritetaan elektroforeettinen erotus 1-prosenttisessa agaroosissa.

Saatu rengasmainen kaksisäikeinen DNA tehdään etidiumbro-midilla näkyväksi ja eluoidaan geelistä elektroeluutiolla (noin 10 ng 15 piissä TE-puskuria).

5 piillä (= noin 3,5 ng) tällä tavalla saatua DNA:ta transformoidaan E_;_ coli-kanta JM101 ja levitetään X-Gal/ IPTG-indikaattorimaljoille (ks. esimerkki 1). Näin saadaan noin 100 väritöntä plakkia.

Näistä plakeista 40 käytetään coli JM101-vil-jelmien(2 ml) ymppäämiseen (ks. esimerkki 2). E^ coli-solut sentrifugoidaankasvatuksen (esimerkki 2) jälkeen erilleen emäiiuoksesta (emäliuos sisältää fagit ja yksi-*· säikeisen DNA:n, solupelletti sisältää jo vastaavan muta- toituneen kaksisäikeisen DNAin).

50 μΐ kunkin näiden 40 faagin emäliuosta suodatetaan nitroselluloosalla, pestään (2 x TE), pidetään 2 tuntia 80°C:ssa vakuumissa ja hybridisoidaan Southern-, menetelmällä (J. Mol. Biol. £8, 503 - 517 (1975)) käyt- : tämällä oligonukleotidialuketta radioaktiivisena koetti mena, jotta saadaan selville mutatoituneen DNA-sekvens-sin läsnäolo (III, ks, kaavio). Näin saadaan 12 potentiaalista faagiemäliuosta, jotka sisältävät (Arg45)-eg-liini C-geenin. Neljä näistä positiivisista faagiemä-liuoksista laimennetaan (noin 1:10^), niihin sekoitetaan E. coli-kantaa JM101 ja levitetään indikaattoriagarille.

Il 96116 23

Kulloisessakin tapauksessa kolmesta syntyneestä plakista eristetään faagit. Niistä eristetään edellä kuvatulla tavalla yksisäikeinen DNA. Nämä 12 yksisäikeistä DNA:ta sekvensoidaan Sangerin menetelmällä (Science, 214, 1205 (1981); Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 5463 (1977)). Kaikista 12 yksisäikeisestä DNA:sta löytyy haluttu mutatoitu-nut egliini C-sekvenssi.

Vastaavista E^_ coli-solupelleteistä (ks. edellä) valmistetaan minipreparaatiolla vastaava mutatoitunut kaksisäikeinen DNA ((Arg45)-egliini C-geeni plasmidissa M13mp8).

Vektorista leikataan mutatoituneen geenin sisältävä EcoRI-BamHI-insertti suorittamalla restriktioaktkaisut EcoRI:llä ja BamHI:llä, fragmentti eristetään ja kloonataan vektoriin pHRil48/EcoRI/BamHI (eurooppalainen patenttihakemus no. 146785). Näin saatu plasmidi pJB618 eristetään ja sillä transformoidaan coli-kanta HB101. Plas-midilla pJB618 transformoituneelle kannalle annetaan nimeksi E. coli HB101/pJB618.

Esimerkki 4: (Pro44)-egliini C:tä koodittavan geenin valmistus (Thr44)-^(Pro44)-mutaatio suoritetaan samoin kuin esimerkissä 3 on kuvattu. Käytettävän mutagenoivan oligo- nukleotidin rakenne on seuraava: 0 5'CT CCT GTT CCT CTG GAC-3'

Egliini C-geenin mutatointi suoritetaan seuraavan kaavion mukaisesti: 3'-GA GGA CAA TGA GAC CTG-5' * (I) + 5’-CT CCT GTT CCT CTG GAC-3' •(oligoaluke) 96116 24 * 5'-CT CCT GTT CCT CTG GAC-3' 3'-GA GGA CAA TGA GAC CTG-5' | fnutatointi ^ 2 Pro Vai Pro Leu Asp 5'-CT CCT GTT CCT CTG GAC-31 3'-GA GGA CAA GGA GAC CTG-5'

Mutatointiseoksen käsittelyllä saadaan aikaan 18 potentiaalista (Pro44)-egliini C-mutanttia.

Kun (Pro44)-egliini C-DNA kloonataan vektoriin pHRi14{yEcoRI/BamHI, saadaan esimerkissä 3 kuvattua tapaa noudattaen plasmidi pJB591. Tällä plasmidilla transfor-moituneellle E^_ coli-kannalle annetaan nimeksi E^_ coli HB101/pJB591.

Esimerkki 5: (Arq45,Ser46)-egliini C:tä koodittavan geenin valmistus (Leu45,Asp46)-MArg45,Ser46)-mutaatio suoritetaan samoin kuin esimerkissä 3 on selostettu. Käytettävän mutatoivan oligonukleotidin rakenne on seuraava: 5'-GTA ACG CAG AGA ACG AGT AAC AGG -3'

Egliini C-geenin mutatointi suoritetaan seuraavasti: 3’-CAT TGC GTC CAG GTC TCA TTG TCC-5’ (I) + 5’-GTA ACG CAG AGA ACG AGT AAC AGG-3' (oligoaluke)

ΛΛΛ XX

5'-GTA ACG CAG AGA ACG AGT AAC AGG-3' (II) 3'-CAT TGC GTC CAG GTC TCA TTG TCC-5' | ifctttätiSTnti 96116 25 5'-GTA ACG CAG AGA ACG AGT AAC AGG-3' (III) 3’-CAT TGC GTC TCT TGC TCA TTG TCC-5' % 7 *3

Leu Ser Arg Thr Val

Mutatointiseoksen käsittelyllä saadaan aikaan 12 potentiaalista (Arg45,Ser46)-egliini C-mutanttia.

Kun (Arg45,Ser46)-egliini C-DNA kloonataan vektoriin pHRil48/EcoRI/BamHI, saadaan esimerkissä 3 kuvattua tapaa noudattaen plasmidi pML147/b. Tällä plasmidilla transformoituneelle E. coli HBlOl-kannalle annetaan nimeksi E^_ coli HB101/pML147/b.

Esimerkki 6; Transformoituneiden E. coli-kantojen kasvatus

Transformoituneita E^ coli HBlOl-kantoja kasvatetaan yön yli 37°C:ssa kierrosnopeudella 250 min * 5 ml:ssa L-ravintoalustaa (ks. esimerkki 2). 1 ml tätä yön yli kasvanutta viljelmää siirretään 25 ml:aan M9-ravinto-alustaa. M9-ravintoalustan koostumus on seuraava (litraa kohti):

Na2HP04.7H20 13,25 g KH2P04 3,0 g

NaCl 0,5 g NH4C1 1,0 g

CaCl2.2H20 0,015 g

MgS04.7H20 0,25 g kasaminohappoja 2,5 g B^vitamiinia 0,0099· g glukoosia 5,0 g ampisilliinia 0,1 g

Kasvatetaan 37°C:ssa kierrosnopeudella 250 min Viljelmä saavuttaa 8-10 tunnissa korkeimman egliini C-mutanttitiitterin (määritetty ihmisen leukosyyttien elastaasiproteaasin avulla julkaisussa U. Seemiiller et ai., Hoppe.-Seyler's Z. Physiol. Chem. 358, 1105 (1977) kuvatulla menetelmällä).

96116 26

Esimerkki 7; Egliinimutanttien eristäminen ja puhdistus

Ylimäärin tuottavat Ej_ coli-solut rikotaan mekaanisesti käyttämällä apuna Dyno-Mill-laitetta. Rikkoutuneet solujätteet sentrifugoidaan Sorval-sentrifugissa (9000 min-1, 30 minuuttia).

Koska egliinimutantit ovat hyvin stabiileja happojen suhteen, voidaan suurin osa emäliuoksen vieraista proteiineista poistaa saostamalla noin 20-prosenttisella etikkahapolla: 10 ml etikkahapon 40-prosenttista vesi- liuosta pipetoidaan 10 minuutin kuluessa 100 ml:aan emä-liuosta. Saatua hapanta liuosta (pH 3,4) sekoitetaan 1 tunti jääjäähdytyksessä. Saostuneet vieraat proteiinit ja muut solunosat sentrifugoidaan pois Sorval-sentrifugissa (9000 min 1, 30 minuuttia). Emäliuosta pakkaskui-vataan yön yli Virtis-Freezemobile-laitteessa.

Kuivattu, kellertävä lyofilisaatti liuotetaan 10 ml:aan 10 mM Tris-HCl-liuosta, pH 7,8, ja s;entrifugoidaan nopeasti (Sorval SS34, 15000 min 1, 10 minuuttia), jotta liuos saadaan kirkkaaksi. Kirkas, keltainen emäliuos sijoitetaan tasapainotettuun Sephadex G-50 superfine-pyl-vääseen (Pharmacia), jonka pituus on 100 cm ja halkaisija 2,5 cm. Eluointi suoritetaan 10 mM Tris-HCl-liuok-. sella pH 7,8, korkeintaan 20 ml/h virtausnopeudella.

Eluaatin absorptiota tarkastellaan 280 nm:ssä. Kerätään 10 ml:n jakeita. Eluointidiagrammi osoittaa korkeata piikkiä (jakeet 31 - 40), joka sisältää kyseisen eg-liinimutantin. Näiden jakeiden sisältämän egliini-mutantin puhtaus varmistetaan SDS-geelielektroforeesiiia· j ja HPLC:llä. Geelielektroforeesin jälkeen on egliini mutanttien puhtausaste noin 99 %.

Puskurin poisto egliinimutanttifraktioista suoritetaan AMICON-konsentrointikennossa käyttämällä YM-2-memb-raania (MWCO 2000). Ultrasuodatuksen jälkeen näytteet pakkaskuivataan uudestaan. Näin saadaan väritön jauhe ·.: (noin 250 mg/100 ml Dyno-Mill-käsitteyä), jota säilyte- li 96116 27 tään -20°C:ssa.

Esimerkki 8: Eqliinimutanttien fysikaalis-kemiallinen karakterisointi

a. (Pro44)-egliini C

Esimerkin 7 mukaisesti puhdistetulle (Pro44)-eglii-ni C:lle suoritetaan molekyylimassan määritys FAB-MS-laitteella. Molekyyli-ionipiikki (M-H+) on kohdassa 8130,6. Näin ollen on tällä menetelmällä saatu tuote N-asetyyli-(Pro44)-egliini C (M-H+:n teoreettinen arvo 8130,07).

Egliinimutantin tryptisessä hajotuksessa syntyy 7 fragmenttia, joista vain Thr44->Pro44-mutaatiossa saatu fragmentti 4 poikkeaa vastaavista N^-asetyyli-egliini C:n fragmenteista (vrt. eurooppalainen patenttihakemus-no. 146785). Näin ollen on tämä egliinimutantti katsottava Nrf,-asetyyli-(Pro44)-egliini C:ksi.

PAGE-SDS-geelielektroforeesissa (vrt. U.K. Laemmli, Nature 227, 680 - 685 (1979)) käyttäytyy N^-asetyyli-(Pro44)-egliini C kuten N -asetyyli-egliini C.

b. (Arg45)-egliini C

Puhdistetun !Arg45)-egliini C:n molekyylimassan-määritys antaa arvon 8175,4 (M-H+). Näin ollen on nytkin kyseessä N-asetyyliyhdiste (M-H+:n teoreettinen arvo on 8175). Trypsiinillä suoritettu entsymaattinen hajotus antaa selvyyden, että kyseessä on N*-asetyyli-(Arg45)-egliini C.

PAGE-SDS-geelielektroforeesissa käyttäytyy N*-ase-; tyyli-(Arg45)-egliini C kuten N^-asetyyli-egliini C.

c. (Arg45,Ser46)-egliini C

Puhdistetun (Arg45,Ser46)-egliini C:n molekyylimas-sanmääritys antaa arvon 8148,7 (M-H+). Näin ollen on 96116 28 nytkin kyseessä N-asetyyliyhdiste (M-H+:n teoreettinen arvo 8149,1). Trypsiinillä suoritettu egliinimutantin hajotus osoittaa, että kyseessä on N -asetyyli-(Arg45,

Ser46)-egliini C-mutantti.

* PAGE-SDS-geelielektroforeesissa käyttäytyy N -ase- j tyyli-(Arg45,Ser46)-egliini C samoin kuin N -asetyyli-eg-liini C.

Esimerkki 9: Egliinimutanttien kineettinen karakteri sointi

Inhibointivakioiden määritys tapahtuu N. Braun et ai:n (Biol. Chem. Hoppe-Seyler 368, 299 - 308 (1987)) mukaan mittaamalla p-nitroaniliinin steady-statereaktio-nopeus proteaasi-inhibiittori-substraattiseoksissa. Vain inhibiittorin pitoisuutta muutetaan, p-nitroaniliinin vapautuminen piirretään 10 - 20 minuutin välillä sen jälkeen, kun OD^g^-aikakäyrä on todettu lineaariseksi.

Eri nousukulmista voidaan määrittää K^. Proteinaasit olivat ihmisen leukosyyttielastaasi (HLE), kymotrypsiini ja trypsiini. Seuraavassa taulukossa on esitetty esimerkkejä inhibiitiovakioista:

Taulukko: Inhibiitiovakioita a. HLE:

* egliini C (Arg45)-egliini C

K± (M) 7,5 x 10-11 1,1 x 10"5 b. Kymotrypsiini K±(M) 4,4 x 10~10 8 x 10'9 : c. Trypsiini K^(M) ei inhibiitiota 1,3 x 10-10

Tulokset osoittavat, että Leu45:n vaihtaminen Arg45:een antaa egliini C-mutantin, joka päinvastoin

II

96116 29 kuin luonnonegliini C on hyvin voimakas trypsiinipinhi-biittori, mutta edelleen vain heikko HLE-inhibiittori.

Esimerkki 10: (Arq45)-egliini C:n ja N^-asetyyli-(Arq45)- egliini C:n ilmentäminen hiivassa

Vektori, joka on tarkoitettu vieraan geenin ilmentämiseen hiivassa, sisältää voimakkaan, mielellään indusoitavissa olevan hiivapromoottorin ja siihen liittyvän trans-kriptionlopetussignaalin, jonka erottaa promoottorista vain yksi restriktiokohta, johon on mahdollista liittää vieras geeni. Hiivaan tarkoitettu ilmentämisvektori sisältää lisäksi DNA-sekvenssejä, jotka mahdollistavat vektorin autonomisenreplikaation ja korkean kopiolukumäärän. Tällainen sekvenssi on mielellään hiivan 2μ-ΌΝΑ. Lisäksi sisältää vektori valintamerkin hiivaa varten, joka mielellään on hiivan LEU2-geeni, sekä myös pBR322-sek-venssejä, joissa on replikoitumisen aloituskohta ja ampi-silliiniresistenssigeeni colissa tapahtuvaa monistusta varten. Tällaisia vektoreita voidaan nimittää sukkulavek-toreiksi, koska niitä voidaan käyttää sekä hiivassa että E. colissa.

Vastaavaa ilmentäisvektoria, jota voidaan käyttää hiivassa erittäin tehokkaasti, on selostettu eurooppa-laisessa patenttihakemuksessa no. 100561. Vieraan geenin ilmentäminen tapahtuu hiivan happofosfataasigeenin säädeltävän PH05-promoottorin ohjauksessa. PH05-promoot-tori, vieras geeni ja PH05-transkriptionlopetussignaali-sekvenssit sijoitettiin peräkkäisesti plasmidiin pJDB207, \ joka sisälsi hiivan 2μ-ϋΝΑ:η, hiivan LEU2-geenin, E.

colissa toimivan replikoitumisen aloituskohdan ja ampi-silliiniresistenssigeenin.

Ilmentämispalsmidi pJDB207R/PHQ5-(Arg45)EGL rakennetaan seuraavasti: a) pJDB207-vektorifaqinentin eristäminen 96116 30 6 jig plasmidia pJDB207R/IF(v-3) (EP 100561) katkaistaan täysin restriktioentsyymillä BamHI. Syntyneet DNA-fragmentit, joiden koot ovat 6,85 ke ja 1,15 ke, saos-tetaan etanolilla ja uudelleensuspendoidaan 400 pl:aan 50 mM Tris-HCl-puskuria, pH 8,0. Lisätään 4,5 yksikköä emäsfosfataasia (vasikan suolesta, Boehringer Mannheim) ja saatua seosta inkuboidaan 1 tunti 37°C:ssa. Sitten fosfataasi inaktivoidaan inkuboimalla 1,5 tuntia 65°C:ssa. Liuoksen pitoisuudeksi säädetään 150 mM NaCl ja sen jälkeen se sijoitetaan 100 μ1:η DE 52-anioninvaihtopylvääseen (Whatman), joka sitä ennen on tasapainotettu liuoksella, jossa on 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl ja 1 mM EDTA.

Kun on ensin pesty samalla puskurilla, DNA eluoidaan 400 /il:11a puskuria, jossa on 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1,5 M NaCl ja 1 mM EDTA, ja saostetaan etanolilla. Suuri 6,85 ke:n BamHI-fragmentti erotetaan pienestä fragmentista 0,6-prosenttisessa matalalla sulavassa agaroosi-geelissä, joka on tehty Tris-boraattipuskuriin, pH 8,3.

b) 534 ep:n suuruisen PHQ5-fragmentin eristäminen 10 /ig plasmidia p31/R (EP 100561) katkaistaan rest-riktioentsyymeillä EcoRI ja BamHI. Syntyneet 3 fragmenttia erotetaan 0,6-prosenttisessa matalalla sulavassa aga-·. roosigeelissä, joka on tehty Tris-boraatti-EDTA-puskuriin, pH 8,3. 534 ep:n BamHI-EcoRI-fragmentti, joka sisältää PHQ5-promoottorin sekä transkriptionaloituskohdan, eristetään.

c) 230 ep:n DNA-fragmentin eristäminen, joka sisältää . ; (Arq45)-eqliini C:n koodittavan sekvenssin 8 jig plasmidia pJB618 katkaistaan restriktioentsyy-meillä BamHI ja EcoRI. Syntyneet 2 fragmenttia erotetaan 0,6-prosenttisessa matalalla sulavassa agaroosigeelissä, joka on tehty Tris-boraatti-EDTA-puskuriin, pH 8,3. 230 ep:n fragmentti eristetään.

II

96116 31 d) DNA-fragmenttien yhteenliittäminen

Kolme kohdissa a) - c) selostettua DNA-fragmenttia, joissa on toisiaan vastaavat yli ulottuvat päät, liitetään yhteen yhteenliittämisreaktiossa. 0,1 pmol (0,45 ^ug) 6,85 ep:n suuruista BamHI-vektorifragmenttia, 0,2 pmol (70 ng) 543 ep:n suuruista EtamHI-EcoRI-PH05-promoottori-fragmenttia ja 0,2 pmol (29 ng) 230 ep:n suuruista EcoRI-BamHI-fragmenttia, joka on saatu plasmidista pJB618, liitetään yhteen. Kaikki kolme DNA-fragmenttia sisältyvät pieniin matalalla sulavan agaroosin palasiin. Kyseiset kolme agaroosipalaa yhdistetään, sulatetaan 65°C:ssa ja laimennetaan puoleen. Yhteenliittäminen suoritetaan 270 μ1:η lopullisessa tilavuudessa puskurissa, jossa on 60 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP ja 16 yksikköä T4-DNA-ligaasia (Boehringer Mannheim), inkubointiajan ollessa 16 tuntia 15°C:ssa. 10 μΐ tätä yhteenliittämisseosta lisätään 100 pl:aan kalsiumilla käsiteltyjä E. coli HBlOl-soluja.

24 transformoitunutta, ampisilliiniresistenttiä yksittäistä pesäkettä kasvatetaan erikseen LB-ravintoalus-tassa, joka sisältää 100 pg/ml ampisilliiniä. Plasmidi-DNA eristetään Holmes et al^n menetelmällä (Anal. Biochem. 114, 193 (1981)) ja analysoidaan Hindlll/EcoRI-kaksois-’ katkaisulla. 600 ep:n suuruisen EcoRI-Hindlll-fragmentin esiintyminen osoittaa, että kysessä on klooni, jossa PH05-promoottori-(Arg45)-egliini C-DNA-fragmentti sijaitsee oikeassa suunnassa ilmentämisvektorissa. Kuten on odotettavissa, sisältää 50 % klooneista insertin oikeassa suunnassa. Yksi näistä klooneista eristetään ja sille annetaan : nimeksi pJDB207R/PHO5-(Arg45)EGL.

e) Saccharomyces cerevisiae-kannan GRF18 transformointi

Hinnen et ai:n transformointimenetelmää (Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 75, 1929 (1978)) käyttäen trans-·.· formoidaan Saccharomyces cerevisiae-kannan GRF18 («., 96116 32 his3-ll, his3-15, leu2-3, ieu2-112, can‘) solut plasmidilla PJDB207R/PHO5-(Arg45)EGL. Transformoituneet solut valitaan hiivan minimiravintoalustoilla, jotka eivät sisällä leusiinia. Valitaan yksittäiset transformoituneet hiiva-pesäkkeet ja niille annetaan nimeksi Saccharornvces cere-visiae GRF18/pJDB207R/PHO5_- (Arg45 )EGL.

f) Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/PHQ5-(Arg45)-EGL:n fermentointi ja (Arg45)-egliini C:n ja N^-asetyyli-(Arg45)-egliini C;n eristäminen

Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/PHQ5-(Arg45)EGL-soluja kasvatetaan 3 litrassa minimiravinto-alustaa, jossa on 0,03 g/1 Ki^PO^, minibioreaktorissa 30°C:ssa ja solut otetaan talteen sitten, kun on saavutettu solutiheys, joka vastaa ODg^Q-arvoa 1;9.

Transformoituneet hiivasolut tuottavat (Arg45)-egliini C:tä ja N^-asetyyli-(Arg45)-egliini C:tä painosuhteessa noin 2:1. Molemmat tuotteet voidaan eristää hiivasoluho-mogenaateista samoin kuin esimerkissä 7 on selostettu E. colin kohdalla.

Esimerkki 11: Farmaseuttinen valmiste

M

Esimerkin 7 mukaisesti valmistettu, H -asetyyli-* (Arg45)-egliini C:tä sisältävä liuos dialysoidaan 0,9- prosenttista NaCl-liuosta vastaan. Liuoksen konsentraa-tio säädetään tämän jälkeen samalla NaCl-liuoksella laimentamalla arvoon 1 mg/ml tai 10 mg/ml. Nämä liuokset steriloidaan ultrasuodatuksella (membraani, jossa on 0,22 .φ μτη:η huokoset).

Steriloituja liuoksia voidaan suoraan käyttää intra-venoosiseen antoon tai jatkuvassa tiputusinfuusiossa.

Mikro-organismien talletus

Kanta E^ coli HB101/pML147 talletettiin 28. tammikuuta 1988 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen-kokoelmiin li 96116 33 (DSM), Mascheroder Weg lb, D-3300 Braunschweig, talle-tusnuraerolla DSM 4380.

Claims (10)

96116

1. Menetelmä kaavan I mukaisten proteaasi-inhibiittoriak-tiivisuutta omaavien yhdisteiden valmistamiseksi R-ThrGluPheGlySerGluLeuLysSerPheProGluValValGlyLysThrVal-AspGlnAlaArgGluTyrPheThrLeuHisTyrProGlnTyrAspVal-W-Phe-LeuProGluGlySerProVa1-X-Y-Z-LeuArgTyrAsnArgValArgVal-PheTyrAsnProGlyThrAsnValValAsnHisValProHisValGly-OH (I), jossa kaavassa R tarkoittaa vetyä tai asetyyliä, W on Tyr tai His, X on Thr, Ser tai Pro, Y on Leu, Met, Arg, Lys, Phe, Tyr tai Trp ja Z on Asp, Glu, Gin, Asn, Ala, Ser tai Thr edellyttäen, että X on muu kuin Thr, kun Y on Leu ja Z on Asp, sekä näiden yhdisteiden suolojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että kasvatetaan transformoitunutta isäntämikro-organismia, joka sisältää kaavan I mukaista yhdistettä koodittavan DNA-sekvenssin, ja eristetään kaavan I mukainen yhdiste tai sen suola.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä kaavan I mukaisten yhdisteiden ja niiden suolojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että R on asetyyli, W on Tyr ja joko X on Thr, Y on Arg tai Lys ja Z on Asp, Glu, Gin, Asn, Ala, Ser tai Thr tai X on Pro, Y on Met ja Z on Asp tai X on Thr, Y on Phe, Tyr, Trp tai Met ja Z on Asp.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä kaavan I mukaisten yhdisteiden ja niiden suolojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että R on asetyyli, W on Tyr, X on Thr, : Y on Arg ja Z on Asp tai Ser. • ·

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan Ne-asetyyli-(Arg45)-egliini C.

5. Menetelmä sellaisen DNA:n valmistamiseksi, joka sisältää patenttivaatimuksen 8 mukaisen rekombinantti-DNA- li 96116 sekvenssin, tunnettu siitä, että DNA valmistetaan kemiallisella synteesillä tai DNA:n fragmentit valmistetaan kemiallisella synteesillä ja liitetään yhteen entsymaattisesti tiettyyn järjestykseen tai egliini B:tä tai egliini C:tä koodittava DNA mutatoidaan yhdessä tai useammassa vaiheessa.

6. Menetelmä ilmentämisvektorin valmistamiseksi, joka sisältää patenttivaatimuksen 8 mukaisen, ilmentymisenoh-jaussekvenssin säätelyssä olevan rekombinantti-DNA-sek-venssin, tunnettu siitä, että vektori-DNA:han, joka sisältää ilmentymisenohjaussekvenssin, liitetään patenttivaatimuksen 8 mukainen DNA-sekvenssi siten, että ilmen-tymisenohjaussekvenssi säätelee mainittua DNA-sekvenssiä.

7. Menetelmä isäntäorganismin valmistamiseksi, joka sisältää patenttivaatimuksen 9 mukaisen ilmentämisvektorin, tunnettu siitä, että isäntäsolu transformoidaan ilmen-tämisvektorilla, joka sisältää ilmentymisenohjaussekvenssin säätelyssä olevan, kaavan I mukaista yhdistettä koodittavan DNA-sekvenssin.

8. Rekombinantti-DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se koodittaa patenttivaatimuksen 1 mukaisesti valmistettavissa olevaa kaavan I mukaista yhdistettä.

9. Ilmentämisvektori, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 1 mukaisesti valmistettavissa olevaa kaavan I mukaista yhdistettä koodittavan, ilmentymisenohjaussekvenssin säätelyssä olevan DNA-sekvenssin.

» " 10. Bakteeri tai hiiva, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 9 mukaisen ilmentämisvektorin. 96116