FI107928B - Erityskuljetin hirudiinin tai hirudiinianalogin tuottamiseksi, kyseessä olevan kuljettimen sisältävät muutetut mikro-organismit, sekä hirudiinin tai hirudiinianalogin valmistusmenetelmä - Google Patents

Description

107928

Erityskuljetin hirudiinin tai hirudiinianalogin tuottamiseksi, kyseessä olevan kuljettimen sisältävät muutetut mikro-organismit, sekä hirudiinin tai hirudiinianalogin - valmistusmenetelmä.

5 Tämä keksintö koskee vieraan proteiinin tuotantoon käytettäviä erityskuljettimia, kyseessä olevia kuljettimia sisältäviä muutettuja mikro-organismeja, sekä menetel-10 mää, jolla tuotetaan hirudiinia tai sen analogeja käyttämällä muutettuja mikro-organismeja.

Tässä keksinnössä selitetty uusi hirudiinianalogi on hyödyllinen antikoagulanttina sen korkean antitrom-15 biiniaktiivisuuden nojalla sekä sen nojalla, että sillä on vähemmän taipumusta aiheuttaa verenvuotoa verrattuna tunnettuun HVl-hirudiiniin.

Lisäksi vieraiden proteiinien, kuten tässä keksinnössä 20 selitetyn hirudiinianalogin, eritystä varten olevat . . eritysvektorit helpottavat vieraiden proteiinien, kuten • 0 * * hirudiinianalogien, teollisesti kannattavaa tuotantoa, • · · ’···* koska ne mahdollistavat korkean saannon, kun vieraita • * * » · · ' proteiineja tuotetaan solun ulkopuolelle käyttämällä • « 25 kyseessä olevilla kuljettimilla muutettua E. colia.

0 0 0 0 0 • 0 0 0 0

Hirudiini on verijuotikkaan, Hirudo medicinalis. sylkirauhasista erittyvä antikoagulaatiotekijä, ja se on 65 ja 66 aminohaposta koostuvien peptidien seos. Dodt ym. .···. 30 (FEBS Lett. 165. 180 (1984)) määrittivät hirudiinin *’* rakenteen hirudiinin muunnelmaksi 1 (HV1). Toisella muunnelmalla, HV2-hirudiinilla, (Harvey et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 83., 1084 (1986)) on yhdeksän eri aminohappoa verrattuna HVl-hirudiiniin, ja vielä toisel- ° : 35 la muunnelmalla, HV3-hirudiinilla, (Dodt et ai., Biol.

* »·

Chem. Hoppe-Seyler, 367, 803 (1986)) on kymmenen eri aminohappoa verrattuna HV2:een siten, että Ser32:een asti jakso on sama kuin HV2:lla ja C-pään alueella on ylimää- 107928 2 räinen aminohappo (Ala63) . Näiden kolmen hirudiinimuun-nelman rakenteet on esitetty kuviossa 1.

Nämä luonnossa esiintyvät muunnelmatyypit sisältävät 65 5 tai 66 aminohappoa, ja kaksi aluetta on havaittavissa. Nämä ovat pallorakenteinen N-pään alue, jossa on kolme disulfidisiltaa, sekä hapan C-pään alue, jolla on homo-logiaa protrombiinimolekyylin trombiinin pilkkomisalueen kanssa tai fibrinogeenin pilkkomisalueen kanssa.

10 Tämän keksinnön keksijät ovat havainneet, että HV1 sisältää Leu64 - Gln65:n, kun taas HV3 sisältää Asp65 -Glu66:n C-pään aminohappoalueella. HVl:n ja HV3:n synteettisten geenien valmistuksesta ja niiden ilmenemises-15 tä E. colissa on jätetty patenttihakemus (japanilainen julkiseksi tullut patenttijulkaisu 3-164184 (1991)).

HV1-, HV2- ja HV3-hirudiinimuunnelmat, joilla on anti- tromboottista aktiivisuutta, eivät ole sopivia lääkkeitä 20 kliiniseen käyttöön niiden vakavien sivuvaikutusten . . vuoksi, joihin kuuluu mm. se, että verenvuoto jatkuu • · * * kauemmin.

• * · « · · • · · • · a • · · '·** On ehdotettu useita järjestelmiä hirudiinin tuottamisek- * · ·.**: 25 si geeniteknologian avulla; kuitenkaan ei ole vielä « · :/·· kehitetty tyydyttävää menetelmää. Teollisuuden näkökul- : : ; masta solun ulkopuolinen tuotantojärjestelmä on erityi sen toivottava, koska jos tuotettu proteiini voidaan erittää solun ulkopuolelle, on siitä hyötyä ei vain .···, 30 tuotteen erottamisen ja puhdistuksen yksinkertaistama- *·* sessa, koska tuote on aktiivisessa muodossa, vaan myös • · · M.* koska tuote täten suojataan bakteerin sisällä olevien • · · proteaasien suorittamalta pilkkomiselta.

• · · • · · i · · .·.: 35 On ehdotettu menetelmiä Bacillus subtiliksen. hiivan tai • ·· E. colin käyttämiseksi isäntinä hirudiinin tuotantoon erityksen avulla.

3 107928

Menetelmät, joissa käytetään Bacillus subtilista isäntänä, ovat haitallisia, koska plasmidit ovat yleensä pysy-mättömiä näissä bakteereissa, mikä johtaa usein plasmi-din poistumiseen tästä bakteerista, mikä tekee vakaan 5 proteiinituotannon vaikeaksi, tai kasvualustaan erittyneet bakteerin omat proteaasit saattavat pilkkoa kasvualustaan erittyneet proteiinituotteet. Ehdotetut menetelmät hirudiinin tuottamiseksi (esimerkiksi japanilainen julkiseksi tullut patenttijulkaisu 2-35084 (1990)) 10 eivät ole ratkaisseet näitä ongelmia, ja saanto on vain noin 100 mg / L.

Tiedetään, että käytettäessä menetelmiä, joissa hiiva on isäntänä, karboksipeptidaasi hydrolysoi tuotteiden C-15 pään aminohappoja.

Aikaisemmassa raportissa (N. Riehl-Bellon et ai., Biochemistry 1989, 28., 2941 - 2949) on tuotu esiin sivutuotteita, jotka ovat syntyneet siten, että HV2:n C-pään 20 1 tai 2 aminohappotähdettä on hydrolysoitu pois.

• · * » • ·* Jotta tämä ongelma voitettaisiin, on ehdotettu menetel- • « # '·!·* mää, joka käyttää isäntinä hiivoja, joilta puuttuu kar- • · · *.·* boksipeptidaasi (japanilainen julkiseksi tullut patent- ϊ,*·{ 25 tijulkaisu 2-104279 (1990) ) , mutta se ei ole johtanut riittävään tuottavuuteen.

• · • · · « · · • · ·

On tiedotettu menetelmästä, jossa käytetään E. colia isäntänä sekä alkaalisen fosfataasin signaalijaksoa (J.

• » ..... 30 Dodt et ai., FEBS Lett. 202. 373 - 377 (1986)). Vaikka *!* tämä on eritysjärjestelmä, tuote eritetään kuitenkin « pääasiassa periplasmiseen tilaan ja menetelmä ei ole «»· *...: tyydyttävä, koska se vaatii bakteerisolujen hajottamisen .···. lisämenetelmävaiheen, kuten osmoottisen sokin, avulla, * · t .!. . 35 ja tuotteen saanto on niinkin alhainen kuin 4 mg / 1.

• · · • · Tämän keksinnön keksijät ovat tuottaneet eri hiru-diinianalogeja edellä mainittujen HV1-, HV2- ja HV3- 4 107928 hirudiinin primaarirakenteen perusteella, jotta niiden ominaisuuksia voitaisiin verrata eläinmalleissa. He havaitsivat, että hirudiinianalogilla (kimeerinen hiru-diini), jolla oli HVl-hirudiinin aminohapojakso 52.

5 aminohappoon asti ja sen jälkeen jakso oli korvattu HV3:n jaksolla, ei ollut vain korkea antitrombiiniaktii-visuus, vaan se myös lyhensi verenvuotoaikaa.

Lisäksi tämän keksinnön keksijät ovat aktiivisesti tut-10 kineet vieraiden proteiinien solun ulkopuolista tuotantoa saannon ollessa korkea käyttämällä E. colia isäntänä, ja he ovat täydentäneet tämän keksinnön havaitsemalla, että kun käytetään pUC-plasmidin replikaation aloituskohtaa (ori) replikaation aloituskohtana erityskul-15 jettimessa, jossa on signaalipeptidin DNA-jakso sekä promoottori, voidaan E. colista erittää vierasta proteiinia suuria määriä.

Tämä keksintö koskee siis menetelmää uuden hirudiini-20 analogin, jolla on korkea antitrombiiniaktiivisuus, valmistamiseksi.

• · • · • · • · :.i.· Tämä keksintö koskee myös DNA-jaksoa, joka koodaa hiru- • * · i.i: diinianalogin aminohappojaksoa, jolla on edellä mainittu 25 korkea antitrombiiniaktiivisuus ja alhainen verenvuoto- ·'·.· taipumus, E. colia transformoimalla tuotettuja muutettu- • * ja mikro-organismeja, joissa on kyseisen DNA-jakson sisältäviä ilmenemiskuljettimia, sekä menetelmää hiru-diinianalogien tuottamiseksi ilmentämällä kyseistä DNA- • · ... 30 jaksoa käyttämällä edellä mainittuja muutettuja mikro- “* organismeja, ja kyseessä olevan hirudiinianalogin tai- : ; : teen saamista.

·** • ·· • · • · • · · .1. Keksintöä voidaan soveltaa antikoagulanttilääkkeeseen, • · · ; . 35 jossa edellä mainittu hirudiinianalogi on vaikuttavana · · ’· *· ainesosana.

Tämän keksinnön mukaisesti saadun uuden hirudiinianalo- 5 5 107928 gin, HVlC3:n, aminohappojakso esitetään seuraavassa primäärirakenteessa:

Vai Vai Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly 15 10

Gin Asn Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn 15 20

Vai Cys Gly Gin Gly Asn Lys Cys Ile Leu 10 25 30

Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gin Cys Vai 35 40

Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gin Ser 45 50

His Asn Gin Gly Asp Phe Glu Pro Ile Pro 15 55 60

Glu Asp Ala Tyr Asp Glu 65 20 (Kaava 1) • · • · • 1 • · : Γ: Tämän analogin aminohappojaksoa koodaava tyypillinen DNA-jakso voidaan esittää seuraavalla kaavalla: ·1· : 25 • ·1 • · • · • » · • · · • · • · · • · · • · · 30 • · · • · • « · • · · • « · • · · • 1 · • · ♦ 1 • · · ··· * 1 1 '·’ ’ 35 • · • · # • · · • · 6 107928 GTT GTA TAC ACT GAT TGT ACT GAA TCT GGC 30 5 CAG AAC CTG TGT CTG TGT GAA GGA TCC AAC 60 GTT TGT GGT CAG GGT AAC AAA TGT ATC CTC 90 GGG TCT GAT GGT GAA AAG AAC CAG TGT GTT 120 10 ACT GGT GAA GGT ACC CCG AAA CCG CAG TCT 150 CAT AAC CAG GGT GAT TTC GAA CCG ATC CCG 180

GAA GAC GCG TAC GAT GAA

15

Kaavassa 1 esitetty tämän keksinnön hirudiinianalogi 20 voidaan valmistaa kemiallisesti, tai se voidaan tuottaa geeniteknologian avulla.

Jotta tuotettaisiin hirudiinianalogia geeniteknologian avulla, ensin, kuten on selitetty myöhemmässä esimerkis- • ‘.85 sä, rakennettiin HV1-hirudiinia erittävät pMTSHVl- ja pMKSHVl-plasmidit ja niitä käytettiin E. colia transfor-moi taessa. HV1-hirudiinia tuotettiin erityksen avulla käyttämällä muutettuja mikro-organismeja. Plasmidi pMTSHVl sisältää promoottorin (Ptrp), signaalipeptidiä • * /:*30 (PhoA-signaali) koodaavan DNA-jakson, HV1-hirudiinin • · · aminohappojaksoa koodaavan DNA-jakson, replikaation . . aloituskohdan (ori) sekä translaation lopetussignaalin *;./ (rrnBT^) sisältävän DNA-jakson, kuten on esitetty • · · *·[ kuviossa 3. Jotta HV1-hirudiinin 52. aminohapon jälkeen :*\35 jakso korvattaisiin HV3:n aminohappojaksolla, tässä keksinnössä pilkottiin HVl:ä erittävä pMTSHVl-plasmidi ··· .!. restriktioentsyymillä, jotta poistettaisiin HVl-hirudii-• · • · nin 52. aminohapon jälkeinen aminohappo jakso. Toisaalta » · « • · • · 7 107928 aminohappojaksoa, joka alkaa HV3:n 53. aminohapolla, koodaava DNA-jakso irrotettiin pUCHV3-ilmenemisplas-midista käyttämällä restriktioentsyymiä. HV1-hirudiinin 52. aminohappoon asti koodaavan jakson sisältävä DNA 5 pMTSHVl-plasmidista ja HV3-hirudiinin 53. aminohapolla alkavaa aminohappojaksoa koodaava DNA, joka oli saatu pUCHV3-plasmidista, liitettiin yhteen DNA-ligaasilla, jolloin saatiin pMTSHVlC3-plasmidi, joka sisältää tämän keksinnön hirudiinianalogin aminohappojaksoa koodaavan 10 DNA:n.

Plasmidi pMTSHVlC3 sisältää DNA-jakson, joka sisältää pMTSHVl-plasmidista saadun promoottorin, signaalipep-tidin ja replikaation aloituskohdan (ori), DNA-jakson, 15 joka koodaa HV1-hirudiinin 1. - 52. aminohapot sekä translaation lopetussignaalin, pUCHV3-plasmidista saadun DNA-jakson, joka koodaa HV3-hirudiinin 53. aminohapolla alkavat aminohapot ja joka liitetään edellä mainitun HVl-hirudiinin 1. - 52. aminohappoja koodaavan DNA-20 jakson ja translaation lopetussignaalin väliin.

Tämän keksinnön hirudiinianalogia tuotetaan solun sisällä ja se eritetään kasvualustaan, kun pMTSHVlC3-plasmidi on viety E. colin sisään, minkä jälkeen muutettuja • · · ‘ .*25 mikro-organismeja on viljelty.

• · · « « · ·*· • · · : Tässä keksinnössä hirudiinianalogi erotettiin yleisesti :\i tunnettujen menetelmien avulla, ja puhdistettiin pyl- ;*·.· väskromatografian, käänteisfaasi-HPLC:n jne. menetelmien • · :*:*;30 avulla.

... . Saadulla hirudiinianalogilla oli korkeampi antitrom-• · · I..* biiniaktiivisuus ja alhaisempi verenvuo to taipumus ver-• · · *. rattuna HVl-hirudiiniin eläinmallissa. Se voidaan for- : *»·35 muloida erinomaiseksi antikoagulanttilääkkeeksi valrais- tantalla se yleisesti tunnetuilla formulaatioraenetelmil- ..... lä. Toisin sanoen tämän keksinnön hirudiinianalogia « · voidaan edelleen valmistaa millä tahansa yleisellä • · • · 8 107928 menetelmällä käyttämällä mitä tahansa yleisiä kantajia lääkekäyttöön tai lisäaineita forraulaatioon. Lääkekoos-tumus annetaan laskimonsisäisesti, ihonsisäisesti, ihonalaisesti tai lihaksensisäisesti tai ulkonaisesti 5 eli ei suun kautta. Vaikka oikea annos määritetään jokaisessa tapauksessa erikseen ottaen huomioon tekijöitä, kuten potilaan oireet, ikä ja sukupuoli, se on yleensä 0,1 mg*.n ja 100 mg*.n rajoissa aikuiselle päivässä, ja kokonaismäärä annetaan yhtenä tai useampana 10 annoksena.

Kuten aikaisemmin on selitetty, tämä keksintö koskee myös lisäksi erityskuljettimia vieraan proteiinin tuotantoa varten, erityisesti erityskuljetinta, jonka 15 avulla saadaan tuotettua solun ulkopuolelle paljon hirudiinia tai sen analogia.

Tämä keksintö koskee myös hirudiinia tai sen analogeja koodaavia DNA-jaksoja sisältäviä erityskuljettimia, 20 kyseessä olevilla erityskuljettimilla transformoituja mikro-organismeja (E. coli), ja menetelmiä hirudiinin tai sen analogien valmistamiseksi viljelemällä kyseessä olevia transformoituja mikro-organismeja sekä tuotteen , . saamista elatusaineesta.

• * » ί -S5 Tämän keksinnön vierasta proteiinia erittävä kuljetin «·· V * sisältää pUC-plasmidista saadun replikaation aloituskoh-• · I/·· dan (ori), tac-promoottorin tai trp-promoottorin, sig- :'\j naalipeptidijakson sekä vierasta proteiinia koodaavan :·:·}30 DNA-jakson.

.·. : Tässä keksinnössä pUC-plasmidin replikaation aloituskoh- • «1 dan (ori) sisältävä DNA-kappale voidaan valmistaa pilk- > i · komalla kaupallisesti saatavilla olevia pUC-perheen • · i ***35 plasmideja, esimerkiksi pUC9:ää, pUC18:aa tai pUC19:ää, J...: sopivien restriktioentsyymien yhdistelmillä. Esimerkiksi .·*·. pilkkpmalla pUC18:aa Pvu I -, tai Pvu I - sekä Pvu II -• » restriktioentsyymeillä valmistetaan replikaation aloi- • 4 • · 9 107928 tuskohta (ori), jonka sisältävää noin 1440 emäsparin DNA-kappaletta voidaan käyttää replikaation aloituskohtana tämän keksinnön plasmideissa.

5 Tämän keksinnön tae-promoottorin ja trp-promoottorin nukleotidijakso on esitetty kuvioissa 7 ja 8 vastaavasti ja ne voidaan helposti valmistaa DNA-syntetisaattorilla jne. Siksi nämä promoottorit voidaan valmistaa ja liittää pUC18-plasmidin replikaation aloituskohdan (ori) 10 sisältäviin kappaleisiin. Vaihtoehtoisesti ne voidaan valmistaa suhteellisen helposti liittämällä DNA-kap-paleita, jotka on valmistettu pilkkomalla kaupallisesti saatavilla olevia plasmideja restriktioentsyymeillä. Esimerkiksi pMK2-plasmidi voidaan valmistaa käyttämällä 15 T4 DNA -ligaasia liitettäessä tac-promoottorin, joka on saatu pilkkomalla kaupallisesti saatavilla oleva pKK223-3-plasraidi (Pharmacia) Pvu I - ja Nru I -restriktioentsyymeillä, DNA-jakson sisältävät DNA-kappaleet ja DNA-kappale, joka sisältää replikaation aloituskohdan (ori), 20 joka on saatu pilkkomalla kaupallisesti saatavilla oleva pUC18-plasmidi Pvu I - ja Pvu II -restriktioentsyymeillä .

Plasmidi pMTl voidaan valmistaa poistamalla tac-promoot- f 9 : 1.fc5 torin DNA-jakson sisältävä kappale pilkkomalla yllämai-nittu pMK2-plasmidi Eco Rl - ja Eco47III-restriktioent-:T: syymeillä ja sitten liittämällä DNA-syntetisaattorilla valmistetun trp-promoottorijakson sisältävä kappale.

♦ · ♦ · * ♦ « • ·· « · .2:130 Tämän keksinnön signaalipeptidien DNA-jaksona voidaan käyttää DNA-jaksoja, jotka koodaavat E. colin periplas-. . massa sijaitsevia signaalipeptidejä, esimerkiksi entsyymi2 mejä, kuten alkaalista fosfataasia (pho A) ja B-lak- « i · *\ 1 tamaasia (bla), tai ulkokalvoproteiineja, kuten OmpA:ta, Γ\35 OmpB:tä ja OmpFtää. Nämä DNA-kappaleet voidaan valmistaa helposti käyttämällä DNA-syntetisaattoria.

··· · 2 ,3 Vaikka mikä tahansa proteiini voi olla tämän keksinnön • · · 3 • · 10 107928 käsittämä vieras proteiini, ovat hirudiini ja sen muune-lmat erityisen sopivia. Näiden proteiinien aminohap-pojaksot on esitetty kuviossa 1 HV1-, HV2-, HV3- ja HV1C3-hirudiineina.

5

Kuvio 1 esittää HV1-, HV2-, HV3- ja HV1C3-hirudiinin aminohappojakson.

Kuvio 2 esittää pho A -slgnaalipeptidin DNA-jakson.

10

Kuvio 3 esittää HV1-hirudiinia erittävän pMTSHVl-plas-midin rakenteen luonnoksen.

Kuvio 4 esittää pMKSHVl-plasmidin rakenteen luonnoksen. 15

Kuvio 5 esittää HV1C3-hirudiinia erittävän pMTSHVlC3-plasmidin rakenteen luonnoksen.

Kuvion 6 A-kohta esittää HV1-hirudiinin C4-käänteis-20 faasi-HPLC-kaavakuvan; B-kohta esittää vastaavasti HV1C3-hirudiinin C4-käänteisfaasi-HPLC-kaavakuvan.

Kuvio 7 esittää tässä keksinnössä käytetyn tac-promoot-torin DNA-jakson.

I 725 f,·,* Kuvio 8 esittää tässä keksinnössä käytetyn trp-promoot- :T: torin DNA-jakson.

• · I « ·

« M

;\i Kuvio 9 esittää HV3-hirudiinia erittävän pMTSHV3-plas- /:\30 midin rakenteen luonnoksen.

• i · ^ . Kuvio 10 esittää esimerkissä 5 käytetyn HV3-hirudiinin eritystä varten olevan Pho A -slgnaalipeptidin DNA-*·;'' jakson.

Γ\.35 ♦ »***j Kuvio 11 esittää puhdistetun HV3-hirudiinin kaavakuvan s »· .I. C4-käänteisfaasi-HPLCsn avulla.

a · • · ··· ♦ a · • a · » · a · 11 107928

Menetelmät pUCHVl-, pMTl- ja pMK2-plasmidien, joita käytetään rakennettaessa pMTSHVl:stä tai pMKSHVl:stä tässä keksinnössä käytettyjä HVl:tä erittäviä eritys-plasmideja, sekä pUCHV3-plasmidin, jota käytetään raken-5 nettaessa pMTSHVlC3-plasmidi, rakentamiseksi on annettu seuraavissa viite-esimerkeissä.

[Viite-esimerkki 1] 10 pUCHVl-plasmidin ia PUCHV3-plasmldln valmistus.

10 μ? kaupallisesti saatavilla olevaa pUC18-plasmidia pilkottiin 30 yksiköllä EcoRItä ja 30 yksiköllä Hindulta 37° C: ssa 2 tuntia. Uuttamisen jälkeen kul-15 jetinosa erotettiin agaroosigeelielektroforeesin avulla. Proteiinit poistettiin uuttamalla fenolilla; DNA saos-tettiin kylmällä etanolilla ja liuotettiin 50 μΐ TE-pus-kuriliuosta (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA). Tähän liuosmäärään, jonka pitäisi sisältää 50 ng DNA:ta, 10 μΐ 20 66 mM Tris-HCltää, pH 7,5, 5 mM MgCl2:a, 5 mM DTTstä, 1 mM ATPttä ja 300 yksikköä T4 DNA-ligaasia, lisättiin kaksijuosteista HV1- tai HV3-DNA:ta, minkä jälkeen reaktion annettiin tapahtua yön yli 16°C:ssa, jotta : Λ saataisiin aikaan pUCHVl- tai pUCHV3-plasmidi, joihin on : :*J15 lisätty HVl-geeni tai HV3-geeni vastaavasti pUC18-plas- midin EcoRI- ja Hindlll-kohtien väliin.

• · • · * .·. · [Viite-esimerkki 2] • · ti« • · · *** 30 pMK2-Plasmidin 1a oMTl-plasmidin valmistus ♦ · *. (a) PMK2-plasmidin valmistus «·· « · ♦ ♦ · ♦ »

Tae-promoottorin sisältävä kappale, joka oli saatu • .*••35 pilkkomalla kaupallisesti saatavilla oleva pKK223-3- plasmidi (Pharmacia) Pvu I - ja Nru I -restriktioentsyy- • ♦ [···* meillä, replikaation aloituskohdan (ori) sisältävä : V kappale, joka oli saatu pilkkomalla kaupallisesti saata- 12 107928 villa oleva pUC18 Pvu I- ja Pvu II -restriktioentsyy-meillä, sekä ampisilliinivastustuskykygeenin sisältävä kappale liitettiin yhteen käyttämällä T4 DNA -ligaasia. Täten saatu kappale liitettiin E. colin JM109iään, minkä 5 jälkeen viljeltiin, seulottiin ampisilliinivastustuskyky sekä saatiin kuljetin, jossa oli sekä tae-promoottori että pUC18:n replikaation aloituskohta (ori) ja joka nimettiin pMK2:ksi.

10 (b) pMTl-plasmidin valmistus 10 μς pMK2-plasmidia pilkottiin 30 yksiköllä EcoRIiä ja Eco47III:a, jolloin poistettiin tac-promoottorin sisältävä kappale, ja sitten saatiin talteen replikaation 15 aloituskohdan (ori) sisältävä kappale agaroosigeelielek-troforeesin avulla. Trp-promoottorin sisältävä DNA-kappale valmistettiin DNA-syntetisaattorin avulla. Tämä kappale liitettiin yhteen käyttämällä T4 DNA -ligaasia 16°C:ssa yön yli edellä mainitun kappaleen kanssa, joka 20 oli saatu aikaan pilkkomalla pMK2 EcoRIsllä ja

Eco47III:11a. Ligaatiotuotteita käytettiin E. coli JM109:n transformoimiseen valmistettaessa kuljetin, jolla oli sekä trp-promoottori että pMK2-plasmidin • ♦ • 1.1 replikaation aloituskohta (ori). Tämän plasmidin DNA- :j125 jakso varmistettiin Sangerin ym. menetelmällä ja se nimettiin pMTltksi.

• ♦ • · 1 • · ♦ • · .·. : Tämä keksintö esitetään yksityiskohtaisesti alempana • · · I..’ seuraavan esimerkin avulla.

!': 30 . . [Esimerkki 1] • · · • ♦ ♦ • · ♦ · ♦ *\ ’ (1) HV1-hirudiinia erittävän pMTSHVI-plasmidin raken- tautinen r1?5 • · · y..' Plasmidi pMTSHVI rakennettiin kuviossa 3 esitetyn mene-• · .·“ telmän mukaan. Valmistettiin neljä kuviossa 2 osoitettua • · · ·1 oligonukleotidia, jotta rakennettaisiin E. colin alkaa- 13 107928 lisen fosfataasin (pho A) signaalipeptidiä vastaava DNA-kappale sekä HV1-hirudiinin N-pään aminohapon Val1-Val2:a koodaava DNA-kappale. Suojauksen poiston jälkeen jokainen oligonukleotidi puhdistettiin 10% polyakryyliamidi-5 geelielektroforeesin avulla.

Sen jälkeen, kun 500 pmol sekä S2- että S4-oligonuk-leotidia oli fosforyloitu, 20 pmol jokaista 4 oligonuk-leotidia sekoitettiin, yhdistettiin ja sitten käsitel-10 tiin 16°C:ssa yön yli 20 μΐ liuosta, joka sisälsi T4:n DNA-ligaasia. Kun proteiini oli poistettu käyttämällä fenolia ja kloroformia ja kun oli saostettu kylmällä etanolilla, saatiin haluttu kaksijuosteinen DNA-kappale. 1/10 saadusta kappaleesta ja 100 ng pUCHVl-plasmidia 15 (japanilainen julkiseksi tullut patenttijulkaisu 3-164184 (1991)), joka oli pilkottu EcoRI- ja Accl-re-striktioentsyymeillä, annettiin reagoida T4:n DNA-ligaa-sin kanssa 16°C:ssa yön yli. Fuusiogeenin, jossa HV1-hirudiinia koodaava DNA-jakso on liitetty heti phoA-20 signaalipeptidiä koodaavan jakson jälkeen, sisältävä pSHVl-hybridiplasmidi saatiin transformoimalla E. coli JM109. Tämän pSHVl-plasmidin DNA-jakso varmistettiin Sangerin ym. menetelmällä.

» · • · · • · • · : ;*j25 10 μg pSHVl :tä pilkottiin EcoRI- (30 yksikköä) ja Hin- ·«· dill-restriktioentsyymeillä (30 yksikköä), ja 276 bp .·. : fuusioitu geenikappale puhdistettiin agaroosigeelielek- • · · · troforeesin avulla.

• · · • · • · · • · · • 30 100 ng saatua DNA-kappaletta ja 100 ng DNA:ta, joka oli valmistettu pilkkomalla E. colln pMTl-ilmenemisvektoria • · · ***: (japanilainen julkiseksi tullut patenttijulkaisu 3-76579 ‘ (1991)) EcoRI- ja Hindlll-restriktioentsyymeillä ja tämän jälkeen puhdistamalla DNA-kappaleet agaroosigeeli- .*•*35 elektroforeesin avulla, liitettiin yhteen käyttämällä t;g T4:n DNA-ligaasia 16°C:ssa yön yli. Tulokseksi saatua • · *...· reaktioseosta käytettiin E. coli JM109:n transforraoimi-• · · : seksi, jotta saataisiin HV1-hirudiinia erittävä pMTSHVl- 14 107928 plasmidi, jossa phoA-signaalipeptidiä ja HV1-hlrudiinia koodaava fuusiogeeni seuraa trp-promoottorialuetta. pMTSHVl:n DNA-jakso varmistettiin Sangerin ym. menetelmällä .

5 (2) HV1-hirudlinia erittävän pMKSHVl-plasmidln rakentaminen pMKSHVl-plasmidi rakennettiin kuviossa 4 esitetyn mene-10 telmän mukaan.

PhoA-signaalipeptidiä ja HV1-hirudiinia koodaava edellä mainittu fuusioitu DNA sekä EcoRI- ja Hindlll-restrik-tioentsyymeillä E. colln pMK2-ilmenemisplasmidia (japa-15 nilainen julkiseksi tullut patenttijulkaisu 3-76579 (1991)) pilkkomalla saatu DNA-kappale liitettiin yhteen käyttämällä T4s n DNA-ligaasia; llgaatiotuotteita käytettiin E. coli JM109:n transformoimiseen, ja saatiin HV1-hirudiinia erittävä pMKSHVl-plasmidi, johon oli liitetty 20 fuusiogeeni 3'-suuntaan tac-promoottorista. pMKSHVl- plasmidin DNA-jakso varmistettiin Sangerin ym. menetelmällä.

: (3) HV1-hirudiinin erltvstuotanto pMTSHVltn avulla : :*£5 ···

Yllä olevissa kohdissa (1) ja (2) rakennetuilla pMTSHVl-: tai pMKSHVl-plasraideilla transformoitua E. coli JM109:ää m · · · viljeltiin 2 x YT-elatusaineessa (16 g/1 Bacto-tryp-• · · I./ töniä, 10 g/1 Bacto-hiivauutetta ja 5 g/1 NaCl), joka 30 sisälsi 100 μς/ιαΐ ampisilliiniä. Kun oli viljelty . . 37°C:ssa 24 tuntia, kerättiin 1 ml viljelmäelatusainet-# · · • · · * • · ta.

··· • · · ♦ ♦ »

Jokaisen näytteen saostetut solut suspendoitiin 1 ml 50 .*••35 mM Tris-HCl:ää (pH 7,5), joka sisälsi 25% sukroosia ja 1

»M

.·, mM EDTAsta, jonka jälkeen inkuboitiin huoneenlämmössä 10 • · [···* minuuttia. Kun solut oli kerätty sentrifugoimalla 6 000 ϊ ·* x g 10 minuuttia, solut suspendoitiin 1 ml kylmää vettä, 15 107928 jotta aineet vapautuisivat periplasmiseen tilaan osmoottisen shokin avulla. Solut poistettiin periplasmisesta fraktiosta sentrifugoimalla 6 000 x g 10 minuuttia. Eritetyn ja periplasmiseen tilaan kerääntyneen hirudii-5 nin määrä määritettiin mittaamalla antitrombiiniaktiivi-suus supernatantista. Antitrombiiniaktiivisuus perustuu väri-intensiteetin, jonka trombiinin hydrolyyttinen aktiivisuus synteettisellä väriä synnyttävällä kromot-syymiTH-substraatilla (Tosylglysilprolylarginiini-4-10 nitroanilideasetaatti, Boeringer-Mannheim) on saanut aikaan, kvantitatiiviseen määrittämiseen sekä hirudiinin trombiinia ehkäisevään aktiivisuuteen, joka estää värin syntymistä.

15 Tämä reaktio toteutettiin seuraavasti. 1 mltssa kyseessä olevaa reaktiotilavuutta lisättiin 0,36 NIH U ihmisen trombiinia (Sigma) puskuriin, joka sisälsi 100 mM Tris-HC1 (pH 8,5), 150 mM NaCl ja 0,1% 6000-polyetyleenigly- kolia, minkä jälkeen lisättiin vakiohirudiinia tai 20 tuntematonta näytettä, ja sen jälkeen esi-inkuboitiin 37°C:ssa 3 minuuttia.

Sekä substraatti että kromotsyymiTH lisättiin lopul- • · • V liseen 200 μΜ konsentraatioon, jotta mitattaisiin p- :,;[i25 nitroanilidin vapautuminen, mikä ilmenee liuoksen absor- banssin nousuna 405 nm:ssä 1 minuutissa. Lisäksi lasket-tiin antitrombiiniaktiivisuus (ATU) .

• · • · • · · • · · .···[ Tuloksesta selvisi, että pMTSHVl-plasmidin sisältävän • · » 30 kannan antitrombiiniaktiivisuus oli 450 ATU 1 ml:ssa . , viljelmäelatusainetta. pMKSHVl-plasmidin sisältävän • » · ’·kannan antitrombiiniaktiivisuus oli 360 ATU 1 ml:ssa • · · *.* * viljelmäelatusainetta. Taulukossa 1 on esitetty lisätut- kimusten tulokset eri E. coli -kantojen, kuten JMlOltn, .“*35 JM103:n, JM109:n, TG1:n, HB101:n, JA221:n, IP03301:n, • · · C600:n, RR1:n ja DH5:n, joihin oli transformoitu • · !*··* pMTSHVl-plasmidi Hanahanin ym. menetelmällä, hirudiinin • « · • ·* tuotannosta.

16 107928

Kun RRlstä käytettiin isäntänä, tuotettiin solun ulkopuolelle noin 2000 ATU/ml HVlrtä.

Taulukko 1.

5

Bakteeri- A660nm Aktiivisuus Tuotetun HVl:n lajit (ATU/ml) aktiivisuus (ATU/ml/A660nm) 10_________ JM101 4.12 256.4 62.2 JM103 4.12 306.7 74.4 JM109 3.06 450.5 147 2 TG1 5.77 185.2 32.1 HB101 3.76 99.0 26 3 is JA221 5.72 413.2 72.2 IFO3301 2.61 148.1 56 8 C600 4.02 526.3 130.9 RR1 7.23 2000.0 276.6 DH5 7.00 10.6 1.5 20 ~ ~ --- (4) Transformoidun E. coli JM109/PMTSHV1tn HVl-hirudii- ί nin eritys villelmäelatusaineeseen : :'25 «··

Kun pMTSHVl-plasmidi transformoitiin E. coli JM109- A : kantaan (E. coli JM109/pMTSHVl) (FERM BP-3266) ja kun • · · A1 kantaa kasvatettiin 2 ltssa 2 x YT-viljelmäelatusainet-• ·· ta, joka sisälsi 2% glukoosia, 5 l:n fermentorissa * 30 sekoittaen ja ilmastaen 37°C:ssa 24 tuntia, tuotettiin solun ulkopuolelle noin 5300 ATU 1 ml:ssa HVl-hirudii- • · · *· **· nia.

··· ♦ · · # · · (5) HVl-hirudiinin puhdistaminen viHelmäelatusaineista ;-?5 «··

Fermentaation jälkeen kerättiin 1,5 1 viljelmäelatusai- • · *···1 netta, ja sentrifugoitiin 6 000 x g 10 minuuttia, jotta ·1 erotettaisiin supernatantti soluriekaleista. Koska 17 107928 supernatantin suolakonsentraatio oli suolainittarilla mitattaessa 1,3%, laimennettiin supernatantti nelinkertaisesti 10 mM kaliumfosfaattipuskurilla (pH 7,0) ja suodatettiin 3,2 μπι suodattimen (Pole Co. Ltd) läpi.

5 Suodattimen läpi tullut liuos laitettiin 10 mM kalium-fosfaattipuskurilla (pH 7,0) tasapainotetun QAE-toyo-helmipylvään päälle (4,4 x 7 cm). Kun näyte oli laitettu pylvään päälle, tasapainotettiin pylväs puskurissa, minkä jälkeen HV1-hirudiini eluoitiin vähitellen 0,2 M 10 NaClslla. Eluoitu liuos konsentroitiin käyttämällä

Amicon Diaflow -kalvoa (YM5), minkä jälkeen suodatettiin 10 mM kaliumfosfaattipuskurilla (pH 7,0) etukäteen tasapainotetun Sephacryl S-100HR -suodattimen läpi, jotta poistettaisiin suola.

15

Aktiiviset fraktiot laitettiin DEAE-toyo-helmipyivään (4,4 x 40 cm) päälle, joka oli tasapainotettu 10 mM kaliumfosfaattipuskurilla (pH 7,0), pestiin perin pohjin, ja sitten eluoitiin lineaarigradientilla, joka oli 20 saatu aikaan 3 1 tasapainotuspuskurin ja tasapainotus-puskurissa olevan 3 1 0,3 M NaCltn välille. Lopullinen puhdistus toteutettiin C4-käänteisfaasi-HPLC-pylväällä Delta-prep-3000s n kanssa, joka on Watersin tuote. Puh-j distettu HV1-hirudiini saatiin eluoimalla se pylväästä ; :*^5 käyttämällä 0,065% (v/v) trifluoroasetaattia sisältävän «·· asetonitriilin 15:stä 30?een % (v/v) olevaa lineaarista * .·, ; gradienttia.

• «i * · 4 · « · ·

• M

Puhdistusaste joka vaiheessa on esitetty taulukossa 2.

• · « • 30 4 4 4 4 4 • aa a · *·* • a · • · a a * · • · a a a aa • • aa • · 4 4 444 4 444 a · a · taa aa· • a a a a a a 18 107928

Taulukko 2.

Puhdistusaste Kokonaisproteiini (mg) Kokonaisak- tiivisuus 5 (ATU) viljelmäelatusaine 13680 6030297 QAE-toyo-helmi 1324 6132812 S-100HR 872 6162156 10 DEAE-toyo-helmi 821 6080019 C4RP-HPLC 570 4675211

Suhteellinen 15 aktiivisuus saanto (%) (ATU/mg) 441 100 4630 101,7 20 7066 102,2 7407 100,8 8202 77,5 4 · * 1 · • ·

« I

:#i’#5 Täten saadun HV1-hirudiinin aminohappokoostumus vastasi {1»1· luonnollisen HV1-hirudiinin arvoa, kuten on esitetty » : taulukossa 3. Puhdistetun HV1-hirudiinin N-pään amino- a · ,·, : happojakso alkoi Vai-Val-Tyrsllä, kuten on esitetty • ta .··»] taulukossa 4, mikä osoitti, että phoA-signaalipeptidin 1 i i 30 pilkkominen oli tapahtunut oikein. Antitrombiiniaktiivi-. . suus oli 8202ATU/mg.

• t · 9 M • · • a· • 1 1 • a a • aa « i • M t ··· • 1 • · • aa a • aa • a • · • •a a a • a a a

Taulukko 3 19 107928 HV1 HV1C3 5 _ ASX 9,00 9,95

Thr 3,86 3,84

Ser 3,70 3,67

Glx 13,78 12,65 10 Gly 8,89 8,86

Ala 0,00 1,06

Cys 5,40 5,40

Vai 2,94 2,92

Met 0,00 0,00 15 Ile 1,89 1,86

Leu 4,04 3,01

Tyr 2,06 2,06

Phe 1,00 1,00

His 1,13 1,11 20 Lys 3,02 3,02

Arg 0,00 0,00

Pro 3,05 4,09 9 9 9 9 9 9 9 9 · • • · · • · · • · · • · · • · · • · · • · • · · • · · • 9 9 · • · · • · 9 9 9 9 99 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 99 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 99 99 9 9 9 9 9 9 9 9 20 107928

Taulukko 4

Kierrosnumero Aminohappo Saanto (pmol) I Vai 310 5 2 Vai 490 3 Tyr 189 4 Thr 138 5 Asp 42 6 Cys 10 7 Thr 44 8 Glu 99 9 Ser 436 10 Gly 205 II Gin 131 15 12 Asn 66 13 Leu 148 14 Cys 15 Leu 174 20 (6) Klmeeristä HVlC3-hirudiinla erittävän PMTSHV1C3-olasmidin valmistaminen • · : pMTSHVlC3-plasmidi rakennettiin kuviossa 5 selitetyn •*.•.25 menetelmän mukaan. Jotta HVl-hirudiini korvattaisiin 52.

:T: aminohapon jälkeen HV3:n jaksolla, pilkottiin HVlstä erittävä pMTSHVl-plasmidi (10 pg) Κρη I - (30 yksikköä) • · ·’·.; ja Hind III - (30 yksikköä) restriktioentsyymeillä, • · minkä jälkeen DNA ajettiin agaroosigeelielektroforeesis- 30 sa, jotta puhdistettaisiin 2,8 Kbp DNA-kappale.

• · • · · ;..* Samoin 10 μg pUCHV3-plasmidia (japanilainen julkiseksi

• I I

\* * tullut patenttijulkaisu 3-164184 (1991)) pilkottiin myös : *.· Kpn I:llä ja Hind 111:11a, ja HV3:n C-pään aminohap- :"*:35 pojaksoa koodaava 80 bp DNA-kappale puhdistettiin.

• · · • · • · ZV'.' 100 ng molempia DNA-kappaleita annettiin reagoida T4:n * · * * DNA-ligaasin kanssa 16°C.*ssa yön yli, ja tulokseksi 21 107928 saatua reaktioseosta käytettiin E. coli JM109:ää transformoitaessa, jotta saataisiin kimeeristä HVlC3:a erittävä pMTSHVlC3-plasmidi. pMTSHVlC3-plasmidin DNA-jakso varmistettiin Sangerin ym. menetelmän avulla.

5 (7) Klmeerlsen HV1C3-hirudlinin tuotanto erityksen avulla käyttämällä hirudiinia erittävää PMTSHV1C3-plas-midia 10 Yllä olevassa kohdassa (6) rakennetulla pMTSHVlC3-plas-midilla transformoitua E. coli RRlstä (FERM BP-3130) viljeltiin 2 x YT-elatusaineessa, joka sisälsi 100 μ9/πι1 ampisilliinia. Kun oli viljelty 37°Csssa 24 tuntia, kerättiin 1 ml viljelmäelatusainetta, ja aiheutettiin 15 osmoottinen shokki, jotta mitattaisiin periplasmisen fraktion antitrombiiniaktiivisuus.

Tulokseksi havaittiin viljelmäelatusaineen antitrom-biiniaktiivisudeksi 3060 ATU 1 ralsssa.

20 (8) Transformoidun E. coli JM109/PMTSHV1C3-kannan kimee-risen HVlC3-hirudiinin eritys fermentaatlonesteeseen tai vlHelmäelatusaineeseen • · • · · • · • · : :*£5 Kun pMTSHVlC3-plasmidilla transformoitua E. coli JM109: ää (FERM BP3104) viljeltiin 2 12% glukoosia .·. : sisältävässä 2 x YT-viljelmäelatusaineessa 5 1 fermen- • · · j torissa sekoittaen ja ilmastaen 37°C:ssa 24 tuntia, • · · l..' havaittiin 6050 ATU/ml:n antitrombiiniaktiivisuus, 350 • · · * *30 ATU/ral periplasmassa ja 5700 ATU/ml viljelmäelatusai- neessa.

• · • · · • ·« • · • · · : (9) Kimeerisen HVlC3-hirudiinin puhdistaminen • · • · • · · .”*35 HVlC3-hirudiini puhdistettiin yllä olevassa kohdassa (8) • · · saadusta viljelmäelatusaineesta yllä olevan kohdan (5) • · '···' menetelmän mukaan. Kun puhdistetun kimeerisen HV1C3-• · · : .* hirudiinin aminohappojakso määritettiin, varmistettiin 22 107928 C-pään aminohappojakso erilaiseksi kuin HVlsn, kuten oli suunniteltukin ja kuten on esitetty kuviossa 1. Spesifinen aktiivisuus oli 11,250 ATU/mg. Puhdistetun HVlsn ja HV1C3:n HPLC-kaavakuvat on esitetty kuviossa 6. Koe 5 toteutettiin VYDAC C4 (0,46 x 25 cm) -kolonnilla käyttämällä asetonitriilin 15:stä 30seen % lineaarista gradienttia virtausnopeuden ollessa 1 ml/min 30 minuutin ajan.

10 [Esimerkki 2]

Hirudiinin estävä toiminta trombiinin aiheuttamaa kuolemaa vastaan 15 Trombiini (10 NIH-yksikköä / 10 g) annettiin laskimonsisäisesti koirashiirille (20 - 25 g) ilman nukutusta ja arvioitiin analysoidun yhdisteen antitrorabiiniaktiivi-suus tarkkailemalla kierähtämisheijasteen häviämistä ja kuolemaa. Kaikki analysoidut yhdisteet liuotettiin suo-20 laan ja 0,05 ml/10 g annettiin laskimonsisäisesti 5 minuuttia ennen trombiinin ruiskuttamista. Tulokset on esitetty taulukossa 5.

• · • *#: Taulukko 5. Hirudiinin estävä toiminta trombiinin al- : :*25 heuttamaa kuolemaa vastaan • · · • · · • · · —- — - —- -- --· --- - —-

Analysoitu yhdiste Annettu määrä Pistemäärä* .·. : (|ig/10g paino) • · · ···* Trombiini + suola 1,7 • · · » V 30 (10 NIH-yksikköä/ . . lOg paino) • · · '· Trombiini + HV1 100 1,3 : (10 NIH-yksikköä/ 200 0,6 10 g paino) 500 0,4 .••*.05 Trombiini + HV1C3 20 1,2 (10 NIH-yksikköä/ 50 0,6 • « j·;’ 10 g paino) 100 0,4 • » · • · • · 23 107928 ♦Pistemäärä pistemäärä 0: kierähtämisheijaste ei hävinnyt (ilmeisesti normaali) pistemäärä 1: kierähtämisheijaste hävinnyt, mutta 5 eläin ei kuole 20 minuutissa pistemäärä 2: kuolema 20 minuutissa.

Kuten taulukosta selviää, tämän keksinnön kimeerinen hirudiini (HV1C3) esti 4-5 kertaa enemmän trombiinin 10 aiheuttamaa kuolemaa in vivo verrattuna HV1-hirudiiniin.

[Esimerkki 3]

Verenvuodon pidentäminen 15 Näytteet ruiskutettiin nukutettujen koirashiirien (20 - 25 g) häntälaskimoon käyttämällä natriumpentobarbitaalla (40 mg/kg i.p.). Pistohaava tehtiin 216-neulalla (ulko- läpimitta 0,85 mm) häntälaskimon toiselle puolelle 5 20 minuuttia analysoitavien yhdisteiden antamisen jälkeen, ja mitattiin, kuinka kauan haavasta vuoti verta. Haavan päälle laitettiin suodatinpaperi, joka vaihdettiin 15 sekunnin välein. Verenvuotoon kuluva aika määritettiin : ajaksi, joka vaadittiin siihen, ettei suodatinpaperille : :125 enää tullut punaista tahraa. Tulokset on esitetty taulu-··· :1·1: kossa 6.

• · • · · • · · • · : Taulukko 6. Verenvuotoon kuluvan alan pidentyminen • · ·

Analysoitu yhdiste Annettu määrä Verenvuotoaika • · · 30 ^g/10g paino) (s) * · -- ------ ------ - *· 1; Suola 148,5 + 14,6 : HV1 20 223,7 ± 15,6 · · 50 376,7 ± 20,2 • :1··?5 100 501,7 ± 47, 1 !:! HV1C3 50 264,0 ± 17,6 • ♦ 100 291,0 ± 30,2 • · · 1 1 200 369,0 ±34,9 24 107928

Verenvuotoon kuluvan ajan pidentyminen on yleensä yksi antikoagulanttien sivuvaikutuksista. Tässä vahvistettiin selvästi todeksi, että tämän keksinnön kimeerinen hiru-diini (HV1C3) aiheutti vähemmän verenvuotoa kuin HV1-5 hirudiini.

[Esimerkki 4]

Kimeeristä HV1C3-hirudiinia ainesosana sisältävä val-10 miste

Esimerkin 1 - (9) puhdistetusta kimeerisestä HV1C3-hirudiinista poistettiin suola käyttämällä Sephadex G25:tä (Pharmacia), minkä jälkeen suodatettiin 0,22 pm 15 suodattimen läpi steriileissä olosuhteissa. Liuos jaettiin pieniin lääkepulloihin ja lyofilisoitiin. Täten saatu lyofilisoitu kimeerisen HV1C3-hirudiinin jauhe voidaan liuottaa suolaan ja käyttää ruiskutettavana lääkkeenä.

20 [Esimerkki 5] HV3-hirudiinin tuotanto • · « · « • · • ♦ ..125 (1) HV3-hirudiinia erittävän plasmidin rakentaminen ·· i ··»· • · · • · · : (i) Kuten on esitetty kuviossa 9, replikaation aloitus- • · · kohta (ori), joka oli saatu pilkkomalla viite-esimerkis-sä 1 valmistettu pUCHV3-plasmidi EcoRI- ja Accl-restrik- ♦ · 1 *·1 äo tioentsyymeillä, ampisilliinivastustuskykygeenin sisältävä kuljetinkappale sekä alkaalisen fosfataasin (phoA) • · signaali jaksoa, jonka DNA-jakso on esitetty kuviossa 10, • · · V: koodaava synteettinen geeni liitettiin yhteen käyttämäl- :·. lä T4:n DNA-ligaasia. Tulokseksi saatiin pSHV3-plasmidi, I—?5 jossa alkaalisen fosfataasin geenin (phoA) signaalipep- • · *·1 tidiä koodaava DNA-jakso oli liitetty HV3:a koodaavan • · · DNA-jjakson 5'-puolelle. Plasmidi vietiin E. coli JM109;n • · · V sisään, minkä jälkeen viljeltiin ja seulottiin ampisil- 25 107928 liinivastustuskyky.

(ii) Seuraavaksi pSHV3-plasmidi pilkottiin EcoRI- ja Hindlll-restriktioentsyymeillä, jotta saataisiin 275 bp 5 geenikappale, jossa alkaalisen fosfataasin geenin (phoA) signaalipeptidiä koodaava DNA-jakso on liitetty HV3:a koodaavan DNA-jakson 5'-puolelle.

(iii) Toisaalta valmistettiin pMTl-plasmidi viite-esi-10 merkissä 2 selitetyn menetelmän mukaan. Tämä plasmidi sisältää pUC18-plasmidin replikaation aloituskohdan (ori) sisältävän DNA-jakson sekä trp-promoottorin, kuten on selitetty viite-esimerkissä 2. Kuljetinkappale saatiin pilkkomalla pMTl-plasmidi EcoRI- ja Hindlll-15 restriktioentsyymeillä.

(iv) Edellä mainittu 275 bp kappale ja kuljetinkappale liitettiin yhteen käyttämällä T4:n DNA-ligaasia, sitten yhdistelmä-DNA vietiin E. coli JM109jn sisään, jota 20 viljeltiin, ja sitten seulottiin ampisilliinivastustus-kyky, jotta saataisiin pMTSHV3-plasmidi, HV3:a erittävä 2,87 kb kuljetin, joka sisältää pUC-plasmidin replikaation aloituskohdan (ori) sisältävän DNA-jakson, trp-Σ 1]: promoottorin DNA-jakson, alkaalisen fosfataasin geenin t :*25 (phoA) signaalipeptidiä koodaavan DNA-jakson sekä HV3sa »· · :1:*· koodaavan DNA-jakson.

• » « · » j ·« : (2) HV3-hirudiinia erittävän plasmidin HV3-hirudiinin * ·· eritystuotanto *** 30

Yllä selitetyn menetelmän avulla rakennetulla pMTSHV3- • · · *· 1: plasmidilla transformoitua E. coli RRl:tä (E. coli ··· V : RRl/pMTSHV3) (FERM BP-3267) viljeltiin 2 litrassa 2 x YT-elatusainetta, joka sisälsi 100 pg/ml ampisilliinia •***35 ja 2% glukoosia. Viljely toteutettiin 2 litrassa elatus-* ·· ainetta 5 1 astiassa 37°C:ssa 24 tuntia. Tulokseksi • · ]···1 havaittiin viljelyelatusaineen antitrombiiniaktiivisuu- ·: deksi 6073 ATU 1 ral:ssa.

26 107928 (3) HV3-hlrudlinin puhdistaminen villelyelatusaineesta HV3-hirudiini saatiin viljelyelatusaineesta esimerkeissä 1 - (5) selitetyn menetelmän avulla. Erityisesti kun 5 viljelyelatusaine oli sentrifugoitu, jotta erotettaisiin supernatantti soluista, laimennettiin supernatantti nelinkertaisesti 10 mM kaliumfosfaattipuskurilla (pH 7,0) ja suodatettiin. Saatu suodos laitettiin QAE-toyo-helmipylvään (4,4 x 13 cm) päälle, kuten on selitetty 10 esimerkissä (5), minkä jälkeen geelisuodatettiin Sephacryl S-lOOHR-pylväässä.

Aktiivinen fraktio laitettiin DEAE-toyo-helmipyivään (4,4 x 40 cm) päälle, joka oli tasapainotettu tasapaino-15 tuspuskurilla ja sitten eluoitiin NaCl:n 0:sta 0,3:een M lineaarigradientilla tasapainotuspuskurissa. Lopulta HV3-hirudiini puhdistettiin C4-käänteis-HPLC:n avulla käyttämällä Vydak C4-pylvästä (4,7 x 30 cm), jota oli eluoitu asetonitriilin 15:stä 30:een % (v/v) lineaari-20 gradientilla (1%/min, 30 minuuttia tai kauemmin). Kaava kuva on esitetty kuviossa 11.

Puhtausaste jokaisessa vaiheessa on esitetty taulukossa • * • · · _ : 7.

t :‘S25 :T: Taulukko 7.

4 • · ♦ · · * 14 • · • ♦ ♦ 1 « • ·· 1 1 " “ ..... ' " ' — I ' ' ' " ” "" —

Puhtausvaihe Kokonaisproteiini Kokonaisaktiivisuus 30 (mg) (ATU) * » _____ ___ • · ·

Viljelyelatusaine 15600 11034400 l\: QAE-toyo-helmi 2111 9227264 Γ\. S-100HR 1453 9268963 • i2j35 DEAE-toyo-helmi 1327 8597892 .:. C4-HPLC 795 6486480 • * • · ««· · -- - · — - -- · -··· • « · 2 • · e ♦ 27 107928

Suhteellinen aktiivisuus Saanto (ATU/mg) (%) 707 100 5 4371 83,6 6381 84,0 6478 77,9 8139 58,8 10

Kun puhdistetun tuotteen aminohappokoostumus ja N-pään arainohappojakso oli analysoitu, saatiin selville, että aminohappokoostumuksen arvo vastasi HV3-hirudiinin teoreettista arvoa, kuten on esitetty taulukossa 8.

15 Kuten on esitetty taulukossa 9, N-pään aminohappojakso 15. aminohappoon asti oli sama kuin HV3-hirudiinin. Nämä tulokset todistavat signaalipeptidin oikean käsittelyn ja tuote varmistettiin HV3-hirudiiniksi.

20 Taulukko 8.

HV3 Teoreettinen t * ϊ V Asx 9,76 10 i,i‘,25 Thr 4,74 5 ίΤ: Ser 3,68 4

Glx 11,55 11 9 ·

Gly 8,77 9 .·:·! Ala 1,07 l 30 Cys 5,22 6 . * Vai 2,03 2

Het 0,00 0 « · · * Ile 2,97 3 Γ\. Leu 3,08 3 i”*35 Tyr 2,04 2 ··· /.* Phe 1,00 1 !:*:* His 1,22 1 • · · : ·* Lys 4,03 4 28 107928

Arg 0,00 0

Pro 4,06 4

Kokonais 66 5 _

Taulukko 9.

Kierrosnumero Aminohappo Saanto (pmol) 10 _ 1 Ile 469 2 Thr 108 3 Tyr 106 15 4 Thr 102 5 Asp 122 6 Cys 7 Thr 100 8 Glu 76 20 9 Ser 32 10 Gly 172 11 Gin 145 12 Asn 93 13 Leu 211 : :*25 14 Cys • * · 15 Leu 189 • · · • « · • · --- ------- — --- — • · · • · · • · • · • · · *· *s Teollinen sopivuus.

··· • · · *.* *30 Tämä keksintö koskee uutta hirudiinianalogia. Tämän keksinnön hirudiinianalogi on hyödyllinen antikoagulant- tina, jolla on voimakas antitrorabiiniaktiivisuus ja ./ taipumus aiheuttaa verenvuotoa.

• · · *...35 • · ’*:** Tämä keksintö koskee myös erityskuljettimia vieraiden • · · ·...· proteiinien mukaan lukien edellä mainitun hirudiiniana- login eritystä varten, muutettuja mikro-organismeja, 29 107928 sekä menetelmiä vieraiden proteiinien tuottamiseksi käyttämällä kyseessä olevia muutettuja mikro-organismeja. Käyttämällä tässä keksinnössä selitettyä menetelmää voidaan tuottaa solun ulkopuolelle vieraita proteii-5 neja siten, että saanto on hyvä, mikä on teollisesti hyödyllistä vieraiden proteiinien hankkimisessa.

Mikro-organismien säilytyspaikat: 10 (1) E. coli JM109/pMTSHVlC3 (Kirjaan vietyyn E. coli JM109/pMTPHOHVlC3:een tehtiin muutoksia) Säilytyspaikkaorganisaatio: 15 Fermentation Research Institute,

Agency of Industrial Science and Technology Ministry of International Trade and Industry

Osoite: 20 1-1-3, Tsukuba-shi Higashi, Ibaraki-ken, Japani

Talletuspäivämäärä: 18. syyskuuta, 1990 « · • · · • · • · . .*£5 Talletusnumeroj I» FERM BP-3104 • · · • · · • · • t t

Vi (2) E. coli RR1/PMTSHV1C3 • · · • · · • · • · · *.* 30 Säilytyspaikkaorganisaatio:

Fermentation Research Institute, • · J/.j Agency of Industrial Science and Technology :T: Ministry of International Trade and Industry • · • « • · · ‘...35 Osoite: • · ‘Γ 1-1-3, Tsukuba-shi Higashi, Ibaraki-ken, Japani • · · • · • · ··· :Talletuspäivämäärä: 30 107928 11. lokakuuta, 1990

Talletusnumero: FERM BP-3130 5 (3) E. coli JM109/pMTSHVl Säilytyspaikkaorganisaatioj Fermentation Research Institute, 10 Agency of Industrial Science and Technology Ministry of International Trade and Industry

Osoite: 1-1-3, Tsukuba-shi Higashi, Ibaraki-ken, Japani 15

Talletuspäivämäärä: 6. helmikuuta, 1991

Talletusnumero: 20 FERM BP-3266 (4) E. coli RRl/pMTSHV3 : Säilytyspaikkaorganisaatio: • · :25 Fermentation Research Institute, • · t

Agency of Industrial Science and Technology • · · *;1 1 Ministry of International Trade and Industry • · · • · · • · • ·

Osoite: • · · V 130 1-1-3, Tsukuba-shi Higashi, Ibaraki-ken, Japani

Talletuspäivämäärä: 6· helmikuuta, 1991 * • · • · :..!135 Talletusnumero: FERM BP-3267 • · · • · • · • · · · · • φ · • · • »

Claims (9)

107928

1. Erityskuljetin hirudiinin tai hirudiinianalogin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää pUC-plasmi- 5 din replikaation aloituskohdan (ori) sisältävän DNA-jak-son, tae- tai trp-promoottorin, signaalipeptidiä koodaa-van DNA-jakson, sekä mainittua hirudiinia tai hirudiini-analogia koodaavan DNA-jakson, jotka kaikki on liitetty toteuttamiskelpoisella tavalla. 10

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen erityskuljetin, tunnettu siitä, että mainittu signaalipeptidiä koodaava DNA-jakso on saatu alkaalisesta fosfataasista.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen erityskuljetin, tunnettu siitä, että mainittu pUC-plasmidin replikaation aloituskohdan (ori) DNA-jakso on saatu pilkkomalla pUC18-plasmidia PvuI- ja PvuII-restriktioentsyymeillä.

4. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-3 mukainen eri- tyskuljetin, tunnettu siitä, että mainittu hirudiini on HV1.

5. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-3 mukainen eri-. 25 tyskuljetin, tunnettu siitä, että mainittu hirudiini on hv3. • · · • 1 *; 1;

6. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-3 mukainen eri- ’· "· tyskuljetin, tunnettu siitä, että mainittu hirudiiniana- » · ·.· · 30 logi on HV1C3, jolla on alla olevan kaavan 1 aminohap posekvenssi: • · · • · · 35 • · • · • · · 9 • 99 « • » « · • · « » · » · a • · 107928 Vai Vai Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly 15 10 Gin Asn Leu Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn 5 15 20 Vai Cys Gly Gin Gly Asn Lys Cys Ile Leu 25 30 (kaava 1) Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gin Cys Vai 35 40 Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gin Ser 45 50

10 His Asn Gin Gly Asp Phe Glu Pro Ile Pro 55 60 Glu Asp Ala Tyr Asp Glu 65

7. Muutetut mikro-organismit, joissa E. coli oli trans formoitu minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-6 mukaisella erityskuljettimella.

8. Menetelmä HV1-, HV3-hirudiinin tai kaavan 1 mukaisen 20 HVlC3-hirudiinianalogin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään patenttivaatimuksen 7 muutettua mikro-organismia ja tuote otetaan talteen viljelyväliaineesta. • t • · • · • · .

9. Menetelmä hirudiinin tai hirudiinianalogin valmista- • · · .·;·,25 miseksi, tunnettu siitä, että viljellään E. Colia, jonka • · · /·' . on transformoitu minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-6 • · · * 1 mukaisella hirudiinin tai hirudiinianalogin tuotantoa • · · ·./ varten olevalla eritysvektorilla ja otetaan tuote tai- • · ♦ *♦1 1 teen viljelyväliaineesta. *···· ♦ · • · · • · • · · • · · • · « • · · • »· • · • · «·· • · * 1 · • · · · • · · • · · • · 107928