JPH03164184A - ヒルジン発現ベクター、ヒルジン融合蛋白、形質転換微生物及びヒルジンの製造法 - Google Patents
ヒルジン発現ベクター、ヒルジン融合蛋白、形質転換微生物及びヒルジンの製造法Info
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Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、ヒルジンもしくはその類縁体の発現ベクター
、ヒルジン融合蛋白、このベクターを大腸菌に組み込ん
だ形質転換微生物及びこの形質転換微生物を用いてヒル
ジンもしくはその類縁体を大量に生産する方法に関する
． 〔従来の技術〕 ヒルジンは、薬用ひる、ヒルドメディシナル（Ｈｉｒｕ
ｄｏ ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ Ｌｉｎｎ．）から見出
されたペプチドである。このベプチドは、トロンビンの
活性を特異的に阻害し、血液の凝固を防止する作用を示
すので、医薬としての利用が注目され、研究が行われて
いる． 最近、そのアミノ酸配列も確定された〔エフイービーエ
スレター（ＦＥＢＳ ＬＥＴＴＥＲＳ ） Ｖｏｌ １
６５ Ｎａ２．Ｐ １８０〜１８４ （１９８４Ｌバイ
オ口ジカルケミストリーホッペザイラー（Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ） Ｖｏｌ３６７，
Ｐ ８０３〜８１Ｎ１９８６） ）。それによると、
６５個のアミノ酸よりなり、６３位のチロシンがスルホ
ン化されているのが一つの特徴である．ヒルジンを医薬
として用いる場合、その原料がヒルのような小動物、特
にその頭部であるので、その生産量には自ら限界があり
、医薬として用いるための生理活性をもった、充分な量
のヒルジンを集めることは、きわめて困難であった。
、ヒルジン融合蛋白、このベクターを大腸菌に組み込ん
だ形質転換微生物及びこの形質転換微生物を用いてヒル
ジンもしくはその類縁体を大量に生産する方法に関する
． 〔従来の技術〕 ヒルジンは、薬用ひる、ヒルドメディシナル（Ｈｉｒｕ
ｄｏ ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ Ｌｉｎｎ．）から見出
されたペプチドである。このベプチドは、トロンビンの
活性を特異的に阻害し、血液の凝固を防止する作用を示
すので、医薬としての利用が注目され、研究が行われて
いる． 最近、そのアミノ酸配列も確定された〔エフイービーエ
スレター（ＦＥＢＳ ＬＥＴＴＥＲＳ ） Ｖｏｌ １
６５ Ｎａ２．Ｐ １８０〜１８４ （１９８４Ｌバイ
オ口ジカルケミストリーホッペザイラー（Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ） Ｖｏｌ３６７，
Ｐ ８０３〜８１Ｎ１９８６） ）。それによると、
６５個のアミノ酸よりなり、６３位のチロシンがスルホ
ン化されているのが一つの特徴である．ヒルジンを医薬
として用いる場合、その原料がヒルのような小動物、特
にその頭部であるので、その生産量には自ら限界があり
、医薬として用いるための生理活性をもった、充分な量
のヒルジンを集めることは、きわめて困難であった。
このため、ヒルジンを遺伝子工学的手法で産生しようと
する試みも種々提案されているが（例えば特表昭６１−
５０１６０９号公報、特開昭６１−１９４９２号公報、
特開昭６１−４７１９８号公報等）、いまだ、充分に満
足できる方法は提案されていない。
する試みも種々提案されているが（例えば特表昭６１−
５０１６０９号公報、特開昭６１−１９４９２号公報、
特開昭６１−４７１９８号公報等）、いまだ、充分に満
足できる方法は提案されていない。
また、ヒルジンを遺伝子工学的手法で産生ずると、その
特徴の一つである６３位のスルホン化チロシンは脱スル
ホン化された形で、すなわち、デスルファトヒルジン（
以下、これを単に「ヒルジン」と称する）となって発現
する。また遺伝子工学的研究が進むにつれてヒルジンに
はア旦ノ酸配列の異ったいくつかの類縁体があることが
判明してきている（同上公報、特開昭６０−２３３０９
８号公報、特開昭６２−２２７９９号公報、特表昭６２
−５０１０１１号公報特表昭６２−５０１４１４号公報
、特開昭６１−２６３９２７号公報、特開昭６３−１５
２９８７号公報等）． 〔発明が解決しようとする課題〕 本発明は、ヒルジンもしくはその類縁体の発現が高く、
これを効率よ《生産できる発現ベクターを提供するとと
もに、遺伝子工学的手法によってヒルジンもしくはその
類縁体を大量かつ安価に生産する方法を提供しようとす
るものである。
特徴の一つである６３位のスルホン化チロシンは脱スル
ホン化された形で、すなわち、デスルファトヒルジン（
以下、これを単に「ヒルジン」と称する）となって発現
する。また遺伝子工学的研究が進むにつれてヒルジンに
はア旦ノ酸配列の異ったいくつかの類縁体があることが
判明してきている（同上公報、特開昭６０−２３３０９
８号公報、特開昭６２−２２７９９号公報、特表昭６２
−５０１０１１号公報特表昭６２−５０１４１４号公報
、特開昭６１−２６３９２７号公報、特開昭６３−１５
２９８７号公報等）． 〔発明が解決しようとする課題〕 本発明は、ヒルジンもしくはその類縁体の発現が高く、
これを効率よ《生産できる発現ベクターを提供するとと
もに、遺伝子工学的手法によってヒルジンもしくはその
類縁体を大量かつ安価に生産する方法を提供しようとす
るものである。
本発明は、
（１） ｔａｃプロモーター又はｔｒｐプロモーター
のフラグメント、ブラスミドｐＵｃ１Ｂの複製開始点（
Ｏｒｉ）のフ７ラグメント、ブタ−アデニレートキナー
ゼのアミノ酸配列または、当該アミノ酸配列中のメチオ
ニンの一部もしくは全部をメチオニン以外のアミノ酸に
置換したアミノ酸配列の一部もしくは全部をコードする
塩基配列からなるＤＮＡ及びヒルジンもしくはその類縁
体のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ
を含み、かつ前記両ＤＮＡが結合されていて、ブタ−ア
デニレートキナーゼのアミノ酸配列の一部もしくは全部
とヒルジンもしくはその類縁体との融合蛋白を発現する
ようにされているヒルジン発現ベクター （２）ブタ−アデニレートキナーゼのアミノ酸配列の一
部もしくは全部とヒルジンもしくはその類縁体とが結合
してなるヒルジン融合蛋白、（３）前記（１）の発現ベ
クターを大腸菌に形質導入したことからなる形質転換微
生物、 （４）前記（３）の形質転換微生物を培養し、ヒルジン
融合蛋白を発現させ、これを採取した後、切断してヒル
ジン又はその類縁体を回収することからなるヒルジンの
製造法、 に関する。
のフラグメント、ブラスミドｐＵｃ１Ｂの複製開始点（
Ｏｒｉ）のフ７ラグメント、ブタ−アデニレートキナー
ゼのアミノ酸配列または、当該アミノ酸配列中のメチオ
ニンの一部もしくは全部をメチオニン以外のアミノ酸に
置換したアミノ酸配列の一部もしくは全部をコードする
塩基配列からなるＤＮＡ及びヒルジンもしくはその類縁
体のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ
を含み、かつ前記両ＤＮＡが結合されていて、ブタ−ア
デニレートキナーゼのアミノ酸配列の一部もしくは全部
とヒルジンもしくはその類縁体との融合蛋白を発現する
ようにされているヒルジン発現ベクター （２）ブタ−アデニレートキナーゼのアミノ酸配列の一
部もしくは全部とヒルジンもしくはその類縁体とが結合
してなるヒルジン融合蛋白、（３）前記（１）の発現ベ
クターを大腸菌に形質導入したことからなる形質転換微
生物、 （４）前記（３）の形質転換微生物を培養し、ヒルジン
融合蛋白を発現させ、これを採取した後、切断してヒル
ジン又はその類縁体を回収することからなるヒルジンの
製造法、 に関する。
上記ヒルジンとしては、ヒルジン−１、ヒルジン−２及
びヒルジン−３が知られ、また、このヒルジンのアミノ
酸の一部を他のアミノ酸に置き換えたもの、あるいはア
ミノ酸の一部を削減したもの等が知られている（前出の
文献類を参照）。本発明においては、これらのヒルジン
もしくはヒルジン類縁体のいずれでも適用できるが、薬
理活性等の面から、第ｌ図及び第２図にアミノ酸配列及
びそれをコードする塩基配列を示したヒルジン−１（Ｈ
Ｖ−１）及びヒルジン−３（ＨＶ−３）が、特に好適で
ある。
びヒルジン−３が知られ、また、このヒルジンのアミノ
酸の一部を他のアミノ酸に置き換えたもの、あるいはア
ミノ酸の一部を削減したもの等が知られている（前出の
文献類を参照）。本発明においては、これらのヒルジン
もしくはヒルジン類縁体のいずれでも適用できるが、薬
理活性等の面から、第ｌ図及び第２図にアミノ酸配列及
びそれをコードする塩基配列を示したヒルジン−１（Ｈ
Ｖ−１）及びヒルジン−３（ＨＶ−３）が、特に好適で
ある。
本発明にいうｔａｃプロモーター又はｔｒｐプロモータ
ーのフラグメントは、第３図及び第４図に示した塩基配
列を有するもので、ＤＮＡ合或機等により容易に合成す
ることができる。従って、これらのプロモーターを合威
し、これをプラスミドｐＵｃ１８の複製開始点（Ｏｒｉ
）のフラグメント等と組合せても良いが、市販のブラス
ミドの切り出しや接合等を組み合せることにより比較的
容易に調製できる。
ーのフラグメントは、第３図及び第４図に示した塩基配
列を有するもので、ＤＮＡ合或機等により容易に合成す
ることができる。従って、これらのプロモーターを合威
し、これをプラスミドｐＵｃ１８の複製開始点（Ｏｒｉ
）のフラグメント等と組合せても良いが、市販のブラス
ミドの切り出しや接合等を組み合せることにより比較的
容易に調製できる。
例えば、市販のプラスミドｐＫκ２２３−３ （ファル
マシア製）を制限酵素Ｐｖｕ Ｉ及びＮｒｕ Ｔで切断
したｔａｃプロモーターのフラグメントを含むサイト部
と市販のプラスミドｐＵｃ１Ｂを制限酵素Ｐｖｕ Ｉ及
びＮｒｕ １で切断した複製開拍点（Ｏｒｉ）のフラグ
メントを含むサイト部とをＴ４ ＤＮＡリガーゼで接合
してプラスξドｐＭκ２を得、これにブタ−アデニレー
トキナーゼの一部もしくは全部のｃＤＮＡを組み込んで
構築すると、ｔａｃプロモーターのフラグメント、プラ
スミドｐＵｃ１８の複製開始点（Ｏｒｉ）のフラグメン
ト、ブタ−アデニレートキナーゼのアミノ酸配列の一部
もしくは全部をコードする塩基配列からなるＤＮＡを含
むベクターが得られる。このベクターのうち、ブタ−ア
デニレートキナーゼの全部のｃＤＮ＾を組み込んだもの
は、本発明者等によりブタ−アデニレートキナーゼ発現
ベクターｐＭκＡＫ３として、既に、提案している（特
開昭６４−５１０８８号公報参照）。この発現ベクター
を利用すると、比較的簡便に、本発明のヒルジン発現ベ
クターを構築することができる。
マシア製）を制限酵素Ｐｖｕ Ｉ及びＮｒｕ Ｔで切断
したｔａｃプロモーターのフラグメントを含むサイト部
と市販のプラスミドｐＵｃ１Ｂを制限酵素Ｐｖｕ Ｉ及
びＮｒｕ １で切断した複製開拍点（Ｏｒｉ）のフラグ
メントを含むサイト部とをＴ４ ＤＮＡリガーゼで接合
してプラスξドｐＭκ２を得、これにブタ−アデニレー
トキナーゼの一部もしくは全部のｃＤＮＡを組み込んで
構築すると、ｔａｃプロモーターのフラグメント、プラ
スミドｐＵｃ１８の複製開始点（Ｏｒｉ）のフラグメン
ト、ブタ−アデニレートキナーゼのアミノ酸配列の一部
もしくは全部をコードする塩基配列からなるＤＮＡを含
むベクターが得られる。このベクターのうち、ブタ−ア
デニレートキナーゼの全部のｃＤＮ＾を組み込んだもの
は、本発明者等によりブタ−アデニレートキナーゼ発現
ベクターｐＭκＡＫ３として、既に、提案している（特
開昭６４−５１０８８号公報参照）。この発現ベクター
を利用すると、比較的簡便に、本発明のヒルジン発現ベ
クターを構築することができる。
一方、上記のプラスミドｐＭＫ２を制限酵素ＥｃｏＲ
１及びＥｃｏ４７ ｍで切断し、複製開始点（Ｏｒｉ）
のフラグメントを含むサイト部とをＤＮＡ合戒機等によ
り合威したｔｒｐプロモーターのフラグメントを接合す
ることによりプラスミドｐＭ７１を得ることができる。
１及びＥｃｏ４７ ｍで切断し、複製開始点（Ｏｒｉ）
のフラグメントを含むサイト部とをＤＮＡ合戒機等によ
り合威したｔｒｐプロモーターのフラグメントを接合す
ることによりプラスミドｐＭ７１を得ることができる。
本発明では、上述のようなｔａｃプロモーターまたはｔ
ｒｐプロモーターのフラグメント、ブラスミドｐｔｌｃ
１８の複製開始点（Ｏｒｉ）のフラグメント、ブタ−ア
デニレートキナーゼのアミノ酸配列の一部もしくは全部
をコードする塩基配列からなるＤＮＡを含むベクターを
利用すると良いが、これら以外に、用いたプラスミド由
来の他の遺伝子を含んでいても何ら支障はないが、例え
ば、ｒｒｎＢターミネータ、アンビシリン耐性遺伝子等
のフラグメント等を含んでいると、高発現を行うことが
でき、またスクリーニングが簡便となり、特に好ましい
．次に、ヒルジンもしくはその類縁体の遺伝子は、ヒル
ジンを構戒するアミノ酸数が６５と比較的小さいので、
ＤＮＡ合戒機を用いることにより、比較的簡単に調製で
きる。この遺伝子は、大腸菌での使用頻度の高いコドン
を用いることが好ましく、特に第１図及び第２図に示し
たＨＶ−１またはＨＶ−３の塩基配列の遺伝子を用いる
ことが好ましい。この合或ＤＮＡを、市販のプラスミド
ｐＵｃ１Ｂを制限酵素ＥｃｏＲ １及び旧ｎｄＩ［［で
切断した部位に組込む。ＨＶ−１の塩基配列の遺伝子を
組込んだプラスξドをｐＵｃｌｌＶ１とし、またＨＶ３
の塩基配列の遺伝子を組込んだプラスミドをｐＵＣＨＶ
３とする． 本発明の発現ベクターを得るためには、プラスミＦ ｐ
ＭＫＡＫ３及びプラスｌ ＦｐＵＣＨＶ１またはｐＵｃ
ＨＶ３を制限酵素で開裂する。前者のブラスミドｐＭＫ
ＡＫ３を開裂する制限酵素としてはＮｅｏ Ｉ及び旧ｎ
ｄＩ［［またはＰｖｕ ＩＩを用いることが好ましく、
特にプラスミドｐｔｌｃＨＶ１との関係においては制限
酵素Ｅｃｏ Ｉ及びＨｉｎｄｌｌｌを、またプラスもド
ｐＵｃＨＶ３との関係においては制限酵素Ｐｖｕ ＩＩ
を用いることが望ましい。これらの制限酵素を使用する
と第５図に示すブタ−アデニレートキナーゼのアミノ酸
配列をコードする塩基配列のＤＮＡは矢印の部位で制限
酵素Ｎｃｏ Ｉまたは制限酵素Ｐｖｕ ＩＩで切断され
て開裂する。
ｒｐプロモーターのフラグメント、ブラスミドｐｔｌｃ
１８の複製開始点（Ｏｒｉ）のフラグメント、ブタ−ア
デニレートキナーゼのアミノ酸配列の一部もしくは全部
をコードする塩基配列からなるＤＮＡを含むベクターを
利用すると良いが、これら以外に、用いたプラスミド由
来の他の遺伝子を含んでいても何ら支障はないが、例え
ば、ｒｒｎＢターミネータ、アンビシリン耐性遺伝子等
のフラグメント等を含んでいると、高発現を行うことが
でき、またスクリーニングが簡便となり、特に好ましい
．次に、ヒルジンもしくはその類縁体の遺伝子は、ヒル
ジンを構戒するアミノ酸数が６５と比較的小さいので、
ＤＮＡ合戒機を用いることにより、比較的簡単に調製で
きる。この遺伝子は、大腸菌での使用頻度の高いコドン
を用いることが好ましく、特に第１図及び第２図に示し
たＨＶ−１またはＨＶ−３の塩基配列の遺伝子を用いる
ことが好ましい。この合或ＤＮＡを、市販のプラスミド
ｐＵｃ１Ｂを制限酵素ＥｃｏＲ １及び旧ｎｄＩ［［で
切断した部位に組込む。ＨＶ−１の塩基配列の遺伝子を
組込んだプラスξドをｐＵｃｌｌＶ１とし、またＨＶ３
の塩基配列の遺伝子を組込んだプラスミドをｐＵＣＨＶ
３とする． 本発明の発現ベクターを得るためには、プラスミＦ ｐ
ＭＫＡＫ３及びプラスｌ ＦｐＵＣＨＶ１またはｐＵｃ
ＨＶ３を制限酵素で開裂する。前者のブラスミドｐＭＫ
ＡＫ３を開裂する制限酵素としてはＮｅｏ Ｉ及び旧ｎ
ｄＩ［［またはＰｖｕ ＩＩを用いることが好ましく、
特にプラスミドｐｔｌｃＨＶ１との関係においては制限
酵素Ｅｃｏ Ｉ及びＨｉｎｄｌｌｌを、またプラスもド
ｐＵｃＨＶ３との関係においては制限酵素Ｐｖｕ ＩＩ
を用いることが望ましい。これらの制限酵素を使用する
と第５図に示すブタ−アデニレートキナーゼのアミノ酸
配列をコードする塩基配列のＤＮＡは矢印の部位で制限
酵素Ｎｃｏ Ｉまたは制限酵素Ｐｖｕ ＩＩで切断され
て開裂する。
一方、プラスミドｐＵｃＨＶ１は制限酵素Ｎｃｏ Ｉ及
びｔｌｉｎｄｌ［Ｉで、またプラスミドｐＵＣＨＶ３は
制限酵素ＥｃｏＲＩ及び旧ｎｄＩ［ｒで切断してＨＶＩ
及びＨＶ３の遺伝子を切り出すことが好ましい。この切
り出す部位を第ｌ図及び第２図に示す。
びｔｌｉｎｄｌ［Ｉで、またプラスミドｐＵＣＨＶ３は
制限酵素ＥｃｏＲＩ及び旧ｎｄＩ［ｒで切断してＨＶＩ
及びＨＶ３の遺伝子を切り出すことが好ましい。この切
り出す部位を第ｌ図及び第２図に示す。
このようにして得られたプラスξドｐＭＫＡκ３の制限
酵素Ｎｃｏ Ｉ及び旧ｎｄＩ［［による切断サイトとｐ
ｌｌｃＨＶ１から制限酵素Ｎｃｏ Ｉ及び旧ｎｄｌ［Ｉ
で切り出したＨＶＩ遺伝子ＤＮＡとをＴ４ ＤＮＡリガ
ーゼで結合し、大腸菌に導入して培養し、スクリーニン
グを行ってブラスミドｐＭＡＫＨＶ１を得る．このプラ
スミドが、本発明のｔａｃプロモーターのフラグメント
、複製開始点（Ｏｒｉ）のフラグメント及びブタ−アデ
ニレートキナーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列
からなるＤＮＡ断片及びヒルジンＨＶ−１のアミノ酸を
コードする塩基配列からなるＤＮＡとを含み、前記の両
ＤＮＡが結合されている発現ベクターの１つで、このこ
とは、サンガー法で確認することができる。
酵素Ｎｃｏ Ｉ及び旧ｎｄＩ［［による切断サイトとｐ
ｌｌｃＨＶ１から制限酵素Ｎｃｏ Ｉ及び旧ｎｄｌ［Ｉ
で切り出したＨＶＩ遺伝子ＤＮＡとをＴ４ ＤＮＡリガ
ーゼで結合し、大腸菌に導入して培養し、スクリーニン
グを行ってブラスミドｐＭＡＫＨＶ１を得る．このプラ
スミドが、本発明のｔａｃプロモーターのフラグメント
、複製開始点（Ｏｒｉ）のフラグメント及びブタ−アデ
ニレートキナーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列
からなるＤＮＡ断片及びヒルジンＨＶ−１のアミノ酸を
コードする塩基配列からなるＤＮＡとを含み、前記の両
ＤＮＡが結合されている発現ベクターの１つで、このこ
とは、サンガー法で確認することができる。
またプラスミドｐＭＫＡＫ３の制限酵素Ｐｖｕ ＩＩに
よる切断サイトをアルカリホスファターゼで処理して５
′−リン酸を除去する。この切断サイトの間に、プラス
ミドｐＵｃＨＶ３から、制限酵素ｆ！ｃｏＲ Ｉ及び旧
ｎｄ■によって切り出されたＨＶ３遺伝子の両端末をク
レノー酵素でブランドエンドにして結合し、大腸菌に導
入して培養し、スクリーニングを行ってブラスミドｐＭ
ＡＫＨＶ３を得る。
よる切断サイトをアルカリホスファターゼで処理して５
′−リン酸を除去する。この切断サイトの間に、プラス
ミドｐＵｃＨＶ３から、制限酵素ｆ！ｃｏＲ Ｉ及び旧
ｎｄ■によって切り出されたＨＶ３遺伝子の両端末をク
レノー酵素でブランドエンドにして結合し、大腸菌に導
入して培養し、スクリーニングを行ってブラスミドｐＭ
ＡＫＨＶ３を得る。
このプラスミドが、本発明のｔａｃプロモーターのフラ
グメント、複製開始点（Ｏｒｉ）のフラグメントを有し
、ブタ−アデニレートキナーゼのアミノ酸配列をコード
する塩基配列からなるＤＮＡ断片及びヒルジンＨν−３
遺伝子のＤＮＡが結合されている発現ベクターの１つで
、このことはサンガー法によって確認することができる
。
グメント、複製開始点（Ｏｒｉ）のフラグメントを有し
、ブタ−アデニレートキナーゼのアミノ酸配列をコード
する塩基配列からなるＤＮＡ断片及びヒルジンＨν−３
遺伝子のＤＮＡが結合されている発現ベクターの１つで
、このことはサンガー法によって確認することができる
。
さらに、本発明のｔｒｐプロモーターを有する発現ベク
ターは次のようにして調製する。
ターは次のようにして調製する。
プラスミドｐＭＴ１を制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ及びＨｉｎ
ｄ ＩＩＩで切断し、ｔｒｐプロモーターのフラグメン
トと複製開始点（Ｏｒｉ）のフラグメントとを含むＤＮ
Ａ断片を得る。
ｄ ＩＩＩで切断し、ｔｒｐプロモーターのフラグメン
トと複製開始点（Ｏｒｉ）のフラグメントとを含むＤＮ
Ａ断片を得る。
一方、先に得られたプラスξドｐＭＡＫＨＶ１のヒルジ
ン融合蛋白のアミノ酸配列をコードする塩基配列からな
るＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ及び旧ｎｄｌｌ［で切
り出す。このＤＮＡフラグメントにはブタ−アデニレー
トキナーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列が制限
酵素ＥｃｏＲ Ｉ及びＮｃｏ Ｉによって断片的に切断
されているＤＮＡとＨＶ−１遺伝子のアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列が制限酵素Ｎｃｏ Ｉ及び旧ｎｄ■に
よって切断されているＤＮＡとが接合されている。この
ＤＮＡフラグメントと上記したプラスミドｐＭ７１を制
限酵素ＥｃｏＲ Ｉ及び旧ｎｄＩ［［で切断したサイト
とをＴ４ ＤＮＡリガーゼで接合し、これを大腸菌Ｅ．
Ｇｏｌｔ ＪＭ １０９株に導入して培養し、スクリー
ニングを行ってプラスミドｐＭＴＡＫＩ｛Ｖｌを得る．
このブラスミドが、本発明のＬｒｐプロモーターのフラ
グメント、複製開始点（Ｏｒｉ）のフラグメント、ブタ
−アデニレートキナーゼのアミノ酸配列をコードする塩
基配列からなるＤＮＡ断片とヒルジンＨＶ−１のアミノ
酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡとよりなり
、両ＤＮＡが結合されいる発現ベクターのｌつで、この
ことはサンガー法により確認できる．また、さらに先に
得られたプラスミドｐＭκＡＫ３をＥｃｏＲ Ｉ及び旧
ｎｄｌＩ［で切断し、ブタ−アデニレートキナーゼの遺
伝子断片を得る．この断片と上記プラスミドｐＭＴ１．
とをＥｃｏＲ Ｉ及びＨｉｎｄｎＩで消化した断片とを
、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより接合し、プラスξドｐＭ
ＴＡＫ３を得る．このブラスミドｐＭＴＡＫ３を制限酵
素Ｐｖｕ １１で切断した断片と前記ＨＶ−３遺伝子と
をＴ４ＤＮＡリガーゼにより接合し、これを大腸菌等に
導入して培養し、スクリーニングを行って、プラスミド
ｐＭＴＡＫＨＶ３を得ることができる。このプラスξド
が、本発明のｔｒｐプロモーターのフラグメント、プラ
スミドｐＵｃ１８の複製開始点（Ｏｒｉ）のフラグメン
ｆ、ブタ−アデニレートキナーゼのアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列からなるＤＮＡ及びヒルジンＨＶ−３の
アミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡを含
み、かつ前記両ＤＮＡが結合されている発現ベクターの
１つである。これのＤＮＡ配列はサンガー法により確認
することができる。
ン融合蛋白のアミノ酸配列をコードする塩基配列からな
るＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ及び旧ｎｄｌｌ［で切
り出す。このＤＮＡフラグメントにはブタ−アデニレー
トキナーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列が制限
酵素ＥｃｏＲ Ｉ及びＮｃｏ Ｉによって断片的に切断
されているＤＮＡとＨＶ−１遺伝子のアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列が制限酵素Ｎｃｏ Ｉ及び旧ｎｄ■に
よって切断されているＤＮＡとが接合されている。この
ＤＮＡフラグメントと上記したプラスミドｐＭ７１を制
限酵素ＥｃｏＲ Ｉ及び旧ｎｄＩ［［で切断したサイト
とをＴ４ ＤＮＡリガーゼで接合し、これを大腸菌Ｅ．
Ｇｏｌｔ ＪＭ １０９株に導入して培養し、スクリー
ニングを行ってプラスミドｐＭＴＡＫＩ｛Ｖｌを得る．
このブラスミドが、本発明のＬｒｐプロモーターのフラ
グメント、複製開始点（Ｏｒｉ）のフラグメント、ブタ
−アデニレートキナーゼのアミノ酸配列をコードする塩
基配列からなるＤＮＡ断片とヒルジンＨＶ−１のアミノ
酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡとよりなり
、両ＤＮＡが結合されいる発現ベクターのｌつで、この
ことはサンガー法により確認できる．また、さらに先に
得られたプラスミドｐＭκＡＫ３をＥｃｏＲ Ｉ及び旧
ｎｄｌＩ［で切断し、ブタ−アデニレートキナーゼの遺
伝子断片を得る．この断片と上記プラスミドｐＭＴ１．
とをＥｃｏＲ Ｉ及びＨｉｎｄｎＩで消化した断片とを
、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより接合し、プラスξドｐＭ
ＴＡＫ３を得る．このブラスミドｐＭＴＡＫ３を制限酵
素Ｐｖｕ １１で切断した断片と前記ＨＶ−３遺伝子と
をＴ４ＤＮＡリガーゼにより接合し、これを大腸菌等に
導入して培養し、スクリーニングを行って、プラスミド
ｐＭＴＡＫＨＶ３を得ることができる。このプラスξド
が、本発明のｔｒｐプロモーターのフラグメント、プラ
スミドｐＵｃ１８の複製開始点（Ｏｒｉ）のフラグメン
ｆ、ブタ−アデニレートキナーゼのアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列からなるＤＮＡ及びヒルジンＨＶ−３の
アミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡを含
み、かつ前記両ＤＮＡが結合されている発現ベクターの
１つである。これのＤＮＡ配列はサンガー法により確認
することができる。
本発明では、これらのブラスミドｐＭＡＫＨＶ１、ｐｎ
ＡＫＨＶ３、ｐＭＴＡＫＨＶ１あるいはｐＭＴＡＫＨＶ
３を大腸菌に導入し、スクリーニングすることにより形
質転換菌を得ることができる．このような大腸菌には、
ＪＭ１０５． ＪＭ １０９． ＩＦＯ ３３０１が用
いられるが、特にこれらの大腸菌に限定されるものでは
ない。形質転換菌を所定の培地で培養することにより、
前記融合蛋白を生産させ、次いで菌体を破壊した後、遠
心分離、カラムクロマトグラフィー等の手段により融合
蛋白を単離精製する．そして、この単離精製の段階で融
合蛋白をプロムシアナミド等で処理してヒルジンもしく
はその類縁体とブタ−アデニレートキナーゼ断片とに分
離する。
ＡＫＨＶ３、ｐＭＴＡＫＨＶ１あるいはｐＭＴＡＫＨＶ
３を大腸菌に導入し、スクリーニングすることにより形
質転換菌を得ることができる．このような大腸菌には、
ＪＭ１０５． ＪＭ １０９． ＩＦＯ ３３０１が用
いられるが、特にこれらの大腸菌に限定されるものでは
ない。形質転換菌を所定の培地で培養することにより、
前記融合蛋白を生産させ、次いで菌体を破壊した後、遠
心分離、カラムクロマトグラフィー等の手段により融合
蛋白を単離精製する．そして、この単離精製の段階で融
合蛋白をプロムシアナミド等で処理してヒルジンもしく
はその類縁体とブタ−アデニレートキナーゼ断片とに分
離する。
また、ｐＭＡＫＨＶ１、ｐＭＡＫ｝ｌＶ３、ｐＭＴＡＫ
ＨＶ１， ｐＭＴＡＫＨＶ３ではヒルジン融合タンパク
のブタ−アデニレートキナーゼ部分に、ヒルジンとの融
合部分のメチオニン（ＣＮＢｒでここを切断しフリーの
ヒルジンを得る）以外にＮ末より５７番目、６２番目及
び７６番目の３ケ所にメチオニンを含んでいる。上記発
現ベクターでヒルジン融合タンパクを発現させヒルジン
を得る際に、ＣＮＢｒでの切断を行ったところ、本来切
断したいメチオニンでは切断されずに７６番目のメチオ
ニンだけで切断され、ヒルジンのＮ末に５ヶ余分なアミ
ノ酸がついたものが少量ではあるが生威し、それとヒル
ジンとの分離がたいへん難しいことがわかった．そこで
こうした余分のアミノ酸がついたものが生威しないよう
に、ブタ−アデニレートキナーゼ中の３つのメチオニン
（５７番目、６２番目、７６番目）をロイシンに変えた
ベクターｐＭ↑ＡＫＩＩＶＩ Ｍ２、ｐＭＴＡＫＨＶＩ
Ｍ３等を作威した．これらのベクターを用いて大腸菌
を形質転換し、ヒルジンＨＶＩ等を発現させるとｐＭＴ
ＡＫＨＶ１によるのと同程度に、しかも副反応生底物を
生ずることなくヒルジンＨＶ １等を得ることができる
。
ＨＶ１， ｐＭＴＡＫＨＶ３ではヒルジン融合タンパク
のブタ−アデニレートキナーゼ部分に、ヒルジンとの融
合部分のメチオニン（ＣＮＢｒでここを切断しフリーの
ヒルジンを得る）以外にＮ末より５７番目、６２番目及
び７６番目の３ケ所にメチオニンを含んでいる。上記発
現ベクターでヒルジン融合タンパクを発現させヒルジン
を得る際に、ＣＮＢｒでの切断を行ったところ、本来切
断したいメチオニンでは切断されずに７６番目のメチオ
ニンだけで切断され、ヒルジンのＮ末に５ヶ余分なアミ
ノ酸がついたものが少量ではあるが生威し、それとヒル
ジンとの分離がたいへん難しいことがわかった．そこで
こうした余分のアミノ酸がついたものが生威しないよう
に、ブタ−アデニレートキナーゼ中の３つのメチオニン
（５７番目、６２番目、７６番目）をロイシンに変えた
ベクターｐＭ↑ＡＫＩＩＶＩ Ｍ２、ｐＭＴＡＫＨＶＩ
Ｍ３等を作威した．これらのベクターを用いて大腸菌
を形質転換し、ヒルジンＨＶＩ等を発現させるとｐＭＴ
ＡＫＨＶ１によるのと同程度に、しかも副反応生底物を
生ずることなくヒルジンＨＶ １等を得ることができる
。
本発明では、ヒルジンもしくはその類縁体をブタ−アデ
ニレートキナーゼとの融合蛋白質として発現させるので
、発現が高く、大量に安価にヒルジンもしくはその類縁
体を製造することができる。
ニレートキナーゼとの融合蛋白質として発現させるので
、発現が高く、大量に安価にヒルジンもしくはその類縁
体を製造することができる。
実施例 １
（１） ＨＶ− びＨＶ−３ のＤＮＡ −
グ ンの 八 の 『１ 各ＤＮＡフラグメントはフォスホアミダイト法による全
自動合戒機（アブライドバイオシステムズモデル３８０
Ａ）で合威した．各ＤＮＡフラグメントの５′末端にＤ
ＭＴ ｒ基を残存させた状態で逆相Ｃ１８カラムに吸着
させ、アセトニトリル−０．１Ｍ トリエチルアンモ
ニウムアセテート（ＴＥＡＡ）のバッファ一系を用いア
セトニトリルの濃度勾配で溶出させた．目的ピークを分
取し、濃縮乾固後、８０％酢酸水１一を加え、室温に２
０分間放置し、その後、濃縮乾固した．内容物を水に溶
かし、再度逆相Ｃ１８カラムを用いた高速液体クロマト
グラフィーにより精製した． （２） 一グメン′の゛ ・ ＨＶ−１及びＨＶ−３の遺伝子は第１図、第２図に示す
ように各々８本のフラグメントに分けて合戒、精製した
． ｝ＩＶ−１の場合、５′一末端のフラグメントを除く６
本のフラグメント５００ｐｍｏｌをリン酸化反応液５０
μｌ中Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ１０単位と１ａ＋
Ｍ ＡＴＰ溶液１．５μ２を加え、３７゜Ｃで１時間反
応させた。
グ ンの 八 の 『１ 各ＤＮＡフラグメントはフォスホアミダイト法による全
自動合戒機（アブライドバイオシステムズモデル３８０
Ａ）で合威した．各ＤＮＡフラグメントの５′末端にＤ
ＭＴ ｒ基を残存させた状態で逆相Ｃ１８カラムに吸着
させ、アセトニトリル−０．１Ｍ トリエチルアンモ
ニウムアセテート（ＴＥＡＡ）のバッファ一系を用いア
セトニトリルの濃度勾配で溶出させた．目的ピークを分
取し、濃縮乾固後、８０％酢酸水１一を加え、室温に２
０分間放置し、その後、濃縮乾固した．内容物を水に溶
かし、再度逆相Ｃ１８カラムを用いた高速液体クロマト
グラフィーにより精製した． （２） 一グメン′の゛ ・ ＨＶ−１及びＨＶ−３の遺伝子は第１図、第２図に示す
ように各々８本のフラグメントに分けて合戒、精製した
． ｝ＩＶ−１の場合、５′一末端のフラグメントを除く６
本のフラグメント５００ｐｍｏｌをリン酸化反応液５０
μｌ中Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ１０単位と１ａ＋
Ｍ ＡＴＰ溶液１．５μ２を加え、３７゜Ｃで１時間反
応させた。
さらに７０゜Ｃで３分間加熱した後１０ｐｍｏｌ／μ２
に調整した．８本のフラグメントを２０ｐｍｏｌずつ混
合し、３分間加熱後急冷し、再度７５゜Ｃで１ｏ分間加
熱後、室温まで約２時間かけて徐冷することにより、ア
ニーリングした。これにＴ４ ＤＮＡリガーゼを含む溶
液２０μｌ （６６ａ＋Ｍ Ｔｒｉｓ−ＣＦ！ ，
ｐＨ７．５、５ｍＭ ＭｇＣｆ ｚ、５ｍＭ ＤＴＴ
， １ｍＭ ＡＴＰ）中、１６゜Ｃで一晩反応させた。
に調整した．８本のフラグメントを２０ｐｍｏｌずつ混
合し、３分間加熱後急冷し、再度７５゜Ｃで１ｏ分間加
熱後、室温まで約２時間かけて徐冷することにより、ア
ニーリングした。これにＴ４ ＤＮＡリガーゼを含む溶
液２０μｌ （６６ａ＋Ｍ Ｔｒｉｓ−ＣＦ！ ，
ｐＨ７．５、５ｍＭ ＭｇＣｆ ｚ、５ｍＭ ＤＴＴ
， １ｍＭ ＡＴＰ）中、１６゜Ｃで一晩反応させた。
ＦＩＶ−３の場合も同様に行った．反応後、水を加えて
２００μｌとした後、フェノール、クロロホルムでタン
パクを除き、冷エタノールで沈澱させ目的とする二重鎖
ＤＮＡを得た． （３） ＨＶ− びＨＶ−３” （７）クｏ
−ニンククローニングベクターには大腸菌のプラスミド
ｐＵｃ１８を用いた。ｐＵｃ１８ ＬＯｕｇをＥｃｏＲ
Ｉ ３０単位、Ｂｉｎｄｎｌ３０単位を用いて３７゜
Ｃで２時間消化した。これをアガロースゲル電気泳動に
供してベクタ一部分を抽出し、フェノール抽出によりタ
ンパクを除き、冷エタノールで沈澱させた後、５０μｌ
のＴＥ緩衝液（１０ａ＋Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃ Ｑ ， ｐ
Ｈ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解した．この溶液の
５０ｎｇの相当量に上記（２）で得た二重鎖ＤＮＡを含
む溶液１０μＮ （６６ｍＭ Ｔｒｉｓ −（：，ｌ
，ｐｌ＋７．５、５ｓ＋Ｍ ＭｇＣ ｌ ｚ、５ｍＭ
ＤＴＴ， １ｍＭ＾ＴＰ， Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ３０
０単位）を加え、１６゜Ｃで一晩反応させた。
２００μｌとした後、フェノール、クロロホルムでタン
パクを除き、冷エタノールで沈澱させ目的とする二重鎖
ＤＮＡを得た． （３） ＨＶ− びＨＶ−３” （７）クｏ
−ニンククローニングベクターには大腸菌のプラスミド
ｐＵｃ１８を用いた。ｐＵｃ１８ ＬＯｕｇをＥｃｏＲ
Ｉ ３０単位、Ｂｉｎｄｎｌ３０単位を用いて３７゜
Ｃで２時間消化した。これをアガロースゲル電気泳動に
供してベクタ一部分を抽出し、フェノール抽出によりタ
ンパクを除き、冷エタノールで沈澱させた後、５０μｌ
のＴＥ緩衝液（１０ａ＋Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃ Ｑ ， ｐ
Ｈ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解した．この溶液の
５０ｎｇの相当量に上記（２）で得た二重鎖ＤＮＡを含
む溶液１０μＮ （６６ｍＭ Ｔｒｉｓ −（：，ｌ
，ｐｌ＋７．５、５ｓ＋Ｍ ＭｇＣ ｌ ｚ、５ｍＭ
ＤＴＴ， １ｍＭ＾ＴＰ， Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ３０
０単位）を加え、１６゜Ｃで一晩反応させた。
この反応液を用いて大腸菌ＪＭｌ０９株を形質転換し、
アンピシリン耐性のコロニーを得た。この形質転換体か
らブラスミＥＤＮ八を調製し、制限酵素による分解パタ
ーン、更にはＤＮＡシークエンシングを行い、ｐＵｃ１
８のＥｃｏＲ Ｉと旧ｎｄＩ［［との間にＨＶ−１合戒
遺伝子が挿入されたプラスミドｐＵｃＨν１及びＨＶ−
３合或遺伝子が挿入されたプラスミドｐＵｃＨＶ３が導
入されていることをｉｆ Ｅｆｆｌした。
アンピシリン耐性のコロニーを得た。この形質転換体か
らブラスミＥＤＮ八を調製し、制限酵素による分解パタ
ーン、更にはＤＮＡシークエンシングを行い、ｐＵｃ１
８のＥｃｏＲ Ｉと旧ｎｄＩ［［との間にＨＶ−１合戒
遺伝子が挿入されたプラスミドｐＵｃＨν１及びＨＶ−
３合或遺伝子が挿入されたプラスミドｐＵｃＨＶ３が導
入されていることをｉｆ Ｅｆｆｌした。
（４） ヒルジン 八 ベタ ーの■発現ベ
クターｐＭＡκｌ｛Ｖｌの調製公知のブタ−アデニレー
トキナーゼ発現ベクターｐＭＫＡＫ３（特開昭６４−５
１０８８号公報参照）１μｇを１０単位のＮｃｏ Ｉ及
び旧ｎｄｌ［［で消化して得られたブタ−アデニレート
キナーゼの８０番目のメチオニンまでをコードする遺伝
子を含む断片を、アガロースゲル電気泳動により抽出し
た。またＨＶ−１遺伝子を有するプラスξドｐＵｃＨＶ
−１ １０μｇを３０単位のＮｃｏ Ｉ及びＨｉｎｄ
ｍで消化し、２１０ｂｐのＨＶ−１をコードする断片を
得た．この断片と上記ｐＭＫｌｌＫ３をＮｃｏ Ｉ及び
Ｈｉｎｄｌ［［で消化した断片をリガーゼ緩衝液（６６
ｍＭ Ｔｒｉｓ・Ｃｌ、ｐＨ１．５、５＋ｗＭ ＭｇＣ
ｊ！ ｔ 、５ｍＭ ＯＴＴＳｌｍＭ＾ＴＰ）に溶解し
、３００単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼにより１６゜Ｃで
一晩反応させた．これを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形
質転換し、目的の組換え体プラスミドｐＭＡＫＨＶ１を
もつ菌株を得た。この菌株は、受託番号微工研条寄第２
５３７号（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５３７）として微生物工
業技術研究所に寄託されている。なお、プラスξドｐＭ
ＡＫ｝ＩＶＩの塩基配列はサンガー等の方法で確認した
。
クターｐＭＡκｌ｛Ｖｌの調製公知のブタ−アデニレー
トキナーゼ発現ベクターｐＭＫＡＫ３（特開昭６４−５
１０８８号公報参照）１μｇを１０単位のＮｃｏ Ｉ及
び旧ｎｄｌ［［で消化して得られたブタ−アデニレート
キナーゼの８０番目のメチオニンまでをコードする遺伝
子を含む断片を、アガロースゲル電気泳動により抽出し
た。またＨＶ−１遺伝子を有するプラスξドｐＵｃＨＶ
−１ １０μｇを３０単位のＮｃｏ Ｉ及びＨｉｎｄ
ｍで消化し、２１０ｂｐのＨＶ−１をコードする断片を
得た．この断片と上記ｐＭＫｌｌＫ３をＮｃｏ Ｉ及び
Ｈｉｎｄｌ［［で消化した断片をリガーゼ緩衝液（６６
ｍＭ Ｔｒｉｓ・Ｃｌ、ｐＨ１．５、５＋ｗＭ ＭｇＣ
ｊ！ ｔ 、５ｍＭ ＯＴＴＳｌｍＭ＾ＴＰ）に溶解し
、３００単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼにより１６゜Ｃで
一晩反応させた．これを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形
質転換し、目的の組換え体プラスミドｐＭＡＫＨＶ１を
もつ菌株を得た。この菌株は、受託番号微工研条寄第２
５３７号（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５３７）として微生物工
業技術研究所に寄託されている。なお、プラスξドｐＭ
ＡＫ｝ＩＶＩの塩基配列はサンガー等の方法で確認した
。
■発現ベクターｐＭＡＫＨＶ３の調製
前記のプラスミドｐＭＫＡＫ３ １μｇを第６図に示す
ように１０単位の制限酵素Ｐｖｕ ＩＩで消化した後、
脱リン酸化酵素（アルカリホスファターゼＢＡＰ） １
単位を含む溶液５０ｔｔ Ｑ （５００ｍＭＴｒｉｓ−
Ｃｌ ， ｐＨ９．０、１ｍＭ ＭｇＣｌｚ， ｌｄ
ＺｎＣｉ！ｚ）を加え３７゜Ｃで３０分反応させた．
フェノール抽出により除タンパクし、冷エタノールで沈
澱させた後、ＴＥＩｌ衝液に溶解した．また、ＨＶ−３
遺伝子を有するプ７ スＱドｐＵｃＨＶ３ ＬＯｌｌｇ
を３０単位のＥｃｏＲ Ｉ及び旧ｎｄｌｌｌで消化後、
２１０ｂｐのＨＶ−３をコードする断片を得た。この断
片を２５μｌのクレノー緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
Ｃ Ｉ ＳｐＨ８．５、５ｍＭＭｇＣ ｌ ｔ＞に溶解
し、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ．．ｄＴＴＰ， ｄＣＴＰ，
ｄ ＧＴＰ）存在下、２単位のクレノー酵素を添加し、
３７゜Ｃで１５分間反応させた。この反応液をエタノー
ル沈澱して、５′一末端を平滑化したＨＶ−３遺伝子断
片を得た．この断片と前記ｐＭＫＡＫ３とをＰｖｕ ｎ
で消化した断片は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより４℃で
一晩反応させた。これを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形
質転換し、正しい方向に連結したブラスミドｐＭＡＫＨ
Ｖ３をもつ菌株を得た。この菌株は、受託番号 微工研
条寄第２５３９号（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５３９）として
微生物工業技術研究所に寄託されている．なお、このプ
ラス藁ドｐＭＡＫＨＶ３の塩基配列はサンガー等の方法
で確認した． ■発現ベクターｐＭＴＡＫＨＶ１の調製（ａ）プラスミ
ドｐＭＴ１の調製 第７図に示すように、市販のプラスミドｐＫＫ２２３−
３（ファルマシア社製）を制限酵素Ｐｖｕ Ｉ及びＮｒ
ｕ １で切断したＰｔａｃサイト部と市販のｐＵｃ１８
を制限酵素Ｐｖｕ Ｉ及びＰｖｕ ｎで切断した複製開
始点（Ｏｒｉ）及びアンビシリン耐性遺伝子を含むサイ
ト部とをＴ４リガーゼで接合した．これを大腸菌ＪＭ１
０９株に導入して培養し、アンピシリン耐性によりスク
リーニングして、ｔａｃプロモーターとｐｔｌｃ１８の
複製開始点（Ｏｒｉ）とを有するベクターを得た。この
ブラスξドをｐＭκ２とした。第８図に示すように、こ
のブラスξドｐ？ｌＫ２ １０μｇを３０単位のＥｃｏ
Ｒ Ｉ及びＥｃｏ４７ ｍで消化し、ｔａｃプロモータ
ーを含む断片を除去し、複製開始点を含む断片をアガロ
ースゲル電気泳動によって回収した。一方、第４図に示
したｔｒｐプロモーターの塩基配列をＴＲＰ−１とＴＲ
Ｐ−２とに分割してＤＮＡ合戒機で合威した。これらを
前述したように逆相Ｃ１８カラムを用いた高速液体クロ
マトグラフィーにより精製し、各々１００ｐ屠Ｏｌをア
ニーリングして二重鎖ＤＮＡを得た．この断片と前記ｐ
ＭＫ２とをＥｃｏＲ Ｉ及びＥｃｏ４７ ｍで消化した
断片はＴ４ ＤＮＡリガーゼにより１６℃で一晩反応さ
せた。これを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、
ｔｒｐプロモーターとｐＭＫ２の複製開始点（Ｏｒ＋）
とを有するベクターを調製した。このプラスミドの塩基
配列はサンガー等の方法で確認し、ｐＭ７１と命名した
．（ｂ）プラスミドｐＭＴＡＫＨＶ１（７）調製上記ブ
ラスミドｐＭＴ１ １μｇを第９図に示すように１０単
位の制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ及び旧ｎｃｌｌｌＩで切断し
、ベクタ一部分をアガロースゲル電気泳動法により回収
した。一方ｐＭ＾ＫＨＶＩ ｌＯｕｇを３０単位のＥｃ
ｏＲ Ｉ及び旧ｎｄＩ［［で消化し、融合蛋白質をコー
ドする遺伝子断片をゲルから回収した．この断片と上記
ＰＭＴＩのＥｃｏＲ Ｉ及びＥｃｏＲ４７ ｍで消化し
た断片を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより１６゜Ｃで一晩
反応させた。これを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転
換し、目的の組換え体プラスミドｐＭＴＡＫＨＶ１をも
つ菌株を得た．この菌株は、受託番号 微工研条寄第２
５３８号（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５３８）として微生物工
業技術研究所に寄託されている。なお、ブラスミドｐＭ
ＴＡＫＨＶ１の塩基配列はサンガー等の方法で確認した
． （Ｃ）ブラスミドｐＭＴＡＫＨＶ３（７）調製プラスミ
ドｐＭＫＡＫ３ １０μｇを３０単位のＥｃｏＲ Ｉ及
びＨｉｎｄ ｍで消化し、ブタ−アデニレートキナーゼ
（ＡＤＫ）の遺伝子断片をアガロースゲル電気泳動法に
より回収した。この断片と上記プラスξドｐＭ７１とを
ＥｃｏＲＩ及び旧ｎｄｌ［［で消化した断片は、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼにより１６゜Ｃで一晩反応させた。これ
を用いて大腸菌ＪＭｌ０９株を形質転換し、目的の組換
え体プラスミドρＭＴＡκ３をもつ菌株を得た。プラス
ミドｐＭＴＡＫ３１μｇを１０単位の制限酵素Ｐｖｕ
ＩＩで消化した後、脱リン酸化酵素（アルカリホスファ
ターゼＢＡＰ） １単位を含む溶液５０１１ １ （５
００＋ｉＭ Ｔｒｉｓ ・Ｃｌ、ｐＨ９．０、１＋＋
Ｍ ＭｇＣｊ！ ｔ 、１ｍＭ Ｚｎ（／！ ｚ）を加
え３７゜Ｃで３０分反応させた．フェノール抽出により
除タンパクし、冷エタノールで沈澱させた後、ＴＥ緩衝
液に溶解した．この断片と前記＋｛Ｖ−３遺伝子をクレ
ノー酵素で平滑化した断片とをＴ４ ＤＮＡリガーゼに
より、４゜Ｃで一晩反応させた．これを用いて大腸菌Ｊ
）’１１０９株を形質転換し、目的の組換え体プラスξ
ドｐＭＴＡＫＨＶ３をもつ菌株を得た．この菌株は、受
託番号 微工研条寄第２５４０号（Ｆｉｌ！ＲＭ ＢＰ
−２５４０）として微生物工業技術研究所に寄託されて
いる．なお、このプラスミドｐＭＴＡＫＨＶ３の塩基配
列はサンガー等の方法で確認した． （５）濫Ｊ盛化５４４塩 上記のプラスミドｐＭＡＫＨＶ１， ｐＭＡＫＨＶ３，
ｐＭＴＡＫＨＶ１及びｐＭＴＡＫＨＶ３により形質転
換された大腸菌ＪＭ １０９株を５０μｇ／一のアンピ
シリンを含む２ＸＴＹ培地〔バタトトリプトン（Ｂａｃ
ｔｏ− ｔｒｙｐｔｏｎｅ） １６ ｇ ／ ｌ、バク
トイーストエキストラクト（Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ
ｅｘｔｒａｃｔ） １０ｇ／ ｌ、Ｎａｃｅ ５ｇ／ｌ
， ｐＨ７．２ ）で培養した。また、ｐＭＴＡＫＨＶ
１及びｐＭＴＡＫＨＶ３ニより形質転換された大腸菌Ｊ
Ｍｌ０９株については５０μｇ／ｒｎｉのアンビシリン
を含むＭ９培地（グルコース５ｇ／ ｊ２、カザミノ酸
５ｇ／１、ＮａＪＰＯ４６ｇ／ｌ．．ＫｌｌｚＰＯｎ
３ｇ／ＩＮａＣ ｌ ０．５ｇ／ ｉ． ， ＮＨ４Ｃ
ｉ．Ｉｇ／ ｌ−、チアミン塩酸塩１０ｍｇ／ ｌ，
ｌｍＭｇｓＯｓ 、１００μＭ ＣａＣ１ｔ， ｝
リプトファン５０■／ ｌ ， ｐＨ７．２）でも同様
に３７゜Ｃで一晩培養した．培養後ｌｕｌを集菌し、レ
ムリのサンプル緩衝液に懸濁し、加熱溶解後、ＳＯＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。泳動後、ク
マシーブリリアントブルーにより染色し、脱色したとこ
ろ、ＨＶ−１融合蛋白質の場合、分子量約１７，０００
の位置に、またＨＶ−３融合蛋白質の場合、分子量約１
４，０００の位置にポリベブチドバンドが見出された．
また菌株としてＪＭ １０５株、ＩＰ０ ３３０１株を
用いて様々な宿主での生産性の検討を行い、電気泳動し
たゲルをデンシトメーターにかけ発現効率を調べた。
ように１０単位の制限酵素Ｐｖｕ ＩＩで消化した後、
脱リン酸化酵素（アルカリホスファターゼＢＡＰ） １
単位を含む溶液５０ｔｔ Ｑ （５００ｍＭＴｒｉｓ−
Ｃｌ ， ｐＨ９．０、１ｍＭ ＭｇＣｌｚ， ｌｄ
ＺｎＣｉ！ｚ）を加え３７゜Ｃで３０分反応させた．
フェノール抽出により除タンパクし、冷エタノールで沈
澱させた後、ＴＥＩｌ衝液に溶解した．また、ＨＶ−３
遺伝子を有するプ７ スＱドｐＵｃＨＶ３ ＬＯｌｌｇ
を３０単位のＥｃｏＲ Ｉ及び旧ｎｄｌｌｌで消化後、
２１０ｂｐのＨＶ−３をコードする断片を得た。この断
片を２５μｌのクレノー緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
Ｃ Ｉ ＳｐＨ８．５、５ｍＭＭｇＣ ｌ ｔ＞に溶解
し、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ．．ｄＴＴＰ， ｄＣＴＰ，
ｄ ＧＴＰ）存在下、２単位のクレノー酵素を添加し、
３７゜Ｃで１５分間反応させた。この反応液をエタノー
ル沈澱して、５′一末端を平滑化したＨＶ−３遺伝子断
片を得た．この断片と前記ｐＭＫＡＫ３とをＰｖｕ ｎ
で消化した断片は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより４℃で
一晩反応させた。これを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形
質転換し、正しい方向に連結したブラスミドｐＭＡＫＨ
Ｖ３をもつ菌株を得た。この菌株は、受託番号 微工研
条寄第２５３９号（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５３９）として
微生物工業技術研究所に寄託されている．なお、このプ
ラス藁ドｐＭＡＫＨＶ３の塩基配列はサンガー等の方法
で確認した． ■発現ベクターｐＭＴＡＫＨＶ１の調製（ａ）プラスミ
ドｐＭＴ１の調製 第７図に示すように、市販のプラスミドｐＫＫ２２３−
３（ファルマシア社製）を制限酵素Ｐｖｕ Ｉ及びＮｒ
ｕ １で切断したＰｔａｃサイト部と市販のｐＵｃ１８
を制限酵素Ｐｖｕ Ｉ及びＰｖｕ ｎで切断した複製開
始点（Ｏｒｉ）及びアンビシリン耐性遺伝子を含むサイ
ト部とをＴ４リガーゼで接合した．これを大腸菌ＪＭ１
０９株に導入して培養し、アンピシリン耐性によりスク
リーニングして、ｔａｃプロモーターとｐｔｌｃ１８の
複製開始点（Ｏｒｉ）とを有するベクターを得た。この
ブラスξドをｐＭκ２とした。第８図に示すように、こ
のブラスξドｐ？ｌＫ２ １０μｇを３０単位のＥｃｏ
Ｒ Ｉ及びＥｃｏ４７ ｍで消化し、ｔａｃプロモータ
ーを含む断片を除去し、複製開始点を含む断片をアガロ
ースゲル電気泳動によって回収した。一方、第４図に示
したｔｒｐプロモーターの塩基配列をＴＲＰ−１とＴＲ
Ｐ−２とに分割してＤＮＡ合戒機で合威した。これらを
前述したように逆相Ｃ１８カラムを用いた高速液体クロ
マトグラフィーにより精製し、各々１００ｐ屠Ｏｌをア
ニーリングして二重鎖ＤＮＡを得た．この断片と前記ｐ
ＭＫ２とをＥｃｏＲ Ｉ及びＥｃｏ４７ ｍで消化した
断片はＴ４ ＤＮＡリガーゼにより１６℃で一晩反応さ
せた。これを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、
ｔｒｐプロモーターとｐＭＫ２の複製開始点（Ｏｒ＋）
とを有するベクターを調製した。このプラスミドの塩基
配列はサンガー等の方法で確認し、ｐＭ７１と命名した
．（ｂ）プラスミドｐＭＴＡＫＨＶ１（７）調製上記ブ
ラスミドｐＭＴ１ １μｇを第９図に示すように１０単
位の制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ及び旧ｎｃｌｌｌＩで切断し
、ベクタ一部分をアガロースゲル電気泳動法により回収
した。一方ｐＭ＾ＫＨＶＩ ｌＯｕｇを３０単位のＥｃ
ｏＲ Ｉ及び旧ｎｄＩ［［で消化し、融合蛋白質をコー
ドする遺伝子断片をゲルから回収した．この断片と上記
ＰＭＴＩのＥｃｏＲ Ｉ及びＥｃｏＲ４７ ｍで消化し
た断片を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより１６゜Ｃで一晩
反応させた。これを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転
換し、目的の組換え体プラスミドｐＭＴＡＫＨＶ１をも
つ菌株を得た．この菌株は、受託番号 微工研条寄第２
５３８号（ＦＥＲＭ ＢＰ−２５３８）として微生物工
業技術研究所に寄託されている。なお、ブラスミドｐＭ
ＴＡＫＨＶ１の塩基配列はサンガー等の方法で確認した
． （Ｃ）ブラスミドｐＭＴＡＫＨＶ３（７）調製プラスミ
ドｐＭＫＡＫ３ １０μｇを３０単位のＥｃｏＲ Ｉ及
びＨｉｎｄ ｍで消化し、ブタ−アデニレートキナーゼ
（ＡＤＫ）の遺伝子断片をアガロースゲル電気泳動法に
より回収した。この断片と上記プラスξドｐＭ７１とを
ＥｃｏＲＩ及び旧ｎｄｌ［［で消化した断片は、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼにより１６゜Ｃで一晩反応させた。これ
を用いて大腸菌ＪＭｌ０９株を形質転換し、目的の組換
え体プラスミドρＭＴＡκ３をもつ菌株を得た。プラス
ミドｐＭＴＡＫ３１μｇを１０単位の制限酵素Ｐｖｕ
ＩＩで消化した後、脱リン酸化酵素（アルカリホスファ
ターゼＢＡＰ） １単位を含む溶液５０１１ １ （５
００＋ｉＭ Ｔｒｉｓ ・Ｃｌ、ｐＨ９．０、１＋＋
Ｍ ＭｇＣｊ！ ｔ 、１ｍＭ Ｚｎ（／！ ｚ）を加
え３７゜Ｃで３０分反応させた．フェノール抽出により
除タンパクし、冷エタノールで沈澱させた後、ＴＥ緩衝
液に溶解した．この断片と前記＋｛Ｖ−３遺伝子をクレ
ノー酵素で平滑化した断片とをＴ４ ＤＮＡリガーゼに
より、４゜Ｃで一晩反応させた．これを用いて大腸菌Ｊ
）’１１０９株を形質転換し、目的の組換え体プラスξ
ドｐＭＴＡＫＨＶ３をもつ菌株を得た．この菌株は、受
託番号 微工研条寄第２５４０号（Ｆｉｌ！ＲＭ ＢＰ
−２５４０）として微生物工業技術研究所に寄託されて
いる．なお、このプラスミドｐＭＴＡＫＨＶ３の塩基配
列はサンガー等の方法で確認した． （５）濫Ｊ盛化５４４塩 上記のプラスミドｐＭＡＫＨＶ１， ｐＭＡＫＨＶ３，
ｐＭＴＡＫＨＶ１及びｐＭＴＡＫＨＶ３により形質転
換された大腸菌ＪＭ １０９株を５０μｇ／一のアンピ
シリンを含む２ＸＴＹ培地〔バタトトリプトン（Ｂａｃ
ｔｏ− ｔｒｙｐｔｏｎｅ） １６ ｇ ／ ｌ、バク
トイーストエキストラクト（Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ
ｅｘｔｒａｃｔ） １０ｇ／ ｌ、Ｎａｃｅ ５ｇ／ｌ
， ｐＨ７．２ ）で培養した。また、ｐＭＴＡＫＨＶ
１及びｐＭＴＡＫＨＶ３ニより形質転換された大腸菌Ｊ
Ｍｌ０９株については５０μｇ／ｒｎｉのアンビシリン
を含むＭ９培地（グルコース５ｇ／ ｊ２、カザミノ酸
５ｇ／１、ＮａＪＰＯ４６ｇ／ｌ．．ＫｌｌｚＰＯｎ
３ｇ／ＩＮａＣ ｌ ０．５ｇ／ ｉ． ， ＮＨ４Ｃ
ｉ．Ｉｇ／ ｌ−、チアミン塩酸塩１０ｍｇ／ ｌ，
ｌｍＭｇｓＯｓ 、１００μＭ ＣａＣ１ｔ， ｝
リプトファン５０■／ ｌ ， ｐＨ７．２）でも同様
に３７゜Ｃで一晩培養した．培養後ｌｕｌを集菌し、レ
ムリのサンプル緩衝液に懸濁し、加熱溶解後、ＳＯＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。泳動後、ク
マシーブリリアントブルーにより染色し、脱色したとこ
ろ、ＨＶ−１融合蛋白質の場合、分子量約１７，０００
の位置に、またＨＶ−３融合蛋白質の場合、分子量約１
４，０００の位置にポリベブチドバンドが見出された．
また菌株としてＪＭ １０５株、ＩＰ０ ３３０１株を
用いて様々な宿主での生産性の検討を行い、電気泳動し
たゲルをデンシトメーターにかけ発現効率を調べた。
この結果を第１表に示した．この結果から明らかなよう
に、何れも高い発現率を示したが、特に、ｔｒｐプロモ
ーターを有するｐＭＴＡκＨＶＩを導入した大腸菌ＪＭ １０９及びＩＦＯ ３３０１が高発現を示した．（６）
ｌ” ）゛ヒルジンの 上記培養液を集めて２１とし、これを遠心して集菌し、
得られたベレットを３００ｍの水に懸濁し、Ｈ２ＳＯ．
でｐｌｒ４に調整し、菌体を破砕し、遠心を行った。得
られたペレットをイソブロパノールとアセトン各２００
ｍで洗浄、乾燥し、７０％ギ酸２００ｄに溶解した（
蛋白含量は２０ｇ／ ｆｆｉ以下とした）。この溶液に
ＣＮＢｒを１％加え室温で一夜放置した．これを４０゜
Ｃの減圧下で濃縮乾固し、０．ＩＭ Ｔｒｉｓ−■ｃｌ
（ｐｌ｛８．７｝、０．１Ｍ（ＮＨ４）！ＳＯ４及び
Ｑ．１ｍＭ Ｔｒｊｔｏｎ Ｘ−１００よりなる緩衝液
４００ｄに溶解し、溶液のｐＨをＮａＯＨで８．７に調
整した。この溶液に、Ｌ−システイン６ｍＭを加え室温
に一夜放置し、硫安を２Ｍとなるまで加え、直ちに遠心
を行った。得られた上清を、５０ＩＩＩＭリン酸ナトリ
ウム（ｐＨ７．０） ２Ｍ硫安で平衡化したプチルート
ヨパール（トーソー）にかけ、同一の緩衝液で洗浄し、
５０＋訓ノン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）１．５Ｍ硫安
で溶出した． 溶出液をゲル濾過又は透析で脱塩し、５０＋ｍＭリン酸
ナトリウム（ｐＨ７．５）で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅ又はＭｏｎｏ−Ｑ （どちらもＰｈａｒｍａｃ
ｉａ）にかけ５ｍＭリン酸ナトリウム、１００＋＊Ｍ
ＮａＣｊ！で溶出させて、ヒルジンの精製を行った。
に、何れも高い発現率を示したが、特に、ｔｒｐプロモ
ーターを有するｐＭＴＡκＨＶＩを導入した大腸菌ＪＭ １０９及びＩＦＯ ３３０１が高発現を示した．（６）
ｌ” ）゛ヒルジンの 上記培養液を集めて２１とし、これを遠心して集菌し、
得られたベレットを３００ｍの水に懸濁し、Ｈ２ＳＯ．
でｐｌｒ４に調整し、菌体を破砕し、遠心を行った。得
られたペレットをイソブロパノールとアセトン各２００
ｍで洗浄、乾燥し、７０％ギ酸２００ｄに溶解した（
蛋白含量は２０ｇ／ ｆｆｉ以下とした）。この溶液に
ＣＮＢｒを１％加え室温で一夜放置した．これを４０゜
Ｃの減圧下で濃縮乾固し、０．ＩＭ Ｔｒｉｓ−■ｃｌ
（ｐｌ｛８．７｝、０．１Ｍ（ＮＨ４）！ＳＯ４及び
Ｑ．１ｍＭ Ｔｒｊｔｏｎ Ｘ−１００よりなる緩衝液
４００ｄに溶解し、溶液のｐＨをＮａＯＨで８．７に調
整した。この溶液に、Ｌ−システイン６ｍＭを加え室温
に一夜放置し、硫安を２Ｍとなるまで加え、直ちに遠心
を行った。得られた上清を、５０ＩＩＩＭリン酸ナトリ
ウム（ｐＨ７．０） ２Ｍ硫安で平衡化したプチルート
ヨパール（トーソー）にかけ、同一の緩衝液で洗浄し、
５０＋訓ノン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）１．５Ｍ硫安
で溶出した． 溶出液をゲル濾過又は透析で脱塩し、５０＋ｍＭリン酸
ナトリウム（ｐＨ７．５）で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅ又はＭｏｎｏ−Ｑ （どちらもＰｈａｒｍａｃ
ｉａ）にかけ５ｍＭリン酸ナトリウム、１００＋＊Ｍ
ＮａＣｊ！で溶出させて、ヒルジンの精製を行った。
実施例２
実施例１で得ラレたｐＭＴＡＫＨＶ１ １０／／ｇを３
０単位のＥｃｏＲ Ｉ及び旧ｎｄｌ［［で切断しアデニ
レートキナーゼーヒルジンＨＶ１部分をアガロースゲル
電気泳動法により回収した， 一方、市販のファージベクターｐＭ１３ｓ＋ｐ１９ １
μｇを同様に１０単位のＥｃｏＲ Ｉ及び｝ｌｉｎｄｌ
ｌｌで切断し、大きな断片をゲルより回収した。第１０
図に示すようにこの断片と上記アデニレートキナーゼー
ビルジンＨＶ １をコードするＤＮＡ断片をＴ４リガー
ゼを用いて１６゜Ｃで一晩反応させた．こうしてできた
アデニレートキナーゼ〜ヒルジンＨＶ １をコードする
ＤＮＡを含むｐＭ１３ ヘクターＭ１３ＡＫＨＶ１と、
ＤＮＡ合戒機で合戒した一本１ｉＤＮＡ ｔｅｍｐｌａ
ｔｅ Ｍ５７−６２Ｌ及びＭ７６Ｌ （第１１図参照）
を用いてＡｍｅｒｓｈａｍ社製ｏ１ｉｇｏｎｕｃｌｅｏ
ｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕ
ｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍによりＳｉｔｅ−ｄ
ｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓを行った． こうして得られた５７番目と６２番目のメチオニンコド
ン（＾ＴＧ）がとちらもロイシンのコドン（ＣＴＧ）に
変わったｐＭ１３ＡＫＨＶＩ Ｍｌと７６番目のメチオ
ニンのコドン（ＡＴＧ）がロイシンのコドン（ＣＴＧ）
に変わったｐＭ１３ＡＸＨＶＩ Ｍ２についてｄｉｄｅ
ｏｘｙ法によりそのＤＮＡ配列を６１１認した． 次に第１２図に示すように、ｐＭｌ３ＡＫ｝ＩＶＩ Ｍ
ｌとｐ？１１３ＡＫＨＶＩ Ｍ２からアデニレートキナ
ーゼーヒルジンンＨＶ１部分をＥｃｏＲ Ｉ及びＨｉｎ
ｄｌ［Ｉにより切り出し、ｐＭＴＡＫＨＶ１からアデニ
レートキナーゼーヒルジンＨＶ１部分を取り除いたもの
とそれぞれ接続しｐＭＴＡＫＨＶＩ Ｍｌ及びｐＭＴＡ
ＸＨＶＩ Ｍ２を作戒した．さらにｐＭＴＩＫＨＶＩ
ＭｌをＰｖｕ ＩＩと旧ｎｄｌ［Ｉで切断した大きな断
片とｐＭＴＡＫ｝ＩＶＩ Ｍ２をＰｖｕ ＩＩと旧ｎｄ
ｌ［［で切断した小さな断片を接続し、３つのメチオニ
ンがすべてロイシンに変わったｐＭＴＡＫＨＶＩ Ｍ３
を作威しそのＤＮＡ配列を確認した． （３）互盗創し３針隻里 ｐＭＴＡＫＨＶＩ Ｍ２とｐＭＴＡＫＨＶＩ Ｍ３を用
いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した．この菌株は、前
者は受託番号微工研条寄第２９８８号（ＦＥＲＭＢＰ−
２９８８）として、後者は受託番号微工研条寄第２９８
９号（Ｆｆ！ＲＭａｐ−２９８９）として微生物工業技
術研究所に寄託されている．これを実施例ｌとして同様
にしてヒルジンＨＶＩを発現させた．ヒルジンＨＶＩの
発現はそれぞれｐＭＴＡＫＩ｛Ｖｌによるものと同程度
であり、かつどちらの場合もｐＭＴＡＫＨＶ１の場合と
異なりアミノ酸が５個Ｎ末に余分についたものは生威し
ないことを確認した． 〔発明の効果〕 本発明は、ヒルジンもしくはその類縁体をブタ一アデニ
レートキナーゼの一部と融合蛋白の形で発現できるベク
ターを用い、遺伝子工学的手法によって発現させるので
、ヒルジンもしくはその類縁体を大量に、しかも安価に
、効率よく生産することができる．
０単位のＥｃｏＲ Ｉ及び旧ｎｄｌ［［で切断しアデニ
レートキナーゼーヒルジンＨＶ１部分をアガロースゲル
電気泳動法により回収した， 一方、市販のファージベクターｐＭ１３ｓ＋ｐ１９ １
μｇを同様に１０単位のＥｃｏＲ Ｉ及び｝ｌｉｎｄｌ
ｌｌで切断し、大きな断片をゲルより回収した。第１０
図に示すようにこの断片と上記アデニレートキナーゼー
ビルジンＨＶ １をコードするＤＮＡ断片をＴ４リガー
ゼを用いて１６゜Ｃで一晩反応させた．こうしてできた
アデニレートキナーゼ〜ヒルジンＨＶ １をコードする
ＤＮＡを含むｐＭ１３ ヘクターＭ１３ＡＫＨＶ１と、
ＤＮＡ合戒機で合戒した一本１ｉＤＮＡ ｔｅｍｐｌａ
ｔｅ Ｍ５７−６２Ｌ及びＭ７６Ｌ （第１１図参照）
を用いてＡｍｅｒｓｈａｍ社製ｏ１ｉｇｏｎｕｃｌｅｏ
ｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕ
ｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍによりＳｉｔｅ−ｄ
ｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓを行った． こうして得られた５７番目と６２番目のメチオニンコド
ン（＾ＴＧ）がとちらもロイシンのコドン（ＣＴＧ）に
変わったｐＭ１３ＡＫＨＶＩ Ｍｌと７６番目のメチオ
ニンのコドン（ＡＴＧ）がロイシンのコドン（ＣＴＧ）
に変わったｐＭ１３ＡＸＨＶＩ Ｍ２についてｄｉｄｅ
ｏｘｙ法によりそのＤＮＡ配列を６１１認した． 次に第１２図に示すように、ｐＭｌ３ＡＫ｝ＩＶＩ Ｍ
ｌとｐ？１１３ＡＫＨＶＩ Ｍ２からアデニレートキナ
ーゼーヒルジンンＨＶ１部分をＥｃｏＲ Ｉ及びＨｉｎ
ｄｌ［Ｉにより切り出し、ｐＭＴＡＫＨＶ１からアデニ
レートキナーゼーヒルジンＨＶ１部分を取り除いたもの
とそれぞれ接続しｐＭＴＡＫＨＶＩ Ｍｌ及びｐＭＴＡ
ＸＨＶＩ Ｍ２を作戒した．さらにｐＭＴＩＫＨＶＩ
ＭｌをＰｖｕ ＩＩと旧ｎｄｌ［Ｉで切断した大きな断
片とｐＭＴＡＫ｝ＩＶＩ Ｍ２をＰｖｕ ＩＩと旧ｎｄ
ｌ［［で切断した小さな断片を接続し、３つのメチオニ
ンがすべてロイシンに変わったｐＭＴＡＫＨＶＩ Ｍ３
を作威しそのＤＮＡ配列を確認した． （３）互盗創し３針隻里 ｐＭＴＡＫＨＶＩ Ｍ２とｐＭＴＡＫＨＶＩ Ｍ３を用
いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した．この菌株は、前
者は受託番号微工研条寄第２９８８号（ＦＥＲＭＢＰ−
２９８８）として、後者は受託番号微工研条寄第２９８
９号（Ｆｆ！ＲＭａｐ−２９８９）として微生物工業技
術研究所に寄託されている．これを実施例ｌとして同様
にしてヒルジンＨＶＩを発現させた．ヒルジンＨＶＩの
発現はそれぞれｐＭＴＡＫＩ｛Ｖｌによるものと同程度
であり、かつどちらの場合もｐＭＴＡＫＨＶ１の場合と
異なりアミノ酸が５個Ｎ末に余分についたものは生威し
ないことを確認した． 〔発明の効果〕 本発明は、ヒルジンもしくはその類縁体をブタ一アデニ
レートキナーゼの一部と融合蛋白の形で発現できるベク
ターを用い、遺伝子工学的手法によって発現させるので
、ヒルジンもしくはその類縁体を大量に、しかも安価に
、効率よく生産することができる．
第１図及び第２図は、本発明で使用するＨＶＩ及びＨＶ
３の遺伝子のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す．また
第３図はｔａｐプロモーターのＤＮＡ配列及び第４図は
ｔｒｐプロモーターのＤＮＡ配列を示す．第５図は、本
発明で使用するブタ−アデニレートキナーゼのＤＮＡ配
列及びアミノ酸配列を示す． 第６図は、本発明の発現ベクターｐＭＡＫＨＶ１及びｐ
ＭＡＫＨＶ３を調製する概略図を示す．第７図及び第８
図は本発明の発現ベクターｐＭＴ八κＨＶＩを調製する
ために用いられるブラスミドｐＭＫ２及びｐＭ↑１を調
製する概略図を、第９図はプラスξドｐＭＴ１から本発
明の発現ベクターｐＭＴＡＫＨＶ１を調製する概略図を
それぞれ示す． 第１０図は、プラスξドｐ？ｌＴＡＷｌ｛Ｖｌからプラ
スξドｐＭ１３ＡＫＨＶ１を調製する概略図を、第１１
図はＭＳ？−６２Ｌ及びＭ７６ＬのＤＮＡ配列を、第１
２図は、ブラスξドｐＭ１３ＡＫＨＶＩ Ｍｌ及びｐＭ
１３ＡＫＨＶＩ Ｍ２から本発明の発現ベクタープラス
ミドｐＭＴＡＫＨＶＩ Ｍ３を調製する概略図をそれぞ
れ示す．
３の遺伝子のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す．また
第３図はｔａｐプロモーターのＤＮＡ配列及び第４図は
ｔｒｐプロモーターのＤＮＡ配列を示す．第５図は、本
発明で使用するブタ−アデニレートキナーゼのＤＮＡ配
列及びアミノ酸配列を示す． 第６図は、本発明の発現ベクターｐＭＡＫＨＶ１及びｐ
ＭＡＫＨＶ３を調製する概略図を示す．第７図及び第８
図は本発明の発現ベクターｐＭＴ八κＨＶＩを調製する
ために用いられるブラスミドｐＭＫ２及びｐＭ↑１を調
製する概略図を、第９図はプラスξドｐＭＴ１から本発
明の発現ベクターｐＭＴＡＫＨＶ１を調製する概略図を
それぞれ示す． 第１０図は、プラスξドｐ？ｌＴＡＷｌ｛Ｖｌからプラ
スξドｐＭ１３ＡＫＨＶ１を調製する概略図を、第１１
図はＭＳ？−６２Ｌ及びＭ７６ＬのＤＮＡ配列を、第１
２図は、ブラスξドｐＭ１３ＡＫＨＶＩ Ｍｌ及びｐＭ
１３ＡＫＨＶＩ Ｍ２から本発明の発現ベクタープラス
ミドｐＭＴＡＫＨＶＩ Ｍ３を調製する概略図をそれぞ
れ示す．
Claims (5)
- （１）ｔａｃプロモーター又はｔｒｐプロモーターのフ
ラグメント、プラスミドｐＵＣ１８の複製開始点（Ｏｒ
ｉ）のフラグメント、ブタ−アデニレートキナーゼのア
ミノ酸配列の一部もしくは全部をコードする塩基配列か
らなるＤＮＡ及びヒルジンもしくはその類縁体のアミノ
酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡを含み、か
つ前記両ＤＮＡが結合されていて、ブタ−アデニレート
キナーゼのアミノ酸配列の一部もしくは全部とヒルジン
もしくはその類縁体との融合蛋白を発現するようにされ
ていることを特徴とするヒルジン発現ベクター。 - （２）請求項（１）のブタ−アデニレートキナーゼのア
ミノ酸配列が、その配列中のメチオニンの全部又は一部
をメチオニン以外のアミノ酸に置換したアミノ酸配列で
あることを特徴とするヒルジン発現ベクター。 - （３）請求項（１）又は（２）の発現ベクターを大腸菌
に形質導入したことからなる形質転換微生物。 - （４）請求項（３）の形質転換微生物を培養し、ヒルジ
ン融合蛋白を発現させ、これを採取した後、切断してヒ
ルジン又はその類縁体を回収することを特徴とするヒル
ジンの製造法。 - （５）ブタ−アデニレートキナーゼのアミノ酸配列又は
当該アミノ酸配列中のメチオニンの一部もしくは全部を
メチオニン以外のアミノ酸に置換したアミノ酸配列の一
部もしくは全部とヒルジンもしくはその類縁体とが結合
してなるヒルジン融合蛋白。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2197069A JPH03164184A (ja) | 1989-08-10 | 1990-07-25 | ヒルジン発現ベクター、ヒルジン融合蛋白、形質転換微生物及びヒルジンの製造法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1-207200 | 1989-08-10 | ||
| JP20720089 | 1989-08-10 | ||
| JP2197069A JPH03164184A (ja) | 1989-08-10 | 1990-07-25 | ヒルジン発現ベクター、ヒルジン融合蛋白、形質転換微生物及びヒルジンの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03164184A true JPH03164184A (ja) | 1991-07-16 |
Family
ID=26510149
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2197069A Pending JPH03164184A (ja) | 1989-08-10 | 1990-07-25 | ヒルジン発現ベクター、ヒルジン融合蛋白、形質転換微生物及びヒルジンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03164184A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0687731A1 (en) | 1990-11-08 | 1995-12-20 | Japan Energy Corporation | Secretion vector, transformed microorganisms containing said vector and manufacture of products from said microorganism |
-
1990
- 1990-07-25 JP JP2197069A patent/JPH03164184A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0687731A1 (en) | 1990-11-08 | 1995-12-20 | Japan Energy Corporation | Secretion vector, transformed microorganisms containing said vector and manufacture of products from said microorganism |
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