WO2009148194A1 - 真核細胞において組換えタンパク質を細胞外に放出させるためのポリヌクレオチド - Google Patents

真核細胞において組換えタンパク質を細胞外に放出させるためのポリヌクレオチド Download PDF

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WO2009148194A1
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sequence
polynucleotide
seq
signal sequence
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PCT/JP2009/060811
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齋藤三郎
秋山暢丈
大野裕治
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オリエンタル酵母工業株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion

Definitions

  • a signal sequence and a glycosylation sequence are linked to a polynucleotide encoding a protein to be expressed in a eukaryotic cell, and the protein is eukaryotic or expressed.
  • Proteins translated from genes play an important role in functions in the body. With the development of gene recombination technology, expression methods of target genes and purification methods have been developed.
  • Mammalian protein expression is preferably expressed in cells that are originally expressed, but when the cells are not used, cells that are systematically close to the original cells are desirable in consideration of protein folding. For this reason, it is preferred to use eukaryotic cells for the production of mammalian recombinant proteins. However, many recombinant proteins are produced intracellularly and accumulate within the cell. In order to produce such a protein, a complicated purification process is required, so that it takes time to produce the protein and it is difficult to produce it in large quantities.
  • Patent Document 1 US Patent No. 5010003
  • Patent Document 2 US Pat. No. 4,588,684
  • Patent Document 3 International Publication No. W000 / 09718 Pamphlet Disclosure of Invention
  • An object of the present invention is to provide a method for efficiently using a recombinant protein by expressing the recombinant protein in a eukaryotic host and releasing it from the cell.
  • the present inventors diligently studied a method for producing a protein more efficiently than conventional techniques in a method for expressing a recombinant protein in a host cell and releasing it outside the cell.
  • the present inventors code an endoplasmic reticulum signal peptide upstream of the polynucleotide encoding the desired recombinant protein to be produced.
  • the target protein is efficiently released (secreted) to the outside of the cell by modifying the sugar chain by means such as linking the polynucleotide that encodes the glycosylated sequence by fusing and expressing the polynucleotide. I found that I can do it.
  • interleukin 4 interleukin 5, interleukin 6, interleukin 12, interleukin 13 or interpokin 31 signal sequence exemplified as the signal sequence of interleukin 4, interleukin 6, interleukin 31, It was found that the target protein can be efficiently released out of the host cell by utilizing the glycosylation sequence of IKIN, and the present invention has been completed.
  • the target protein expressed as a fusion protein downstream of the endoplasmic reticulum migration signal sequence and the glycosylation sequence is a fibroblast Cos-1 cell that is an adherent cell.
  • the sugar chain is added by inserting the glycosylated sequence, and the target protein is efficiently released outside the cell. Proved It was. Moreover, this efficient protein release was observed in fibroblasts and epithelial cells, and was observed in suspension cells and adherent cells, indicating that it was independent of the cell type.
  • glycosylation sequences also promoted protein release, confirming the importance of the existence of N-glycans, and the importance of glycosylation rather than primary structure. Proven to be high.
  • the cytokinine that is not released in its full length, mouse leukin 33 and the nuclear protein human p53 protein into the culture supernatant by the method of the present invention Due to the efficient release of two types of fluorescent proteins, the cytokinine that is not released in its full length, mouse leukin 33 and the nuclear protein human p53 protein into the culture supernatant by the method of the present invention, The effectiveness of the present invention has been proven. In the comparison of the signal translocation signal sequence, the protein release is slightly more or less inferior, less than the effect of glycosylation, and the presence of the signal translocation signal sequence is important. The result was of any type. However, the signal sequence of mouse interleukin 33 was hardly released extracellularly, and this does not indicate the need for signal sequence selection.
  • the method of the present invention was also useful for the production of active protein.
  • protein release into a low protein medium facilitated protein purification, confirming that it is useful not only for production but also for protein production including purification.
  • a polynucleotide used for producing a recombinant protein in a host eukaryotic cell comprising a polynucleotide that encodes a fusion protein to which an N-glycosylation sequence is added, wherein the protein is expressed as a host protein. Outside the nucleus A polynucleotide for release.
  • a host eukaryotic cell comprising a polynucleotide encoding an endoplasmic reticulum migratory signal sequence, and a polynucleotide encoding a fusion protein having a type 0-glycosylation sequence added to the protein downstream of the polynucleotide.
  • a polynucleotide used for producing a recombinant protein in a cell the polynucleotide for releasing the protein out of a host eukaryotic cell.
  • [3] Endoplasmic reticulum signal sequence mouse interleukin 4 signal sequence (SEQ ID NO: 1), mouse interleukin 5 signal sequence (SEQ ID NO: 3), mouse interleukin 6 signal sequence (SEQ ID NO: 5)
  • Mouse interleukin 12 signal sequence SEQ ID NO: 7
  • mouse interleukin 13 signal sequence SEQ ID NO: 9
  • mouse interleukin 31 signal sequence SEQ ID NO: 11
  • human interleukin 13 sequence
  • a host eukaryotic cell comprising the expression vector according to [4].
  • N consisting of a polynucleotide encoding an endoplasmic reticulum signal sequence, and a sequence represented by Asn-X- (Thr / Ser) (X is an amino acid excluding proline) downstream of the polynucleotide.
  • the polynucleotide according to any one of [1 :) to [3] is introduced into a host eukaryotic cell, the host eukaryotic cell is cultured, and a protein encoded by the polynucleotide is expressed.
  • a method for producing a protein comprising: recovering a target protein from a cell culture supernatant.
  • the expression vector according to [6] or [7] is introduced into a host eukaryotic cell, the host eukaryotic cell is cultured, a protein encoded by the polynucleotide is expressed and released outside the cell, A method for producing a protein comprising recovering a target protein from a culture supernatant.
  • N-glycosylation sequence consisting of a sequence represented by Asn-X- (Thr / Ser) (X is an amino acid excluding proline) is added to the protein, and the N-glycosylation sequence is added to the N-glycosylation sequence.
  • N-glycosylation sequence consisting of a sequence represented by Asn-X- (Thr / Ser) (X is an amino acid excluding proline) is added to a protein that is not naturally glycosylated.
  • X is an amino acid excluding proline
  • the 0-glycan addition sequence is added to a protein that is not naturally glycosylated, and the 0-glycan addition sequence is linked to the 0-glycan addition sequence.
  • a polynucleotide according to any one of [1] to [3] is introduced into a non-human animal, a protein encoded by the polynucleotide is expressed in the moving object, and an antibody against the protein
  • a method for producing an antibody by DNA immunization comprising the step of:
  • Figure 1 shows Freestyle-293F using an expression vector having a polynucleotide encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 45, 46, 47, 48, 49, and 50. It is a photograph showing the results of Western blot analysis of proteins expressed in cells.
  • FIG. 2 schematically shows the arrangement of signal sequences and glycosylation sequences for various variants of amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 44, 60, 61, 62, 63, 50 and 64. It is a diagram that expresses it.
  • Fig. 3 shows a Western plot analysis of proteins expressed in Freestyle_293F cells using an expression vector having a polynucleotide encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 60, 61, 62, and 63. It is a photograph which shows a result.
  • FIG. 4 shows Western expression of a protein expressed in Cos-1 cells using an expression vector having a polynucleotide encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 44, 60, 61, 62, and 63. It is a photograph which shows the result of plot analysis.
  • FIG. 5 shows Western blot analysis of the protein expressed in Freestyle-293F cells using an expression vector having a polynucleotide encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 62 and 63. It is a photograph which shows the result.
  • FIG. 6 is a photograph showing the results of Western plot analysis of a protein expressed in Freestyle-293F cells using an expression vector having a polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 64.
  • FIG. 7 shows a sequence encoding the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 6 7, 6 8 and 6 9.
  • FIG. 5 is a photograph showing the results of Western blot analysis of a protein expressed in Freestyle-293F cells using an expression vector carrying a renucleotide.
  • Figure 8 shows the sequence selective DNA-binding ability of P 53 protein expressed in Freestyle-293F cells with an expression vector carrying a polynucleotide encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 7, and 6 9
  • FIG. 8 shows the sequence selective DNA-binding ability of P 53 protein expressed in Freestyle-293F cells with an expression vector carrying a polynucleotide encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 7, and 6 9
  • FIG. 9 shows the results of expression in Freestyle-293F cells using an expression vector having a polynucleotide encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 69, and purification of the supernatant using a nickel chelate column. It is a photograph.
  • Figure 10 is a photograph showing the results of Western blot analysis of a protein expressed in Freestyle-293F cells using an expression vector having a polynucleotide encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 73 and 74. It is.
  • FIG. 11 shows a freestyle-293F using an expression vector having a polynucleotide encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 84, 90, 91, 92, 93, 94 and 95. It is a photograph showing the results of Western blot analysis of proteins expressed in cells.
  • the signal sequence in the present invention consists of 15 to 30 amino acids that bind to a signal recognition particle (SRP) protein, which is a GTP-binding regulatory protein present in the endoplasmic reticulum, and more mainly the N-terminus.
  • SRP signal recognition particle
  • Hydrophobic amino acids include dalysin, alanine, valine, leucine, isoloicin, proline, methionine, phenylalanin, tyrosine, and tryptophan.
  • the hydrophobic amino acids in the signal sequence may be the same amino acid or different amino acids.
  • the signal moiety is first synthesized
  • SRP recognizes the signal sequence. Later, translation is temporarily halted, SRP binds to the ribosome, and this complex binds to the SRP receptor on the endoplasmic reticulum membrane. Signal sequence Is released from the SRP, penetrates the pores in the endoplasmic reticulum membrane and moves into the endoplasmic reticulum, translation is resumed, and the protein enters the endoplasmic reticulum. The signal sequence is then excised by a peptidase in the endoplasmic reticulum, and the protein is transported to the Golgi apparatus and released outside the cell.
  • the signal sequence of the present invention is not limited as long as it has an action as an endoplasmic reticulum migration signal, but is preferably a peptide sequence that is recognized and cleaved by a signal peptide recognition mechanism.
  • Examples of such a signal sequence include the signal sequence of interleukin 4, interleukin 5, interleukin 6, interleukin 12, interleukin 13, or interleukin 31.
  • the nucleotide sequences encoding the signal sequences of mouse interleukin 4, mouse interleukin 5, mouse interleukin 6, mouse interleukin 12, mouse interleukin 13 and mouse interleukin 31 are shown in SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, respectively.
  • amino acid sequences of these signal sequences are represented by SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10 and 12 respectively.
  • nucleotide sequences encoding the signal sequences of human interleukin 13 and human interleukin 31 are represented by SEQ ID NOs: 13 and 15, respectively, and the amino acid sequences of these signal sequences are respectively represented. Represented in SEQ ID NOs: 14 and 16.
  • a polynucleotide encoding the signal sequence portion may be linked upstream of the target protein, or the polynucleotide encoding the protein having the signal sequence.
  • a polynucleotide encoding a continuous fragment containing a signal sequence portion may be linked upstream of the target protein.
  • N-glycosylation sequence is an N-glycosylation sequence represented by the amino acid sequence Asn-X- (Thr / Ser).
  • X is any amino acid other than proline
  • Thr / Ser represents Thr or Ser.
  • N-linked sugar chain is Asn- X- (Thr / Ser)
  • Specific examples of the arrangement include NYS, NYT, NAS, NAT, NTS, NTT and the like.
  • a glycosylation sequence a protein is transferred to the endoplasmic reticulum, and then a glycosylation is added to the Golgi apparatus, which is unregulatedly released outside the cell.
  • the N-glycosylation sequence not only the N-glycosylation sequence but also the 0-glycosylation sequence can be used. You can also.
  • the extracellular release protein showed an increase in molecular weight on electrophoresis showing type 0-glycan modification. It is shown that chain modification also has the same activity to increase the extracellular release efficiency.
  • the target protein to be produced as a recombinant protein and released to the outside of the cell is not limited, and any protein can be produced by the method of the present invention.
  • proteins that are not released extracellularly can be listed.
  • An example of such a protein is a protein that is not naturally glycosylated in nature.
  • proteins that are not released outside the cell such as cytoplasmic proteins and nuclear proteins.
  • an extracellular secreted protein that is released in a non-regulatory manner by converting the signal sequence and adding the sugar chain sequence can be mentioned.
  • An example of such a protein is mouse IL-33.
  • a polynucleotide encoding a glycosylated sequence When a polynucleotide encoding a glycosylated sequence is used by linking to a polynucleotide encoding a target protein to be released outside the cell, the polynucleotide encoding the glycosylated sequence encodes the target protein. It may be connected to the upstream (5 'side) or downstream (3' side) of the polynucleotide. In this case, a polynucleotide encoding an endoplasmic reticulum migration signal sequence and a polynucleotide encoding a fusion protein in which a type 0-glycosylation sequence is added to the protein downstream of the polynucleotide are included.
  • SEQ ID NO: 17 shows the polynucleotide sequence (GSS_artificial) in which the N-glycan modification sequence is linked downstream (3 ′) of the polynucleotide encoding the signal sequence of mouse interleukin 31.
  • glycosylation sequence is present downstream of the endoplasmic reticulum migration signal sequence.
  • this glycosylation sequence is artificially designed and does not exist in nature.
  • a fluorescent protein was fused downstream of this sequence, a sugar chain was added and released extracellularly. Therefore, the sugar chain addition sequence is not limited to the naturally occurring sugar chain addition sequence.
  • a polynucleotide encoding a protein having an endoplasmic reticulum migration signal sequence and a sugar chain addition sequence in nature, and including a polynucleotide encoding a signal sequence included in the gene of the protein is used. You can also. In this case, upstream of the polynucleotide encoding the protein of interest to produce a continuous polynucleotide from the signal sequence of the protein gene to at least the glycosylation sequence of 0RF (open reading frame) encoding the protein ( 5 'side) and can be used. Further, a polynucleotide encoding a full-length sequence including a signal sequence of a natural protein may be linked to a polynucleotide encoding a target protein.
  • Examples of a polynucleotide encoding a natural protein containing such a signal sequence and a sugar chain addition sequence include polynucleotides encoding interleukin 13 and interleukin 31.
  • the animal species from which interleukin 13 and interleukin 31 are derived is not limited, but those derived from humans and mice can be preferably used.
  • a polynucleotide encoding mouse interleukin 31 containing the signal sequence represented by SEQ ID NO: 19 and a polynucleotide encoding human interleukin 31 containing the signal sequence represented by SEQ ID NO: 21 can be mentioned.
  • the amino acid sequences encoded by the respective polynucleotides are shown in SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 22.
  • a polynucleotide consisting of a base sequence encoding a protein having the activity of the protein encoded by can also be used.
  • stringent conditions are, for example, conditions of “1 XSSC, 0.1% SDS, 37.C”, and more severe conditions are “0.5 XSSC, 0.1% SDS, The condition is about “42 ° C”, and the more severe condition is about “0.2XSSC, 0.1% SDS, 65 ° C”.
  • murine interleukin 33 when the target protein to be expressed has a glycosylation sequence in nature, this glycosylation sequence is fused with an endoplasmic reticulum migration signal sequence. A sugar chain is added to the cell to promote extracellular release. In such a situation, since this naturally occurring sugar chain addition sequence can be used, it is necessary to link the polynucleotide encoding the sperm chain addition sequence upstream or downstream of the polynucleotide encoding the target protein. Not sure.
  • the base sequence of murine interleukin 33 is shown in SEQ ID NO: 23, and its amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 24.
  • this polynucleotide is a polynucleotide encoding the endoplasmic reticulum migration signal sequence of the present invention, and downstream of the polynucleotide, a protein of type 0-glycosylation sequence or Asp-X_ (Thr / Ser ) (Wherein X is an amino acid excluding porin) an N-type-glycosylation sequence-added polynucleotide encoding a fusion protein ”.
  • a polynucleotide consisting of a base sequence encoding a protein having the activity of a protein encoded by a polynucleotide consisting of the base sequence can also be used.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 23 and a homology search program such as BLAST are used to calculate 80% or more, preferably about 90% or more, using the default (initial setting) parameters of the program.
  • a polynucleotide comprising a nucleotide sequence having about 95% or more identity
  • the present invention includes a polynucleotide for expressing a protein of interest in a host cell and releasing (developing) the protein outside the host cell, the polynucleotide encoding an endoplasmic reticulum migratory signal sequence. 0 type-glycosylation sequence or
  • the polynucleotide includes a polynucleotide encoding an N-type glycosylation sequence consisting of the sequence represented by Asp-X- (Thr / Ser) (X is an amino acid excluding proline) and a polynucleotide encoding a target protein.
  • the polynucleotide includes a polynucleotide encoding a sugar chain addition sequence and a polynucleotide encoding a protein of interest downstream of a polynucleotide encoding an endoplasmic reticulum migration signal.
  • the polynucleotide encoding the target protein and the polynucleotide encoding the glycosylated sequence may be a polynucleotide encoding a fusion protein in which the glycosylated sequence is added to the target protein.
  • the polynucleotide encoding the fusion protein is present downstream of the polynucleotide encoding the endoplasmic reticulum translocation signal sequence.
  • a plurality of glycosylation sequences may be linked.
  • the polynucleotide used for expressing the protein of the present invention in a eukaryotic cell and releasing it out of the cell is, for example, a polynucleotide encoding an endoplasmic reticulum migration signal- ⁇ Asn-X- (Thr / Ser) ⁇ N (N is
  • other nucleotide sequences may be included between the polynucleotide encoding the endoplasmic reticulum migration signal, the polynucleotide encoding the glycosylation sequence and the polynucleotide encoding the protein of interest.
  • a promoter may be operably linked upstream of the polynucleotide.
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is suitable for the host used for gene expression.
  • the host is an enzyme
  • PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH A promoter is preferred.
  • SRa promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned.
  • an inducible promoter that acts inductively under specific conditions such as addition of a drug (inducer) may be used.
  • the polynucleotide for expressing the target recombinant protein in the eukaryotic cell of the present invention and secreting it outside the cell is further known in the art as an enhancer, splicing signal, poly A addition site, selectable marker, SV40 replication. Origin may be included.
  • the present invention relates to a polynucleotide encoding an endoplasmic reticulum translocation signal sequence, and a protein of type 0-glycosylation sequence or Asn-X- (Thr / Ser) (X is a proline) downstream of the polynucleotide.
  • the expression cassette is also included.
  • the present invention comprises a polynucleotide encoding an endoplasmic reticulum migration signal sequence, and a sequence expressed by Asn-X- (Thr / Ser) (X is an amino acid excluding proline) downstream of the polynucleotide.
  • a polynucleotide encoding a fusion protein to which an N-glycosylation sequence is added is introduced into a host eukaryotic cell, the host eukaryotic cell is cultivated, and a protein encoded by the polynucleotide is expressed. It includes a method for producing a protein, which comprises releasing the protein to the outside of the cell and recovering the target protein from the cell culture supernatant.
  • the polynucleotide for expressing the target recombinant protein in the eukaryotic cell of the present invention and releasing it outside the cell may be incorporated into a vector and introduced into the host eukaryotic cell.
  • eukaryotic cells used in the method of the present invention include yeast, insect cells, avian cells, amphibian cells, reptile cells, and mammalian cells.
  • yeasts include Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R-, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NCYC1913, NCYC2036 (Pichia pastoris) and the like.
  • Insect cells include night steal cells such as Sf21.
  • amphibian cells examples include Xenopus laevis egg cells.
  • mammalian cells examples include human cells such as HEK293 cells, FreeStyle293 cells and FL cells; monkey cells such as COS-7 and Vero; Chinese hamster cells such as CH0 and dhfr gene-deficient CH0 cells; mouse L cells and mouse AtT -Mouse cells such as 20 cells, mouse myeloma cells; rat cells such as rat GH3 cells.
  • expression vectors include pKAl, pCDM8, pSVK3, pSVL, pBK-CMV, pBK_RSV, EBV vector, pRS, and pYE82.
  • pIND / V5_His pFLAG-CMV-2, pEGFP-Nl, pEGFP-C1, etc.
  • it can be expressed as a fusion protein to which various tags such as His tag, FLAG tag, and GFP are added.
  • tags such as His tag, FLAG tag, and GFP are added.
  • cells that can be cultured under low protein concentration conditions include FreeStyle293 cells.
  • the vector is a polynucleotide encoding an endoplasmic reticulum migration signal sequence, type 0-N-type consisting of a sequence represented by glycosylation sequence or Asn-X- (Thr / Ser) (X is an amino acid excluding proline)- It includes a polynucleotide used for producing a recombinant protein in a host cell containing a polynucleotide encoding a glycosylated sequence and a polynucleotide encoding a target protein.
  • the present invention includes an expression vector for expressing such a recombinant protein and releasing it outside the host cell, and a host cell introduced with the vector.
  • a multicloning site may be included as a site for linking the target protein, and a foreign gene encoding the target protein may be incorporated into the site.
  • the vector of the present invention is a type 0-glycosylation sequence or Asn-X- (Thr / Ser) (X is an amino acid excluding proline) downstream of the polynucleotide encoding the endoplasmic reticulum migration signal sequence.
  • the recombinant vector can be introduced into yeast as long as it is a method for introducing DNA into yeast.
  • the Electroporation method [Becker, D. .. et al .: Methods. Enzyraol., 194: 182 (1990)]
  • the Spheroplus method [Hinnen, A. et al .: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75: 1929 (1978)]
  • lithium acetate method [Itoh, H .: J. Bacteriol., 153: 163 (1983)] and the like.
  • the method for introducing a recombinant vector into animal cells include the electoral position method, the calcium phosphate method, and the lipofusion method.
  • the protein of interest is expressed extracellularly, that is, cultured. It can be released into the supernatant. Cultivation is performed according to a conventional method used for culturing a host. After completion of the culture, the cells and the supernatant are separated by a known method, and the supernatant is collected. Purification of the protein contained in the culture supernatant or the extract thus obtained can be performed by appropriately combining known separation / purification methods.
  • the released protein is less contaminated or contaminated, and there is no need to use a surfactant during extraction, which is also effective for recovery as an active protein.
  • a surfactant for example, treatment with denaturing agents and surfactants such as urea, ultrasonic treatment, enzyme digestion, salting out solvent precipitation method, dialysis, centrifugation, ultrafiltration, gel filtration, SDS-PAGE, isoelectric focusing Ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography, reverse phase chromatography, and the like.
  • a sugar chain can also be removed from the produced protein using a glycolytic enzyme.
  • glycosylation may impart new activity to the expressed protein.
  • the glycosylation sequence is also effective for the preparation of useful glycoproteins.
  • the present invention includes proteins produced by the methods of the present invention.
  • the protein may undergo various modifications in the cell after being translated. Therefore, modified proteins are also included in the scope of the protein of the present invention. Examples of such post-translational modifications include elimination of N-terminal methionine, N-terminal acetylation, limited degradation by intracellular proteases, misdreylation, isoprenylation, and phosphorylation.
  • a polynucleotide encoding the endoplasmic reticulum migration signal sequence of the present invention and N-glycosylation consisting of a sequence represented by 0 type-glycosylation sequence or Asn-X- (Thr / Ser) (X is an amino acid except proline) downstream of the nucleotide.
  • a protein expression vector containing a polynucleotide encoding a fusion protein with an added sequence can be used for DNA immunization. Specifically, after introducing an expression vector for eukaryotic cells into an animal's muscle or skin by injection or gene gun, the expressed protein is released into the blood, resulting in immunity and serum that reacts with the target protein It can be produced by collecting. Examples of animals that can be used include mice, rats, rabbits, goats, and chickens. Monoclonal antibodies can be produced by hybridizing B cells collected from the spleen of immunized animals and myeloma.
  • the introduced protein since the introduced protein is released outside the cell, it can be used for gene therapy and DNA vaccines. Furthermore, it can be applied to cell therapy by establishing cells that produce extracellular secreted proteins. In addition, proteins that are present in cells and normally recognized as self can be released outside the cell to induce immunogenicity and used to create a model mouse for autoimmune diseases.
  • primer sequences SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26 were used.
  • BalbA Phus ion PCR kit using mouse spleen cell cDNA as a template
  • PCR was performed based on the instruction manual (Finnzyrae, Finland). 96 ° C 2 minutes + (98 ° C 15 seconds, 58 ° C 15 seconds, 72 ° C 1 minute) X 35 + 72 ° C 1 minute. PCR The following conditions were used unless otherwise specified.
  • the resulting PCR fragment (574b. P.) Is phosphorylated with T4 polynucleotide kinase (Invitrogen) in the presence of ATP (Invitrogen) and cloned into the EcoRV site of the cloning vector pBluescript2SK + in the form of a blunt end.
  • ATP Invitrogen
  • a Kozak sequence and EcoRI site are placed at the N-terminus, and the end codon at the C-terminus is BamHI.
  • PCR is performed using the cDNA of Balb / C mouse spleen cells as a template using primers with sequences that change at the site, and subcloning into the EcoRV site of pBluescript2SK + as in the case of raIL-31.
  • the primers represented by SEQ ID NOs: 29 and 30 are used for mouse IL-4, the primers represented by SEQ ID NOs: 31 and 32 are used for IL-5, and SEQ ID NOs: 33 and 3 are used for IL-6.
  • Primers represented by 4 were used, primers represented by SEQ ID NOs: 35 and 36 were used for IL-12, and primers represented by SEQ ID NOs: 37 and 38 were used for IL-13.
  • primer sequences SEQ ID NO: 39 and SEQ ID NO: 39 were used between the Hindlll force and Xhol sites of the mammalian expression vector pcDNA3.1-MH-A + (Invitrogen).
  • PCR using the primers represented by SEQ ID NOs: 41 and 42 using the green fluorescent protein (EGFP) expression vector pEGFP-Cl (Clonetech) as a template. Gyoku, EGFP cDNA was amplified. The resulting fragment was subcloned into the EcoRV site of pBluescript2SK +, and clones that were not mutated during PCR and oligo synthesis were selected. The plasmid was cleaved with the restriction enzymes BamHI and Sail, and the excised fragment was subcloned between the plasmid pcDNA3.1-modified + BamHI and Xhol sites, and the EGFP expression vector EGFP-H / pcDNA3. 1 vector was obtained.
  • EGFP green fluorescent protein
  • This expression vector has the following polynucleotide sequence (SEQ ID NO: 4 3) downstream of the CMV promoter, and expresses the protein of SEQ ID NO: 4 (EGFP-H). With this change, the Xhol site has been moved to a new location by ligation.
  • the mIL-4-EGFPH / pcDNA3.1 expression vector expresses the protein (mIL-4-EGFPH) represented by SEQ ID NO: 45.
  • the mIL-5-EGFPH / pcDNA3.1 expression vector expresses the protein represented by SEQ ID NO: 46 (ml 5 EGFPH).
  • the mIL-6-EGFPH / pcDNA3.1 expression vector expresses the protein (mlL-6-EGFPH) represented by SEQ ID NO: 47.
  • the raIL-12-EGFPH / pcDNA3.1 expression vector expresses the protein (mIL_12-EGFPH) represented by SEQ ID NO: 48.
  • the mlL-13_EGFPH / pcDNA3.1 expression vector expresses the protein (ralL-13-EGFPH) represented by SEQ ID NO: 49.
  • mlL31-fus / pBSK2 + was cleaved with EcoRI and Xhol, and the resulting fragment was introduced between EcoRI and Xhol of this created vector (EGFP-MH / pcDNA3.1-MH-A +).
  • a vector (mlL-31-EGFPH / pcDNA3.1) expressing a fusion protein of interleukin 31 and EGFP and a histidine tag was obtained.
  • the mIL-31-EGFPH / pcDNA3.1 expression vector expresses the protein represented by SEQ ID NO: 50 (mlL-31-EGFPH).
  • vector 1 (mIL-31-EGFPH / pcDNA3.1) was modified. Temper mlL- 31- EGFPH / pcDNA3.1 As a rate, a partial region of mIL31 was amplified by PCR using a primer (SEQ ID NO: 51) having a sequence present in the CMV promoter region of the expression vector and the primers shown below, and the obtained fragment was Cleaved with EcoRI and BamHI and introduced between EcoRI and BamHI of EGFPH / pcDNA3.1 vector to create each mutant.
  • SEQ ID NO: 51 primer having a sequence present in the CMV promoter region of the expression vector and the primers shown below
  • the relationship between the primer sequences used and the mutant expression vectors obtained was as follows. From the primer represented by SEQ ID NO: 52 and the primer represented by SEQ ID NO: 51, SS-EGFPH / pcDNA3.1 is the primer represented by SEQ ID NO: 53 and the primer represented by SEQ ID NO: 51 A-EGFPH / pcDNA3.1 Force from the primer represented by SEQ ID NO: 5 4 and the primer represented by SEQ ID NO: 51, GSS-EGFPH / pcDNA3.1, SEQ ID NO: GSS (DD) -EGFPH / pcDNA3.1 was prepared from the primer represented by 5 5 and the primer represented by SEQ ID NO: 51. ,
  • PCR was performed using primers (SEQ ID NO: 51 and SEQ ID NO: 56) using mIL-31-EGFPH / pcDNA3.1 as a template. A fragment containing the signal sequence was obtained. At the same time, PCR was performed using the synthetic oligo DNA (SEQ ID NO: 5 7) as a template and primers (SEQ ID NO: 58 and SEQ ID NO: 59) to produce a fragment having an artificial sugar chain modification site.
  • SS-EGFPH / pcDNA3.1 is represented by SEQ ID NO: 60
  • ⁇ -EGFPH / pcDNA3.1 is represented by SEQ ID NO: 61
  • GSS-EGFPH / pcDNA3.1 is represented by SEQ ID NO: 62
  • GSS (DD) -EGFPH pcDNA3.1 expresses the protein represented by SEQ ID NO: 63
  • SS-Art-EGFPH / pcDNA3.1 expresses the protein represented by SEQ ID NO: 64, respectively.
  • PCR was performed using human mononuclear cell cDNA as a template and primers (SEQ ID NO: 65 and SEQ ID NO: 6 6), and an Xhol site was placed at the C-terminus.
  • the cDNA encoding the protein was amplified.
  • the resulting fragment was phosphorylated and cloned into the EcoRV site of pBluescript 2 SK + with blunt ends.
  • Select clones without mutations during PCR synthesis or during primer synthesis, cut with BamHI and Xhol, and subclone between BamHI and Xhol of pcDNA3.1-myc-His_A +, p53 expression vector p53H / pcDNA3.1 was obtained.
  • h-p53-his / pcDNA3.1 1-MH-A + vector is digested with BamHI and Xbal, and the resulting fragment is transformed into SS-EGFPH / pcDNA3.1 or GSS-EGFPH / pcDNA3.1 BamHI and Xbal sites. Introduced in between, SS_EGFPH / pcDNA3.1 to SS_p53H / pcDNA3.1 and GSS-EGFPH / pcDNA3.1 to GSS_p53H / pcDNA3.1 were obtained.
  • SS_p53H / pcDNA3.1 is the protein represented by SEQ ID NO: 68 (ss-p53H protein), and GSS-p53H / pcDNA3.1 is the protein represented by SEQ ID NO: 69 (GSS-p53H protein).
  • SEQ ID NO: 68 ss-p53H protein
  • GSS-p53H / pcDNA3.1 is the protein represented by SEQ ID NO: 69 (GSS-p53H protein).
  • PCR was performed using primers (SEQ ID NOs: 70 and 7 1) to amplify cDNA encoding mouse interleukin 33 (mIL-33) with an Xhol site at the C-terminus. did. The resulting fragment was phosphorylated and cloned into the EcoRV site of pBluescript 2 SK + with blunt ends. Select clones without mutations during PCR synthesis or primer synthesis, cut with BamHI and Xhol, and subclone between BamHI and Xhol in pcDNA3.1-myc-His-A +, mIL-33 expression vector mIL_33H / pcDNA3.1 was obtained.
  • PCR was performed using primers (SEQ ID NOs: 71 and 72) to amplify the cDNA fragment encoding the mature part of mIL-33.
  • the resulting fragment is phosphorylated, cloned into pBluescript 2 SK + EcoRV site with blunt ends, selected by PCR and a clone without mutation during primer synthesis, cleaved with BamHI and Xhol, and SS_p53H / pcDNA3. subcloned between 1 BamHI and Xhol, yielding expression vector SS- mIL-33H / pcDNA3. 1 placing the mature type mIL_33 downstream of the signal sequence of m IL31.
  • mIL-33H / pcDNA3.1 is the protein represented by SEQ ID NO: 73 (mIL-33 protein), and SS-mIL_33H / pcDNA3.1 is the protein represented by SEQ ID NO: 74 (SS-mIL-33H protein). Each protein is expressed.
  • HEK-293 and Cos-1 cells are Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Gibco-Invitrogen), 10% fetal bovine serum, (Gibco-Invitrogen) (Hyclone, Logan, UT, USA) and Cell culture was performed in a 37 ° C 5% carbon dioxide environment using a penicillin / streptomycin (Gibco-Invitrogen) medium.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • Gibco-Invitrogen 10% fetal bovine serum
  • Cell culture was performed in a 37 ° C 5% carbon dioxide environment using a penicillin / streptomycin (Gibco-Invitrogen) medium.
  • FreeStyle293-T (FS-293T) (Invitrogen) Itoda vesicles were cultured on a rotary shaker in the presence of 8% carbon dioxide at 37 ° C according to the Invitrogen manual using the medium of FreeStyle medium (Invitrogen). .
  • HEK-293 and Cos-1 cells were transferred using Lipofectamine 2000 (Invitrogen) and the FS293-T cells were transferred using 293fectin (Invitrogen) according to the operation manual.
  • serum Low immunoglobl in fetal bovine serum (Invitrogen) was used instead to prevent non-specific detection of immunoglopurin in Western blot.
  • the cell supernatant was taken and centrifuged at 2000 g for 5 minutes to obtain the cell supernatant.
  • HEK-293 and Cos-1 cells after removing the supernatant, wash twice with the same volume of PBS as the medium, lyse the cells with the same volume of PBS containing 0.5% SDS, and heat at 100 ° C. A heat treatment was performed for 5 minutes.
  • FreeStyle_293T the cells were washed with a PBS buffer by centrifugation, the cells were lysed with PBS containing 0.5% SDS in the same amount as the medium, and then heat-treated at 100 ° C for 5 minutes.
  • the cell supernatant and cell fraction extract were subjected to Western blotting using Hybond-P (PVDF) membrane (Amersham) according to the protocol of Toyobo's CanGetSignal kit (Toyama, Japan).
  • Ant i-His-tag antibody (PM002, BL Japan) is used as the primary antibody
  • Ant i-rabbit-IgG-HRP conjugate antibody (Cat. NA934V GE healthcare% h UK) is used as the secondary antibody.
  • ECL plus Detection was carried out by exposure to Hyperfilm-ECL (Amersham) according to the detection kit protocol. '
  • the obtained image was converted into an electronic image by using an image reader Chem Doc XRS manufactured by Bio-rad, and the densitometry was performed with the attached Quantity One software.
  • PCR is performed using primers (SEQ ID NO: 75 and SEQ ID NO: 76) to amplify the cDNA encoding the fluorescent protein. After the electrophoresis, purification was carried out to obtain cDNA encoding the base sequence represented by SEQ ID NO: 77 consisting of 684 bases.
  • Phosphoric acid is added to the primer represented by SEQ ID NO: 78, mixed with an equal amount of the primer represented by SEQ ID NO: 79, annealed, and smoothed to obtain the cDNA represented by SEQ ID NO: 80. Obtained. After ligation of the cDNAs represented by SEQ ID NO: 74 and SEQ ID NO: 80 and purification, PCR was performed using the primers represented by SEQ ID NO: 79 and SEQ ID NO: 74, which were phosphorylated using this cDNA as a cage.
  • Art-DsredH / pcDNA3.1 expresses the protein (Art-DsredH protein) represented by SEQ ID NO: 84.
  • mouse IL-4 To isolate the signal sequence of mouse IL-4, perform PCR using primers (SEQ ID NO: 51 and SEQ ID NO: 85), using the mIL-4-EGFPH / pcDNA3.1 plasmid as a saddle. After purification, cleave with Hindlll and BamHI, and add plasmid Art_DsredH / pcDNA3.1.
  • mouse IL-5 To isolate the signal sequence of mouse IL-5, perform PCR using primers (SEQ ID NO: 51 and SEQ ID NO: 86), using the plasmid mIL_5_EGFPH / pcDNA3.1 as a saddle and purify Hindlll And BamHI, subcloning between the Hindlll and BamHI of the plasmid Art_DsredH / pcDNA3.1, select the clone with the desired structure, the signal sequence of mouse IL-5, the artificial glycosylation sequence and the red color A vector SS (mIL5) -Art-DsredH / pcDNA3.1 that expresses a fluorescent protein and a histidine tag as a fusion protein was obtained.
  • primers SEQ ID NO: 51 and SEQ ID NO: 86
  • the plasmid of mIL-6-EGFPH / pcDNA3.1 was used as a saddle, PCR was performed using primers (SEQ ID NO: 51 and SEQ ID NO: 87), and after purification Cleaved with Hindlll and BamHI, subcloned between Hindlll and BamHI of the plasmid Art-DsredH / pcDNA3.1, selected a clone with the desired structure, signal sequence of mouse IL-6 and artificial sugar chain A vector SS (mIL6) -Art-DsredH / pcDNA3.1 that expresses the additional sequence, red fluorescent protein and histag as a fusion protein was obtained.
  • PCR was performed using primers (SEQ ID NO: 51 and SEQ ID NO: 88) and purified by using the mIL-12-EGFPH / pcDNA3.1 plasmid as a saddle. Then, cleave with Hindlll and BamHI, perform subcloning between Hindlll and BamHI of plasmid Art-DsredH / pcDNA3.1, select a clone with the desired structure, and select the signal sequence of mouse IL-12 and artificial sugar.
  • a vector SS (raIL12) -Art-DsredH / pcDNA3.1 was obtained, in which a chain addition sequence, a red fluorescent protein, and a histidine tag were expressed as a fusion protein.
  • Expression vector containing mouse IL-31 signal peptide SS-EGFP-MH / pcDNA3.1 1-MH-A + was cleaved with Hindlll and BamHI and electrophoresed into mouse I.
  • CDNA containing 31 signal peptides was purified, subcloned between Hindlll and BamHI of plasmid Art_DsredH / pcDNA3.1, mouse IL-31 signal sequence, artificial glycosylation sequence, red fluorescent protein and histidine
  • a vector SS (mIL31) -Art-DsredH / pcDNA3.1 for expressing the tag as a fusion protein was obtained.
  • the expression vector created by the above method is SS (mIL4) -Art-DsredH / pcDNA3.1 is the protein represented by SEQ ID NO: 90, SS (mIL5) -Art- DsredH / pcDNA3.1 is SEQ ID NO: 9
  • the protein represented by 1 is represented by SS (mIL6) -Art-DsredH / pcDNA3.1 is represented by SEQ ID NO: 9 2
  • the protein represented by SS (mIL12) _Art-DsredH / pcDNA3.1 is represented by SEQ ID NO: 93.
  • SS (mIL13)-Art-DsredH / pcDNA3.1 is represented by SEQ ID NO: 94
  • SS (mIL31) _Art-DsredH / pcDNA3.1 is represented by SEQ ID NO: 95.
  • Each protein is expressed by the CMV promoter.
  • Fig. 1 shows the results of detecting the expressed protein by Western plotting with an antibody that recognizes the histidine tag at the C terminus after electrophoresis by SDS-PAGE using the cell fraction and cell supernatant as samples.
  • Fig. 1 shows the results of detecting the expressed protein by Western plotting with an antibody that recognizes the histidine tag at the C terminus after electrophoresis by SDS-PAGE using the cell fraction and cell supernatant as samples.
  • Interleukin 6 does not have an N-type glycosylation sequence, but a protein that appears to be glycosylated is released in the supernatant. A fusion protein of interleukins 13 and 31 is efficiently released into the medium.
  • SEQ ID NO: 4 4 (EGFP-H) SEQ ID NO: 60 (SS_EGFPH / pcDNA3.1), SEQ ID NO: 61 ( ⁇ -EGFPH / pcDNA3.1), SEQ ID NO: 62 (GSS-EGFPH / pcDNA3.1), Sequence No. 63 (GSS (DD) -EGFPH / pcDNA3.1), SEQ ID NO: 50 (mIL-31-EGFPH) and SEQ ID NO: 64 (SS-Art-EGFPH / pcDNA3.1)
  • Figure 2 shows a schematic diagram of the arrangement of the signal sequence and glycosylation sequence for various mutants. In the figure, the part indicated by the black triangle indicates the position of addition of the N-type sugar chain in each mutant, and the number indicates the position of the amino acid.
  • A is SS-EGFPH (SEQ ID NO: 60), b is ⁇ -EGFPH (SEQ ID NO: 61), c is GSS-EGFPH (SEQ ID NO: 62), d is GSS (DD) -EGFPH (SEQ ID NO: 60) 6 3) is shown.
  • Fig. 3 it can be seen that not only the signal sequence but also the N-type glycosylation sequence allows the fusion protein to be efficiently released into the medium.
  • FIG. 4 shows the results of detecting the expressed protein by Western plotting using an antibody that recognizes the C-terminal histidine tag after electrophoresis using SDS-PAGE with the supernatant as a sample.
  • C below the electrophoresis photograph indicates the cell fraction, and S indicates the supernatant fraction.
  • A is EGFPH (SEQ ID NO: 4 4), b is SS-EGFPH (SEQ ID NO: 60), c is ⁇ -EGFPH (SEQ ID NO: 6 1), d is GSS-EGFPH (SEQ ID NO: 6 2), e is GSS (DD)-EGFPH (SEQ ID NO: 63) is shown.
  • Fig. 4 the same results as in Fig. 3 can be confirmed not only in suspended cells but also in adherent cells.
  • Cell fraction and supernatant fraction were treated with N-glycosydase F under denaturing conditions to remove N-type sugar chains, and each sample was electrophoresed with 12.5% SDS-PAGE.
  • Fig. 5 shows the results of Western blot analysis of the C-terminal histidine tag after electrophoresis. In Fig. 5, C below the electrophoresis photograph indicates the cell fraction and S indicates the supernatant fraction.
  • FIG. 6 shows the results of detecting the expressed protein by Western plotting using an antibody that recognizes the C-terminal histidine tag after electrophoresis by PAGE.
  • C below the electrophoresis photograph indicates the cell fraction and S indicates the supernatant fraction.
  • the artificially designed glycosylation sequence has a sugar chain attached, releasing the EGFP protein. It was issued.
  • a polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 (p53H / pcDNA3.1), SEQ ID NO: 68 (SS-p53H / pcDNA3.1) and SEQ ID NO: 69 (GSS-p53H / pcDNA3.1) Expressed in Freestyle-293F cells using the retained expression vector, electrophoresed by SDS-PAGE using the cell fraction and cell supernatant as a sample, and then expressed by Western plotting with an antibody that recognizes the C-terminal histidine tag
  • Figure 7 shows the result of detecting.
  • C at the bottom of the electrophoresis photograph indicates the cell fraction and S indicates the supernatant fraction.
  • p53 protein was detected in the supernatant of only the GSS_p53H expression protein in which the endoplasmic reticulum transition signal sequence was added to the glycosylation sequence.
  • FIG. 8 shows the results of measuring the selective DNA binding ability of the p53 protein with the Trans-AM kit and measuring the selective DNA binding ability as absorbance at 450 nm.
  • the activity of p53 protein '14 was measured using TransAM p53 (Cat. 41196) manufactured by Active Motif according to the attached instructions. As shown in FIG. 8, by adding GSS, the activated p53 protein was released extracellularly.
  • Fig. 9 shows the results of analysis of the expression vector expressed in Freestyle-293F cells using an expression vector having a polynucleotide encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 69 and purified using a nickel chelate column. Shown in
  • the eluate was concentrated with an Araicon Ultra-15 ultrafiltration concentration filter (Cat.
  • UFC901024 manufactured by Millipore and dialyzed in PBS. The obtained sample was subjected to SDS-PAGE electrophoresis and stained with Coomassie.
  • WB shows Western plot analysis with C-terminal histidine tag before purification, and CBB shows an image of purified protein subjected to Coomassie staining.
  • the arrowhead indicates the position of the p53 protein.
  • the interleukin 33 signal sequence does not release the protein into the supernatant, but by replacing it with the interleukin 31 signal sequence, Protein was released in the form of sugar chain attached.
  • SEQ ID NO: 8 4 (Art-Dsred protein), SEQ ID NO: 90 (mIL4), SEQ ID NO: 9 1 (mIL5), SEQ ID NO: 9 2 (mIL6), SEQ ID NO: 9 3 (mIL12), SEQ ID NO: 9 4 (mIL13) and it was expressed in Free S tyl e -293F cells with an expression vector harboring a polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 5 (mIL31), by SDS-PAGE of cell fractions and the supernatant fraction as a sample
  • Figure 11 shows the results of Western plot analysis in which electrophoresis was performed and the histidine tag added to the C-terminus was detected.
  • C below the electrophoresis photograph indicates the cell fraction and S indicates
  • Figure 11 shows a comparison of the released proteins, so we can see the impact of each mouse interleukin signal sequence release. No protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 84 without a signal sequence was released, but any protein was released efficiently when there was a signal sequence. Artificial glycosylation sequences have also been shown to be effective for extracellular release.
  • a polynucleotide encoding an endoplasmic reticulum signal sequence a polynucleotide encoding an N-type glycosylation sequence consisting of a sequence represented by Asn_X- (Thr / Ser) (X is an amino acid excluding proline) or 0
  • a polynucleotide encoding a type-glycosylation sequence and a polynucleotide encoding a target protein are introduced into a host eukaryotic cell, the cell is cultured, and the protein is expressed, the target protein modified with a sugar chain is expressed. Quality is efficiently released out of the host cell.
  • the target protein can be efficiently purified by expressing the introduced protein that is not originally released outside the cell and releasing it outside the cell.
  • the originally released protein can be designed with attention to glycosylation, thereby improving the release efficiency to the outside of the cell, and subsequent purification and the like can be performed efficiently.

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Abstract

組換えタンパク質を真核細胞宿主で発現させ、細胞外に放出させることにより、組換えタンパク質を効率 的に製造する方法の提供。　小胞体移行性シグナル配列とAsn-X-(Thr/Ser)（Xはプロリンを除くアミノ酸）で表される配列からなる糖鎖付加配列をコードするポリヌクレオチド、及び小胞体移行性シグナル配列を融合させても効率的に宿主外へ放出されない目的蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞内で組換えタンパク質を製造するために用いるポリヌクレオチドであって、前記目的タンパク質を糖鎖修飾に依存して宿主細胞外に放出させるポリヌクレオチド。

Description

真核細胞において組換えタンパク質を細胞外に放出させるための
ポリヌクレオチド
技術分野
本発明は、 真核細胞で発現させようとするタンパク質をコードするポリヌクレ ォチドにシグナル配列及び糖鎖付加配列を連結させ、 該タンパク質を真核細胞又 明
は動物で発現させ、 細胞外に放出させる方法、 並びにその方法に用いるポリヌク 田
レオチド、 ベクター及び宿主細胞に関する。 背景技術
遺伝子より翻訳されるタンパク質は生体における機能において重要な役割を担 つている。 遺伝子組換え技術の発展により、 目的遺伝子の発現方法及びその精製 法が開発されてきた。
哺乳類のタンパク質の発現は、 本来発現している細胞において発現させるのが 望ましいが、 その細胞が用いられないときは、 タンパク質の折りたたみ等を考慮 すると系統的に本来の細胞に近い細胞が望ましい。 このため、 ほ乳類の組換えタ ンパク質の製造には、 真核細胞を用いるのが好ましい。 しかしながら、 多くの組 換えタンパク質は細胞内で生産され、 細胞内に蓄積する。 このようなタンパク質 を製造するためには、 複雑な精製工程が必要になるため、 タンパク質の製造に時 間がかかり、 また大量に製造することも困難であった。
このため、 酵母を用いた組換えタンパク質の製造において、 細胞内で発現させ る組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列にシグナル配列を連結さ せて、 発現させた組換えタンパク質を細胞外に放出させる方法やそのためのべク ターが種々開発されていた （特許文献 1〜3を参照）。
しかしながら、 従来法では、 例えば比較的高分子量のタンパク質の細胞外への 放出効率は必ずしも高くなく、 組換えタンパク質をより効率的に細胞外へ放出す る系の開発が望まれていた。 特許文献 1 米国特許第 5010003号公報
特許文献 2 米国特許第 4588684号公報
特許文献 3 国際公開第 W000/09718号パンフレッ ト 発明の開示
本発明は、 組換えタンパク質を真核細胞宿主で発現させ、 細胞外に放出させる ことにより、 組換えタンパク質を効率的に利用する方法の提供を目的とする。 本発明者らは、 組換えタンパク質を宿主細胞内で発現させ、 細胞外に放出させ る方法において、 従来の技術よりも効率的にタンパク質を製造する方法について 鋭意検討を行った。 本発明者らは、 組換えタンパク質を宿主細胞内で発現させる 際に、 製造しようとする目的の組換えタンパク質をコードするポリヌクレ.ォチド の上流に小胞体移行性のシグナルぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチドを融合 して発現させ、 さらに糖鎖付加配列をコードするポリヌクレオチドを連結させる などの工夫により、 糖鎖修飾させることにより、 目的のタンパク質を効率的に細 胞外に放出 （分泌） させることができることを見出した。
この際、 小胞体移行性である、 インターロイキン 4、 インターロイキン 5、 ィ ンターロイキン 6、 インタ一ロイキン 12、 インターロイキン 13又はインター口 ィキン 31 のシグナル配列として例示されるシグナル配列と例示したインター口 ィキンの糖鎖付加配列を利用することにより、 効率的に目的のタンパク質を宿主 細胞外に放出できることを見出し、 本発明を完成させるに至った。
また、 前記の小胞体移行性シグナル配列と人工的に設計した糖鎖付加配列を融 合させることにより発現させたタンパク質の細胞外への放出は小胞体移行性シグ ナル配列の種類にはあまり依存せず、 糖鎖修飾の存在に大きく依存し、 一方で放 出されるぺプチド配列の構造には大きくは依存していないことを見出した。
本発明において、 小胞体移行性シグナル配列と糖鎖付加配列を融合したタンパ ク質として用いることにより、 その下流に融合タンパク質として発現させた目的 タンパク質は、 接着細胞である繊維芽細胞 Cos-1細胞、 及ぴ浮遊細胞で上皮細胞 である Freestyle293 - F細胞によつて発現させたところ、糖鎖付加配列の挿入によ り糖鎖が付加され、 効率的に細胞外に目的タンパク質が放出されることが証明さ れた。 また、 この効率の良いタンパク質放出は、 繊維芽細胞及び上皮細胞で観察 され、 また、 浮遊細胞及び接着細胞で観察されたことより、 細胞種に依存しない ことが示された。
変異体の解析により、 糖鎖が付加されないとタンパク質は効率的に細胞外に放 出されないことが判明し、 また糖鎖分解酵素による解析で糖鎖付加配列を導入し たタンパク質では N型糖鎖付加の修飾がされていることが証明された。
また、 人工的に設計した糖鎖付加配列によっても、 タンパク質の放出が促進さ れたことより、 N-型糖鎖の存在自体の重要性が認められ、 一次構造よりも糖鎖修 飾の重要性が高いことが証明された。
2種類の蛍光タンパク質、 及び全長では放出されないサイ トカインであるマウ スィンターロイキン 33及び核タンパク質であるヒ ト p53タンパク質が本発明の方 法で培養上清中に効率的に放出されたことより、 本発明の有効性が証明された。 小胞体移行性シグナル配列の比較では、 タンパク質放出に関しては多少の差こ そあれ優劣はっけがたく、 糖鎖付加による影響に比べて小さく、 小胞体移行性シ グナル配列の存在こそが重要で、 余り種類は問わない結果となった。 しかし、 マ ウスィンターロイキン 33のシグナル配列では、ほとんど細胞外放出が行われなか つたので、 シグナル配列の選択の不必要性を示唆するものではない。
比較的大きいヒ トの癌抑制遺伝子産物であるヒ ト p53タンパク質が活性を持つ て放出されたことより、 本発明の手法は活性型のタンパク質の生産についても有 用性が認められた。
また、 低タンパク質培地中へのタンパク質の放出により、 タンパク質精製が非 常に容易にできたことより、 生産のみならず精製を含めたタンパク質生産に有用 であることが確認された。
すなわち、 本発明の態様は以下のとおりである。
[ 1 ] 小胞体移行性シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、 及び該ポリヌ クレオチドの下流に、 タンパク質に Asn-X- (Thr/Ser) (Xはプロリンを除くァミノ 酸）で表される配列からなる N型-糖鎖付加配列が付加された融合タンパク質をコ 一ドするポリヌクレオチドを含む、 宿主真核細胞内で組換えタンパク質を製造す るために用いるポリヌクレオチドであって、 前記タンパク質を宿主真核細胞外に 放出させるためのポリヌクレオチド。
[ 2 ] 小胞体移行性シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、 及び該ポリヌ クレオチドの下流に、タンパク質に 0型-糖鎖付加配列が付加された融合タンパク 質をコードするポリヌクレオチドを含む、 宿主真核細胞内で組換えタンパク質を 製造するために用いるポリヌクレオチドであって、 前記タンパク質を宿主真核細 胞外に放出させるためのポリヌクレオチド。
[ 3 ] 小胞体移行性シグナル配列が、 マウスインターロイキン 4のシグナル配列 (配列番号 1 )、 マウスインターロイキン 5のシグナル配列 （配列番号 3 )、 マウ スインターロイキン 6 のシグナル配列 （配列番号 5 )、 マウスインターロイキン 12のシグナル配列（配列番号 7 )、マウスインタ一ロイキン 13のシグナル配列（配 列番号 9 )、 マウスインターロイキン 31のシグナル配列 （配列番号 1 1 )、 ヒ トイ ンターロイキン 13 (配列番号 1 3 ) のシグナル配列及びヒ トインターロイキン 31 のシグナル配列 （配列番号 1 5 ) からなる群から選択される、 [ 1 ]又は [ 2 ]のポ リヌクレオチド。
[ 4 ] [ 1：！〜 [ 3 ]のいずれかのポリヌクレオチドを含む、 組換えタンパク質を発 現し宿主真核細胞外に放出させるための発現ベクター。
[ 5 ] [ 4 ]の発現べクタ一を含む宿主真核細胞。
[ 6 ] 小胞体移行性シグナル配列をコ一ドするポリヌクレオチド、 及び該ポリヌ クレオチドの下流に、 Asn-X- (Thr/Ser) (Xはプロリンを除くアミノ酸） で表され る配列からなる N型-糖鎖付加配列をコードするポリヌクレオチドを含み、前記小 胞体移行性シグナル配列をコードするポリヌクレオチドの下流でありかつ該 N型
-糖鎖付加配列をコードするポリヌクレオチドの上流若しくは下流に、発現させよ うとする目的タンパク質をコードする外来遺伝子を導入可能なマルチクローニン グ部位を含む、 宿主真核細胞内で組換えタンパク質を製造するために用いる発現 ベクターであって、 前記目的タンパク質を宿主真核細胞外に放出させるための発 現ベクター。
[ 7 ] 小胞体移行性シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、 及び該ポリヌ クレオチドの下流に、 0 型-糖鎖付加配列をコードするポリヌクレオチドを含み、 前記小胞体移行性シグナル配列をコードするポリヌクレオチドの下流でありかつ 該 o型-糖鎖付加配列をコードするポリヌクレオチドの上流若しくは下流に、発現 させようとする目的タンパク質をコードする外来遺伝子を導入可能なマルチク口 一ユング部位を含む、 宿主真核細胞内で組換えタンパク質を製造するために用い る発現ベクターであって、 前記目的タンパク質を宿主細胞外に放出させるための 発現ベクター。
[8] [1：)〜 [3]のいずれかのポリヌクレオチドを宿主真核細胞に導入し、 該宿 主真核細胞を培養し、 前記ポリヌクレオチドがコ一ドするタンパク質を発現させ 細胞外に放出させ、 細胞培養上清より 目的タンパク質を回収することを含む、 タ ンパク質の製造方法。
[9] [6]又は [7]の発現ベクターを宿主真核細胞に導入し、 該宿主真核細胞を 培養し、 前記ポリヌクレオチドがコ一ドするタンパク質を発現させ細胞外に放出 させ、 細胞培養上清より 目的タンパク質を回収することを含む、 タンパク質の製 造方法。
[1 0] [8]又は [9]の方法により製造されたタンパク質。
[1 1] タンパク質に Asn-X-(Thr/Ser) (Xはプロリンを除くアミノ酸） で表され る配列からなる N型-糖鎖付加配列が付加され、該 N型-糖鎖付加配列に N型-糖鎖 が結合し糖鎖修飾された [1 0]のタンパク質。
[1 2] 天然において糖鎖修飾されない'タンパク質に Asn-X-(Thr/Ser) (Xはプロ リンを除くアミノ酸） で表される配列からなる N型-糖鎖付加配列が付加され、該 N型-糖鎖付加配列に N型-糖鎖が結合した、 [1 1 ]の糖鎖修飾されたタンパク質。
[1 3] タンパク質に 0型 -糖鎖付加配列が付加され、 該 0型-糖鎖付加配列に 0 型-糖鎖が結合し糖鎖修飾された [1 0]のタンパク質。 ·
[14] 天然において糖鎖修飾されないタンパク質に 0 型-糖鎖付加配列が付加 され、 該 0型-糖鎖付加配列に 0型-糖鎖が結合した、 [1 3]の糖鎖修飾されたタ ンパク質。
[1 5] [1]〜[3]のいずれかのポリヌクレオチドを非ヒ ト動物に導入し、 該動 物体内で前記ポリヌクレオチドがコ一ドするタンパク質を発現させ、 該タンパク 質、に対する抗体を製造させることを含む、 DNA免疫による抗体の製造方法。
[1 6] 小胞体移行性シグナル配列と Asn_X- (Thr/Ser) (Xはプロリンを除くアミ ノ酸）で表される配列からなる糖鎖付加配列をコードするポリヌクレオチド及び、 小胞体移行性シグナル配列を融合させても効率的に宿主外へ放出されない目的蛋 白質をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞内で組換えタンパク質を製造 するために用いるポリヌクレオチドであって、 前記目的タンパク質を糖鎖修飾に 依存して宿主細胞外に放出させるポリヌクレオチド。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2008- 149275号の明細書 および Zまたは図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 配列番号 4 5 、 4 6 、 4 7 、 4 8 、 4 9及び 5 0で表されるアミノ酸 配列をコー ドするポリ ヌク レオチ ドを保有する発現べク ターを用いて Freestyle - 293F 細胞に発現させたタンパク質のウェスタンブロッ ト解析の結果 を示す写真である。
図 2は、 配列番号 4 4 、 6 0 、 6 1 、 6 2 、 6 3 、 5 0及び 6 4で表されるァ ミノ酸配列の各種変異体についてシグナル配列及び糖鎖付加配列の配置を模式的 に表した図である。
図 3は、 配列番号 6 0 、 6 1 、 6 2及び 6 3で表されるアミノ酸配列をコード するポリヌクレオチドを保有する発現べクタ一を用いて Freestyle_293F 細胞に 発現させたタンパク質のウェスタンプロット解析の結果を示す写真である。
図 4は、 配列番号 4 4 、 6 0 、 6 1 、 6 2及び 6 3で表されるアミノ酸配列を コードするポリヌクレオチドを保有する発現ベクターを用いて Cos- 1細胞に発現 させたタンパク質のウェスタンプロット解析の結果を示す写真である。
図 5は、 配列番号 6 2及び 6 3で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌク レオチドを保有する発現べクタ一を用いて Freestyle-293F 細胞に発現させたタ ンパク質のウェスタンブ ύット解析の結果を示す写真である。
図 6は、 配列番号 6 4のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを保有す る発現ベクターを用いて Freestyle- 293F 細胞に発現させたタンパク質のウェス タンプロッ ト解析の結果を示す写真である。
図 7は、 配列番号 6 7 、 6 8及び 6 9で表されるアミノ酸配列をコードするポ リヌクレオチドを保有する発現ベクターを用いて Freestyle- 293F 細胞に発現さ せたタンパク質のウェスタンブロッ ト解析の結果を示す写真である。
図 8は、 配列番号 6 7及び 6 9で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌク レオチドを保有する発現ベクターを用いて Freestyle-293F細胞に発現させた P53 タンパク質の配列選択的 DNA結合能を示す図である。
図 9は、 配列番号 6 9で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド を保有する発現ベクターを用いて Freestyle-293F細胞に発現させ、その上清を二 ッケルキレートカラムにより精製した結果を示す写真である。
図 1 0は、 配列番号 7 3及び 7 4で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌ クレオチドを保有する発現ベクターを用いて Freestyle - 293F 細胞に発現させた タンパク質のウェスタンブロッ ト解析の結果を示す写真である。
図 1 1は、 配列番号 8 4、 9 0、 9 1、 9 2、 9 3、 9 4及び 9 5で表される ァミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを保有する発現ベクターを用いて Freestyle - 293F 細胞に発現させたタンパク質のウェスタンブロッ ト解析の結果 を示す写真である。
発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。
本発明におけるシグナル配列は、 小胞体に存在する GTP結合性の調節タンパク 質であるシグナル認識粒子 （s ignal recognition particle : SRP)タンパク質に結 合する、 15〜30アミノ酸よりなり、 さらに主に N末端にある 5〜10個の連続する 疎水性アミノ酸よりなる疎水性コアを有する小胞体移行性のシグナル配列である。 疎水性アミノ酸には、 ダリシン、 ァラニン、 バリン、 ロイシン、 ィソロイシン、 プロリン、 メチォニン、 フエ二ルァラニン、 チロシン、 トリプトファンが含まれ る。 シグナル配列中の疎水性アミノ酸は同じアミノ酸であってもよいし、 異なる アミノ酸であってもよい。
リボソームにおけるタンパク質の翻訳の際、 最初にシグナル部分が合成され、
SRPがシグナル配列を認識する。 その後、 翻訳が一時的に中止され、 SRPはリボソ ームと結合し、 この複合体が小胞体膜上の SRP受容体に結合する。 シグナル配列 が SRPから解離し、 小胞体膜にある小孔を貫通して小胞体内に移動すると翻訳が 再開され、 タンパク質が小胞体内に入る。 そしてシグナル配列が小胞体内のぺプ チダーゼによって切除され、 タンパク質がゴルジ体に輸送され、 細胞外に放出さ れる。
本発明のシグナル配列は、 小胞体移行性シグナルとしての作用を有する配列な らば限定されないが、 好ましくはシグナルペプチド認識機構によって、 認識され 切断されるぺプチド配列である。 このようなシグナル配列として、 例えば、 ィン ターロイキン 4、インターロイキン 5、インターロイキン 6、インターロイキン 12、 ィンターロイキン 13、 若しくはィンターロイキン 31 のシグナル配列が挙げられ る。 マウスインターロイキン 4、 マウスインターロイキン 5、 マウスインターロイ キン 6、 マウスインターロイキン 12、 マウスインターロイキン 13及びマウスィン ターロイキン 31のシグナル配列をコードする塩基配列を、 それぞれ配列番号 1、 3、 5、 7、 9及び 1 1に表し、 これらのシグナル配列のアミノ酸配列をそれぞ れ配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0及び 1 2に表す。 また、 ヒ トインターロイキン 13、及びヒ トインターロイキン 31のシグナル配列をコードする塩基配列を、それ ぞれ配列番号 1 3及び 1 5に表し、 これらのシグナル配列のアミノ酸配列を、 そ れぞれ配列番号 1 4及び 1 6に表す。
シグナル配列を有するタンパク質のシグナル配列を利用する場合、 シグナル配 列部分をコードするポリヌクレオチドのみを目的のタンパク質の上流に連結させ てもよいし、 シグナル配列を有する該タンパク質をコードするポリヌクレオチド であって、 シグナル配列部分を含む連続する断片をコードするポリヌクレオチド を目的のタンパク質の上流に連結させてもよい。
N型-糖鎖付加配列 (N型-糖鎖修飾配列） は、 アミノ酸配列、 Asn-X- (Thr/Ser) で表される N型-糖鎖付加配列である。 ここで、 Xはプロリン以外の任意のァミノ 酸であり、 Thr/Ser は Thr 又は Ser を示す。 N-結合型糖鎖が Asn- X- (Thr/Ser)
(NXT/S)の Asnに N-結合型で結合する。 該配列の具体例として、 NYS、 NYT、 NAS、 NAT、 NTS, NTT 等が挙げられる。 糖鎖付加配列が存在するとタンパク質が小胞体 に移行後ゴルジ体において糖鎖が付加され、 非調節性に細胞外へ放出される。 本発明において、 N型-糖鎖付加配列のみならず、 0型-糖鎖付加配列を用いるこ ともできる。 EGFPタンパク質と融合させ発現させた実験において、 細胞外放出タ ンパク質は 0型-糖鎖修飾を示す電気泳動上で分子量の増加が示されており、これ は N型のみならず 0型 -糖鎖修飾も同様の細胞外放出効率を上昇させる活性を有す ることを示す。
本発明において、 組換えタンパク質として産生させ細胞外に放出させる目的の タンパク質は限定されず、 あらゆるタンパク質を本発明の方法で生産することが できる。
好ましくは、 細胞外に放出されないタンパク質が列挙できる。 このようなタン パク質として、 例えば天然において本来糖鎖修飾されないタンパク質が挙げられ る。 さらに、 細胞質タンパク質、 核タンパク質等細胞外に放出されないタンパク 質が挙げられる。 さらに、 シグナル配列を変換し糖鎖配列が付加されたことによ り、 非調節的に放出される細胞外分泌タンパク質を挙げることができる。 このよ うなタンパク質として、 例えばマウス IL-33が挙げられる。
糖鎖付加配列をコードするポリヌクレオチドを、 細胞外に放出させる目的のタ ンパク質をコードするポリヌクレオチドに連結させて用いる場合、 糖鎖付加配列 をコードするポリヌクレオチドは、 目的のタンパク質をコードするポリヌクレオ チドの上流 （5'側） に連結しても、 下流（3'側） に連結してもよい。 この場合、 小 胞体移行性シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、 及び該ポリヌクレオチ ドの下流に、タンパク質に 0型-糖鎖付加配列が付加された融合タンパク質をコー ドするポリヌクレオチドを含む。
配列番号 1 7にマウスインターロイキン 31 のシグナル配列をコードするポリ ヌクレオチドの下流（3'側） に N型-糖鎖修飾配列を連結したポリヌクレオチドの 配列 （GSS_artificial)を示す。 該ポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列
(GSSアミノ酸） を配列番号 1 8に示す。 配列番号 1 8に表されるアミノ酸におい て糖鎖付加配列が小胞体移行性シグナル配列の下流に存在している。 しかしなが ら、 この糖鎖付加配列は人工的に設計されたものであり、 天然には存在しない。 N 型-糖鎖が付加され得るアミノ酸は 4箇所存在する。この配列の下流に蛍光タンパ ク質を融合させたところ、 糖鎖が付加され細胞外に放出された。 従って、 糖鎖付 加配列は天然に存在する糖鎖付加配列に限定されない。 また、 天然において小胞体移行性シグナル配列及び糖鎖付加配列を有するタン パク質をコードするポリヌクレオチドであって、 そのタンパク質の遺伝子が含む シグナル配列をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを利用する こともできる。 この場合、 そのタンパク質の遺伝子のシグナル配列からタンパク 質をコードする 0RF (open reading frame) の少なくとも糖鎖付加配列までの連続 するポリヌクレオチドを製造しようとする目的のタンパク質をコードするポリヌ クレオチドの上流（5'側） に連結して用いることができる。 また、 目的のタンパク 質をコードするポリヌクレオチドに天然のタンパク質のシグナル配列を含む全長 配列をコードするポリヌクレオチドを連結してもよい。
このようなシグナル配列及び糖鎖付加配列を含む天然のタンパク質をコードす るポリヌクレオチドとして、 インタ一ロイキン 13及びィンターロイキン 31をコ 一ドするポリヌクレオチドが挙げられる。インターロイキン 13及びインターロイ キン 31が由来する動物種は限定されないが、 ヒ ト、マウス由来のものが好適に用 い得る。
例えば、 配列番号 1 9に表されるシグナル配列を含むマウスインターロイキン 31をコードするポリヌクレオチド、配列番号 2 1に表されるシグナル配列を含む ヒ トインターロイキン 31をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。それぞれ のポリヌクレオチドがコ一ドするアミノ酸配列を配列番号 2 0及び配列番号 2 2 に示す。
これらの塩基配列と相補的な配列からなる塩基配列からなるポリヌクレオチド とストリンジヱントな条件でハイブリダィズすることができるポリヌクレオチド であって、 配列番号 1 9又は 2 1に表される塩基配列からなるポリヌクレオチド がコードするタンパク質の活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からな るポリヌクレオチドも用いることができる。 ここで、 「ストリンジェントな条件」 とは、 例えば、 「1 XSSC、 0. 1% SDS、 37。C」 程度の条件であり、 より厳しい条件 としては 「0. 5XSSC、 0. 1% SDS、 42°C」 程度の条件であり、 さらに厳しい条件と しては 「0. 2XSSC、 0. 1% SDS、 65°C」 程度の条件である。 このようにハイブリダ ィゼーションの条件が厳しくなるほど高い相同性を有する DNAの単離、 検出を期 待しうる。 ただし、 上記の SS SDS及び温度の条件の組み合わせは例示であり、 当業者であればハイブリダィゼーションのストリンジエンシーを決定する上記若 しくは他の要素 （例えば、 ポリヌクレオチド濃度、 ポリヌクレオチドの長さ、 ハ イブリダィゼーシヨンの反応時間など） を適宜組み合わせることにより、 上記と 同様のストリンジエンシーを実現することが可能である。 また、 配列番号 1 9又 は 2 1に表される塩基配列と B L A S T等の相同性検索プログラムを用いて該プ ログラムのデフォルト （初期設定） のパラメータを用いて算出される 80%以上、 好ましくは約 90%以上、より好ましくは約 95%以上の同一性を有する塩基配列か らなるポリヌクレオチドも用いることができる。
なお、マウスィンターロイキン 33に例示されるように、発現させようとする目 的タンパク質が天然において糖鎖付加配列を有する場合、 小胞体移行性シグナル 配列と融合させることにより、 この糖鎖付加配列に糖鎖が付加され、 細胞外放出 が促進される。 このような状況では、 この天然において存在する糖鎖付加配列を 利用することができるので、 目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの上 流又は下流に精鎖付加配列をコードするポリヌクレオチドを連結する必要は必ず しもない。 マウスィンターロイキン 33の塩基配列を配列番号 2 3に、そのアミノ 酸配列を配列番号 2 4に示す。 この場合も、このポリヌクレオチドは本発明の「小 胞体移行性シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、 及び該ポリヌクレオチ ドの下流に、 タンパク質に 0型-糖鎖付加配列若しくは Asp- X_ (Thr/Ser) (Xはプ 口リンを除くアミノ酸）で表される配列からなる N型-糖鎖付加配列が付加された 融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド」 に包含される。 また、 配列番号 2 3に表される塩基配列と相補的な配列からなる塩基配列からなるポリヌクレオ チドとストリンジヱントな条件でハイブリダイズすることができるポリヌクレオ チドであって、 配列番号 2 3に表される塩基配列からなるポリヌクレオチドがコ 一ドするタンパク質の活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるポ リヌクレオチドも用いることができる。 さらに、 配列番号 2 3に表される塩基配 列と B L A S T等の相同性検索プログラムを用いて該プログラムのデフオルト (初期設定）のパラメータを用いて算出される 80%以上、好ましくは約 90%以上、 より好ましくは約 95%以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチ ドも用いることができる。 本発明は、 目的のタンパク質を宿主細胞で発現させ、 該宿主細胞外に放出 （分 泌） させるためのポリヌクレオチドを包含し、 該ポリヌクレオチドは、 小胞体移 行性シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、 0 型-糖鎖付加配列若しくは
Asp-X- (Thr/Ser) (Xはプロリンを除くアミノ酸） で表される配列からなる N型- 糖鎖付加配列をコードするポリヌクレオチド並びに目的タンパク質をコードする ポリヌクレオチドを含む。 該ポリヌクレオチドは小胞体移行性シグナルをコード するポリヌクレオチドの下流に、 糖鎖付加配列をコードするポリヌクレオチド及 び目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。 目的のタンパク質を コードするポリヌクレオチドと糖鎖付加配列をコードするポリヌクレオチドは、 目的のタンパク質に糖鎖付加配列が付加された融合タンパク質をコードするポリ ヌクレオチドであってもよレ、。 該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド は、小胞体移行性シグナル配列をコードするポリヌクレオチドの下流に存在する。 糖鎖付加配列は、 複数連結してもよい。 すなわち、 本発明のタンパク質を真核細 胞で発現させ細胞外に放出させるために用いるポリヌクレオチドは、 例えば、 小 胞体移行性シグナルをコードするポリヌクレオチド- {Asn-X- (Thr/Ser) } N (Nは、
1〜5の整数）をコードするポリヌクレオチド -目的のタンパク質をコードするポ リヌクレオチドからなる。 また、 小胞体移行性シグナルをコードするポリヌクレ ォチド、 糖鎖付加配列をコードするポリヌクレオチド及び目的のタンパク質をコ 一ドするポリヌクレオチドの間には、 他のヌクレオチド配列が含まれていてもよ い - 実際、赤色蛍光タンパク質（Dsred)及び緑色蛍光タンパク質（EGFP)を用いた実験 において、 NYTNNYSNISNNYS の配列（配列番号 9 6 ) で示される人工的に設計され た 1 4アミノ.酸からなる N型-糖鎖付加配列において、小胞体移行性シグナル配列 の下流に発現させると糖鎖が付加され、 またそれに伴い生産されたタンパク質の 細胞外放出が誘起されることが示された。
このポリヌクレオチドの上流には、 プロモーターが作動可能に連結されていて もよい。 本発明で用いられるプロモーターとしては、 遺伝子の発現に用いる宿主 に対応した適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。 例えば宿主が酵 母である場合は、 PH05プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、 ADH プロモータ一などが好ましい。 動物細胞を宿主として用いる場合は、 SR aプロモ 一ター、 SV40プロモーター、 LTRプロモーター、 CMVプロモーター、 HSV- TKプロ モーターなどが挙げられる。 また、 薬剤 （インデューサー） の添加等の特定の条 件下で誘導的に作用する誘導性のプロモーターを用いてもよい。
本発明の真核細胞において目的組換えタンパク質を発現し細胞外に分泌させる ためのポリヌクレオチドは、 さらに、 当該技術分野で公知の、 ェンハンサー、 ス プライシングシグナル、 ポリ A付加部位、 選択マーカー、 SV40複製オリジン等を 含んでいてもよい。
本発明は、 小胞体移行性シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、 及び該 ポリヌク レオチ ドの下流に、 タンパク質に 0 型 -糖鎖付加配列若しく は Asn-X- (Thr/Ser) (Xはプロリンを除くアミノ酸） で表される配列からなる N型- 糖鎖付加配列が付加された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、 並び にプロモーター等を含む、 宿主細胞内で組換えタンパク質を製造するために用い る発現カセットをも包含する。
本発明は、 小胞体移行性シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、 及び該 ポリヌクレオチドの下流に、 タンパク質に Asn-X- (Thr/Ser) (Xはプロリンを除く アミノ酸）で表される配列からなる N型-糖鎖付加配列が付加された融合タンパク 質をコードするポリヌクレオチドを宿主真核細胞に導入し、 該宿主真核細胞を培 養し、 前記ポリヌクレオチドがコ一ドするタンパク質を発現させ細胞外に放出さ せ、 細胞培養上清より 目的タンパク質を回収することを含む、 タンパク質の製造 方法を包含する。
本発明の真核細胞において目的組換えタンパク質を発現し細胞外に放出させる ためのポリヌクレオチドは、 ベクターに組込み宿主真核細胞に導入すればよい。 本発明の方法で用いる真核細胞としては、 酵母、 昆虫細胞、 鳥類細胞、 両生類 細胞、 爬虫類細胞、 哺乳類細胞が挙げられる。
酵母と しては、 例えば、 サッカロマイセス セレビシェ （Saccharomyces cerevisiae) AH22、 AH22R -、 NA87- 11A、 DKD- 5D、 20B- 12、 スキゾサッカロマイセ ス ボンべ （Schizosaccharomyces pombe) NCYC1913、 NCYC2036、 ピキア パス トリ ス （Pichia pastoris) 等が挙げられる。 昆虫細胞としては、 Sf21などの夜盗蛾細胞等が挙げられる。
両生類細胞としては、 アフリカッメガエル卵細胞等が挙げられる。
哺乳類細胞としては、 例えば、 HEK293細胞、 FreeStyle293細胞、 FL細胞など のヒ ト細胞； COS- 7、 Veroなどのサル細胞； CH0、 dhfr遺伝子欠損 CH0細胞など のチャイニーズハムスター細胞；マウス L細胞、 マウス AtT- 20細胞、 マウスミエ ローマ細胞などのマウス細胞；ラッ ト GH3細胞などのラッ ト細胞等が挙げられる。 発現ベクターとしては、 pKAl、 pCDM8、 pSVK3、 pSVL、 pBK-CMV, pBK_RSV、 EBV ベクター、 pRS、 pYE82 などが例示できる。 また、 pIND/V5_His、 pFLAG-CMV - 2、 pEGFP-Nl、 pEGFP-C 1などを発現ベクターとして用いれば、 Hi sタグ、 FLAGタグ、 GFPなど各種タグを付加した融合タンパク質として発現させることもできる。 これらの細胞の中でも、 低タンパク質濃度条件下で培養し得る細胞を用いた場 合、 培養上清からの精製が容易に行えるので望ましい。 低タンパク質濃度条件下 で培養し得る細胞として、 例えば、 FreeStyle293細胞が挙げられる。
ベクターは、 小胞体移行性シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、 0型- 糖鎖付加配列若しくは Asn-X- (Thr/Ser) (Xはプロリンを除くアミノ酸） で表され る配列からなる N 型-糖鎖付加配列をコードするポリヌクレオチド及び目的タン パク質をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞内で組換えタンパク質を製 造するために用いるポリヌクレオチドを含む。 本発明は、 このような組換えタン パク質を発現し宿主細胞外に放出させるための発現ベクター及び該ベクターを導 入した宿主細胞を包含する。
さらに、 目的のタンパク質を連結させる部位として、 マルチクローニング部位 を含ませておきその部位に目的のタンパク質をコードする外来遺伝子を組込んで もよい。 この場合、 本発明のベクターは、 小胞体移行性シグナル配列をコードす るポリヌクレオチドの下流に 0型-糖鎖付加配列若しくは Asn-X- (Thr/Ser) (Xは プロリンを除くアミノ酸）で表される配列からなる N型-糖鎖付加配列をコードす るポリヌクレオチド並びに目的タンパク質をコードする外来遺伝子を導入可能な マルチクローニング部位を含む宿主細胞内で組換えタンパク質を製造するために 用いる発現ベクターである。
酵母への組換えベクターの導入方法は、 酵母に DNAを導入する方法であれば特 に限定されず、 例えばエレク トロポレーシヨン法 [Becker, D. . et al. ： Methods. Enzyraol. , 194 : 182 (1990) ]、スフエロプラス卜法 [Hinnen, A. et al. ： Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 75 : 1929 (1978) ]、 酢酸リチウム法 [Itoh, H. ： J. Bacteriol. , 153 : 163 (1983) ]等が挙げられる。動物細胞への組換えベクターの導入方法として は、 例えばエレク ト口ポレーシヨン法、 リン酸カルシウム法、 リポフエクシヨン 法等が挙げられる。
本発明の真核細胞において目的組換えタンパク質を発現し細胞外に分泌させる ためのポリヌクレオチドを含むベクターを導入した宿主真核細胞を培養すること により、 目的のタンパク質を発現させ、 細胞外すなわち培養上清中に放出させる ことができる。 培養は、 宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。 培養終了後、 公知の方法で細胞と上清とを分離し、 上清を集める。 このように して得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれるタンパク質の精製は、 公知 の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。 細胞内からの抽出と 比べ、 放出されたタンパク質は不純物若しくは夾雑物も少なく、 また抽出時にお ける界面活性剤の使用も不必要であり、 この点からも活性タンパク質として回収 する上で有効である。 例えば、 尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、 超音 波処理、 酵素消化、 塩析ゃ溶媒沈殿法、 透析、 遠心分離、 限外濾過、 ゲル濾過、 SDS-PAGE、 等電点電気泳動、 イオン交換クロマトグラフィー、 疎水性クロマトグ ラフィー、 ァフィニテ'ィークロマトグラフィー、 逆相クロマトグラフィーなどが 挙げられる。
産生されたタンパク質から糖鎖を糖鎖分解酵素を用いて取り除くこともできる。 しかしながら、 糖鎖付加により新たな活性を発現タンパク質に付与することもあ り、 この場合は、 糖鎖付加配列は有用な糖鎖タンパク質の調製にも有効である。 本発明は、 本発明の方法により製造されたタンパク質を包含する。 該タンパク 質は、 翻訳された後、 細胞内で各種修飾を受ける場合がある。 従って、 修飾され たタンパク質も本発明のタンパク質の範囲に含まれる。 このような翻訳後の修飾 としては、 N末端メチォニンの脱離、 N末端ァセチル化、 細胞内プロテアーゼによ る限定分解、 ミス ドレイル化、 イソプレニル化、 リン酸化などが例示できる。 本発明の小胞体移行性シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、 及び該ポ リ ヌク レオチ ドの下流に、 タンパク質に 0 型-糖鎖付加配列若しく は Asn-X- (Thr/Ser) (Xはプロリンを除くアミノ酸） で表される配列からなる N型 - 糖鎖付加配列が付加された融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む タンパク質発現ベクターは、 DNA 免疫に利用することができる。 具体的には、 真 核細胞用発現ベクターを注射や遺伝子銃によって、 動物の筋肉や皮膚に導入した 後、 発現タンパク質が血中に放出されるため、 免疫が生じ、 目的タンパク質に反 応する血清を採取することにより作製することができる。動物としては、マウス、 ラッ ト、 ゥサギ、 ャギ、 ニヮ トリなどが用いられる。 免疫した動物の脾臓から採 取した B細胞とミエローマを融合させてハイブリ ドーマを作成すれば、 モノクロ ーナル抗体を産出することができる。
また細胞外に導入タンパク質が放出されるため、 遺伝子治療及び DNAワクチン にも使用できる。 さらに、 細胞外分泌タンパク質を生産する細胞を樹立すること により、 細胞治療にも応用できる。 また細胞内に存在し通常は自己と認識されて いるタンパク質を細胞外に放出させて免疫原性を誘導し、 自己免疫疾患モデルマ ウスの作成に用いることも出来る。
実施例
次に実施例を示しこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、 この発明は これらの例に限定されるものではない。 なお、 DNA の組換えに関する基本的な操 作及び酵 汉 1 (ま、 文 "Molecular Cloning, Laboratory Manual . Cold spring Harbor Laboratory, 1989)に従った。 制限酵素及び各種修飾酵素は特に記載のな い場合には、 Invitrogen社製のものを用いた。 各酵素反応の緩衝液組成及び反応 条件は付属の説明書に従った。
方法
( 1 ) 発現ベクターの構築
N末端に Kozak配列及び EcoRIサイ ト、 C末端に Xholサイ トを配置した cDNA を作製するため、 プライマー配列 （配列番号 2 5及び配列番号 2 6 ) を用いて、
BalbA: マウスの脾臓細胞の cDNA をテンプレー トと して、 Phus ion PCR ki t
(Finnzyrae 社、 フィンランド） の使用説明書に基づいて、 PCR を行った。 96°C2 分 + (98°C 15秒、 58°C 15秒、 72°C 1分） X 35+72°C 1分の条件で行った。 PCRにつ いて以下特に記載しない場合は、 前述の条件を用いた。
得られた PCR フラグメント （574b. p. ) を ATP (Invitrogen社） 存在下、 T4ポ リヌクレオチドキナーゼ （Invitrogen社） により リン酸化し、 クローニングべク ター pBluescript2SK+の EcoRV サイ トに平滑末端の形でクローニングを行い、 Genebankのクローン XM_132344における当該領域と一致する配列番号 2 7で表さ れる配列を含むクローンを得た。
マウス IL-31の C末端に EGFPタンパク質及びヒスチジンタグと融合させるため、 このプラスミ ドをテンプレートとし、 N末端に Kozak配列及び EcoRIサイ トを配 置し、 C末端側の終了コドンを Xholサイ トに変更する配列を持ったプライマー配 列 （配列番号 2 5及び配列番号 2 8 ) を用いて、 PCRを行ない、 pBluescript2Sk+ の EcoRVサイ トにサブクローニングを行い、変異が無く全長の cDNAを持つクロー ン（mIL31-fus/pBSK2+)を得た。
同様にマウス IL - 4、 5、 6、 12及び 13を C末端に EGFPタンパク質及びヒスチジ ンタグと融合させるため、 N末端に Kozak配列及び EcoRIサイ トを配置し、 C末端 側の終了コ ドンを BamHI サイ トに変更する配列を持ったプライマーを用いて Balb/Cマウスの脾臓細胞の cDNAをテンプレートとして、 PCRを行ない、 raIL-31 の時と同様に pBluescript2SK+の EcoRVサイ 卜にサブクローニングを行い、 変異 が無く全長の cDNAを持つクローン（mIL- X- fus/pBSK2+ (X=4， 5， 6, 12, 13) )を得た。 マウス IL - 4には配列番号 2 9及び 3 0で表されるプライマーを、 IL- 5には配列 番号 3 1及び 3 2で表されるプライマーを、 IL-6には配列番号 3 3及び 3 4で表 されるプライマーを、 IL-12には配列番号 3 5及ぴ 3 6で表されるプライマーを、 IL-13には配列番号 3 7及び 3 8で表されるプライマーをそれぞれ用いた。
クラゲ蛍光タンパク質 （EGFP) を用いて解析を行うため、 哺乳類発現ベクター pcDNA3. 1-MH-A+ (Invi trogen社）の Hindlll力 ら Xholサイ トの間にプライマー配 列 （配列番号 3 9及び配列番号 4 0 ) をァニールしたマルチプルクローニンダサ ィ トの変更を行ない、 HindIII、 EcoRI, BamHI及び Xholの位置を変更したプラス ミ ド pcDNA3. 1- modif ied+ を得た。
緑色蛍光タンパク質 （EGFP) 発現ベクターである pEGFP- Cl (Clonetech社）をテ ンプレートとして、 配列番号 4 1及び 4 2で表されるプライマーを用いて PCRを 行レ、、 EGFPの cDNAを増幅した。得られたフラグメントを pBluescript2SK+の EcoRV サイ トにサブクローニングを行い、 PCR 及びオリゴ合成中に変異の入らなかった クローンを選択した。 このプラスミ ドを制限酵素 BamHI と Sailで切断し、切り出 されたフラグメントをプラスミ ド pcDNA3. 1- modified+の BamHIカゝら Xholサイ ト の間にサブクローニングを行い、 EGFP発現ベクター EGFP - H/pcDNA3. 1ベクターを 得た。
この発現ベクターは CMV プロモーターの下流に以下のポリヌクレオチド配列 (配列番号 4 3 ) を持ち、 配列番号 4 4のタンパク質 （EGFP-H)を発現する。 この変更により、 Xholサイ トはライゲーションにより、 新しい位置に移動して いる。
この作成したベクター （ EGFP- H/pcDNA3. 1 ) の EcoRI と BamHI の間に、 mIL-X-fus/pBSK2+ (X=4, 5, 6， 12, 13) を EcoRI と BamHIで切断したフラグメント を挿入し、マウス全長ィンターロイキンと EGFPとヒスチジンタグの融合タンパク 質を発現するベクター （ralL- X- EGFPH/pcDNA3. 1) (X=4, 5, 6, 12, 13) を得た。
mIL-4-EGFPH/pcDNA3. 1 発現ベクターは配列番号 4 5で表されるタンパク質 (mIL-4-EGFPH)を発現させる。 mIL-5-EGFPH/pcDNA3. 1発現べクタ一は配列番号 4 6で表されるタンパク質（mlい 5- EGFPH)を発現させる。 mIL-6- EGFPH/pcDNA3. 1 発 現ベクターは配列番号 4 7で表されるタンパク質（mlL- 6- EGFPH)を発現させる。 raIL-12-EGFPH/pcDNA3. 1 発現ベクターは配列番号 4 8で表されるタンパク質 (mIL_12- EGFPH)を発現させる。 mlL- 13_EGFPH/pcDNA3. 1 発現ベクターは配列番号 4 9で表されるタンパク質（ralL- 13- EGFPH)を発現させる。
同様に mlL31- fus/pBSK2+を EcoRI と Xholで切断し、 得られたフラグメントを この作成したベクター（EGFP- MH/pcDNA3. 1- MH- A+)の EcoRIと Xholの間に導入し、 マウス全長ィンターロイキン 31 と EGFPとヒスチジンタグの融合タンパク質を発 現するベクター （mlL - 31-EGFPH/pcDNA3. 1) を得た。
mIL-31-EGFPH/pcDNA3. 1 発現べクタ一は配列番号 5 0で表されるタンパク質 (mlL- 31-EGFPH)を発現させる。
マウスィンターロイキン 31の細胞外分泌に必要な領域を決定するため、べクタ 一 (mIL-31-EGFPH/pcDNA3. 1) の改変を行った。 mlL- 31- EGFPH/pcDNA3. 1をテンプ レートとして、 発現ベクターの CMVプロモーター領域内に存在する配列を持つプ ライマー（配列番号 5 1 ) と以下に示すプライマーにより mIL31の一部領域を PCR によ り増幅し、 得られたフラグメ ン トを EcoRI と BamHI によ り切断し、 EGFPH/pcDNA3. 1ベクターの EcoRIと BamHIの間に導入し、各々の変異体を作成し た。
用いたプライマーの配列と得られた変異体発現ベクターの関係は以下のとおり であった。 配列番号 5 2で表されるプライマー及び配列番号 5 1で表されるブラ イマ一より SS- EGFPH/pcDNA3. 1が、 配列番号 5 3で表されるプライマー及び配列 番号 5 1で表されるプライマーより A -EGFPH/pcDNA3. 1 力 配列番号 5 4で表さ れ る プ ラ イ マ ー及び配列番号 5 1 で表 さ れ る プ ラ イ マ ー よ り GSS-EGFPH/pcDNA3. 1 、配列番号 5 5で表されるプライマー及び配列番号 5 1で 表されるプライマーより GSS (DD) - EGFPH/pcDNA3. 1が作成された。 ，
次にシグナルシーケンスと人工的な糖鎖修飾サイ トを構築するため、 mIL-31-EGFPH/pcDNA3. 1 をテンプレートとしてプライマー （配列番号 5 1及び配 列番号 5 6 ) を用いて PCRを行い、 シグナルシーケンスを含むフラグメントを得 た。 同時に合成オリゴ DNA (配列番号 5 7 ) をテンプレートとして、 プライマー (配列番号 5 8及び配列番号 5 9 ) を用いて PCRを行い、 人工的な糖鎖修飾サイ トを持つフラグメントを作成した。 各々のフラグメントを精製し等量混合し、 こ のフラグメントをテンプレートとして、 プライマー （配列番号 5 1及び配列番号 5 9 ) を用いて PCRを行い、 PCRによって 2つのフラグメントを結合させ、 増幅 することにより cDNAフラグメントを作成した。精製後 EcoRI と BamHIにより切断 し、 EGFPH/pcDNA3. 1ベクターの EcoRI と BaraHIの間に導入し、 シグナルシーケン スと人工的な糖鎖修飾サイ トを持つ発現ベクター SS-Art- EGFPH/pcDNA3. 1 を作成 した。 SS-EGFPH/pcDNA3. 1は配列番号 6 0で表される、 Δ -EGFPH/pcDNA3. 1は配列 番号 6 1 で表される、 GSS-EGFPH/pcDNA3. 1 は配列番号 6 2で表される、 GSS (DD) -EGFPH pcDNA3. 1は配列番号 6 3で表される、 SS-Art- EGFPH/pcDNA3. 1は 配列番号 6 4で表されるタンパク質を各々発現させる。
ヒ ト末梢単核球の cDNAをテンプレートとして、プライマー（配列番号 6 5及ぴ 配列番号 6 6 ) を用いて PCRを行い、 C末端に Xholサイ トを配置した、 ヒ ト p53 タンパク質をコードする cDNAを增幅した。得られたフラグメントを、 リン酸化を 行い、 pBluescript 2 SK+の EcoRVサイ トに平滑末端によりクローニングを行った。 PCRによる変異、 また、 プライマー合成中の変異の無いクローンを選択し、 BamHI 及び Xholで切断し、 pcDNA3. 1- myc-His_A+の BamHI及び Xholの間にサブク.ローニ ングし、 p53発現ベクター p53H/pcDNA3. 1を得た。 p53H/pcDNA3. 1ベクタ一は配列 番号 6 7で表されるタンパク質 （P53タンパク質） を発現させる。
h-p53-his/pcDNA3. 1- MH - A+ベクターを BamHI及び Xbalで切断し、得られたフラ グメントを SS- EGFPH/pcDNA3. 1又は GSS- EGFPH/pcDNA3. 1の BamHI及び Xbalサイ ト の 間 に 導 入 し 、 SS_EGFPH/pcDNA3. 1 か ら SS_p53H/pcDNA3. 1 を 、 GSS-EGFPH/pcDNA3. 1から GSS_p53H/pcDNA3. 1を得た。 SS_p53H/pcDNA3. 1は配列番 号 6 8で表されるタンパク質 （ss-p53Hタンパク質） を、 GSS-p53H/pcDNA3. 1は配 列番号 6 9で表されるタンパク質（GSS-p53Hタンパク質） をそれぞれ発現させる。 マウスインターロイキン 33の発現ベクター
マウス脾臓の cDNAをテンプレートとして、プライマー（配列番号 7 0及び 7 1 ) を用いて PCRを行い、 C末端に Xholサイ トを配置した、 マウスインターロイキン 33 (mIL- 33)をコードする cDNAを増幅した。得られたフラグメントを、 リン酸化を 行い、 pBluescript 2 SK+の EcoRVサイ トに平滑末端によりクローニングを行った。 PCRによる変異、 また、 プライマー合成中の変異の無いクローンを選択し、 BamHI 及び Xholで切断し、 pcDNA3. 1- myc- His- A+の BamHI及び Xholの間にサブクローニ ングし、 mIL- 33発現ベクター mIL_33H/pcDNA3. 1を得た。
このベクターをテンプレートとしてプライマー （配列番号 7 1及び 7 2 ) を用 いて PCRを行い、 mIL-33の成熟した部分をコードする cDNAフラグメントを增幅 した。 得られたフラグメントを、 リン酸化を行い、 pBluescript 2 SK+の EcoRV サイ トに平滑末端によりクローニングを行い、 PCR による変異及びプライマー合 成中の変異の無いクローンを選択し、 BamHI及び Xholで切断し SS_p53H/pcDNA3. 1 の BamHI及び Xholの間にサブクローニングし、 mIL31のシグナル配列の下流に成 熟型 mIL_33を配置した発現ベクター SS- mIL-33H/pcDNA3. 1を得た。
mIL-33H/pcDNA3. 1は配列番号 7 3で表されるタンパク質 （mIL- 33タンパク質） を、 SS - mIL_33H/pcDNA3. 1は配列番号 7 4で表されるタンパク質（SS- mIL- 33Hタン パク質） をそれぞれ発現させる。
細胞培養
HEK-293 及び Cos— 1 細胞は Dulbecco' s modified Eagle ' s medium (DMEM) (Gibco-Invi trogen社）、 10%牛胎児血清、 (Gibco-Invi trogen) (Hyclone, Logan, UT, USA)及びぺニシリン /ストレプトマイシン（Gibco- Invi trogen)の培地を用い、 37°C 5 %二酸化炭素環境下で細胞培養を行った。
FreeStyle293-T (FS-293T) (Invitrogen社）糸田胞は FreeStyle medium (Invitrogen 社）の培地を用い、 Invitrogen社のマニュアルに従って 37°C 8 %二酸化炭素存在 下でロータリ一シェーカーにより振盪培養を行った。
各種発現プラスミ ドは DH5 a - FTに形質転換を行い、 NucleoBond Xtra Midiプ ラスミ ド精製キット （Macherey- Nagel社 Duren、 ドイツ） の操作手引書に従って 精製を行った。 また トランスフエクシヨ ンは HEK-293 及び Cos- 1 細胞は Lipof ectamine2000 (Invitrogen社）を、 FS293- T細胞は 293fectin (Invitrogen社） を用いて操作手引書に従い、行った。この際、血清を用いる際は Low immunoglobl in fetal bovine serum (Invitrogen 社）を替わりに用い、 ウェスタンブロットにお けるィムノグロプリンの非特異的検出を防いだ。
トランスフエクシヨンの後、 3日後に細胞上清を取り、 2000 gで 5分間遠心を 行い、 細胞上清とした。 HEK-293及び Cos-1細胞は上清を取り除いた後、 培地と 同量の PBSで 2回洗浄し、培地と同量の 0. 5%SDS含有 PBSで細胞を溶解し、 100°C で 5分過熱処理を行った。 FreeStyle_293Tの場合は細胞を遠心法により PBSバッ ファーで洗浄し、 培地と同量の 0. 5%SDS含有 PBSで細胞を溶解し、 100°Cで 5分 過熱処理を行った。
(PBS : 137 m NaCl, 8. 1 mMNa2HP04, 2. 68 mM KC1 and 1. 47 mM KH2P04， pH7. 4) ゥエスタンブロッ ト
細胞上清と細胞分画抽出液を Toyobo社の CanGetSignalキッ ト （富山、 日本） のプロ トコルに従って、 Hybond- P (PVDF)メンブラン（Amersham)を用いてゥエスタ ンブロットを行った。 1次抗体には Ant i- Hi s- tag抗体 （PM002、 BL 日本） を用 い、 2次抗体には Ant i- rabbit- IgG- HRP コンジュゲート抗体 （Cat. NA934V GE healthcare %h UK) を用い、 Amersham社 (Oakvi l le, Ontario, Canada) ECL plus . 検出キッ 卜のプロ トコルに従って、 Hyperfi lm- ECL (Amersham 社） に感光させ検 出を行った。 '
得られた画像は Bio- rad社の画像読取装置 Chem Doc XRSを用いて、 電子画像化 し、 デンシトメ トリ一は付属の Quantity Oneソフトウェアーにより行った。
Art-DsredH/pcDNA3. 1の作成
赤色蛍光タンパク質発現ベクター pDsRed-Monomer- C1 (クロンテック社） を铸型 として、 プライマー （配列番号 7 5及び配列番号 7 6 ) を用いて PCRを行い、 蛍 光タンパク質をコードする cDNAを増幅し、 電気泳動後精製し、 684塩基からなる 配列番号 7 7で表される塩基配列をコードする cDNAを得た。
配列番号 7 8で表されるプライマーをリン酸ィ匕し、 これに配列番号 7 9で表さ れるプライマーを等量混合し、 ァニールさせ、 平滑化を行い配列番号 8 0で表さ れる cDNAを得た。 配列番号 7 4及び配列番号 8 0で表される cDNAをライゲーシ ヨンし、精製後、 この cDNAを铸型として燐酸化された配列番号 7 9及び配列番号 7 4で表されるプライマーを用いて PCRを行い、 配列番号 8 1に表される 747塩 基の cDNAを得、 この cDNAを pBluescript2SK+の EcoRVサイ トにサブクローニン グし、 プライマー合成中及び PCR中に変異の無い人工糖鎖付加サイ トと赤色蛍光 タンパクタンパク質をコードする cDNAを含むプラスミ ドを得た。 Invitrogen社 pcDNA3. 1-MH-A+ ベクターの EcoRVと Xbalで切断し配列番号 8 2及び 8 3で表さ れる合成 DNAをァニールさせたものを挿入したサブクローン化したプラスミ ドを Xholと EcoRIで切断し、配列番号 & 1に表される配列もつプラスミ ドを EcoRI と Sairで切断し精製した 747塩基の cDNAをサブクローニングし、 糖鎖付加配列を 含む赤色蛍光タンパク質を発現するベクターである Art- DsredH/pcDNA3. 1を得た。
Art-DsredH/pcDNA3. 1は配列番号 8 4で表されるタンパク質 （Art-DsredHタン パク質） を発現させる。
マウスインターロイキン （IL- 4/5/6/12/13) のシグナル配列の単離
マウス IL- 4のシグナル配列を単離するため、 mIL- 4- EGFPH/pcDNA3. 1のプラス ミ ドを铸型とし、 プライマー （配列番号 5 1及び配列番号 8 5 ) を用い PCRを行 い、 精製後、 Hindlll と BamHI で切断し、 プラスミ ド Art_DsredH/pcDNA3. 1 の
Hindlll と BamHI との間にサブクローニングを行い、 目的の構造をもつクローン を選択し、マウス IL-4のシグナル配列と人工糖鎖付加配列と赤色蛍光タンパク質 及びヒ スチジンタ グを融合タ ンパク 質と して発現させるベク ター SS (raIL4) -Art-DsredH/pcDNA3. 1を得た。
マウス IL- 5のシグナル配列を単離するため、 mIL_5_EGFPH/pcDNA3. 1 のプラス ミ ドを铸型とし、 プライマー （配列番号 5 1及び配列番号 8 6 ) を用い PCRを行 い、 精製後、 Hindlll と BamHI で切断し、 プラスミ ド Art_DsredH/pcDNA3. 1 の Hindlll と BamHI との間にサブクローニングを行い、 目的の構造をもつクローン を選択し、マウス IL- 5のシグナル配列と人工糖鎖付加配列と赤色蛍光タンパク質 及びヒ スチジンタ グを融合タ ンパク 質と して発現させるベク ター SS (mIL5) -Art-DsredH/pcDNA3. 1を得た。
マウス IL- 6のシグナル配列を単離するため、 mIL- 6- EGFPH/pcDNA3. 1のプラス ミ ドを铸型とし、 プライマー （配列番号 5 1及び配列 8 7 ) を用い PCRを行い、 精製後、 Hindlll と BamHIで切断し、 プラスミ ド Art- DsredH/pcDNA3. 1の Hindlll と BamHIとの間にサブクローニングを行い、目的の構造をもつクローンを選択し、 マウス IL- 6 のシグナル配列と人工糖鎖付加配列と赤色蛍光タンパク質及びヒス チ ジ ン タ グ を 融 合 タ ン ノ ク 質 と し て 発 現 さ せ る ベ ク タ ー SS (mIL6) -Art-DsredH/pcDNA3. 1を得た。
マウス IL-12のシグナル配列を単離するため、 mIL- 12-EGFPH/pcDNA3. 1 のプラ スミ ドを铸型とし、 プライマー （配列番号 5 1及び配列番号 8 8 ) を用い PCRを 行い、 精製後、 Hindlll と BamHIで切断し、 プラスミ ド Art- DsredH/pcDNA3. 1の Hindlll と BamHI との間にサブクローニングを行い、 目的の構造をもつクローン を選択し、 マウス IL-12のシグナル配列と人工糖鎖付加配列と赤色蛍光タンパク 質及びヒ スチジンタ グを融合タ ンパク質と して発現させるベク ター SS (raIL12) -Art-DsredH/pcDNA3. 1を得た。
マウス IL-13のシグナル配列を単離するため、 mIL_5_EGFPH/pcDNA3. 1のプラス ミ ドを铸型とし、 プライマー （配列番号 5 1及び 8 9 ) を用い PCRを行い、 精製 後、 Hindlll と BamHIで切断し、 プラスミ ド Art_DsredH/pcDNA3. 1 の Hindlll と
BamHI との間にサブクローニングを行い、 目的の構造をもつクローンを選択し、 マウス IL-13のシグナル配列と人工糖鎖付加配列と赤色蛍光タンパク質及びヒス チ ジ ン タ グ を 融 合 タ ン パ ク 質 と し て 発 現 さ せ る ベ ク タ ー SS (mIL13) -Art-DsredH/pcDNA3. 1を得た。
マ ウ ス IL-31 の シ グ ナ ル ぺ プ チ ド を 含 む 発 現 べ ク タ ー SS-EGFP-MH/pcDNA3. 1-MH-A+を Hindlll と BamHIで切断し、電気泳動によりマウス I 31のシグナルぺプチドを含む cDNAを精製し、プラスミ ド Art_DsredH/pcDNA3. 1 の Hindlll と BamHI との間にサブクローニングを行い、 マウス IL-31のシグナル 配列と人工糖鎖付加配列と赤色蛍光タンパク質及びヒスチジンタグを融合タンパ ク質として発現させるベクター SS (mIL31) - Art- DsredH/pcDNA3. 1を得た。
上記の手法で作成した発現ベクターは、 SS (mIL4) -Art-DsredH/pcDNA3. 1が配列 番号 9 0で表されるタンパク質を、 SS (mIL5) -Art- DsredH/pcDNA3. 1が配列番号 9 1で表されるタンパク質を、 SS (mIL6) -Art-DsredH/pcDNA3. 1が配列番号 9 2で表 されるタンパク質を、 SS (mIL12) _Art- DsredH/pcDNA3. 1 が配列番号 9 3で表され るタンパク質を、 SS (mIL13) - Art- DsredH/pcDNA3. 1 が配列番号 9 4で表されるタ ンパク質を、 SS (mIL31) _Art- DsredH/pcDNA3. 1 が配列番号 9 5で表されるタンパ ク質を、 CMVプロモーターによりそれぞれ発現させる。
DsRedタンパク質の発現
プラ ス ミ ド Art-DsredH/pcDNA3. 1 及び SS (mIL- X) - Art_DsredH/pcDNA3. 1 (X=4, 5, 6, 12, 13, 31) を、 それぞれ Freestyle_293F及び Cos- 1細胞に EGFPタン パク質発現ベクターと同様の手法でトランスフヱク トを行い、 上清及び細胞分画 のタンパク質の抽出液を得て、 12. 5%の SDS-PAGEにより電気泳動を行い、融合タ ンパク質の C末端に配置されたヒスチジンタグをウェスタンプロット法により検 出した。
タンパク質の精製
FreeStyle293 培地中に放出されたヒスチジンタグ付きタンパク質は遠心によ り上清を分離後、 50mM Tris HC1 (pH=7. 4)、 食塩濃度を 0. 5N、 10mMィミダゾール
(ナカライ社）、 0. 05%Chaps (同人化学）に調整し、 Qiagen社の Ni- NTA Superf low セファロース （Cat. 30430) にかけて、 ヒスチジンタグ付きタンパク質を吸着さ せた。 カラムを 50ra Tris HCl (pH=7. 4)、 食塩濃度を 0. 5N、 10mMイミダゾール、
ChapsO. 05%のバッファーで洗浄後、 PBSバッファーで洗浄し、 0. 5N食塩、 250mM イミダゾールを含むバッファーで溶出した。 溶出液を Mil l ipore 社の Amicon Ultra_15限外ろ過濃縮フィルター （Cat. UFC901024) で濃縮し、 PBS中で透析を行 つた。 得られたサンプルを SDS - PAGE電気泳動を行い、 クマジー染色を行った。 p53タンパク質の活性は Active Motif社の TransAM p53 (Cat. 41196)を用いて、 添付説明書に従って計測した。 配列番号 4 5 (mIL-4-EGFPHタンパク質）、 配列番号 4 6 (mIL-5- EGFPHタンパ ク質）、 配列番号 4 7 (mIL-6-EGFPH タンパク質）、 配列番号 4 8 (mIL- 12-EGFPH タンパク質）、 配列番号 4 9 (mIL-13-EGFPH タンパク質） 及び配列番号 5 0 (mIL-31-EGFPHタンパク質） で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオ チドを保有する発現ベクターを用いて Freestyle_293F細胞に発現させ、細胞分画 及び細胞上清を試料として SDS-PAGEにより電気泳動後、 C末端のヒスチジンタグ を認識する抗体でウェスタンプロット法により発現タンパク質を検出した結果を 図 1に示す。 図 1中 Cは細胞分画を、 Sは上清分画を示す。 図 1に示すように、 ィンターロイキン 6は N型糖鎖付加配列を持たないが、 上清に糖鎖修飾したと思 われるタンパク質が放出されている。 インターロイキン 13と 31の融合タンパグ 質が効率的に培地中に放出されている。
配列番号 4 4 (EGFP-H) 配列番号 6 0 (SS_EGFPH/pcDNA3. 1)、配列番号 6 1 ( Δ -EGFPH/pcDNA3. 1) 、 配列番号 6 2 (GSS-EGFPH/pcDNA3. 1) 、 配列番号 6 3 (GSS (DD) -EGFPH/pcDNA3. 1)、 配列番号 5 0 (mIL- 31-EGFPH)及び配列番号 6 4 (SS-Art-EGFPH/pcDNA3. 1)で表されるアミノ酸配列の各種変異体についてシグナ ル配列及び糖鎖付加配列の配置の模式図を図 2に示す。 図中、 黒三角で示した部 分は、 各変異体における N -型糖鎖の付加位置を示し、 数字はアミノ酸の位置を示 す。
配列番号 4 4、 6 0、 6 1、 6 2及び 6 3で表されるアミノ酸配列をコードす るポリヌクレオチドを保有する発現ベクターを用いて Freestyle- 293F 細胞に発 させ、 細胞分画及び細胞上清を試料として SDS-PAGEにより電気泳動後、 C末端 のヒスチジンタグを認識する抗体でウェスタンプロッ ト法により発現タンパク質 を検出した結果を図 3に示す。 図 3中、 泳動写真の下の C は細胞分画を示し、 S は上清分画を示す。 また、 aは SS-EGFPH (配列番号 6 0 )、 bは Δ -EGFPH (配列番 号 6 1 )、 cは GSS-EGFPH (配列番号 6 2 )、 dは GSS (DD) -EGFPH (配列番号 6 3 ) を示す。 図 3に示すようにシグナル配列だけではなく、 N 型糖鎖付加配列を持つ た時に特に融合タンパク質が効率的に培地中に放出されているのがわかる。
配列番号 4 4、 6 0、 6 1、 6 2及び 6 3で表されるアミノ酸配列をコードす るポリヌクレオチドを保有する発現ベクターを用いて Cos-1細胞に発現させ、 細 胞分画及び細胞上清を試料として SDS-PAGEにより電気泳動後、 C末端のヒスチジ ンタグを認識する抗体でウェスタンプロット法により発現タンパク質を検出した 結果を図 4に示す。 図 4中、 泳動写真の下の Cは細胞分画を示し、 Sは上清分画 を示す。 また、 aは EGFPH (配列番号 4 4 )、 bは SS-EGFPH (配列番号 6 0 )、 cは 厶- EGFPH (配列番号 6 1 )、 dは GSS-EGFPH (配列番号 6 2 )、 eは GSS (DD) - EGFPH (配列番号 6 3 ) を示す。 図 4に示すように浮遊細胞だけではなく接着細胞にお いても図 3と同じことが確認できる。
配列番号 6 2 (GSS (DD) -EGFPH)及び配列番号 6 3 (GSS-EGFPH)で表されるアミ ノ酸配列をコ一ドするポリヌク レオチドを保有する発現べクターを用いて Freestyle- 293F 細胞に発現させ、 細胞分画及ぴ上清分画を試料と して N-glycosydase F で変性条件で処理し、 N 型糖鎖を除去し、 各々のサンプルを 12. 5%SDS-PAGEで電気泳動し C末端のヒスチジンタグを検出したウェスタンブロ ット解析の結果を図 5に示す。 図 5中、 泳動写真の下の Cは細胞分画を Sは上清 分画を示す。 GSS-EGFPH の細胞分画及び上清分画とも糖鎖の除去により分子量が 低下していることがわかる。 GSS-EGFPH の細胞分画の糖鎖付加より上清分画の糖 鎖付加が多いことがわかる。 糖鎖除去後は両者とも予想される分子量である為、 他のタンパク質修飾とは考えられない。
配列番号 6 4 (GSS (ART) -EGFPH)のァミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド を保有する発現ベクターを用いて Freestyle-293F細胞に発現させ、細胞分画及び、 細胞上清を試料として SDS-PAGEにより電気泳動後、 C末端のヒスチジンタグを認 識する抗体でウェスタンプロット法により発現タンパク質を検出した結果を図 6 に示す。 図 6中、 泳動写真の下の Cは細胞分画を Sは上清分画を示す。 図 6に示 すように、 人工的に設計した糖鎖修飾配列でも糖鎖が付き、 EGFPタンパク質が放 出された。
配列番号 6 7 (p53H/pcDNA3. 1)、 配列番号 6 8 (SS-p53H/pcDNA3. 1)及ぴ配列番 号 6 9 (GSS-p53H/pcDNA3. 1)のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを保 有する発現ベクターを用いて Freestyle- 293F細胞に発現させ、細胞分画及び細胞 上清を試料として SDS-PAGEにより電気泳動後、 C末端のヒスチジンタグを認識す る抗体でウェスタンプロット法により発現タンパク質を検出した結果を図 7に示 す。 図 7中、 泳動写真の下の Cは細胞分画を Sは上清分画を示す。 図 7に示すよ うに、小胞体移行シグナル配列を糖鎖付加配列を付加した GSS_p53Hの発現タンパ ク質のみ上清に p53タンパク質が検出された。
配列番号 6 7 (p53)、配列番号 6 9 (GSS-p53) のァミノ酸配列をコードするポリ ヌクレオチドを保有する発現ベクターを用いて Freestyle-293F細胞に発現させ、 その上清分画に放出された p53 タンパク質の配列選択的 DNA結合能を Trans-AM キッ トにて測定し、 その選択的 DNA配列結合能を 450nmの吸光度として計測した 結果を図 8に示す。 p53タンパク質の活' 14は Active Motif社の TransAM p53 (Cat. 41196)を用いて、 添付説明書に従って計測した。 図 8に示すように、 GSS を付加 することにより、 活性型 p53タンパク質が細胞外に放出された。
配列番号 6 9に表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを保有す る発現ベクターを用いて Freestyle - 293F細胞に発現させ、その上清を二ッケルキ レートカラムにより精製したものの解析の結果を図 9に示す。
FreeStyle293 培地中に放出されたヒスチジンタグが付加されたタンパク質は 遠心により上清を分離後、 50mM Tri s HCl (pH=7. 4)、 食塩濃度を 0. 5N、 lOraMイミ ダゾール （ナカライ社）、 0. 05%Chaps (同人化学） に調整し、 Qiagen社の Ni- NTA Superflow セファロース （Cat. 30430) にかけて、 ヒスチジンタグ付きタンパク 質を吸着させた。 カラムを 50mM Tris HCl (pH=7. 4)、 食塩濃度を 0· 5Ν、 lOmMイミ ダゾール、 ChapsO. 05%のバッファーで洗浄後、 PBS ノくッファーで洗浄し、 0. 5N 食塩、 250raMイミダゾールを含むバッファーで溶出し、 溶出液を Mil l ipore社の Araicon Ultra- 15限外ろ過濃縮フィルター （Cat. UFC901024) で濃縮し、 PBS中で 透析を行った。得られたサンプルを SDS - PAGE電気泳動を行い、 クマジー染色を行 つた。 WBは精製前の C末端のヒスチジンタグによるウェスタンプロッ ト解析を示し、 CBBは精製されたタンパク質についてクマジー染色を行った像を示す。矢頭は p53 タンパク質の位置を示す。
図 9に示すように、 放出されたタンパク質のみが精製され、 ウェスタンプロッ トの像と一致した。
配列番号 7 3 (インターロイキン 33) 及び配列番号 7 4 (インターロイキン 31 のシグナル配列とインターロイキン 33 の成熟タンパク質を融合させたタンパク 質） のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを保有する発現ベクターを用 いて Freestyle - 293F 細胞に発現させ、 細胞分画及び上清分画を試料として SDS- PAGEにより電気泳動を行い、 C末端に付加してあるヒスチジンタグを検出し たウェスタンブロット解析の結果を示す。 図 1 0中、 泳動写真の下の Cは細胞分 画を Sは上清分画を示す。
図 1 0に示すように、ィンターロイキン 33のシグナル配列では、上清にタンパ ク質が放出されないが、ィンターロイキン 31のシグナル配列に置換することによ り、上清にィンターロイキン 33のタンパク質が糖鎖が付加された形で放出された。 配列番号 8 4 (Art-Dsred タンパク質）、 配列番号 9 0 (mIL4)、 配列番号 9 1 (mIL5)、 配列番号 9 2 (mIL6)、 配列番号 9 3 (mIL12)、 配列番号 9 4 (mIL13)及び 配列番号 9 5 (mIL31)のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを保有する 発現ベクターを用いて FreeStyle-293F細胞に発現させ、細胞分画及び上清分画を 試料として SDS- PAGEにより電気泳動を行い、 C末端に付加してあるヒスチジンタ グを検出したウェスタンプロッ ト解析の結果を図 1 1に示す。 図 1 1中、 泳動写 真の下の Cは細胞分画を Sは上清分画を示す。
図 1 1は、 放出されるタンパク質の比較を示すので、 各マウスインターロイキ ンのシグナル配列の放出に関わる影響がわかる。 シグナル配列が無い配列番号 8 4に表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は放出されなかったが、 シグナル 配列がある場合、 どのタンパク質も効率的に放出された。 また人工的な糖鎖付加 配列も細胞外放出に有効であることが示された。 産業上の利用可能性 小胞体移行性シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、 Asn_X- (Thr/Ser) (Xはプロリンを除くアミノ酸） で表される配列からなる N型-糖鎖付加配列をコ ードするポリヌクレオチド若しくは 0 型-糖鎖付加配列をコードするポリヌクレ ォチド並びに目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを宿主真核細胞に導 入し、 該細胞を培養し、 タンパク質を発現させた場合、 糖鎖修飾された目的タン パク質は効率的に宿主細胞外に放出される。 この方法により、 本来細胞外に放出 されない導入タンパク質を発現させ、 細胞外に放出させることにより、 目的のタ ンパク質を効率的に精製することができる。 また、 本来放出されるタンパク質に おいても、 糖鎖付加に留意して設計することにより、 細胞外への放出効率を向上 させることができ、 その後の精製等を効率的に行うことができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲
1 . 小胞体移行性シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、 及び該ポリ ヌクレオチドの下流に、 タンパク質に Asn-X- (Thr/Ser) (Xはプロリンを除くアミ ノ酸）で表される配列からなる N型-糖鎖付加配列が付加された融合タンパク質を コードするポリヌクレオチドを含む、 宿主真核細胞内で組換えタンパク質を製造 するために用いるポリヌクレオチドであって、 前記タンパク質を宿主真核細胞外 に放出させるためのポリヌクレオチド。
2 . 小胞体移行性シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、 及び該ポリ ヌクレオチドの下流に、タンパク質に 0型-糖鎖付加配列が付加された融合タンパ ク質をコードするポリヌクレオチドを含む、 宿主真核細胞内で組換えタンパク質 を製造するために用いるポリヌクレオチドであって、 前記タンパク質を宿主真核 細胞外に放出させるためのポリヌクレオチド。
3 . 小胞体移行性シグナル配列が、 マウスインターロイキン 4のシグナル配 列 （配列番号 1 )、 マウスインターロイキン 5のシグナル配列 （配列番号 3 )、 マ ウスインターロイキン 6のシグナル配列（配列番号 5 )、 マウスインターロイキン 12のシグナル配列（配列番号 7 )、マウスインターロイキン 13のシグナル配列（配 列番号 9 )、 マウスインターロイキン 31のシグナル配列 （配列番号 1 1 )、 ヒ トイ ンターロイキン 13 (配列番号 1 3 ) のシグナル配列及びヒ トインターロイキン 31 のシグナル配列 （配列番号 1 5 ) からなる群から選択される、 請求項 1又は 2に 記載のポリヌクレオチド。
4 . 請求項 1 〜 3のいずれか 1項に記載のポリヌクレオチドを含む、 組換え タンパク質を発現し宿主真核細胞外に放出させるための発現ベクター。
5 . 請求項 4記載の発現ベクターを含む宿主真核細胞。
6 . 小胞体移行性シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、 及び該ポリ ヌクレオチドの下流に、 Asn-X- (Thr/Ser) (Xはプロリンを除くアミノ酸） で表さ れる配列からなる N型-糖鎖付加配列をコードするポリヌクレオチドを含み、前記 小胞体移行性シグナル配列をコードするポリヌクレオチドの下流でありかつ該 N 型 -糖鎖付加配列をコードするポリヌクレオチドの上流若しくは下流に、発現させ ようとする目的タンパク質をコードする外来遺伝子を導入可能なマルチクロー二 ング部位を含む、 宿主真核細胞内で組換えタンパク質を製造する こめに用いる発 現ベクターであって、 前記目的タンパク質を宿主真核細胞外に放出させるための 発現ベクター。
7 . 小胞体移行性シグナル配列をコードするポリヌクレオチド、 及び該ポリ ヌクレオチドの下流に、 0型-糖鎖付加配列をコードするポリヌクレオチドを含み、 前記小胞体移行性シグナル配列をコードするポリヌクレオチドの下流でありかつ 該 0型-糖鎖付加配列をコードするポリヌクレオチドの上流若しくは下流に、発現 させようとする目的タンパク質をコードする外来遺伝子を導入可能なマルチク口 一二ング部位を含む、 宿主真核細胞内で組換えタンパク質を製造するために用い る発現ベクターであって、 前記目的タンパク質を宿主細胞外に放出させるための 発現ベクター。
8 . 請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載のポリヌクレオチドを宿主真核細胞 に導入し、 該宿主真核細胞を培養し、 前記ポリヌクレオチドがコードするタンパ ク質を発現させ細胞外に放出させ、 細胞培養上清より目的タンパク質を回収する ことを含む、 タンパク質の製造方法。
9 . 請求項 6又は 7に記載の発現ベクターを宿主真核細胞に導入し、 該宿主 真核細胞を培養し、 前記ポリヌクレオチドがコ一ドするタンパク質を発現させ細 胞外に放出させ、 細胞培養上清より 目的タンパク質を回収することを含む、 タン パク質の製造方法。
1 0 . 請求項 8又は 9に記載の方法により製造されたタンパク質。
1 1 . タンパク質に Asn - X- (Thr/Ser) (Xはプロリンを除くアミノ酸） で表さ れる配列からなる N型-糖鎖付加配列が付加され、 該 N型-糖鎖付加配列に N型 - 糖鎖が結合し糖鎖修飾された請求項 1 0記載のタンパク質。
1 2 . 天然において糖鎖修飾されないタンパク質に Asn - X- (Thr/Ser) (Xはプ 口リンを除くアミノ酸） で表される配列からなる N型-糖鎖付加配列が付加され、 該 N型-糖鎖付加配列に N型-糖鎖が結合した、 請求項 1 1記載の糖鎖修飾された タンパク質。
1 3 . タンパク質に 0型-糖鎖付加配列が付加され、 該 0型-糖鎖付加配列に o型-糖鎖が結合し糖鎖修飾された請求項 1 0記載のタンパク質。
1 4 . 天然において糖鎖修飾されないタンパク質に 0型-糖鎖付加配列が付加 され、 該 0型-糖鎖付加配列に 0型-糖鎖が結合した、 請求項 1 3記載の糖鎖修飾 されたタンパク質。
1 5 . 請求項 1〜3のいずれか 1項に記載のポリヌクレオチドを非ヒ ト動物 に導入し、 該動物体内で前記ポリヌクレオチドがコ一ドするタンパク質を発現さ せ、 該タンパク質に対する抗体を製造させることを含む、 DNA 免疫による抗体の 製造方法。
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