KR102120335B1

KR102120335B1 - 노로 바이러스 백신을 생산하기 위한 재조합 발현 벡터

Info

Publication number: KR102120335B1
Application number: KR1020180145450A
Authority: KR
Inventors: 최덕영
Original assignee: (주)인테라
Priority date: 2018-11-22
Filing date: 2018-11-22
Publication date: 2020-06-09
Also published as: KR20200060644A

Abstract

본 발명은 노로 바이러스 백신을 생산하기 위한 재조합 발현 벡터에 관한 것으로서, 보다 상세하게 본 발명은 수용성 노로 바이러스 백신을 생산하기 위한 재조합 발현 벡터 및 이를 이용한 수용성 노로 바이러스 백신 생산방법에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 발현 벡터 및 이를 이용한 노로 바이러스 백신 생산 방법은 대장균에서 효과적으로 노로 바이러스 VLP 백신을 생산할 수 있을 뿐만 아니라 구조적으로도 정교한 VLP 생산을 가능하게 함으로써, 저비용 고효율의 노로 바이러스 VLP 백신을 생산할 수 있게 되었다.

Description

노로 바이러스 백신을 생산하기 위한 재조합 발현 벡터{Recombinant Expression Vectors for Producing Norovirus Vaccine}

본 발명은 노로 바이러스 백신을 생산하기 위한 재조합 발현 벡터에 관한 것으로서, 보다 상세하게 본 발명은 노로 바이러스 백신 항원을 수용성으로 생산하고 이를 효율적으로 바이러스 유사입자로의 자가조립을 유도하는 재조합 발현 벡터 및 이를 이용한 수용성 노로 바이러스 백신 생산방법에 관한 것이다.

노로 바이러스(Norovirus)는 전 세계적으로 급성 위장염을 유발하는 주요 병원체 중 하나이며, 매년 20만명의 5세 미만 개발도상국 어린이들이 노로바이러스로 인해 사망한다. 노로바이러스는 주로 대변-구강 경로 (Fecal-oral route) 를 통하여 감염되며 메스꺼움, 구토, 설사, 탈수 등을 유발한다. 칼리시바이러스과(Caliciviridae)에 속하는 노로 바이러스는 막이 없는 바이러스이며 직경은 약 30~40 nm 정도이다. 7.6 kbp 길이의 단일가닥 (+)RNA로 이루어져 있으며 3개의 ORF(open reading frame)를 가지고 있다. 이 중 ORF2에는 노로 바이러스의 형태를 이루는 주요 구조단백질 VP1이 코딩되어 있고, ORF3에는 VP2 단백질이 코딩되어 있으나 구조형성에 직접적으로 관여하지는 않는다. VP1은 전체 59 kDa 크기이며 이합체(dimer)를 이룬다. 이렇게 90개의 이합체가 자가 조립되어(self-assembly) 총 180개의 VP1이 하나의 바이러스 입자(particle)를 형성한다. VP1 단백질은 2개의 도메인(domain)으로 이루어지는데 S 도메인(S domain)이 구조를 이루는데 작용하고 P 도메인(P domain)은 실제적인 면역반응 유발에 관여한다.

현재까지 노로 바이러스에 대한 세포 배양 방법은 알려진 바 없으며 적절한 동물모델 또한 개발되지 않은 상황이다. 따라서 효과적인 노로 바이러스 백신을 개발하기 위해서는 세포배양에 제한받지 않는 VLP(Virus-Like Particles) 형태의 백신개발이 필수적이다. VLP는 바이러스 구조 단백질을 야생형 바이러스와 겉모습이 유사한 구조를 나타내도록 특이적으로 발현시킨 것으로서 매우 복잡하고 정교한 구조물이다. 야생형 바이러스와 그 구조가 유사하기 때문에 체내에서 높은 면역반응을 유도할 수 있으며 T-세포, B-세포 면역경로를 둘 다 자극할 수 있다는 장점이 있다. 또한, 형성된 구조물 안에 유전물질이 없으므로 감염능력이 없어 높은 안전성을 가진다는 점과 뛰어난 구조적 안정성을 보인다는 것이 특징이다. 하지만 그 구조가 복잡하여 완전한 VLP를 만드는 것이 매우 어렵다는 단점이 있다.

노로 바이러스 VLP는 주로 배큘로 바이러스-곤충세포에서 생산할 수 있으며, 효모에서도 VLP를 생산할 수 있다고 알려져 있다. 하지만 대장균 에서는 구조단백질 (VP1)을 수용성으로 발현했다는 보고는 있지만 VLP (Virus-Like Particle) 를 형성했다는 보고는 지금까지 된 바가 없다. 대장균에서 유래하는 노로바이러스 VLP가 개발될 수 있다면 노로바이러스에 대한 대부분의 사상자가 개발도상국에서 발생하는 만큼 다른 발현시스템을 이용한 백신에 비해 저가형 백신으로써 인류사회에 큰 공헌을 할 수 있다.

본 발명자들은 이전 연구에서 RBD (RNA Binding Domain)를 포함하는 LysRS (Lysyl tRNA synthetase)가 결합파트너로써 다양한 단백질의 단백질 접힘 및 수용성 증가에 관여한다는 것을 밝힌 바 있다. 그러나 LysRS는 약 100kDa이 넘는 거대 단백질일 뿐만 아니라 이량체(dimer)를 이루어야 하는 구조적인 한계성으로 인한 입체적 간섭현상(steric hindrance) 때문에, 재조합 단백질이 원하는 활성 형태를 갖도록 3차원 구조 형성, 이량체 이상의 다량체, 또는 단량체로의 형성을 방해할 수 있다. 이에, LysRS를 대체하기 위한 RNA 결합 도메인으로 RID(RNA interacting domain, N-terminal appended RNA binding domain of Lysyl tRNA synthetase)가 사용되고 있다. 하지만 RID 자체는 발현 레벨이 매우 낮다는 단점이 있다.

단백질 발현 레벨은 여러가지 요인에 의해 결정될 수 있지만, 단백질의 N-말단 서열, 정확하게는 mRNA 서열이 단백질 발현 레벨에 중요한 것으로 알려져 있다.

이에, 본 발명자들은 단백질의 수용성 및 발현 효율에 대하여 연구하던 중 요산산화효소(urate oxidase) 단백질이 대장균에서 비정상적으로 발현이 잘 되는 것을 확인하였고, 요산산화효소의 N-말단 서열이 노로바이러스 VP1 단백질의 발현 수준에 미치는 영향과 RID의 발현에 미치는 영향을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 원핵세포에서 발현이 잘 되지 않는 노로바이러스 VP1 단백질의 발현 효율을 증진시킬 뿐 아니라 수용성을 높일 수 있는 노로 바이러스 백신 생산용 재조합 발현 벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 또한, 노로 바이러스 백신 생산용 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 노로 바이러스 백신 생산용 재조합 발현 벡터를 숙주세포에 도입하는 단계를 포함하는 노로 바이러스 백신 생산방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 요산산화효소로부터 유래한 7개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 또는 그 일부 서열이 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키는데 결정적인 역할을 하며, 요산산화효소로부터 유래한 7개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드가 수용성 증진 파트너로 알려진 RID(RNA interacting domain)에도 적용됨을 확인한 후, 노로 바이러스의 VP1 단백질에 적용하여본 결과, VP1 단백질의 발현 효율을 증진시킬 뿐만 아니라 수용성을 높일 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

이에 본 발명은 목적 단백질로 노로 바이러스 유래 VP1 단백질; 및 요산산화효소로부터 유래한 7개의 아미노산 또는 그 일부 서열을 포함하는 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드;를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 노로 바이러스 백신 생산용 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어 “요산산화효소(urate oxidase)”(EC 1.7.3.3 (uricase)는 퓨린 분해 기작에 작용하는 효소이다. 우리카아제(uricase)는 요산을 알란토인으로 산화시키는 효소이다. 사람을 포함한 고등 영장류는 우리카아제가 존재하지 않으며, 요산은 퓨린 분해 대사의 최종 물질이다. 이 대사물인 유리산(free acid)과 요산염(urate salt) 모두 물에서 비수용성이므로, 개개인의 차이에 따라 침전되어 통풍을 유발한다. 통풍을 효율적으로 치료하기 위해, 사람에 존재하지 않은 우리카아제 를 직접 사람에게 주사하는 치료법이 실용화되어 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "목적 단백질(target protein)"은 당업자가 대량으로 생산하고자 하는 단백질로서, 재조합 발현벡터에 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하여 숙주세포에서 발현이 가능한 단백질을 의미하며, 본 발명에서는 노로 바이러스의 VP1 단백질이 이에 해당된다.

본 명세서에서 사용된 용어 “목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드” 또는 “expression enhancer tag(eet)”는 목적 단백질의 N-말단에 융합되어 함께 발현됨으로써 단백질의 발현 효율을 증진시키는 짧은 펩타이드 서열을 의미한다.

본 발명의 노로 바이러스 백신 생산용 재조합 발현 벡터에 있어서, 상기 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 그 일부 서열은 요산산화효소(urate oxidase)로부터 유래한 것일 수 있다.

또한 본 발명에 따른 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드에 있어서, 상기 서열번호 1의 일부 서열은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "발현 벡터"는 발현 벡터의 전사에 제공되는 추가단편에 작동 가능하게 연결된 타겟 단백질을 암호화하는 단편으로 구성되는 선형 또는 원형의 DNA 분자이다. 그와 같은 추가 단편은 프로모터 및 종료암호 서열을 포함한다. 발현 벡터는 하나 이상의 복제 개시점, 하나 이상의 선택 마커 등을 또한 포함한다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유도되거나 또는 둘 다의 요소를 함유한다.

본 명세서에서 사용된 용어 “작동 가능하게 연결된”은 프로모터에서 전사가 개시하고 암호화 서열을 통해 종료암호로 진행하는데 작용하도록 단편이 배열되는 것을 나타낸다.

본 발명의 노로 바이러스 백신 생산용 재조합 발현 벡터는 상기 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 서열번호 1의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서 상기 서열번호 1의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3으로 표시되는 서열일 수 있다

본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서 상기 서열번호 2의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4로 표시되는 서열일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서 상기 노로 바이러스 생산용 재조합 발현 벡터는 1~6개의 히스티딘을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 단백질 절단효소 인식 부위를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드;를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 노로 바이러스 백신 생산용 재조합 발현 벡터에 있어서, 상기 1 내지 6개의 히스티딘을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 10으로 표시될 수 있다.

본 발명의 노로 바이러스 백신 생산용 재조합 발현 벡터에 있어서, 상기 단백질 절단효소는 TEV일 수 있다.

본 발명의 노로 바이러스 백신 생산용 벡터에 있어서, 상기 단백질 절단효소 인식 부위를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 11로 표시되는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 발현벡터에 있어서, 상기 발현벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 파지 입자 또는 게놈 삽입물일 수 있다. 상기 발현벡터는 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주세포의 게놈과 무관하게 복제되거나 숙주세포의 게놈 내로 통합될 수 있다.

본 발명은 또한 상기 노로 바이러스 유래 VP1 단백질; 및 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드를 포함하는 발현벡터가 형질전환된 숙주세포를 제공하고자 한다.

본 명세서에서 사용된 용어 “형질전환” 또는 “도입”은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 발현벡터를 형질전환시키는 방법은 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO₄)법, 염화칼슘(CaCl₂)법, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법 또는 초산 리튬-DMSO법을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 숙주세포에 있어서, 상기 숙주세포는 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주세포가 바람직하며, 원핵 및 진핵을 포함한 모든 미생물이 사용될 수 있다. 바람직하기는, 상기 숙주세포는 대장균(E. coli)일 수 있다.

본 발명은 또한 발현 효율이 증진된 노로 바이러스 백신 생산 방법을 제공하고자 한다. 상기 노로 바이러스 백신 생산 방법은:

(a) 목적 단백질로 노로 바이러스 유래 VP1 단백질; 및 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 일부 서열을 포함하는 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드;를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 노로 바이러스 백신 생산용 재조합 발현 벡터를 생산하는 단계;

(b) 상기 발현 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 생산하는 단계; 및

(c) 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 융합 단백질의 발현을 유도하고, 이를 수득하는 단계를 포함할 수 있다.

제2구현예에 따르면,

본 발명은 노로 바이러스 유래 VP1 단백질; 및 서열번호 1 의 아미노산 서열 또는 이의 일부 서열을 포함하는 펩타이드와 상기 펩타이드의 융합파트너로서 RID(RNA interacting domain)을 포함하는 목적 단백질의 발현 효율 및 수용성을 증진시키기 위한 융합 단백질;을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 노로 바이러스 백신 생산용 재조합 발현 벡터를 제공하고자 한다.

즉, 본 발명의 발현벡터는 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5`-말단에 결합된 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 융합 단백질은 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드 및 RID의 융합 단백질일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “융합 단백질(fusion protein)” 또는 “재조합 단백질(recombinant protein)” 은 원래의 목적 단백질 서열의 N-말단 또는 C-말단에 다른 단백질이 연결되거나 다른 아미노산 서열이 부가된 단백질을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 “RID”, “RNA interacting domain“, “N terminal appended RNA binding domain of Lysyl tRNA synthetase)”, 또는 “LysRS RNA 결합 도메인(LysRS RNA interacting domain)”는 LysRS의 RNA와 기타 단백질간의 상호작용에 관여하는 고유한 N-말단(N-terminal) 연장부위를 의미한다.

본 발명에 따른 목적 단백질의 발현 효율 및 수용성을 증진시키기 위한 융합 단백질에 있어서, 상기 RID는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 융합 단백질은 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 목적 단백질의 발현 효율 및 수용성을 증진시키기 위한 융합 단백질에 있어서, 상기 목적 단백질은 노로 바이러스 유래 VP1 단백질을 의미한다.

본 발명은 또한 목적 단백질의 N-말단에 결합하고 서열번호 1의 아미노산 또는 이의 일부 서열을 포함하는 펩타이드 및 이의 융합파트너로서 RID를 포함하는 융합 단백질을 갖는 목적 단백질의 발현 효율 및 수용성을 증진시키기 위한 발현벡터가 형질전환된 숙주세포를 제공하고자 한다.

본 발명은 또한 발현 효율 및 수용성이 증진된 노로 바이러스 백신의 생산 방법을 제공하고자 한다. 상기 노로 바이러스 백신의 생산 방법은:

(A) 노로 바이러스 유래 VP1 단백질의 N-말단에 서열번호 1의 아미노산 또는 이의 일부 서열을 포함하는 펩타이드 및 이의 융합파트너로서 수용성을 높여 주는 RID를 포함하는 융합 단백질이 결합된 재조합 목적 단백질을 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;

(B) 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입하는 단계; 및

(C) 상기 숙주세포로부터 재조합 노로 바이러스 VP1 단백질을 생산하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 요산산화효소로부터 유래한 7개의 아미노산을 포함하는 펩타이드는 목적 단백질의 발현 효율을 향상시킬 수 있으며, 또한 수용성 증진 단백질로 잘 알려진 RID에 상기 펩타이드를 결합한 융합 단백질은 목적 단백질의 발현 효율뿐만 아니라 수용성을 향상시킴으로써, 재조합 노로 바이러스 VP1 단백질의 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 재조합 발현 벡터 및 이를 이용한 노로 바이러스 백신 생산 방법은 대장균에서 효과적으로 노로 바이러스 VLP 백신을 생산할 수 있을 뿐만 아니라 구조적으로도 정교한 VLP 생산을 가능하게 함으로써, 저비용 고효율의 노로 바이러스 VLP 백신을 생산할 수 있게 되었다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 수용성 노로 바이러스 생산용 재조합 발현 벡터의 구조를 나타낸 모식도이다.
도 2a는 본 발명의 일실시예에 따라 발현된 VP1 단백질의 수용성 발현을 SDS-PAGE로 확인한 결과로 왼쪽 패널은 MSAVKAA-RID가 재조합 되어 있는 VP1(70 kDa)의 발현 결과이고 오른쪽 패널은 비교예(MSEQ-RID가 재조합 되어 있는 VP1; 69 kDa)의 결과이다.
도 2b는 본 발명의 일실시예에 따라 발현된 VP1 단백질의 수용성 발현을 SDS-PAGE로 확인한 결과로 왼쪽 패널은 MSAVKAA-RID가 재조합 되어 있는 VP1(70 kDa)의 발현 결과, 가운데 패널은 MSAV-RID가 재조합 되어 있는 VP1(70 kDa)의 발현 결과, 오른쪽 패널은 대조군(MS-RID)의 결과이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 발현된 VP1 단백질을 니켈 친화성 크로마토그래피를 통해 정제하고 확인한 크로마토그램 결과이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 발현된 VP1 단백질을 정제한 후 SDS-PAGE로 확인하였고, 18~20 레인의 분획을 풀링(pooling)한 결과이다.
도 5는 TEV 단백질 절단효소를 이용하여 노로 바이러스 VP1을 절단한 후 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과이다.
도 6은 발현 및 정제를 통해 얻은 단백질이 VP1 서열로 이루어져 있는지 확인하기 위하여 펩타이드 맵핑과 N-말단 및 C-말단 아미노산 서열 분석 결과로서,
도 6a는 트립신 처리 후 분석된 UPLC 피크이고,
도 6b는 트립신 처리 시 나타나는 펩타이드 절편을 LC-MS/MS 로 분석한 결과 당초 예상한 시퀀스와 83.9%의 아미노산 서열이 일치함을 확인한 결과이고,
도 6c는 N-말단 서열이 노로 바이러스 VP1과 일치함을 확인한 결과이고,
도 6d는 C-말단 서열이 노로 바이러스 VP1과 일치함을 확인한 결과이다.
도 7은 TEV 단백질 절단효소로 절단한 후 형성된 VLP를 정제하기 위하여 크기 배제 크로마토그래피를 수행한 결과를 나타낸 크로마토그램(A) 및 SDS-PAGE(B) 결과이다.
도 8은 정제된 VLP의 전체적인 직경을 확인하기 위하여 DLS(Dynamic Light Scattering)를 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 정제된 VP1 단백질이 VLP를 형성했는지 TEM 전자현미경을 이용하여 확인한 결과이다[A: 전자현미경을 통하여 확인한 대장균 유래 VLP(Virus-like particle), B: 히스티딘, TEV 인식서열을 포함하는 RID tag을 제거하지 않은 재조합 VP1 단백질 (VLP 구조형성에 실패하였음), C: 배큘로바이러스-곤충세포 시스템을 이용하여 생산한 노로바이러스 VLP. D: 야생형 노로바이러스 비리온].

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

재조합 발현 벡터 제작 및 VP1 단백질 발현

대장균을 통한 노로 바이러스 VLP 생산에는 Norovirus Hu/GII.4/Hiroshima/55/2005/JPN (NCBI access number: AB504310.1) 유래 VP1 유전자가 이용되었으며, 해당 VP1 유전자는 유전자 합성을 통하여 확보하였다. pGE-LysRS 벡터가 발현벡터로 이용되었으며 위 벡터는 pGEMEX-1(Promega) 벡터를 수정하여 만든 발현 벡터이다. 구체적으로, NdeⅠ과 BamHⅠ 제한효소를 처리하여 절단하였으며 잘려진 발현벡터 내에 MSAVKAA(eet1, 서열번호 1)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 3) 또는 MSAV(eet2, 서열번호 2)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 4); 6개의 히스티딘 태그(Histag)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 11); G를 제거한 TEV 인식서열 (ENLYFQ)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 12); 및 VP1(서열번호 13)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 14)이 연속적으로 구성되어있는 DNA 절편을 삽입하였다(도 1). 이렇게 완성된 재조합 플라스미드를 대장균 숙주 HMS174(DE3)에 형질전환 하였다. 단백질을 발현하기 위한 최초배양은 50 μg/ml 암피실린이 들어간 15 μg/ml LB 배지에 37℃에서 하루 동안 배양한 후, 같은 농도의 암피실린이 들어간 15 ml의 LB 배지에 전날 배양한 대장균 1 ml을 첨가하여 37℃에서 O.D_600nm가 0.5~0.7에 도달할 때까지 배양하였다. 적정 O.D 값에 도달하였을 때 1 mM IPTG로 과발현을 유도하였으며 IPTG 첨가 후에는 다양한 온도(37℃, 16℃)에서 발현시켰다. 비교예로 이전 연구에 적용된 4개의 아미노산을 포함하는 RID가 접합된 노로바이러스 VP1도 동일한 조건에서 발현시켰으며, 발현된 단백질을 채취하여 SDS-PAGE를 통하여 수용성 여부를 확인하였다.

그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이 재조합된 VP1 단백질은 37℃뿐만 아니라 16℃ 에서도 잘 발현됨을 확인하였다. 또한, 비교예 VP1과 발현량을 비교한 결과, 본 발명의 재조합 VP1이 비교예 VP1 보다 발현량이 약 2배 이상으로 현저하게 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 2a). 또한, 노로 VP1 단백질의 크기는 59kDa이고 RID (8kDa)가 포함된 VP1의 크기는 약 70kDa 이었으며 확인 결과 적절한 위치에서 발현되었음을 확인하였다.

본 발명의 펩타이드 중 일부 서열의 효과

상기 실시예 1에서 확인된 펩타이드(eet1, 서열번호 1)의 일부 서열(eet2, 서열번호 2)을 노로 VP1에 융합하였을 때의 효과를 확인하기 위해 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 VP1 단백질을 발현시켰다. 1mM IPTG 첨가 후 37℃에서 3시간 동안 발현된 단백질을 채취하여 SDS-PAGE를 통하여 수용성 여부를 확인하였다.

그 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이, MS-RID가 융합된 대조군에서는 VP1 단백질이 발현되지 않았고, VP1에 eet2를 융합시킨 경우는 eet1과 비슷한 발현량을 보이는 것을 확인하였다.

노로바이러스 VP1 정제

수용성이 확인된 단백질들은 니켈(Ni) 친화성 크로마토그래피를 통하여 정제되었다. 위와 동일한 방식의 배양방법을 이용하여 3 ml, 50 ml를 거쳐 최종적으로 500 ml의 대장균을 발현 및 수확한 뒤 정제를 진행하였다. 구체적으로, A 버퍼 [50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM 염화나트륨, 5% 글리세롤, 0.1 mM 2-머캅토에탄올, 및 10 mM 이미다졸] 로 먼저 이퀼리브리엄 하였고 이퀼리브리엄 한 Ni-NTA 컬럼 (GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK)을 이용하여 샘플 단백질을 정제하였다. A 버퍼 이후 B 버퍼[50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM 염화나트륨, 5% 글리세롤, 0.1 mM 2-머캅토에탄올, 및 300 mM 이미다졸]를 이용해 10~300 mM 범위의 직선형 그래디언트 이미다졸로 단백질을 용출시켰다. SDS-PAGE를 통해 타겟 단백질을 포함하는 분획을 확인한 후 해당 분획을 모아 C 버퍼(저장버퍼) [50 mM Tris-HCl (pH 8.5), 10 mM NaCl, 0.1 % 2-머캡토에탄올]를 이용하여 투석하였다. 최종적으로 정제된 단백질의 농도는 BSA(Amresco, Solon, OH, USA)를 이용하여 정량하였다. 정제된 VP1 단백질은 20% 글리세롤(glycerol)을 1:1 비율로 섞은 후 -20℃에서 보관하였다.

니켈 친화성 크로마토그래피로 정제된 MSAVKAA-RID-VP1 융합단백질을 확인한 결과 및 SDS-PAGE를 통해 정제 여부를 확인한 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다. 정제를 성공적으로 진행하였으며, 1차 정제 이후 TEV protease를 통한 MSAVKAA-RID를 포함하는 접합 단백질 (tag) 또한 성공적으로 제거하였다. 이후 2^nd Ni-affinity chromatography를 통하여 TEV, cleaved tag, uncleaved-융합단백질을 분리하고 완전히 정제된 VP1을 획득하였다(도 5).

정제된 VP1의 아미노서열 분석

발현 및 정제 실험을 통해 얻은 단백질이 예상했던 VP1 sequence로 이루어져 있는지 확인하기 위하여 펩타이드 맵핑(Peptide mapping) 및 N-말단 및 C-말단 시퀀싱을 전문분석기관인 ISS (www.isslab.co.kr)에 의뢰하여 진행하였다. 먼저 트립신 처리 시 나타나는 펩타이드 절편을 LC-MS/MS 로 분석한 결과 당초 예상한 시퀀스와 83.9%의 아미노산 서열이 일치함을 확인하였다. N-말단 서열 26mer 와 C-말단 3-mer을 비교한 결과 NoV VP1 과 일치함을 확인하였다(도 6).

크기 배제 크로마토그래피(Size exclusion chromatography)

TEV cleavage 후 단백질 절단효소로 절단시킨 VP1 단백질의 이합체가 VLP를 형성하는지 여부를 확인하기 위한 생화학적 분석을 수행하였다. 구체적으로, 4℃에서 Superdex-200 분석 겔-여과 컬럼(analytical gel-filtration column)을 통하여 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)로 진행하였다.

전날 AcTEV 단백질 절단효소를 이용하여 16℃에서 하루동안 융합 단백질을 절단시켰다. 컬럼에는 버퍼[Ammonium acetate 250 mM (pH 6.0)]로 이퀼리브리엄을 진행하였고, 이퀼리브리엄 종료 후에 융합 파트너 단백질이 절단된 VP1 샘플을 로딩하여 정제하였다. 정제 후 페리틴(440 kDa), 알돌레이즈(158 kDa), 콘알부민(75 kDa), 오발부민(44 kDa), 블루 덱스트란 2000(GE Healthcare)을 이용하여 칼리브레이션을 진행함으로써 크로마토그램(chromatogram) 상에서 피크(peak)로 나타난 단백질의 분자량을 결정하였다.

종래 연구 결과에 의하면 노로 바이러스 VLP는 10 MDa 의 분자량을 보이고 우리가 사용한 컬럼의 최대 정제 한계가 800 kDa이므로 VLP를 적절하게 형성하였을 때 Void에서 정제될 것이라고 가정하였다. 크로마토그램을 확인한 결과 Void에서 노로 바이러스 VLP로 보이는 높은 피크를 확인할 수 있었으며(도 7A), 정제하여 수확한 분획들을 SDS-PAGE로 확인해본 결과 크로마토그램의 void에서 나타난 피크가 노로 바이러스 VLP에 해당함을 확인할 수 있었다(도 7B). 또한 TEV 단백질 절단효소에 의해 잘려진 hRBD 또한 크로마토그래피를 통하여 정제되었음을 확인할 수 있었다.

동적광산란 분석

정제된 바이러스 유사 입자(VLP)의 전체적인 직경을 확인하기 위하여 동적광산란(Dynamic Light Scattering, DLS)을 통하여 분석하였다.

그 결과 야생형 노로바이러스가 보이는 30~40nm와 비슷한 크기로 나타나는 것을 확인하였다(도 8).

전자 현미경을 통한 VLP 형성 확인

Void에서 정제된 VP1 단백질이 VLP를 형성했는지 확인하기 위하여 전자 현미경으로 관찰하였다. 정제된 노로 바이러스 VLP를 먼저 구리 그리드에 1분 간 올린 뒤 2% 아세트산 우라닐(uranyl acetate)를 이용하여 15초 간 염색하였다. 전 처리한 샘플을 30분 간 상온에서 건조시킨 뒤 투과 전자 현미경(TEM, Transmission electron microscopy; JEM-1011, JEOL, Japan)을 이용하여 촬영하였다. 위 실험은 연세대학교 의과대학 의생명연구원 연구지원부에서 수행하였다.

그 결과 도 9에 나타난 바와 같이, 정제된 VP1 단백질이 VLP를 형성하는 것을 확인할 수 있었다. 확인된 VLP의 직경은 34 nm 였으며, 배큘로바이러스-곤충세포 발현시스템을 이용하여 생산한 노로바이러스 VLP와 야생형 노로바이러스의 직경과 비슷하였다. 반면, TEV 단백질 절단효소로 단백질 절단하지 않고 hRBD가 융합되어 있는 VP1은 VLP를 형성하지 못하고 응집되는 것을 확인할 수 있었다(도 9).

<110> Inthera Inc. <120> Recombinant Expression Vectors for Producing Norovirus Vaccine <130> 1064696 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MSAVKAA protein <400> 1 Met Ser Ala Val Lys Ala Ala 1 5 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MSAV protein <400> 2 Met Ser Ala Val 1 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MSAVKAA DNA <400> 3 atgtccgcag taaaagcagc c 21 <210> 4 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MSAV DNA <400> 4 atgtccgcag ta 12 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MSEQHAQ Protein <400> 5 Met Ser Glu Gln His Ala Gln 1 5 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MSEQHAQ DNA <400> 6 atgtctgaac aacacgcaca g 21 <210> 7 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hRID protein <400> 7 Met Ala Ala Val Gln Ala Ala Glu Val Lys Val Asp Gly Ser Glu Pro 1 5 10 15 Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys Lys 20 25 30 Val Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln Lys Glu Leu Ser Glu Lys Gln Leu 35 40 45 Ser Gln Ala Thr Ala Ala Ala Thr Asn His Thr Thr Asp Asn Gly Val 50 55 60 Gly Pro Glu Glu Glu Ser Val 65 70 <210> 8 <211> 213 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hRID DNA <400> 8 atggcggccg tgcaggcggc cgaggtgaaa gtggatggca gcgagccgaa actgagcaag 60 aatgagctga agagacgcct gaaagctgag aagaaagtag cagagaagga ggccaaacag 120 aaagagctca gtgagaaaca gctaagccaa gccactgctg ctgccaccaa ccacaccact 180 gataatggtg tgggtcctga ggaagagagc gtg 213 <210> 9 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> eet1-hRID protein <400> 9 Met Ser Ala Val Lys Ala Ala Ala Ala Val Gln Ala Ala Glu Val Lys 1 5 10 15 Val Asp Gly Ser Glu Pro Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg 20 25 30 Leu Lys Ala Glu Lys Lys Val Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln Lys Glu 35 40 45 Leu Ser Glu Lys Gln Leu Ser Gln Ala Thr Ala Ala Ala Thr Asn His 50 55 60 Thr Thr Asp Asn Gly Val Gly Pro Glu Glu Glu Ser Val 65 70 75 <210> 10 <211> 231 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> eet1-hRID DNA <400> 10 atgtccgcag taaaagcagc cgcggccgtg caggcggccg aggtgaaagt ggatggcagc 60 gagccgaaac tgagcaagaa tgagctgaag agacgcctga aagctgagaa gaaagtagca 120 gagaaggagg ccaaacagaa agagctcagt gagaaacagc taagccaagc cactgctgct 180 gccaccaacc acaccactga taatggtgtg ggtcctgagg aagagagcgt g 231 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Histidine tag <400> 11 caccatcacc atcaccat 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEV <400> 12 gaaaacctgt attttcag 18 <210> 13 <211> 1620 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VP1 <400> 13 Met Glu Thr Leu Tyr Ser Met Glu Thr Ala Leu Ala Ser Glu Arg Ala 1 5 10 15 Ser Asn Ala Ser Pro Ala Leu Ala Ser Glu Arg Pro Arg Ala Ser Glu 20 25 30 Arg Ala Ser Pro Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Thr His Arg Ala Leu Ala 35 40 45 Ala Ser Asn Leu Glu Ala Val Ala Leu Pro Arg Ala Gly Leu Ala Val 50 55 60 Ala Leu Ala Ser Asn Ala Ser Asn Gly Leu Ala Val Ala Leu Met Glu 65 70 75 80 Thr Ala Leu Ala Leu Glu Ala Gly Leu Ala Pro Arg Ala Val Ala Leu 85 90 95 Val Ala Leu Gly Leu Tyr Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ile Leu Glu Ala 100 105 110 Leu Ala Ala Leu Ala Pro Arg Ala Val Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu 115 120 125 Tyr Gly Leu Asn Gly Leu Asn Ala Ser Asn Val Ala Leu Ile Leu Glu 130 135 140 Ala Ser Pro Pro Arg Ala Thr Arg Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gly Ala 145 150 155 160 Ser Asn Ala Ser Asn Pro His Glu Val Ala Leu Gly Leu Asn Ala Leu 165 170 175 Ala Pro Arg Ala Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Gly Leu Ala Pro His Glu 180 185 190 Thr His Arg Val Ala Leu Ser Glu Arg Pro Arg Ala Ala Arg Gly Ala 195 200 205 Ser Asn Ala Leu Ala Pro Arg Ala Gly Leu Tyr Gly Leu Ala Ile Leu 210 215 220 Glu Leu Glu Ala Thr Arg Pro Ser Glu Arg Ala Leu Ala Pro Arg Ala 225 230 235 240 Leu Glu Ala Gly Leu Tyr Pro Arg Ala Ala Ser Pro Leu Glu Ala Ala 245 250 255 Ser Asn Pro Arg Ala Thr Tyr Arg Leu Glu Ala Ser Glu Arg His Ile 260 265 270 Ser Leu Glu Ala Ala Leu Ala Ala Arg Gly Met Glu Thr Thr Tyr Arg 275 280 285 Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Thr Tyr Arg Ala Leu Ala Gly Leu Tyr Gly 290 295 300 Leu Tyr Pro His Glu Gly Leu Ala Val Ala Leu Gly Leu Asn Val Ala 305 310 315 320 Leu Ile Leu Glu Leu Glu Ala Ala Leu Ala Gly Leu Tyr Ala Ser Asn 325 330 335 Ala Leu Ala Pro His Glu Thr His Arg Ala Leu Ala Gly Leu Tyr Leu 340 345 350 Tyr Ser Ile Leu Glu Ile Leu Glu Pro His Glu Ala Leu Ala Ala Leu 355 360 365 Ala Val Ala Leu Pro Arg Ala Pro Arg Ala Ala Ser Asn Pro His Glu 370 375 380 Pro Arg Ala Thr His Arg Gly Leu Ala Gly Leu Tyr Leu Glu Ala Ser 385 390 395 400 Glu Arg Pro Arg Ala Ser Glu Arg Gly Leu Asn Val Ala Leu Thr His 405 410 415 Arg Met Glu Thr Pro His Glu Pro Arg Ala His Ile Ser Ile Leu Glu 420 425 430 Ile Leu Glu Val Ala Leu Ala Ser Pro Val Ala Leu Ala Arg Gly Gly 435 440 445 Leu Asn Leu Glu Ala Gly Leu Ala Pro Arg Ala Val Ala Leu Leu Glu 450 455 460 Ala Ile Leu Glu Pro Arg Ala Leu Glu Ala Pro Arg Ala Ala Ser Pro 465 470 475 480 Val Ala Leu Ala Arg Gly Ala Ser Asn Ala Ser Asn Pro His Glu Thr 485 490 495 Tyr Arg His Ile Ser Thr Tyr Arg Ala Ser Asn Gly Leu Asn Ser Glu 500 505 510 Arg Ala Ser Asn Ala Ser Pro Ser Glu Arg Thr His Arg Ile Leu Glu 515 520 525 Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Ile Leu Glu Ala Leu Ala Met Glu Thr Leu 530 535 540 Glu Ala Thr Tyr Arg Thr His Arg Pro Arg Ala Leu Glu Ala Ala Arg 545 550 555 560 Gly Ala Leu Ala Ala Ser Asn Ala Ser Asn Ala Leu Ala Gly Leu Tyr 565 570 575 Ala Ser Pro Ala Ser Pro Val Ala Leu Pro His Glu Thr His Arg Val 580 585 590 Ala Leu Ser Glu Arg Cys Tyr Ser Ala Arg Gly Val Ala Leu Leu Glu 595 600 605 Ala Thr His Arg Ala Arg Gly Pro Arg Ala Ser Glu Arg Pro Arg Ala 610 615 620 Ala Ser Pro Pro His Glu Ala Ser Pro Pro His Glu Ile Leu Glu Pro 625 630 635 640 His Glu Leu Glu Ala Val Ala Leu Pro Arg Ala Pro Arg Ala Thr His 645 650 655 Arg Val Ala Leu Gly Leu Ala Ser Glu Arg Ala Arg Gly Thr His Arg 660 665 670 Leu Tyr Ser Pro Arg Ala Pro His Glu Thr His Arg Val Ala Leu Pro 675 680 685 Arg Ala Val Ala Leu Leu Glu Ala Thr His Arg Val Ala Leu Gly Leu 690 695 700 Ala Gly Leu Ala Met Glu Thr Thr His Arg Ala Ser Asn Ser Glu Arg 705 710 715 720 Ala Arg Gly Pro His Glu Pro Arg Ala Ile Leu Glu Pro Arg Ala Leu 725 730 735 Glu Ala Gly Leu Ala Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Pro His Glu Thr His 740 745 750 Arg Gly Leu Tyr Pro Arg Ala Ser Glu Arg Ser Glu Arg Ala Leu Ala 755 760 765 Pro His Glu Val Ala Leu Val Ala Leu Gly Leu Asn Pro Arg Ala Gly 770 775 780 Leu Asn Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Ala Arg Gly Cys Tyr Ser Thr His 785 790 795 800 Arg Thr His Arg Ala Ser Pro Gly Leu Tyr Val Ala Leu Leu Glu Ala 805 810 815 Leu Glu Ala Gly Leu Tyr Thr His Arg Thr His Arg Gly Leu Asn Leu 820 825 830 Glu Ala Ser Glu Arg Pro Arg Ala Val Ala Leu Ala Ser Asn Ile Leu 835 840 845 Glu Cys Tyr Ser Thr His Arg Pro His Glu Ala Arg Gly Gly Leu Tyr 850 855 860 Ala Ser Pro Val Ala Leu Thr His Arg His Ile Ser Ile Leu Glu Pro 865 870 875 880 Arg Ala Gly Leu Tyr Thr His Arg Ala Arg Gly Thr His Arg Thr Tyr 885 890 895 Arg Ala Arg Gly Met Glu Thr Ala Ser Asn Leu Glu Ala Ala Leu Ala 900 905 910 Ser Glu Arg Gly Leu Asn Ala Ser Asn Thr Arg Pro Ala Ser Asn Ala 915 920 925 Ser Asn Thr Tyr Arg Ala Ser Pro Pro Arg Ala Thr His Arg Gly Leu 930 935 940 Ala Gly Leu Ala Ile Leu Glu Pro Arg Ala Ala Leu Ala Pro Arg Ala 945 950 955 960 Leu Glu Ala Gly Leu Tyr Thr His Arg Pro Arg Ala Ala Ser Pro Pro 965 970 975 His Glu Val Ala Leu Gly Leu Tyr Leu Tyr Ser Ile Leu Glu Gly Leu 980 985 990 Asn Gly Leu Tyr Met Glu Thr Leu Glu Ala Thr His Arg Gly Leu Asn 995 1000 1005 Thr His Arg Thr His Arg Leu Tyr Ser Gly Leu Tyr Ala Ser Pro Gly 1010 1015 1020 Leu Tyr Ser Glu Arg Thr His Arg Ala Arg Gly Gly Leu Tyr His Ile 1025 1030 1035 1040 Ser Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Thr His Arg Val Ala Leu Ser Glu Arg 1045 1050 1055 Thr His Arg Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Val Ala Leu Ala Ser Pro Pro 1060 1065 1070 His Glu Thr His Arg Pro Arg Ala Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Gly Leu 1075 1080 1085 Tyr Ser Glu Arg Val Ala Leu Gly Leu Asn Pro His Glu Ala Leu Ala 1090 1095 1100 Thr His Arg Ala Ser Pro Thr His Arg Ala Ser Pro Ala Ser Asn Ala 1105 1110 1115 1120 Ser Pro Pro His Glu Gly Leu Ala Thr His Arg Gly Leu Tyr Gly Leu 1125 1130 1135 Asn Ala Ser Asn Thr His Arg Ala Arg Gly Pro His Glu Thr His Arg 1140 1145 1150 Pro Arg Ala Val Ala Leu Gly Leu Tyr Val Ala Leu Ile Leu Glu Gly 1155 1160 1165 Leu Asn Ala Ser Pro Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Ser Glu Arg Ala Leu 1170 1175 1180 Ala His Ile Ser Ala Arg Gly Ala Ser Asn Gly Leu Ala Pro Arg Ala 1185 1190 1195 1200 Gly Leu Asn Gly Leu Asn Thr Arg Pro Val Ala Leu Leu Glu Ala Pro 1205 1210 1215 Arg Ala Ala Ser Pro Thr Tyr Arg Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Ala Arg 1220 1225 1230 Gly Thr His Arg Val Ala Leu His Ile Ser Ala Ser Asn Val Ala Leu 1235 1240 1245 His Ile Ser Leu Glu Ala Ala Leu Ala Pro Arg Ala Ala Leu Ala Val 1250 1255 1260 Ala Leu Ala Leu Ala Pro Arg Ala Thr His Arg Pro His Glu Pro Arg 1265 1270 1275 1280 Ala Gly Leu Tyr Gly Leu Ala Gly Leu Asn Leu Glu Ala Leu Glu Ala 1285 1290 1295 Pro His Glu Pro His Glu Ala Arg Gly Ser Glu Arg Thr His Arg Met 1300 1305 1310 Glu Thr Pro Arg Ala Gly Leu Tyr Cys Tyr Ser Ser Glu Arg Gly Leu 1315 1320 1325 Tyr Thr Tyr Arg Pro Arg Ala Ala Ser Asn Met Glu Thr Ala Ser Pro 1330 1335 1340 Leu Glu Ala Ala Ser Pro Cys Tyr Ser Leu Glu Ala Leu Glu Ala Pro 1345 1350 1355 1360 Arg Ala Gly Leu Asn Gly Leu Ala Thr Arg Pro Val Ala Leu Gly Leu 1365 1370 1375 Asn His Ile Ser Pro His Glu Thr Tyr Arg Gly Leu Asn Gly Leu Ala 1380 1385 1390 Ala Leu Ala Ala Leu Ala Pro Arg Ala Ala Leu Ala Gly Leu Asn Ser 1395 1400 1405 Glu Arg Ala Ser Pro Val Ala Leu Ala Leu Ala Leu Glu Ala Leu Glu 1410 1415 1420 Ala Ala Arg Gly Pro His Glu Val Ala Leu Ala Ser Asn Pro Arg Ala 1425 1430 1435 1440 Ala Ser Pro Thr His Arg Gly Leu Tyr Ala Arg Gly Val Ala Leu Leu 1445 1450 1455 Glu Ala Pro His Glu Gly Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Tyr Ser Leu Glu 1460 1465 1470 Ala His Ile Ser Leu Tyr Ser Thr His Arg Gly Leu Tyr Thr Tyr Arg 1475 1480 1485 Val Ala Leu Thr His Arg Val Ala Leu Ala Leu Ala His Ile Ser Thr 1490 1495 1500 His Arg Gly Leu Tyr Gly Leu Asn His Ile Ser Ala Ser Pro Leu Glu 1505 1510 1515 1520 Ala Val Ala Leu Ile Leu Glu Pro Arg Ala Pro Arg Ala Ala Ser Asn 1525 1530 1535 Gly Leu Tyr Thr Tyr Arg Pro His Glu Ala Arg Gly Pro His Glu Ala 1540 1545 1550 Ser Pro Ser Glu Arg Thr Arg Pro Val Ala Leu Ala Ser Asn Gly Leu 1555 1560 1565 Asn Pro His Glu Thr Tyr Arg Thr His Arg Leu Glu Ala Ala Leu Ala 1570 1575 1580 Pro Arg Ala Met Glu Thr Gly Leu Tyr Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Ala 1585 1590 1595 1600 Leu Ala Gly Leu Tyr Ala Arg Gly Ala Arg Gly Ala Arg Gly Ala Leu 1605 1610 1615 Ala Leu Glu Ala 1620 <210> 14 <211> 1620 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VP1 <400> 14 atgaaaatgg cgagcaatga tgcgagcccg agcgatggca gcaccgcgaa tctggtgccg 60 gaagtgaata atgaagtgat ggcgctggaa ccggtggtgg gcgcggcgat tgcggcgccg 120 gtggcgggcc agcagaatgt gattgatccg tggattcgca ataattttgt gcaggcgccg 180 ggcggcgaat ttaccgtgag cccgcgcaat gcgccgggcg aaattctgtg gagcgcgccg 240 ctgggcccgg atctgaatcc gtatctgagc catctggcgc gcatgtataa tggctatgcg 300 ggcggctttg aagtgcaggt gattctggcg ggcaatgcgt ttaccgcggg caaaattatt 360 tttgcggcgg tgccgccgaa ttttccgacc gaaggcctga gcccgagcca ggtgaccatg 420 tttccgcata ttattgtgga tgtgcgccag ctggaaccgg tgctgattcc gctgccggat 480 gtgcgcaata atttttatca ttataatcag agcaatgata gcaccattaa actgattgcg 540 atgctgtata ccccgctgcg cgcgaataat gcgggcgatg atgtgtttac cgtgagctgc 600 cgcgtgctga cccgtccgag cccggatttt gattttattt ttctggtgcc gccgaccgtg 660 gaaagccgta ccaaaccgtt taccgtgccg gtgctgaccg tggaagaaat gaccaatagc 720 cgctttccga ttccgctgga aaaactgttt accggcccga gcagcgcgtt tgtggtgcag 780 ccgcagaatg gccgctgcac caccgatggc gtgctgctgg gcaccaccca gctgagcccg 840 gtgaatattt gcacctttcg tggcgatgtg acccatattc cgggcacccg cacctatcgc 900 atgaatctgg cgagccagaa ttggaataat tatgatccga ccgaagaaat tccggcgccg 960 ctgggcaccc cggattttgt gggcaaaatt cagggcatgc tgacccagac caccaaaggc 1020 gatggcagca cccgtggcca taaagcgacc gtgagcaccg gcagcgtgga ttttaccccg 1080 aaactgggca gcgtgcagtt tgcgaccgat accgataatg attttgaaac cggccagaat 1140 acccgcttta ccccggtggg cgtgattcag gatggcagca gcgcgcatcg caatgaaccg 1200 cagcagtggg tgctgccgga ttatagcggt cgcaccgtgc ataatgtgca tctggcgccg 1260 gcggtggcgc cgacctttcc gggcgaacag ctgctgtttt ttcgcagcac catgccgggc 1320 tgcagcggct atccgaatat ggatctggat tgcctgctgc cgcaggaatg ggtgcagcat 1380 ttttatcagg aagcggcgcc ggcgcagagc gatgtggcgc tgctgcgctt tgtgaatccg 1440 gataccggcc gcgtgctgtt tgaatgcaaa ctgcataaaa ccggctatgt gaccgtggcg 1500 cataccggcc agcatgatct ggtgattccg ccgaatggct attttcgctt tgatagctgg 1560 gtgaatcagt tttataccct ggcgccgatg ggcaatggcg cgggccgccg tcgcgcgctg 1620 1620

Claims

목적 단백질; 및 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드;를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고,
상기 목적 단백질은 노로 바이러스 유래 VP1 단백질인, 노로 바이러스 백신 생산용 재조합 발현 벡터.
제1항에 있어서,
상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 요산산화효소(urate oxidase)로부터 유래한 것을 특징으로 하는 노로 바이러스 백신 생산용 재조합 발현 벡터.
삭제
제1항 또는 제2항에 따른 발현벡터로 형질전환된 숙주세포.
제4항에 있어서,
상기 숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 형질전환 숙주세포.
(a) 노로 바이러스 유래 VP1 단백질; 및 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드;를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 노로 바이러스 백신 생산용 재조합 발현 벡터를 생산하는 단계;
(b) 상기 발현 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 생산하는 단계; 및
(c) 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 융합 단백질의 발현을 유도하고, 이를 수득하는 단계를 포함하는 노로 바이러스 백신 생산방법.
제6항에 있어서,
상기 숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 노로 바이러스 백신 생산방법.
노로 바이러스 유래 VP1 단백질; 및
서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와 상기 펩타이드의 융합파트너로서 RID(LysRS RNA interacting domain)을 포함하는 목적 단백질의 발현 효율 및 수용성을 증진시키기 위한 융합 단백질;
을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 노로 바이러스 백신 생산용 재조합 발현 벡터.
제8항에 있어서,
상기 RID는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현벡터.
제8항에 있어서,
상기 융합 단백질은 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현벡터.
제8항에 따른 발현벡터로 형질전환된 숙주세포.
제11항에 있어서,
상기 숙주세포는 대장균(E.coli)인 것을 특징으로 하는 숙주세포.