WO2019103512A2 - 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 신규한 펩타이드 및 이를 포함하는 융합 단백질 - Google Patents

목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 신규한 펩타이드 및 이를 포함하는 융합 단백질 Download PDF

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    • C12N2770/16022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to novel peptides for enhancing the expression efficiency of a target protein and fusion proteins comprising the novel peptides. More specifically, the present invention relates to a peptide comprising 7 amino acids derived from urate oxidase or a peptide fragment thereof, and a fusion protein comprising a RID (RNA interacting domain) as a fusion partner with the peptide .
  • RID RNA interacting domain
  • coli have low expression levels or lack the proper " post-translational chaperons " or " posttranslational processing & (Recombinant protein expression in Escherichia coli, Current Opinion in Biotechnology (1999), 10: 411-421).
  • the recombinant protein is expressed as an insoluble protein inclusion body.
  • RID RNA interacting domain, N-terminal appended RNA binding domain of Lysyl tRNA synthetase
  • RID itself has a large or large disadvantage that the expression level is very low.
  • Norovirus is one of the major pathogens causing acute gastroenteritis worldwide, and 200,000 children under 5 years of age die each year from Norovirus. Noroviruses are mainly infected through the fecal-oral route and cause nausea, vomiting, diarrhea, and dehydration.
  • Norovirus belonging to Caliciviridae is a membrane-free virus with a diameter of about 30 to 40 nm. It consists of 7.6 kbp single stranded (+) RNA and has 3 open reading frames (ORFs). Of these, ORF2 is encoded by the major structural protein VP1 in the form of Norovirus, and ORF3 is encoded by the VP2 protein, but is not directly involved in the formation of the structure.
  • VP1 has a total size of 59 kDa and is a dimer. These 90 dimers are self-assembled and a total of 180 VP1 forms a virus particle.
  • the VP1 protein consists of two domains: the S domain (S domain) and the P domain (P domain) are involved in the induction of an actual immune response.
  • VLP Virus-Like Particles
  • VLPs are highly complex and elaborate constructs that specifically express viral structural proteins to show a similar structure to that of wild-type viruses. Because of its similar structure to the wild-type virus, it can induce a high immune response in the body and can stimulate both T-cell and B-cell immune pathways. In addition, it is characterized by high safety due to lack of infectivity due to absence of genetic material in the formed structure and excellent structural stability. However, the structure is complicated and it is very difficult to make a complete VLP.
  • Norovirus VLPs are mainly produced in baculovirus-insect cells and are known to be capable of producing VLPs in yeast.
  • Escherichia coli has reported that it expresses the structural protein (VP1) in a water-soluble form, it has never been reported to form a virus-like particle (VLP). If Norovirus VLPs derived from Escherichia coli can be developed, most casualties to Norovirus can make a significant contribution to human society as a low-cost vaccine compared to vaccines using different expression systems as they occur in developing countries.
  • LysRS Lysyl tRNA synthetase
  • RBD RNA Binding Domain
  • LysRS is not only a large protein of about 100 kDa, but also because of the steric hindrance due to the structural limitations of dimer formation, it is necessary that the recombinant protein has three dimensional structure, It may interfere with the formation of oligomers, monomers, or monomers. Therefore, RID (RNA interacting domain, N-terminal appended RNA binding domain of Lysyl tRNA synthetase) is used as an RNA binding domain to replace LysRS.
  • RID RNA interacting domain, N-terminal appended RNA binding domain of Lysyl tRNA synthetase
  • RID itself has a disadvantage in that the expression level is very low.
  • Protein expression levels can be determined by a variety of factors, but it is known that the N-terminal sequence of a protein, precisely the mRNA sequence, is important for protein expression levels.
  • the inventors of the present invention found that the urate oxidase protein was abnormally expressed in Escherichia coli during the study of the water solubility and the expression efficiency of the protein, and the N-terminal sequence of the uric acid oxidase expressed the expression of the target protein And the effect on the expression of RID was confirmed and the present invention was completed.
  • the present invention has been made to solve the above-mentioned problems, and it is an object of the present invention to provide a peptide having 7 amino acids derived from uric acid oxidase or a partial sequence thereof, which plays a crucial role in enhancing the expression efficiency of a target protein, Amino acid peptides are also applied to the RID (RNA interacting domain) known as a water-solubility enhancing partner, thereby confirming that the expression efficiency of the target protein can be enhanced and the water-solubility can be enhanced, thus completing the present invention.
  • RID RNA interacting domain
  • the present invention provides a method for producing a recombinant vector comprising the steps of: expressing a peptide comprising 7 amino acids or a partial sequence thereof derived from uric acid oxidase, a polynucleotide encoding the peptide, an expression vector comprising the peptide and a host cell transformed with the expression vector
  • the purpose is to provide.
  • the present invention also relates to a fusion protein comprising RID as a fusion partner with a peptide comprising 7 amino acids or a partial sequence thereof derived from uric acid oxidase, an expression vector comprising said fusion protein, and an expression vector To a host cell.
  • the present invention also provides a method for producing an expression vector, comprising the steps of: preparing an expression vector comprising a polynucleotide encoding a target protein and a polynucleotide encoding a peptide that enhances expression efficiency of a target protein bound to the 5'-terminal of the polynucleotide; To a host cell to produce a transformant, and culturing the transformant to induce the expression of the recombinant target protein and obtaining the same, thereby providing a method for producing a water-soluble target protein .
  • the present invention also provides a recombinant expression vector for producing Norovirus vaccine capable of enhancing the expression efficiency of the VP1 protein and enhancing the water solubility by using Norovirus VP1 protein which is not expressed well in prokaryotic cells as a target protein, Transformed host cells, and methods for producing norovirus vaccines using the vectors and host cells.
  • the present invention provides a peptide for enhancing the expression efficiency of a target protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial sequence thereof.
  • Urate oxidase (EC 1.7.3.3 (uricase) is an enzyme that acts on the purine cleavage mechanism.) Uricase is an enzyme that oxidizes uric acid to allantoin. And the uric acid is the final substance of the purine metabolism.It is because the metabolites free acid and urate salt are both water insoluble, In order to treat the gout efficiently, a therapeutic method of directly injecting a non-human carase into a human is practiced.
  • target protein refers to any protein that a person skilled in the art intends to produce in large quantities and which is capable of expressing in a host cell by inserting a polynucleotide encoding the protein into a recombinant expression vector .
  • the term " peptide for enhancing the expression efficiency of a target protein " or " expression enhancer tag (eet) " refers to a short peptide sequence which enhances the expression efficiency of a protein by being fused to the N- .
  • the peptide for enhancing the expression efficiency of a target protein in the present invention includes a seven amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or a partial sequence thereof.
  • recombinant protein or "fusion protein” refers to a protein that is linked to another protein at the N- or C-terminus of the original target protein sequence, .
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a partial sequence thereof may be derived from urate oxidase.
  • a part of the sequence of SEQ ID NO: 1 may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the peptide for enhancing the expression efficiency of the target protein may bind to the N-terminal of the target protein.
  • the target protein may be selected from the group consisting of an antigen, an antibody, a cell receptor, an enzyme, a structural protein, a serum and a cell protein.
  • the antigen may be a VP1 protein derived from Norovirus.
  • the present invention also provides a polynucleotide encoding a peptide for enhancing the expression efficiency of the target protein.
  • the polynucleotide may be a polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • polynucleotide encoding SEQ ID NO: 1 may be a sequence represented by SEQ ID NO: 3
  • polynucleotide encoding SEQ ID NO: 2 may be the sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • the present invention also provides an expression vector comprising a peptide for enhancing the expression efficiency of the target protein.
  • the present invention provides an expression vector comprising a polynucleotide encoding a target protein and a polynucleotide encoding a peptide for enhancing the efficiency of expression of the target protein bound to the 5'-terminal of the polynucleotide encoding the target protein do.
  • expression vector is a linear or circular DNA molecule consisting of a fragment encoding a polypeptide of interest operably linked to an additional fragment provided in the transcription of the expression vector. Such additional fragments include promoter and termination coding sequences.
  • the expression vector also includes at least one replication origin, at least one selection marker, a polyadenylation signal, and the like. Expression vectors are generally derived from plasmid or viral DNA, or contain both elements.
  • operably linked indicates that fragments are arranged such that transcription in the promoter begins and proceeds through the coding sequence to the termination cipher.
  • the expression vector may be a plasmid, a viral vector, a phage particle or a genome insert.
  • the expression vector may be transformed into a host cell and then cloned or integrated into the genome of the host cell irrespective of the genome of the host cell.
  • the present invention also provides a host cell transformed with an expression vector comprising a peptide for enhancing the expression efficiency of the target protein.
  • transformation or " introduction” as used herein means that DNA is introduced into a host and the DNA becomes replicable as an extrachromosomal element or by chromosome integration completion.
  • Methods for transforming an expression vector according to the present invention include electroporation, calcium phosphate (CaPO 4 ), calcium chloride (CaCl 2 ), microinjection, polyethylene glycol (PEG), DEAE- Tran method, cationic liposome method, or lithium acetate-DMSO method, but the method is not limited thereto.
  • the host cell is preferably a host cell having high efficiency of DNA introduction and high efficiency of expression of the introduced DNA, and all microorganisms including prokaryotic and eukaryotic cells can be used.
  • the host cell may be E. coli .
  • the present invention also provides a method for producing a target protein with enhanced expression efficiency.
  • the method for producing the target protein comprises:
  • the present invention provides a fusion protein for enhancing the expression efficiency and water solubility of a target protein comprising an RID (RNA interacting domain) as a peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a partial sequence thereof and a fusion partner thereof.
  • RID RNA interacting domain
  • RNA interacting domain N terminal appended RNA binding domain of Lysyl tRNA synthetase
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may be derived from uric acid oxidase.
  • the peptide may bind to the N-terminal of the target protein.
  • the fusion protein for enhancing expression efficiency and water solubility of a target protein according to the present invention may include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7.
  • the fusion protein of the present invention may include the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9.
  • the target protein may be selected from the group consisting of an antigen, an antibody, a cell receptor, an enzyme, a structural protein, a serum and a cell protein have.
  • the present invention also relates to a method for enhancing the expression efficiency and water solubility of a target protein having a fusion protein comprising a RID as a fusion partner and a peptide comprising an amino acid of SEQ ID NO: 1 or a partial sequence thereof, Expression vector.
  • the expression vector may be a plasmid, a viral vector, a phage particle or a genome insert.
  • the expression vector may be transformed into a host cell and then cloned or integrated into the genome of the host cell irrespective of the genome of the host cell.
  • the present invention also relates to a method for enhancing the expression efficiency and water solubility of a target protein having a fusion protein comprising a RID as a fusion partner and a peptide comprising an amino acid of SEQ ID NO: 1 or a partial sequence thereof, To provide a host cell transformed with an expression vector.
  • the host cell is preferably a host cell having high efficiency of DNA introduction and high efficiency of expression of the introduced DNA, and all microorganisms including prokaryotic and eukaryotic cells can be used.
  • the host cell may be E. coli .
  • the present invention also provides a method for producing a target protein with enhanced expression efficiency and water solubility.
  • the method for producing the target protein comprises:
  • the present invention also relates to a method for the production of a target protein, And a peptide for promoting the expression efficiency of a target protein comprising 7 amino acids derived from uric acid oxidase or a partial sequence thereof, in a recombinant expression vector for producing a norovirus vaccine.
  • the peptide for enhancing the expression efficiency of the target protein may be one derived from urate oxidase, or the amino acid sequence of SEQ ID NO: have.
  • a part of the sequence of SEQ ID NO: 1 may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the recombinant expression vector for the production of the Norovirus vaccine of the present invention may contain a polynucleotide encoding the peptide of SEQ ID NO: 1 for enhancing the expression efficiency of the target protein.
  • polynucleotide encoding the peptide of SEQ ID NO: 1 may be the sequence of SEQ ID NO: 3
  • the polynucleotide encoding the peptide of SEQ ID NO: 2 may be the sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the recombinant expression vector for producing norovirus comprises a polynucleotide encoding 1 to 6 histidines; And a polynucleotide encoding a protein cleavage enzyme recognition site.
  • the polynucleotide encoding the above 1 to 6 histidine may be represented by SEQ ID NO: 10.
  • the protein-cleaving enzyme may be TEV.
  • the polynucleotide encoding the protein cleavage enzyme recognition site may be represented by SEQ ID NO: 11.
  • the expression vector may be a plasmid, a viral vector, a phage particle or a genome insert.
  • the expression vector may be transformed into a host cell and then cloned or integrated into the genome of the host cell irrespective of the genome of the host cell.
  • the present invention also relates to the aforementioned Norovirus-derived VP1 protein; And an expression vector comprising a peptide for enhancing expression efficiency of a target protein.
  • the host cell is preferably a host cell having high efficiency of DNA introduction and high efficiency of expression of the introduced DNA, and all microorganisms including prokaryotic and eukaryotic cells can be used.
  • the host cell may be E. coli .
  • the present invention also seeks to provide a method for producing a norovirus vaccine with enhanced expression efficiency.
  • the method for producing the norovirus vaccine comprises:
  • a VP1 protein derived from Norovirus as a target protein (a) a VP1 protein derived from Norovirus as a target protein; And a peptide for enhancing the expression efficiency of a target protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a partial sequence thereof; producing a recombinant expression vector for the production of a norovirus vaccine comprising the polynucleotide;
  • the present invention also relates to a VP1 protein derived from Norovirus; And a fusion protein for enhancing the expression efficiency and water solubility of a target protein comprising an RID (RNA interacting domain) as a fusion partner of the peptide with the peptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a partial sequence thereof and a polynucleotide To provide a recombinant expression vector for the production of a norovirus vaccine.
  • RID RNA interacting domain
  • the expression vector of the present invention comprises a polynucleotide encoding a target protein and a polynucleotide encoding a fusion protein bound to the 5'-terminal of the polynucleotide encoding the target protein, A fusion protein of a peptide and RID to enhance expression efficiency.
  • fusion protein or " recombinant protein” refers to a protein that is linked to another protein at the N- or C-terminus of the original target protein sequence, .
  • the present invention also seeks to provide a method for producing an effective Norovirus vaccine with enhanced expression efficiency and water solubility.
  • the method of producing the Norovirus vaccine comprises:
  • a recombinant target protein having a fusion protein comprising an amino acid of SEQ ID NO: 1 or a peptide comprising a partial sequence thereof and RID which enhances water solubility as a fusion partner thereof, at the N-terminus of the VP1 protein derived from Norovirus Preparing an expression vector;
  • the peptide containing 7 amino acids derived from the uric acid oxidase according to the present invention can improve the expression efficiency of the target protein and the fusion protein in which the peptide is bound to the RID well known as a water soluble enhancer protein has an expression efficiency By improving water solubility as well, it can be usefully used for the production of a recombinant target protein.
  • the peptide that enhances the expression efficiency of the target protein according to the present invention can be applied together with the RID known as a soluble and enhancing fusion partner of the peptide and the peptide capable of improving the expression efficiency of a target protein, And at the same time, can be usefully used for the production of a recombinant target protein.
  • FIG. 1 shows experimental results showing the effect of the peptide (eet1) of the present invention on the expression efficiency of EGFP protein (A: SDS-PAGE showing the expression of each fusion protein, B: a control group treated with 80 ⁇ M of IPTG ) Was expressed as 1, and C: graph showing the relative activity of each relative activity when the protein activity of the control group treated with 80 M of IPTG was 1).
  • FIG. 2 shows the results of comparing the effect of the peptide of the present invention or its part on the expression efficiency and activity of EGFP protein (A: SDS-PAGE showing the expression of each fusion protein, B: control group treated with 80 ⁇ M IPTG (MSEQHAQ-EGFP) expressed as 1, the relative expression level of each protein, and the relative activity of D: protein glycoprotein activity when the protein activity of the control group treated with C: IPTG 80 ⁇ M was regarded as 1 graph).
  • A SDS-PAGE showing the expression of each fusion protein
  • B control group treated with 80 ⁇ M IPTG (MSEQHAQ-EGFP) expressed as 1
  • D protein glycoprotein activity when the protein activity of the control group treated with C: IPTG 80 ⁇ M was regarded as 1 graph
  • FIG. 3 is a graph showing the effect of the peptide of the present invention on the expression of TruB, an Escherichia coli-derived protein (A: SDS-PAGE showing the expression of each fusion protein, and B: Relative expression level).
  • FIG. 4 is a graph (A) showing the effect of the peptide of the present invention on the hRID as a water-soluble enhancing fusion partner and a graph (B) showing a change in the relative expression amount.
  • FIG. 5 is a graph showing the effect of the hRID fusion with the peptide of the present invention on the expression efficiency of a target protein.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing the structure of a recombinant expression vector for producing water-soluble norovirus according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 7a shows the results of SDS-PAGE of the VP1 protein expressed in accordance with an embodiment of the present invention.
  • VP1 70 kDa
  • MSAVKAA-RID MSAVKAA-RID
  • Example VP1 with recombined MSEQ-RID: 69 kDa
  • FIG. 7b shows the expression of VP1 (70 kDa) in which MSAVKAA-RID was recombined in the left panel as a result of SDS-PAGE analysis of soluble expression of VP1 protein expressed according to an embodiment of the present invention.
  • the expression of VP1 (70 kDa) in which RID was recombined is shown in the right panel as a result of the control (MS-RID).
  • FIG. 8 is a chromatogram result obtained by purifying VP1 protein expressed by nickel affinity chromatography according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 shows the result of pooling the fractions of 18 to 20 lane by SDS-PAGE after purifying the expressed VP1 protein according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 11 shows peptide mapping and N-terminal and C-terminal amino acid sequence analysis results to confirm that the protein obtained through expression and purification is composed of the VP1 sequence
  • Figure 11a is the UPLC peak analyzed after tryptic treatment, Analysis of the peptide fragment in the trypsin treatment by LC-MS / MS showed that 83.9% of the amino acid sequence was consistent with the original sequence.
  • Fig. 11c shows that the N-terminal sequence was consistent with norovirus VP1
  • Fig. 11D shows the result of confirming that the C-terminal sequence matches the Norovirus VP1.
  • 12A is a chromatogram showing a result of performing size exclusion chromatography to purify a VLP formed after cleavage with a TEV protease.
  • FIG. 12B shows the result of S-PAGE of the purified VLP protein after cleavage with TEV protein cleaving enzyme.
  • FIG. 13 shows the result of analysis through DLS (Dynamic Light Scattering) to check the overall diameter of the purified VLP.
  • FIG. 14 shows the results of TEM microarray analysis of whether or not the purified VP1 protein forms VLP.
  • A Virus-like particle from Escherichia coli confirmed by electron microscope
  • B histidine, RID Recombinant VP1 protein without tag removal (failed to form VLP structure)
  • C Norovirus VLP produced by baculovirus-insect cell system.
  • D wild type norovirus virion.
  • Protein solubility and folding enhancement by interaction with RNA, PLoS ONE (2008), 3: e2677) were used as expression vectors for pGE-LysRS.
  • pGE-LysRS is regulated by the T7 promoter and the LysRS gene is cut out using one of the cleavage sites in Nde1 and MCS (Kpn1-BamH1-EcoRV-Sal1-Hind3) and EGFP or hRID at that position, or Other proteins were inserted.
  • the amino acid sequence (eet1) of SEQ ID NO: 1 or a part thereof (eet2, SEQ ID NO: 2) was inserted at the N-terminal position of the inserted protein.
  • the target proteins to be expressed were inserted using the prepared hRID, or two cleavage enzyme sites in the MCS of the amino acid-containing hRID vector of SEQ ID NO: 1.
  • the prepared protein expression vector was transformed into BL21 (DE3), BL21 (DE3) -pLysS, or BL21 (DE3) -pLysE competent cells and cultured. All transformed E. coli were cultured in LB medium containing 50 ⁇ g / ml of ampicillin, and E. coli transformed with BL21 * (DE3) -pLysS or BL21 * (DE3) -pLysE had 34 ⁇ g / ml And cultured in a medium supplemented with chloramphenicol. The incubation temperature varies from protein to protein and was cultured at 33 to 37 ° C.
  • IPTG is added at a level of 0 ⁇ M to 1 mM to activate the T7 promoter, and then IPTG is added at 33 ° C. or 37 ° C. for 3 Time.
  • the well-cultured E. coli was centrifuged and the supernatant was removed and stored.
  • 0.3 ml of PBS was added to 5 ml of the LB medium to produce E. coli, and lysate was prepared by sonication.
  • 60 ⁇ l of B-PER (Thermo Fisher Scientific) was treated with appropriate concentrations of DNAase (DNase) and lysozyme in 1 ml of E. coli harvest to obtain lysates.
  • the lysate was then analyzed by SDS-PAGE.
  • SEQ ID NO: 3 coding for the amino acid sequence (eet1) of SEQ ID NO: 1 at the N-terminus of the EGFP gene sequence and the EGFP gene sequence at that position, using the Nde1 and Hind3 restriction enzymes in the pGE LysRS plasmid, Two additional fusion sequences (eet1-EGFP) were inserted.
  • the vector is expressed by the T7 promoter and is regulated by the lac operator and regulated by IPTG.
  • Two recombinant plasmids were transformed into BL21 * (DE3) -pLysE competent cells, respectively, and the protein was expressed at 37 ° C for 3 hours. At this time, IPTG was treated at four concentrations of 0, 20, 40 and 80 ⁇ M.
  • Fluorescence values were measured at 485 nm / 520 nm using Fluostar Optima in the form of a lysate of EGFP expressed in each condition in order to confirm the activity of the expressed EGFP protein.
  • EGFP fusion protein was expressed in the same manner as in Example 1 to confirm the effect of fusing a partial sequence (eet2, SEQ ID NO: 2) of the peptide (eet1) identified in Example 1 to the target protein.
  • a gene SEQ ID NO: 6 encoding the amino acid sequence (MSEQHAQ) derived from Lysyl tRNA synthetase shown in SEQ ID NO: 5 was used.
  • MSEQHAQ amino acid sequence
  • the expression level of the EGFP protein (eet1-EGFP, eet2-EGFP) to which the novel peptide of the present invention was added was higher than that of the control protein (MSEQHAQ-EGFP) It was confirmed to be small.
  • the IPTG concentration of 40 ⁇ M or more was fused with eet1 or eet2, the amount of active protein was found to be larger.
  • TruB protein which is known to be poorly expressed in E. coli
  • a total of four recombinant plasmids were transformed into BL21 * (DE3) -pLysS competent cells and expressed at 37 ° C. At this time, IPTG was treated at a concentration of 1 mM and cultured for 3 hours.
  • hRID protein SEQ ID NO: 7
  • SEQ ID NO: 8 a fusion sequence in which a gene encoding the hRID protein (SEQ ID NO: 8) and a gene encoding eet1 were linked to the N-terminus of hRID was inserted into the pGE LysRS plasmid.
  • Two recombinant plasmids were transformed into BL21 * (DE3) -pLysS competent cells and expressed at 37 ° C. At this time, IPTG was treated at 0, 20, 100 and 1000 ⁇ M concentration and cultured for 3 hours.
  • the expression of the fusion sequence (eet1-hRID) to which eet1 was added was confirmed to be well expressed (Fig. 4A) although the control group (hRID) hardly expressed.
  • the expression level of the control group was too low to be standardized, and the expression level was compared based on the experimental group in which 1000 ⁇ M of IPTG was used (FIG. 4B).
  • HRID was used as a fusion partner to increase the solubility and solubility of CsTA1953, CsTA37, and CsTA422 proteins, which are not expressed well in E. coli and which are not well expressed in water.
  • LysRS was cut out using Nde1 and Kpn1 in the pGE LysRS plasmid and the gene sequence (SEQ ID NO: 8) coding for hRID or the gene sequence (SEQ ID NO: 10) coding for the eet1-hRID fusion protein was inserted at the position.
  • CsTA1953 gene, CsTA37 and CsTA422 genes were inserted into pGE-hRID plasmid and pGE-eet1-hRID plasmid using BamH1 and Hind3, respectively.
  • VP1 gene derived from Norovirus Hu / GII.4 / Hiroshima / 55/2005 / JPN (NCBI access number: AB504310.1) was used for the production of Norovirus VLP through E. coli.
  • the pGE-LysRS vector was used as an expression vector and the above vector was an expression vector prepared by modifying pGEMEX-1 (Promega) vector. Specifically, NdeI and BamHI restriction enzymes were digested and digested.
  • coli host HMS174 (DE3).
  • 1 ml of Escherichia coli cultured on the previous day in 15 ml of LB medium containing the same concentration of ampicillin was cultured in a 15 ⁇ g / ml LB medium containing 50 ⁇ g / ml of ampicillin at 37 ° C. for one day And incubated at 37 ° C until OD 600 nm reached 0.5-0.7.
  • Overexpression was induced with 1 mM IPTG when the OD reached the optimum value. After the addition of IPTG, expression was induced at various temperatures (37 ° C, 16 ° C).
  • Norovirus VP1 conjugated with RID containing the four amino acids used in the previous study was also expressed under the same conditions. Expressed proteins were collected and SDS-PAGE was used to confirm the water solubility.
  • the recombinant VP1 protein was well expressed at 16 ° C as well as at 37 ° C.
  • the expression level of the recombinant VP1 of the present invention was remarkably increased to about two times or more as compared with the VP1 of the comparative example (Fig. 7A).
  • the size of VP1 protein was 59 kDa and the size of VP1 containing RID (8 kDa) was about 70 kDa.
  • Fig. 7B it was confirmed that the VP1 protein was not expressed in the control group fused with MS-RID, and that the expression level of eet1 was similar to that of VP1 when fused with eet2.
  • Proteins identified as soluble were purified via nickel (Ni) affinity chromatography. Using the same method as above, 3 ml and 50 ml were used to finally express 500 ml of Escherichia coli, followed by harvesting and purification. Specifically, the first equilibrium and equilibrium Ni-NTA column (GE 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM sodium chloride, 5% glycerol, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK).
  • Ni nickel affinity chromatography
  • a linear gradient imidazole in the range of 10 to 300 mM was eluted using B buffer [50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM sodium chloride, 5% glycerol, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, and 300 mM imidazole]
  • B buffer [50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM sodium chloride, 5% glycerol, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, and 300 mM imidazole]
  • C buffer storage buffer
  • concentration of the purified protein was quantified using BSA (Amresco, Solon, OH, USA).
  • the purified VP1 protein was mixed at a ratio of 1: 1 with 20% glycerol and stored at -20 ° C.
  • FIG. 8 The results of confirming the MSAVKAA-RID-VP1 fusion protein purified by nickel affinity chromatography and confirming the purification through SDS-PAGE are shown in FIG. 8 and FIG.
  • a conjugate protein containing MSAVKAA-RID through TEV protease was also successfully removed. Thereafter, TEV, cleaved tag, and uncleaved-fusion protein were separated through 2 nd Ni-affinity chromatography and fully purified VP1 was obtained (FIG. 10).
  • the fused protein was cleaved at 16 °C for one day with AcTEV protein cleaving enzyme.
  • the column was subjected to equilibrium with a buffer [Ammonium acetate 250 mM (pH 6.0)], and after the completion of equilibrium, the VP1 sample in which the fusion partner protein was cleaved was loaded and purified. After purification, calibration was carried out on chromatograms using ferritin (440 kDa), aldolase (158 kDa), conalbumin (75 kDa), ovalbumin (44 kDa), bluesdextran 2000 (GE Healthcare) The peak molecular weight of the protein was determined.
  • Norovirus VLP has a molecular weight of 10 MDa and that the maximum purification limit of our column is 800 kDa, so it is assumed that VLP will be purified in Void when properly formed.
  • a high peak appeared as VLP in the void FOG. 12A
  • the purified fractions were confirmed by SDS-PAGE and the peak in the void of the chromatogram corresponds to VLP (Fig. 7B).
  • hRBD truncated by TEV protein cleavage enzyme was also purified through chromatography.
  • VLP virus-like particles
  • Voids were observed with an electron microscope to confirm that the purified VP1 protein formed VLPs.
  • Purified Norovirus VLP was first placed on a copper grid for 1 min and stained with 2% uranyl acetate for 15 sec. The pre-treated samples were dried at room temperature for 30 minutes and then photographed using a transmission electron microscope (TEM, JEM-1011, JEOL, Japan). The above experiment was carried out by the Research Support Department of the Life Research Institute of Yonsei University College of Medicine.
  • Fig. 14 it was confirmed that the purified VP1 protein forms VLPs.
  • the diameter of the identified VLP was 34 nm and was similar to the diameter of Norovirus VLP and wild-type Norovirus produced using the baculovirus-insect cell expression system.
  • VP1 fused with hRBD without protein cleavage by TEV protein cleavage enzyme does not form VLP and coagulates (Fig. 14).

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Abstract

본 발명은 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 신규한 펩타이드 혹은 그의 일부 시퀀스, 그리고 이를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명에 따른 신규한 펩타이드는 목적 단백질의 발현 효율을 향상시킬 수 있으며, 또한 수용성 증진을 위해 상기 펩타이드는 수용성 증진 융합 단백질에도 적용될 수 있어서, 목적 단백질의 발현 효율뿐만 아니라 수용성을 향상시킴으로써, 재조합 목적 단백질의 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 신규한 펩타이드 및 이를 포함하는 융합 단백질
본 발명은 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 신규한 펩타이드 및 이를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. 보다 상세하게 본 발명은 요산산화효소(urate oxidase)로부터 유래한 7개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 또는 그 일부를 포함하는 펩타이드, 및 상기 펩타이드와 이의 융합파트너로서 RID(RNA interacting domain)를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다.
현대의 생명공학에 있어서 핵심은 재조합 단백질의 생산이며 그 중에서도 중요한 것은 재조합 단백질의 양을 많이 생산하는 것이다. 많이 생산된 재조합 단백질은 활성 외래 단백질의 생산 및 회수, 기능 연구를 위한 결정화, 산업화 등에 매우 중요하다. 현재까지 대장균을 이용한 많은 재조합 단백질 생산 연구가 진행되어 왔는데, 이는 대장균이 조작이 쉽고, 짧은 성장시간, 안전한 발현, 저비용과 규모를 쉽게 바꿀 수 있는 장점이 있기 때문이다. 그러나, 대장균(E. coli)에서 생산된 외래 기원의 재조합 단백질은 발현 레벨이 낮거나, 적절한 "전사 후 샤페론(post-translational chaperons)"이나 "전사 후 과정(posttranslational processing)"이 없기 때문에, 생산된 재조합 단백질의 불가용성 단백질 응집체(inclusion body)로 형성되는 단점이 지적되고 있다(Francois Baneyx, Recombinant protein expression in Escherichia coli, Current Opinion in Biotechnology (1999), 10:411-421).
불용성으로 단백질이 생산되는 문제는, 수용성이 높은 단백질을 융합시켜 발현시키는 방법이 개발되어 있다(Dominic Esposito and Deb K Chatterjee, Enhancement of soluble protein expression through the use of fusion tags, Current Opinion in Biotechnology (2006), 17:353-358). 또한 LysRS(lysyl tRNA synthetase)와 같은 RNA 결합 도메인을 이용하여 재조합 단백질의 수용성을 증가시키는 방법이 시도되고 있다(Choi SI et al. Protein solubility and folding enhancement by interaction with RNA, PLoS ONE (2008), 3:e2677). 그러나 LysRS는 약 100 kDa(monomer size = 약 58 kDa)이 넘는 거대 단백질일 뿐만 아니라 이량체(dimer)를 이루어야 하는 구조적인 한계성으로 인한 입체적 간섭현상(steric hindrance) 때문에, 재조합 단백질이 원하는 활성 형태를 갖도록 3차원 구조 형성, 이량체 이상의 다량체, 또는 단량체로의 형성을 방해할 수 있다. 이에, LysRS를 대체하기 위한 RNA 결합 도메인으로 RID(RNA interacting domain, N-terminal appended RNA binding domain of Lysyl tRNA synthetase)가 사용되고 있다. 하지만 RID 자체는 발현 레벨이 매우 낮다는 크나 큰 단점이 있다.
한편, 노로 바이러스(Norovirus)는 전 세계적으로 급성 위장염을 유발하는 주요 병원체 중 하나이며, 매년 20만명의 5세 미만 개발도상국 어린이들이 노로바이러스로 인해 사망한다. 노로바이러스는 주로 대변-구강 경로 (Fecal-oral route) 를 통하여 감염되며 메스꺼움, 구토, 설사, 탈수 등을 유발한다. 칼리시바이러스과(Caliciviridae)에 속하는 노로 바이러스는 막이 없는 바이러스이며 직경은 약 30~40 nm 정도이다. 7.6 kbp 길이의 단일가닥 (+)RNA로 이루어져 있으며 3개의 ORF(open reading frame)를 가지고 있다. 이 중 ORF2에는 노로 바이러스의 형태를 이루는 주요 구조단백질 VP1이 코딩되어 있고, ORF3에는 VP2 단백질이 코딩되어 있으나 구조형성에 직접적으로 관여하지는 않는다. VP1은 전체 59 kDa 크기이며 이합체(dimer)를 이룬다. 이렇게 90개의 이합체가 자가 조립되어(self-assembly) 총 180개의 VP1이 하나의 바이러스 입자(particle)를 형성한다. VP1 단백질은 2개의 도메인(domain)으로 이루어지는데 S 도메인(S domain)이 구조를 이루는데 작용하고 P 도메인(P domain)은 실제적인 면역반응 유발에 관여한다.
현재까지 노로 바이러스에 대한 세포 배양 방법은 알려진 바 없으며 적절한 동물모델 또한 개발되지 않은 상황이다. 따라서 효과적인 노로 바이러스 백신을 개발하기 위해서는 세포배양에 제한받지 않는 VLP(Virus-Like Particles) 형태의 백신개발이 필수적이다. VLP는 바이러스 구조 단백질을 야생형 바이러스와 겉모습이 유사한 구조를 나타내도록 특이적으로 발현시킨 것으로서 매우 복잡하고 정교한 구조물이다. 야생형 바이러스와 그 구조가 유사하기 때문에 체내에서 높은 면역반응을 유도할 수 있으며 T-세포, B-세포 면역경로를 둘 다 자극할 수 있다는 장점이 있다. 또한, 형성된 구조물 안에 유전물질이 없으므로 감염능력이 없어 높은 안전성을 가진다는 점과 뛰어난 구조적 안정성을 보인다는 것이 특징이다. 하지만 그 구조가 복잡하여 완전한 VLP를 만드는 것이 매우 어렵다는 단점이 있다.
노로 바이러스 VLP는 주로 배큘로 바이러스-곤충세포에서 생산할 수 있으며, 효모에서도 VLP를 생산할 수 있다고 알려져 있다. 하지만 대장균 에서는 구조단백질 (VP1)을 수용성으로 발현했다는 보고는 있지만 VLP (Virus-Like Particle) 를 형성했다는 보고는 지금까지 된 바가 없다. 대장균에서 유래하는 노로바이러스 VLP가 개발될 수 있다면 노로바이러스에 대한 대부분의 사상자가 개발도상국에서 발생하는 만큼 다른 발현시스템을 이용한 백신에 비해 저가형 백신으로써 인류사회에 큰 공헌을 할 수 있다.
본 발명자들은 이전 연구에서 RBD (RNA Binding Domain)를 포함하는 LysRS (Lysyl tRNA synthetase)가 결합파트너로써 다양한 단백질의 단백질 접힘 및 수용성 증가에 관여한다는 것을 밝힌 바 있다. 그러나 LysRS는 약 100kDa이 넘는 거대 단백질일 뿐만 아니라 이량체(dimer)를 이루어야 하는 구조적인 한계성으로 인한 입체적 간섭현상(steric hindrance) 때문에, 재조합 단백질이 원하는 활성 형태를 갖도록 3차원 구조 형성, 이량체 이상의 다량체, 또는 단량체로의 형성을 방해할 수 있다. 이에, LysRS를 대체하기 위한 RNA 결합 도메인으로 RID(RNA interacting domain, N-terminal appended RNA binding domain of Lysyl tRNA synthetase)가 사용되고 있다. 하지만 RID 자체는 발현 레벨이 매우 낮다는 단점이 있다.
단백질 발현 레벨은 여러가지 요인에 의해 결정될 수 있지만, 단백질의 N-말단 서열, 정확하게는 mRNA 서열이 단백질 발현 레벨에 중요한 것으로 알려져 있다.
이에, 본 발명자들은 단백질의 수용성 및 발현 효율에 대하여 연구하던 중 요산산화효소(urate oxidase) 단백질이 대장균에서 비정상적으로 발현이 잘 되는 것을 확인하였고, 요산산화효소의 N-말단 서열이 목적 단백질의 발현 수준에 미치는 영향과 RID의 발현에 미치는 영향을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 요산산화효소로부터 유래한 7개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 또는 그 일부 서열이 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키는데 결정적인 역할을 하며, 요산산화효소로부터 유래한 7개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드가 수용성 증진 파트너로 알려진 RID(RNA interacting domain)에도 적용됨을 확인하여, 목적 단백질의 발현 효율을 증진시킬 뿐만 아니라 수용성을 높일 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 요산산화효소로부터 유래한 7개의 아미노산 또는 그 일부 서열을 포함하는 펩타이드, 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 펩타이드를 포함하는 발현벡터, 및 상기 발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한, 요산산화효소로부터 유래한 7개의 아미노산 또는 그 일부 서열을 포함하는 펩타이드와 이의 융합파트너로서 RID를 포함하는 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 포함하는 발현벡터, 및 상기 발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드의 5'-말단에 결합된 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키는 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계, 상기 발현 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계 및 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 목적 단백질의 발현을 유도하고, 이를 수득하는 단계를 포함하는 수용성 목적 단백질의 생산 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 원핵세포에서 발현이 잘 되지 않는 노로바이러스 VP1 단백질을 목적 단백질로 하여, 상기 VP1 단백질의 발현 효율을 증진시킬 뿐 아니라 수용성을 높일 수 있는 노로 바이러스 백신 생산용 재조합 발현 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포 및 상기 벡터와 숙주세포를 이용하여 노로바이러스 백신 생산방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
제1구현예에 따르면,
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 일부 서열을 포함하는 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드를 제공하고자 한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "요산산화효소(urate oxidase)"(EC 1.7.3.3 (uricase)는 퓨린 분해 기작에 작용하는 효소이다. 우리카아제(uricase)는 요산을 알란토인으로 산화시키는 효소이다. 사람을 포함한 고등 영장류는 우리카아제가 존재하지 않으며, 요산은 퓨린 분해 대사의 최종 물질이다. 이 대사물인 유리산(free acid)과 요산염(urate salt) 모두 물에서 비수용성이므로, 개개인의 차이에 따라 침전되어 통풍을 유발한다. 통풍을 효율적으로 치료하기 위해, 사람에 존재하지 않은 우리카아제 를 직접 사람에게 주사하는 치료법이 실용화되어 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "목적 단백질(target protein)"은 당업자가 대량으로 생산하고자 하는 단백질로서, 재조합 발현벡터에 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하여 숙주세포에서 발현이 가능한 모든 단백질을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드" 또는 "expression enhancer tag(eet)"는 목적 단백질의 N-말단에 융합되어 함께 발현됨으로써 단백질의 발현 효율을 증진시키는 짧은 펩타이드 서열을 의미한다. 구체적으로 본 발명에서 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 7개 아미노산 서열 또는 그 일부 서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "재조합 단백질(recombinant protein)" 또는 "융합 단백질(fusion protein)"은 원래의 목적 단백질 서열의 N-말단 또는 C-말단에 다른 단백질이 연결되거나 다른 아미노산 서열이 부가된 단백질을 의미한다.
본 발명에 따른 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 그 일부 서열은 요산산화효소(urate oxidase)로부터 유래한 것일 수 있다.
또한 본 발명에 따른 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드에 있어서, 상기 서열번호 1의 일부 서열은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드에 있어서, 상기 펩타이드는 목적 단백질의 N-말단에 결합할 수 있다.
본 발명에 따른 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드에 있어서, 상기 목적 단백질은 항원, 항체, 세포수용체, 효소, 구조 단백질, 혈청 및 세포 단백질로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택될 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 상기 항원은 노로바이러스 유래 VP1 단백질일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서 상기 서열번호 1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3으로 표시되는 서열일 수 있다
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서 상기 서열번호 2을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4로 표시되는 서열일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드를 포함하는 발현벡터를 제공하고자 한다.
본 발명은 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5`-말단에 결합된 상기 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "발현벡터"는 발현벡터의 전사에 제공되는 추가단편에 작동가능하게 연결된 관심의 폴리펩티드를 암호화하는 단편으로 구성되는 선형 또는 원형의 DNA 분자이다. 그와 같은 추가단편은 프로모터 및 종료암호 서열을 포함한다. 발현벡터는 하나 이상의 복제 개시점, 하나 이상의 선택 마커, 폴리아데닐화 신호 등을 또한 포함한다. 발현벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유도되거나, 또는 둘 다의 요소를 함유한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "작동 가능하게 연결된"은 프로모터에서 전사가 개시하고 암호화 서열을 통해 종료암호로 진행하는데 작용하도록 단편이 배열되는 것을 나타낸다.
본 발명에 따른 발현벡터에 있어서, 상기 발현벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 파지 입자 또는 게놈 삽입물일 수 있다. 상기 발현벡터는 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주세포의 게놈과 무관하게 복제되거나 숙주세포의 게놈 내로 통합될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드를 포함하는 발현벡터가 형질전환된 숙주세포를 제공하고자 한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "형질전환" 또는 "도입"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 발현벡터를 형질전환시키는 방법은 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4)법, 염화칼슘(CaCl2)법, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법 또는 초산 리튬-DMSO법을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 숙주세포에 있어서, 상기 숙주세포는 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주세포가 바람직하며, 원핵 및 진핵을 포함한 모든 미생물이 사용될 수 있다. 바람직하기는, 상기 숙주세포는 대장균(E. coli)일 수 있다.
본 발명은 또한 발현 효율이 증진된 목적 단백질의 생산 방법을 제공하고자 한다. 상기 목적 단백질의 생산 방법은:
(A) N-말단에 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 그 일부를 포함하는 펩타이드가 결합된 재조합 목적 단백질을 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;
(B) 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입하는 단계; 및
(C) 상기 숙주세포로부터 재조합 목적 단백질을 생산하는 단계를 포함할 수 있다.
제2구현예에 따르면,
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 일부 서열을 포함하는 펩타이드 및 이의 융합파트너로서 RID (RNA interacting domain)를 포함하는 목적 단백질의 발현 효율 및 수용성을 증진시키기 위한 융합 단백질을 제공하고자 한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "RID", "RNA interacting domain", "N terminal appended RNA binding domain of Lysyl tRNA synthetase)", 또는 "LysRS RNA 결합 도메인(LysRS RNA interacting domain)"는 LysRS의 RNA와 기타 단백질 간의 상호작용에 관여하는 고유한 N-말단(N-terminal) 연장부위를 의미한다.
본 발명에 따른 목적 단백질의 발현 효율 및 수용성을 증진시키기 위한 융합 단백질에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 요산산화효소로부터 유래할 수 있다.
본 발명에 따른 목적 단백질의 발현 효율 및 수용성을 증진시키기 위한 융합 단백질에 있어서, 상기 펩타이드는 목적 단백질의 N-말단에 결합할 수 있다.
본 발명에 따른 목적 단백질의 발현 효율 및 수용성을 증진시키기 위한 융합 단백질에 있어서, 상기 RID는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질은 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 목적 단백질의 발현 효율 및 수용성을 증진시키기 위한 융합 단백질에 있어서, 상기 목적 단백질은 항원, 항체, 세포수용체, 효소, 구조 단백질, 혈청 및 세포 단백질로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택될 수 있다.
본 발명은 또한 목적 단백질의 N-말단에 결합하고 서열번호 1의 아미노산 또는 이의 일부 서열을 포함하는 펩타이드 및 이의 융합파트너로서 RID를 포함하는 융합 단백질을 갖는 목적 단백질의 발현 효율 및 수용성을 증진시키기 위한 발현벡터를 제공하고자 한다.
본 발명의 발현벡터는 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5`-말단에 결합된 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 융합 단백질은 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드 및 RID의 융합 단백질일 수 있다.
본 발명에 따른 발현벡터에 있어서, 상기 발현벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 파지 입자 또는 게놈 삽입물일 수 있다. 상기 발현벡터는 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주세포의 게놈과 무관하게 복제되거나 숙주세포의 게놈 내로 통합될 수 있다.
본 발명은 또한 목적 단백질의 N-말단에 결합하고 서열번호 1의 아미노산 또는 이의 일부 서열을 포함하는 펩타이드 및 이의 융합파트너로서 RID를 포함하는 융합 단백질을 갖는 목적 단백질의 발현 효율 및 수용성을 증진시키기 위한 발현벡터가 형질전환된 숙주세포를 제공하고자 한다.
본 발명에 따른 숙주세포에 있어서, 상기 숙주세포는 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주세포가 바람직하며, 원핵 및 진핵을 포함한 모든 미생물이 사용될 수 있다. 바람직하기는, 상기 숙주세포는 대장균(E. coli)일 수 있다.
본 발명은 또한 발현 효율 및 수용성이 증진된 목적 단백질의 생산 방법을 제공하고자 한다. 상기 목적 단백질의 생산 방법은:
(A) 목적 단백질의 N-말단에 서열번호 1의 아미노산 또는 이의 일부 서열을 포함하는 펩타이드 및 이의 융합파트너로서 수용성을 높여 주는 RID를 포함하는 융합 단백질이 결합된 재조합 목적 단백질을 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;
(B) 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입하는 단계; 및
(C) 상기 숙주세포로부터 재조합 목적 단백질을 생산하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 목적 단백질로 노로 바이러스 유래 VP1 단백질; 및 요산산화효소로부터 유래한 7개의 아미노산 또는 그 일부 서열을 포함하는 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드;를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 노로 바이러스 백신 생산용 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 노로 바이러스 백신 생산용 재조합 발현 벡터에 있어서, 상기 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 그 일부 서열은 요산산화효소(urate oxidase)로부터 유래한 것일 수 있다.
또한 본 발명에 따른 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드에 있어서, 상기 서열번호 1의 일부 서열은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 노로 바이러스 백신 생산용 재조합 발현 벡터는 상기 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 서열번호 1의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서 상기 서열번호 1의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3으로 표시되는 서열일 수 있다
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서 상기 서열번호 2의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4로 표시되는 서열일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서 상기 노로 바이러스 생산용 재조합 발현 벡터는 1~6개의 히스티딘을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 단백질 절단효소 인식 부위를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드;를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 노로 바이러스 백신 생산용 재조합 발현 벡터에 있어서, 상기 1 내지 6개의 히스티딘을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 10으로 표시될 수 있다.
본 발명의 노로 바이러스 백신 생산용 재조합 발현 벡터에 있어서, 상기 단백질 절단효소는 TEV일 수 있다.
본 발명의 노로 바이러스 백신 생산용 벡터에 있어서, 상기 단백질 절단효소 인식 부위를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 11로 표시되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 발현벡터에 있어서, 상기 발현벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 파지 입자 또는 게놈 삽입물일 수 있다. 상기 발현벡터는 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주세포의 게놈과 무관하게 복제되거나 숙주세포의 게놈 내로 통합될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 노로 바이러스 유래 VP1 단백질; 및 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드를 포함하는 발현벡터가 형질전환된 숙주세포를 제공하고자 한다.
본 발명에 따른 숙주세포에 있어서, 상기 숙주세포는 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주세포가 바람직하며, 원핵 및 진핵을 포함한 모든 미생물이 사용될 수 있다. 바람직하기는, 상기 숙주세포는 대장균(E. coli)일 수 있다.
본 발명은 또한 발현 효율이 증진된 노로 바이러스 백신 생산 방법을 제공하고자 한다. 상기 노로 바이러스 백신 생산 방법은:
(a) 목적 단백질로 노로 바이러스 유래 VP1 단백질; 및 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 일부 서열을 포함하는 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드;를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 노로 바이러스 백신 생산용 재조합 발현 벡터를 생산하는 단계;
(b) 상기 발현 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 생산하는 단계; 및
(c) 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 융합 단백질의 발현을 유도하고, 이를 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 노로 바이러스 유래 VP1 단백질; 및 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 일부 서열을 포함하는 펩타이드와 상기 펩타이드의 융합파트너로서 RID(RNA interacting domain)을 포함하는 목적 단백질의 발현 효율 및 수용성을 증진시키기 위한 융합 단백질;을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 노로 바이러스 백신 생산용 재조합 발현 벡터를 제공하고자 한다.
즉, 본 발명의 발현벡터는 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5`-말단에 결합된 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 융합 단백질은 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드 및 RID의 융합 단백질일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "융합 단백질(fusion protein)" 또는 "재조합 단백질(recombinant protein)" 은 원래의 목적 단백질 서열의 N-말단 또는 C-말단에 다른 단백질이 연결되거나 다른 아미노산 서열이 부가된 단백질을 의미한다.
본 발명은 또한 발현 효율 및 수용성이 증진된 노로 바이러스 백신의 생산 방법을 제공하고자 한다. 상기 노로 바이러스 백신의 생산 방법은:
(A) 노로 바이러스 유래 VP1 단백질의 N-말단에 서열번호 1의 아미노산 또는 이의 일부 서열을 포함하는 펩타이드 및 이의 융합파트너로서 수용성을 높여 주는 RID를 포함하는 융합 단백질이 결합된 재조합 목적 단백질을 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;
(B) 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입하는 단계; 및
(C) 상기 숙주세포로부터 재조합 노로 바이러스 VP1 단백질을 생산하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 요산산화효소로부터 유래한 7개의 아미노산을 포함하는 펩타이드는 목적 단백질의 발현 효율을 향상시킬 수 있으며, 또한 수용성 증진 단백질로 잘 알려진 RID에 상기 펩타이드를 결합한 융합 단백질은 목적 단백질의 발현 효율뿐만 아니라 수용성을 향상시킴으로써, 재조합 목적 단백질의 생산에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키는 펩타이드는 목적 단백질의 발현 효율을 향상시킬 수 있으며, 또한 상기 펩타이드와 이의 수용성 증진 융합파트너로 알려진 RID와 함께 적용될 수 있어, 목적 단백질의 발현량과 수용성을 동시에 향상시킴으로써, 재조합 목적 단백질의 생산에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 펩타이드(eet1)가 EGFP 단백질의 발현 효율에 미치는 영향을 나타내는 실험 결과이다(A: 각각의 융합 단백질 발현을 나타내는 SDS-PAGE 결과, B: IPTG 80 μM 이 처리된 대조군(EGFP)의 발현량을 1로 하였을 때 각각의 상대적 발현량을 나타낸 그래프, C: IPTG 80 μM 이 처리된 대조군의 단백질 활성을 1로 하였을 때 각각의 상대적 활성을 나타낸 그래프).
도 2는 본 발명의 펩타이드 혹은 그 일부가 EGFP 단백질의 발현 효율 및 활성에 미치는 영향을 비교한 결과이다(A: 각각의 융합 단백질 발현을 나타내는 SDS-PAGE 결과, B: IPTG 80 μM 이 처리된 대조군(MSEQHAQ-EGFP)의 발현량을 1로 하였을 때 각각의 상대적 발현량, C: IPTG 80 μM 이 처리된 대조군의 단백질 활성을 1로 하였을 때 각각의 상대적 활성, D: 단위 단백질당 단백질 활성을 나타낸 그래프).
도 3은 본 발명의 펩타이드가 대장균 유래 단백질인 TruB의 발현에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다(A: 각각의 융합 단백질 발현을 나타내는 SDS-PAGE 결과, B: 대조군의 발현량을 1로 하였을 때 각각의 상대적 발현량을 나타낸 것).
도 4는 본 발명의 펩타이드가 수용성 증진 융합파트너인 hRID에 미치는 영향을 나타내는 SDS-PAGE 결과(A) 및 상대적 발현량 변화를 나타낸 그래프(B)이다.
도 5는 본 발명의 펩타이드가 추가된 hRID 융합이 목적 단백질의 발현 효율에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 수용성 노로 바이러스 생산용 재조합 발현 벡터의 구조를 나타낸 모식도이다.
도 7a는 본 발명의 일실시예에 따라 발현된 VP1 단백질의 수용성 여부를 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 왼쪽 패널은 MSAVKAA-RID가 재조합 되어 있는 VP1(70 kDa)의 발현 결과, 오른쪽 패널은 비교예(MSEQ-RID가 재조합 되어 있는 VP1; 69 kDa)의 결과이다.
도 7b는 본 발명의 일실시예에 따라 발현된 VP1 단백질의 수용성 발현을 SDS-PAGE로 확인한 결과로 왼쪽 패널은 MSAVKAA-RID가 재조합 되어 있는 VP1(70 kDa)의 발현 결과, 가운데 패널은 MSAV-RID가 재조합 되어 있는 VP1(70 kDa)의 발현 결과, 오른쪽 패널은 대조군(MS-RID)의 결과이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따라 발현된 VP1 단백질을 니켈 친화성 크로마토그래피를 통해 정제하고 확인한 크로마토그램 결과이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따라 발현된 VP1 단백질을 정제한 후 SDS-PAGE로 확인하였고, 18~20 레인의 분획을 풀링(pooling)한 결과이다.
도 10은 TEV 단백질 절단효소를 이용하여 노로 바이러스 VP1을 절단한 후 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과이다.
도 11은 발현 및 정제를 통해 얻은 단백질이 VP1 서열로 이루어져 있는지 확인하기 위하여 펩타이드 맵핑과 N-말단 및 C-말단 아미노산 서열 분석 결과로서,도 11a는 트립신 처리 후 분석된 UPLC 피크이고, 도 11b는 트립신 처리 시 나타나는 펩타이드 절편을 LC-MS/MS 로 분석한 결과 당초 예상한 시퀀스와 83.9%의 아미노산 서열이 일치함을 확인한 결과이고, 도 11c는 N-말단 서열이 노로 바이러스 VP1과 일치함을 확인한 결과이고, 도 11d는 C-말단 서열이 노로 바이러스 VP1과 일치함을 확인한 결과이다.
도 12a는 TEV 단백질 절단효소로 절단한 후 형성된 VLP를 정제하기 위하여 크기 배제 크로마토그래피를 수행한 결과를 나타낸 크로마토그램이다.
도 12b는 TEV 단백질 절단효소로 절단한 후 형성된 VLP 단백질을 정제한 ㅎ후 S-PAGE를 통해 확인한 결과이다.
도 13은 정제된 VLP의 전체적인 직경을 확인하기 위하여 DLS(Dynamic Light Scattering)를 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 정제된 VP1 단백질이 VLP를 형성했는지 TEM 전자현미경을 이용하여 확인한 결과이다[A: 전자현미경을 통하여 확인한 대장균 유래 VLP(Virus-like particle), B: 히스티딘, TEV 인식서열을 포함하는 RID tag을 제거하지 않은 재조합 VP1 단백질 (VLP 구조형성에 실패하였음.), C: 배큘로바이러스-곤충세포 시스템을 이용하여 생산한 노로바이러스 VLP. D: 야생형 노로바이러스 비리온].
이하, 발명의 이해를 돕기 위해 다양한 실시예를 제시한다. 하기 실시예는 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 발명의 보호범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실험 방법>
1. 단백질 발현 벡터의 제작
단백질 발현 벡터로 pGE-LysRS 발현 벡터를 사용하였다(Choi SI et al., Protein solubility and folding enhancement by interaction with RNA, PLoS ONE (2008), 3:e2677). pGE-LysRS는 T7 promoter에 의해 발현이 조절되고, LysRS 유전자를 Nde1과 MCS(Kpn1-BamH1-EcoRV-Sal1-Hind3)에 있는 절단 위치 중 하나를 사용하여 잘라내고, 그 위치에 EGFP 또는 hRID, 또는 다른 단백질들을 삽입하였다. 이 때, 삽입된 단백질의 N-말단 위치에 서열번호 1의 아미노산 서열(eet1) 혹은 그 일부(eet2, 서열번호 2)를 삽입하였다. 그 다음, 제조된 hRID, 또는 서열번호 1의 아미노산 함유 hRID 벡터의 MCS에 있는 두 개의 절단효소 부위(enzyme site)를 사용하여, 발현하고자 하는 목적 단백질들을 삽입하였다.
2. 단백질 발현 및 SDS-PAGE
제조된 단백질 발현 벡터를 BL21(DE3), BL21(DE3)-pLysS, 또는 BL21(DE3)-pLysE competent cell에 형질전환 시켜 배양하였다. 모든 형질전환된 대장균은 50 μg/ml의 암피실린(Ampicillin)이 포함된 LB 배지에서 배양하였으며, BL21*(DE3)-pLysS 또는 BL21*(DE3)-pLysE에 형질전환된 대장균은 34 μg/ml의 클로람페니콜이 추가되어 있는 배지에서 배양하였다. 배양 온도는 단백질마다 다르며, 33 ~ 37℃의 조건에서 배양하였다. 대장균의 OD600 값이 0.5 이상이 되면, T7 promoter를 활성화 시키기 위해서 IPTG를 0 μM ~ 1 mM 수준으로 넣어주고, 단백질이 충분히 생산될 수 있도록, IPTG를 넣어준 이후부터 33℃ 또는 37℃에서 3시간 정도를 배양하였다. 충분히 배양된 대장균은 원심분리하여 상등액을 제거한 후에 보관하였다. 그 다음, LB 배지의 5 ml에 해당되는 대장균 수확물에 PBS 0.3 ml을 넣고 초음파 분쇄를 하여, 용해물(lysate)을 만들었다. 또는, 1 ml에 해당되는 대장균 수확물에 B-PER(Thermo Fisher Scientific) 60 μl를 적절한 농도의 DNA 가수분해효소(DNase) 및 라이소자임(lysozyme)과 함께 처리하여 용해물을 획득하였다. 그 후, 상기 용해물을 SDS-PAGE로 분석하였다.
3. EGFP 단백질의 형광 측정
분석하고자 하는 샘플에서 발현된 단백질의 활성을 확인하기 위해 Fluostar Optima(BMG Labtech)를 이용하여 Ex 485 nm / Em 520 nm에서 형광을 측정하였다.
<실시예>
[실시예 1]
본 발명의 펩타이드가 EGFP 단백질의 발현 효율 및 활성에 미치는 효과
1-1. SDS-PAGE 분석
pGE LysRS 플라스미드에서 Nde1과 Hind3 제한효소를 사용하여 LysRS를 떼어내고, 그 위치에 EGFP 유전자 서열과 EGFP 유전자 서열의 N-말단에 서열번호 1의 아미노산(eet1)을 코딩하는 유전자 서열(서열번호 3)이 추가된 융합 서열(fusion form, eet1-EGFP) 두 가지를 각각 집어 넣었다. 상기 벡터는 T7 promoter에 의해 발현되고, lac operator에 의해서 조절되는 형태로 IPTG에 의해서 프로모터 활성화가 조절된다. 두 개의 재조합 플라스미드를 각각 BL21*(DE3)-pLysE competent cell에 형질전환 시키고 37℃ 조건에서 3시간 동안 단백질을 발현하였다. 이때, IPTG는 0, 20, 40 및 80 μM 4가지 농도로 처리하였다.
그 결과, 도 1A 및 도 1B에 나타낸 바와 같이 EGFP 유전자의 융합 서열(eet1-EGFP)의 경우 대조군(EGFP)에 비해 발현이 잘 이루어졌다는 것을 확인할 수 있었다.
1-2. 단백질 활성 분석
발현된 EGFP 단백질이 활성도 잘 띄고 있는지 확인하기 위해 각 조건에서 발현된 EGFP 시료를 용해물 형태로 Fluostar Optima 를 이용하여 485 nm/520 nm에서 형광 값을 측정하였다.
그 결과, 도 1C에 나타낸 바와 같이 eet1이 추가된 융합 서열의 경우 EGFP 단백질의 발현뿐만 아니라 활성도 증가된 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 2]
본 발명의 펩타이드 중 일부 서열의 효과
상기 실시예 1에서 확인된 펩타이드(eet1)의 일부 서열(eet2, 서열번호 2)을 목적 단백질에 융합하였을 때의 효과를 확인하기 위해 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 EGFP 융합 단백질을 발현시켰다. 대조군으로는 서열번호 5로 표시되는 라이실 tRNA 합성효소(Lysyl tRNA synthetase) 유래 아미노산 서열(MSEQHAQ)을 코딩하는 유전자(서열번호 6)를 사용하였다. 다만, IPTG의 농도는 10, 20, 40및 80 μM로 처리하였다.
그 결과 도 2A 및 도 2B에 나타낸 바와 같이, 대조군의 펩타이드가 융합된 대조군 단백질(MSEQHAQ-EGFP) 대비, 본 발명의 신규 펩타이드가 추가된 EGFP 단백질(eet1-EGFP, eet2-EGFP)의 발현량이 더 적은 것으로 확인이 되었다. 그러나 도 2C에 나타난 바와 같이, 40 μM 이상의 IPTG 농도에서는 eet1 또는 eet2를 융합시킨 경우 활성 단백질의 양이 더 많은 것을 알 수 있었다. 이로부터 eet2 서열이 융합된 것은 eet1 보다 발현량이 더 낮았지만, 단백질 활성이 더 우수하여 80 μM 의 IPTG 농도에서 가장 많은 양의 활성 단백질이 만들어졌음을 알 수 있었다(도 2A 내지 2C).
아울러, 이를 단위 단백질당 활성 측면으로 계산하였을 때, eet1 서열을 융합하는 경우 대조군 대비 2배 이상, eet2 서열을 융합하는 경우 대조군 대비 3배 이상 양질의 단백질을 발현시킬 수 있다는 것을 확인하였다(도 2D). 이로부터 단백질의 발현량만 단순히 증가시키는 것보다 활성이 높은 단백질의 발현을 높이는 것이 단백질 발현 효율 향상에 실질적으로 더 좋다는 것을 알 수 있었다.
[실시예 3]
본 발명에 따른 펩타이드가 TruB 및 TruB-EGFP 단백질의 발현 효율에 미치는 효과
대장균에서 발현이 잘 안 되는 것으로 알려진 TruB 단백질의 발현에 본 발명에 따른 펩타이드가 미치는 효과를 알아보기 위하여, 상기 실시예 1과 동일한 방법을 이용하여 TruB및 TruB-EGFP 단백질을 코딩하는 유전자 서열과 각각의 서열에 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열이 추가된 융합 서열(fusion form)을 각각 pGE LysRS 플라스미드에 삽입하였다. 총 4개의 재조합된 플라스미드를 BL21*(DE3)-pLysS competent cell에 형질전환 시키고, 37℃ 조건에서 단백질을 발현하였다. 이 때, IPTG는 1 mM 농도로 처리하고 3시간 동안 배양하였다.
그 결과, 대조군(Tru 및 Tru-EGFP)은 잡밴드에 가려질 정도로 발현이 거의 안되었지만, TruB 및 TruB-EGFP 단백질에 각각 서열번호 1의 eet1를 융합시킨 경우 각각의 단백질이 발현되는 것을 확인하였고, 이때 발현량은 대조군의 3배 이상인 것을 알 수 있었다(도 3A 및 3B).
[실시예 4]
본 발명에 따른 펩타이드가 RID 단백질의 발현 효율에 미치는 효과
대장균에서 수용성 증진 융합파트너로 개발된 hRID 단백질(서열번호 7)의 발현에 본 발명에 따른 펩타이드가 미치는 효과를 알아보기 위하여, 상기 실시예 1과 동일한 방법을 이용하여 발현량을 확인하였다. 구체적으로, hRID 단백질을 코딩하는 유전자(서열번호 8) 및 hRID 의 N-말단에 eet1을 코딩하는 유전자가 연결된 융합 서열(서열번호 10)을 pGE LysRS plasmid에 각각 삽입하였다. 2개의 재조합된 플라스미드를 BL21*(DE3)-pLysS competent cell에 형질전환 시키고, 37℃ 조건에서 단백질을 발현하였다. 이 때, IPTG는 0, 20, 100 및 1000 μM 농도로 처리하고 3시간 동안 배양하였다.
그 결과 도 4에 나타낸 바와 같이, 대조군(hRID)은 발현이 거의 되지 않았으나, eet1이 추가된 융합 서열(eet1-hRID)은 발현이 잘 되는 것을 확인할 수 있었다(도 4A). 발현량의 정량 분석의 경우 대조군의 발현 레벨이 너무 낮아 기준으로 잡기 어려워, 1000 μM의 IPTG가 사용된 실험군을 기준으로 잡고 발현량을 비교하였다(도 4B).
[실시예 5]
본 발명에 따른 펩타이드 및 RID를 포함하는 융합 단백질이 CsTA1953, CsTA37 및 CsTA422 총 3가지의 단백질의 발현 효율에 미치는 효과
대장균에서 발현이 잘 안되고, 발현이 되더라도 수용성 발현이 잘 안 되는 것으로 알려진 CsTA1953, CsTA37 및 CsTA422 단백질의 발현량과 수용성 증가를 위한 융합파트너로서 hRID를 사용하였다. pGE LysRS 플라스미드에서 Nde1과 Kpn1을 이용하여 LysRS를 잘라내었고, 그 위치에 hRID를 코딩하는 유전자 서열(서열번호 8) 또는 eet1-hRID 융합 단백질을 코딩하는 유전자 서열(서열번호 10)을 각각 삽입하였다. 그 다음 pGE-hRID 플라스미드 및 pGE-eet1-hRID 플라스미드에 BamH1과 Hind3를 이용하여 CsTA1953 유전자, CsTA37 및 CsTA422 유전자를 각각 삽입하였다.
제작된 총 6개의 재조합 단백질을 상기 실시예4와 동일한 IPTG 농도 조건으로 발현시켰고, 그 중 CsTA37, 및 CsTA422가 포함된 4개의 재조합 단백질은 IPTG 1 mM이 처리된 조건에서만 실험을 진행하였다. 이 단백질들은 33℃ 조건에서 발현되었다.
그 결과 도 5에 나타낸 바와 같이, eet1-hRID 융합 단백질을 결합시킨 경우 CsTA1953, CsTA37 및 CsTA422 단백질의 발현 효율이 개선된다는 것을 확인할 수 있었다. 여기서도 모든 대조군(hRID-)은 잡밴드에 가려질 정도로 발현이 잘 이뤄지지 않았으며(도 5A 및 도 5B), CsTA1953 의 경우는 대조군의 발현량이 너무 낮아서, 1000 μM의 IPTG가 사용된 실험군을 기준으로 잡고 정량 분석을 하였다(도 5B). CsTA37과 CsTA422 같은 경우, 대조군 대비 최소 7배 이상 발현이 증가된 것을 알 수 있었다(도 5D).
[실시예 6]
본 발명에 따른 펩타이드 및 RID를 포함하는 융합 단백질이 노로바이러스 VP1 단백질의 발현 효율에 미치는 효과
6-1. 재조합 발현 벡터 제작 및 VP1 단백질 발현
대장균을 통한 노로 바이러스 VLP 생산에는 Norovirus Hu/GII.4/Hiroshima/55/2005/JPN (NCBI access number: AB504310.1) 유래 VP1 유전자가 이용되었으며, 해당 VP1 유전자는 유전자 합성을 통하여 확보하였다. pGE-LysRS 벡터가 발현벡터로 이용되었으며 위 벡터는 pGEMEX-1(Promega) 벡터를 수정하여 만든 발현 벡터이다. 구체적으로, NdeⅠ과 BamHⅠ 제한효소를 처리하여 절단하였으며 잘려진 발현벡터 내에 MSAVKAA(eet1, 서열번호 1)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 3) 또는 MSAV(eet2, 서열번호 2)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 4); 6개의 히스티딘 태그(Histag)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 11); G를 제거한 TEV 인식서열 (ENLYFQ)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 12); 및 VP1(서열번호 13)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 14)이 연속적으로 구성되어있는 DNA 절편을 삽입하였다(도 6). 이렇게 완성된 재조합 플라스미드를 대장균 숙주 HMS174(DE3)에 형질전환 하였다. 단백질을 발현하기 위한 최초배양은 50 μg/ml 암피실린이 들어간 15 μg/ml LB 배지에 37℃에서 하루 동안 배양한 후, 같은 농도의 암피실린이 들어간 15 ml의 LB 배지에 전날 배양한 대장균 1 ml을 첨가하여 37℃에서 O.D600nm가 0.5~0.7에 도달할 때까지 배양하였다. 적정 O.D 값에 도달하였을 때 1 mM IPTG로 과발현을 유도하였으며 IPTG 첨가 후에는 다양한 온도(37℃, 16℃)에서 발현시켰다. 비교예로 이전 연구에 적용된 4개의 아미노산을 포함하는 RID가 접합된 노로바이러스 VP1도 동일한 조건에서 발현시켰으며, 발현된 단백질을 채취하여 SDS-PAGE를 통하여 수용성 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 7a에 나타낸 바와 같이 재조합된 VP1 단백질은 37℃뿐만 아니라 16℃ 에서도 잘 발현됨을 확인하였다. 또한, 비교예 VP1과 발현량을 비교한 결과, 본 발명의 재조합 VP1이 비교예 VP1 보다 발현량이 약 2배 이상으로 현저하게 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 7a). 또한, 노로 VP1 단백질의 크기는 59kDa이고 RID (8kDa)가 포함된 VP1의 크기는 약 70kDa 이었으며 확인 결과 적절한 위치에서 발현되었음을 확인하였다.
6-2. 본 발명의 펩타이드 중 일부 서열의 효과 확인
상기 실시예 6-1에서 확인된 펩타이드(eet1, 서열번호 1)의 일부 서열(eet2, 서열번호 2)을 노로 VP1에 융합하였을 때의 효과를 확인하기 위해 상기 실시예 6-1과 동일한 방법으로 VP1 단백질을 발현시켰다. 1mM IPTG 첨가 후 37℃에서 3시간 동안 발현된 단백질을 채취하여 SDS-PAGE를 통하여 수용성 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 7b에 나타낸 바와 같이, MS-RID가 융합된 대조군에서는 VP1 단백질이 발현되지 않았고, VP1에 eet2를 융합시킨 경우는 eet1과 비슷한 발현량을 보이는 것을 확인하였다.
6-3. 노로바이러스 VP1 정제
수용성이 확인된 단백질들은 니켈(Ni) 친화성 크로마토그래피를 통하여 정제되었다. 위와 동일한 방식의 배양방법을 이용하여 3 ml, 50 ml를 거쳐 최종적으로 500 ml의 대장균을 발현 및 수확한 뒤 정제를 진행하였다. 구체적으로, A 버퍼 [50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM 염화나트륨, 5% 글리세롤, 0.1 mM 2-머캅토에탄올, 및 10 mM 이미다졸] 로 먼저 이퀼리브리엄 하였고 이퀼리브리엄 한 Ni-NTA 컬럼 (GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK)을 이용하여 샘플 단백질을 정제하였다. A 버퍼 이후 B 버퍼[50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM 염화나트륨, 5% 글리세롤, 0.1 mM 2-머캅토에탄올, 및 300 mM 이미다졸]를 이용해 10~300 mM 범위의 직선형 그래디언트 이미다졸로 단백질을 용출시켰다. SDS-PAGE를 통해 타겟 단백질을 포함하는 분획을 확인한 후 해당 분획을 모아 C 버퍼(저장버퍼) [50 mM Tris-HCl (pH 8.5), 10 mM NaCl, 0.1 % 2-머캡토에탄올]를 이용하여 투석하였다. 최종적으로 정제된 단백질의 농도는 BSA(Amresco, Solon, OH, USA)를 이용하여 정량하였다. 정제된 VP1 단백질은 20% 글리세롤(glycerol)을 1:1 비율로 섞은 후 -20℃에서 보관하였다.
니켈 친화성 크로마토그래피로 정제된 MSAVKAA-RID-VP1 융합단백질을 확인한 결과 및 SDS-PAGE를 통해 정제 여부를 확인한 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다. 정제를 성공적으로 진행하였으며, 1차 정제 이후 TEV protease를 통한 MSAVKAA-RID를 포함하는 접합 단백질 (tag) 또한 성공적으로 제거하였다. 이후 2nd Ni-affinity chromatography를 통하여 TEV, cleaved tag, uncleaved-융합단백질을 분리하고 완전히 정제된 VP1을 획득하였다(도 10).
6-4. 정제된 VP1의 아미노서열 분석
발현 및 정제 실험을 통해 얻은 단백질이 예상했던 VP1 sequence로 이루어져 있는지 확인하기 위하여 펩타이드 맵핑(Peptide mapping) 및 N-말단 및 C-말단 시퀀싱을 전문분석기관인 ISS (www.isslab.co.kr)에 의뢰하여 진행하였다. 먼저 트립신 처리 시 나타나는 펩타이드 절편을 LC-MS/MS 로 분석한 결과 당초 예상한 시퀀스와 83.9%의 아미노 서열이 일치함을 확인하였다. N-말단 서열 26mer 와 C-말단 3-mer을 비교한 결과 NoV VP1 과 일치함을 확인하였다(도 11).
6-5. 크기 배제 크로마토그래피(Size exclusion chromatography)
TEV cleavage 후 단백질 절단효소로 절단시킨 VP1 단백질의 이합체가 VLP를 형성하는지 여부를 확인하기 위한 생화학적 분석을 수행하였다. 구체적으로, 4℃에서 Superdex-200 분석 겔-여과 컬럼(analytical gel-filtration column)을 통하여 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)로 진행하였다.
전날 AcTEV 단백질 절단효소를 이용하여 16℃에서 하루동안 융합 단백질을 절단시켰다. 컬럼에는 버퍼[Ammonium acetate 250 mM (pH 6.0)]로 이퀼리브리엄을 진행하였고, 이퀼리브리엄 종료 후에 융합 파트너 단백질이 절단된 VP1 샘플을 로딩하여 정제하였다. 정제 후 페리틴(440 kDa), 알돌레이즈(158 kDa), 콘알부민(75 kDa), 오발부민(44 kDa), 블루 덱스트란 2000(GE Healthcare)을 이용하여 칼리브레이션을 진행함으로써 크로마토그램(chromatogram) 상에서 피크(peak)로 나타난 단백질의 분자량을 결정하였다.
종래 연구 결과에 의하면 노로 바이러스 VLP는 10 MDa 의 분자량을 보이고 우리가 사용한 컬럼의 최대 정제 한계가 800 kDa이므로 VLP를 적절하게 형성하였을 때 Void에서 정제될 것이라고 가정하였다. 크로마토그램을 확인한 결과 Void에서 노로 바이러스 VLP로 보이는 높은 피크를 확인할 수 있었으며(도 12a), 정제하여 수확한 분획들을 SDS-PAGE로 확인해본 결과 크로마토그램의 void에서 나타난 피크가 노로 바이러스 VLP에 해당함을 확인할 수 있었다(도 7b). 또한 TEV 단백질 절단효소에 의해 잘려진 hRBD 또한 크로마토그래피를 통하여 정제되었음을 확인할 수 있었다.
6-6. 동적광산란 분석
정제된 바이러스 유사 입자(VLP)의 전체적인 직경을 확인하기 위하여 동적광산란(Dynamic Light Scattering, DLS)을 통하여 분석하였다.
그 결과 야생형 노로바이러스가 보이는 30~40nm와 비슷한 크기로 나타나는 것을 확인하였다(도 13).
6-7. 전자 현미경을 통한 VLP 형성 확인
Void에서 정제된 VP1 단백질이 VLP를 형성했는지 확인하기 위하여 전자 현미경으로 관찰하였다. 정제된 노로 바이러스 VLP를 먼저 구리 그리드에 1분 간 올린 뒤 2% 아세트산 우라닐(uranyl acetate)를 이용하여 15초 간 염색하였다. 전 처리한 샘플을 30분 간 상온에서 건조시킨 뒤 투과 전자 현미경(TEM, Transmission electron microscopy; JEM-1011, JEOL, Japan)을 이용하여 촬영하였다. 위 실험은 연세대학교 의과대학 의생명연구원 연구지원부에서 수행하였다.
그 결과 도 14에 나타난 바와 같이, 정제된 VP1 단백질이 VLP를 형성하는 것을 확인할 수 있었다. 확인된 VLP의 직경은 34 nm 였으며, 배큘로바이러스-곤충세포 발현시스템을 이용하여 생산한 노로바이러스 VLP와 야생형 노로바이러스의 직경과 비슷하였다. 반면, TEV 단백질 절단효소로 단백질 절단하지 않고 hRBD가 융합되어 있는 VP1은 VLP를 형성하지 못하고 응집되는 것을 확인할 수 있었다(도 14).
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 저술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (16)

  1. 목적 단백질의 N-말단에 결합되고 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 일부 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 요산산화효소(urate oxidase)로부터 유래한 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 목적 단백질은 항원, 항체, 세포수용체, 효소, 구조 단백질, 혈청 및 세포 단백질로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3 또는 서열번호 4로 표시되는 서열인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  7. 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
    상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5`-말단에 결합된 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
    를 포함하는 발현벡터.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 목적 단백질은 노로바이러스 유래 VP1 단백질인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
  9. 제7항에 따른 발현벡터로 형질전환된 숙주세포.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 숙주세포는 대장균(E. coli)인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
  11. 목적 단백질의 N-말단에 결합되고 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 일부 서열을 포함하는 펩타이드; 및
    상기 펩타이드의 융합파트너로서 RID(RNA interacting domain)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 목적 단백질의 발현 효율 및 수용성을 증진시키기 위한 융합 단백질.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 RID는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 목적 단백질은 노로 바이러스 유래 VP1 단백질인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  15. 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
    상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5'-말단에 결합된 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  16. (A) 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드의 5'-말단에 결합된 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키는 펩타이드 및 수용성을 높여 주는 RID를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;
    (B) 상기 발현 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계: 및
    (C) 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 목적 단백질의 발현을 유도하고, 이를 수득하는 단계를 포함하는 수용성 목적 단백질의 생산 방법.
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