KR0141315B1 - 인간 싸이모신 알파 1의 새로운 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 싸이모신 알파1 유전자를 유비퀴틴 유전자에 연결시킨 유비퀴틴-인간 싸이모신 알파1 융합유전자를 대장균에서 발현시켜 생산한유비퀴틴-인간 싸이모신 알파 1 융합 단백질을 분리한 다음, 상기 융합 단백질을 유비퀴틴 절단 효소로 절단하여 인간 싸이모신 알파 1 단백질만을 분리하는 것을 포함하는, 인간 싸이모신 알파 1 단백질의 제조방법을 제공한다.

Description

인간 싸이모신 알파 1의 새로운 제조방법

제1도는 유비퀴틴-싸이모신 알파 1 융합단백질의 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 유전자의 염기서열을 나타낸 것이고,

제2도는 유비퀴틴-싸이모신 알파1 발현벡터의 클로닝 과정을 도시한 것이고,

제3도는 융합단백질인 유비퀴틴-싸이모신 알파1의 발현정도 및 정제후의 순도를 전기영동으로 분석한 결과를 나타낸 것이며,

제4도는 정제된 유비퀴틴-싸이모신 알파1을 유비퀴틴 절단효소로 절단한 결과와 절단후 싸이모신 알파1만을 분리해 낸 것을 전기영동으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 유전자 재조합 기술을 이용한 인간 싸이모신 알파1(thymosin alpha 1, 이하 Tα1으로 표시함)의 새로운 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 유비퀴틴(ubiquitin, 이하 Ub로 표시함)을 이용하여 Tα1을 유전공학적 방법으로 대량 생산할 수 있는 새로운 제조방법에 관한 것이다.

Tα1은 흉선에서 분비되는 호르몬의 일종으로 28개의 아미노산으로 구성되어 있고 아미노 말단에 아세틸기가 있는 폴리펩티드이다. 여러방면의 임상결과 면역기능을 보강시키는 역할을 하는 Tα1은 면역 기능이 떨어진 각종 질명의 치료제 뿐만 아니라, 암치료의 보강제로 또 노화방지, B 또는 C형 간염 등과 같은 감염성 질병에도 병용치료제로 사용될 수 있다(Goldstein, A. et. al., Med. Oncol. Tumor Pharmacother. 3,211-221(1986), Mutchnick, M.G. et. al., Hepatology 14, 409-415(1991)). 이러한 Tα1은 1977년 소의 흉선에서 최초로 정제되었고, 이어 그 아미노산 서열이 밝혀졌다(Goldstein A.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 725-729 (1977); 미합중국 특허 제4,079,127호). 그후 인간의 Tα1도 소와 동일한 아미노산 서열을 갖는 것으로 밝혀졌고, 이를 토대로 여러 가지 방법의 화학적 합성이 시도 되었다(미합중국 특허 제4,504,415호 및 제4,855,407호). 그러나 Tα1의 효율적인 제조와 경제적인 대량생산을 위해서는 유전공학적인 방법의 적용이 요구되었는데, Tα1과 같이 작은 포리펩티드만을 세포내에서 발현시킬 경우 불안정하여 합성되자마자 곧 분해되어 버리는 문제점을 지니고 있다. 이세 Tα1을 β-갈락토시다제의 카복시 말단에 메티오닌을 첨가하여 연결시킨 융합단백질 형태로 대장균에서 발현시키고, CNBr을 이용한 화학적 반응으로 메티오닌 뒤의 펩티드결함을 절단시켜 아세틸기가 없는 Tα1을 얻는데 성공하였으며, 아세틸기가 없는 Tα1도 천연 Tα1과 같은 활성을 지니고 있음을 보여주었다 (Wetzel, R. et. al., Biochemistry 19,6096-6104(1980)).

이에 본 발명자들은 보다 효율적인 Tα1의 유전공학적 대량생산을 위하여 연구 노력한 결과, 우선 Tα1을 Ub에 연결한 유비퀴틴-싸이모신 알파1(ubiquitin-thymosin 1, 이하 Ub-Tα1으로 표시함) 형태의 융합단백질로 대장균에서 발현시켜 세포내 안정성 문제를 해결하고, 이를 정제한 후 Ub절단효소를 이용하여 실험관에서 절단한 다음 다시 Tα1만을 분리 정제함으로써 유전공학적으로 Tα1을 대량 생산할 수 있는 새로운 Tα1의 제조방법을 발명하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 Ub을 이용한 Tα1의 새로운 유전공학적 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명에서 Tα1의 융합단백질로 사용한 Ub은 76개의 아미노산으로 구성된 비교적 작은 단백질로서, 모든 진핵세포에서 존재하며 단백질의 선택적인 분해를 비롯한 여러 조절작용에 관여한다(Rechsteiner M., Ubiquitin, Plenum, New York, 1998). 이러한 Ub이세포내에서 합성될 때 단독으로 만들어지는 경우는 없고, 여러개의 Ub이 일렬로 연결된 형태나 또는 Ub의 카복시말단에 다른 단백질이 연결된 형태로 만들어진후, Ub절단효소에 의해 Ub과 Ub사이 또는 Ub과 다른 단백질 사이의 연결이 정확하게 절단됨으로써 세포내 여러 가지 기능을 수행할 수 있는 Ub이 생성되게 된다. 이화같이 Ub의 세포내 생산을 위하여 필수불가결한 Ub절단효소는 Ub뒤에 붙어있는 다른 단백질의 아미노산 서열이나 구조에 상관없이 Ub과 다른 단백질 사이의 펩티드 결합을 정확하게 절단한다(Bachmair A. et. al., Science 234,179-186 (1986)). 한편 Ub과 Ub절단효소를 비롯한 Ub에 관계되는 효소들은 모든 진핵세포에는 존재한, 박테리아와 같은 원핵세포에는 존재하지 않는다. 따라서 Ub에 단백질이 연결된 융합단백질을 암호화하는 유전자를 진핵세포에서 발현시키면, 합성된 단백질이 세포내에서 정확하게 절단되어 원하는 어떠한 아미노산(프롤린만 예외)으로도 시작하는 단백질을 얻을 수 있다(미국특허 제5,093,242호). 상기 융합단백질 유전자를 박테리아 등의 원핵세포에서 발현시키면 Ub이 절단되지 않은 융합단백질 형태로 얻을 수 있고, 이를 세포밖에서 정제된 Ub절단효소로 절단하여 목적하는 단백질만을 Ub으로부터 분리.정제함으로써, 박테리아 등의 미생물을 이용한 단백질의 유전공학적 생산에 이용될 수 있다. 이는 특히 세포내에서 단독으로 발현될 경유 불안정하여 쉽게 분해되는 펩티드들의 유전공학적 생산을 가능케 한다.

본 발명자들은 상기에 기술한 Ub과 Ub절단효소의 분포와 특성을 이용하여, Tα1과 Ub를 연결시킨 융합단백질을 Ub절단효소가 존재하지 않는 대장균에서 발현시키고, 이를 정제한 후 시험관에서 Ub절단효소로 이용하여 Ub과 Tα1으로 분리한 다음, 다시 Tα1만을 정제함으로써 고순도의 Tα1을 유전공학적방법으로 대량생산할 수 있는 새로운 Tα1의 제조방법을 발명하게 되었다. 대장균에서 발현된 Ub-Tα1융합 단백질의 분리 및 정제는 통상의 방법으로 수행할 수 있으며, 예를들면 세포파쇄, 원심분리, 수용액층의 투석, 이온교환수지 컬럼통과, 역상 크로마토그래피 과정을 적절히 조합하여 분리 정제할 수 있다.

본 발명에서 이용하는 Ub절단효소는 효모 유비키틴하이드롤레이즈(Miller, H.I. et. al., BioTechnology, 7,698-704 (1989))나 유비퀴틴카복실하이드롤레이즈 L3(Mayer, A.M. and Wilkinson, K.D. Biochemistry 28,166-172 (1989))와 같이 이미 정제된 효소를 비롯한 어떠한 종류의 Ub절단효소도 이용이 가능하다.

Ub 절단효소 처리 후 Tα1만을 분리해 내는 단계는 여러 가지 단백질 분리정제 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들면 양이온 교환 크로마토그래피 및/또는 역상고압 크로마토그래피를 사용할 수 있다.

본 발명을 제조방법에 따라 그 단계별로 상세히 설명하면 다음과 같다.

면저 Tα1을 Ub에 연결되는 융합단백질로 발현시키기 위하여, 이미 알려진 Tα1의 아미노산 서열을 토대로 합성한 Tα1유전자를 Ub유전자에 연결시키고, 이를 발현벡터에 삽입하여 Ub-Tα1 발현벡터를 제조한다. 이때 Ub유전자는 합성할 수도 있고, 또는 기존의 Ub 유전자를 포함하는 발현벡터를 이용하여 Tα1유전자를 Ub유전자에 직접연결할 수도 있다.

바람직한 실시태양으로서 본 발명의 Ub-Tα1 융합단백질은 제1도에 도시한 아미노산 서열을 가지며, 이를 코딩하는 유전자는 제1도의 염기서열을 가지나 이에 한정되는 것은 아니며, 그 생물학적 활성에 큰 변화가 없는 한 적절히 변형시킬 수 있다.

상기와 같이 제조된 발현벡터를 이용하여 Ub절단효소가 존재하지 않는 대장균을 형질전환시키고, 형질전환된 유전자 재조합 대장균을 배양하면서 Ub-Tα1융합 유전자의 발현을 유도한다. Ub-Tα1융합 유전자의 발현이 유도된 대장균을 수거하여 완충용액에 현탁한 후이를 파쇄시킨다. 원심분리하여 불용성 침전물을 제거하고 얻은 상층액을 완충용액으로 투석하여 평형을 이룬 후, 이를 pH 8-9에서 음이온 교환수지로, 그리고 pH4-6에서 양이온 교환수지로 순차적으로 크로마토그래피하면 98% 이상의 순도를 갖는 Ub-Tα1 융합 단백질을 분리.정제할 수 있다. 이때 음이온 교환수지와 양이온 교환수지의 순서를 바꾸어 크로마토그래피하여도 정제의 효율성에는 영향이 없다. 정제된 Ub-Tα1 융합단백질을 Ub절단효소로 절단한 후, 다시 양이온 교환수지 크로마토그래피나 역상크로마토그래피를 이용하여 손쉽게 Tα1만을 분리.정제할 수 있다.

이하 본 발명을 다음의 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다. 다음의 실시예는 구체적인 설명을 하기 위한 것이며 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

Tα1 유전자의 합성

먼저 공지되 Tα1의 아미노산 서열을 토대로 Tα1유전자의 핵산서열을 결정하고, 이 유전자의 한쪽끝은 절단될 Ub 카복실 말단의 아미노산들을 재생하면서 Sacll 제한효소 인지부의를 포함하고, 다른 한쪽끝은 두 개의 종료코돈과 SalⅠ 제한효소 인지부위를 포함하도록 핵산서열을 설계한 후 이를 다음과 같은 4개의 올리고머로 나누어 DNA합성기(미국 Applied Biosystem사의 380B모델)로 합성하였다.

합성된 4개의 올리고머를 1mM EDTA, 50mM Tris-HC1(pH8.0), 50mM 붕산 및 2M 우레아를 함유하는 15% 폴리아크 리아마이드젤을 이용한는 전기영동으로 분리하고, 이를 C18 역상컬럼(미국 Waters사의 SEP-PAK)에 부착시킨 후 50% 아세토니트릴로 용출하여 정제하였다. 정제된 각각의 올리고머를 37。C에서 10mM 디티오트레이톨(DTT) 및 66μM ATP를 함유하는 70mM Tris-HC1(pH7.6)용액에서 키나제와 1시간 동안 반응시켜 각 올리고머의 5`쪽을 인산화 시켰다. 이어 올리고머#1과 #2를 그리고 #3와 #4를 각각 같은 몰비로섞고 이를 70。C로 가열한 후 1시간에 걸쳐 30。C 이하로 서서히 온도를 낮추어 다음과 같은 염기쌍 구조를 갖는 A와 B 두 개의 DNA 단편을 얻었다.

이를 다시 접합완충액 (10mM MgCl2, 10mM DTT, 1mM ATP 및 25 μg/ml 소혈청알부민(BSA)을 함유하는 50mM 트리스 완충용액(pH7.8))에서 4시간 동안 16。C에서 리가제 효소와 반응시켜 다음과 같은 핵산서열을 갖는 유전자를 제조하였다.

[실시예 2]

Ub-Tα1 융합단백질 발현벡터 및 균주의 제조

본 실시예에서는 이미 제조된 벡터내의 Ub 유전자를 이용하기 위하여 먼저, 플라스미드 ptrpH-UB-KHCV897(ATCC 68640)로부터 Ub유전자를 함유하는 NdeI-BamHI 절편을 분리하고, 이를 같은 제한효소인 NdeI과 BamHI으로 절단한 pET-11a(Novagen, USA) 발현벡터에 삽입하여 pET-UB-KHCV897 벡터를 제조하였다.

상기에서 제조된 발현벡터 pET-UB-KHCV897을 SacII 및 SaII 제한효소로 동시에 절단하여 얻은 5.9Kb DNA절편과 실시예 1에서 제조한 Tα1유전자를 1:20의 몰비로 섞어 실시예 1에서와 같은 접합완충액에서 16。C를 유지시키면서 리가제 효소와 밤새 반응시켰다. 이 접합반응액으로 직접 대장균 BL21(DE3)을 형질전환시킨 후,

100 μg/ml 앰피실린과과 34μg/ml 클로람페니콜을 함유하는 아가배지에 배양하였다.

이때 얻은 콜로니 중에서 일부를 선택하여 DNA서열을 디데옥시 터미네이션 방법(Sanger, F. et. al., P.N.A.S. 74, 5403 (1977))으로 확인한 후 이를 Ub-Tα1의 발현균주 대장균(BL21(DE3)pLys/pETUBT α)로 사용하였다. 이상과 같은, Ub-Tα1 유전자를 함유하는 발현벡터(pET-UBT α1)의 제조과정을 요약하여 제 2 도에 도시하였다.

상기 Ub-Tα1 발현벡터를 함유하는 대장균 BL21(DE3)pLys/pETUBT α은 한국과학기술연구원 부설 유전공학연구소 유전자 은행에 1994년 7월 28일자로 기탁번호 KCTC 0118BP로 기탁되어 있다.

[실시예 3]

Ub-Tα1 의 발현

상기 실시예 2에서 제조된 발현 균주인 유전자 재조합 대장균 (BL21(DE3)pLys/pETUBT α)을 37。C에서 250rpm으로 흔들어 주면서 100 μg/ml 앰피실린과과 34μg/ml 클로람페니콜을 함유한 LB배양액 100ml에 배양하였다. 600nm 파장에서 흡광도가 0.5되게 자랐을 때 IPTG를 1mM 되게 가해주어 Ub-Tα1의 발현을 유도한 후 3시간 더 배양하였다. 이때 Ub-Tα1의 발현된 정도를 SDS 폴리아크릴아마이드젤 전기영동으로 분석한 결과를 제 3 도에 나타내었다. 제 3 도에서'1'은 IPTG를 가하기 직전 수거한 세포의 추출물이고, '2'는 IPTG를 가하고 3시간 더 배양한 후 수거한 세포의 추출물이다. '1'과 '2'를 비교하여 Ub-Tα1(⇒로 표시)이 다량 발현되었음을 알 수 있었다.

[실시예 4]

Ub-Tα1 의 정제

실시예 3에서와 같은 방법으로 배양한 대장균 배양액을 원심분리하여 세포침전물을 수거하고 이르 1mM DTT, 1mM EDTA, 5% 글리세롤을 함유하는 50mM 트리스 완충용액(pH8.0)에 현탁시킨 후, 초음파 분쇄기를 이용하여 세포를 파쇄시켰다. 파쇄된 세포를 10,000xg에서 30분간 원심분리한 후, 침전물은 버리고 10mM NaCl을 함유하는 20mM 트리스 완충용액(pH8.2)에 투석하여 평형되게 하였다. 평형된 세포용액을 같은 완충용액으로 평형시킨 DEAE-세파로즈 컬럼 (1x10cm)에 투여하였다. 컬럼에 흡착되지 않은 단백질 및 기타 물질을 40ml의 같은 완충용액으로 씻어낸 후 10mM 내지 500mM 농도의 NaCl로 선형 구배시키면서 흡착된 물질을 용출시켰다. 이때 용출속도는 분당 1ml이었으며 각분획의 부피는 4ml로 하였다. DEAE-세파로즈로부터 용출되어 나오는 단백질을 280nm의 파장으로 검출하고 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동으로 분석한 후 Ub-Tα1 을 함유하는 분획만 모았다.

상기와 같이 얻은 단백질 용액을 20mM 소듐아세테이트 완충용액(pH4.5)에 투석하여 평형시킨 후 같은 완충용액으로 평형시킨 모노-S(1x10cm) 컬럼에 투여하였다. 컬럼에 흡착되지 않은 단백질을 20ml의 20mM 소듐아세테이트 완충용액(pH4.5)으로 씻어주고, 이어 80ml의 같은 완충용액에 NaCl의 농도를 0M에서 0.5M까지 선형구배하면서 흡착된 단백질을 용출시켰다. 이때 용출속도는 분당 1ml이었으며 각분획의 부피는 2ml로 하였다. 모노-S 컬럼으로부터 용출되어 나오는 단백질을 280nm의 파장으로 검출하고, 또 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동으로 분석한 후Ub-Tα1을 함유하는 분획만 모았다. 이때 정제된 Ub-Tα1 은 제 3 도의 '3'에 나타난 바와 같이 98%이상의 순도를 지녔으며, 정제효율은 100ml 배양물로부터 20mg 이상을 얻을 수 있었다.

[실시예 5]

Ub-Tα1 의 절단

상기 실시예 4에서 정제된 Ub-Tα1 융합단백질을 몰비로 0.2%의 Ub절단효소와 37。C에서 30분간, 5mM DTT를 함유한 50mM트리스 완충용액(pH7.2)에서 반응시켰다. 반응결과를 SDS 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동으로 분석한 결과 Ub-Tα1이 95%이상 절단되었음을 알 수 있었다(제 4 도, A). 그러나 폴리아크릴아마이드젤상 단백질의 염색과 탈색과정에서 Tα1과 같이 작은 펩타이드는 빠져나가 제 3도의

젤사진에서는 Tα1의 관찰은 어렵고 Ub만 관찰할 수 있었다. 제 4 도 A에서 '1'은 실시예 4에서 정제된 Ub-Tα1(3μg)이고'2'는 같은양(3μg)의 Ub-Tα1을 Ub절단효소와 반응시킨후의 산물이다.

실시예 6: Tα1 정제

실시예 5에서 Ub절단효소에 의하여 Ub-Tα1로부터 분리된 Tα1 은 다시 C8 역상고압크로마토그래피를 이용하여 순수정제하였다.실시예 5의 반응액에 0.1M되게 아세트산을 가한 후 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)로 평형된 C8 역상컬럼에 투여하였다. 이어 0.1% TFA를 유지하면서 0-60% 아세토니트릴로 선형구배 시키면서 컬럼에 부착된 단백질을 용출시킨 결과 Tα1 ,Ub, 그리고 미처 절단되지 않은 Ub-Tα1의 순으로 용출되어 나왔다. 이때 정제된 Tα1과 Ub을 각각 5μg씩을 SDS 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동으로 분석한 결과 젤상에서 각각 단일띠로 관찰할 수 있었다(제 4 도, B). 제 4 도 B에서 같은 양의 Ub과 Tα1이 다르게 보이는 것은 쿠마시 불루로 단백질을 염색하고 탈색하는 과정 동안 분자량이 작은 Tα1은 빠져나가 일부만 검출되었기 때문이다.

정제되 Tα1을 아미노산 서열분석기(미국 Applied Biosystem사의 모델)로 분석한 결과 아미노 말단 3개의 아미노산서열이 세린-아스파틱산-알라닌으로 맑혀졌으며, 따라서 Ub절단효소가 정확하게 Ub과 Tα1의 경계를 절단하였음을 확인할 수 있었다. 또한 아미노산 분석기 (미국 Applied Biosystem사의 모델 420A)로 분석한 결과 정제된 Tα1의 28개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 아미노산 조성도 기대값과 일치함을 확인할 수 있었다.

Claims (6)

1. 인간 싸이모신 알파1 유전자를 유비퀴틴 유전자에 연결시킨 유비퀴틴-인간 싸이모신 알파 1 융합유전자를 대장균에서 발현시켜 생산한 유비퀴틴-인간 싸이모신 알파 1 융합 단백질을 분리한 다음, 상기 융합 단백질을 유비퀴틴 절단 효소로 절단하여 인간 싸이모신 알파 1 단백질만을 분리하는 것을 포함하는, 인간 싸이모신 알파 1 단백질의 제조방법.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 유비퀴틴-인간 싸이모신 알파 1융합 단백질이 하기 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 제조방법
3. 제 2 항에 있어서, 상기 융합 유전자가 하기 염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 제조방법:
4. 제 1 항에 있어서, 유비퀴틴-인간 싸이모신 알파1 융합단백질을 대장균으로부터 분리함에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피를 수행함을 포함하는 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 융합 단백질을 유비키틴 절단 효소로 절단한 후 인간 싸이모신 알파1을 분리함에 있어서, 역상 고압 크로마토그래피를 이용하는 방법.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 역상 고압 크로마토그래피는 C-4, C-8, 또는 C-18

   역상 컬럼을 사용함을 특징으로 하는 방법.